Лекарственные средства для лечения ишемических заболеваний - RU2311921C2

Описание

Область техники

Данное изобретение относится к средству для лечения ишемического заболевания, содержащему в качестве активного ингредиента человеческий колониестимулирующий фактор гранулоцитов (далее именуемый человеческим G-CSF).

Предшествующий уровень техники

Данное изобретение относится к средству для лечения ишемического заболевания. Сначала будет описано типичное ишемическое заболевание, обструктивный артериосклероз.

Обструктивный артериосклероз представляет собой заболевание, при котором артериосклеротическое поражение приводит к окклюзии или стенозу главной стволовой артерии в конечности, в частности в нижней конечности, вызывая ишемическое расстройство по периферии. Клинические симптомы данного заболевания классифицируются как ощущение холода или онемения, перемежающаяся хромота, боль в покое и образование язвы/некроза. По оценкам, в Японии количество больных с обструктивным артериосклерозом составляет приблизительно 100000 (Yusuka Tada: Biomedicine & Therapeutics, Vol.31, 289-292; 1997). Ожидается, что количество больных с этим заболеванием увеличится в связи с увеличением популяции пожилых людей и переходом на западный рацион питания. Способы лечения обструктивного артериосклероза включают кинезитерапию или лечебную физкультуру, фармакотерапию и реваскуляризацию, которые выбираются в зависимости от симптомов или состояние больного. Недавно также предпринимались попытки генотерапии и внутримышечной трансплантации клеток костного мозга.

Описанные выше способы лечения в настоящее время достигают определенного успеха при лечении обструктивного артериосклероза, но соответствующие способы лечения связаны со следующими проблемами. Хотя лечебная физкультура в некоторых легких случаях увеличивает расстояние, которое может пройти больной, трудно прогнозировать эффект данного способа лечения. Кроме того, больных не удовлетворяет увеличение расстояния, которое они могут пройти, если оно имеет место, и у 30% из них потребовалось осуществление реваскуляризации (Takashi Ohta: Japan Medical Journal, Vol.3935, 25-29, 1999). В настоящее время лечебная физкультура не является очень эффективным видом лечения.

При фармакотерапии главным образом назначаются антитромбоцитарные средства, но они просто предотвращают усугубление симптомов. Средства, улучшающие микроциркуляцию, и средства, улучшающие доставку кислорода, которые с недавних пор активно внедряются, показаны только при легких случаях. В настоящее время нет радикальных лечебных средств для лечения обструктивного артериосклероза.

С другой стороны, реваскуляризация является в настоящее время самым эффективным способом лечения, который включает чрескожную ангиопластику или операцию шунтирования, в зависимости от состояния больного или локализации или тяжести поражения. Данные хирургические операции настолько обширны, что создают такие проблемы, как связанные с операцией осложнения или случаи смерти и неблагоприятный прогноз в отношении продолжительности жизни.

При использовании генотерапии лечение осуществляют с использованием генов ангиогенных факторов, таких как фактор роста эндотелиальных клеток сосудов и фактор роста эпидермальных клеток. Однако данная терапия еще находится на экспериментальной стадии, и оценка ее безопасности и эффективности еще не была проведена. Таким образом, генотерапия еще не получила общего распространения.

Внутримышечная трансплантация клеток костного мозга, о терапевтических эффектах которой недавно сообщалось, представляет собой лечение, при котором клетки костного мозга трансплантируются в мышцу около пораженной части, после чего они дифференцируются в клетки сосудистого эндотелия с образованием кровеносных сосудов. Хотя ее эффективность должна пройти оценку у большего количества больных, ожидают, что данный способ лечения станет перспективным, потому что с его использованием можно лечить тяжелые случаи. Однако считается, что одной из проблем, связанных с данным способом лечения, являются большие трудности, связанные с взятием костного мозга, которые ложатся на плечи и больных и медицинского персонала.

Недавно проведенные исследования показали, что гемопоэтические стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в клетки сосудистого эндотелия, присутствуют не только в костном мозге, но также в периферической крови, и они принимают участие в ангиогенезе (Qun Shi et al. Blood Vol.92, 362-367; 1998, Takayuki Asahara et al. Circulation Research Vol.85, 221-228; 1999, Mario Peichev et al. Blood Vol.95, 952-958; 2000). (Гемопоэтические стволовые клетки называются "клетками-предшественниками эндотелиальных клеток" с точки зрения функции дифференциации в эндотелиальные клетки. Однако данные клетки первоначально получены из гемопоэтических стволовых клеток. Таким образом, термин "гемопоэтические стволовые клетки" используется здесь в соответствии с концепцией, что они представляют собой клеточную популяцию, способную стать эндотелиальными клетками). Следовательно, производят сбор гемопоэтических стволовых клеток в периферической крови и трансплантируют их в мышцу поблизости к пораженной части, посредством чего можно ожидать излечение обструктивного артериосклероза. Данная процедура имеет преимущество в том, что трудности, создаваемые для больного и медицинского персонала во время взятия стволовых клеток периферической крови, меньше, чем трудности во время трансплантации стволовых клеток костного мозга. Однако обычно частота встречаемости гемопоэтических стволовых клеток в периферической крови крайне низка. Таким образом, весьма проблематично, можно ли получить необходимое и адекватное количество гемопоэтических стволовых клеток для лечения обструктивного артериосклероза.

Описание изобретения

Человеческий G-CSF представляет собой гемопоэтический фактор, обнаруженный как фактор дифференциации/пролиферации для клеток-предшественников гранулоцитной линии. Он применяется в клинике в качестве средства для лечения нейтропении после трансплантации костного мозга или химиотерапии при раке, потому что он способствует нейтрофильному гемопоэзу in vivo. В дополнение к данному действию, трансплантация периферических стволовых клеток мобилизует человеческий G-CSF, т.е. трансплантация периферических стволовых клеток проводится в клинических условиях с целью ускорения восстановления гемопоэза у раковых больных после интенсивной химиотерапии. Это мобилизующее гемопоэтические стволовые клетки действие G-CSF гораздо более мощное, чем действие GM-CSF, также являющегося гемопоэтическим фактором для гранулоцитной линии. С точки зрения также небольшого количества побочных эффектов G-CSF имеет преимущество над GM-CSF.

Перед лечением путем внутримышечной трансплантации клеток костного мозга у больных с обструктивным артериосклерозом можно ожидать, что введение человеческого G-CSF увеличит частоту встречаемости гемопоэтических стволовых клеток в костном мозге. Таким образом, может быть уменьшено количество пункций костного мозга для сбора клеток костного мозга, и может быть уменьшена нагрузка на больного. В этом случае нагрузка на больного и на медицинский персонал может быть дополнительно снижена получением для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток из периферической крови. Кроме того, было показано, что гемопоэтические стволовые клетки в периферической крови участвуют в образовании кровеносных сосудов, и поэтому ожидается, что увеличение количества гемопоэтических стволовых клеток в периферической крови, вызванное введением человеческого G-CSF, будет способствовать образованию кровеносных сосудов. Следовательно, можно ожидать, что простое введение человеческого G-CSF больным будет излечивать обструктивный артериосклероз. Ясно, что такое лечение обструктивного артериосклероза введением человеческого G-CSF заметно снизит нагрузку на больного и медицинский персонал в том смысле, что оно избежит необходимости сбора и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Краткое описание чертежа

Чертеж представляет собой изображение, показывающее воздействия (В) инокуляции мононуклеарных клеток периферической крови, полученных у мышей, обработанных G-CSF, и (С) введения G-CSF на плотность капилляров в ишемизированной конечности крысы. Величины плотности капилляров отдельных животных наносились на график для группы В, группы С и контрольной группы (А).

Можно ожидать, что описанные выше три способа лечения обструктивного артериосклероза с использованием человеческого G-CSF будут иметь эффект в тяжелых случаях и окажут очень благоприятное воздействие на больных. Если данное лечение комбинируется с лечением ангиогенным фактором, который способствует дифференциации и росту сосудистых эндотелиальных клеток-предшественников, таким как фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), фактор роста эпидермиса (EGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) или фактор роста фибробластов (FGF), или с генотерапией данных факторов, ожидается, что лечебный эффект этого лечения дополнительно усилится. В этом случае данные факторы или их гены можно вводить больным, например, в участки около пораженной части. Аналогичным образом, ожидается, что G-CSF проявит возросший терапевтический эффект при комбинации со средствами, применяемыми в клинических условиях в качестве способов медикаментозной терапии при лечении обструктивного артериосклероза, таких как антитромбоцитарные средства, вазозиляторы, средства, улучшающие микроциркуляцию, и антилипемические средства.

Кроме того, G-CSF настоящего изобретения может применяться в качестве средства для лечения других заболеваний, классифицируемых как ишемические заболевания. Данные заболевания включают следующие: травму, реакцию отторжения при трансплантации, ишемическое цереброваскулярное расстройство (например, апоплексия, инфаркт мозга), ишемическое почечное заболевание, ишемическое легочное заболевание, ишемическое заболевание, связанное с инфекцией, ишемическое заболевание конечностей, ишемическая болезнь сердца (ишемическая миокардиопатия, инфаркт миокарда, ишемическая сердечная недостаточность). То есть настоящее изобретение представляет средства, содержащие G-CSF, в качестве активных ингредиентов для лечения данных заболеваний.

В результате проведенных исследований авторы создали настоящее изобретение. А именно, настоящее изобретение представляет средства для лечения ишемического заболевания, которые содержат в качестве активного ингредиента человеческий G-CSF.

Настоящее изобретение будет подробно описано ниже.

Варианты осуществления изобретения

Человеческий G-CSF представляет собой белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную ниже в формуле 1.

Человеческий G-CSF представляет собой белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную ниже в формуле 1. Человеческий G-CSF, применяемый в настоящем изобретении в дополнение к данному белку, включает мутантный белок, который продуцируется введением в первоначальный белок некоторых изменений аминокислот, таких как замещение, добавление или делеция. Альтернативно, человеческий G-CSF в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой белок формулы 1 или его мутантный вариант, описанный выше, с различными модификациями или без них. Пока продукты обладают активностью G-CSF, они могут применяться в настоящем изобретении. Используемый здесь термин "различные модификации" относится к структурной трансформации, добавлению и делеции сахарной цепи и связыванию неорганических или органических соединений, таких как полиэтиленгликоль и витамин В12.

Формула 1: Аминокислотная последовательность человеческого G-CSF

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys 16

Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys lie Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln 32

Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val 48

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly lie Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys 64

Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser 80

Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser 96

Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp 112

Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro 128

Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe 144

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe 160

Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

174

Способ получения данного человеческого G-CSF может представлять собой любой способ, который может дать определенный выше продукт. Конкретно, человеческий G-CSF получают с использованием опухоли, продуцирующей человеческий G-CSF, гибридомы, продуцирующей человеческий G-CSF, или трансформированного хозяина, которому в результате генетической рекомбинации был придан потенциал продукции G-CSF. В зависимости от структуры человеческого G-CSF, который предстоит продуцировать, на подходящей стадии процесса продуцирования соответствующим образом применяют операцию изменения или различные модифицирующие операции. Если человеческий G-CSF нужно получить путем генетической рекомбинации, может использоваться любой обычно используемый хозяин, такой как Escherichia coli или клетки животных.

Средство для лечения ишемического заболевания в соответствии с настоящим изобретением может содержать фармацевтические переносчики и носители, необходимые для придания формы лекарственной фармацевтической композиции, и может, кроме того, содержать стабилизаторы и средства, предотвращающие адсорбцию. Подходящие стандартные лекарственные формы могут быть выбраны из форм, включающих инъекционные формы, препараты пролонгированного действия, интраназальные препараты, оральные препараты, транспульмональные препараты, трансдермальные препараты и препараты, вводимые через слизистые оболочки. При желании могут применяться подходящие устройства.

Дозу и частоту введения человеческого G-CSF, содержащегося в средстве для лечения ишемических заболеваний в соответствии с настоящим изобретением, можно определить с учетом состояния больного, которому показано средство. Доза обычно составляет от 0,1 до 500 мкг/кг/в день, предпочтительно, от 1 до 50 мкг/кг/в день на взрослого человека. Что касается частоты введения, то средство изобретения может вводиться в течение от 1 до 7 дней в неделю. Способ введения предпочтительно включает внутривенное введение, подкожное введение и внутримышечное введение. Однако настоящее изобретение не ограничено дозой человеческого G-CSF и может комбинироваться с препаратами, применявшимися до настоящего времени, и обладающими эффективностью против обструктивного артериосклероза, такими как антитромбоцитарные средства, сосудорасширяющие средства, средства, улучшающие микроциркуляцию, антикоагулянты и антилипемические средства, и может также применяться в комбинации с генотерапией.

Настоящее изобретение будет описано подробнее со ссылкой на экспериментальные примеры (фармакологическая эффективность) и примеры осуществления изобретения (примеры препарата), которые никоим образом не ограничивают настоящее изобретение.

Экспериментальный пример 1 (фармакологическая эффективность)

Левую бедренную артерию и вену безволосых мышей (BALB/cAJcl-nu) перевязывали, а затем удаляли для получения моделей ишемии нижней конечности. В нелеченой группе через 2 недели после создания ишемии у 3 из 5 животных (60%) развилось выпадение функции нижней конечности, а у 2 животных (40%) развился некроз. В группе с подкожным введением G-CSF в дозе 100 мкг/кг/в день всего 5 раз, начиная за 3 дня до создания ишемии нижней конечности до 1-го дня после операции, через 2 недели после создания ишемии выпадение функции и некроз нижней конечности наблюдался соответственно у 1 (20%) и 3 (60%) из 5 животных, и у 1 животного (20%) повреждение не наблюдалось. Таким образом, у группы, леченой G-CSF, повреждение нижней конечности было снижено. Эти данные показывают, что G-CSF может оказывать действие на облегчение повреждения нижней конечности после ишемии путем стимулирования ангиогенеза.

Экспериментальный пример 2 (фармакологическая эффективность)

После подкожного введения в течение 5 дней G-CSF в дозе 100 мкг/кг/в день мышам (BALB/cAJcl-nu) брали кровь и получали фракцию мононуклеарных клеток способом градиента плотности (d=1,077). Таким же образом левую бедренную артерию и вену безволосых крыс (F344/N Jcl-rnu) удаляли для получения моделей ишемии нижней конечности. Через 1 день после создания ишемии мононуклеарные клетки периферической крови от мышей, леченых G-CSF, внутримышечно вводили в дозе 2×10⁷ клеток/голову (соответствующей приблизительно 5 мл периферической крови) в ишемизированную конечность безволосых крыс с моделью ишемии нижней конечности. Контрольная группа получала внутримышечно фосфатный буфер. Через 1 неделю после введения готовили образец ткани нижней конечности, и плотность капилляров измеряли после окрашивания щелочной фосфатазы. В результате, наблюдалась тенденция к более высокой плотности капилляров в группе, леченой мононуклеарными клетками, чем в контрольной группе (при 5 животных на группу в контрольной группе количество капилляров в поле зрения составило 38,3±1,7 (средняя величина ± стандартная ошибка), а в группе, леченой мононуклеарными клетками периферической крови, 42,3±2,1. Результаты показаны на фиг.1А и В.

Эти данные показывают возможность того, что G-CSF способствует мобилизации эндотелиальных клеток-предшественников в периферическую кровь мышей, способствуя посредством этого ангиогенезу у крыс, получавших трансплантат периферических мононуклеарных клеток, и свидетельствуют о возможности применения G-CSF для лечения нарушений периферического кровообращения.

Экспериментальный пример 3 (фармакологическая эффективность)

Левую бедренную артерию и вену безволосых крыс (F344/N Jcl-rnu) удаляли для получения моделей ишемии нижней конечности. Плотность капилляров измеряли окрашиванием щелочной фосфатазы образца ткани нижней конечности, полученного через 1 неделю после создания ишемии. Сравнения проводили между группой, которой подкожно вводили G-CSF в дозе 100 мкг/кг/в день, начиная за 4 дня до создания ишемии, вплоть до 1 недели после создания ишемии (группа лечения G-CSF), и контрольной группой. Контрольная группа получала внутримышечное введение фосфатного буфера. В результате было показано, что плотность капилляров была выше в группе лечения G-CSF, чем в контрольной группе (при 5 животных на группу в контрольной группе количество капилляров в поле зрения составило 38,3±1,7 (средняя величина ± стандартная ошибка), а в группе лечения G-CSF - 44,7±2,4). Результаты показаны на фиг.1А и С.

Эти данные свидетельствуют о том, что G-CSF обладает эффектом, способствуя ангиогенезу в участке ишемии, и свидетельствуют о возможности применения G-CSF для лечения нарушений периферического кровообращения.

Пример 1 (пример препарата)

Полисорбат 20 (Tween 20: полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат), неионное поверхностно-активное вещество, в количестве от 0,1 мг/мл добавляют в 50 мкг/мл человеческого G-CSF (10 мМ фосфатный буфер, рН 7,0), и смесь доводят до осмотического давления 1 с использованием NaCl. Затем смешанный раствор стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр, имеющий размер пор 0,22 мм. Полученный раствор заливают в стерилизованный флакончик, после чего заполненный флакончик закрывают стерилизованной аналогичным образом резиновой пробкой, а затем закатывают алюминиевым колпачком для получения фармацевтического раствора для инъекций. Данный препарат для инъекций хранят в холодном темном месте при 10°С или ниже.

Пример 2 (пример препарата)

Полисорбат 80 (Tween 80: полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат), неионное поверхностно-активное вещество, в количестве от 0,1 мг/мл добавляют в 100 мкг/мл человеческого G-CSF (10 мМ фосфатный буфер, рН 7,0), и смесь доводят до осмотического давления 1 с использованием NaCl. Затем смешанный раствор стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр, имеющий размер пор 0,22 мм. Полученный раствор заливают в стерилизованный флакончик, после чего заполненный флакончик закрывают стерилизованной аналогичным образом резиновой пробкой, а затем закатывают алюминиевым колпачком для получения фармацевтического раствора для инъекций. Данный препарат для инъекций хранят в холодном темном месте при 10°С или ниже.

Пример 3 (пример препарата)

Полисорбат 20 (Tween 20: полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат), неионное поверхностно-активное вещество, в количестве 0,1 мг/мл, 10 мг/мл гипералиментной питательной смеси и 50 мг/мл маннита добавляют в 50 мкг/мл человеческого G-CSF (10 мМ фосфатный буфер, рН 7,0) с последующим разведением смеси. Затем раствор стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр, имеющий размер пор 0,22 мм. Полученный раствор заливают в стерилизованный флакончик, после чего заполненный флакончик наполовину закрывают стерилизованной аналогичным образом резиновой пробкой и лиофилизируют для получения лиофилизированного препарата для инъекций. Данный лиофилизированный препарат для инъекций хранят при комнатной температуре или ниже, и перед применением его следует растворить дистиллированной водой для инъекций.

Промышленная применимость

Ожидается, что средство для лечения ишемических заболеваний в соответствии с настоящим изобретением, которое содержит в качестве активного ингредиента человеческий G-CSF, проявит терапевтический эффект в относительно тяжелых случаях обструктивного артериосклероза, как продемонстрировано в экспериментальных примерах 1-3. Предполагается, что данный эффект G-CSF основан на стимуляции ангиогенеза. Таким образом, ожидается, что G-CSF будет терапевтически эффективным против других ишемических заболеваний, а именно травмы, реакции отторжения во время трансплантации, ишемического цереброваскулярного расстройства (например, апоплексии, инфаркта мозга), ишемического почечного заболевания, ишемического легочного заболевания, ишемического заболевания, связанного с инфекцией, ишемического заболевания конечностей и ишемической болезни сердца (ишемической миокардиопатиии, инфаркта миокарда, ишемической сердечной недостаточности).

Способы лечения в соответствии с настоящим изобретением удобны, безопасны и эффективны по сравнению с обычными способами лечения.

Реферат

Изобретение относится к области биофармакологии и медицины и касается средства для лечения ишемического заболевания, содержащее в качестве активного ингредиента человеческий колониестимулирующий фактор гранулоцитов (человеческий G-CSF). Введением данного терапевтического средства обеспечивается лечение, в частности, по поводу обструктивного артериосклероза, которое может устранить недостатки, связанные с обычными способами лечения, такими как кинезиотерапия, фармакотерапия и реваскуляризация. Кроме того, терапевтическое средство может применяться в качестве средства для лечения ишемического заболевания, такого как ишемическое цереброваскулярное расстройство или ишемическая болезнь сердца. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения. 8 н. и 8 з.п., ф-лы, 1 ил.

Формула