Реагент для определения концентрации и тест-полоски на его основе - RU2225005C2

Чертежи

Показать все 9 чертежа(ей)

Описание

Перекрестная ссылка на более раннюю патентную заявку
Настоящая заявка является продолжающей по отношению к патентной заявке США 09/161876, поданной 28 сентября 1998 г.

Предпосылки к созданию изобретения
1. Область изобретения
Настоящее изобретение относится к диагностическим композициям, которые позволяют измерять концентрации анализируемых веществ в биологических жидкостях, содержащих гемоглобин. Эти композиции основаны на предшественниках тетразольных красителей и вызывают подавление их восстановления, индуцированное гемоглобином.

2. Описание близких областей
Жировая ткань является одной из наиболее распространенных форм хранения энергии в организме. Она высвобождает запас жирных кислот в кровеносную систему, которые метаболизируются, главным образом, в печени. При протекании этого процесса происходит расходование жира и высвобождение энергии, которая становится доступной для нужд организма. Обычно расходуется небольшое количество жиров, жирные кислоты полностью метаболизируются с образованием диоксида углерода и воды, и это превращение не нарушает рН баланса в организме. Однако если в организме имеются недостаточные количества углеводов в силу, например, особенностей питания, тогда расход жиров и образование жирных кислот могут возрастать до потенциально вредных уровней. Помимо пациентов с такими особенностями пищевого рациона, пациенты, страдающие инсулинзависимым диабетом, также являются чувствительными к описанным процессам, поскольку у них нарушен метаболизм углеводов. Когда для покрытия энергетических затрат организма используется избыточное количество жирных кислот, образуется большое количество ацетоацетата, ацетона и бета-гидроксибутирата. Эти промежуточные соединения называют кетоновыми телами, а состояние, обусловливаемое их повышенным образованием, - кетоацидозом.

Кетоновые тела в норме могут вновь метаболизироваться в другие соединения при условии, что их не слишком много. Таким образом, в здоровом организме накапливается ничтожно малое количество этих соединений. Когда большое количество жиров метаболизируется в относительно малый промежуток времени или когда большую часть энергии организм получает за счет жиров, образуются огромные количества кетоновых тел. Избыточное образование этих метаболитов жира может вызывать некоторые неврологические расстройства, если эта проблема быстро не скорригирована.

Кетоновые тела имеются в крови и при превышении определенного порога экскретируются с мочой. Они легко обнаруживаются современными лабораторными способами. В среднем, процентные доли бета-гидроксибутирата, ацетоацетата и ацетона составляют 78%, 20% и 2% соответственно. В силу относительно низкой концентрации и высокой летучести ацетон определяется редко. Вместо него количественно определяют ацетоацетат путем реакции с нитропруссидом, а бета-гидроксибутират количественно определяют ферментативным методом. Тест-полоски для определения ацетоацетата существуют уже несколько десятилетий. Они действуют на основе реакции сочетания ионов нитропруссида с альдегидами и кетонами. Образец щелочной мочи или сыворотка крови взаимодействует с нитропруссидом в течение нескольких минут, в результате чего появляется пурпурное окрашивание. Интенсивность цвета указывает на концентрацию ацетоацетата. Однако с тестом взаимодействует ацетон, приводя к появлению завышенных показателей. Помимо этого, по мере выздоровления пациента от эпизода кетоацидоза уровень ацетоацетата в моче и крови повышается, что затрудняет диагностику.

Тест на бета-гидроксибутират является более пригодным для мониторинга концентраций кетоновых тел. Он основан на окислении бета-гидроксибутирата соответствующей дегидрогеназой в присутствии кофактора никотинамидадениндинуклеотида (NAD). (Строго говоря, в естественных условиях присутствует и окисляется только D-бета-гидроксибутират, но мы для краткости опускаем "D" в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения). В результате этого окисления образуется NADH, и его концентрацию измеряют непосредственно с помощью УФ-спектрофотометра. Следовательно, соответствующее изменение сигнала в спектре пропорционально концентрации определяемого вещества. К сожалению, возбуждение, соответствующее NADH, наблюдается в УФ-части спектра; таким образом, этот способ определения подходит только при наличии лабораторного оборудования. Другим способом мониторинга бета-гидроксибутирата является окисление NADH тетразольным соединением.

Тетразольные соединения обычно очень чувствительны к действию сильных оснований и света. Следовательно, необходимо предпринимать специальные меры для сохранения целостности этих соединений. Тем не менее тетразольные соединения сыграли важную роль в изучении тканевого метаболизма. Например, этот класс соединений использовали для изучения реакций анаэробного окисления и восстановления в клетке. Помимо этого, их широко применяют в клинической диагностике. Эти соединения обычно являются слабоокрашенными или бесцветными, которые после реакции восстановления в присутствии восстановителя дают интенсивно окрашенный формазан. Такие восстановители, как аскорбаты, сульфгидрильные соединения или варианты NADH, NADPH и PQQH₂ (восстановленный PQQ - пирролохинолинхинон), способны образовывать краситель.

Было установлено, что в клинической диагностике эти красители незаменимы для мониторинга образования NAD(P)H из их родительских соединений, NAD(P)+, в анаэробных реакциях (см., например, патент США 5 360 595, выданный 1 ноября 1994 г. авторам D. Bell и др.). Эта реакция окисления-восстановления протекает быстро и не чувствительна к кислороду. Получающееся окрашивание очень интенсивно и мало растворимо в воде.

В принципе, предшественники тетразольных красителей можно использовать для определения кетоновых тел и глюкозы в цельной крови. Однако тетразолий может восстанавливаться без помощи ферментов гемоглобином (Fe(II)) с образованием окрашенного формазана, если гемоглобин содержится не только в эритроцитах. Следовательно, свободный гемоглобин серьезно препятствует измерениям. В самом деле, в силу гемолиза и наличия в результате свободного гемоглобина в избытке относительно анализируемого соединения, при обычном определении кетоновых тел возникающий сигнал гемоглобина может перекрывать нужный сигнал. Определение глюкозы, особенно при нормальных концентрациях и выше, не подвержено таким неблагоприятным воздействиям. Когда эту реакцию осуществляют в образцах крови с высоким гематокритом или при повышенной температуре, когда окисление гемоглобина идет быстрее, помехи при измерении уровней глюкозы также становятся значительными. Поскольку гемолиз эритроцитов, который обусловливает наличие свободного гемоглобина, устранить нелегко, следует удалить эритроциты из образцов крови перед проведением анализа, если при этом используются тетразольные соединения.

Эритроциты могут быть удалены из образцов крови путем фильтрования через мембраны и фильтры, путем улавливания их с помощью химических реагентов или путем сочетания обеих методик. Методики фильтрования для отделения эритроцитов из цельной крови дороги и требуют значительно больших объемов образцов. Примером теста на кетоновые тела (бета-гидроксибутират) в крови, при котором используется фильтрование для удаления эритроцитов из образца цельной крови, является тест KetoSite^®, который можно приобрести в компании GDS Diagnostics, Elkhart, IN (см. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2-е издание, изд. Burtis et al., W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA, 1994, стр. 974). "Тест-карта", которая используется в этом тесте, имеет два фильтрующих слоя, что делает эту карту довольно дорогой и требует использования большого (25 мкл) образца крови. Помимо этого, кровь не должна быть гемолизирована.

Сочетание фильтрования и химического улавливания используется в тест-полосках для определения уровней глюкозы в крови Ames^® Glucometer Encore^TM, от компании Miles. В этой тест-полоске используются слой фильтрующего материала и вещество, способствующее агглютинации (картофельный лектин), для устранения помех со стороны эритроцитов. (См. Chu et al., European Pat. Appl. 0 638 805 А 2, опубл. 15 февраля 1995 г.).

Введение в систему окислителя для окисления гемоглобина в метгемоглобин является другим способом уменьшения помех со стороны гемоглобина. Хотя известно, что ферроцианиды трансформируют гемоглобин в метгемоглобин, они также разрушают и нужный продукт, NADH.

Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к реагенту для измерения концентрации анализируемых веществ в биологических жидкостях, содержащих гемоглобин. Этот реагент включает:
a) фермент дегидрогеназу, специфичную по отношению к анализируемому веществу,
b) никотинамидадениндинуклеотид (NAD), производное NAD, пирролохинолинхинон (PQQ) или производное PQQ,
c) предшественник тетразольного красителя,
d) фермент диафоразу или его аналог и
е) нитритную соль.

Этот реагент особенно подходит для изготовления покрытия на один или более субстратов с получением тест-полоски сухого реагента для измерения анализируемого вещества. Особенно предпочтительная тест-полоска включает:
a) подложку,
b) на этой подложке тест-слой, имеющий покрытие, которое включает:
i) фермент дегидрогеназу, специфичную по отношению к анализируемому веществу,
ii) никотинамидадениндинуклеотид (NAD), производное NAD, пирролохинолинхинон (PQQ) или производное PQQ,
iii) предшественник тетразольной краски и
iv) фермент диафоразу или его аналог и
с) на этом тест-слое впитывающий поверхностный слой, который покрыт нитритной солью.

Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет общий вид тест-полоски по настоящему изобретению.

Фиг.2 представляет подетальное изображение другой тест-полоски по настоящему изобретению.

Фиг. 3 представляет подетальное изображение еще одной тест-полоски по настоящему изобретению.

Фиг. 4 представляет схематичное изображение химизма анализа на кетоновые тела по настоящему изобретению.

Фиг.5 представляет схематичное изображение химизма анализа на глюкозу по настоящему изобретению.

Фиг. 6 представляет график, который показывает эффект нитрита как вещества, подавляющего гемоглобин, при анализе на кетоновые тела.

Фиг. 7 представляет график, который показывает эффект нитрита как вещества, подавляющего гемоглобин, при анализе на глюкозу.

Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к реагенту для измерения концентрации анализируемого соединения в биологических жидкостях, содержащих гемоглобин (таких как цельная кровь), путем получения концентрации восстановленной формы кофактора, такого как NADH, NAD(P)H или PQQH₂, который является мерой концентрации анализируемого соединения. Включение в реагент нитрита позволяет преодолеть помехи со стороны гемоглобина для измерения концентрации восстановленного кофактора. Этот реагент особенно пригоден, но не ограничен, для измерения уровней кетоновых тел и глюкозы.

Фиг. 1 изображает типичную тест-полоску 10 по настоящему изобретению, которая состоит из тест-слоя 12, фиксированного на подложке 14. Подложка может быть пластиковой, например из полистирола, нейлона или полиэфира, или металлической, или из любого другого известного подходящего материала. Тест-слой покрыт реагентом, который взаимодействует с анализируемым соединением с изменением окраски. Тест-слой предпочтительно включает впитывающий материал, такой как фильтровальная бумага или полимерная мембрана. Однако, поскольку эта реакция не требует присутствия кислорода, тест-слой может быть и не впитывающим, например пластиковой пленкой. Этот реагент включает фермент, специфичный по отношению к анализируемому соединению, агент, переносящий гидрид, предшественник тетразольной краски, подходящий кофактор фермента и вещество, подавляющее гемоглобин. Необязательно, можно включать буфер и стабилизатор для большей стабильности системы.

Как показано на фиг.2, тест-полоска может быть многослойной, с поверхностным слоем 16, перекрывающим тест-слой 12. При этой конструкции реагент может быть разделен между двумя слоями. Например, вещество, подавляющее гемоглобин, может быть нанесено на необязательный поверхностный слой 16, а остальные составляющие реагента - на тест-слой 12. Предпочтительно поверхностный слой 16 является впитывающим и служит в качестве распределяющего и адсорбирующего слоя для адсорбирования избытка образца. Образец наносят на поверхностный слой 16, и он проходит через тест-слой 12. Концентрацию анализируемого соединения определяют путем измерения изменения окраски через подложку 14 или, если подложечный слой 14 непрозрачен в том месте, где он прилежит к области реакции, - через необязательное окошечко или сквозное отверстие 18.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения, представленном на фиг.3, прокладка 20 отделяет поверхностный слой 16 от тест-слоя 12. Прокладка 20 предпочтительно представляет невпитывающую пластиковую пленку, имеющую клейкое покрытие (не показано) на обеих поверхностях. Канал 22 в прокладке 20 создает капиллярный путь для образца, который протекает через отверстие 24 в измерительный участок 26. Этот поток зависит от прохождения воздуха между поверхностью тест-слоя 12 и прилегающим слоем или, альтернативно, через необязательную отдушину 18. Изменение окраски в измерительном участке 26 отслеживается через необязательную отдушину/окошечко 18. Реагент может целиком помещаться на тест-слое 12 или, альтернативно, может быть разделен между тест-слоем и одним или более не впитывающими слоями 14 и 16. Следовательно, первая часть реагента может находиться на тест-слое, а вторая - на одном или более не впитывающих слоях. Когда мы упоминаем о том, что реагент "покрывает" или "находится на" слое, мы включаем сюда и такую возможность, при которой реагент абсорбируется слоем, особенно, если последний является впитывающим.

Ферментами, подходящими для анализов по настоящему изобретению, и соответствующими им анализируемыми соединениями являются: алкогольдегидрогеназа для спирта, формальдегиддегидрогеназа для формальдегида, глюкозодегидрогеназа для глюкозы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа для глюкозо-6-фосфата, глутаматдегидрогеназа для глутаминовой кислоты, глицериндегидрогеназа для глицерина, бета-гидроксибутиратдегидрогеназа для бета-гидроксибутирата, гидроксистероиддегидрогеназа для стероида, L-лактатдегидрогеназа для L-лактата, лейциндегидрогеназа для лейцина, малатдегидрогеназа для яблочной кислоты и пируватдегидрогеназа для пировиноградной кислоты.

Для активации фермента необходим соответствующий кофактор этого фермента. В зависимости от фермента могут использоваться следующие кофакторы: бета-никотинамидадениндинуклеотид (бета-NAD), бета-никотинамидадениндинуклеотидфосфат (бета-NADP), тионикотинамидадениндинуклеотид, тионикотинамидадениндинуклеотидфосфат, никотинамид 1,N6-этеноадениндинуклеотид, никотинамид 1,N6-этеноадениндинуклеотидфосфат и пирролохинолинхинон (PQQ). В присутствии фермента анализируемое соединение восстанавливает кофактор.

Следующим этапом в процессе образования красителя является отделение гидрида из восстановленного кофактора. Это может осуществляться или с помощью диафоразы, такой как липоатдегидрогеназа, ферредоксин-NАDР-редуктаза, липоамиддегидрогеназа, или с помощью аналога, такого как феназинметосульфат (PMS) или Meldola Blue. Кинетика и стабильность реакции являются главными факторами отбора переносящего гидрид агента или "отделителя" гидрида. Например, PMS является универсальным отделителем гидрида, поскольку у него относительно быстрая кинетика реакции с большинством тетразольных соединений, перечисленных ниже. По этой причине он является предпочтительным, когда кофактором является PQQ. PMS, однако, более чувствителен к свету, чем отделители гидрида на основе ферментов. Диафораза более стабильна и по этой причине более предпочтительна, когда кофактором является NAD.

Захваченный гидрид переносится на тетразольное соединение (предшественник красителя) с образованием окрашенного продукта. Наиболее подходящими тетразольными соединениями для этого процесса являются 2-(2'бензотиазолил)-5-стирил-3-(4'-фталгидразидил)тетразолий (BSPT), 2-бензотиазолил-(2)-3,5-дифенилтетразолий (BTDP), 2, 3-ди(4-нитрофенил)-тетразолий (DNP), 2,5-дифенил-3-(4-стирилфенил)тетразолий (DPSP), дистирилнитроголубой тетразолий (DS-NBT), 3,3'-[3,3'-диметокси-(1,1'-дифенил)-4,4'-диил]-бис[2-(4-нитрофенил)-5-фенил-2Н тетразолий (МВТ), 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н тетразолий (МТТ), 2-фенил-3-(4-карбоксифенил)-5-метил тетразолий (РСРМ), тетразолий голубой (ТВ), тиокарбамил нитроголубой тетразолий (TCNBT), тетра-нитроголубой тетразолий (TNBT), тетразолий фиолетовый (TV), 2-бензотиазотиазолил-3-(4-карбокси-2-метоксифенил)-5-[4-(2-сульфоэтилкарбамоил)фенил] -2Н-тетразолий (WST-4) и 2,2'-дибензотиазолил-5,5'-бис[4-ди(2-сульфоэтил)карбамоилфенил]-3,3'-(3,3'-диметокси-4, 4'-дифенилен)дитетразолий, динатриевая соль (WST-5). WST-5 является предпочтительной, поскольку она легко растворяется в водной среде, которая наиболее совместима с биологическими образцами. Помимо этого, полученное формазановое соединение демонстрирует сильное спектральное поглощение в пурпурно-синей части спектра, уменьшая, таким образом, необходимость в корректировке фонового сигнала от гемоглобина.

И, наконец, в реагенте присутствует вещество, подавляющее гемоглобин, для устранения нежелательной реакции с образованием краски между гемоглобином и тетразольным соединением. Роль вещества, подавляющего гемоглобин, заключается в окислении гемоглобина в метгемоглобин, который не вступает в реакцию с тетразолием или формазаном. Неожиданно оказалось, что нитритные соли, такие как нитрит натрия, нитрит калия и их производные, являются весьма эффективными в подавлении гемоглобина, в то же время не разрушая восстановленный кофактор (такой как NADH или PQQH₂). Нитриты эффективны также при повышенной температуре и в образцах с высоким гематокритом. Предпочтителен нитрит натрия, поскольку он хорошо растворим в воде, не токсичен и относительно дешев.

Несмотря на то, что реагент по настоящему изобретению может использоваться влажным химическим способом, например, в кювете, в предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к сухим тест-полоскам для анализа на бета-гидроксибутират или глюкозу в цельной крови. Тест-полоска состоит из мембранного тест-слоя предпочтительно из нейлона, который помещается между подложкой и поверхностным слоем. Подложка предпочтительно представляет из себя листок из полиэфира. Поверхностный слой может быть изготовлен из любого известного впитывающего материала. Предпочтительным материалом является пористый полиэтилен, обработанный метилолеоилтауратом натрия, который можно приобрести у компании Porex Corp. of Fairburn, GA. Мы упоминаем этот материал как "Porex". Тест-слой содержит реагент, включающий бета-гидроксибутират-дегидрогеназу (или глюкозодегидрогеназу), NAD (или PQQ), диафоразу (или PMS) и WST-5 (таблица 1 (или 3) ниже). Поверхностный слой из Porex содержит нитритный реагент (таблица 2).

При использовании тест-полоски на верхнюю поверхность поверхностного слоя из Porex наносят каплю цельной крови. После того как цельная кровь или гемолизированная кровь приходит в контакт с Роrех, нитрит натрия растворяется и вступает в реакцию с имеющимся свободным гемоглобином, что способствует устранению гемоглобина как вещества, мешающего исследованию. Полученный практически не содержащий гемоглобина образец попадает на нижележащий тест-слой посредством капиллярных или гравитационных сил. На тест-слое образец инициирует каскад реакций с образованием краски, концентрация которой пропорциональна концентрации анализируемого соединения в образце и может быть непосредственно измерена фотометром. Фиг.4 изображает реакцию по определению бета-гидроксибутирата с использованием фермента, NAD и диафоразы. Фиг. 5 изображает реакцию по определению глюкозы с использованием фермента, PQQ и PMS.

Фиг. 6 изображает изменение со временем оптической плотности образцов крови с гематокритом 55% и содержащих 0 и 15 мг/дл бета-гидроксибутирата, с нитритом и без него. Использовалась система NAD, а концентрация нитрита составляла 5 г/дл. В отсутствии нитрита гемоглобин восстанавливает тетразолий с получением непрерывно возрастающей концентрации красителя, с соответствующим повышением оптической плотности. Нитрит, удаляя гемоглобин (путем окисления), ограничивает цветообразование до уровня, который создают только кетоновые тела (т. е. бета-гидроксибутират), содержащиеся в образце. Изготовление тест-полоски, которая использовалась для получения данных, изображенных на графике, описано в примере 1, ниже.

Фиг. 7 показывает влияние нитрита на цветообразующую реакцию в системе глюкоза/PQQ. Образцы крови с гематокритом 60% содержали 0 или 100 мг/дл глюкозы и 0 или 5 г/дл нитрита. Температуру образцов, не содержавших глюкозы, поддерживали на уровне 35^oС. Этот график показывает, что настоящая система является эффективной при температурах до 35^oС и гематокрите до 60%. Изготовление использовавшейся тест-полоски описано в примере 2, ниже.

Следующие примеры демонстрируют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. В примере 1 анализируемым соединением является бета-гидроксибутират, а ферментом - бета-гидроксибутират-дегидрогеназа. В примере 2 анализируемым соединением является глюкоза, а ферментом - глюкозодегидрогеназа. Эти композиции могут быть легко модифицированы для применения с другими комбинациями анализируемое соединение/фермент, перечисленными ранее (см., например, Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2-е издание, изд. Burtis et al. , W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA, 1994, стр. 976-978 и 1174-1175). Эти примеры не являются ограничительными.

Пример 1
Нейлоновую 0,8 мкм мембрану от компании Cuno (Meriden, СТ, USA) погружали в реагент, указанный в таблице 1, до насыщения. Избыток реагента осторожно удаляли стеклянной палочкой. Полученную мембрану подвешивали для просушивания в сухожаровом шкафу с температурой 56^oС на 10 минут. Рогех (толщиной 0,6 мм) пропитывали раствором нитрита, указанным в таблице 2, а затем подвешивали для просушивания в сухожаровом шкафу с температурой 100^oС на десять часов. В конечном итоге мембрану ламинировали между полиэфирной заготовкой (0,4 мм полиэфир Melenex^® от компании ICI America, Wilmington, DE) и импрегнированным нитритом Роrех.

Пример 2
Процедуру примера 1 повторяли, за исключением того, что первым реагентом был реагент, указанный в таблице 3.

Реферат

Изобретение относится к диагностике с помощью реагента для определения концентрации анализируемого соединения в биологической жидкости, содержащей гемоглобин, такой как цельная кровь. Этот реагент включает фермент дегидрогеназу, специфичную по отношению к анализируемому соединению, пирролохинолинхинон (PQQ) или производное PQQ, предшественник тетразольной краски, фермент диафоразу или его аналог и нитритную соль. Этот реагент вызывает образование краски, что является мерой концентрации анализируемого соединения. Нитритная соль подавляет мешающее анализу образование краски, вызванное гемоглобином без помощи ферментов. Предпочтительно этот реагент используется в сухой тест-полоске для определения кетоновых тел, таких как бета-гидроксибутират и другие. Изобретение позволяет проводить реакцию быстро, реакция при этом не чувствительна к кислороду. 3 с. и 11 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл.

Формула