Нацеленные/иммуномодулирующие слитые белки и способы их получения - RU2636342C2

Чертежи

Показать все 96 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Заявка притязает на приоритет заявки на патент Индии №1689/СНЕ/2012, поданной 30 апреля 2012 г., и заявки на патент Индии №1690/СНЕ/2012, поданной 30 апреля 2012 г., содержание которых, таким образом, включено сюда посредством ссылки для любых задач.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится, в целом, к области получения слитых белков для использования в терапии рака и, конкретнее, к нуклеотидным последовательностям, кодирующим слитые белки, где слитые или химерные полипептиды содержат по меньшей мере одну направляющую группировку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, противодействующую иммунной толерантности раковых клеток.

Предшествующий уровень техники

Иммунная система обеспечивает организму человека средства для распознавания и защиты от микроорганизмов и веществ, распознаваемых как чужеродные или потенциально вредные. В то время как пассивная иммунотерапия рака моноклональными антителами и пассивным переносом Т-клеток, атакующих раковые клетки, продемонстрировали клиническую эффективность, задача активной терапевтической вакцинации, заключающаяся в индуцировании этих иммунных эффекторов и формировании иммунологической памяти против опухолевых клеток, остается трудновыполнимой. Идентифицировано несколько опухолеспецифических и опухоль-ассоциированных антигенов, но эти антигены обычно обладают слабой иммуногенностью, и опухоли используют различные механизмы для создания среды, вызывающей толерантость, позволяющей им избегать иммунологической атаки. Способы преодоления такой иммунной толерантности и активации высоких уровней антител и/или Т-клеточных ответов являются ключевыми для эффективной иммунотерапии рака. Еще важнее, необходимо исследовать отдельные белки и пути создания активного химерного полипептида с активной третичной структурой.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены полинуклеотиды, а также кодируемые ими полипептиды, экспрессируемые в раковых клетках. Эти полинуклеотиды и экспрессируемые полипептиды полезны во множестве терапевтических способов лечения рака. Согласно настоящему изобретению также предложены способы уменьшения роста раковых клеток посредством противодействия иммунной толерантности раковых клеток, где Т-клетки остаются активными и ингибируют рекрутинг Т-регуляторных клеток, которые, как известно, подавляют ответ иммунной системы на опухоль. Таким образом, химерные полипептиды, образованные полинуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению, полезны для лечения рака, благодаря экспрессированным слитым или химерным полипептидам.

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложены химерные полипептиды, содержащие по меньшей мере одну направляющую группировку для нацеливания на раковую клетку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, противодействующую иммунной толерантности раковой клетки, где направляющая группировка и иммуномодулирующая группировка соединены аминокислотным спейсером с достаточной длиной, измеряемой количеством аминокислотных остатков, так, что обе группировки могут успешно связываться с их отдельными мишенями. Альтернативно, направляющая группировка и иммуномодулирующая группировка, противодействующая иммунной толерантности раковой клетки, могут быть непосредственно связаны друг с другом. Химерные/слитые полипептиды по изобретению полезны для связывания с рецептором раковой клетки и уменьшения способности раковых клеток избегать иммунного ответа.

Настоящее изобретение основано на получении химерных/слитых белков посредством экспрессии полинуклеотидов, кодирующих слитые белки, противодействующие иммунной толерантности раковых клеток или приводящие к ее обратному развитию. Раковые клетки могут избегать устранения химиотерапевтическими агентами или нацеленными на опухоль антителами посредством определенных иммуносупрессивных механизмов в микроокружении опухоли, и такую способность раковых клеток называют иммунной толерантностью. Такие иммуносупрессивные механизмы включают иммуносупрессивные цитокины (например, трансформирующий фактор роста-бета (TGFβ)) и регуляторные Т-клетки и/или иммуносупрессивные миелоидные дендритные клетки (DC). Благодаря противодействию опухоль-индуцированной иммунной толерантности, согласно настоящему изобретению предложены эффективные композиции и способы для лечения рака, возможно в комбинации с другим существующим лечением рака. Согласно настоящему изобретению предложены способы противодействия опухоль-индуцированной иммунной толерантности и повышения противоопухолевой эффективности химиотерапии посредством активации и применения опосредованного Т-клетками адаптивного противоопухолевого действия на резистентные или диссеминированные раковые клетки.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложена молекула, содержащая по меньшей мере одну направляющую группировку, слитую с по меньшей мере одной иммуномодулирующей группировкой. Направляющая группировка специфически связывается с молекулой-мишенью, а иммуномодулирующая группировка специфически связывается с одной из следующих молекул: (1) трансформирующий фактор роста-бета (TGFβ); (2) лиганд-1 запрограммированной гибели-1 (PD-L1) или лиганд-2 запрограммированной гибели-1 (PD-L2); (3) лиганд активатора рецептора ядерного фактора-КВ (RANK) (RANKL); (4) рецептор трансформирующего фактора роста-бета (TGFβR); (5) молекула запрограммированной гибели-1 (PD1); (6) рецептор 4-1ВВ; или (7) активатор рецептора ядерного фактора-κВ (RANK).

В другом аспекте направляющая группировка включает антитело, фрагмент антитела, включая легкие или тяжелые цепи антитела, scFv или Fc-содержащий полипептид, специфически связывающиеся с компонентом опухолевой клетки, опухолевым антигеном, сосудистой сетью опухоли, микроокружением опухоли или инфильтрирующей опухоль иммунокомпетентной клеткой. Предпочтительно, направляющая группировка представляет собой антитело или его фрагмент, имеющие аффинность связывания в отношении компонента опухолевой клетки. Следует отметить, что каждая из тяжелой цепи и легкой цепи может по отдельности быть соединена с отдельной и отличной иммуномодулирующей группировкой. Кроме того, тяжелая или легкая цепь антительной направляющей группировки может быть соединена с иммуномодулирующей группировкой, которая, в свою очередь, может быть дополнительно соединена со второй иммуномодулирующей группировкой, где между двумя иммуномодулирующими группировками присутствует линкер.

В еще одном аспекте предложен химерный полипептид, содержащий опухоль-направляющую группировку и иммуномодулирующую группировку, содержащую молекулу, связывающуюся с трансформирующим фактором роста-бета (TGFβ), где опухоль-направляющая группировка представляет собой антитело, связывающееся с EGFR1 (рецептор эпидермального фактора роста 1), где антитело может представлять собой полноразмерное антитело, тяжелую цепь или легкую цепь. Опухоль-направляющая группировка может включать моноклональные антитела, нацеленные на раковую клетку, включая, без ограничения, цетуксимаб, трастузумаб, ритубксимаб, ипилимумаб, тремелимумаб, муромонаб-СD3, абциксимаб, даклизумаб, базиликсимаб, паливизумаб, инфликсимаб, гемтузумаб озогамицин, алемтузумаб, ибритумомаб тиуксетан, адалимумаб, омализумаб, тозитумомаб, 1-131 тозитумомаб, эфализумаб, бевацизумаб, панитумумаб, пертузумаб, натализумаб, этанерцепт, IGN101 (Aphton), волоциксимаб (Biogen Idee и PDL BioPharm), mAb против CD80 (Biogen Idee), mAb против CD23 (Biogen Idel), CAT-3888 (Cambridge Antibody Technology), CDP-791 (Imclone), эраптузумаб (Immunomedics), MDX-010 (Medarex и BMS), MDX-060 (Medarex), MDX-070 (Medarex), матузумаб (Merck), CP-675,206 (Pfizer), CAL (Roche), SGN-30 (Seattle Genetics), занолимумаб (zanolimumab) (Serono и Genmab), адекатумумаб (Sereno), ореговомаб (oregovomab) (United Therapeutics), нимотузумаб (YM Bioscience), ABT-874 (Abbott Laboratories), деносумаб (Amgen), AM 108 (Amgen), AMG 714 (Amgen), фонтолизумаб (Biogen Idee и PDL BioPharm), даклизумаб (Biogent Idee и PDL BioPharm), голимумаб (Centocor и Schering-Plough), CNTO 1275 (Centocor), окрелизумаб (Genetech и Roche), HuMax-CD20 (Genmab), белимумаб (HGS и GSK), эпратузумаб (Immunomedics), MLN1202 (Millennium Pharmaceuticals), визилизумаб (PDL BioPharm), тоцилизумаб (Roche), окрелизумаб (Roche), цертолизумаб пегол (UCB, ранее Celltech), экулизумаб (Alexion Pharmaceuticals), пекселизумаб (Alexion Pharmaceuticals и Procter & Gamble), абциксимаб (Centocor), ранибизимумаб (ranibizimumab) (Genetech), меполизумаб (GSK), TNX-355 (Tanox) или MYO-029 (Wyeth).

В другом аспекте опухоль-направляющая группировка представляет собой моноклональное антитело, связывающееся с HER2/Neu (рецептор эпидермального фактора роста человека 2), CD20, CTLA4, EGFR1, где антитело может представлять собой полноразмерное антитело, тяжелую цепь или легкую цепь.

В еще одном аспекте направляющая группировка представляет собой молекулу, специфически связывающуюся с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR1, Erb-B1), HER2/neu (Erb-B2), CD20, антигеном-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4), необходимым для функционирования Treg-клеток (CD152), Н-1 и интерлейкином-6 (IL-6).

В еще одном аспекте направляющая группировка специфически связывается с компонентом регуляторной Т-клетки (Treg), миелоидной супрессорной клетки или дендритной клетки. В другом аспекте направляющая группировка специфически связывается с одной из следующих молекул: (1) CD4; (2) CD25 (рецептор IL-2a; IL-2aR); (3) рецептор трансформирующего фактора роста-бета (TGFβR); (6) трансформирующий фактор роста-бета (TGFβ); (7) молекула запрограммированной гибели-1 (PD1); (8) лиганд запрограммированной гибели-1 (PD-L1 или PD-L2).

В другом аспекте иммуномодулирующая группировка специфически связывается с одной из следующих молекул: (1) трансформирующий фактор роста-бета (TGFβ); (2) лиганд запрограммированной гибели-1 (PD-L1 или PD-L2); или рецептор 4-1ВВ.

В еще одном аспекте иммуномодулирующая группировка включает молекулу, связывающуюся с TGFβ и ингибирующую его функцию. Конкретно, иммуномодулирующая группировка включает внеклеточный лиганд-связывающий домен рецептора трансформирующего фактора роста-бета TGFβRII, TGFβRIIb или TGFβRIII. В другом аспекте иммуномодулирующая группировка включает внеклеточный лиганд-связывающий домен (ECD) TGFβRII. Кроме того, иммуномодулирующая группировка может включать лиганд Н-4-1ВВ, связывающийся с рецептором 4-1ВВ, для стимуляции Т-клеток для помощи в эрадиации опухоли.

В еще одном аспекте направляющая группировка включает антитело, фрагмент антитела или полипептид, специфически связывающиеся с HER2/neu, EGFR1, CD20 или антигеном-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4), и где иммуномодулирующая группировка включает внеклеточный лиганд-связывающий домен TGF-βRII.

В еще одном аспекте иммуномодулирующая группировка включает молекулу, специфически связывающуюся с лигандом-1 молекулы запрограммированной гибели-1 (PD-L1) или лигандом-2 молекулы запрограммированной гибели-1 (PD-L2) и ингибирующую их активность. В другом аспекте иммуномодулирующая группировка включает внеклеточный лиганд-связывающий домен или эктодомен молекулы запрограммированной гибели-1 (PD1).

В другом аспекте направляющая группировка включает антитело, фрагмент антитела или полипептид, специфически связывающиеся с HER2/neu, EGFR1, CD20, антигеном-4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA-4), CD25 (рецептором IL-2a; IL-2aR) или CD4, и где иммуномодулирующая группировка включает внеклеточный лиганд-связывающий домен или эктодомен молекулы запрограммированной гибели-1 (PD1).

В еще одном аспекте направляющая группировка включает антитело или фрагмент антитела, специфически связывающиеся с CD20, и иммуномодулирующая группировка включает последовательность трансформирующего фактора роста-β (TGFβ).

В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложены оптимизированные гены, кодирующие слитый полипептид, содержащий по меньшей мере одну направляющую группировку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, для лечения рака у субъекта-человека, где оптимизированные гены модифицированы для повышения их экспрессии у субъекта-человека, предпочтительно, оптимизированные гены содержат последовательности, кодирующие направляющую группировку или иммуномодулирующую группировку, выбранные из SEQ ID NO: 12-28.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложен вектор, содержащий оптимизированные гены для лечения рака у субъекта-человека, модифицированные для увеличения содержания CG-последовательностей. Предпочтительно, вектор содержит последовательности, кодирующие по меньшей мере одну направляющую группировку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, выбранные из SEQ ID NO: 12-28.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака у субъекта, включающий:

а) обеспечение по меньшей мере одного рекомбинантного вектора, содержащего нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере одну направляющую группировку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, выбранные из SEQ ID NO: 12-28; и

б) введение рекомбинантного вектора субъекту в таких условиях, что указанные нуклеотидные последовательности экспрессируются на уровне, обеспечивающем терапевтически эффективное количество кодируемых слитых белков у субъекта.

В альтернативном аспекте согласно настоящему изобретению предложен вектор экспрессии, содержащий полинуклеотиды оптимизированных генов, кодирующих по меньшей мере одну направляющую группировку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, выбранных из SEQ ID NO: 12-28.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложена рекомбинантная клетка-хозяин, трансфицированная полинуклеотидом, кодирующим пептид слитого белка по настоящему изобретению.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения слитого белка по настоящему изобретению, включающий:

а) трансфицирование клетки-хозяина полинуклеотидными последовательностями, кодирующими химерные слитые белки, с получением трансформированной клетки-хозяина, где полинуклеотидные последовательности кодируют по меньшей мере одну направляющую группировку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку и выбраны из SEQ ID NO: 12-28; и

б) содержание трансформированной клетки-хозяина в биологических условиях, достаточных для экспрессии пептида.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению химерного слитого белка, как показано на Фиг. 1-15, в применении лекарственного средства для лечения рака. Предпочтительно, слитый белок экспрессирован в клетке-хозяине и такие экспрессированные белки вводят в терапевтическом количестве для уменьшения эффектов рака у субъекта, нуждающегося в этом.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения опухолевого заболевания. Способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, одного или более слитых белков по изобретению, в различных аспектах субъекту вводят одну или более молекул по изобретению в комбинации с другой противораковой терапией, в одном аспекте противораковая терапия включает химиотерапевтическую молекулу, антитело, низкомолекулярный ингибитор киназ, гормональный агент или цитотоксический агент. Противораковая терапия может также включать ионизирующее излучение, ультрафиолетовое излучение, криоабляцию, термическую абляцию или радиочастотную абляцию.

В еще одном аспекте согласно настоящему изобретению предложен способ получения терапевтически активных слитых белков «антитело-пептид», включающий:

а) получение кодон-оптимизированной последовательности указанного слитого белка;

б) клонирование оптимизированной последовательности указанного слитого белка в клетке-хозяине, способной к временной или продолжительной экспрессии;

в) выращивание клетки-хозяина в среде в условиях, подходящих для роста и предоставление клетке-хозяину возможности экспрессировать клонированный белок; и

г) очистку экспрессированного белка и, возможно, проверку способности белка к биспецифическому связыванию с его мишенями.

В предпочтительном воплощении терапевтически активные слитые белки «антитело-пептид» представляют собой направляющее антитело, слитое с одной или более иммуномодулирующими группировками, противодействующими иммунной толерантности раковой клетки. В одном аспекте иммуномодулирующая группировка может быть присоединена аминокислотным спейсером, длина которого достаточна для обеспечения возможности биспецифического связывания молекулы. Иммуномодулирующая группировка может быть связана с С-концом тяжелой или легкой цепи антитела.

В предпочтительном способе, как описано выше, иммуномодулирующая группировка представляет собой (1) трансформирующий фактор роста-бета (ΤGFβ), (2) молекулу запрограммированной гибели-1 (PD1), (3) CTLA-4 или (4) 4-1ВВ или их части, и направляющее антитело связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR1, Erb-B1), HER2/neu (Erb-B2), CD20, CD6, CTLA-4, муцином-1 (MUC-1), интерлейкином-2 (IL-2) или интерлейкином-6 (IL-6).

Способ по настоящему изобретению обеспечивает нуклеотидные последовательности, кодирующие терапевтически активные слитые белки «антитело-пептид», и такая экспрессия может быть проведена в транзиторной клеточной линии или стабильной клеточной линии. Временную экспрессию осуществляют посредством трансфицирования или трансформирования хозяина векторами, переносящими слитые белки в клетки-хозяева, являющиеся клетками млекопитающих.

После экспрессии слитых пептидов предпочтительно подвергают их очистке и анализируют их in vitro для проверки их биспецифичности, то есть способности связываться как направляющей группировкой, так и иммуномодулирующей группировкой. Такие анализы могут включать анализ in vitro, такой как ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ) или анализы связывания с NК/T-клетками для подтверждения бифункционального связывания с мишенями или стимуляции иммунокомпетентных клеток.

Следует отметить, что, если определенные слитые пептиды демонстрируют желаемую биспецифичность, такие слитые пептиды отбирают для субклонирования в стабильную клеточную линию для экспрессии и очистки в большем масштабе. Такие стабильные клеточные линии раскрыты ранее, например линии клеток млекопитающих, включая, без ограничения, НЕК293 (клетки почек эмбриона человека), СНО (клетки яичников китайского хомячка) или NSO.

В другом аспекте культуральная среда может быть улучшена дополнением такой среды. Например, культуральная среда может содержать соль двухвалентного переходного металла, которую добавляют в клеточную культуру изначально или в режиме подпитки, для уменьшения накопления лактата во время культивирования и/или для уменьшения неоднородности слитых белков. Желаемая соль переходного металла содержит ион цинка, и добавление иона металла может быть проведено на разных фазах получения.

Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания, графических материалов и формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг. 1 показаны аминокислотные последовательности слитого белка «антитело против HER2/neu-TGFβRII» в константной области LC (легкая цепь) с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 1) и легкой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 2), присоединенной к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, и где линкер (SEQ ID NO: 3) расположен между легкой цепью антитела против HER2/neu и TGFβRII и показан курсивом.

На Фиг. 2 показаны аминокислотные последовательности слитого белка «антитело против EGFR1-TGFβRII» в константной области LC с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 5) и аминокислотной последовательностью легкой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 6), присоединенной к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, и где линкер (SEQ ID NO: 3) расположен между легкой цепью антитела против EGFR1 и TGFβRII и показан курсивом.

На Фиг. 3 показаны аминокислотные последовательности слитого белка «антитело против CTLA4-TGFβRII» в константной области LC с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 7) и аминокислотной последовательностью легкой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 8), присоединенной к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, и где линкер (SEQ ID NO: 3) расположен между легкой цепью антитела против CTLA4 и TGFβRII и показан курсивом.

На Фиг. 4 показаны аминокислотные последовательности слитого белка «НС (тяжелая цепь) антитела против HER2/neu-4-1BB» и «LC-TGFβRII» с аминокислотной последовательностью слитого белка «НС антитела против HER2/neu-4-1BB», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 1) присоединена клинкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 2) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, и где линкер (SEQ ID NO: 3) расположен между легкой цепью антитела против HER2/neu и TGFβRII и показан курсивом.

На Фиг. 5 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС антитела против EGFR1-4-1BB» и «LC-TGFβRII» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против EGFR1-4-1ВВ», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 5) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 6) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 6 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС антитела против CTLA4-4-1BB» и «LC-TGFβRII» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против CTLA4-4-1ВВ», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 7) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 8) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 7 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС антитела против HER2/neu-PD1» и «LC-TGFβRII» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против HER2/neu-PD1», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 1) присоединена клинкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO:10) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 2) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 8 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС антитела против EGFR1-PD1» и «LC-TGFβRII» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против EGFR1-PD1», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 5) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO:10) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 6) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 9 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС антитела против CTLA4-PD1» и «LC-TGFβRII» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против CTLA4-PD1», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 7) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 10) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 8) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 10 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС антитела против HER2/neu-TGFβRII-4-1BB» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против HER2/neu-TGFβRII-4-1BB», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 1) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 2).

На Фиг. 11 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС антитела против EGFR1-TGFβRII-4-1BB» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против EGFR1-TGFβRII-4-1BB», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 5) последовательность присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 6).

На Фиг. 12 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС антитела против CTLA4-TGFβRII-4-1ВВ» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против CTLA4-ΤGΡβRΙΙ-4-1ΒΒ», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 7) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 8).

На Фиг. 13 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС антитела против HER2/neu-TGFβRII-PD1» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против HER2/neu-TGFβRII-PD1», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 1) присоединена клинкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 10) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 2).

На Фиг. 14 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС антитела против EGFR1-PD1» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против EGFR1-TGFβRII-PD1», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 5) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 10) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 6).

На Фиг. 15 показан слитый белок «НС антитела против CTLA4-TGFβRII-PD1» с аминокислотной последовательностью слитого белка «тяжелая цепь антитела против CTLA4-TGFβRII-PD1», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 7) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 8) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 8).

На Фиг. 16 показаны нуклеотидные последовательности константной области тяжелой цепи антитела против HER2/neu с линкером (SEQ ID NO: 12) и ECD TGFβRII (SEQ ID NO: 13), кодон-оптимизированные для экспрессии в клетке СНО.

На Фиг. 17 показаны нуклеотидные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 14), вариабельной области легкой цепи антитела против HER2/neu (SEQ ID NO: 15) и константной области тяжелой цепи антитела против EGFR1 с линкером (SEQ ID NO: 16), кодон-оптимизированные для экспрессии в клетке СНО.

На Фиг. 18 показаны нуклеотидные последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 17), вариабельной области легкой цепи антитела против EGFR1 (SEQ ID NO: 18), вариабельной области тяжелой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 19) и вариабельной области легкой цепи антитела против CTLA4 (SEQ ID NO: 20), кодон-оптимизированные для экспрессии в клетке СНО.

На Фиг. 19 показаны нуклеотидные последовательности молекулы lgG1 против CD20 (SEQ ID NO: 21), вариабельной области тяжелой цепи антитела против CD20 (SEQ ID NO: 22) и вариабельной области легкой цепи антитела против CD20 (SEQ ID NO: 23), кодон-оптимизированные для экспрессии в клетке СНО.

На Фиг. 20 показаны нуклеотидные последовательности 4-1ВВ (SEQ ID NO: 24) и тяжелой цепи антитела против IL-6R (SEQ ID NO: 25), кодон-оптимизированные для экспрессии в клетке СНО.

На Фиг. 21 показаны нуклеотидные последовательности вариабельной области легкой цепи антитела против IL-6R (SEQ ID NO: 26), тяжелой цепи антитела против 4-1ВВ (SEQ ID NO: 27) и вариабельной области легкой цепи антитела против 4-1ВВ (SEQ ID NO: 28), кодон-оптимизированные для экспрессии в клетке СНО.

На Фиг. 22 показан анализ антитела против HER2/neu-TGFβRII и антитела против EGFR1-TGFβRII, очищенных с использованием белка А, в 12%-м PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле).

На Фиг. 23А показаны образцы антитела против HER2/neu-TGFβRII, проанализированные посредством хроматографии с белком A/SEC, и на Фиг. 23В показаны образцы антитела против EGFR1-TGFβRII, проанализированные посредством хроматографии с белком A/SEC.

На Фиг. 24А показано, что молекулы антитела против HER2/neu-TGFβRII и антитела против EGFR1-TGFβRII связываются с ΤGFβ, указывая на функциональность слитого белка, и на Фиг. 24 В показано, что антитело против HER2-TGFβRII ингибирует пролиферацию клеточной линии ВТ474 аналогично Bmab200 (герцептину).

На Фиг. 25 показано, что антитело против EGFR1-TGFβRII ингибирует пролиферацию клеточной линии А431 аналогично цетуксимабу.

На Фиг. 26 показана АDСС(антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность)-активность антитела против HER2-TGFβRII на клетках ВТ474, аналогичная ADCC-активности Bmab200 (герцептина).

На Фиг. 27 показана ADCC-активность антитела против EGFR1-TGFβRII на клетках А431, аналогичная ADCC-активности цетуксимаба.

На Фиг. 28 показана ADCC-активность антитела против EGFR1-4-1BB в сравнении с антителом против EGFR1-TGFβRII и цетуксимабом.

На Фиг. 29А показано, что связывающая активность антитела против CTLA4-TGFβRII в отношении TGFβ1 сопоставима с антителом против EGFR1-TGFβRII, и на Фиг. 29В показана связывающая активность антитела против CTLA4-TGFβRII в отношении CTLA4.

На Фиг. 30А показана связывающая активность антитела против CTLA4-TGFβRII, определяющая уровень связывания с PD1-Fc, и на Фиг. 30В показана связывающая активность антитела против EGFR1-4-1BB, определяющая связывание с 4-1BBL.

На Фиг. 31 показана связывающая активность антитела против EGFR1-4-1ВВ в отношении EGFR, и на Фиг. 31В показана связывающая активность PD1-FC-4-1BB в отношении PDLI-Fc.

На Фиг. 32 показана связывающая активность антитела против EGFR1-PD1 в отношении EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) и PD1.

На Фиг. 33 показаны фотографии экспрессированных белков и их восстановительное алкилирование.

На Фиг. 34А показан массовый спектр легкой цепи (LC) (восстановленной) слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFPRII», и на Фиг. 34В показан развернутый массовый спектр LC (восстановленной) слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII».

На Фиг. 35 показан массовый спектр тяжелой цепи (НС) (восстановленной) слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII».

На Фиг. 36А показан массовый спектр LC (восстановленной) антитела против EGFR1-ECD TGFβRII, и на Фиг. 36В показан развернутый массовый спектр LC (восстановленной) антитела против EGFR1-ECD TGFβRII.

На Фиг. 37 показан массовый спектр НС (восстановленной) антитела против EGFR1-ECD TGFβRII.

На Фиг. 38А показана UV-хроматограмма триптических пептидов слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII», и на Фиг. 38В показана общая ионная хроматограмма (TIC) триптических пептидов слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII».

На Фиг. 39, 40 и 41 приведены перечни прогнозируемых/наблюдаемых триптических пептидов легкой цепи, тяжелой цепи и соединительного мотива слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII», соответственно.

На Фиг. 42А показана UV-хроматограмма триптических пептидов слитого белка «антитело против EGFR1-ECD TGFβRII», и на Фиг. 38В показана общая ионная хроматограмма (TIC) триптических пептидов слитого белка «антитело против EGFR1-ECD TGFβRII».

На Фиг. 43 приведен перечень прогнозируемых/наблюдаемых триптических пептидов легкой цепи слитого белка «антитело против EGFR1-ECD TGFβRII».

На Фиг. 44 показан перечень прогнозируемых/наблюдаемых триптических пептидов тяжелой цепи слитого белка «антитело против EGFR1-ECD TGFβRII».

На Фиг. 45 показан перечень прогнозируемых/наблюдаемых триптических пептидов тяжелой цепи слитого белка «антитело против EGFR1-ECD TGFβRII».

На Фиг. 46 показаны аминокислотные последовательности слитого белка «кантузумаб-TGFβRII» в константной области LC с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи кантузумаба (SEQ ID NO: 29) и аминокислотной последовательностью легкой цепи кантузумаба (SEQ ID NO: 30), присоединенной к аминокислотным остаткам ΤGFβRΙΙ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, и где линкер (SEQ ID NO: 3) расположен между легкой цепью кантузумаба и TGFβRII и показан курсивом.

На Фиг. 47 показаны аминокислотные последовательности слитого белка «циксутумумаб-TGFβRII» в константной области LC с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи циксутумумаба (SEQ ID NO: 31) и аминокислотной последовательностью легкой цепи циксутумумаба (SEQ ID NO: 32), присоединенной к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, и где линкер (SEQ ID NO: 3) расположен между легкой цепью циксутумумаба и TGFβRII и показан курсивом.

На Фиг. 48 показаны аминокислотные последовательности слитого белка «кливатузумаб-TGFβRII» в константной области LC с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи кливатузумаба (SEQ ID NO: 33) и аминокислотной последовательностью легкой цепи кливатузумаба (SEQ ID NO: 34), присоединенной к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, и где линкер (SEQ ID NO: 3) расположен между легкой цепью кливатузумаба и TGFβRII и показан курсивом.

На Фиг. 49 показаны аминокислотные последовательности слитого белка «притумумаб-TGFβRII» в константной области LC с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи притумумаба (SEQ ID NO: 35) и аминокислотной последовательностью легкой цепи притумумаба (SEQ ID NO: 36), присоединенной к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, и где линкер (SEQ ID NO: 3) расположен между легкой цепью притумумаба и TGFβRII и показан курсивом.

На Фиг. 50 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС кантузумаба-4-1ВВ» и «LC-TGFβRII», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи кантузумаба (SEQ ID NO: 29) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи кантузумаба (SEQ ID NO: 30) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 51 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС циксутумумаба-4-1ВВ» и «LC-TGFβRII», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи циксутумумаба (SEQ ID NO:31) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность 4-1 ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи циксутумумаба (SEQ ID NO: 32) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 52 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС кливатузумаба-4-1ВВ» и «LC-TGFβRII», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи кливатузумаба (SEQ ID NO: 33) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность 4-1 ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи кливатузумаба (SEQ ID NO: 34) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 53 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС притумумаба-4-1ВВ» и «LC-TGFβRII», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи притумумаба (SEQ ID NO: 35) присоединена клинкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи притумумаба (SEQ ID NO: 36) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 54 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС кантузумаба-PD1» и «LC-TGFβRII», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи кантузумаба (SEQ ID NO: 29) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO:10) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи кантузумаба (SEQ ID NO: 30) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 55 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС циксутумумаба-PD1» и «LC-TGFβRII», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи циксутумумаба (SEQ ID NO: 31) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 10) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи циксутумумаба (SEQ ID NO: 32) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 56 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС кливатузумаба-PD1» и «LC-TGFβRII», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи кливатузумаба (SEQ ID NO: 33) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 10) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи кливатузумаба (SEQ ID NO: 34) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 57 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС притумумаба-PD1» и «LC-TGFβRII», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи притумумаба (SEQ ID NO: 35) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 10) показана прописными буквами, и аминокислотная последовательность легкой цепи притумумаба (SEQ ID NO: 36) присоединена к аминокислотным остаткам TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4), показанным жирным шрифтом, с линкером (SEQ ID NO: 3) между ними.

На Фиг. 58 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС канутзумаба-TGFβRII-4-1BB», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи кантузумаба (SEQ ID NO: 29) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи кантузумаба (SEQ ID NO: 30).

На Фиг. 59 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС циксутумумаба-TGFβRII-4-1ВВ», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи циксутумумаба (SEQ ID NO: 31) присоединена клинкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи циксутумумаба (SEQ ID NO: 32).

На Фиг. 60 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС кливатузумаба-TGFpRII-4-1ВВ», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи кливатузумаба (SEQ ID NO: 33) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи кливатузумаба (SEQ ID NO: 34).

На Фиг. 61 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС притумумаба-TGFβRII-4-1BB», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи притумумаба (SEQ ID NO: 35) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность 4-1ВВ (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 9) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи притумумаба (SEQ ID NO: 36).

На Фиг. 62 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС кантузумаба-TGFβRII-PD1», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи кантузумаба (SEQ ID NO: 29) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 10) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи кантузумаба (SEQ ID NO: 30).

На Фиг. 63 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС циксутумумаба-TGFβRII-PD1», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи циксутумумаба (SEQ ID NO: 31) присоединена клинкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 10) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи циксутумумаба (SEQ ID NO: 32).

На Фиг. 64 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС кливатузумаба-TGFβRII-PD1», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи кливатузумаба (SEQ ID NO: 33) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 10) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи кливатузумаба (SEQ ID NO: 34).

На Фиг. 65 показана аминокислотная последовательность слитого белка «НС притумумаба-TGFβRII-PD1», где аминокислотная последовательность тяжелой цепи притумумаба (SEQ ID NO: 35) присоединена к линкеру (SEQ ID NO: 3), показанному курсивом, и последовательность TGFβRII (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 4) показана жирным шрифтом, и аминокислотная последовательность PD1 (иммуномодулирующая группировка) (SEQ ID NO: 10) показана прописными буквами, с линкером между ними (SEQ ID NO: 11), включая аминокислотную последовательность легкой цепи притумумаба (SEQ ID NO: 36).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если не указано иное, при практическом использовании настоящего изобретения будут применены обычные иммунологические, молекулярно-биологические, микробиологические методики, методики клеточной биологии и методики рекомбинантных ДНК, входящие в компетенцию специалистов в данной области. См., например, Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel, et al. eds., (1987)); серию METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, и ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987)).

Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют то же значение, в котором их обычно понимает специалист в области, к которой относится данное изобретение. Терминология, использованная здесь, приведена лишь с целью описания определенных воплощений и не ограничивает изобретение. При использовании в описании изобретения и приложенной формуле изобретения формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст ясно не требует иного. Следующие термины имеют приведенные ниже значения.

При использовании здесь термин «полинуклеотид» обозначает последовательность нуклеотидов, соединенных фосфодиэфирными связями. Полинуклеотиды представлены здесь в направлении от 5'-конца к 3'-концу. Полинуклеотид по настоящему изобретению может представлять собой молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновой кислоты (РНК). Там, где полинуклеотид представляет собой молекулу ДНК, эта молекула может представлять собой ген или молекулу кДНК (комплементарная ДНК). Нуклеотидные основания указаны здесь однобуквенным кодом: аденин (А), гуанин (G), тимин (Т), цитозин (С), инозин (I) и урацил (U). Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть получен с применением стандартных методик, хорошо известных специалисту в данной области.

При использовании здесь термин «оптимизированный» означает, что нуклеотидная последовательность изменена для кодирования аминокислотной последовательности с использованием кодонов, предпочтительных при получении в клетке или организме, обычно в эукариотической клетке, например клетке Pichia, клетке Trichoderma, клетке яичника китайского хомячка (СНО) или человеческой клетке. Оптимизированную нуклеотидную последовательность конструируют таким образом, чтобы она сохраняла всю или, по возможности, большую часть аминокислотной последовательности, исходно кодируемой начальной нуклеотидной последовательностью, также известной как «исходная» последовательность. Оптимизированные последовательности, приведенные здесь, конструированы для включения кодонов, предпочтительных для клеток млекопитающих (СНО), тем не менее, здесь также предусмотрена оптимизированная экспрессия этих последовательностей в других эукариотических клетках. Аминокислотные последовательности, кодируемые оптимизированными нуклеотидными последовательностями, также называют оптимизированными. При использовании здесь термин «экспрессия» определяют как транскрипцию и/или трансляцию определенной нуклеотидной последовательности под действием ее промотора.

При использовании здесь термин «трансфекция» клетки обозначает введение генетического материала в клетку с целью генетической модификации клетки. Трансфекция может быть проведена множеством способов, известных в данной области, таких как трансдукция или электропорация.

При использовании здесь термин «рак» определяют как заболевание, характеризующееся быстрым и неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Раковые клетки могут распространяться местно или через кровоток и лимфатическую систему в другие части организма. Примеры различных видов рака включают, без ограничения, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак кожи, рак глаза, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почки, рак печени, злокачественные опухоли головного мозга, лимфомы, лейкозы, рак легкого и тому подобное.

Термин «трансген» использован в широком смысле для обозначения любой гетерологичной нуклеотидной последовательности, включенной в вектор для экспрессии в клетке-мишени, и связанных с ней последовательностей контроля экспрессии, таких как промоторы. Специалистам в данной области известно, что выбор последовательностей контроля экспрессии будет основан на их способности стимулировать экспрессию трансгена в клетке-мишени. Примером трансгена является нуклеиновая кислота, кодирующая химерный слитый белок по настоящему изобретению.

При использовании здесь термин «вектор экспрессии» обозначает вектор, содержащий ну клеи новокислотную последовательность, кодирующую по меньшей мере часть транскрибируемого генного продукта. Векторы экспрессии могут содержать множество контрольных последовательностей, что относится к нуклеиновокислотным последовательностям, необходимым для транскрипции и, возможно, трансляции функционально связанной с ними кодирующей последовательности у определенного организма-хозяина. В дополнение к контрольным последовательностям, управляющим транскрипцией и трансляцией, векторы и векторы экспрессии могут содержать нуклеиновокислотные последовательности, выполняющие также другие функции. Термин также включает рекомбинантную плазмиду или вирус, содержащие полинуклеотид для доставки в клетку-хозяина in vitro или in vivo. Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой транзиторную клеточную линию или стабильную клеточную линию и, более предпочтительно, клетку хозяина, являющуюся клеткой млекопитающего, и выбранную из группы, состоящей из НЕК293, СНО и NSO.

При использовании здесь термин «субъект» обозначает человека или позвоночное животное, включая собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, овцу, козу, цыпленка, обезьяну, крысу и мышь.

При использовании здесь термин «терапевтически эффективное количество» обозначает количество рассматриваемого соединения, которое вызовет в ткани, системе, животном или человеке биологический или медицинский ответ, которого добивается исследователь, ветеринар, врач или другой клиницист.

При использовании здесь термин «фармацевтически приемлемый» означает, что носитель, разбавитель или эксципиент должны быть совместимы с другими ингредиентами композиции и безвредны для реципиента.

При использовании здесь термин «рекомбинантный» обозначает генетический объект, отличающийся от обычно обнаруживаемого в природе. Применительно к полинуклеотиду или гену это означает, что полинуклеотид является продуктом различных комбинаций стадий клонирования, рестрикции и/или лигирования и других способов, приводящих к получению конструкции, отличающейся от полинуклеотида, обнаруживаемого в природе.

При использовании здесь термин «по существу идентичная» или «по существу сходная», относящийся к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту, означает, что при оптимальном выравнивании, с подходящими нуклеотидными вставками или делециями, с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью) идентичность нуклеотидной последовательности составляет по меньшей мере приблизительно от 95 до 99% последовательности.

Термины «пептид», «полипептид» и «белок» использованы взаимозаменяемо для обозначения последовательности полимера из по меньшей мере двух аминокислот, ковалентно связанных амидной связью.

При использовании здесь применительно к пептидам термин «гомологичный» относится к сходству аминокислотных последовательностей двух пептидов. Когда аминокислотное положение в обоих пептидах занято идентичными аминокислотами, они гомологичны по этому положению. Таким образом, «по существу гомологичный» обозначает аминокислотную последовательность, в значительной степени, но не полностью гомологичную и сохраняющую большую часть или всю активность последовательности, которой она гомологична. При использовании здесь «по существу гомологичный» обозначает последовательность, по меньшей мере на 50% идентичную, и предпочтительно по меньшей мере на 75% и более предпочтительно на 95% гомологичную эталонному пептиду. Возможно включение дополнительных модификаций пептидных последовательностей, таких как незначительные изменения, делеции, замены или дериватизации аминокислотной последовательности последовательностей, раскрытых здесь, при условии, что пептид имеет по существу такую же активность или функцию, как немодифицированные пептиды. Следует отметить, что модифицированный пептид будет сохранять активность или функцию, ассоциированную с немодифицированным пептидом, модифицированный пептид будет обычно иметь аминокислотную последовательность, «по существу гомологичную» аминокислотной последовательности немодифицированной последовательности.

При использовании здесь термин «введение» определяют как фактическое физическое введение композиции в или на (там, где это уместно) субъекта-хозяина. Настоящее изобретение предполагает все и любые способы введения композиции в субъекта, способ не зависит от любого конкретного способа введения, и его не следует толковать таким образом. Способы введения хорошо известны специалистам в данной области, и предпочтительно композицию вводят подкожно или внутрь опухоли. Специалисту в данной области будет ясно, что, несмотря на возможность применения для введения более чем одного способа введения, определенный способ может обеспечить немедленную и более эффективную реакцию, чем другой способ. Местная или системная доставка может быть осуществлена посредством введения, включающего нанесение или инстилляцию иммуновакцин в полости тела, ингаляцию или инсуффляцию аэрозоля или парентеральное введение, включая внутримышечное, внутривенное, интрапортальное, внутрипеченочное, брюшинное, подкожное или внутрикожное введение. В случае опухоли центральной нервной системы композицию необходимо вводить внутрь опухоли ввиду невозможности примирования иммунной системы в центральной нервной системе.

Несмотря на то, что химиотерапевтические агенты могут индуцировать «иммуногенную» гибель опухолевых клеток и облегчать перекрестное представление антигенов дендритными клетками, опухоли создают среду, вызывающую толерантность, позволяющую им подавлять активацию врожденных и адаптивных иммунных ответов и избегать иммунологической атаки иммунокомпетентными эффекторными клетками. Согласно настоящему изобретению предложены способы противодействия опухоль-индуцированной иммунной толерантности в опухолевом микроокружении, что позволяет повысить противоопухолевую эффективность химиотерапии посредством активации и применения опосредованного Т-клетками адаптивного противоопухолевого иммунитета против диссеминированных раковых клеток.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что нацеленные иммуномодулирующие антитела или слитые белки по настоящему изобретению могут противодействовать или приводить к обратному развитию иммунной толерантности раковых клеток. Раковые клетки могут избегать устранения химиотерапевтическими агентами или антителами, нацеленными на опухоль, посредством определенных иммуносупрессивных механизмов в опухолевом микроокружении, и такую способность раковых клеток называют иммунной толерантностью. Благодаря противодействию опухоль-индуцированной иммунной толерантности, согласно настоящему изобретению предложены эффективные композиции и способы для лечения рака, возможно в комбинации с другим существующим лечением рака.

Согласно настоящему изобретению предложены композиции и способы получения слитых белков, противодействующих иммунной толерантности в опухолевом микроокружении и стимулирующих опосредованный Т-клетками адаптивный противоопухолевый иммунитет, поддерживая стойкую длительную защиту от рецидивирующих или диссеминированных видов рака. Эти слитые белки разработаны для содействия эффективным длительным опосредованным Т-клетками иммунным ответам против опухолевых клеток посредством по меньшей мере одного из следующего:

а) стимулирования гибели опухолевых клеток усилением антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC); и

б) усиления активации и пролиферации противоопухолевых CD8+Т-клеток посредством противодействия иммуносупрессии, опосредованной регуляторными Т-клетками и миелоидными супрессорными клетками. Эти противоопухолевые иммунные ответы можно активировать в тандеме с сенсибилизацией опухолевых клеток к опосредованной иммунными эффекторами цитотоксичности, создавая посредством этого петлю положительной обратной связи, усиливающую циторедукцию опухоли и укрепляющую адаптивный противоопухолевый иммунитет.

Кроме того, слитые белки по настоящему изобретению отличаются от существующих терапевтических молекул и превосходят их по меньшей мере в одном из следующих аспектов: (1) противодействие иммунной толерантности в опухолевом микроокружении и стимуляция опосредованного Т-клетками адаптивного противоопухолевого иммунитета для поддержания длительной защиты от рецидивирующих или диссеминированных видов рака (для предотвращения или лечения различных видов рака); (2) получение иммунных клеточных композиций для адоптивной клеточной терапии различных видов рака; и (3) применение в качестве иммунных адъювантов или вакцин для профилактики различных видов рака или инфекционных заболеваний.

Нацеленные иммуностимулирующие антитела и/или слитые белки по изобретению позволяют разорвать иммуносупрессивные сети в опухолевом микроокружении. Опухоли используют широкий спектр регуляторных механизмов для избегания или подавления иммунного ответа. Раковые клетки активно стимулируют иммунную толерантность в опухолевом микроокружении, экспрессируя цитокины и молекулы, ингибирующие дифференцировку и созревание антиген-представляющих дендритных клеток (DC). Иммуносупрессивные цитокины и лиганды, продуцируемые опухолевыми клетками, включают следующее: (1) трансформирующий фактор роста-бета (TGFP); (2) лиганд-1 запрограммированной гибели-1 (PD-L1; В7-Н1); (3) фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); и (4) интерлейкин-10 (IL-10).

В дополнение к блокированию созревания дендритных клеток (DC), эти молекулы стимулируют развитие специализированных подгрупп иммуносупрессивных CD4⁺ Т-клеток (регуляторных Т-клеток; Treg-клеток) и миелоидных супрессорных клеток (MDSC). Treg-клетки представляют собой небольшую субпопуляцию CD4⁺ Т-клеток, конститутивно экспрессирующую CD25 [сс-цепь рецептора интерлейкина-2 (IL-2)] и транскрипционный фактор «forkhead box Р3» (FOXP3). Treg-клетки (CD4+CD25+FoxP3+ клетки) поддерживают иммунную толерантность, ограничивая активацию, пролиферацию и эффекторные функции широкого спектра иммунокомпетентных клеток, включая CD4 и CDS Т-клетки, натуральные клетки-киллеры (NK) и NKT-клетки, В-клетки и антиген-представляющие клетки (АРС) in vitro и in vivo.

Накопление Treg-клеток в опухолевом микроокружении усиливает иммунную толерантность опухоли и способствует прогрессированию и метастазированию опухоли. Повышенная экспрессия иммуносупрессивных цитокинов (TGFβ, PD-L1) и инфильтрация опухоли Treg-клетками коррелирует со снижением выживаемости пациентов с различными типами рака. Слитые белки по настоящему изобретению ингибируют ключевые иммуносупрессивные молекулы, экспрессированные опухолевой клеткой-мишенью или инфильтрирующими опухоль Treg-клетками и миелоидными супрессорными клетками (DC или MDSC). Как таковые они позволяют направленно ингибировать развитие или функционирование Treg-клеток в опухолевом микроокружении.

Согласно настоящему изобретению предложен способ предотвращения или лечения опухолевого заболевания. Способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, одного или более слитых белков по настоящему изобретению в комбинации с другой противораковой терапией, представляющей собой химиотерапевтическую молекулу, антитело, низкомолекулярный ингибитор киназ, гормональный агент, цитотоксический агент, нацеленный терапевтический агент, антиангиогенный агент, ионизирующее излучение, ультрафиолетовое излучение, криоабляцию, термическую абляцию или радиочастотную абляцию.

При использовании здесь термин «антитело» включает природные или искусственные моно- или поливалентные антитела, включая, без ограничения, поликлональные, моноклональные, мультиспецифические, человеческие, гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, Е(аb’)-фрагменты, фрагменты, полученные с использованием Fab-экспрессионной библиотеки, антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела к антителам по изобретению) и эпитоп-связывающие фрагменты любого из указанного выше. Антитело может иметь происхождение из какого-либо животного источника, включая птиц и млекопитающих. В одном аспекте антитело представляет собой человеческое, мышиное или крысиное (например, мышиное и крысиное), ослиное, овечье, кроличье, козье антитело, антитело морской свинки, верблюда, лошади или цыпленка или имеет происхождение от них. Кроме того, такое антитело может представлять собой гуманизированный вариант антитела. Антитело может быть моноспецифическим, биспецифическим, триспецифическим или более мультиспецифическим. В данной заявке антитело особым образом включает «химерное» антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, имеющих происхождение из определенного вида или принадлежащих определенному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, имеющих происхождение из другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность.

Примеры антител, которые могут быть включены в композиции и способы, раскрытые здесь, включают, без ограничения, такие антитела, как трастузумаб (антитело против HER2/neu); пертузумаб (mAb против HER2); цетуксимаб (химерное моноклональное антитело к рецептору эпидермального фактора роста EGFR); панитумумаб (антитело против EGFR); нимотузумаб (антитело против EGFR); залутумумаб (mAb против EGFR); нецитумумаб (mAb против EGFR); MDX-210 (гуманизированное биспецифическое антитело против HER-2); MDX-210 (гуманизированное биспецифическое антитело против HER-2); MDX-447 (гуманизированное биспецифическое антитело против рецептора EGF); ритуксимаб (химерное мышиное/человеческое mAb против CD20); обинутузумаб (mAb против CD20); офатумумаб (mAb против CD20); тозитумомаб-I131 (mAb против CD20); ибритумомаб тиуксетан (mAb против CD20); бевацизумаб (mAb против VEGF); рамуцирумаб (mAb против VEGFR2); ранибизумаб (mAb против VEGF); афлиберцепт (внеклеточные домены VEGFR1 и VEGFR2, слитые с Fc lgG1); AMG386 (пептид, связывающийся с ангиопоэтином-1 и -2, слитый с Fc lgG1); далотузумаб (mAb против IGF-1R); гемтузумаб озогамицин (mAb против CD33); алемтузумаб (mAb против Campath-I/CD52); брентуксимаб ведотин (mAb против CD30); катумаксомаб (биспецифическое mAb, нацеленное на эпителиальную молекулу клеточной адгезии и CD3); наптумомаб (mAb против 5Т4); гирентуксимаб (антитело против карбоангидразы IX); или фарлетузумаб (антитело против фолатного рецептора). Другие примеры включают такие антитела, как Раnоrех™ ((17-1А) (мышиное моноклональное антитело); Раnоrех (@(17-1А) (химерное мышиное моноклональное антитело); ВЕС2 (антиидиотипическое mAb, имитирует эпитоп GD) (с BCG); Oncolym (моноклональное антитело Lym-1); SMART М195 Ab, гуманизированное 13' 1 LYM-1 (Oncolym), Ovarex (B43.13, антиидиотипическое мышиное mAb); 3622W94, mAb связывающееся с панкарциномным антигеном EGP40 (17-1 А) в аденокарциномах; Zenapax (SMART против Tac (рецептора IL-2); SMART М195 Ab, гуманизированное Ab, гуманизированное); NovoMAb-G2 (Ab, специфическое в отношении всех видов рака); TNT (химерное mAb к гистоновым антигенам); TNT (химерное mAb к гистоновым антигенам); GJiomab-Н (моноклональные-гуманизированные Ab); GN1-250 Mab; EMD-72000 (химерный антагонист EGF); LymphoCide (гуманизированное антитело IL.L.2); и беспицифическое MDX-260, нацеленное на GD-2, ANA Ab, SMART 1DiO Ab, SMART ABL 364 Ab или ImmuRAIT-CEA.

Для получения антител могут быть применены различные способы. В гибридомной технологии, относящейся к клонированной клеточной линии, образующей антитело одного типа, используют клетки различных видов, включая мышей (мышиные), хомяков, крыс и людей. В другом способе получения антитела применяют генетическое конструирование, включая методики рекомбинантных ДНК. Например, антитела, полученные этими методиками, включают, среди прочего, химерные антитела и гуманизированные антитела. Химерное антитело сочетает кодирующие области ДНК от более чем одного типа видов. Например, химерное антитело может иметь происхождение от мышиной вариабельной области и человеческой константной области. Гуманизированное антитело имеет происхождение преимущественно из человека, несмотря на то, что оно содержит участки, не являющиеся человеческими. Как и химерное антитело, гуманизированное антитело может содержать полностью человеческую константную область. Но, в отличие от химерного антитела, вариабельная область может частично иметь происхождение из человека. Синтетические части гуманизированного антитела, не являющиеся человеческими, часто имеют происхождение от CDR мышиных антител. В любом случае, эти области важны для распознавания и связывания антителом специфического антигена.

В одном воплощении гибридома может продуцировать нацеленный слитый белок, содержащий направляющую группировку и иммуномодулирующую группировку. В одном воплощении направляющая группировка, содержащая антитело, фрагмент антитела или полипептид, соединена или слита с иммуномодулирующей группировкой, состоящей из полипептида, с линкером или без линкера. Линкер может представлять собой аминокислотный линкер. В одном воплощении линкер представляет собой (GGGGS)n, где n представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8. Например, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 4). В другом воплощении линкер представляет собой EPKSCDK (SEQ ID NO: 11). В различных аспектах длина линкера может быть изменена для оптимизации связывания направляющей группировки или функции иммуномодулирующей группировки. В различных аспектах иммуномодулирующая группировка представляет собой полипептид, слитый с С-концом Fc-области тяжелой цепи направляющего антитела или Fc-содержащего слитого белка. В другом аспекте иммуномодулирующая группировка представляет собой полипептид, слитый с С-концом легкой цепи направляющего антитела.

Фрагмент антитела может содержать часть интактного антитела, например, включая его антиген-связывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты; Fc-фрагменты или Fc-слитые продукты; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, полученные из фрагмента(ов) антитела. Интактное антитело представляет собой антитело, содержащее антиген-связывающую вариабельную область, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи СН1, СН2 и СН3. Константные домены могут представлять собой константные домены с нативной последовательностью (например, человеческие константные домены с нативной последовательностью), или вариант их аминокислотной последовательности, или любой другой модифицированный Fc (например, гликозилированный или конструированный иным образом Fc).

Слитые белки по настоящему изобретению могут быть синтезированы обычными методиками, известными в данной области, например химическим синтезом, таким как твердофазный пептидный синтез. Такие способы известны специалистам в данной области. Обычно в таких способах применяют методы твердофазного или жидкофазного синтеза, хорошо известные в данной области. Конкретно, способы включают последовательное добавление одной или более аминокислот или подходящим образом защищенных аминокислот к растущей пептидной цепи. Обычно аминогруппа или карбоксигруппа первой аминокислоты защищена подходящей защитной группой. Защищенная или дериватизированная аминокислота может затем быть присоединена к инертному твердому носителю или использована в растворе добавлением следующей аминокислоты в последовательность, имеющую подходящим образом защищенную комплементарную группу (аминогруппу или карбоксильную группу), в условиях подходящих для образования амидной связи. Затем из этого нового добавленного аминокислотного остатка удаляют защитную группу, после чего добавляют следующую аминокислоту (защищенную подходящим образом), и так далее. После соединения всех желаемых аминокислот с образованием правильной последовательности любые оставшиеся защитные группы и любые твердые носители удаляют, последовательно или одновременно, с получением конечного полипептида. Простая модификация этого общего способа позволяет добавлять к растущей цепи более чем одну аминокислоту за один раз, например сочетанием (в условиях, не приводящих к рацемизации хиральных центров) защищенного трипептида с надлежащим образом защищенным дипептидом с получением, после снятия защиты, пентапептида.

Типичные защитные группы включают трет-бутилоксикарбонил (Вос), 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc), бензилоксикарбонил (Cbz), п-толуолсульфонил (Tos); 2,4-динитрофенил, бензил (Bzl), бифенилизопропилоксикарбоксикарбонил, циклогексил, изопропил, ацетил, о-нитрофенилсульфонил и тому подобное. Из них предпочтительны Вос и Fmoc.

Типичные твердые носители обычно представляют собой поперечно сшитые полимерные вещества. Они включают дивинилбензоловые поперечно сшитые стироловые полимеры, например, дивинилбензоловые-гидроксиметилстироловые сополимеры, дивинилбензоловые-хлорметилстироловые сополимеры и дивинилбензоловые-бензгидриламинополистироловые сополимеры. Дивинилбензоловые-бензгидриламинополистироловые сополимеры, как проиллюстрировано здесь, в которых использована п-метилбензгидриламинная смола, обладают преимуществом непосредственного введения терминальной амидной функциональной группы в пептидную цепь, сохраняющую ее функцию после отделения цепи от твердого носителя.

В одном способе полипептиды получают посредством обычного твердофазного химического синтеза, например в пептидном синтезаторе Applied Biosystems, Inc. (ABI) 430A с использованием смолы, позволяющей синтезировать пептиды в амидной форме, и с использованием трет-Вос-производных аминокислот (Peninsula Laboratories, Inc.) со стандартными растворителями и реагентами. Таким способом можно синтезировать полипептиды, содержащие L- или D-аминокислоты. Состав полипептидов подтверждают количественным анализом аминокислот, и конкретная последовательность каждого пептида может быть определена посредством секвенирования.

Предпочтительно, полипептиды могут быть получены методиками рекомбинантных ДНК посредством синтеза ДНК, кодирующей желаемый полипептид. После синтеза или выделения кодирующих последовательностей желаемых полипептидов они могут быть клонированы в подходящий вектор для экспрессии. Специалистам в данной области известно множество клонирующих векторов, и подходящий клонирующий вектор может быть выбран по их усмотрению. Ген может быть помещен под контроль промотора, сайта связывания с рибосомами (для экспрессии у бактерий) и, возможно, оператора (называемых здесь общим термином «контрольные элементы»), так, что в клетке-хозяине, трансформированной вектором, содержащим эту экспрессионную конструкцию, происходит транскрипция последовательности ДНК, кодирующей желаемый полипептид, с образованием РНК. Кодирующая последовательность может содержать или не содержать сигнальный пептид или лидерную последовательность. К кодирующей последовательности могут быть добавлены гетерологичные лидерные последовательности, что приводит к секреции экспрессированного полипептида из организма-хозяина. Также могут быть желательны другие регуляторные последовательности, позволяющие регулировать экспрессию белковых последовательностей относительно роста клетки-хозяина. Такие регуляторные последовательности известны специалистам в данной области, и примеры включают последовательности, приводящие к включению или выключению экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, включая присутствие регуляторного соединения. В векторе могут также присутствовать регуляторные элементы других типов, например энхансерные последовательности.

Контрольные последовательности и другие регуляторные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью перед вставкой в вектор, как в клонирующих векторах, описанных выше. Альтернативно, кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в вектор экспрессии, уже содержащий контрольные последовательности и подходящий сайт рестрикции.

Вектор экспрессии может затем быть использован для трансформирования подходящей клетки-хозяина. В данной области известно множество линий клеток млекопитающих, включая иммортализованные клеточные линии, доступные от Американской коллекции типовых культур (АТСС), такие как, без ограничения, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, НЕК293, клетки почки новорожденного хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки печеночно-клеточного рака человека (например, Hep G2), клетки Мадин-Дарби бычьей почки («MDBK»), клетки NOS, имеющие происхождение от раковых клеток, таких как клетки саркомы, а также другие. Сходным образом, с настоящими экспрессионными конструкциями можно использовать бактериальных хозяев, таких как Е. coli, Bacillus subtilis и Streptococcus spp. Дрожжевые хозяева, полезные в настоящем изобретении, включают, среди прочих, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe и Yarrowia lipolytica. Клетки насекомых для использования с бакуловирусными векторами экспрессии включают, среди прочих, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni. Белки могут также быть экспрессированы в трипаносомах.

В зависимости от выбранных системы экспрессии и хозяина, белки по настоящему изобретению получают посредством выращивания клеток-хозяев, трансформированных вектором экспрессии, описанным выше, в условиях, в которых экспрессируется интересующий белок. Затем осуществляют выделение белка из клеток-хозяев и его очистку. Если система экспрессии секретирует белок в питательную среду, белок может быть очищен непосредственно из среды. Если белок не секретируется, его выделяют из лизатов клеток. Выбор подходящих условий выращивания и способов выделения входит в компетенцию специалиста в данной области. После очистки можно определить аминокислотные последовательности белков, то есть провести несколько повторных циклов расщепления по Эдману с последующим анализом аминокислот посредством HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография). В данной области также известны другие способы определения аминокислотной последовательности.

После синтеза или получения иным способом можно анализировать ингибирующую активность полипептида-кандидата, оценивая способность кандидата ингибировать индуцируемую липополисахаридом ядерную транслокацию NF-.каппа.В, например с использованием мышиных эндотелиальных клеток.

Слитые белки по настоящему изобретению могут быть включены в терапевтические композиции в различных лекарственных формах, таких как, без ограничения, жидкие растворы или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, суппозитории, полимерные микрокапсулы или микровезикулы, липосомы и растворы для инъекций или инфузий. Предпочтительная форма зависит от способа введения и конкретного целевого типа рака. Композиции также предпочтительно содержат фармацевтически приемлемые наполнители, носители или адъюванты, хорошо известные в данной области, такие как человеческий сывороточный альбумин, ионообменные вещества, оксид алюминия, лецитин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия и соли или электролиты, такие как сульфат протамина. Подходящими наполнителями являются, например, вода, физиологический раствор, декстроза, глицерин, этанол или тому подобное, и их комбинации. Современные способы изготовления таких композиций известны или будут очевидны специалистам в данной области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18th edition, 1990.

Описанные выше композиции могут быть введены с применением обычных способов доставки, включая, без ограничения, внутривенное, внутрибрюшинное, пероральное, внутрилимфатическое или подкожное введение. В настоящем изобретении может также быть применено местное введение в рассматриваемую опухоль или в воспалительный очаг, например инъекция непосредственно в артритический сустав.

Терапевтически эффективные дозы будут легко определены специалистом в данной области и будут зависеть от тяжести и течения заболевания, состояния здоровья пациента, его ответа на лечение и решения лечащего врача.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Ниже приведены примеры конкретных воплощений для осуществления настоящего изобретения. Примеры предложены исключительно в иллюстративных целях и никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Авторы изобретения приложили усилия для обеспечения точности используемых численных значений (например, количества, температуры и так далее), но, несомненно, следует допускать некоторые экспериментальные погрешности и отклонения.

Пример 1

Осуществляли экспрессию слитых белков, содержащих тяжелую цепь IgG, соединенную с иммуномодулирующими (подавляющими или активирующими) лигандами, с использованием кодон-оптимизированных генов для экспрессии в клетках СНО. Кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности, определенные SEQ ID NO: 12-28, экспрессировали в клетках СНО, и экспрессированные химерные/слитые белки показаны в таблице 1.

Экспрессированный белок характеризовали с применением SDS PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), экспрессированные слитые белки «антитело против HER2/neu-TGFβRII» и «антитело против EGFR1-TGFβRII» очищали из супернатантов культур с использованием колонки с белком А, и результаты показаны на Фиг. 22. Следует отметить, что масса легкой цепи антитела против EGFR1-TGFβRII больше, что может быть обусловлено наличием двух сайтов гликозилирования в вариабельных областях легкой и тяжелой цепей. Масса тяжелых цепей антитела против HER2/neu-TGFβRII и антитела против EGFR1-TGFβRII больше из-за TGFβRII. Кроме того, тяжелая цепь антитела против HER2/neu-TGFβRII имеет четыре сайта N-гликозилирования, в то время как антитело против EGFR1-TGFβRII имеет пять сайтов N-гликозилирования.

Пример 2

Хроматография с белком A/SEC-хроматография (гель-хроматография). Образцы антитела против HER2/neu-TGFβRII и антитела против EGFR1-TGFβRII анализировали посредством хроматографии с белком A/SEC-хроматографии, и результаты показаны на Фиг. 23. На Фиг. 23А показан острый пик элюирования Bmab200 (герцептина) в сравнении с более широким пиком элюирования, который, как полагают, является мерой неоднородности, обусловленной наличием гликозилирования, поскольку в области TGFβRII присутствуют три дополнительных сайта N-гликозилирования. Следует отметить, что хранение при -80°С не приводило к агрегации. Изменение положения или раннее появление пика в SEC-колонке указывает на увеличение молекулярной массы, обусловленное партнером по слиянию. Это еще раз подтверждает, что экспрессируется полноразмерная молекула. На Фиг. 23В показан острый пик элюирования Bmab200 (герцептина) в сравнении с более широким пиком элюирования, который, как полагают, является мерой неоднородности, обусловленной наличием сайтов гликозилирования, поскольку в области TGFβRII присутствуют три дополнительных сайта N-гликозилирования. Снова, хранение при -80°С не приводило к агрегации. Изменение положения или раннее появление пика в SEC-колонке указывает на увеличение молекулярной массы, обусловленное партнером по слиянию. Это еще раз подтверждает, что экспрессируется полноразмерная молекула.

Пример 3

Функциональный анализ слитых белков. Для проверки связывающей способности антитела против HER2/neu-TGFβRII и антитела против EGFR1-TGFβRII в отношении TGFβ проводили ELISA-эксперимент. На Фиг. 24А показано, что молекулы «антитело против HER2/neu-TGFβRII» и «антитело против EGFR1-TGFβRII» связываются с TGFβ, указывая на функциональность слитого белка. На Фиг. 24В показано, что антитело против HER2-TGFβRII ингибирует пролиферацию клеточной линии ВТ474 аналогично Bmab200 (герцептину). На Фиг. 25 показано, что антитело против EGFR1-TGFβRII ингибирует пролиферацию клеточной линии А431 аналогично цетуксимабу.

Пример 4

Осуществляли оценку антителозависимой клеточной цитотоксической (ADCC) активности слитого белка «антитело против HER2/neu-TGFβRII» для определения связывания белка с рецепторами-мишенями на клетках. Результаты показаны на Фиг. 26, где определена активность в отношении клеток ВТ474, и очевидно, что ADCC-активность (% лизиса клеток) антитела против HER2-TGFβRII в отношении клеток ВТ474 аналогична ADCC-активности Bmab200 (герцептина). На Фиг. 27 показана ADCC-активность антитела против EGFR1-TGFβRII в отношении клеток А431, аналогичная ADCC-активности цетуксимаба. На Фиг. 28 показана ADCC-активность антитела против EGFR1-4-1ВВ в сравнении с антителом против EGFR1-TGFβRII и цетуксимабом.

Пример 5

Связывающая активность экспрессированных белков. Задачей данного исследования является анализ функциональности слитых белков по связыванию с рецепторами-мишенями на клетках дозозависимым образом. На Фиг. 29А показано, что связывающая активность антитела против CTLA4-TGFβRII в отношении TGFβ1 сопоставима с антителом против EGFR1-TGFβRII, и на Фиг. 29 В показана связывающая активность антитела против CTLA4-TGFβRII в отношении CTLA4. На Фиг. 30А показана связывающая активность антитела против CTLA4-TGFβRII, определяющая уровень связывания с PD1-Fc, и на Фиг. 30В показана связывающая активность антитела против EGFR1-4-1ВВ, определяющая связывание с 4-1BBL. На Фиг. 31А показана связывающая активность антитела против EGFR1-4-1BB в отношении EGFR, и на Фиг. 31В показана связывающая активность PD1-Fс-4-1BB в отношении PDL1-Fc. На Фиг. 32 показана связывающая активность антитела против EGFR1-PD1 в отношении EGFR и PD1.

Пример 6

Подтверждение первичной структуры молекулы. Как показано на Фиг. 33, экспрессированные белки оценивали, определяя их молекулярную массу и наличие гликозилирования. Образцы анализировали посредством восстанавливающего и невосстанавливающего SDS PAGE. Тяжелые и легкие цепи антитела разделяли посредством восстановительного алкилирования, что позволяло оценивать восстановленные структуры. Расщепление слитых белков трипсином позволяло определить первичную последовательность. Проводили МS/МS(тандемная масс-спектрометрия)-анализ белков.

Масс-спектрометрический анализ антитела против HER2/neu-TGFβRII и антитела против EGFR1-TGFβRII. Экспрессировали и анализировали слитый белок, показанный на Фиг. 1. На Фиг. 34А показан массовый спектр легкой цепи (LC) (восстановленной) слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII», и на Фиг. 34В показан развернутый массовый спектр LC (восстановленной) слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII». На Фиг. 35 показан массовый спектр тяжелой цепи (НС) (восстановленной) слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII».

Экспрессировали и анализировали слитый белок, показанный на Фиг. 2. На Фиг. 36А показан массовый спектр LC (восстановленной) антитела против EGFR1-ECD TGFβRII, и на Фиг. 36В показан развернутый массовый спектр LC (восстановленной) антитела против EGFR1-ECD TGFβRII. На Фиг. 37 показан массовый спектр НС (восстановленной) антитела против EGFR1-ECD TGFβRII.

Пример 7

Слитые белки, имеющие аминокислотные последовательности, описанные на Фиг. 1 и 2, исследовали с применением UV-хроматографии, получая хроматограммы в результате хроматографического разделения расщепленных трипсином слитых белков и проводя анализ при длине волны UV 218-222 нм. Также оценивали общий ионный ток (TIC) в соответствии с UV-записью. На Фиг. 38А показана UV-хроматограмма триптических пептидов слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII», и на Фиг. 38В показана общая ионная хроматограмма (TIC) триптических пептидов слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII». На Фиг. 39. 40 и 41 приведены перечни прогнозируемых/наблюдаемых триптических пептидов легкой цепи, тяжелой цепи и соединительного мотива слитого белка «антитело против HER2/neu-ECD TGFβRII», соответственно. Следует отметить, что были идентифицированы все прогнозируемые пептиды молекул, включая пептиды легкой и тяжелой цепи и пептиды соединительного мотива (ΤGΡβΒΙΙ).

На Фиг. 42А показана UV-хроматограмма триптических пептидов слитого белка «антитело против EGFR1-ECD TGFβRII», и на Фиг. 42В показана общая ионная хроматограмма (TIC) триптических пептидов слитого белка «антитело против EGFR1-ECD TGFβRII». На Фиг. 43. 44 и 45 приведены перечни прогнозируемых/наблюдаемых триптических пептидов легкой цепи, тяжелой цепи и соединительного мотива слитого белка «антитело против EGFR1-ECD TGFβRII», соответственно. Снова были идентифицированы все прогнозируемые пептиды молекул, включая пептиды легкой и тяжелой цепи и пептиды соединительного мотива (TGFβRII).

Пример 8

Линия клеток-хозяев, использованная для экспрессии рекомбинантного слитого белка, представляет собой клетки СНО или производное клеток СНО. Клетки СНО, упоминаемые здесь, представляют собой либо клетки Freedom CHO-S, имеющие происхождение от клеток СНО, адаптированные для свободной от сыворотки суспензионной культуры с высокой плотностью в среде с определенным химическим составом, способные продуцировать высокие уровни секретируемого рекомбинантного белка, либо клетки СНО К1, имеющие те же свойства, что и АТСС №CCL-61. В целом, это адгезивная клеточная линия. Для получения стабильной клеточной линии использовали следующие векторы.

Вектор Freedom рСНО 1.0, разработанный ProBioGen AG, для экспрессии одного или двух интересующих генов, расположенных после двух разных гибридных СМV (цитомегаловирус)-промоторов вектора. Этот вектор содержит дигидрофолатредуктазный (DHFR) селекционный маркер и ген устойчивости к пуромицину, что позволяет проводить селекцию с использованием МТХ (метотрексат) и пуромицина одновременно.

Нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие легкую цепь или слитый белок легкой цепи, клонировали в рестриктазные сайты AvrII и BstZ17 под контролем EF2(фактор элонгации 2)/СМV-промотора.

Нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие тяжелую цепь или слитый белок тяжелой цепи, клонировали в рестриктазные сайты EcoRV и Pad под контролем CMV/EF1 -промотора.

Полученной(ыми) конструкцией(ями) трансфицировали клетки Freedom CHO-S/клетки СНОК1. Для получения рекомбинантного слитого белка выбирали отдельную высокопродуктивную клональную клеточную линию. Получали МСВ («исходный банк клеток») и характеризовали на предмет жизнеспособности клеток, продуктивности, стабильности и других параметров. После очистки клетки использовали для культивирования.

Пример 9

Культивирование клеток осуществляли в режиме подпитки. При культивировании используемые клетки-хозяева, являющиеся клетками млекопитающих, представляют собой клетки яичника китайского хомячка (СНО), и культуральную среду вносят сразу. Клетки СНО генетически модифицировали для получения слитого белка «антитело-пептид». В среду добавляли гептагидрат сульфата цинка в концентрации 0,4 мМ. В отличие от этого, в контрольную среду соль цинка не добавляли. Цикл производственной ферментации начинали при исходном количестве клеток 0,3-0,45 × 10⁶ клеток/мл при 37±1°С; в первые 3-4 суток клетки выращивали в периодической фазе. Следующая стадия включала снижение температуры до 31±1°С и продолжение цикла до 7 суток. На протяжении цикла количество лактата уменьшалось почти на 10-40%. Полученный слитый белок затем выделяли из среды с применением методики аффинной хроматографии.

Пример 10

Применяли культивирование клеток в режиме подпитки. Изначально в культуры вносили клетки-хозяева, являющиеся клетками млекопитающих, и культуральную среду, представляющую собой Hyclone CDM4Mab. В среду также вносили соли (цинка) (0,3 мМ). Цикл производственной ферментации начинали при исходном количестве клеток 0,3-0,45 × 10⁶ клеток/мл при 37±1°С; в первые 3-4 суток клетки выращивали в периодической фазе. Следующая стадия включала снижение температуры до 31±1°С и продолжение цикла до 7 суток.

Пример 11

Очистка слитых иммуностимулирующих молекул «антитело-пептид» с использованием колонок с белком А. Супернатант культур, секретированный рекомбинантной клеточной линией СНО, содержащей слитые моноклональные антитела, анализировали на предмет титра и эндотоксинов в стерильных условиях. Осуществляли аффинную хроматографию супернатанта с использованием аффинной смолы Mab Select Xtra Protein А, промывку и уравновешивание связывающим буфером. рН супернатанта корректировали с использованием 0,5 M фосфата до того же рН, что и у колонки, супернатанту давали связаться с колонкой/пройти через колонку при скорости потока 0,5 мл в минуту для достижения максимального связывания. Все слитые молекулы «антитело-белок» связывались через Fc-область, при этом примеси удалялись с проточной фракцией. Колонку промывали уравновешивающим буфером и связанные слитые молекулы элюировали с использованием 0,1 M глицина при рН 3,0. рН элюированных белков корректировали до нейтрального рН или рН стабильной композиции и очищенный белок хранили при -20°С или при 2-8°С.

Пример 12

Сравнение трастузумаба со слитой молекулой «трастузумаб-рецептор TGFβRII»

Рак молочной железы со сверхэкспрессией рецептора ЕrbВ2 в результате конститутивной активации или гетеродимеризации с другими представителями семейства рецепторов ErbB будет приводить к прогрессированию опухоли. Это будет включать связывание факторов роста, ассоциированных с сигнальным путем ErbB. Кроме того, опухоль создает среду, где иммунная система подавлена активацией TGFβ и определенных цитокинов, вовлеченных в подавленный иммунный ответ. Получали новую молекулу, где трастузумаб (антитело против ЕrbВ2) слит с рецептором TGFβRII в форме слитого белка. В то время как трастузумаб, предположительно, будет действовать как молекула, нацеленная на клетки рака молочной железы, сверхэкспрессирующие ЕrbВ2, рецептор TGFβRII будет секвестрировать TGFP, приводя к иммунной активации. В эксперименте будет использован рост клеточных линий, экспрессирующих ЕrbВ2, резистентных к герцептину (селектированных посредством выращивания клеток ВТ474 в присутствии герцептина) в присутствии TGFβ, цитотоксических СD8-положительных клеток и NK-клеток. В то время как трастузумаб не будет эффективно индуцировать цитотоксичность, слитая молекула «трастузумаб-рецептор TGFβRII» будет секвестрировать TGFP, предотвращая посредством этого ингибирование цитотоксических CD8- и NK-клеток. Это будет приводить к усилению цитотоксичности, наблюдаемой у клеток, обработанных слитой молекулой «трастузумаб-рецептор TGFβRII», по сравнению с клетками, обработанными трастузумабом самим по себе. При оценке результатов эксперимента будет использован резазуриновый краситель аламаровый синий, активируемый прямопропорционально количеству жизнеспособных клеток. Другим способом может быть измерение цитотоксичности с использованием CytoTox-Glo, что позволяет измерять высвобождение протеазы, непосредственно соответствующее доле погибших клеток. Еще одним способом может быть использование проточного цитометра, позволяющего непосредственно оценивать популяцию апоптотических и некротических клеток с использованием аннексина V и йодида пропидия. Результаты этих множественных экспериментов позволят лучше оценить активность конъюгатной молекулы в сравнении с трастузумабом самим по себе.

Несмотря на то, что изобретение было описано со ссылкой на изложенные выше примеры, следует понимать, что сущность и объем изобретения включают модификации и варианты. Соответственно, изобретение ограничено только последующей формулой изобретения.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитых белков, ингибирующих пролиферацию раковых клеток, что может быть использовано в медицине. Рекомбинантным путем получают химерный слитый белок, содержащий направляющую группировку для нацеливания на раковую клетку, иммуномодулирующую группировку, противодействующую иммунной толерантности раковых клеток, и аминокислотный спейсер. Изобретение позволяет повысить эффективность лечения раковых заболеваний. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 65 ил., 1 табл., 12 пр.

Формула