Вакцинная композиция против злокачественной опухоли - RU2682726C9

Чертежи

Показать все 42 чертежа(ей)

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по лейкоцитарному антигену человека (HLA)-A*0206 индивидуумов, содержащей белковый продукт гена опухолевого супрессора опухоли Вильмса 1 (WT1) (далее в настоящем документе иногда сокращаемый как белок WT1) или его неполный пептид (далее в настоящем документе иногда сокращаемый как пептид WT1). Настоящее изобретение также относится к вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, содержащей ДНК или РНК, кодирующую указанный выше белок WT1 или пептид WT1, способу индукции специфичных к WT1 CTL, способу индукции дендритных клеток, которые презентируют злокачественный антиген, и способу диагностики злокачественной опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов и способу лечения или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов.

Настоящее изобретение дополнительно относится к вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, содержащей модифицированный пептид WT1.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ген опухоли Вильмса WT1 выделен как ген, ассоциированный с образованием опухоли при опухоли Вильмса, которая представляет собой педиатрическую опухоль почек (смотри в непатентной литературе 1). Этот ген кодирует фактор транскрипции "цинковые пальцы", ассоциированный с механизмом регуляции роста и дифференцировки клеток и апоптоза и развития тканей.

Ген WT1 исходно классифицировали как ген опухолевого супрессора. Однако на основании недавних данных, представленных далее в (i)-(iii):

(i) высокая экспрессия гена WT1 дикого типа при различных злокачественных новообразованиях и солидных злокачественных опухолях человека, включая злокачественные опухоли системы кроветворения, такие как лейкоз и миелодиспластические синдромы (MDS),

(ii) ингибирование роста лейкозных клеток и клеток солидных злокачественных опухолей человека, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами WT1, и

(iii) стимуляция роста и ингибирование дифференцировки миелоидных клеток-предшественников мыши при конститутивной экспрессии гена WT1 дикого типа,

предположено, что ген WT1 дикого типа при различных злокачественных заболеваниях проявляет онкогенное действие, а не супрессирующее опухоль действие (смотри в патентной литературе 1).

Также известно о высокой экспрессии гена WT1 при солидных злокачественных опухолях, таких как рак желудка, рак толстого кишечника, рак легких, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичников (смотри в патентной литературе 2).

В основном иммунная система для элиминации чужеродных объектов включает гуморальный иммунитет, в который вовлечены макрофаги, распознающие антиген и служащие в качестве антигенпредставляющих клеток, хелперные T-клетки, распознающие антиген, презентированный макрофагами, и продуцирующие различные лимфокины для активации других T-клеток, и B-лимфоциты, дифференцирующиеся в продуцирующие антитела клетки под действием лимфокинов; и клеточный иммунитет, в котором цитотоксические T-лимфоциты (CTL), продуцирующиеся вследствие дифференцировки в ответ на презентацию антигена, атакуют и разрушают клетки-мишени.

В настоящее время полагают, что направленный на злокачественные опухоли иммунитет главным образом основан на клеточном иммунитете, в который вовлечены CTL. В направленном на злокачественные опухоли иммунитете, основанном на CTL, T-клетки предшественники распознают антиген злокачественной опухоли, презентированный в форме комплекса главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и антигена злокачественной опухоли, и, таким образом, дифференцируются и развиваются в CTL, атакующие и разрушающие злокачественные клетки. В этом случае злокачественная клетка на клеточной поверхности презентирует комплекс антигена MHC класса I и антигена злокачественной опухоли, который является мишенью для CTL (смотри в непатентной литературе от 2 до 5). MHC у людей называют лейкоцитарный антиген человека (HLA).

Полагают, что указанный выше антиген злокачественной опухоли, который презентирует антиген MHC класса I на поверхностях злокачественных клеток, т.е. клетках-мишенях, представляет собой пептид, длиной приблизительно от 8 до 12 аминокислот, продуцируемый вследствие опосредованного внутриклеточными протеазами процессинга антигенного белка, синтезируемого в злокачественных клетках (смотри в непатентной литературе от 2 до 5). В настоящее время осуществляется поиск антигенных белков различных видов злокачественных опухолей, но в качестве специфичных для злокачественных опухолей белков идентифицировано только небольшое количество белков.

Автор настоящего изобретения синтезировал полипептиды, каждый состоящий из смежных аминокислот в количестве от 7 до 30 на основе аминокислотной последовательности продукта экспрессии гена WT1 и каждый содержащий, по меньшей мере, одну аминокислоту, по-видимому, служащую в качестве якорной аминокислоты для связывания с HLA-A*2402 или HLA-A*0201, подтверждая, что эти пептиды связываются с HLA-A*2402 или HLA-A*0201 (эти пептиды рестриктированы по HLA-A*2402 или HLA-A*0201), и обнаружил, что связывание пептидов с HLA-A*2402 или HLA-A*0201 индуцирует CTL, приводящий к цитотоксическому ответу к клеткам-мишеням (далее в настоящем документе, сокращаемому как ответ CTL). На основании данного факта эти пептиды идентифицированы как эпитоп CTL, полученный из продукта экспрессии гена WT1 (белка WT).

На настоящий момент идентифицированы специфичные для WT1 эпитопы CTL только для HLA-A*2402 и HLA-A*0201 (смотри в патентной литературе 3), HLA-A*3303 (смотри в патентной литературе 4) или HLA-A*1101 (смотри в патентной литературе 5). Подтверждено, что ответ CTL, индуцированный полипептидами из указанной выше литературы, рестриктирован по HLA-A*2402, HLA-A*0201, HLA-A*3303 и HLA-A*1101.

Это указывает на возможность того, что белковый продукт гена опухолевого супрессора WT1 представляет собой перспективный антиген для отторжения опухоли, также называемый опухолеспецифическим антигеном (TAA). Фактически, высокие уровни специфичных к WT1 CTL или высокие титры антител к WT1 наблюдали не в периферической крови здоровых доноров крови, а в периферической крови пациентов со злокачественными опухолями.

Однако типы HLA в достаточной степени разнообразны, чтобы служить в качестве маркеров для идентификации индивидуумов. В HLA антигены MHC класса I классифицируют на HLA-A, HLA-B и HLA-C, а антигены MHC класса II классифицируют на HLA-DP, HLA-DQ и HLA-DR. Каждый класс содержит несколько типов антигенов. Антигенсвязывающий участок каждого HLA обладает генетическим полиморфизмом. Например, известно, что у HLA-A, HLA-B и HLA-C существует 27 или более, 59 или более и 10 или более разновидностей полиморфизма (аллелей), соответственно.

Таким образом, желательно идентифицировать антиген злокачественной опухоли, связывающийся с другими типами HLA, отличными от HLA-A*2402, HLA-A*0201, HLA-A*3303 и HLA-A*1101, и индуцирующий ответ CTL, и, таким образом, применять иммунотерапевтическое лечение для более широкого диапазона индивидуумов.

При этом в двух документах сообщается о трех указанных ниже модифицированных пептидах WT1:

пептид WT1₁₈₇P1Y (YLGEQQYSV; SEQ ID NO: 12), пептид WT1₁₂₆P1Y (YMFPNAPYL; SEQ ID NO: 35) (об указанных выше двух пептидах смотри в патентной литературе 6) и пептид WT1₁₂₆P9M (RMFPNAPYM; SEQ ID NO: 52) (смотри в патентной литературе 7).

Кроме того, в письменных доводах при рассмотрении европейского патента № 1127068 приведены два указанных ниже пептида:

пептид WT1₁₂₆P2L (RLFPNAPYL; SEQ ID NO: 39) и пептид WT1₁₂₆P2L&P9V (RLFPNAPYV; SEQ ID NO: 75) (смотри в непатентной литературе 7).

Однако никогда не публиковалось, служат ли эти модифицированные пептиды WT1 в качестве антигена злокачественной опухоли, который связывается с типами HLA, отличными от HLA-A*2402, HLA-A*0201, HLA-A*3303 и HLA-A*1101, и индуцирует ответ CTL.

Патентная литература 1: JP-A 9-104629

Патентная литература 2: JP-A 11-035484

Патентная литература 3: публикация WO 00/06602

Патентная литература 4: патентная заявка Японии № 2006-045287

Патентная литература 5: патентная заявка Японии № 2006-355356

Патентная литература 6: публикация WO 2005/053618

Патентная литература 7: публикация WO 2007/016466

Непатентная литература 1: Gessler, M. et al., Nature, vol. 343, pp. 774-778, 1990

Непатентная литература 2: Cur. Opin. Immunol., vol. 5, p. 709, 1993

Непатентная литература 3: Cur. Opin. Immunol., vol. 5, p. 719, 1993

Непатентная литература 4: Cell, vol. 82, p. 13, 1995

Непатентная литература 5: Immunol. Rev., vol. 146, p. 167, 1995

Непатентная литература 6: Mol. Cell. Biol., vol. 11, p. 1707, 1991

Непатентная литература 7: письменные доводы для рассмотрения европейского патента № 1127068

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ЗАДАЧА, ПОДЛЕЖАЩАЯ РЕШЕНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Целью настоящего изобретения является применение способа лечения и/или профилактики злокачественных опухолей для пациентов со злокачественными опухолями, включая лейкоз, кроме положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, где способ основан на белковом продукте гена опухолевого супрессора WT1 (белок WT1) или его неполном пептиде (пептид WT1).

СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ ЗАДАЧИ

Автор для достижения указанной выше цели настоящего изобретения провел интенсивные исследования. В результате он выявил, что пептид WT1₁₈₇ (SLGEQQYSV) и пептид WT1₁₂₆ (RMFPNAPYL), каждый полученный из белка WT1 человека, который известен как индуцирующий только рестриктированные по HLA-A*0201 CTL, неожиданно также индуцировал рестриктированные по HLA-A*0206 CTL. В условиях, где как пептид WT1, индуцирующий рестриктированные по HLA-A*0201 CTL, были известны только пептиды, описанные в публикации WO 00/06602, автор настоящего изобретения обнаружил, что модифицированный пептид на основе пептида WT1₁₈₇ (также обозначаемый как модифицированный пептид WT1₁₈₇) и модифицированный пептид на основе пептида WT1₁₂₆ (также обозначаемый как модифицированный пептид WT1₁₂₆) также связывается с молекулой HLA-A*0201. На основе этих изысканий автор настоящего изобретения провел дополнительные интенсивные исследования и осуществил настоящее изобретение.

Конкретно, настоящее изобретение относится к следующему (1)-(17).

(1) Вакцинная композиция против злокачественной опухоли для положительных по лейкоцитарному антигену человека (HLA)-A*0206 индивидуумов, содержащая белковый продукт гена опухолевого супрессора WT1 или его неполный пептид.

(2) Композиция по указанному выше (1), где белковый продукт гена опухолевого супрессора WT1 представляет собой белок по следующим (a) или (b):

(a) белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или

(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, с делецией, заменой или добавлением от одной до нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности (a), каждая из которых иммуногенна у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов.

(3) Композиция по указанному выше (1), где неполный пептид представляет собой

пептид WT1₁₈₇: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2),

пептид WT1₁₂₆: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3),

пептид WT1₁₈₇P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11),

пептид WT1₁₈₇P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16),

пептид WT1₁₈₇P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20),

пептид WT1₁₂₆P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34),

пептид WT1₁₂₆P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39),

пептид WT1₁₂₆P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) или

пептид WT1₁₂₆P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).

(4) Композиция по указанным выше (1)-(3), дополнительно содержащая адъювант.

(5) Вакцинная композиция против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, содержащая ДНК, кодирующую белковый продукт гена опухолевого супрессора WT1 или его неполный пептид.

(6) Вакцинная композиция против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, содержащая РНК, кодирующую белковый продукт гена опухолевого супрессора WT1 или его неполный пептид.

(7) Способ индукции специфичных к WT1 CTL, включающий культивирование мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), полученных у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, в присутствии белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1 или его неполного пептида с получением индуцированных из них специфичных к WT1 CTL.

(8) Способ индукции дендритных клеток, презентирующих белковый продукт гена опухолевого супрессора WT1 или его неполный пептид, включающий культивирование незрелых дендритных клеток, полученных у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, в присутствии белкового продукта или его неполного пептида с получением индуцированных из них дендритных клеток, которые презентируют белковый продукт или его неполный пептид.

(9) Способ диагностики злокачественной опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, включающий

i) стадию детекции или количественного определения белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1 или его неполного пептида, антитела к нему или специфичных к WT1 CTL в образце у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, и стадию сравнения количества белка или его неполного пептида, антитела к нему или специфичным к WT1 CTL с количеством белка или его неполного пептида в случае, где злокачественная опухоль не развивается, или

ii) стадию введения положительному по HLA-A*0206 индивидууму специфичных к WT1 CTL, индуцированных способом, указанным в приведенном выше (7), или дендритных клеток, индуцированных способом, указанных в приведенном выше (8), и стадию определения положения или области CTL или дендритных клеток у положительного по HLA-A*0206 индивидуума.

(10) Вакцинная композиция против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, содержащая следующий пептид:

модифицированный пептид на основе пептида WT1₁₈₇: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), или пептида WT1₁₂₆: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), каждый из которых представляет собой неполный пептид белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1, где модифицированный пептид иммуногенен у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

(11) Композиция по указанному выше (10), где модифицированный пептид представляет собой

пептид WT1₁₈₇P1F: Phe Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 11),

пептид WT1₁₈₇P2M: Ser Met Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 16),

пептид WT1₁₈₇P3M: Ser Leu Met Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 20),

пептид WT1₁₂₆P1F: Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 34),

пептид WT1₁₂₆P2L: Arg Leu Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 39),

пептид WT1₁₂₆P3M: Arg Met Met Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 46) или

пептид WT1₁₂₆P9V: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Val (SEQ ID NO: 49).

(12) Способ лечения или профилактики злокачественных опухолей, включающий введение положительному по HLA-A*0206 индивидууму композиции, содержащей белковый продукт гена опухолевого супрессора WT1 или его неполный пептид.

(13) Белковый продукт гена опухолевого супрессора WT1 или его неполный пептид для лечения или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов.

(14) Способ лечения или профилактики злокачественных опухолей, включающий введение положительному по HLA-A*0201 индивидууму композиции, содержащей следующий пептид:

модифицированный пептид на основе пептида WT1₁₈₇: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), или пептида WT1₁₂₆: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), каждый из которых представляет собой неполный пептид белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1, где модифицированный пептид иммуногенен у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов,

(15) Пептид, представляющий собой:

модифицированный пептид на основе пептида WT1₁₈₇: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), или пептид WT1₁₂₆: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), каждый из которых представляет собой неполный пептид белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1, где модифицированный пептид иммуногенен у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов,

для лечения или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

(16) Способ лечения или профилактики злокачественных опухолей, включающий введение РНК, кодирующей белковый продукт гена опухолевого супрессора WT1 или его неполный пептид, в дендритные клетки положительного по HLA-A*0206 индивидуума.

(17) РНК, кодирующая белковый продукт гена опухолевого супрессора WT1 или его неполный пептид, для лечения или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов.

Настоящее изобретение также относится к применению белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1 или его неполного пептида для получения вакцинной композиции против злокачественной опухоли, используемой для лечения или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов.

Настоящее изобретение также относится к применению следующего пептида:

модифицированный пептид на основе пептида WT1₁₈₇: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val (SEQ ID NO: 2), или пептида WT1₁₂₆: Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 3), каждый из которых представляет собой неполный пептид белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1, где модифицированный пептид иммуногенен у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов,

для получения вакцинной композиции против злокачественной опухоли, используемой для лечения или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

Как применяют в настоящем документе, "вакцинная композиция против злокачественной опухоли" (или "композиция против злокачественной опухоли") относится к лекарственному средству, применяемому для профилактики или лечения злокачественной опухоли посредством прививки или введения животному, включая человека. "Лечение", кроме полного излечения болезненного состояния, относится к остановке прогрессирования болезненного состояния посредством ингибирования прогрессирования и/или ухудшения симптомов до некоторой степени даже при неуспехе полного излечения; или к полному или частичному улучшению при болезненном состоянии в направлении излечения. "Профилактика" относится к профилактике, задержке или отсрочиванию развития заболевания.

Следующие термины: мононуклеарные клетки периферической крови, незрелые дендритные клетки, специфичные к WT1 CTL, образцы и т.д., полученные у положительных по HLA-A*0206 или положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, относятся к мононуклеарным клеткам периферической крови, незрелым дендритным клеткам, специфичным к WT1 CTL, биологическим образцам и т.д., таким как кровь, которые выделены или собраны у положительных по HLA-A*0206 или положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, соответственно. Специфичные к WT1 CTL, полученные у положительных по HLA-A*0206 или положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, также включают CTL, индуцированные из мононуклеарных клеток периферической крови, незрелых дендритных клеток или биологических образцов, таких как кровь, которые выделены или собраны у положительных по HLA-A*0206 или положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает возможность индукции in vivo и in vitro специфичных к WT1 CTL у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. Хотя субъекты иммунотерапии с применением содержащей белок WT1 или пептид WT1 вакцины, как правило, ограничены положительными по HLA-A*0201 пациентами и положительными по HLA-A*2402 пациентами, настоящее изобретение может расширить диапазон субъектов положительными по HLA-A*0206 пациентами. HLA-A2, который представляет собой серотип антигенов HLA класса I, наиболее часто встречается у европеоидов (приблизительно 50%), и у подавляющего большинства встречается HLA-A*0201, тогда приблизительно у 4% европеоидов встречается HLA-A*0206. С другой стороны, наиболее частым серотипом у японцев является HLA-A24 (приблизительно 58%), и у подавляющего большинства встречается HLA-A*2402. Приблизительно у 42% японцев встречается HLA-A2. Среди них, только приблизительно у 43% встречается HLA-A*0201, а у других встречается HLA-A*0206 или HLA-A*0207. Другими словами, приблизительно у 18% японцев встречается HLA-A*0201, и приблизительно у 17% японцев встречается HLA-A*0206. Таким образом, тот факт, что, по меньшей мере, рестриктированный по HLA-A*0206 эпитоп CTL идентифицирован у японцев, также как и рестриктированный по HLA-A*0201 эпитоп CTL, очень полезен для расширения диапазона субъектов иммунотерапии против злокачественных опухолей положительными по HLA-A*0206 индивидуумами. Так как этот аллель встречается у 14% китайцев и 9% южнокорейцев, можно применять вакцинную композицию против злокачественной опухоли по настоящему изобретению для дальнейшего расширения диапазона субъектов.

Вакцинная композиция против злокачественной опухоли по настоящему изобретению пригодна для лечения экспрессирующих WT1 злокачественных опухолей, таких как опухоли системы кроветворения и солидные злокачественные опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. Вакцинная композиция против злокачественной опухоли по настоящему изобретению также пригодна для профилактики развития злокачественной опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг. 1 показана цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL, индуцированных из PBMC положительного по HLA-A*0206 здорового донора крови. На фиг. 1a показана цитотоксическая активность против меченных⁵¹Cr B-LCL. На фиг. 1b показано, что цитотоксическая активность против меченных⁵¹Cr аутологичных B-LCL увеличивается параллельно концентрации пептида WT1₁₈₇, используемого для примирования им PBMC.

На фиг. 2 показана цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL, индуцированных из PBMC положительного по HLA-A*0206 здорового донора крови. На фиг. 2a и 2b показана соответствующая цитотоксическая активность CTL, раздельно полученных у двух здоровых доноров крови, отличных от донора крови на фиг. 1a, против меченных⁵¹Cr B-LCL.

На фиг. 3a показана цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL против B-LCL, трансформированных геном WT1, или B-LCL, трансформированных пустым контрольным вектором. На фиг. 3b показана цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL против клеток 0206K562, клеток K562, клеток KH88 или клеток JY.

На фиг. 4 показано ингибирование цитотоксической активности специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL антителами к HLA класса I и/или класса II.

На фиг. 5 показана цитотоксическая активность против меченных⁵¹Cr B-LCL, специфичных к пептиду WT1₁₂₆ CTL, индуцированных из PBMC положительного по HLA-A*0206 здорового донора крови.

На фиг. 6a и 6b показана соответствующая цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₂₆ CTL, раздельно индуцированных у двух различных доноров, против клеток 0206K562, клеток K562, клеток KH88 или клеток JY.

На фиг. 7 показаны результаты проточного цитометрического анализа CTL, окрашенных тетрамерами HLA, связанными с пептидом WT1₁₂₆, и антителами к CD8. CTL индуцированы посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0201 донора 1 модифицированными пептидами.

На фиг. 8 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных стимуляцией PBMC от положительного по HLA-A*0201 донора 1 пептидом WT1₁₂₆P1F.

На фиг. 9 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных стимуляцией PBMC от положительного по HLA-A*0201 донора 1 пептидом WT1₁₂₆P2L.

На фиг. 10 приведены результаты проточного цитометрического анализа CTL, окрашенных тетрамерами HLA, связанными с пептидом WT1₁₂₆, и антителами к CD8. CTL индуцированы посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0201 донора 2 пептидом WT1₁₂₆P2L.

На фиг. 11 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от донора 2 пептидом WT1₁₂₆P2L.

На фиг. 12 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора 3 модифицированными пептидами WT1₁₂₆.

На фиг. 13 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора 3 пептидом WT1₁₂₆P9V.

На фиг. 14 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных стимуляцией PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора 4 модифицированными пептидами WT1₁₂₆.

На фиг. 15 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных стимуляцией PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора 4 модифицированными пептидами WT1₁₂₆.

На фиг. 16 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных стимуляцией PBMC от положительного по HLA-A*0201 донора модифицированными пептидами WT1₁₈₇.

На фиг. 17 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора пептидом WT1₁₈₇P1F.

На фиг. 18 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора пептидом WT1₁₈₇P2M.

На фиг. 19 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₈₇ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 20 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₈₇ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 21 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₈₇ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 22 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₈₇ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 23 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₂₆ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 24 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₂₆ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 25 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₂₆ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 26 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₂₆ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 27 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₂₆ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 28 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₈₇ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 29 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₈₇ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 30 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₂₆ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 31 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₂₆ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

На фиг. 32 приведены результаты оценки действия модифицированных пептидов WT1₁₂₆ на активность индукции специфического клеточного иммунитета.

ЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее в настоящем документе будет проиллюстрировано настоящее изобретение.

Когда в настоящем описании и рисунках сокращенно представляют аминокислотные остатки, используют следующие коды:

Ala или A: остаток аланина

Arg или R: остаток аргинина

Asn или N: остаток аспарагина

Asp или D: остаток аспарагиновой кислоты

Cys или C: остаток цистеина

Gln или Q: остаток глутамина

Glu или E: остаток глутаминовой кислоты

Gly или G: остаток глицина

His или H: остаток гистидина

Ile или I: остаток изолейцина

Leu или L: остаток лейцина

Lys или K: остаток лизина

Met или M: остаток метионина

Phe или F: остаток фенилаланина

Pro или P: остаток пролина

Ser или S: остаток серина

Thr или T: остаток треонина

Trp или W: остаток триптофана

Tyr или Y: остаток тирозина

Val или V: остаток валина

Белок WT1 по настоящему изобретению может представлять собой продукт гена фактора транскрипции типа "цинковый палец", выделенного в качестве гена, являющегося причиной опухоли Вильмса, где продукт гена способен связываться с молекулой HLA-A*0206 и служить, таким образом, в качестве антигена-мишени злокачественных опухолей. Более конкретно, белок WT1 по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой белок WT1 человека, состоящий из 449 аминокислот (список последовательностей: SEQ ID NO: 1), или белок, состоящий из аминокислотной последовательности, где в аминокислотной последовательности белка WT1 человека присутствует делеция, замена или добавление одной или нескольких аминокислот (предпочтительно приблизительно от 2 до 6 аминокислот), и которая является иммуногенной у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. Аминокислоты, используемые для добавления или замены, кроме 20 кодируемых в генах аминокислот, могут являться неприродными аминокислотами.

Неполный пептид белка WT1 (пептид WT1) относится к пептиду, состоящему из части аминокислотной последовательности, составляющей белок WT1. Пептид WT1 может представлять собой пептид, состоящий из аминокислот в количестве от 8 до 12, предпочтительно из аминокислот в количестве от 8 до 9, происходящий из белка WT1 и связывающийся с молекулой HLA-A*0206 и, таким образом, индуцирующий цитотоксические T-клетки. Особенно предпочтительным является пептид WT1₁₈₇ (Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val; SEQ ID NO: 2) или пептид WT1₁₂₆ (Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu; SEQ ID NO: 3), оба описанные в публикации WO 00/06602.

В качестве пептида WT1 по настоящему изобретению также можно использовать модифицированный пептид с наличием делеции, замены или добавления одной или нескольких аминокислот пептида WT1 при условии, что он является иммуногенным у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. Примеры такого модифицированного пептида включают модифицированный пептид WT1₁₈₇ и модифицированный пептид WT1₁₂₆.

Модифицированный пептид WT1₁₈₇ предпочтительно представляет собой пептид, содержащий те же аминокислотные остатки (EQQYS) в положениях от 4 до 8 от N-конца, которые в тех же положениях содержит пептид WT1₁₈₇, а более предпочтительно - пептид, содержащий те же аминокислотные остатки (EQQYSV) в положениях от 4 до 9 от N-конца, которые в соответствующих положениях содержит пептид WT1₁₈₇. Такой модифицированный пептид WT1₁₈₇ предпочтительно представляет собой пептид, состоящий из любой из приведенных далее аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4-26 и 54-62.

Пептид WT1₁₈₇P1G (GLGEQQYSV; SEQ ID NO: 4)

Пептид WT1₁₈₇P1A (ALGEQQYSV; SEQ ID NO: 5)

Пептид WT1₁₈₇P1V (VLGEQQYSV; SEQ ID NO: 6)

Пептид WT1₁₈₇P1L (LLGEQQYSV; SEQ ID NO: 7)

Пептид WT1₁₈₇P1I (ILGEQQYSV; SEQ ID NO: 8)

Пептид WT1₁₈₇P1M (MLGEQQYSV; SEQ ID NO: 9)

Пептид WT1₁₈₇P1W (WLGEQQYSV; SEQ ID NO: 10)

Пептид WT1₁₈₇P1F (FLGEQQYSV; SEQ ID NO: 11)

Пептид WT1₁₈₇P1Y (YLGEQQYSV; SEQ ID NO: 12)

Пептид WT1₁₈₇P2V (SVGEQQYSV; SEQ ID NO: 13)

Пептид WT1₁₈₇P2Q (SQGEQQYSV; SEQ ID NO: 14)

Пептид WT1₁₈₇P2I (SIGEQQYSV; SEQ ID NO: 15)

Пептид WT1₁₈₇P2M (SMGEQQYSV; SEQ ID NO: 16)

Пептид WT1₁₈₇P3L (SLLEQQYSV; SEQ ID NO: 17)

Пептид WT1₁₈₇P3A (SLAEQQYSV; SEQ ID NO: 18)

Пептид WT1₁₈₇P3V (SLVEQQYSV; SEQ ID NO: 19)

Пептид WT1₁₈₇P3M (SLMEQQYSV; SEQ ID NO: 20)

Пептид WT1₁₈₇P3P (SLPEQQYSV; SEQ ID NO: 21)

Пептид WT1₁₈₇P3W (SLWEQQYSV; SEQ ID NO: 22)

Пептид WT1₁₈₇P3F (SLFEQQYSV; SEQ ID NO: 23)

Пептид WT1₁₈₇P3Y (SLYEQQYSV; SEQ ID NO: 24)

Пептид WT1₁₈₇P3S (SLSEQQYSV; SEQ ID NO: 25)

Пептид WT1₁₈₇P3I (SLIEQQYSV; SEQ ID NO: 26)

Пептид WT1₁₈₇P9L (SLGEQQYSL; SEQ ID NO: 53)

Пептид WT1₁₈₇P1D (DLGEQQYSV; SEQ ID NO: 54)

Пептид WT1₁₈₇P1E (ELGEQQYSV; SEQ ID NO: 55)

Пептид WT1₁₈₇P1H (HLGEQQYSV; SEQ ID NO: 56)

Пептид WT1₁₈₇P1K (KLGEQQYSV; SEQ ID NO: 57)

Пептид WT1₁₈₇P1N (NLGEQQYSV; SEQ ID NO: 58)

Пептид WT1₁₈₇P1P (PLGEQQYSV; SEQ ID NO: 59)

Пептид WT1₁₈₇P1Q (QLGEQQYSV; SEQ ID NO: 60)

Пептид WT1₁₈₇P1R (RLGEQQYSV; SEQ ID NO: 61)

Пептид WT1₁₈₇P1T (TLGEQQYSV; SEQ ID NO: 62)

Модифицированный пептид WT1₁₂₆ предпочтительно представляет собой пептид, содержащий те же аминокислотные остатки (PNAPY) в положениях от 4 до 8 от N-конца, которые в соответствующих положениях содержит пептид WT1₁₂₆. Такой модифицированный пептид WT1₁₂₆ предпочтительно представляет собой пептид, состоящий из любой из приведенных далее аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 27-52 и 63-75.

Пептид WT1₁₂₆P1G (GMFPNAPYL; SEQ ID NO: 27)

Пептид WT1₁₂₆P1A (AMFPNAPYL; SEQ ID NO: 28)

Пептид WT1₁₂₆P1V (VMFPNAPYL; SEQ ID NO: 29)

Пептид WT1₁₂₆P1L (LMFPNAPYL; SEQ ID NO: 30)

Пептид WT1₁₂₆P1I (IMFPNAPYL; SEQ ID NO: 31)

Пептид WT1₁₂₆P1M (MMFPNAPYL; SEQ ID NO: 32)

Пептид WT1₁₂₆P1W (WMFPNAPYL; SEQ ID NO: 33)

Пептид WT1₁₂₆P1F (FMFPNAPYL; SEQ ID NO: 34)

Пептид WT1₁₂₆P1Y (YMFPNAPYL; SEQ ID NO: 35)

Пептид WT1₁₂₆P2V (RVFPNAPYL; SEQ ID NO: 36)

Пептид WT1₁₂₆P2Q (RQFPNAPYL; SEQ ID NO: 37)

Пептид WT1₁₂₆P2A (RAFPNAPYL; SEQ ID NO: 38)

Пептид WT1₁₂₆P2L (RLFPNAPYL; SEQ ID NO: 39)

Пептид WT1₁₂₆P2I (RIFPNAPYL; SEQ ID NO: 40)

Пептид WT1₁₂₆P3I (RMIPNAPYL; SEQ ID NO: 41)

Пептид WT1₁₂₆P3L (RMLPNAPYL; SEQ ID NO: 42)

Пептид WT1₁₂₆P3G (RMGPNAPYL; SEQ ID NO: 43)

Пептид WT1₁₂₆P3A (RMAPNAPYL; SEQ ID NO: 44)

Пептид WT1₁₂₆P3V (RMVPNAPYL; SEQ ID NO: 45)

Пептид WT1₁₂₆P3M (RMMPNAPYL; SEQ ID NO: 46)

Пептид WT1₁₂₆P3P (RMPPNAPYL; SEQ ID NO: 47)

Пептид WT1₁₂₆P3W (RMWPNAPYL; SEQ ID NO: 48)

Пептид WT1₁₂₆P9V (RMFPNAPYV; SEQ ID NO: 49)

Пептид WT1₁₂₆P9A (RMFPNAPYA; SEQ ID NO: 50)

Пептид WT1₁₂₆P9I (RMFPNAPYI; SEQ ID NO: 51)

Пептид WT1₁₂₆P9M (RMFPNAPYM; SEQ ID NO: 52)

Пептид WT1₁₂₆P1D (DMFPNAPYL; SEQ ID NO: 63)

Пептид WT1₁₂₆P1E (EMFPNAPYL; SEQ ID NO: 64)

Пептид WT1₁₂₆P1H (HMFPNAPYL; SEQ ID NO: 65)

Пептид WT1₁₂₆P1K (KMFPNAPYL; SEQ ID NO: 66)

Пептид WT1₁₂₆P1N (NMFPNAPYL; SEQ ID NO: 67)

Пептид WT1₁₂₆P1P (PMFPNAPYL; SEQ ID NO: 68)

Пептид WT1₁₂₆P1Q (QMFPNAPYL; SEQ ID NO: 69)

Пептид WT1₁₂₆P1S (SMFPNAPYL; SEQ ID NO: 70)

Пептид WT1₁₂₆P1T (TMFPNAPYL; SEQ ID NO: 71)

Пептид WT1₁₂₆P2I&P9I (RIFPNAPYI; SEQ ID NO: 72)

Пептид WT1₁₂₆P2I&P9V (RIFPNAPYV; SEQ ID NO: 73)

Пептид WT1126P2L&P9I (RLFPNAPYI; SEQ ID NO: 74)

Пептид WT1126P2L&P9V (RLFPNAPYV; SEQ ID NO: 75)

Кроме прочего, модифицированный пептид WT1₁₈₇ предпочтительно представляет собой пептид WT1₁₈₇P1F (SEQ ID NO: 11), пептид WT1₁₈₇P2M (SEQ ID NO: 16) или пептид WT1₁₈₇P3M (SEQ ID NO: 20), более предпочтительно - пептид WT1₁₈₇P1F или пептид WT1₁₈₇P2M, а еще более предпочтительно - пептид WT1₁₈₇P2M. Модифицированный пептид WT1₁₂₆ предпочтительно представляет собой пептид WT1₁₂₆P1F (SEQ ID NO: 34), пептид WT1₁₂₆P2L (SEQ ID NO: 39), пептид WT1₁₂₆P3M (SEQ ID NO: 46) или пептид WT1₁₂₆P9V (SEQ ID NO: 49), более предпочтительно - пептид WT1₁₂₆P2L, пептид WT1₁₂₆P3M или пептид WT1₁₂₆P9V, а еще более предпочтительно - пептид WT1₁₂₆P9V.

Пептид WT1 в вакцинной композиции против злокачественной опухоли по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой пептид WT1₁₈₇, пептид WT1₁₂₆, пептид WT1₁₈₇P1F, пептид WT1₁₈₇P2M, пептид WT1₁₈₇P3M, пептид WT1₁₂₆P1F, пептид WT1₁₂₆P2L, пептид WT1₁₂₆P3M или пептид WT1₁₂₆P9V. Более предпочтителен пептид WT1₁₈₇, пептид WT1₁₂₆, пептид WT1₁₈₇P1F, пептид WT1₁₈₇P2M, пептид WT1₁₂₆P2L, пептид WT1₁₂₆P3M или пептид WT1₁₂₆P9V. Еще предпочтительнее пептид WT1₁₈₇, пептид WT1₁₂₆, пептид WT1₁₈₇P2M или пептид WT1₁₂₆P9V. Особенно предпочтителен пептид WT1₁₈₇ или пептид WT1₁₂₆.

Также в качестве пептида WT1 можно использовать производное пептида WT1. Например, производное пептида WT1₁₈₇ или WT1₁₂₆ может быть образовано из аминокислотной последовательности из указанных выше 9 смежных аминокислот и различных веществ, связанных с ее N- и/или C-концом. Различные вещества могут представлять собой, например, аминокислоты, пептиды, их аналоги и т.д. Такое вещество, связанное с пептидом WT1₁₈₇, пептидом WT1₁₂₆ или их модифицированным пептидом претерпевает, например, in vivo, ферментативное преобразование в результате внутриклеточного процессинга и т.д., и, наконец, образуется пептид, состоящий из указанных выше 9 аминокислот и представляется в виде комплекса с молекулой HLA-A*0206 на клеточной поверхности. Таким образом, у пациентов с HLA-A*0206 можно индуцировать специфичный ответ CTL на WT1.

Пептид WT1 можно получать способом, как правило используемым в данной области техники, таким как способ пептидного синтеза, описанный в Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966; The Proteins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; Peptide synthesis, Maruzen Co., Ltd., 1975; Basis and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen Co., Ltd. 1985; the Sequel to Development of Pharmaceuticals, Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa Publishing Company, 1991 и т.д.

В качестве способа скрининга пептида WT1 и его модифицированного пептида, вследствие простоты, предпочтителен, например, способ, включающий проведение анализа IFNγ при одноразовой стимуляции пептидом PBMC (мононуклеарных клеток периферической крови) некоторых пациентов с HLA-A*0206, а затем отбор пептида, демонстрирующего хороший ответ.

В настоящем изобретении в качестве активного ингредиента вакцинной композиции против злокачественной опухоли также можно использовать полинуклеотиды, такие как ДНК, кодирующую указанный выше белок WT1 или пептид WT1, иммуногенный у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. То есть, вставляя полинуклеотид, кодирующий белок WT1 или пептид WT1, в подходящий вектор, предпочтительно экспрессирующий вектор, и затем, вводя вектор животным, включая людей, в живом организме можно индуцировать направленный на злокачественные опухоли иммунитет. Примеры полинуклеотида включают ДНК, РНК и т.п., а предпочтительными являются ДНК или РНК. Последовательность оснований полинуклеотида можно определять на основе аминокислотной последовательности белка WT1 или пептида WT1, иммуногенного у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. Полинуклеотид можно получать известным способом синтеза ДНК или РНК, способом ПЦР и т.д. Такая вакцинная композиция против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, содержащая ДНК, кодирующую белок WT1 или пептид WT1, также является одним из аспектов настоящего изобретения. Белок WT1 или пептид WT1 предпочтительно представляет собой пептид WT1, более предпочтительно - пептид WT1₁₈₇, пептид WT1₁₂₆ или его модифицированный пептид, а наиболее предпочтительно - пептид WT1₁₈₇ или пептид WT1₁₂₆. Экспрессирующий вектор, используемый для вставки в него указанной выше ДНК, конкретно не ограничен. РНК не нужно вставлять в вектор, а можно использовать в качестве активного ингредиента композиции как есть.

Вакцинная композиция против злокачественной опухоли по настоящему изобретению может содержать адъювант. Адъювант не ограничен, при условии, что, после введения вместе или раздельно с белком WT1 или пептидом WT1, используемым как антиген, он может неспецифически усиливать иммунный ответ на антиген. Примеры адъюванта включают адъюванты осаждающего типа и масляные адъюванты. Примеры адъювантов осаждающего типа включают гидроксид натрия, гидроксид алюминия, фосфат кальция, фосфат алюминия, квасцы, PEPES и карбоксивиниловые полимеры. Предпочтительным масляным адъювантом является адъювант, который может формировать мицеллы так, что масло заключает водный раствор антигена. Конкретные их примеры включают парафиновое масло, ланолин, Freund, Montanide ISA-763AVG, Montanide ISA-51, неполный адъювант Фрейнда и полный адъювант Фрейнда. Эти адъюванты также можно использовать в виде смеси двух или более их видов. Предпочтительным является масляный адъювант.

Количество адъюванта в вакцинной композиции против злокачественной опухоли по настоящему изобретению конкретно не ограничено при условии, что иммунологический ответ на антигены можно неспецифически усилить. Его количество можно соответственно выбрать в зависимости от вида адъюванта и т.д.

Вакцинную композицию против злокачественной опухоли по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально (например, интраперитонеально, подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно, интраназально и т.д.). В случае парентерального введения активный ингредиент, т.е. белок WT1 или пептид WT1, также может впитываться через кожу посредством нанесения вакцинной композиции на кожу, или посредством прикрепления к коже пластыря, содержащего вакцинную композицию. Вакцинную композицию по настоящему изобретению также можно водить посредством ингаляции и т.д. Вакцинную композицию предпочтительно вводят парентерально, а более предпочтительно - внутрикожно или подкожно. Например, часть тела для интрадермального или подкожного введения предпочтительно представляет собой плечо и т.д.

Вакцинная композиция против злокачественной опухоли по настоящему изобретению может находиться в различных лекарственных формах в зависимости от способа его введения, а его иллюстративные лекарственные формы включают твердый препарат и жидкий препарат. Вакцинная композиция против злокачественной опухоли может находиться, например, в форме твердого или жидкого препарата для внутреннего применения путем перорального введения, в форме инъекции для парентерального введения и т.п.

Примеры твердых препаратов для внутреннего применения посредством перорального введения включают таблетки, пилюли, капсулы, порошки и гранулы.

Для получения твердого препарата для внутреннего применения белок WT1 или пептид WT1 не обрабатывают, смешивают с добавкой или гранулируют (например, в соответствии со способом грануляции при перемешивании, грануляции в псевдоожиженном слое, сухой грануляции, грануляции в псевдоожиженном слое при вращении и перемешивании и т.д.), а затем обрабатывают обычным способом. Например, капсулы можно получать посредством инкапсуляции и т.д., а таблетки можно получать посредством таблетирования и т.д. В твердый препарат соответствующим образом можно добавлять один или два или более видов добавок. Примеры добавок включают эксципиенты, такие как лактоза, маннит, глюкоза, микрокристаллическая целлюлоза и кукурузный крахмал; связывающие средства, такие как гидроксипропилцеллюлоза, поливинилпирролидон и алюминометасиликат магния; диспергирующие средства, такие как кукурузный крахмал; дезинтегрирующие средства, такие как карбоксиметилцеллюлоза кальция; смазывающие средства, такие как стеарат магния; растворители, такие как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота; стабилизаторы; водорастворимые полимеры, включая целлюлозы, такие как гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза и метилцеллюлоза, и синтетические полимеры, такие как полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон и поливиниловый спирт; и подсластители, такие как белый сахар, порошковый сахар, сахароза, фруктоза, глюкоза, лактоза, сироп из восстановленной мальтозы (мальтитный сироп), порошок сиропа из восстановленной мальтозы (порошок мальтитного сиропа), кукурузный сироп с высоким содержанием глюкозы, кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы, мед, сорбит, мальтит, маннит, ксилит, эритритол, аспартам, сахарин и сахаринат натрия.

Если необходимо, гранулы или таблетки можно покрывать покрывающим средством и т.д., и их можно покрывать двумя или более его слоями. Примеры покрывающего средства включают белый сахар, желатин, фталат гидроксипропилцеллюлозы и гидроксипропилметилцеллюлозы. Капсулы можно получать, смешивая активный ингредиент с гидратом пранлукаста и эксципиентом, соответствующим образом выбранным из указанных выше эксципиентов, необязательно гранулируя смесь и необязательно покрывая полученные гранулы покрывающим средством с последующим заполнением капсул. Альтернативно капсулы можно получать, добавляя в соответствующую основу для капсул (желатин и т.д.) глицерин, сорбит и т.д. для увеличения ее пластичности, и инкапсулируя активный ингредиент в полученную основу. Если необходимо, к основе для капсул можно добавлять окрашивающее вещество или консервант (диоксид серы и парабены, такие как метилпарагидроксибензоат, этилпарагидроксибензоат и пропилпарагидроксибензоат). Капсулы включают твердые капсулы и мягкие капсулы.

Примеры жидкого препарата для внутреннего применения путем перорального введения включают воду, суспензии/эмульсии, сиропы, препараты для растворения перед применением, такие как безводные сиропы и эликсиры. Для получения жидкого препарата для внутреннего применения белок WT1 или пептид WT1 растворяют, суспендируют или эмульгируют в разбавителе, как правило, применяемом для жидких препаратов для внутреннего применения. Примеры разбавителя включают очищенную воду, этанол и их смесь. Жидкий препарат может дополнительно содержать увлажнитель, суспендирующее средство, эмульгатор, подсластитель, средство для придания вкуса, ароматизатор, консервант или буферное средство. Например, безводные сиропы можно получать, смешивая активный ингредиент с гидратом пранлукаста и добавляя такой ингредиент, как белый сахар, порошковый сахар, сахароза, фруктоза, глюкоза и лактоза. Также безводные сиропы можно обычным способом помещать в гранулы.

Примеры лекарственной формы для парентерального введения включают инъекционные формы, мази, гели, кремы, пластыри, аэрозоли и спреи. Предпочтительными являются инъекционные формы. Например, инъекционная форма предпочтительно содержит традиционный носитель с белком WT1 или пептидом WT1.

Инъекционная форма для парентерального введения может представлять собой водную инъекционную форму или масляную инъекционную формы. Водную инъекционную форму можно получать известным способом, например, соответствующим образом добавляя фармацевтически приемлемую добавку к водному растворителю (вода для инъекций, очищенная вода и т.д.) с получением раствора, смешивая белок WT1 или пептид WT1 с раствором, стерилизуя посредством фильтрации полученную смесь с применением фильтра и т.д., а затем заполняя полученным фильтратом асептический контейнер. Примеры фармацевтически приемлемой добавки включают указанные выше адъюванты; средства придания изотоничности, такие как хлорид натрия, хлорид калия, глицерин, маннит, сорбит, борная кислота, бура, глюкоза и пропиленгликоль; буферные средства, такие как раствор фосфатного буфера, раствор ацетатного буфера, раствор боратного буфера, раствор карбонатного буфера, раствор цитратного буфера, раствор буфера Tris, раствор глутаматного буфера и раствор соли эпсилон-аминокапроновой кислоты; консерванты, такие как метилпарагидроксибензоат, этилпарагидроксибензоат, пропилпарагидроксибензоат, бутилпарагидроксибензоат, хлорбутанол, бензиловый спирт, хлорид бензалкония, дегидроацетат натрия, эдетат натрия, борная кислота и бура; загустители, такие как гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, поливиниловый спирт и полиэтиленгликоль; стабилизаторы, такие как гидросульфит натрия, тиосульфат натрия, эдетат натрия, цитрат натрия, аскорбиновая кислота и дибутилгидрокситолуол; и регуляторы pH, такие как соляная кислота, гидроксид натрия, фосфорная кислота и уксусная кислота. Инъекционная форма может дополнительно содержать подходящий растворитель, и его примеры включают спирты, такие как этанол; полиспирты, такие как пропиленгликоль и полиэтиленгликоль; и неионные поверхностно-активные средства, такие как полисорбат 80, полиоксиэтилен-гидрогенизированное касторовое масло 50, лизолецитин и полиолы-плюроники. Также в инъекционной форме могут содержаться белки, такие как бычий сывороточный альбумин и гемоцианин морского блюдца; полисахариды, такие как аминодекстран, и т.д. Для препарата масляной инъекционной формы в качестве масляного растворителя используют, например, кунжутное масло или соевое масло, а в качестве солюбилизатора можно смешивать бензилбензоат или бензиловый спирт. Полученную инъекционную форму, как правило, хранят в подходящей ампуле, флаконе и т.д. Из жидких препаратов, таких как инъекционные формы, также можно удалять влагу и их можно сохранять посредством криоконсервации или лиофилизации. Лиофилизированные препараты готовят к применению посредством повторного их растворения в добавляемой дистиллированной воде для инъекций и т.д. непосредственно перед применением.

Другая лекарственная форма вакцинной композиции против злокачественной опухоли по настоящему изобретению может представлять собой липосому, содержащую белок WT1 или пептид WT1 и, если необходимо, полисахариды и/или другие ингредиенты, которые можно смешивать в вакцинную композицию против злокачественной опухоли.

Доза вакцинной композиции против злокачественной опухоли по настоящему изобретению варьирует в зависимости от разновидности используемых белка WT1, пептида WT1 или ДНК, возраста и массы тела пациента, подлежащего лечению заболевания и т.д. Например, в случае вакцинной композиции, содержащей пептид WT1, например, пептид WT1₁₈₇ или пептид WT1₁₂₆, суточная доза предпочтительно составляет приблизительно от 0,1 мкг/кг массы тела до 1 мг/кг массы тела в расчете на количество пептида WT1. Доза пептида WT1, как правило, составляет от 0,0001 мг до 1000 мг, предпочтительно - от 0,01 мг до 1000 мг, и более предпочтительно - от 0,1 мг до 10 мг. Это количество предпочтительно вводят один раз в течение срока от нескольких суток до нескольких месяцев.

Вакцинная композиция против злокачественной опухоли по настоящему изобретению представляет собой вакцинную композицию против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. Тип HLA, который является характеристикой для отбора положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, можно определять, например, по периферической крови доноров. Примеры способа определения типа HLA включают известные способы, такие как способ типирования ДНК, например, способ SBT (типирования на основе секвенирования) или способ SSP, и способ типирования HLA. В способе SBT для точного определения генотипа HLA последовательность оснований амплифицированной посредством ПЦР ДНК сравнивают с данными о последовательности оснований известных аллелей. В способе SSP после амплификации посредством ПЦР с использованием множества праймеров, специфичных для соответствующих аллелей HLA, проводят последующий электрофорез для проверки наличия конкретной полосы. Таким образом, можно идентифицировать генотип HLA.

Когда вакцинную композицию против злокачественной опухоли по настоящему изобретению вводят положительному по HLA-A*0206 индивидууму, то рестриктированный по HLA-A*0206 белок WT1 или пептид WT1 в вакцинной композиции или белок WT1 или пептид WT1, экспрессированный с ДНК или РНК в вакцинной композиции, связывается с молекулой HLA-A*0206 на поверхности антигенпредставляющей клетки (дендритной клетки) положительного по HLA-A*0206 индивидуума. Это индуцирует специфический противоопухолевый иммунитет, т.е. специфичные к WT1 CTL, которые разрушают злокачественные клетки у индивидуума (положительного по HLA-A*0206 индивидуума).

Такой противоопухолевый иммунитет можно проверять, например, посредством специфичного ответа CTL на WT1, тестирования цитотоксичности против злокачественных клеток (например, тестирования цитотоксичности по высвобождению⁵¹Cr) и т.д. Например, рестриктированные по HLA-A*0201 пептид WT1₁₈₇ и пептид WT1₁₂₆, каждый состоящий из 9 аминокислот, происходящих из белка WT1, который, как опубликовано, способен индуцировать специфичный ответ CTL на WT1, могут индуцировать рестриктированный по HLA-A*0206 ответ. Приблизительно 17% японцев являются положительными по HLA-A*0206, в то же время почти такая же часть положительна по HLA-A*0201. В следующих ниже примерах с 1 по 5, специфичные к пептиду WT1₁₈₇ CTL получают из PBMC трех положительных по HLA-A*0206 доноров крови. Индуцированные CTL продемонстрировали цитотоксическое действие на экспрессирующие WT1 положительные по HLA-A*0206 лейкозные клетки. Так как специфичную к пептиду WT1₁₈₇ и к пептиду WT1₁₂₆ активность CTL можно ингибировать посредством антител к HLA класса I, выявлено, что эту активность демонстрируют рестриктированные по HLA класса I CTL. Белок WT1 или пептид WT1, включая пептид WT1₁₈₇ и/или пептид WT1₁₂₆, или их модифицированные пептиды могут представлять собой вакцину для положительных по HLA-A*0206 пациентов со злокачественными опухолями, а также положительных по HLA-A*0201 пациентов со злокачественными опухолями. Таким образом, иммунотерапию на основе белка WT1 или пептида WT1 для пациентов со злокачественными опухолями, такими как опухоли системы кроветворения и солидные злокачественные опухоли, можно дополнительно применять для положительных по HLA-A*0206 пациентов со злокачественными опухолями. Способ лечения и/или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, включающий введение вакцинной композиции против злокачественной опухоли по настоящему изобретению положительному по HLA-A*0206 индивидууму, является одним из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

У положительных по HLA-A*0206 индивидуумов вакцинную композицию против злокачественной опухоли по настоящему изобретению можно использовать для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей, сопровождающихся увеличенной экспрессией гена WT1: например, опухолей системы кроветворения, таких как лейкоз, миелодиспластический синдром, множественная миелома и злокачественная лимфома; и солидных злокачественных опухолей, таких как рак желудка, рак толстого кишечника, рак легких, рак молочной железы, рак половых клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки и рак яичников.

Иллюстративный способ введения вакцинной композиции против злокачественной опухоли по настоящему изобретению представляет собой способ, включающий сбор PBMC из периферической крови положительного по HLA-A*0206 пациента, извлечение дендритных клеток из PBMC, примирование дендритных клеток пептидом, например пептидом WT1₁₈₇ или пептидом WT1₁₂₆, или полинуклеотидом, например ДНК или РНК, содержащихся в качестве активного ингредиента в вакцинной композиции против злокачественной опухоли по настоящему изобретению, и возврат дендритных клеток пациенту посредством подкожного введения и т.д. Условия для примирования дендритных клеток пептидом WT1 и т.д. конкретно не ограничены, при условии, что достигается эффект по настоящему изобретению, и они могут представлять собой обычные условия.

В случае, когда для вакцинной композиции против злокачественной опухоли используют РНК, кодирующую белок WT1 или пептид WT1, предпочтительно, чтобы композицию вводили так, чтобы РНК входила в дендритные клетки положительного по HLA-A*0206 индивидуума. Иллюстративный способ введения РНК в дендритные клетки положительного по HLA-A*0206 индивидуума представляет собой способ, включающий сбор дендритных клеток у положительного по HLA-A*0206 индивидуума таким же способом, как указано выше, и введение РНК в дендритные клетки посредством электрического импульса. Белку WT1 или пептиду WT1, экспрессируемым с введенной в дендритные клетки РНК, позволяют презентироваться на их поверхности. Возвращая примированные РНК дендритные клетки положительному по HLA-A*0206 индивидууму, в живом организме можно быстро индуцировать направленный на злокачественные опухоли иммунитет. Такой способ лечения или профилактики злокачественных опухолей, включающий введение РНК, кодирующей белок WT1 или пептид WT1 в дендритные клетки положительного по HLA-A*0206 индивидуума, представляет собой один из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу индукции специфичных к WT1 CTL, культивируя PBMC, полученные у положительного по HLA-A*0206 индивидуума в присутствии белка WT1 или пептида WT1, с получением индуцируемых из них специфичных к WT1 CTL. Индивидуум, у которого можно получать PBMC, конкретно не ограничен, при условии, что индивидуум положителен по HLA-A*0206. Примеры белка WT1 или пептида WT1 включают пептид WT1₁₈₇, пептид WT1₁₂₆ и их модифицированный пептид, а предпочтительно - пептид WT1₁₈₇ и пептид WT1₁₂₆. Например, специфичные к WT1 CTL можно индуцировать из клеток-предшественников CTL, находящихся среди PBMC, культивируя PBMC, полученные у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, в присутствии пептида WT1₁₈₇ (или пептида WT1₁₂₆). Условия культивирования PBMC, полученных у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, конкретно не ограничены и могут представлять собой обычные условия. Полученные, таким образом, CTL распознают комплекс пептида WT1₁₈₇ (или пептида WT1₁₂₆) и молекулы HLA-A*0206. Таким образом, используя специфичные к WT1 CTL, индуцированные по настоящему изобретению, у положительного по HLA-A*0206 индивидуума можно специфически разрушать высокоэкспрессирующие WT1 опухолевые клетки, и, таким образом, можно лечить и/или предотвращать опухоли системы кроветворения и солидные злокачественные опухоли у индивидуума, т.е. положительного по HLA-A*0206 индивидуума. Способ введения таких специфичных к WT1 CTL положительному по HLA-A*0206 индивидууму конкретно не ограничен и, например, может являться таким же, как способ введения указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору для индукции специфичных к WT1 CTL, содержащему в качестве основного составляющего рестриктированный по HLA-A*0206 белок WT1 или пептид WT1. Предпочтительно набор используют для указанного выше способа индукции специфичных к WT1 CTL, полученных у положительного по HLA-A*0206 индивидуума. Такой набор в дополнение к рестриктированному по HLA-A*0206 белку WT1 или пептиду WT1 может содержать, например, средства для сбора PBMC, адъювант и реакционный контейнер. Используя набор можно эффективно индуцировать специфичные к WT1 CTL, распознающие комплекс антигена злокачественной опухоли, такого как пептид WT1₁₈₇ и пептид WT1₁₂₆, и молекулы HLA-A*0206.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу индукции дендритных клеток, которые презентируют белок WT1 или пептид WT1, культивируя незрелые дендритные клетки, полученные у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, в присутствии белка WT1 или пептида WT1, с получением индуцированных из них дендритных клеток, которые презентируют белок WT1 или пептид WT1. Примеры белка WT1 или пептида WT1 включают пептид WT1₁₈₇, пептид WT1₁₂₆ и их модифицированный пептид, а предпочтительно - пептид WT1₁₈₇ и пептид WT1₁₂₆. Индивидуум, у которого получают незрелые дендритные клетки, конкретно не ограничен, при условии, что индивидуум является положительным по HLA-A*0206. Так как незрелые дендритные клетки находятся среди PBMC и т.д., PBMC также можно культивировать в присутствии, например, пептида WT1₁₈₇ или пептида WT1₁₂₆. При введении полученных таким образом дендритных клеток положительному по HLA-A*0206 индивидууму, эффективно индуцируются указанные выше специфичные к WT1 CTL, и, таким образом, можно лечить и/или предотвращать опухоли системы кроветворения и солидные злокачественные опухоли у индивидуума. Способ введения таких дендритных клеток положительному по HLA-A*0206 индивидууму конкретно не ограничен и, например, может являться таким же, как способ введения указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору для индукции дендритных клеток, которые презентируют белок WT1 или пептид WT1, содержащему в качестве основного составляющего рестриктированный по HLA-A*0206 белок WT1 или пептид WT1. Предпочтительно набор используют для указанного выше способа индукции дендритных клеток. Такой набор в дополнение к рестриктированному по HLA-A*0206 белку WT1 или пептиду WT1 может содержать, например, средства для сбора незрелых дендритных клеток и PBMC, адъювант и реакционный контейнер. Используя набор можно эффективно индуцировать дендритные клетки, презентирующие белок WT1 или пептид WT1 посредством молекулы HLA-A*0206.

Злокачественные опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов можно диагностировать, используя

(1) белок WT1 или пептид WT1, специфичные к WT1 CTL, индуцированные указанным выше способом, или дендритные клетки, индуцированные указанным выше способом, или

(2) антитело к следующему: белок WT1 или пептид WT1, специфичные к WT1 CTL, индуцированные указанным выше способом, или дендритные клетки, индуцированные указанным выше способом.

Такой способ диагностики злокачественных опухолей также является одним из аспектов настоящего изобретения. В указанном выше пункте (1), диагностику злокачественной опухоли предпочтительно проводят с применением специфичных к WT1 CTL, индуцированных указанным выше способом. Примеры белка WT1 или пептида WT1 включают пептид WT1₁₈₇, пептид WT1₁₂₆ и их модифицированный пептид, а предпочтительно - пептид WT1₁₈₇ и пептид WT1₁₂₆.

Иллюстративный способ диагностики злокачественной опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов по настоящему изобретению включает стадию детекции или количественного определения белка WT1 или пептида WT1, антител к ним или специфичных к WT1 CTL в образце, взятом у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, и стадию сравнения количества белка или его неполного пептида, антител к ним или специфичных к WT1 CTL, с количеством белка или его неполного пептида, антител к ним или специфичных к WT1 CTL, в том случае, когда злокачественная опухоль не развивается.

В образце, взятом у пациента со злокачественной опухолью (например, в крови), присутствует пептид WT1 и/или белок WT1, высвобождаемые из злокачественных клеток, и усилен иммунологический ответ на антиген злокачественной опухоли. То есть, образец, взятый у пациента со злокачественной опухолью, содержит увеличенное количество антител к пептиду WT1 или белку WT1, специфичным к WT1 CTL и т.д. Поэтому, когда количество пептида WT1 или белка WT1, антител к ним или специфичных к WT1 CTL в образце увеличено по сравнению с количеством пептида WT1 или белка WT1, антител к ним или специфичных к WT1 CTL, в случае, когда злокачественная опухоль не развивается, возможно развилась злокачественная опухоль. Количество антител можно измерять, например, способом ELISA. Специфичные к WT1 CTL можно детектировать способом с использованием мультимеров WT1, таких как тетрамеры MHC, описанные ниже.

Альтернативно диагностику злокачественной опухоли также можно проводить посредством инкубации указанных выше CTL, дендритных клеток или антител совместно с образцом, взятым у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, или вводя указанные выше CTL, дендритные клетки или антитела положительному по HLA-A*0206 индивидууму; а затем проводя определение расположения, области, количества и т.д. CTL, дендритных клеток или антител. Так как CTL и дендритные клетки обладают свойством собираться вокруг злокачественных клеток, можно осуществлять диагностику злокачественной опухоли посредством введения CTL или дендритных клеток индивидууму, и проверяя их расположение или область. Способ диагностики злокачественной опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, включающий стадию введения специфичных к WT1 CTL или дендритных клеток, индуцированных указанным выше способом, положительному по HLA-A*0206 индивидууму, и стадию определения расположения или области CTL или дендритных клеток у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения.

Диагностику злокачественной опухоли также можно осуществлять, инкубируя CTL или дендритные клетки совместно с образцом, взятым у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, позволяя им реагировать, добавляя антитела к CTL или дендритным клеткам, продолжая инкубацию, и детектируя или количественно определяя посредством связанной с антителом метки и т.д. связанные антителами комплексы злокачественных клеток и CTL, связанные антителами дендритные клетки и т.д. Когда количество связанных антителами комплексов злокачественных клеток и CTL или связанных антителами дендритных клеток по сравнению со связанными антителами комплексами злокачественных клеток и CTL или связанными антителами дендритными клетками, в том случае, когда злокачественная опухоль не развивается, возможно, произошло развитие злокачественной опухоли. Указанные выше CTL, дендритные клетки или антитела могут быть мечеными. Мечение позволяет эффективное проведение диагностики. Примеры образца, взятого у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, включают биологические образцы, получаемые у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, такие как моча, кровь, жидкость тканевого экстракта, слюна, слезы и другие биологические жидкости, а предпочтительной является кровь.

Примеры способа диагностики злокачественной опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов с применением указанного выше белка WT1 или пептида WT1 включают анализ с тетрамерами MHC, анализ с пентамерами MHC и анализ с декстрамерами MHC, в каждом из которых в качестве антигена используют пептид WT1. Например, в анализе с тетрамерами MHC или анализе с пентамерами MHC с применением пептида WT1₁₈₇ или пептида WT1₁₂₆ в качестве антигенного пептида, специфичные к WT1 CTL у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов можно детектировать, применяя в качестве зонда комплекс MHC/пептид WT1₁₈₇ или комплекс MHC/пептид WT1₁₂₆. Так как пациенты со злокачественными опухолями демонстрируют высокую экспрессию специфичных к WT1 CTL, злокачественную опухоль можно диагностировать, изменяя экспрессию специфичных к WT1 CTL у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. Так как у пациентов со злокачественными опухолями развивается развернутый иммунный ответ на антигены злокачественных опухолей, злокачественную опухоль также можно диагностировать, тестируя иммунный ответ на белок WT1 или пептид WT1 у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. Примеры способа тестирования иммунного ответа включают способ, включающий измерение концентрации антител к белку WT1 или пептиду WT1 посредством ELISA. Такой способ диагностики злокачественной опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов с использованием белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1 или его неполного пептида также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения. Анализ с тетрамерами MHC и анализ с пентамерами MHC можно осуществлять известным способом с применением коммерчески доступного набора, например, "WT1 tetramer" (Medical & Biological Laboratories, Co., Ltd.).

Диагностику злокачественных опухолей для положительных по HLA-A*0206 индивидуумов также можно осуществлять способом, включающим стадию взаимодействия образца, взятого у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, с антителом к следующему: белок WT1 или пептид WT1, специфичные к WT1 CTL, индуцированные указанным выше способом, или дендритные клетки, индуцированные указанным выше способом, и стадию детекции или количественного определения комплекса антитела с белком WT1 или пептидом WT1, или комплекса антитела со специфичными к WT1 CTL или дендритными клетками. Когда количество комплекса антитела с белком WT1 или пептидом WT1, или комплекса антитела со специфичными к WT1 CTL или дендритными клетками по сравнению с количеством комплекса антитела с белком WT1 или пептидом WT1, или комплекса антитела со специфичными к WT1 CTL или дендритными клетками, в случае, когда злокачественная опухоль не развивается, увеличено, возможно, произошло развитие злокачественной опухоли.

Примеры антитела к дендритным клеткам включают антитело, распознающее комплекс пептид WT1/HLA-A*0206. Так как такое антитело может распознавать пептид WT1 и молекулу HLA-A*0206, антитело может распознавать дендритные клетки с пептидом WT1, презентированным HLA класса I.

В качестве антитела к дендритным клеткам также можно использовать антитело, распознающее комплекс пептида WT1/HLA-A*0206/TCR (рецептор T-клеточных антигенов) CTL. Такое антитело может распознавать комплекс дендритной клетки и CTL и комплекс злокачественной клетки и CTL.

Диагностику злокачественной опухоли можно осуществлять, инкубируя такие антитела совместно с образцом, взятым у положительного по HLA-A*0206 индивидуума, позволяя им формировать комплекс, и детектируя или количественно определяя связанный антителами комплекс злокачественной клетки и CTL, связанные антителами дендритные клетки, презентирующие пептид WT1, или т.п. посредством флуоресцентного излучения излучаемого антителами. Когда количество связанного антителами комплекса злокачественных клеток и CTL, связанных антителами дендритных клеток, презентирующих пептид WT или т.п. по сравнению с количеством связанного антителами комплекса злокачественных клеток и CTL, связанных антителами дендритных клеток, презентирующих пептид WT, или т.п., в том случае, когда злокачественная опухоль не развивается, увеличено, возможно, произошло развитие злокачественной опухоли.

Способ лечения или профилактики злокачественных опухолей, включающий введение композиции, содержащей белок WT1 или пептид WT1, положительному по HLA-A*0206 индивидууму, также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения. Композиция, содержащая белок WT1 или пептид WT1 и их предпочтительные варианты осуществления, является такой же, как описано в отношении указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли.

Применение белка WT1 или пептида WT1 для лечения или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов и их применение для получения вакцинной композиции против злокачественной опухоли, используемой для лечения или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов, также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения. Белок WT1 или пептид WT1 и их предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как описано в отношении указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли.

Вакцинная композиция против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, содержащая модифицированный пептид на основе пептида WT1₁₈₇ (SEQ ID NO: 2) или пептида WT1₁₂₆ (SEQ ID NO: 3), каждый из которых представляет собой неполный пептид белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1, где модифицированный пептид иммуногенен у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения.

Примеры модифицированного пептида WT1₁₈₇ или модифицированного пептида WT1₁₂₆ включают пептиды с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в указанном выше пептиде WT1₁₈₇ или пептиде WT1₁₂₆. Модифицированный пептид WT1₁₈₇ предпочтительно представляет собой пептид, содержащий те же аминокислотные остатки в положениях от 4 до 8 от N-конца, которые в соответствующих положениях содержит пептид WT1₁₈₇. В качестве такого модифицированного пептида предпочтительными являются указанные выше пептиды SEQ ID NO: 4-12, 15 и 16, 18-20 и 22-25. Также является предпочтительным пептид WT1₁₈₇P9L (SLGEQQYSL; SEQ ID NO: 53). Модифицированный пептид WT1₁₂₆ предпочтительно представляет собой пептид, содержащий те же аминокислотные остатки в положениях от 4 до 8 от N-конца, которые в соответствующих положениях содержит пептид WT1₁₂₆. Например, предпочтительными являются указанные выше пептиды SEQ ID NO: 27-37 и 39-52.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве модифицированного пептида WT1₁₈₇ можно использовать указанные выше пептиды SEQ ID NO: 4-26 и 53-62, а в качестве модифицированного пептида WT1₁₂₆ можно использовать указанные выше пептиды SEQ ID NO: 27-52 и 63-75. Среди модифицированных пептидов SEQ ID NO: 4-75, предпочтительными являются пептиды за исключением пептида WT1₁₈₇P1D, пептида WT1₁₈₇P1E, пептида WT1₁₈₇P1H, пептида WT1₁₈₇P1P и пептида WT1₁₈₇P2Q и пептида WT1₁₂₆P1D, пептида WT1₁₂₆P1E, пептида WT1₁₂₆P1P, пептида WT1₁₂₆P2A и пептида WT1₁₂₆P2Q.

В частности, модифицированный пептид WT1₁₈₇ предпочтительно представляет собой пептид WT1₁₈₇P1F, пептид WT1₁₈₇P2M или пептид WT1₁₈₇P3M, а более предпочтительно - пептид WT1₁₈₇P1F или пептид WT1₁₈₇P2M. Модифицированный пептид WT1₁₂₆ предпочтительно представляет собой пептид WT1₁₂₆P1F, пептид WT1₁₂₆P2L, пептид WT1₁₂₆P3M или пептид WT1₁₂₆P9V, а более предпочтительно - пептид WT1₁₂₆P1F или пептид WT1₁₂₆P2L.

Количество для применения модифицированного пептида WT1₁₈₇ или пептида WT1₁₂₆, которые иммуногенны у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, является таким же, как количество пептида WT1 в указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. Другие ингредиенты вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов и ее предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как другие ингредиенты вакцинной композиции и ее предпочтительные варианты осуществления в указанной выше вакцинной композиции для положительных по HLA-A*0206 индивидуумов.

В качестве активного ингредиента вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов также можно использовать ДНК и РНК, кодирующие указанный выше модифицированный пептид WT1₁₈₇ или пептид WT1₁₂₆, иммуногенные у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов. Такая вакцинная композиция против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения.

Отличные от указанных выше ДНК и РНК ингредиенты в вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов и ее предпочтительные варианты осуществления являются такими как ингредиенты композиции и ее предпочтительные варианты изобретения у указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0206 индивидуумов.

Специфичные к WT1 CTL можно индуцировать из PBMC, полученных у положительного по HLA-A*0201 индивидуума, культивируя PBMC в присутствии модифицированного пептида WT1₁₈₇ или пептида WT1₁₂₆, иммуногенных у указанного выше положительного по HLA-A*0201 индивидуума. Такой способ индукции специфичных к WT1 CTL также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения.

Предпочтительные примеры модифицированного пептида WT1₁₈₇ или пептида WT1₁₂₆, иммуногенных у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, являются такими же, как использовались для указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

Дендритные клетки, презентирующие модифицированный пептид WT1₁₈₇ или пептид WT1₁₂₆, можно индуцировать из незрелых дендритных клеток, полученных у положительного по HLA-A*0201 индивидуума, культивируя незрелые дендритные клетки в присутствии модифицированного пептида, иммуногенного у указанного выше положительного по HLA-A*0201 индивидуума. Такой способ индукции дендритных клеток, презентирующих модифицированный пептид WT1₁₈₇ или пептид WT1₁₂₆, также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения. Предпочтительные примеры модифицированного пептида являются такими же, как использовались для указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

Злокачественные опухоли у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов можно диагностировать, применяя указанный выше модифицированный пептид WT1₁₈₇ или модифицированный пептид WT1₁₂₆, иммуногенные у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, антитела к ним, специфичные к WT1 CTL, индуцированные модифицированным пептидом, или дендритные клетки, индуцированные модифицированным пептидом. Такой способ диагностики злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения. Способ диагностики злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов и его предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как указанный выше способ диагностики злокачественной опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов и его предпочтительные варианты осуществления.

Примеры способа диагностики злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов включают анализ с тетрамерами MHC, анализ с пентамерами MHC и анализ с декстрамерами MHC, в каждом из которых в качестве антигена используют модифицированный пептид WT1₁₈₇ или модифицированный пептид WT1₁₂₆, иммуногенные у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов. Предпочтительные примеры модифицированного пептида являются такими же, как использовались для указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

Злокачественные опухоли у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов можно диагностировать, используя антитела к следующему: указанные выше модифицированный пептид WT1₁₈₇ или модифицированный пептид WT1₁₂₆, иммуногенные у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, специфичные к WT1 CTL, индуцированные модифицированным пептидом, или дендритные клетки, индуцированные модифицированным пептидом. Такой способ диагностики злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения. Предпочтительные примеры модифицированного пептида являются такими же, как использовались для указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов. Способ диагностики злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов и его предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как указанные выше способ диагностики злокачественной опухоли у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов и его предпочтительные варианты осуществления.

Способ лечения или профилактики злокачественных опухолей, включающий введение положительному по HLA-A*0201 индивидууму вакцинной композиции против злокачественной опухоли, содержащей следующий пептид:

модифицированный пептид на основе пептида WT1₁₈₇ (SEQ ID NO: 2) или пептид WT1₁₂₆ (SEQ ID NO: 3), каждый из которых представляет собой неполный пептид белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1, где модифицированный пептид иммуногенен у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов,

также представляет собой один из аспектов настоящего изобретения.

Предпочтительные примеры модифицированного пептида являются такими же, как использовались для указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов. Вакцинная композиция против злокачественной опухоли и ее предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как описано в отношении указанной выше вакцинной композиции для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

Настоящее изобретение относится к применению следующего пептида:

модифицированный пептид на основе пептида WT1₁₈₇ (SEQ ID NO: 2) или пептида WT1₁₂₆ (SEQ ID NO: 3), каждый из которых представляет собой неполный пептид белкового продукта гена опухолевого супрессора WT1, где модифицированный пептид иммуногенен у положительного по HLA-A*0201 индивидуума,

для лечения или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов, и применению их для получения вакцинной композиции против злокачественной опухоли, используемой для лечения или профилактики злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

Предпочтительные примеры модифицированного пептида являются такими же, как использовались для указанной выше вакцинной композиции против злокачественной опухоли для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов. Вакцинная композиция против злокачественной опухоли и ее предпочтительные варианты осуществления являются такими же, как описаны в отношении указанной выше вакцинной композиции для положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

ПРИМЕРЫ

Далее в настоящем документе, настоящее изобретение будет проиллюстрировано более подробно в качестве примеров, но оно не ограничено ими. Сокращения в примерах имеют указанные ниже значения. Синтетические пептиды приобретали в SIGMA GENOSYS JAPAN.

DC: дендритные клетки

PBMC: мононуклеарные клетки периферической крови

CD: кластер дифференцировки (антиген дифференцировки лейкоцитов)

GM-CSF: гранулоцитарно-моноцититарный колониестимулирующий фактор

IL: интерлейкин

TNFα: фактор некроза опухоли α

PGE: простагландин

Gy: Грей

B-LCL: клеточная линия B-лимфобластов

EB вирус: вирус Эпштейна-Барр

tBu: трет-бутил

Trt: трифенилметил

Fmoc: 9-флуоренилметилоксикарбонил

Пример 1 (прогнозирование молекул HLA, способных к связыванию с пептидом WT1)

Молекулы HLA, способные к связыванию с пептидом WT1₁₈₇ (SEQ ID NO: 2), прогнозировали с применением программы прогнозирования NetMHC2.0 Server.

Как результат, в программе прогнозирования NetMHC2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC-2.0/) на основании аффинности связывания с молекулой HLA-A*0206 был высоко ранжирован рестриктированный по HLA-A*0201 пептид WT1₁₈₇, способный индуцировать специфичные к WT1 CTL.

Пример 2 (получение специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL из PBMC положительных по HLA-A*0206 здоровых доноров крови и тест цитотоксичности CTL)

(1) Выделение PBMC положительных по HLA-A*0206 здоровых доноров крови и получение DC

Сначала из периферической крови каждого из положительных по HLA-A*0206 здоровых доноров крови (три индивидуума) центрифугированием в градиенте плотности фиколла-гипака выделяли PBMC. Затем из PBMC выделяли CD14-позитивные клетки с применением магнитных частиц-DM с антителами к CD14 человека (произведенных Becton, Dickinson and company (BD)). В этом случае полагали, что в популяции моноцитов присутствует большое количество CD14-позитивных клеток. Для получения DC выделенные CD14-позитивные клетки культивировали в среде X-VIVO15 (произведенной BioWhittaker, Walkersville, MD), дополненной 1 об./об.% сывороточным AB человека, 800 МЕ/мл GM-CSF (произведенного Pepro Tech INC, Rocky Hill, NJ) и 1000 МЕ/мл IL-4 (произведенного Pepro Tech INC).

(2) Индукция аутологичных зрелых DC

DC, полученные в указанном выше пункте (1), культивировали при 37°C в течение 1 суток, а затем к лункам с культурой, содержащим DC, добавляли смесь цитокинов для созревания, содержащую 10 нг/мл TNF-α (фактор некроза опухоли-α; Pepro Tech INC, Rocky Hill, NJ), 10 нг/мл IL-β, 1000 МЕ/мл IL-6 и 1 мкг/мл PGE2. Через 24 часа культивирования при 37°C получали аутологичные зрелые DC.

(3) Индукция специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL

Аутологичные зрелые DC примировали пептидом WT1₁₈₇, облученным 30 Гр радиоактивного излучения, и совместно культивировали с обогащенными CD8-позитивными T-клетками PBMC, полученными у положительного по HLA-A*0206 здорового донора крови. Примирование DC пептидом WT1₁₈₇ проводили посредством культивирования DC в присутствии 10 мкг/мл пептида WT1₁₈₇ при 37°C в течение 30 минут. CD8-позитивные T-клетки обогащали из PBMC положительного по HLA-A*0206 здорового донора крови с применением микробус с CD8 и колонки MS (произведенной Miltenyi Biotec GmbH).

После второй стимуляции аутологичные PBMC, примированные пептидом, а затем облученные радиоактивным облучением, использовали как селективные стимулирующие клетки. Через двое суток после второй стимуляции к среде для культивирования добавляли рекомбинантные IL-2 (предоставленный Shionogi & Co., Ltd.) и IL-7 (произведенный Pepro Tech INC) в концентрации 10 МЕ/мл и 10 нг/мл, соответственно. После 4-ой стимуляции клетки культивировали в течение 10 суток при 37°C, а затем полученные клетки (CTL) собирали посредством центрифугирования с применением центрифуги. Цитотоксическую активность этих клеток (CTL) против клеток-мишеней тестировали в тесте цитотоксичности по высвобождению⁵¹Cr.

(4) Тест цитотоксичности

Тест цитотоксичности проводили посредством теста цитотоксичности по высвобождению⁵¹Cr. Тест цитотоксичности по высвобождению⁵¹Cr проводили, как указано далее. Сначала клетки-мишени (1×10⁷ клеток/мл) инкубировали в присутствии 100 мкл⁵¹Cr (удельная радиоактивность: 1 мКи/мл) в RPMI1640 (произведенной NIHON PHARMACEUTICAL CO., LTD.), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой, при 37°C в течение 1,5 часов для мечения клеток-мишеней⁵¹Cr. Затем меченные⁵¹Cr клетки-мишени добавляли в лунки 96-луночных круглодонных планшетов, содержащих различные количества CTL, полученных в указанном выше пункте (3) (суспендированных в 100 мкл среды для анализа), смешивали с CTL, а затем инкубировали при 37°C в течение 4 часов. Эти клетки смешивали так, чтобы отношение E/T (отношение количества клеток) составляло 1:1, 5:1, 20:1 или 25:1, при условии, что CTL и меченные⁵¹Cr клетки-мишени обозначали как "E" и "T", соответственно. После завершения инкубации из каждой лунки отбирали 100 мкл супернатанта. Определяли количество высвободившегося из меченных клеток⁵¹Cr, и на основе высвобождения⁵¹Cr рассчитывали специфический лизис (%). Специфический лизис (%) рассчитывали указанным далее способом.

Специфический лизис (%) = (высвобождение из тестируемого образца - спонтанное высвобождение)/(максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение) × 100.

В формуле величина спонтанного высвобождения относится к степени флуоресценции супернатанта культуры в лунках, содержащих только клетки-мишени, а максимальное высвобождение относится к степени флуоресценции среды для культивирования, в которой клетки-мишени полностью лизированы обработкой 1% масс. Triton X-100.

Используемые клетки-мишени представляли собой B-LCL, клетки K562, клетки JY и клетки KH88, которые будут подробно описаны ниже. Клетки KH88 являются такими же, как клетки KH88OF8, используемые в следующем ниже примере 9.

B-LCL, полученные путем опосредованной вирусом EB трансформации B-лимфоцитов периферической крови, полученных от положительного по HLA-A*0206 донора крови, не экспрессируют WT1.

Клетки K562, полученные от пациента с хроническим миелогенным лейкозом при бластном кризе, представляют собой экспрессирующую WT1 клеточную линию, не экспрессирующую HLA класса I. Автор настоящего изобретения не смог получить экспрессирующую WT1 положительную по HLA-A*0206 лейкозную клеточную линию дикого типа. Вследствие этого также использовали клетки 0206K562, которые получали посредством трансформации клеток K562 генами HLA-A*0206. Анализ FACS с использованием антитела к HLA-A2 (клон BB7.2; произведенный BD Biosciences Pharmingen) продемонстрировал, что клетки 0206K562, трансформированные генами HLA-A*0206, экспрессируют на клеточных поверхностях молекулы HLA-A*0206.

Анализ вестерн-блоттингом показал, что клетки B-LCL, трансформированные геном WT1, экспрессируют WT1. В качестве контроля использовали клетки B-LCL, трансформированные пустым контрольным вектором.

Клетки JY являются не экспрессирующей WT1 негативной по HLA-A*0206 линией B-клеток, полученной опосредованной вирусом EB трансформацией.

Клетки KH88 являются экспрессирующей WT1 негативной по HLA-A*0206 лейкозной клеточной линией.

Каждую клеточную линию культивировали в среде для культивирования RPMI1640, дополненной 10 об./об.% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сывороткой, 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мг/мл стрептомицина.

(5) Анализ антителами и проточной цитометрией

mAb к CD14, CD86, CD80, CD83 и HLA-DR человека приобретали в BD. Концентрацию и зрелость DC подтверждали посредством анализа клеточных поверхностных антигенов с применением моноклональных антител (mAb), перечисленных выше. Образцы анализировали в проточном цитометре (FACS Calibur; произведенный BD) с применением программного обеспечения CellQest.

(6) Результаты

Проведено тестирование, можно ли из PBMC положительных по HLA-A*0206 доноров крови получать специфичные к пептиду WT1₁₈₇ CTL. Специфичную к пептиду WT1₁₈₇ цитотоксическую активность тестировали с использованием CTL, полученных посредством повторной стимуляции обогащенных CD8-позитивными T-клетками PBMC от положительного по HLA-A*0206 здорового донора крови посредством аутологичных DC или PBMC, примированных пептидом WT1₁₈₇. CTL продемонстрировали более сильную цитотоксическую активность в отношении аутологичных клеток B-LCL, примированных пептидом WT1₁₈₇, чем в отношении клеток B-LCL, не примированных пептидом WT1₁₈₇ (фиг. 1a). На фиг. 1a вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CTL, полученных посредством пептидной стимуляции (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (отношение E/T). Закрашенный треугольник соответствует клеткам, примированным 10 мкг/мл пептида WT1₁₈₇, а закрашенный квадрат соответствует клеткам, не примированным пептидом WT1₁₈₇. Такая же цитотоксическая активность, как указанная выше, показана у CTL, сходным образом полученных из PBMC, выделенных у двух других положительных по HLA-A*0206 здоровых доноров крови (фиг. 2a и 2b). На фиг. 2 закрашенный треугольник соответствует клеткам, примированным 10 мкг/мл пептида WT1₁₈₇, а закрашенный квадрат соответствует клеткам, не примированным пептидом WT1₁₈₇. Эти результаты показывают, что в каждом случае цитотоксическая активность специфична в отношении пептида WT1₁₈₇.

Цитотоксическая активность CTL увеличивалась параллельно концентрации пептида WT1₁₈₇, используемого для примирования DC или PBMC, и достигала плато при концентрации пептида 0,1 мкг/мл (фиг. 1b). Половина от максимальной концентрации пептида WT1₁₈₇ для специфического лизиса (полумаксимальное значение лизиса) составляла приблизительно 5×10^-5 мкг/мл. Это показывает, что аффинность TCR (рецепторы T-клеточных антигенов) CTL в отношении комплекса пептид WT1₁₈₇/HLA-A*0206 была относительно высокой. Этот результат убедительно свидетельствует, что CTL, индуцируемые пептидом WT1₁₈₇, могут распознавать пептид WT1₁₈₇.

Таким же образом, как и выше, тестировали цитотоксическую активность против различных клеток-мишеней, эндогенно экспрессирующих WT1, с использованием CTL, полученных стимуляцией обогащенных CD8-позитивными T-клетками PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора крови посредством DC или PBMC, которых примировали пептидом WT1₁₈₇. Результаты представлены на фиг. 3a и 3b. Соответствующую цитотоксическую активность в отношении клеток-мишеней, представленную на фиг. 3a и 3b, определяли в одно и то же время. На фиг. 3a представлена цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL против B-LCL, трансформированных геном WT1 (экспрессирующие WT1, положительные по HLA-A*0206; закрашенный треугольник), или B-LCL, трансформированных пустым контрольным вектором (не экспрессирующие WT1, положительные по HLA-A*0206; закрашенный квадрат). На фиг. 3b показана цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL против клеток 0206K562 (экспрессирующие WT1, положительные по HLA-A*0206; закрашенный квадрат), клеток K562 (экспрессирующие WT1, отрицательные по HLA-A*0206; незакрашенный квадрат), клеток KH88 (экспрессирующие WT1, отрицательные по HLA-A*0206; закрашенная окружность) или клеток JY (не экспрессирующие WT1, отрицательные по HLA-A*0206; закрашенный треугольник).

CTL продемонстрировали более сильную цитотоксическую активность против B-LCL, трансформированных WT1 (экспрессирующие WT1, положительные по HLA-A*0206), чем против B-LCL, трансформированных пустым контрольным вектором (не экспрессирующие WT1, положительные по HLA-A*0206) (фиг. 3a). Кроме того, как показано на фиг. 3b, CTL продемонстрировали более сильную цитотоксическую активность против клеток 0206K562, трансформированных HLA-A*0206 (экспрессирующие WT1, положительные по HLA-A*0206), чем против клеток K562 (экспрессирующие WT1, отрицательные по HLA-A*0206), клеток KH88 (экспрессирующие WT1, отрицательные по HLA-A*0206) или клеток JY (не экспрессирующие WT1, отрицательные по HLA-A*0206). Другими словами, CTL продемонстрировали значимую цитотоксическую активность против экспрессирующих WT1, положительных по HLA-A*0206 лейкозных клеток-мишеней, но не цитотоксическую активность против не экспрессирующих WT1 и/или отрицательных по HLA-A*0206 клеток. Данный результат демонстрирует, что специфичные к пептиду WT1₁₈₇ CTL, полученные in vitro, демонстрируют цитотоксическую активность против опухолевых клеток, эндогенно экспрессирующих WT1 подобно лейкозным клеткам и являющихся положительными по HLA-A*0206. Результат на фиг. 3b убедительно свидетельствует, что цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL рестриктирована по HLA-A класса I. Это основано на том факте, что в отношении клеток 0206K562 наблюдали более сильную цитотоксическую активность, чем против клеток K562.

Приведенные выше результаты демонстрируют, что указанные выше культивируемые CTL являются специфичными к пептиду WT1₁₈₇ CTL.

Результаты на каждой фигуре являются типичными данными и в основном, с некоторыми отклонениями, воспроизводятся.

Пример 3 (подтверждение класса HLA, по которому рестриктированы специфичные к пептиду WT1₁₈₇ CTL)

Проводили тестирование того, рестриктирована ли цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL, полученных в примере 2 по HLA класса I. Тест цитотоксичности по высвобождению⁵¹Cr проводили в присутствии или в отсутствие mAb к HLA класса I или HLA класса II. В качестве клеток-мишеней использовали аутологичные B-LCL. В данном эксперименте соотношение E/T составляло 5:1.

Результаты показаны на фиг. 4. На фиг. 4a приведены результаты теста, который проводили с использованием в качестве клеток-мишеней B-LCL (не экспрессирующие WT1₁₈₇, положительные по HLA-A*0206) в отсутствие mAb против HLA класса I (mAb к HLA класса I) и mAb против HLA класса II (mAb к HLA класса II). На фиг. 4b приведены результаты теста, который проводили с использованием в качестве клеток-мишеней B-LCL, примированных пептидом WT1₁₈₇ (экспрессирующие WT1₁₈₇, положительные по HLA-A*0206), в отсутствие mAb к HLA класса I и в присутствии mAb к HLA класса II. На фиг. 4c приведены результаты теста, который проводили с использованием в качестве клеток-мишеней B-LCL, примированных пептидом WT1₁₈₇ (экспрессирующие WT1₁₈₇, положительные по HLA-A*0206), в присутствии mAb к HLA класса I и в отсутствие mAb к HLA класса II. На фиг. 4d приведены результаты теста, который проводили с использованием в качестве клеток-мишеней B-LCL, примированных пептидом WT1₁₈₇ (экспрессирующие WT1₁₈₇, положительные по HLA-A*0206), в отсутствие mAb к HLA класса I и mAb к HLA класса II.

Как показано на фиг. 4, цитотоксическую активность специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL полностью ингибировали добавлением антител к HLA класса I, а не антител к HLA класса II. Результат показывает, что цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL рестриктирована по HLA класса I, как и ожидалось.

Пример 4 (тест цитотоксичности против опухолевых клеток)

Тест цитотоксичности против экспрессирующих WT1, положительных по HLA-A*0206 опухолевых клеток проводили in vitro с использованием специфичных к пептиду WT1₁₈₇ CTL, полученных в примере 2. Тест цитотоксичности проводили в соответствии с тестом цитотоксичности по высвобождению⁵¹Cr, описанном в примере 2. В результате специфичные к пептиду WT1₁₈₇ CTL продемонстрировали цитотоксическую активность против экспрессирующих WT1 опухолевых клеток (данные не показаны).

Пример 5 (получение специфичных к пептиду WT1₁₂₆ CTL, и тест цитотоксичности CTL)

Специфичные к пептиду WT1₁₂₆ CTL получали таким же образом, как в примере 2 (3), за исключением, что вместо пептида WT1₁₈₇ использовали пептид WT1₁₂₆ (SEQ ID NO: 3). Тест цитотоксичности с использованием этих CTL для определения специфичной по отношению к пептиду WT1₁₂₆ цитотоксической активности проводили таким же образом, как в примере 2. На фиг. 5 показана цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₂₆ CTL, индуцированных из PBMC того же положительного по HLA-A*0206 здорового донора крови, как на фиг. 2b. На фиг. 5 закрашенный треугольник соответствует клеткам, примированным 10 мкг/мл пептида WT1₁₂₆, а закрашенный квадрат соответствует клеткам, не примированным пептидом WT1₁₂₆. CTL продемонстрировали более сильную цитотоксическую активность против аутологичных клеток B-LCL, примированных пептидом WT1₁₂₆, чем против клеток B-LCL, не примированных пептидом WT1₁₂₆ (фиг. 5). Данный результат демонстрирует, что цитотоксическая активность CTL специфична по отношению к пептиду WT1₁₂₆.

Таким же образом, как в примере 2, тестировали цитотоксическую активность против различных клеток-мишеней, эндогенно экспрессирующих WT1, с использованием CTL, полученных стимуляцией обогащенных CD8-позитивными T-клетками PBMC от положительных по HLA-A*0206 доноров крови посредством DC или PBMC, примированных пептидом WT1₁₂₆. Цитотоксическая активность против каждой клетки-мишени представлена на фиг. 6a и 6b. Клетки-мишени на фиг. 6a и 6b представляют собой клетки 0206K562 (экспрессирующие WT1, положительные по HLA-A*0206; закрашенный квадрат), клетки K562 (экспрессирующие WT1, отрицательные по HLA-A*0206; незакрашенный квадрат), клетки KH88 (экспрессирующие WT1, отрицательные по HLA-A*0206; закрашенная окружность) и клетки JY (не экспрессирующие WT1, отрицательные по HLA-A*0206; закрашенный треугольник). На фиг. 6a показана цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₂₆ CTL, индуцированных из PBMC того же положительного по HLA-A*0206 здорового донора крови, как на фиг. 2a. На фиг. 6b показана цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₂₆ CTL, индуцированных из PBMC того же положительного по HLA-A*0206 здорового донора крови, как на фиг. 2b.

Подобно специфичным к пептиду WT1₁₈₇ CTL, специфичные к пептиду WT1₁₂₆ CTL продемонстрировали значимую цитотоксическую активность против экспрессирующих WT1, положительных по HLA-A*0206 лейкозных клеток-мишеней, но не продемонстрировали цитотоксической активности против не экспрессирующих WT1 и/или отрицательных по HLA-A*0206 клеток. Данный результат демонстрирует, что специфичные к пептиду WT1₁₂₆ CTL, полученные in vitro, демонстрируют цитотоксическую активность против опухолевых клеток, эндогенно экспрессирующих WT1 подобно лейкозным клеткам и являющихся положительными по HLA-A*0206. Результаты на фиг. 6a и 6b убедительно свидетельствуют, что цитотоксическая активность специфичных к пептиду WT1₁₂₆ CTL рестриктирована по HLA-A класс I. Это основано на том факте, что против клеток 0206K562 наблюдалась более сильная цитотоксическая активность, чем против клеток K562.

Приведенные выше результаты демонстрируют, что полученные CTL являются специфичными к пептиду WT1₁₂₆ CTL.

Результаты на каждой фигуре являются типичными данными и в основном, с некоторыми отклонениями, воспроизводятся.

Пример 6 (получение вакцинных композиций)

Получали приведенные далее вакцинные композиции 1-8 против злокачественной опухоли. Они представляют собой только примеры вакцинных композиций против злокачественной опухоли по настоящему изобретению.

Вакцинная композиция 1 против злокачественной опухоли

Пептид WT1₁₈₇ 3 мг

Монтанид ISA-51 400 мг

5% глюкоза в воде 400 мг

Указанные выше ингредиенты смешивали, и смесь назвали вакцинная композиция 1 против злокачественной опухоли.

Вакцинная композиция 2 против злокачественной опухоли

Пептид WT1₁₈₇ 1 мг

Монтанид ISA-51 400 мг

5% глюкоза в воде 400 мг

Указанные выше ингредиенты смешивали, и смесь назвали вакцинная композиция 2 против злокачественной опухоли.

Вакцинная композиция 3 против злокачественной опухоли

Пептид WT1₁₈₇ 0,001 мг

Монтанид ISA-51 400 мг

5% глюкоза в воде 400 мг

Указанные выше ингредиенты смешивали, и смесь назвали вакцинная композиция 3 против злокачественной опухоли.

Вакцинная композиция 4 против злокачественной опухоли

Пептид WT1₁₈₇ 10 мг

Монтанид ISA-51 400 мг

5% глюкоза в воде 400 мг

Указанные выше ингредиенты смешивали, и смесь назвали вакцинная композиция 4 против злокачественной опухоли.

Вакцинные композиции 5-8 против злокачественной опухоли

Вакцинной композиции 5-8 против злокачественной опухоли получали таким же образом, как и указанные выше вакцинной композиции 1-4 против злокачественной опухоли за исключением того, что вместо пептида WT1₁₈₇ использовали пептид WT1₁₂₆.

Пример 7 (аффинность модифицированных пептидов к молекулам HLA-A*0206)

В случае пептида WT1₁₈₇, пептида WT1₁₂₆ и модифицированных пептидов с заменами аминокислотного остатка в положении 1, 2, 3 или 9 от N-конца пептида WT1₁₈₇ или пептида WT1₁₂₆ с использованием программы прогнозирования NetMHC2.0 Server анализировали аффинность к молекулам HLA-A*0206. Результаты анализа модифицированных пептидов WT1₁₈₇ и модифицированных пептидов WT1₁₂₆ приведены в таблицах 1 и 2, соответственно. Меньшие значения (пептид способен к связыванию при меньшей концентрации) указывают на большую аффинность.

Пример 8 (аффинность модифицированных пептидов к молекулам HLA-A*0201)

В случае пептида WT1₁₈₇, пептида WT1₁₂₆ и модифицированных пептидов, содержащих замену аминокислотного остатка в положении 1, 2, 3 или 9 от N-конца пептида WT1₁₈₇ или пептида WT1₁₂₆ с использованием программы прогнозирования NetMHC2.0 Server анализировали аффинность к молекулам HLA-A*0201. Результаты анализа модифицированных пептидов WT1₁₈₇ и модифицированных пептидов WT1₁₂₆ приведены в таблицах 3 и 4, соответственно. Меньшие значения указывают на большую аффинность.

Пример 9 (сравнение рестриктированных по HLA-A*0201 CTL, индуцированных различными модифицированными пептидами WT1₁₂₆)

(1) Цель

Принимая во внимание результаты примера 8, в качестве модифицированных пептидов WT1₁₂₆ для тестирования выбрали пептид WT1₁₂₆P1F (SEQ ID NO: 34), пептид WT1₁₂₆P2L (SEQ ID NO: 39), пептид WT1₁₂₆P3M (SEQ ID NO: 46) и пептид WT1₁₂₆P9V (SEQ ID NO: 49), и для скрининга на модифицированные пептиды WT1₁₂₆, способные индуцировать CTL с высокой цитотоксической активностью, проводили приведенные ниже эксперименты. Если не указано иначе, используемые в примерах с 9 до 12 реагенты, среды, экспериментальные способы и т.д. являлись такими же, как в примере 1. Если не указано иначе, в примерах с 9 по 12 культивирование проводили при 37°C.

(2) Материалы и методы

У здорового человека-донора с выявленной экспрессией молекул HLA-A*0201 (положительный по HLA-A*0201 здоровый донор крови) выделяли PBMC, и из PBMC выделяли CD14-позитивные клетки с применением магнитных частиц-DM с антителами к CD14 человека. Среду для культивирования получали посредством добавления 800 МЕ/мл GM-CSF и 1000 МЕ/мл IL-4 к среде X-VIV015, дополненной 1 об./об.% сывороточным AB человека, а CD14-позитивные клетки культивировали в среде для культивирования в течение 1 суток.

К указанной выше культуре добавляли смесь цитокинов для созревания, содержащую 10 нг/мл TNFα, 10 нг/мл IL-β, 1000 МЕ/мл IL-6 и 1 мкг/мл PGE2. После дополнительных одних суток культивирования получали аутологичные зрелые DC.

Аутологичные зрелые DC примировали 10 мкг/мл модифицированного пептида WT1₁₂₆, полученного в примере 13 (пептид WT1₁₂₆P1F, пептид WT1₁₂₆P2L, пептид WT1₁₂₆P3M или пептид WT1₁₂₆P9V), культивировали в течение 4 часов, и облучали 35 Гр радиоактивного излучения. Полученные таким образом клетки использовали как стимулирующие клетки для индукции CTL.

PBMC (2×10⁶ клеток/лунку), служащие в качестве иммунореактивных клеток, и указанные выше DC (2×10⁵ клеток/лунку) совместно культивировали в 24-луночном планшете. Через одну неделю проводили повторную стимуляцию, добавляя клетки T2, которые примировали пептидом и облучали 75 Гр радиоактивного излучения. Через трое суток после повторной стимуляции добавляли 20 МЕ/мл IL-2. Такую же повторную стимуляцию повторяли еще 3 раза, добавляя примированные пептидом облученные клетки T2, а затем иммунореактивные клетки обогащались CD8-позитивными клетками.

В отношении CD8-позитивных T-клеток на проточном цитометре анализировали реакцию на тетрамер HLA-A*0201, связанный с пептидом WT1₁₂₆, и тестировали цитотоксическую активность против различных клеток-мишеней.

Используемые клетки-мишени представляли собой клетки K562, клетки 0206K562, клетки JY, KH88OF8 клетки, клетки TF-1 и клетки THP-1, которые представлены в таблице 5. Свойства этих клеток представлены в таблице 5. В качестве клеток-мишеней также использовали B-лимфобластную клеточную линию (B-LCL), полученную посредством вирусной инфекции EB из крови положительного по HLA-A*0201 донора.

(3) Результаты

На фиг. 7 приведены результаты проточного цитометрического анализа PBMC от положительного по HLA-A*0201 донора 1, которые стимулировали различными модифицированными пептидами WT1₁₂₆, а затем окрашивали меченным PE (фикоэритрином) тетрамером HLA-A*0201, связанным с пептидом WT1₁₂₆ (Medical & Biological Laboratories, Co., Ltd.), и меченным APC-Cy7 антителом к CD8 (APC-Cy7: аллофикоцианин-цианин-7). Когда PBMC окрашивают указанным выше тетрамером и антителом к CD8, индуцированные стимуляцией модифицированным пептидом CTL связываются с тетрамером и антителом к CD8, и, таким образом, можно детектировать испускаемую тетрамером флуоресценцию и испускаемую антителом к CD8 флуоресценцию, соответственно. На фиг. 7a-7e вертикальная ось соответствует интенсивности флуоресценции, испускаемой тетрамером HLA-A*0201, а горизонтальная ось соответствует интенсивности флуоресценции, испускаемой антителом к CD8. Каждый блок на фиг. 7a-7e демонстрирует частоту (%) индуцированных, рестриктированных по HLA-A*0201 CTL, способных распознавать пептид WT1₁₂₆. На фиг. 7a показан результат анализа PBMC, которые не стимулировали никаким модифицированным пептидом WT1₁₂₆ и окрашивали указанным выше тетрамером и антителом к CD8 (фон). На фиг. 7b показан результат анализа PBMC, стимулированных пептидом WT1₁₂₆P1F и окрашенных. На фиг. 7c показан результат анализа PBMC, стимулированных пептидом WT1₁₂₆P2L и окрашенных. На фиг. 7d показан результат анализа PBMC, стимулированных пептидом WT1₁₂₆P3M и окрашенных. На фиг. 7e показан результат анализа PBMC, стимулированных пептидом WT1₁₂₆P9V и окрашенных.

Частота указанных выше CTL, индуцированных стимуляцией PBMC пептидом WT1₁₂₆P1F, составляла 0,14% (фиг. 7b). Частота указанных выше CTL, индуцированных стимуляцией PBMC пептидом WT1₁₂₆P2L, составляла 0,37% (фиг. 7c). CTL, индуцируемые этими пептидами раздельно, являлись позитивными по тетрамеру HLA, CD8-позитивными и способными к связыванию с тетрамером HLA-A*0201, связанным с пептидом WT1₁₂₆. Эти результаты показывают, что стимуляция PBMC модифицированным пептидом WT1₁₂₆ индуцировала CTL, которые могут распознавать пептид дикого типа (пептид WT1₁₂₆).

На фиг. 8 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от донора 1 пептидом WT1₁₂₆P1F. На фиг. 8 вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CD8-позитивных T-клеток, полученных посредством стимуляции пептидом (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (соотношение E/T). Закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки JY, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали примированные пептидом WT1₁₂₆P1F клетки JY.

Клетки JY положительны по HLA-A*0201 и негативны по WT1. The CTL продемонстрировали более сильную цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₂₆P1F клеток JY, чем против не примированных пептидом WT1₁₂₆P1F клеток JY. Этот результат показывает, что индуцированы CTL, специфичны к использованному для указанной выше стимуляции пептиду и рестриктированы по HLA-A*0201.

На фиг. 9 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от донора 1 пептидом WT1₁₂₆P2L. На фиг. 9 вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CD8-позитивных T-клеток, полученных посредством стимуляции пептидом (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (соотношение E/T). На фиг. 9a закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки JY, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали примированные пептидом WT1₁₂₆P2L клетки JY. На фиг. 9b закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки TF-1, закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки THP-1, закрашенный треугольник соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки KH88OF8, и крест соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки B-LCL.

Индуцированные CTL показали более сильную цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₂₆P2L клеток JY, чем против не примированных пептидом WT1₁₂₆P2L клеток JY (фиг. 9a). Индуцированные CTL показали более сильную цитотоксическую активность против клеток TF-1 и клеток THP-1, которые являются положительными по HLA-A*0201 и WT1-позитивными, чем против клеток KH88OF8, которые отрицательны по HLA-A*0201 и WT1-позитивны, и клеток B-LCL, которые положительны по HLA-A*0201 и WT1-негативны (фиг. 9b). Как очевидно из результатов, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P2L CTL рестриктированы по HLA-A*0201 и способны разрушать злокачественные клетки, эндогенно экспрессирующие WT1.

На фиг. 10 приведены результаты проточного цитометрического анализа PBMC от положительного по HLA-A*0201 донора 2, стимулированных пептидом WT1₁₂₆P2L, а затем окрашенных меченным PE тетрамером HLA-A*0201, связанным с пептидом WT1₁₂₆, и меченным APC-Cy7 антителом к CD8. То есть, на фиг. 10 приведены результаты проточного цитометрического анализа индуцированных CTL, окрашенных тетрамером HLA, связанным с пептидом WT1₁₂₆, и антителом к CD8. Вертикальная ось соответствует интенсивности флуоресценции, испускаемой тетрамером HLA-A*0201, а горизонтальная ось соответствует интенсивности флуоресценции, испускаемой антителом к CD8.

Клетки в верхней правой области на фиг. 10 представляют собой индуцированные CTL, которые рестриктированы по HLA-A*0201 и могут распознавать пептид WT1₁₂₆. 5,43% лимфоцитов PBMC, стимулированных пептидом WT1₁₂₆P2L являются положительными по тетрамеру HLA, CD8-позитивными CTL, которые способны связываться с тетрамером HLA-A*0201, связанным с пептидом WT1₁₂₆. Этот результат показывает, что стимуляция PBMC модифицированным пептидом индуцировала CD8-позитивные CTL, которые могут распознавать пептид дикого типа.

На фиг. 11 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных стимуляцией PBMC от донора 2 пептидом WT1₁₂₆P2L. На фиг. 11a и 11b вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CD8-позитивных T-клеток, полученных посредством стимуляции пептидом (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (соотношение E/T). На фиг. 11a закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки JY, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали примированные пептидом WT1₁₂₆ клетки JY. На фиг. 11b закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки JY, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали примированные пептидом WT1₁₂₆P2L клетки JY.

Индуцированные CTL показали более сильную цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₂₆ клеток JY, чем против не примированных пептидом WT1₁₂₆ клеток JY (фиг. 11a). Индуцированные CTL также показали более сильную цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₂₆P2L клеток JY, чем против не примированных пептидом WT1₁₂₆P2L клеток JY (фиг. 11b). Как очевидно из результатов, CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P2L, могут распознавать пептид WT1₁₂₆P2L и пептид дикого типа WT1₁₂₆.

Пример 10 (сравнение рестриктированных по HLA-A*0206 CTL, индуцированных различными модифицированными пептидами WT1₁₂₆)

(1) Цель

Принимая во внимание результаты примера 7, для тестирования в качестве модифицированных пептидов WT1₁₂₆ выбраны пептид WT1₁₂₆P1F, пептид WT1₁₂₆P2L, пептид WT1₁₂₆P3M и пептид WT1₁₂₆P9V, и для скрининга на модифицированные пептиды WT1₁₂₆, способные индуцировать CTL с высокой цитотоксической активностью, проводили приведенные ниже эксперименты.

(2) Материалы и методы

У здорового человека-донора с выявленной экспрессией молекул HLA-A*0206 (положительный по HLA-A*0206 здоровый донор крови), выделяли PBMC, и из PBMC выделяли CD14-позитивные клетки с применением магнитных частиц-DM с антителами к CD14 человека. Среду для культивирования получали посредством добавления 800 МЕ/мл GM-CSF и 1000 МЕ/мл IL-4 к среде X-VIV015, дополненной 1 об./об.% сывороточным AB человека, а CD14-позитивные клетки культивировали в среде для культивирования в течение 1 суток.

К указанной выше культуре добавляли смесь цитокинов для созревания, содержащую 10 нг/мл TNFα, 10 нг/мл IL-β, 1000 МЕ/мл IL-6 и 1 мкг/мл PGE2. После дополнительных одних суток культивирования получали аутологичные зрелые DC.

Аутологичные зрелые DC примировали 10 мкг/мл модифицированного пептида WT1₁₂₆, полученного в примере 13 (пептид WT1₁₂₆P1F, пептид WT1₁₂₆P2L, пептид WT1₁₂₆P3M или пептид WT1₁₂₆P9V), культивировали в течение 4 часов и облучали 35 Гр радиоактивного излучения. Полученные таким образом клетки использовали в качестве стимулирующих клеток для индукции CTL.

Обогащенные CD8-позитивными T-клетками PBMC (2×10⁶ клеток/лунку) и указанные выше DC (1×10⁵ клеток/лунку) совместно культивировали в 24-луночном планшете. Через десять суток проводили повторную стимуляцию, добавляя PBMC, которые примировали пептидом и облучали 35 Гр радиоактивного излучения. Через двое суток после повторной стимуляции добавляли 10 МЕ/мл IL-2 и 10 нг/мл IL-7. После повторения такой же стимуляции еще 4 раза, происходило обогащение CD8-позитивными T-клетками. CD8-позитивные T-клетки тестировали на цитотоксическую активность против различных клеток-мишеней.

Используемые клетки-мишени представляли собой B-LCL, полученные посредством вирусной инфекции EB из крови положительного по HLA-A*0206 донора, клетки K562 и клетки 0206K562.

(3) Результаты

На фиг. 12 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных стимуляцией PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора 3 различными пептидами. На фиг. 12a показана цитотоксическая активность CTL, индуцированных стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P2L. На фиг. 12b показана цитотоксическая активность CTL, индуцированных стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P3M. На фиг. 12c показана цитотоксическая активность CTL, индуцированных стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P9V. На фиг. 12a-12c вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CD8-позитивных T-клеток, полученных посредством стимуляции пептидом (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (соотношение E/T). Закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали аутологичные клетки B-LCL, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали аутологичные клетки B-LCL, примированные таким же модифицированным пептидом WT1₁₂₆, как использовался для указанной выше стимуляции.

CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P2L, показали более сильную цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₂₆P2L аутологичных клеток B-LCL, которые положительны по HLA-A*0206 и негативны по WT1, чем против не примированных пептидом WT1₁₂₆P2L аутологичных клеток B-LCL (фиг. 12a). CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P3M, показали более сильную цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₂₆P3M аутологичных клеток B-LCL, которые положительны по HLA-A*0206 и негативны по WT1, чем против не примированных пептидом WT1₁₂₆P3M аутологичных клеток B-LCL (фиг. 12b). CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P9V, показали более сильную цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₂₆P9V аутологичных клеток B-LCL, которые положительны по HLA-A*0206 и негативны по WT1, чем против не примированных пептидом WT1₁₂₆P9V аутологичных клеток B-LCL (фиг. 12c).

Эти результаты показывают, что индуцированы CTL, специфичные к пептиду, используемому для указанной выше стимуляции, и рестриктированные по HLA-A*0206.

На фиг. 13 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора 3 пептидом WT1₁₂₆P9V. На фиг. 13 вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CD8-позитивных T-клеток, полученных посредством стимуляции пептидом (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (соотношение E/T). Закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали аутологичные клетки B-LCL, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали аутологичные клетки B-LCL с трансфицированным геном WT1.

На фиг. 13 CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P9V, показали более сильную цитотоксическую активность против аутологичных клеток B-LCL, исходно положительных по HLA-A*0206 и негативных по WT1, которые делали положительными по WT1 посредством трансфекции гена WT1 в клетки B-LCL, чем против не трансфицированных геном WT1 аутологичных клеток B-LCL (фиг. 12c). Как очевидно из результата, CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P9V, рестриктированы по HLA-A*0206 и демонстрируют цитотоксическую активность, распознавая присутствующий эндогенно пептид WT1₁₂₆ дикого типа.

На фиг. 14 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных стимуляцией PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора 4 различными пептидами. На фиг. 14a показана цитотоксическая активность CTL, индуцированных стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P2L. На фиг. 14b показана цитотоксическая активность CTL, индуцированных стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P3M. На фиг. 14c показана цитотоксическая активность CTL, индуцированных стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P9V. На фиг. 14a-14c вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CD8-позитивных T-клеток, полученных посредством стимуляции пептидом (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (соотношение E/T). Закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали аутологичные клетки B-LCL, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой аутологичные клетки B-LCL примировали тем же модифицированным пептидом WT1₁₂₆, который использовали в качестве клеток-мишеней для указанной выше стимуляции.

CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P2L, показали более сильную цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₂₆P2L аутологичных клеток B-LCL, которые положительны по HLA-A*0206 и негативны по WT1, чем против не примированных пептидом WT1₁₂₆P2L аутологичных клеток B-LCL (фиг. 14a). CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P3M, показали более сильную цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₂₆P3M аутологичных клеток B-LCL, которые положительны по HLA-A*0206 и негативны по WT1, чем против не примированных пептидом WT1₁₂₆P3M аутологичных клеток B-LCL (фиг. 14b). CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P9V, показали более сильную цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₂₆P9V аутологичных клеток B-LCL, которые положительны по HLA-A*0206 и негативны по WT1, чем против не примированных пептидом WT1₁₂₆P9V аутологичных клеток B-LCL (фиг. 14c). Эти результаты показывают, что индуцированы CTL, специфичные к пептиду, используемому для указанной выше стимуляции, и рестриктированные по HLA-A*0206.

На фиг. 15 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора 4 различными пептидами. Используемые клетки-мишени были отрицательными по HLA-A*0206, положительными по WT1 клетками K562, и клетки K562 делали эндогенно презентирующими антигенные пептиды WT1 посредством трансфекции в них гена HLA-A*0206 (клетки 0206K562). На фиг. 15a показана цитотоксическая активность CTL, индуцированных стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P2L. На фиг. 15b показана цитотоксическая активность CTL, индуцированных стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P3M. На фиг. 15c показана цитотоксическая активность CTL, индуцированных стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P9V. На фиг. 15a-15c вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CD8-позитивных T-клеток, полученных посредством стимуляции пептидом (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (соотношение E/T). Закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки K562, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки 0206K562, т.е. клетки K562, сделанные эндогенно презентирующими антигенные пептиды WT1 посредством трансфекции в них гена HLA-A*0206.

На фиг. 15a-15c CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₂₆P2L, пептидом WT1₁₂₆P3M или пептидом WT1₁₂₆P9V, в каждом случае показали более сильную цитотоксическую активность против клеток 0206K562, чем против клеток K562. Как очевидно из результатов, CTL, индуцированные стимуляцией любым из этих модифицированных пептидов, рестриктированы по HLA-A*0206 и демонстрируют цитотоксическую активность, распознавая присутствующий эндогенно пептид WT1₁₂₆ дикого типа.

Пример 11 (сравнение рестриктированных по HLA-A*0201 CTL, индуцированных различными модифицированными пептидами WT1₁₈₇)

(1) Цель

Принимая во внимание результаты примера 8, для тестирования в качестве модифицированных пептидов WT1₁₈₇ выбраны пептид WT1₁₈₇P1F (SEQ ID NO: 11), пептид WT1₁₈₇P2M (SEQ ID NO: 16) и пептид WT1₁₈₇P3M (SEQ ID NO: 20), и для скрининга на модифицированные пептиды WT1₁₈₇, способные индуцировать CTL с высокой цитотоксической активностью, проводили приведенные ниже эксперименты.

(2) Материалы и методы

У здорового человека-донора с выявленной экспрессией молекул HLA-A*0201 (положительный по HLA-A*0201 здоровый донор крови) выделяли PBMC, и из PBMC выделяли CD14-позитивные клетки с применением магнитных частиц-DM с антителами к CD14 человека. Среду для культивирования получали посредством добавления 800 МЕ/мл GM-CSF и 1000 МЕ/мл IL-4 к среде X-VIVO15, дополненной 1 об./об.% сывороточным AB человека, а CD14-позитивные клетки культивировали в среде для культивирования в течение 1 суток.

К указанной выше культуре добавляли смесь цитокинов для созревания, содержащую 10 нг/мл TNFα, 10 нг/мл IL-β, 1000 МЕ/мл IL-6 и 1 мкг/мл PGE2. После дополнительных одних суток культивирования получали аутологичные зрелые DC.

Аутологичные зрелые DC примировали 10 мкг/мл модифицированного пептида WT1₁₈₇, полученного в примере 13 (пептид WT1₁₈₇P1F, пептид WT1₁₈₇P2M или пептид WT1₁₈₇P3M), культивировали в течение 4 часов и облучали 35 Гр радиоактивного излучения. Полученные таким образом клетки использовали в качестве стимулирующих клеток для индукции CTL.

PBMC (2×10⁶ клеток/лунку), служащие в качестве иммунореактивных клеток, и указанные выше DC (2×10⁵ клеток/лунку) совместно культивировали в 24-луночном планшете. Через одну неделю проводили повторную стимуляцию, добавляя клетки T2, которые примировали пептидом и облучали 75 Гр радиоактивного излучения. Через трое суток после повторной стимуляции добавляли 20 МЕ/мл IL-2. Такую же повторную стимуляцию повторяли еще 3 раза, добавляя примированные пептидом облученные клетки T2, а затем иммунореактивные клетки обогащались CD8-позитивными клетками. CD8-позитивные T-клетки тестировали на цитотоксическую активность против клеток-мишеней, т.е., в данном случае, клеток JY.

(3) Результаты

На фиг. 16 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0201 донора пептидом WT1₁₈₇P1F (фиг. 16a) или пептидом WT1₁₈₇P2M (фиг. 16b). На фиг. 16a и 16b вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CD8-позитивных T-клеток, полученных посредством стимуляции пептидом (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (соотношение E/T). Закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки JY, закрашенный треугольник соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали примированные пептидом WT1₁₈₇ клетки JY, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки JY, примированные модифицированным пептидом WT1₁₈₇ (пептид WT1₁₈₇P1F), который использовали для указанной выше стимуляции. Клетки JY положительны по HLA-A*0201 и негативны по WT1.

CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₈₇P1F, продемонстрировали одинаковую цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₈₇ клеток JY и примированных пептидом WT1₁₈₇P1F клеток JY, и активность была сильнее, чем активность против не примированных пептидом клеток JY (фиг. 16a). CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₈₇P2M, продемонстрировали одинаковую цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₈₇ клеток JY и примированных пептидом WT1₁₈₇P2M клеток JY, и активность была сильнее, чем активность против не примированных пептидом клеток JY (фиг. 16b). Как очевидно из результатов, CTL, индуцированные стимуляцией модифицированным пептидом, могут распознавать модифицированный пептид WT1₁₈₇ и пептид WT1₁₈₇ дикого типа.

Пример 12 (сравнение рестриктированных по HLA-A*0206 CTL, индуцированных различными модифицированными пептидами WT1₁₈₇)

(1) Цель

Принимая во внимание результаты примера 7, в качестве модифицированных пептидов WT1₁₈₇ для тестирования выбраны пептид WT1₁₈₇P1F, пептид WT1₁₈₇P2M и пептид WT1₁₈₇P3M, и для скрининга на модифицированные пептиды WT1₁₈₇, способные индуцировать CTL с высокой цитотоксической активностью, проводили приведенные ниже эксперименты.

(2) Материалы и методы

У здорового человека-донора с выявленной экспрессией молекул HLA-A*0206 (положительный по HLA-A*0206 здоровый донор крови) выделяли PBMC, и из PBMC выделяли CD14-позитивные клетки с применением магнитных частиц-DM с антителами к CD14 человека. Среду для культивирования получали посредством добавления 800 МЕ/мл GM-CSF и 1000 МЕ/мл IL-4 к среде X-VIVO15, дополненной 1 об./об.% сывороточным AB человека, а CD14-позитивные клетки культивировали в среде для культивирования в течение 1 суток.

К указанной выше культуре добавляли смесь цитокинов для созревания, содержащую 10 нг/мл TNFα, 10 нг/мл IL-β, 1000 МЕ/мл IL-6 и 1 мкг/мл PGE2. После дополнительных одних суток культивирования получали аутологичные зрелые DC.

Аутологичные зрелые DC примировали модифицированным пептидом WT1₁₈₇, полученным в примере 13 (пептид WT1₁₈₇P1F, пептид WT1₁₈₇P2M или пептид WT1₁₈₇P3M), культивировали в течение 4 часов и облучали 35 Гр радиоактивного излучения. Полученные таким образом клетки использовали в качестве стимулирующих клеток для индукции CTL.

Обогащенные CD8-позитивными T-клетками PBMC (2×10⁶ клеток/лунку) и указанные выше DC (1×10⁵ клеток/лунку) совместно культивировали в 24-луночном планшете. Через десять суток проводили повторную стимуляцию, добавляя PBMC, которые примировали пептидом и облучали 35 Гр радиоактивного излучения. Через двое суток после повторной стимуляции добавляли 10 МЕ/мл IL-2 и 10 нг/мл IL-7. После повторения такой же стимуляции еще 4 раза, происходило обогащение CD8-позитивными T-клетками. CD8-позитивные T-клетки тестировали на цитотоксическую активность против различных клеток-мишеней.

Используемые клетки-мишени представляли собой B-LCL, полученные посредством вирусной инфекции EB из крови положительного по HLA-A*0206 донора, клетки K562 и клетки 0206K562.

(3) Результаты

На фиг. 17 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора пептидом WT1₁₈₇P1F. На фиг. 17 вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CD8-позитивных T-клеток, полученных посредством стимуляции пептидом (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (соотношение E/T). На фиг. 17a закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки B-LCL, закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали примированные пептидом WT1₁₈₇ клетки B-LCL, а закрашенный треугольник соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали примированные пептидом WT1₁₈₇P1F клетки B-LCL. На фиг. 17b закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки K562, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки 0206K562, т.е. клетки K562, сделанные эндогенно презентирующими антигенные пептиды WT1 посредством трансфекции в них гена HLA-A*0206.

CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₈₇P1F, продемонстрировали одинаковую цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₈₇ клеток B-LCL и примированных пептидом WT1₁₈₇P1F клеток B-LCL, и активность была сильнее, чем активность против не примированных пептидом клеток B-LCL (фиг. 17a). Когда в качестве клеток-мишеней использовали отрицательные по HLA-A*0206, положительные по WT1 клетки K562, и клетки K562, сделанные эндогенно презентирующими антигенные пептиды WT1 посредством трансфекции в них гена HLA-A*0206 (клетки 0206K562), CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₈₇P1F, показали более сильную цитотоксическую активность против клеток 0206K562, чем против клеток K562 (фиг. 17b). Как очевидно из результатов, CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₈₇P1F, могут распознавать пептид WT1₁₈₇P1F и пептид дикого типа WT1₁₈₇. Подобным образом обнаружено, что CTL рестриктированы по HLA-A*0206 и демонстрируют цитотоксическую активность, распознавая присутствующий эндогенно пептид WT1₁₈₇ дикого типа.

На фиг. 18 приведены результаты измерения цитотоксической активности CTL, индуцированных посредством стимуляции PBMC от положительного по HLA-A*0206 донора пептидом WT1₁₈₇P2M. На фиг. 18 вертикальная ось соответствует цитотоксической активности, а горизонтальная ось соответствует отношению CD8-позитивных T-клеток, полученных посредством стимуляции пептидом (эффектор: E), к клеткам-мишеням (мишень: T) (соотношение E/T). На фиг. 18a закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки B-LCL, закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали примированные пептидом WT1₁₈₇ клетки B-LCL, а закрашенный треугольник соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали примированные пептидом WT1₁₈₇P2M клетки B-LCL. На фиг. 18b закрашенный ромб соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки K562, а закрашенный квадрат соответствует группе, в которой в качестве клеток-мишеней использовали клетки 0206K562, т.е. клетки K562, сделанные эндогенно презентирующими антигенные пептиды WT1 посредством трансфекции в них гена HLA-A*0206.

CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₈₇P2M, продемонстрировали одинаковую цитотоксическую активность против примированных пептидом WT1₁₈₇ клеток B-LCL и примированных пептидом WT1₁₈₇P2M клеток B-LCL, и активность была сильнее, чем активность против не примированных пептидом клеток B-LCL (фиг. 18a). Когда в качестве клеток-мишеней использовали отрицательные по HLA-A*0206, положительные по WT1 клетки K562, и клетки K562, сделанные эндогенно презентирующими антигенные пептиды WT1 посредством трансфекции в них гена HLA-A*0206 (клетки 0206K562), CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₈₇P2M, показали более сильную цитотоксическую активность против клеток 0206K562, чем против клеток K562 (фиг. 18b). Как очевидно из результатов, CTL, индуцированные стимуляцией пептидом WT1₁₈₇P2M, могут распознавать пептид WT1₁₈₇P2M и пептид дикого типа WT1₁₈₇. Подобным образом обнаружено, что CTL рестриктированы по HLA-A*0206 и демонстрируют цитотоксическую активность, распознавая присутствующий эндогенно пептид WT1₁₈₇ дикого типа.

Как очевидно из результатов примеров 9-12, CTL, индуцированные стимуляцией модифицированным пептидом WT1₁₂₆, т.е. пептидом WT1₁₂₆P1F, пептидом WT1₁₂₆P2L, пептидом WT1₁₂₆P3M или пептидом WT1₁₂₆P9V, рестриктированы по HLA-A*0206 и демонстрируют цитотоксическую активность, распознавая присутствующий эндогенно пептид WT1₁₂₆ дикого типа. Кроме того, пептид WT1₁₂₆P9V, пептид WT1₁₂₆P2L и пептид WT1₁₂₆P3M были высокоэффективными.

Как очевидно из приведенных выше результатов, CTL, индуцированные стимуляцией модифицированным пептидом WT1₁₈₇, т.е. пептидом WT1₁₈₇P1F, пептидом WT1₁₈₇P2M или пептидом WT1₁₈₇P3M, рестриктированы по HLA-A*0206 и демонстрируют цитотоксическую активность, распознавая присутствующий эндогенно пептид WT1₁₈₇ дикого типа. Кроме того, пептид WT1₁₈₇P2M и пептид WT1₁₈₇P1F были высокоэффективными.

Таким образом, показано, что эти модифицированные пептиды являются эффективными при лечении и профилактике злокачественных опухолей, сопровождающихся увеличенной экспрессией гена WT1 у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов.

Как очевидно из приведенных выше результатов, CTL, индуцированные стимуляцией модифицированным пептидом WT1₁₂₆, т.е. пептидом WT1₁₂₆P1F, пептидом WT1₁₂₆P2L, пептидом WT1₁₂₆P3M или пептидом WT1₁₂₆P9V, рестриктированы по HLA-A*0201 и демонстрируют цитотоксическую активность, распознавая присутствующий эндогенно пептид WT1₁₂₆ дикого типа. Кроме того, пептид WT1₁₂₆P1F и пептид WT1₁₂₆P2L были высокоэффективными.

Как очевидно из приведенных выше результатов, CTL, индуцированные стимуляцией модифицированным пептидом WT1₁₈₇, т.е. пептидом WT1₁₈₇P1F, пептидом WT1₁₈₇P2M или пептидом WT1₁₈₇P3M, рестриктированы по HLA-A*0201 и демонстрируют цитотоксическую активность, распознавая присутствующий эндогенно пептид WT1₁₈₇ дикого типа. Кроме того, пептид WT1₁₈₇P2M и пептид WT1₁₈₇P1F были высокоэффективными. Таким образом, показано, что эти модифицированные пептиды эффективны при лечении и профилактике злокачественных опухолей, сопровождающихся увеличенной экспрессией гена WT1 у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

Пример 13

Синтез пептида WT1₁₈₇P2V (SVGEQQYSV; SEQ ID NO: 13; H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH)

1. Синтез смолы с защищенным пептидом (H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-смола)

0,4 г Fmoc-Val-Alko-смолы (Alko представляет собой п-алкоксибензиловый спирт) (произведенный WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD; 0,80 ммоль/г) помещали в реакционный сосуд твердофазного синтезатора ACT496, произведенного Advanced ChemTech, отмывали DMF (N,N'-диметилформамидом) (этап 1), обрабатывали 25% раствором пиперидина в DMF (5 минут × 1 раз, и 30 минут × 1 раз) с удалением группы Fmoc (этап 2), и снова отмывали DMF (этап 3) с получением H-Val-Alko-смолы. В этот реакционный сосуд добавляли 0,7 мл NMP (N-метилпирролидинона) и раствор 121 мг (0,96 ммоль) DIPCI (N,N'-диизопропилкарбодиимида) в 0,9 мл NMP, а затем раствор 368 мг (0,96 ммоль) Fmoc-Ser(tBu)-OH и 147 мг (0,96 ммоль) моногидрата HOBT (1-гидроксибензотриазола) в 1,8 мл NMP. Реакцию присоединения проводили при комнатной температуре в течение 60 минут (этап 4). Проводили дополнительную реакцию присоединения с использованием тех же количеств Fmoc-Ser(tBu)-OH, моногидрата HOBT и DIPCI, как указано выше (этап 5). Полученную смолу отмывали DMF (этап 6), снимали защиту (этап 7) и снова отмывали (этап 8) с получением H-Ser(tBu)-Val-Alko-смолы. Затем последовательно проводили присоединения, повторяя этапы 4-8 с применением Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH и Fmoc-Ser(tBu)-OH. Полученную смолу с пептидом извлекали из реакционного сосуда, отмывали простым эфиром, а затем сушили в вакууме с получением 980 мг H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-смолы. Схема процесса синтеза, указанного выше, приведена в таблице 6.

2. Удаление защитной группы у защищенного пептида на смоле

К 980 мг H-Ser(tBu)-Val-Gly-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Val-Alko-смолы добавляли 5 мл смешанного раствора трифторуксусная кислота/вода/триизопропилсилан (95/2,5/2,5 (объемное соотношение)). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2,5 часов. Смолу отфильтровывали, а полученный фильтрат добавляли к ледяному диэтиловому эфиру. Полученный осадок собирали стеклянным фильтром. Остаток промывали диэтиловым эфиром и сушили в вакууме с получением 268 мг неочищенного пептида.

3. Очистка неочищенного пептида

268 мг полученного неочищенного пептида растворяли в 20% водном растворе уксусной кислоты и очищали посредством жидкостной хроматографии с обращенной фазой.

Насос: Shimadzu LC-8A

Колонка: YMC-Pack Pro C18 AS12S11-2530WT 3смΦ×25см

Элюент 1: H₂O/0,1% TFA

Элюент 2 (второй элюент): CH₃CN/0,1% TFA

Скорость потока: 10 мл/мин

Детекция: УФ 220 нм

После уравновешивания вторым элюентом в концентрации 1% в колонку вносили раствор неочищенного пептида. После этого позволяли расти концентрации второго элюента до 8% в течение 30 минут, а затем до 14% в течение 120 минут. Содержащие требуемое соединение фракции собирали, в вакууме испаряли ацетонитрил, а затем осадок лиофилизировали. Таким образом, получали 105 мг требуемого пептида WT1₁₈₇P2V (SVGEQQYSV; SEQ ID NO: 13; H-Ser-Val-Gly-Glu-Gln-Gln-Tyr-Ser-Val-OH).

Условия, используемые для анализа ВЭЖХ и масс-спектрометрии очищенного пептида, являлись такими, как указано ниже.

Анализ ВЭЖХ (Shimadzu LC-10Avp)

Колонка: YMC-Pack Pro C18 AS-302 4,6 ммΦ×150 мм

Элюент 1: H₂O/0,1% TFA

Элюент 2: CH₃CN/0,1% TFA

Градиент: концентрации элюента 2 позволяли расти с увеличением от 10% до 40% в течение 30 минут.

Скорость потока: 1 мл/мин

Детекция: УФ 220 нм

Чистота: 97,4%, время удержания: 11,22 минут

Аминокислотный анализ (анализатор аминокислот Hitachi L-8500)

Гидролиз: 1% фенол/6Н водный раствор соляной кислоты, 110°C, 24 часа

Способ анализа: нингидриновый способ

Ser:1,78(2) Glx:3,26(3) *Gly: (1) Val:2,04(2) Tyr:1,06(1)

*) Gly = стандартная аминокислота, значение в скобках представляет собой теоретическое значение.

Масс-спектрометрия (масс-спектрометр Applied Biosystems API 150EX)

m/z = 996,9 [M+1]⁺ (теоретическое значение = 996,5)

Анализ аминокислотной последовательности (белковый секвенатор Applied Biosystems 491)

Аминокислотную последовательность проверяли последовательно от N-концевого Ser до C-концевого Val.

Пептиды, представленные в таблицах 7 и 8, синтезировали таким же способом, как указано выше.

Пептиды, представленные в таблицах 9-12, синтезировали сходным образом, но используемые для анализа ВЭЖХ и масс-спектрометрии очищенных пептидов условия являлись такими, как указано ниже.

Анализ ВЭЖХ (Agilent HP1100 или Thermo Fisher Scientific Surveyor)

Колонка: Thermo Fischer Scientific BioBasic-18 3 ммΦ×250 мм

Элюент 1: H₂O/0,1% TFA

Элюент 2: CH₃CN/0,1% TFA

Градиент: концентрации элюента 2 позволяли изменяться до концентрации, представленной в таблице в течение 20 минут.

Скорость потока: 0,4 мл/мин

Детекция: 215 нм

Масс-спектрометрия

Масс-спектрометр Thermo Bioanalysis Dynamo (MALDI-TOF)

Пример 14

(Оценка модифицированных пептидов на активность индуцирования специфических иммунных клеток с использованием экспрессирующих HLA-A*0201 трансгенных мышей, и подтверждение перекрестной реактивности индуцированных специфических иммунных клеток к пептиду дикого типа)

<Способы>

(1) Модифицированные пептиды-кандидаты

В отношении пептида WT1₁₈₇, пептида WT1₁₂₆ и их модифицированных пептидов (пептиды, содержащие замену одного или двух аминокислотных остатков в положении 1, 2, 3 и/или 9 от N-конца пептида WT1₁₈₇ или пептида WT1₁₂₆) известным в данной области техники способом анализировали аффинность к молекулам HLA-A*0201, т.е. способом, с применением следующих четырех компьютерных баз данных:

BIMAS (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html),

SYFPEITHI (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/binding.html),

RANLPEP (http://immunax.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html), и

NetMHC3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/).

Результаты анализа пептида WT1₁₈₇ и его модифицированных пептидов приведены в таблицах 13-16 и 21. Результаты анализа пептида WT1₁₂₆ и его модифицированных пептидов приведены в таблицах 17-20 и 22-23. Прогнозируемая аффинность приведена в баллах.

Модифицированный пептид, для которого предсказана равная или большая аффинность по сравнению с пептидом дикого типа (пептид WT1₁₈₇ или пептид WT1₁₂₆), по меньшей мере, в одной из баз данных выбирали в дополнение к пептидам дикого типа в качестве образца для тестирования в следующих пунктах (2)-(4).

(2) Получение и введение пептидных препаратов

Получали пептид, синтезированный и лиофилизированный в примере 13, в концентрации 40 мг/мл в DMSO (произведенном Nacalai Tesque, Inc.). После этого, 32,5 мкл полученного раствора пептида в DMSO смешивали с 540 мкл дистиллированной воды для инъекций (произведенной Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). Затем 550 мкл смеси смешивали с 700 мкл неполного адъюванта Фрейнда (монтанид ISA-51) с применением стеклянного шприца с получением эмульсии вода-в-масле. Экспрессирующую HLA-A*0201 трансгенную мышь (название линии: HLA-A2+HLA-DR1+/Iaβ° β2m, EMMA ID number EM: 01783) иммунизировали посредством подкожного введения 300 мкл препарата (эмульсия вода-в-масле) в основание хвоста. Оценку каждого пептида проводили с использованием 2 или 3 мышей.

(3) Получение клеток селезенки

Через 7 суток после иммунизации выделяли селезенку. Селезенку разрушали растиранием о пористую часть покровного стекла, а затем подвергали гемолитической обработке лизирующим буфером ACK (произведенным Lonza Co.) с получением клеток селезенки. В этом эксперименте в качестве среды для клеток селезенки использовали CTM (полная среда для T-клеток: среда RPMI-1640 (произведенная Invitrogen Corporation), дополненная 10% ЭТС, 10 мМ HEPES, 20 мМ L-глутамином, 1 мМ пируватом натрия, 1 мМ MEM с заменимыми аминокислотами, 1% MEM с витаминами и 55 мкМ 2-меркаптоэтанолом с условием, что эти концентрации являлись конечными концентрациями), а клеточную суспензию получали при концентрации 5×10⁶ клеток/мл.

(4) Способ ELISPOT

Обладает ли вводимый пептид активностью индукции специфичных к WT1 иммунных клеток, проверяли способом ELISPOT, способ с применением в качестве показателя IFNγ. Способ проводили в соответствии с приложенным руководством. После добавления CTM в объеме 50 мкл/лунку в планшеты для ELISPOT (произведенные BD Japan, каталожный No. 551083), в них вносили суспензию клеток селезенки в объеме 100 мкл (5×10⁵ клеток/лунку). Кроме того, в них добавляли вводимый пептид или пептид дикого типа в объеме 50 мкл/лунку (конечная концентрация пептида: 2 мкг/мл). Данный способ анализа известен как один из способов замещения, которые позволяют предсказывать цитотоксическую активность (J. Immunological Methods, 1995, 181, 45-54).

<Результаты>

Результаты оценки активности индукции специфического клеточного иммунитета показаны на фиг. 19-22 и 28-29 для модифицированных пептидов WT1₁₈₇, и на фиг. 23-27 и 30-32 для модифицированных пептидов WT1₁₂₆. На каждой из фиг. 19-32 вертикальная ось соответствует количеству специфичных к антигенному пептиду отвечающих клеток на 5×10⁵ клеток селезенки (точек/5×10⁵ клеток), а горизонтальная ось соответствует конкретным мышам (2 или 3 мыши), используемым для оценки. Белый столбец соответствует количеству специфических иммунных клеток, отвечающих при отсутствии стимуляции антигенными пептидами. Серый столбец соответствует количеству специфических иммунных клеток, отвечающих на стимуляцию пептидом дикого типа. Черный столбец соответствует количеству специфических иммунных клеток, отвечающих на стимуляцию вводимым (модифицированным) пептидом.

На фиг. 19-32 показана соответствующая активность индукции специфического клеточного иммунитета в отношении указанных далее пептидов.

Фиг. 19a: пептид WT1₁₈₇P1A, b: пептид WT1₁₈₇P1F, c: пептид WT1₁₈₇P1G, d: пептид WT1₁₈₇P1I, e: пептид WT1₁₈₇P1L, f: пептид WT1₁₈₇P1M.

Фиг. 20a: пептид WT1₁₈₇P1V, b: пептид WT1₁₈₇P1W, c: пептид WT1₁₈₇P2I, d: пептид WT1₁₈₇P2M, e: пептид WT1₁₈₇P2Q, f: пептид WT1₁₈₇P2V.

Фиг. 21a: пептид WT1₁₈₇P3A, b: пептид WT1₁₈₇P3F, c: пептид WT1₁₈₇P3I, d: пептид WT1₁₈₇P3L, e: пептид WT1₁₈₇P3M, f: пептид WT1₁₈₇P3P.

Фиг. 22a: пептид WT1₁₈₇P3S, b: пептид WT1₁₈₇P3V, c: пептид WT1₁₈₇P3W, d: пептид WT1₁₈₇P3Y, e: пептид WT1₁₈₇P9L.

Фиг. 23a: пептид WT1₁₂₆P1A, b: пептид WT1₁₂₆P1F, c: пептид WT1₁₂₆P1G, d: пептид WT1₁₂₆P1I, e: пептид WT1₁₂₆P1L, f: пептид WT1₁₂₆P1M.

Фиг. 24a: пептид WT1₁₂₆P1V, b: пептид WT1₁₂₆P1W, c: пептид WT1₁₂₆P2A, d: пептид WT1₁₂₆P2I, e: пептид WT1₁₂₆P2L, f: пептид WT1₁₂₆P2Q.

Фиг. 25a: пептид WT1₁₂₆P2V, b: пептид WT1₁₂₆P3A, c: пептид WT1₁₂₆P3G, d: пептид WT1₁₂₆P3I, e: пептид WT1₁₂₆P3L, f: пептид WT1₁₂₆P3M.

Фиг. 26a: пептид WT1₁₂₆P3P, b: пептид WT1₁₂₆P3V, c: пептид WT1₁₂₆P3W, d: пептид WT1₁₂₆P9A, e: пептид WT1₁₂₆P9I, f: пептид WT1₁₂₆P9M.

Фиг. 27: пептид WT1₁₂₆P9V.

Фиг. 28a: пептид WT1₁₈₇P1D, b: пептид WT1₁₈₇P1E, c: пептид WT1₁₈₇P1H, d: пептид WT1₁₈₇P1K.

Фиг. 29a: пептид WT1₁₈₇P1N, b: пептид WT1₁₈₇P1P, c: пептид WT1₁₈₇P1Q, d: пептид WT1₁₈₇P1R, e: пептид WT1₁₈₇P1T.

Фиг. 30a: пептид WT1₁₂₆P1D, b: пептид WT1₁₂₆P1E, c: пептид WT1₁₂₆P1H, d: пептид WT1₁₂₆P1K, e: пептид WT1₁₂₆P1N, f: пептид WT1₁₂₆P1P.

Фиг. 31a: пептид WT1₁₂₆P1Q, b: пептид WT1₁₂₆P1S, c: пептид WT1₁₂₆P1T, d: пептид WT1₁₂₆P2I&P9I, e: пептид WT1₁₂₆P2I&P9V, f: пептид WT1₁₂₆P2L&P9I.

Фиг. 32: пептид WT1₁₂₆P2L&P9V.

Как показано в этих результатах, когда модифицированные пептиды, за исключением пептида WT1₁₈₇P1D, пептида WT1₁₈₇P1E, пептида WT1₁₈₇P1H, пептида WT1₁₈₇P1P и пептида WT1₁₈₇P2Q; пептида WT1₁₂₆P1D, пептида WT1₁₂₆P1E, пептида WT1₁₂₆P1P, пептида WT1₁₂₆P2A и пептида WT1₁₂₆P2Q, вводили мышам, происходила индукция специфических иммунных клеток с исключительной эффективностью.

Затем специфические иммунные клетки, индуцированные стимуляцией модифицированных пептидов, анализировали на перекрестную реактивность с пептидом дикого типа (таблицы 24-25). Результаты показывают, что конкретно пептид WT1₁₈₇P1A, пептид WT1₁₈₇P1I, пептид WT1₁₈₇P1L, пептид WT1₁₈₇P1M, пептид WT1₁₈₇P1N, пептид WT1₁₈₇P1Q, пептид WT1₁₈₇P1T, пептид WT1₁₈₇P1V, пептид WT1₁₈₇P2V, пептид WT1₁₈₇P2M, пептид WT1₁₈₇P2I, пептид WT1₁₈₇P3A, пептид WT1₁₈₇P3F, пептид WT1₁₈₇P3P, пептид WT1₁₈₇P3S, пептид WT1₁₈₇P3V и пептид WT1₁₈₇P9L из числа модифицированных пептидов WT1₁₈₇; и пептид WT1₁₂₆P1S, пептид WT1₁₂₆P2I, пептид WT1₁₂₆P2L, пептид WT1₁₂₆P2V, пептид WT1₁₂₆P3W, пептид WT1₁₂₆P9I, пептид WT1₁₂₆P9M и пептид WT1₁₂₆P9V из числа модифицированных пептидов WT1₁₂₆ могут индуцировать специфические иммунные клетки, которые эффективно распознают модифицированный пептид и пептид дикого типа.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

Вакцинная композиция против злокачественной опухоли по настоящему изобретению пригодна в качестве лекарственного средства, применяемого для лечения и профилактики экспрессирующих WT1 злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0206 индивидуумов. Вакцинная композиция против злокачественной опухоли по настоящему изобретению также пригодна в качестве лекарственного средства, применяемого для лечения и профилактики экспрессирующих WT1 злокачественных опухолей у положительных по HLA-A*0201 индивидуумов.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению противоопухолевых пептидных вакцин, и может быть использовано в медицине для лечения или профилактики злокачественных опухолей, сопровождающихся повышенной экспрессией гена WT1. Вакцинная композиция содержит эффективное количество пептида WT1:Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu, пептида WT1: Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val или их модифицированных вариантов. Изобретение обеспечивает эффективный противоопухолевый ответ у положительных по лейкоцитарному антигену человека (HLA)-A*0206 индивидуумов. 5 н. и 12 з.п. ф-лы, 32 ил., 25 табл., 14 пр.

Формула