Способ получения регуляторных дендритных клеток - RU2597976C2

Чертежи

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения регуляторных дендритных клеток, используемых для профилактики и лечения заболеваний, таких как отторжение трансплантата, заболевание трансплантат-против-хозяина, аутоиммунное заболевание, аллергическое заболевание, хроническое воспаление и сепсис, который является следствием аномального ответа и избыточного ответа иммунной системы. Настоящее изобретение более конкретно относится к способу получения регуляторных дендритных клеток, используя производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина и, в частности, (S)-(+)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевину (NK026680). Более того, настоящее изобретение относится к регуляторным дендритным клеткам, полученным указанным выше способом, и фармацевтической композиции или фармацевтическому набору, содержащим вышеупомянутые регуляторные дендритные клетки. Более того, настоящее изобретение относится к применению производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина для получения регуляторных дендритных клеток.

Уровень техники

Заболевания, являющиеся следствием иммунологических аномальностей и избыточных иммунных реакций, упреждались и лечились, главным образом, с использованием лекарственных препаратов, таких как иммуносупрессанты, противовоспалительные агенты и противоаллергические агенты. Несмотря на то, что лечение такими лекарственными препаратами эффективно, оно проблематично, поскольку снижает QOL (качество жизни) пациентов вследствие побочного действия.

Эти лекарственные препараты также переносятся в ткани, отличные от иммунных клеток мишени. В таких тканях, не являющихся мишенями, у лекарственного средства наблюдаются неспецифические эффекты, так что имеет место побочное действие. Такие нежелательные эффекты часто вынуждают прервать введение даже при наблюдении иммуносупрессивного влияния. Альтернативно, QOL пациентов может быть снижено при осуществлении медицинских процедур или т.п. для облегчения побочного действия. Несмотря на предпринятые попытки смягчения побочных эффектов за счет местного введения это применимо лишь для атопического дерматита, бронхиальной астмы и т.п., когда поврежденные участки располагаются в специфических тканях или органах.

Вследствие этого были предприняты попытки профилактики и лечения указанных выше заболеваний, используя регуляторные дендритные клетки. Дендритные клетки представляют собой антигенпредставляющие клетки, обладающие отростками, и они широко распространены в виде незрелых дендритных клеток в периферических нелимфоидных тканях и лимфоидных тканях. В воспаленной ткани, зараженной микроорганизмами, вирусы и чужеродный материал, дендритные клетки фагоцитируют чужеродные антигены, что приводит к дифференциации их в зрелые дендритные клетки, и затем мигрируют во вторичную региональную лимфоидную ткань. Здесь зрелые дендритные клетки активируют наивные Т-клетки с помощью двухсигнального механизма, который состоит из антиген-специфичного сигнала и ко-стимулирующего сигнала, индуцируя их дифференциацию в антиген-специфические эффекторные Т-клетки, таким образом индуцируя иммунные ответы. Описанные выше дендритные клетки представляют собой сильные антигенпредставляющие клетки, соединяющие врожденный иммунитет и приобретенный иммунитет.

В то же время, в условиях воспаления присутствуют некоторые дендритные клетки, экспрессирующие более низкие уровни костимуляторных молекул. Полагали, что эти дендритные клетки регулируют Т-клетки путем супрессии, чтобы индуцировать иммунологическую невосприимчивость к собственным тканям организма, собственным антигенам или подобному. Такие дендритные клетки называют регуляторными дендритными клетками. При лечении иммуноцитами, используя регуляторные дендритные клетки, наблюдались терапевтические эффекты за счет индукции антиген-специфической толерантности Т-клеток или развития регуляторных Т-клеток на мышах-моделях заболевания трансплантат-против-хозяина, аутоиммунного заболевания или аллергического заболевания (непатентные документы 1, 2 и 3). Более того, на модели сепсиса мыши регуляторные дендритные клетки ингибировали продукцию провоспалительных цитокинов путем продукции IL-10, демонстрируя эффект выживаемости (непатентный документ 4).

В патентном документе 1 описаны способ индукции иммунорегуляторных дендритных клеток человека путем культивирования дендритных клеток человека или их клеток-предшественников in vitro с цитокинами, к которым относятся по меньшей мере IL-10 и TGF-β, и иммунорегуляторные дендритные клетки человека, полученные данным способом. В патентном документе 2 описана попытка применения регуляторной дендритной клетки в качестве агента для усиления продукции IL-10 при синдроме системного воспалительного ответа.

Были предприняты попытки клинического применения вышеописанной терапии иммуноцитами, используя регуляторные дендритные клетки при заболевании иммунной системы. Для реального клинического применения необходимо создать способ широкомасштабного получения наряду с обеспечением безопасности регуляторных дендритных клеток. Как описано в непатентном документе 1, для получения регуляторных дендритных клеток, как было сообщено ранее, используют цитокины, к которым относятся IL-10 и TGF-β. Эти цитокины получают из генных рекомбинантов Escherichia coil и подобного, поэтому остаются проблемы обеспечения безопасности и стоимости продукции, что препятствует широкомасштабному получению.

Вместе с тем, производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина (патентные документы 3 и 4) представляет собой вещество, ингибирующее функции дендритных клеток, и у него наблюдается супрессивное влияние на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мыши (патентный документ 4). Одно из таких производных (S)-(+)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевины (далее в настоящем документе обозначаемого как «NK026680») приводит к снижению уровни экспрессии костимуляторных молекул, и у NK026680 наблюдались терапевтические эффекты на модели заболевания трансплантат-против-хозяина и модель аутоиммунного васкулита (непатентные документы 5 и 6).

Документы предшествующего уровня техники

Патентные документы

Патентный документ 1: Патентная публикация Японии (Kokai) №2004-298181 А

Патентный документ 2: Патентная публикация Японии (Kokai) №2006-290761 А

Патентный документ 3: Патентная публикация Японии (Kokai) №2005-154335 А

Патентный документ 4: Международная патентная публикация W02004/108729

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Sato К, Yamashita N, Yamashita N, Baba M, Matsuyama T. Regulatory dendritic cells protect mice from murine acute graft-versus-host disease and leukemia relapse. Immunity 2003; 18(3): 367-379.

Непатентный документ 2: Sato К, Yamashita N, Baba M, Matsuyama T. Modified myeloid dendritic cells act as regulatory dendritic cells to induce anergic and regulatory T cells. Blood 2003; 101(9): 3581-3589.

Непатентный документ 3: Fujita S, Yamashita N, Ishii Y, Sato Y, Sato K, Eizumi K, Fukaya T, Nozawa R, Takamoto Y, Yamashita N, Taniguchi M, Sato K. Regulatory dendritic cells protect against allergic airway inflammation in a murine athmatic model. J Allergy Clin Immunol 2008; 121(1): 95-104.

Непатентный документ 4: Fujita S, Seino K, Sato K, Sato Y, Eizumi K, Yamashita N, Taniguchi M, Sato K. Regulatory dendritic cells act as regulators of acute lethal systemic inflammatory response. Blood 2006; 107(9): 3656-3664.

Непатентный документ 5: Saiga К, Toyoda E, Tokunaka К, Masuda A, Matsumoto S, Ma shiba H, Kuramochi H, Nemoto К, Abe F, Kawagishi N, Furukawa H, Ono M. NK026680, a novel compound suppressive of dendritic cell function, ameliorates mortality in acute lethal graft-versus-host reaction in mice. Bone Marrow Transplant 2006; 37(3): 317-323.

Непатентный документ 6: Saiga К, Yoshida M, Nakamura I, Toyoda E, Tokunaka K, Morohashi H, Abe F, Nemoto K, Nose M. Evaluation of the ameliorative ef fects of immunosuppressants on crescentic glomerulonephritis in SCG/Kj mice. Int Immunopharmacol 2008; 8(9): 1183-1189.

Описание изобретения

Проблема, решаемая изобретением

Задача, решаемая настоящим изобретением - создать способ, который даст возможность безопасного и удобного широкомасштабного получения регуляторных дендритных клеток. Другой целью, решаемой настоящим изобретением, является получение регуляторных дендритных клеток, которые можно использовать для профилактики и лечения заболеваний иммунной системы, в то же время сохраняя QOL пациентов.

Способы решения задачи

В результате интенсивных исследований для достижения вышеуказанных целей авторы настоящего изобретения обнаружили, что регуляторные дендритные клетки могут быть получены путем культивирования регуляторных дендритных клеток при наличии производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, и, таким образом, завершили настоящее изобретение.

Настоящее изобретение представляет следующее изобретение.

(1) Способ получения регуляторных дендритных клеток, который содержит культивирование клеток, которые могут быть индуцированы с целью получения регуляторных дендритных клеток при наличии производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина.

(2) Способ получения регуляторных дендритных клеток по (1), в котором производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина представляет собой (S)-(+)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевину.

(3) Способ получения регуляторных дендритных клеток по (1) или (2), в котором клетки, которые могут быть индуцированы с целью получения регуляторных дендритных клеток, представляют собой дендритные клетки или их клетки-предшественники.

(4) Способ получения регуляторных дендритных клеток по (3), в котором клетки-предшественники дендритных клеток представляют собой моноциты.

(5) Способ получения регуляторных дендритных клеток по какому-либо из (1)-(4), в котором клетки, которые могут быть индуцированы с целью получения регуляторных дендритных клеток, представляют собой клетки, полученные из периферической крови, костного мозга, селезенки или пуповинной крови.

(6) Способ получения регуляторных дендритных клеток по какому-либо из (1)-(5), который содержит культивирование клеток при наличии GM-CSF и IL-4.

(7) Способ получения регуляторных дендритных клеток по какому-либо из пп.1-6, который содержит культивирование клеток при наличии TNF-α и/или LPS.

(8) Регуляторная дендритная клетка, которую получают способом получения по какому-либо из (1)-(7).

(9) Регуляторная дендритная клетка по (8), в которой уровни экспрессии CD40, CD80 и CD86 ниже, чем таковые клеток, полученных культивированием клеток, которые могут быть индуцированы с целью получения регуляторных дендритных клеток в отсутствие производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина.

(10) Регуляторная дендритная клетка по (8) или (9), в которой уровни экспрессии IL-6 и IL-12p40 ниже, чем таковые клеток, полученных культивированием клеток, которые могут быть индуцированы с целью получения регуляторных дендритных клеток в отсутствие производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина.

(11) Регуляторная дендритная клетка по какому-либо из (8)-(10), которая обладает меньшей способностью индуцировать активацию Т-клеток против аллоантигена, чем клетки, полученные культивированием клеток, которые могут быть индуцированы с целью получения регуляторных дендритных клеток в отсутствие производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина.

(12) Фармацевтическая композиция или фармацевтический набор, который содержит регуляторную дендритную клетку по какому-либо из (8)-(11).

(13) Фармацевтическая композиция или фармацевтический набор по (12), который используют для профилактики и/или лечения отторжения трансплантата, заболевания трансплантат-против-хозяина, аутоиммунного заболевания, аллергического заболевания, воспалительного заболевания, сепсиса или шока, которые являются следствием аномальных ответов и избыточных реакций иммунной системы.

(14) Применение производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина для получения регуляторных дендритных клеток.

(15) Применение по (14), в котором производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина представляет собой (S)-(+)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевину.

(16) Реагент для индукции регуляторных дендритных клеток, который содержит производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина.

(17) Реагент для индукции регуляторных дендритных клеток по (16), в котором производное [1,2,4] триазоло[1,5-а]пиримидина представляет собой (S)-(+)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)- [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевину.

Эффекты изобретения

В настоящем изобретении производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина используют для индукции регуляторных дендритных клеток ex vivo из мононуклеарных клеток, содержавшихся среди клеток периферической крови, клеток костного мозга или подобное. Производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина представляет собой низкомолекулярное соединение, которое может быть получено с низкой стоимостью и может обеспечить широкомасштабное получение и безопасность. За счет применения производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина для получения регуляторных дендритных клеток большое количество регуляторных дендритных клеток может быть получено безопасным и удобным путем. Согласно настоящему изобретению регуляторные дендритные клетки могут быть получены с низкой стоимостью в большом количестве без применения дорогостоящих рекомбинантных цитокинов, обладающих нестабильными физическими характеристиками. Более того, поскольку лекарственные препараты, которые были использованы для получения, не сохраняются в регуляторных дендритных клетках по настоящему изобретению, регуляторные дендритные клетки крайне эффективны для профилактики и лечения заболеваний, являющихся следствием аномальностей в иммунной системе и избыточных иммунных ответов, таких как миелосупрессия, трансплантация органа, аутоиммунное заболевание, аллергическое заболевание и шок, не приводя к какому-либо негативному влиянию, вызванному лекарственными препаратами, использованными для получения.

Краткое описание чертежей

[Фигура 1] На фиг.1 показано встраивание 3Н-TdR в аллогенные Т-клетки, активированные регуляторными дендритными клетками (NK-DC), необработанными дендритными клетками (CTR-DC) и незрелыми дендритными клетками (unstim-DC). Черные круги указывают на NK-DC, белые круги указывают на CTR-DC и х указывает на unstim-DC.

[Фигура 2] На фиг.2 показана степень выживаемости мышей С3Не/J с трансплантированным сердцем (которым были перенесены регуляторные дендритные клетки по настоящему изобретению (NK-DC) или необработанные дендритные клетки (CTR-DC)), мышей С3Не/J с C57BL/6 трансплантатами сердца в модели трансплантации сердца. Непрерывная линия указывает на NK-DC и пунктирные линии указывают на CTR-DC или не стимулируемые DC.

Варианты осуществления изобретения

В настоящем изобретении регуляторные дендритные клетки могут быть получены путем обработки в тестовой пробирке клеток, которые могут быть индуцированы с целью получения регуляторных дендритных клеток (например, дендритных клеток или их клеток-предшественников), с помощью производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина и при желании цитокинов и/или стимуляторов воспаления. Конкретно, регуляторные дендритные клетки могут быть получены путем обработки моноцитов, собранных из периферийной крови, костного мозга и тому подобного, с фактором дифференцировки (GM-CSF, IL-4), фактором созревания (например, воспалительные цитокины, TNF-a, воспалительные вещества, липополисахарид (LPS)) и производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина. Последовательность лечения: стимуляция этими цитокинами и/или стимуляция воспаления и добавление производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина - особым образом не ограничивается. Регуляторные дендритные клетки могут быть получены путем стимуляции в произвольном порядке. Например, моноциты культивируют in vitro при наличии GM-CSF и IL-4, таким образом, побуждая моноциты к дифференциации в дендритные клетки, и затем регуляторные дендритные клетки могут быть индуцированы из полученных таким образом дендритных клеток, используя производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина. При этом моноциты могут быть сначала простимулированы с помощью GM-CSF и IL-4 для дифференциации в дендритные клетки и затем простимулированы с помощью производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, или моноциты могут быть одновременно простимулированы с помощью GM-CSF, IL-4 и производного [1,2,4]риазол[1,5-а]пиримидина. При этом вместе с производным [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина могут присутствовать цитокины для дифференциации в регуляторные дендритные клетки (например, IL-10 и TGF-(3). Более того, зрелые регуляторные дендритные клетки могут быть получены стимуляцией воспаления, используя TNF-α, LPS или подобное.

Цитокины или стимуляторы воспаления, используемые для получения регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению, особым образом не ограничиваются. К примерам цитокинов относятся цитокины, обладающие функцией индукции дифференциации дендритных клеток, такие как GM-CSF, IL-4, IL-10 и TGF-β. К примерам стимуляторов воспаления относятся липополисахариды, представленные LPS, и цитокины, такие как TNF-α, обеспечивающий стимуляцию воспаления.

Дендритные клетки могут быть получены путем культивирования моноцитов при наличии GM-CSF и/или IL-4, как описано выше. Моноциты в этом случае могут быть получены из клеток периферической крови, костного мозга, селезенки или из пуповинной крови. Более того, дендритные клетки также могут быть выделены из этих тканей и органов с помощью клеточного сортера или подобного, используя в качестве индикатора экспрессию поверхностного антигена (например, CD1a), специфичного для дендритных клеток. Популяция специфических клеток может быть выделена, используя клеточный сортер согласно известному способу. Моноциты, которые используют для получения регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению, могут быть получены от млекопитающего, такого как приматы, грызуны, плотоядные, парнокопытные, непарнокопытные и подобное. К их конкретным примерам относятся люди, обезьяны, мыши, крысы, кролики, кошки, крупный рогатый скот, собаки, лошади и козы. Самым предпочтительным примером из них является человек. Среди вышеуказанных примеров предпочтительно, чтобы моноциты получали от животного того же вида, что и животное, подвергаемое профилактике или лечению заболевания, используя регуляторные дендритные клетки по настоящему изобретению.

Моноциты и дендритные клетки могут быть культивированы посредством известных техник культивирования лимфоидных клеток. В качестве культурной среды может быть использована, например, среда RPMI1640 или DMEM. Клетки могут быть культивированы в этих основных средах, дополненных подходящими антибиотиками, сывороткой животных или подобным. Емкости для культивирования также не ограничиваются. В зависимости от объема культивирования могут быть подходящим образом выбраны и использованы коммерчески доступные планшеты, чашки и флаконы.

Производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, используемое по настоящему изобретению, представляет собой соединение, описанное в патентной публикации Японии (Kokai) №2005-154335 А и международной патентной публикации 2004/108729. Конкретно, производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, используемое по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой соединение следующей формулы (1) или его фармацевтически приемлемую соль.

[Химическая формула 1]

[где Ar представляет ароматическую углеводную группу или ароматическую гетероциклическую группу, содержащую от 1 до 4 гетероатомов, которая необязательно может иметь заместитель, Х представляет собой О, S, NH, N-СН₃ или N-CN, Y обозначает фенильную группу, которая необязательно может иметь заместитель, или группу RNH, и R представляет атом водорода, цианогруппу, линейную, разветвленную или циклическую алкильную группу, которая необязательно может иметь заместитель, ароматическую углеводную группу, которая необязательно может иметь заместитель, или 5-7-членную гетероциклическую группу, которая необязательно может иметь заместитель и содержит от 1 до 4 гетероатомов, выбранных независимым образом из N, О и S].

Конкретным примером является производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-илмочевины или его фармацевтически приемлемая соль, где Ar представляет собой фенильную группу, которая может иметь заместитель, или 5-6-членную ароматическую гетероциклическую группу, которая может иметь заместитель и содержит 1 гетероатом, выбранный из N, О и S, где фенильная группа или ароматическая гетероциклическая группа может быть замещена на 1 или 2 идентичных или различающихся группы, выбранных из группы заместителей, состоящей из галогеногруппы, гидроксигруппы, цианогруппы, нитрогруппы, (С1-С6) алкильной группы, (С1-С6) алкоксильной группы и алкилендиоксигруппы, Х представляет собой О, и R представляет собой фенильную группу, которая необязательно может быть замещена на 1-3 идентичных или различающихся группы, выбранных из группы заместителей, состоящей из галогеногруппы, гидроксигруппы, (С1-С6) алкильной группы, (С1-С6) алкоксильной группы, (С1-С7) ацилоксигруппы, трифторметильной группы и трифторметоксигруппы или группы, представленной общей формулой (2):

[Химическая формула 2]

{где R1 представляет атом водорода или (С1-С6) алкильную группу, R2 представляет атом водорода или метильную группу, R3 представляет атом водорода, фенильную группу (где фенильная группа необязательно может быть замещена на 1 группу, выбранную из группы, состоящей из галогеногруппы, гидроксигруппы, (С1-С6) алкильной группы и (С1-С6) алкоксильной группы) или (С1-С10) алкильную группу (где алкильная группа необязательно может быть замещена на 1 или 2 идентичных или различающихся группы, выбранных из группы, состоящей из галогеногруппы, гидроксигруппы, (С1-С6) алкоксильной группы, (С1-С7) ацилоксигруппы и трифторметильной группы)}.

К конкретным примерам производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, используемым по настоящему изобретению, относятся, но ими не ограничиваясь, следующие соединения:

(S)-1-(3-этокси-1-метилпропил)-3-[7-(3,4-метилендиоксифенил)- [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина;

(S)-1-(4-метокси-1-метилбутил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина;

(S)-1-(4-гидрокси-1,4-диметилпентил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина;

(S)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина;

(S)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-{7-[3-(пиридин-3-илметокси)фенил]-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил}мочевина;

(S)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-(7-тиофен-2-ил[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина;

(S)-1-[1-(3-метоксифенил)этил]-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина;

(S)-1-[7-(3,4-метилендиоксифенил)-[1,2,4] триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]-3-[1-(3-метоксифенил)этил]мочевина;

(S)-1-[7-(3,4-метилендиоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]-3-[1-(3,4,5-триметоксифенил)этил]мочевина;

(S)-1-(7-тиофен-2-ил[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]-3-[1-(3,4,5-триметоксифенил)этил]мочевина;

(S)-1-[1-(3,4-метилендиоксифенил)этил]-3-{7-[3-(пиридин-3-илметокси)фенил]-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил}мочевина;

(S)-1-(1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-гидроксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина;

(S)-1-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]-3-(1-фенилэтил)мочевина;

4хлор-2-метокси-N-(7-тиофен-2-ил[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]бензамид;

(S)-1-(1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина;

1-(2-метоксифенил)-3-(7-тиофен-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина;

1-изопропил-3-(7-тиофен-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина;

(R)-1-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]-3-(1-фенилэтил)мочевина; и

(R)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина.

Самым предпочтительным из конкретных примеров производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, используемых по настоящему изобретению, является (S)-(+)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевина.

Согласно настоящему изобретению предлагаются применение производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина для получения регуляторных дендритных клеток и реагент для индукции регуляторных дендритных клеток, который содержит производное [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина.

Концентрация производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, используемая для культивирования, находится в диапазоне от 1 нг/мл до 5000 нг/мл и предпочтительно находится в диапазоне от 10 нг/мл до 500 нг/мл. Концентрация GM-CSF, IL-4, IL-10, TGF-β, TNF-α или LPS находится в диапазоне от 1 нг/мл до 1000 нг/мл и предпочтительно находится в диапазоне от 10 нг/мл до 100 нг/мл. Кроме того, количество дней культивирования, которое требуется для индуцирования регуляторных дендритных клеток, не ограничивается. Например, моноциты могут культивироваться вместе с производным [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, цитокинами и/или стимуляторами воспаления в течение от около нескольких дней до 10 дней. Экспрессию поверхностного антигена моноцитов или дендритных клеток оценивают посредством проточной цитометрии или подобного, так что продолжительность культивирования, которая потребуется для индуцирования зрелых дендритных клеток, может быть определена подходящим образом. Условия, такие как концентрации и продолжительность культивирования, для производного [1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидина, цитокинов и/или воспалительных веществ, используемых для индуцирования регуляторных дендритных клеток, могут быть определены, областьюнеотвечаемости аллогенных Т клеток или фенотип дендритных клеток в качестве индикатора.

При использовании регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению для лечения заболевания регуляторные дендритные клетки по настоящему изобретению индуцируютантигенами, связанным с заболеванием, подвергаемым лечению. В качестве антигена в случае аутоиммунного заболевания или аллергического заболевания используют белок или пептид антигена, существующий в ткани и/или органе, связанном с таким заболеванием, или РНК или ДНК, кодирующую его, или их модифицированный продукт. В случае отторжения трансплантата или заболевания трансплантат-против-хозяина используют антигены, полученные от донора или реципиента. Стимуляция в этом случае может быть осуществлена путем культивирования in vitro регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению вместе с антигеном.

Для лечения аутоиммунного заболевания или аллергического заболевания дендритные клетки инкубируют вместе с антигенами в течение периода в диапазоне от 10 дней до 1 дня, включая конечный день культивирования. В случае белковых антигенов они добавляются in vitro в концентрации в диапазоне от 1 нг/мл до 10 мг/мл и предпочтительно в диапазоне от 10 нг/мл до 5 мг/мл. При использовании регуляторных дендритных клеток, дополнительно простимулированных стимулятором воспаления, как правило, антиген добавляют одновременно со стимуляцией воспаления или перед ней.

Регуляторные дендритные клетки по настоящему изобретению могут быть использованы для терапевтических лекарственных средств, профилактических лекарственных средств и подобного при иммунных заболеваниях и подобном, являющихся следствием иммунологических аномалий. К примерам иммунного заболевания относятся отторжение трансплантата, аутоиммунное заболевание, аллергическое заболевание, воспалительное заболевание, сепсис и шок.

К примерам отторжения трансплантата относятся сверхострое отторжение, заболевание трансплантат-против-хозяина и хроническое отторжение после трансплантации. Регуляторные дендритные клетки по настоящему изобретению могут быть использованы для индукции иммунологической невосприимчивости, например, в дополнение к лечению и профилактике отторжений трансплантата. Трансплантат может представлять собой любой орган, такой как костный мозг, почка, печень, сердце и поджелудочная железа. В отношении взаимосвязи донор-хозяин, трансплантация может представлять собой, например, гетерологическую трансплантацию, гомологичную трансплантацию или АВО несовместимую трансплантацию. Также регуляторные дендритные клетки по настоящему изобретению могут быть использованы с целью иммуносупрессии и длительной приживаемости при трансплантациях, такой как трансплантация костного мозга, трансплантация стволовых клеток периферической крови и трансплантация стволовых клеток пуповинной крови, которые осуществляют при лечении рака, лечении аутоиммунных заболеваний, генной терапии и в восстановительной медицине.

К примерам аутоиммунного заболевания относятся ревматоидный артрит, рассеянный склероз, системная красная волчанка, хроническая красная волчанка, синдром Шергена, болезнь Крона, язвенный колит, идиопатический тромбоцитоз, апластическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный миокардит, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, болезнь Бехчета, аутоиммунный гастрит, инсулин-зависимый сахарный диабет, миастения гравис, полимиозит, склеродермия, смешанное соединительнотканное заболевание, анкилозирующий спондилит, хронический тиреоидит, пузырчатка, синдром Гийена-Барре и HTLV-1-ассоциированная миелопатия. Также к примерам аллергического заболевания относятся атопический дерматит, поллиноз, контактная гиперчувствительность, астма, псориаз и анафилаксия. К примерам воспалительного заболевания относятся полиартрит, саркоидоз, гломерулонефрит, нефротический синдром, хронический васкулит и синдром Вегенера.

Дозу регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению подходящим образом определяют так, чтобы у индивидуума, которому, ее вводят, могли быть выявлены желаемые эффекты. Конкретно, индивидууму, подвергаемому лечению, вводят около от 0,5×10⁵ до 10⁹ регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению внутривенно, подкожно или внутрикожно (и предпочтительно внутривенно). Среда, используемая при введении, может представлять собой любую обычно используемую среду и не ограничивается особым образом при условии, что она не вызывает негативного эффекта или подобного у индивидуума, подвергаемого введению, и не вызывает нарушения функций регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению. К примерам такой среды относится среда, такая как RPMI1640 и DMEM, буфер Хенкса, фосфатно-забуференный солевой раствор (PBS), физиологический раствор и раствор декстрозы. Примеры индивидуума, подвергаемого введению, не ограничиваются особым образом при условии, что он представляет собой млекопитающее. К примерам относятся приматы, грызуны, плотоядные, парнокопытные и непарнокопытные, такие как человек, обезьяна, мышь, крыса, кролик, кошка, крупный рогатый скот, собака, лошадь и коза. Его предпочтительным примером является человек.

Сроки введения агентов для профилактики или лечения большого числа заболеваний у индивидуумов, подвергаемых введению, особым образом не ограничиваются. Такой агент может быть введен при необходимости. Конкретно, в случае отторжения трансплантата или заболевания трансплантат-против-хозяина, ассоциированного с трансплантацией органа и/или ткани, введение предпочтительно осуществляют перед процедурой (трансплантацией), при которой прогнозируют возникновение такого заболевания. Сроки введения и доза иммунорегуляторных дендритных клеток человека могут быть подходящим образом определены в зависимости от типа заболевания, тяжести заболевания, состояния пациента и подобного.

Настоящее изобретение дополнительно охватывает фармацевтическую композицию или фармацевтический набор, который содержит регуляторные дендритные клетки по настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению особым образом не ограничивается при условии, что она содержит регуляторные дендритные клетки по настоящему изобретению. Ее примером является фармацевтическая композиция, полученная путем суспендирования регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению в среде, которая не вызывает какого-либо негативного эффекта или подобного у индивидуума, подвергаемого введению, описанного выше, и не ухудшает функции регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению. В ее примеры также включается фармацевтическая композиция, полученная путем добавления приемлемой в медицине добавки, которая поддерживает состояние регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению или других агентов. Термин «фармацевтический набор по настоящему изобретению» относится к комбинации регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению с другим(и) агентом(ами). Примеры других агентов не ограничиваются при условии, что они представляют собой известные терапевтические лекарственные средства или профилактические лекарственные средства для лечения иммунного заболевания или подобного, являющегося следствием иммунологических аномалий, и к ним относятся иммунорегуляторные лекарственные средства, такие как салазосульфапиридин, буцилламин, ауротиомалат натрия, D-пеницилламин, ауранофин, актарит и лобензарит, иммуносупрессивные лекарственные средства, такие как метотрексат, лефлуномид, такролимус, мизорибин, циклофосфамид, азатиоприн, циклоспорин и микофенолат мофетил, биологические препараты, такие как инфликсимаб, этанерцепт, адалимумаб, тоцилизумаб и ритуксимаб, NSAID, такие как мефенамовая кислота, диклофенак натрия, набуметон, этодолак, локсопрофен натрия и мелоксикам, стероидные лекарственные средства, такие как преднизолон, метилпреднизолон, метилпреднизолонацетат (эфир), метилпреднизолонсукцинат натрия (эфир), дексаметазон, бетаметазон и гидрокортизон, NRTI, такие как зидовудин, ламибудин, абакавир и эмтрицитабин, лекарственное средство на основе нуклеотидов, ингибирующее обратную транскриптазу, такое как тенофовир, NNRTI, такие как эфавиренз, лекарственные средства, ингибирующие протеазу, такие как атазанавир, фозампренавир, лопинавир, ритонавир и дарунавир, и лекарственное средство, ингибирующее интегразу, такое как ралтегравир. Кроме того, относительно фармацевтического набора по настоящему изобретению, порядок введения регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению и других агентов не ограничивается.

Регуляторные дендритные клетки по настоящему изобретению поясняются в следующих примерах в нескольких вариантах осуществления. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

Примеры

Забор клеток костного мозга мышей C57BL/6

У каждой мыши C57BL/6 (SLC, самца, возраст 10-12 недель) иссекали бедренную кость, оба конца бедренной кости помещали в среду RPMI1640, и таким образом ткань костного мозга удаляли из полости кости. Из ткани костного мозга, используя шприц 26G, получали одноклеточную суспензию, таким образом, получали клетки костного мозга мыши C57BL/6.

Стимуляция дифференциации клеток костного мозга мыши C57BL/6 в дендритные клетки и созревание полученных клеток

Клетки костного мозга мыши C57BL/6 культивировали в течение 7 дней в 10% среде FCS-RPMI1640, содержащей GM-CSF в концентрации 20 нг/мл (продукция фирмы Peprotech, источник: кролик) и IL-4 в концентрации 20 нг/мл (продукция фирмы Peprotech, источник: кролик), так, чтобы вызвать дифференциацию клеток в дендритные клетки. После этого для созревания добавляли TNF-a в концентрации 20 нг/мл (продукция фирмы Peprotech, источник: кролик). Обработку с помощью NK026680 осуществляли путем добавления NK026680 в количестве 50 нг/мл в дни культивирования 2 и 4 и добавления NK026680 в количестве 250 нг/мл в день культивирования 6.

Забор клеток селезенки и Т-клеток мыши C57BL/6

У каждой мыши C57BL/6 (SLC, самца, возраст 10-12 недель) иссекали селезенку, клетки селезенки извлекали из селезенки в среде RPMI1640, одноклеточную суспензию получали, используя шприц 26G, и, таким образом, получали клетки селезенки мыши C57BL/6. Т-клетки мыши C57BL/6 отделяли и собирали из клеток селезенки мыши C57BL/6, используя нейлоновую вату (продукция фирмы R&D systems).

Экстракт клеток селезенки мыши C57BL/6

Клетки селезенки мыши C57BL/6 полностью разрушали, используя ультразвуковой дезинтегратор, и затем замораживали при -80°С. После этого замороженные (разрушенные) клетки размораживали и затем центрифугировали (300 g в течение 5 минут) для удаления фрагментов клеток. Супернатант полученного продукта использовали в качестве экстракта.

Забор клеток костного мозга мышей С3Не/J

У каждой мыши C3He/J (SLC, самца, возраст 10-12 недель) иссекали бедренную кость, оба конца бедренной кости помещали в среду RPMI1640 и таким образом из полости кости извлекали костномозговую ткань. Из ткани костного мозга, используя шприц 26G, получали одноклеточную суспензию, таким образом, получая клетки костного мозга мыши C3He/J.

Дифференциация клеток костного мозга мыши C3He/J в дендритные клетки

Клетки костного мозга мыши C3He/J культивировали в течение 7 дней в 10% среде FCS-RPMI1640, содержащей GM-CSF в концентрации 20 нг/мл и IL-4 в концентрации 20 нг/мл, так, чтобы вызвать дифференциацию клеток в дендритные клетки. Обработку с помощью NK026680 осуществляли путем добавления NK026680 в количестве 50 нг/мл в дни культивирования 2 и 4 и добавления NK026680 в количестве 250 нг/мл в день культивирования 6. Также на день 6 добавляли экстракт клеток селезенки мыши C57BL/6.

Экстракт клеток селезенки мыши BALB/c

У каждой мыши BALB/c (SLC, самца, возраст 10-12 недель) иссекали селезенку, клетки селезенки извлекали из селезенки в среде RPMI1640, одноклеточную суспензию получали, используя шприц 26G, и, таким образом, получали клетки селезенки мыши BALB/c. Клетки селезенки полностью разрушали, используя ультразвуковой дезинтегратор, и затем замораживали при -80°С. После этого замороженные (разрушенные) клетки размораживали и затем центрифугировали (при 300 g в течение 5 минут) для удаления фрагментов клеток. Супернатант полученного продукта использовали в качестве экстракта.

(Пример 1)

Экстракт клеток селезенки, полученный от мыши BALB/c, добавляли к дендритным клеткам, полученным из клеток костного мозга, которые забирали от мыши C57BL/6, таким образом, побуждая клетки представить антиген BALB/c. Эффект встраивания антигена BALB/c подтверждали путем измерения посредством проточной цитометрии экспрессии антигена I-Ad (антитело: продукция фирмы BD pharmingen), который представляет собой главный комплекс гистосовместимости (МНС) мыши BALB/c. В то же время клетки культивировали при наличии или в отсутствие NK026680, и клетки оставляли для созревания при посредстве TNF-a (продукция фирмы Peprotech, источник: кролик). Зрелость дендритных клеток подтверждали с помощью анализа проточной цитометрии экспрессии маркера зрелых дендритных клеток. NK026680 обработанные дендритные клетки (NK-DC) по настоящему изобретению и необработанных дендритных клетках (CTR-DC) инкубировали с флуоресцентно-мечеными антителами против костимуляторных молекул, CD40, CD80 и CD86. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) измеряли посредством проточной цитометрии, таким образом, сравнивая уровни экспрессии CD40, CD80 и CD86.

Результаты примера 1 показаны в таблице 1. Сравнивались величины MFI, представляющие количества флуоресцентно-меченых антител против CD40, CD80 и CD86, которые связываются. В результате было обнаружено, что уровни экспрессии CD40, CD80 и CD86 дендритных клеток, обработанных с помощью NK026680, по настоящему изобретению (NK-DC), меньше, чем уровни необработанных дендритных клеток (CTR-DC). Низкоуровневая экспрессия костимуляторных молекул является характеристикой регуляторных дендритных клеток, и это демонстрировало, что дендритные клетки (обработанные с помощью NK026680) по настоящему изобретению представляют собой регуляторные дендритные клетки.

(Пример 2)

В этом примере 2 способом, аналогичным таковому в примере 1, получали дендритные клетки по настоящему изобретению, обработанные с помощью NK026680, и необработанные дендритные клетки, которые были получены путем дифференциации и созревания клеток костного мозга мыши C57BL/6. После стимуляции с помощью TNF-α клетки культивировали в течение 24 часов. Супернатант полученной таким образом культуры собирали, и затем посредством ELISA (продукция фирмы BD Bioscience) (n=3) измеряли концентрации цитокинов, стимулирующих иммунный ответ, IL-6 и IL-12р40.

Результаты примера 2 показаны в таблице 2. Концентрации IL-6 и IL-12p40, содержавшихся в супернатанте культуры дендритных клеток, обработанных с помощью NK026680, оказались ниже, чем таковые в супернатанте культуры необработанных дендритных клеток. Низкоуровневая продукция цитокинов, стимулирующих иммунный ответ (IL-6 и IL-12p40) является характеристикой регуляторных дендритных клеток, и это демонстрировало, что дендритные клетки по настоящему изобретению, обработанные с помощью NK026680, представляют собой регуляторные дендритные клетки.

(Пример 3)

В этом примере 3 способом, аналогичным таковому в примере 1, получали регуляторные дендритные клетки по настоящему изобретению, обработанные с помощью NK026680, (NK-DC) и необработанные дендритные клетки (CTR-DC), которые были получены путем дифференциации и созревания клеток костного мозга мыши C57BL/6. Кроме того, вызывали дифференциацию клеток костного мозга мыши C57BL/6 в дендритные клетки и затем побуждали их представить антиген BALB/c способом, аналогичным таковому в примере 1. Также получали незрелые дендритные клетки (unstim-DC), не вызывающие созревания, используя TNF-α. Т-клетки мыши C57BL/6 смешивали с каждым из 3 типов дендритной клетки, и затем измеряли встраивание 3Н-TdR (продукция фирмы GE HealthCare). Количество встроенного 3Н-TdR представляет способность дендритных клеток индуцировать активацию Т-клеток против аллоантигена.

Результаты примера 3 представлены на фиг.1. Было обнаружено, что NK-DC обладает более низкой способностью индуцировать активацию Т-клеток против антигена BALB/c, чем CTR-DC. Кроме того, было обнаружено, что NK-DC обладает способностью индуцировать активацию Т-клеток, эквивалентную таковой клеток unstim-DC. Конкретно, было показано, что способность NK-DC активировать индукцию Т-клеток снижалась до того же уровня, что и у незрелых дендритных клеток даже при стимуляции аллоантигеном.

(Пример 4)

В этом примере 4 к дендритным клеткам, полученным из клеток костного мозга мыши С3Не/J, добавляли экстракт клеток селезенки мыши C57BL/6, чтобы вызвать презентацию на клетках антигена C57BL/6. Эффект встраивания антигена C57BL/6 подтверждали путем измерения посредством проточной цитометрии экспрессии антигена I-Ab (антитело; продукция фирмы BD Pharmingen), который представляет собой МНС мыши BALB/c. В это же время клетки культивировали при наличии или в отсутствие NK026680. Дендритные клетки (NK-DC), обработанные с помощью NK026680, и необработанные дендритные клетки (CTR-DC) по отдельности переносили мышам C3He/J (SCL, самцам, возраст 10-12 недель) путем внутривенного введения (количество введенных клеток: 3×10⁶клеток/мышь; и среда: фосфатно-забуференный солевой раствор (PBS)). В это же время также получали группу (n=6), в которую дендритные клетки не переносили (без обработки). Через 7 дней сердца мышей C57BL/6 (SCL, самцов, возраст 10-12 недель) трансплантировали в группу, которой перенесли NK-DC, группу, которой перенесли CTR-DC, и группу без обработки и затем сравнивали степени выживаемости 3 групп.

Результаты примера 4 показаны на фиг.2. В группе, которой перенесли NK-DC, наблюдалась существенно улучшенная степень выживаемости и увеличенный период выживаемости по сравнению с группой, которой перенесли CTR-DC, и необработанной группой.

Промышленное применение

Согласно способу получения регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению может быть получено большое количество регуляторных дендритных клеток, при том, что способ очень удобен. Кроме того, регуляторные дендритные клетки, которые получают способом получения регуляторных дендритных клеток по настоящему изобретению, можно использовать для профилактики и лечения заболевания, являющегося следствием иммунологических аномалий и избыточных иммунных ответов.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению регуляторных дендритных клеток, и может быть использовано в медицине для лечения заболеваний, являющихся следствием иммунологических аномальностей и избыточных иммунных реакций. Способ включает дифференциацию в регуляторные дендритные клетки клеток, которые могут быть индуцированы с целью получения регуляторных дендритных клеток, в присутствии (S)-(+)-1-(5-гидрокси-1,5-диметилгексил)-3-[7-(4-метоксифенил)-[1,2,4]триазоло[1,5-а]пиримидин-2-ил]мочевины, GM-CSF и IL-4 и последующее созревание регуляторных дендритных клеток в присутствии TNF-α и/или LPS. Изобретение позволяет повысить степень и увеличить период выживаемости пациентов при трансплантации им указанных регуляторных дендритных клеток. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 4 пр.

Формула