Модуляция экспрессии фактора 11 - RU2739594C2

Код документа: RU2739594C2

Описание

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В соответствии со статьей 35 Кодекса законов США, в настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки №61/105772, поданной 15 октября 2008, и предварительной заявки №61/174461, поданной 30 апреля 2009. Каждая из вышеуказанных заявок во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Список последовательностей

Настоящая заявка подана вместе со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей представлен в виде файла, озаглавленного 20091015_BIOL0107WOSEQ.txt, который был создан 15 октября 2009 и имеет размер 92 Kb. Информация о списке последовательностей в электронном формате во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам, соединениям и композициям, применяемым для снижения уровня экспрессии мРНК и белка фактора 11 у животного. Такие способы, соединения и композиции могут быть применены для лечения, предупреждения или ослабления тромбоэмболических осложнений.

Предшествующий уровень техники

Для функционирования системы кровообращения необходимы механизмы, которые предупреждают потерю крови, а также механизмы, которые предотвращают нежелательную закупорку кровеносных сосудов. Вообще говоря, свертывание крови включает каскад реакций и, в конечном счете, приводит к превращению растворимого фибриногена в нерастворимый фибриновый гель. Стадии этого каскада реакций включают превращение неактивного зимогена в активированный фермент. Затем, активный фермент катализирует следующую стадию этого каскада реакций.

Каскад реакций свертывания крови

Каскад реакций свертывания крови может быть инициирован двумя путями, такими как путь тканевого фактора (также называемого «внешним путем»), который представляет собой первичный путь, и путь контактной активации (также называемый «внутренним путем»).

Путь тканевого фактора инициируется тканевым фактором, который представляет собой рецептор клеточной поверхности (TF, также называемый фактором III), и который конститутивно экспрессируется экстраваскулярными клетками (перицитами, кардимиоцитами, клетками гладких мышц и кератиноцитами), а также васкулярными моноцитами и эндотелиальными клетками после их индуцирования воспалительными цитокинами или эндотоксином. (Drake et al, Am J Pathol. 1989, 134:1087-1097). TF представляет собой высокоаффинный клеточный рецептор для фактора свертывания крови VIIa, то есть сериновая протеаза. В отсутствие TF, фактор VIIa обладает очень низкой каталитической активностью, и связывание с TF необходимо для сообщения фактору VIIa функциональных свойств благодаря аллостерическому механизму. (Drake et al., Am. J. Pathol. 1989, 134:1087-1097). Комплекс TF-VIIa активирует превращение фактора X в фактор Xa. Xa, в свою очередь, ассоциируется с его кофактором, фактором Va, и образует протромбиназный комплекс, который, в свою очередь, активирует превращение протромбина (также называемого фактором II или фактором 2а) в тромбин (также называемый фактором Па или фактором 2а). Тромбин активирует тромбоциты, превращает фибриноген в фибрин и стимулирует перекрестное связывание фибрина благодаря активации фактора XIII, что приводит к образованию устойчивого сгустка на тех участках экстраваскулярных клеток, на которых присутствует TF. Кроме того, тромбин усиливает ответ в виде каскада реакций свертывания крови благодаря активации факторов V и VIII.

Путь контактной активации запускается в результате активации фактора XII в ХIIа. Фактор XIIa превращает XI в XIa, а ХIа превращает IX в IXa. IХа ассоциируется с его кофактором VIIIa с последующим превращением X в Ха. Два пути сходятся в этой точке, поскольку фактор Ха ассоциируется с фактором Va, что приводит к активации протромбина (фактора II) в тромбин (фактор IIa).

Ингибирование свертывания крови

Контроль за прохождением каскада реакций свертывания крови осуществляется по меньшей мере по трем механизмам, а именно, под действием активированного белка С, антитромбина и ингибитора пути тканевого фактора. Активированный белок С представляет собой сериновую протеазу, которая разлагает кофакторы Va и VIIIa. Белок С активируется тромбином посредством тромбомодулина, а для его функционирования необходим кофермент белок S. Антитромбин представляет собой ингибитор сериновой протеазы (серпин), который ингибирует сериновые протеазы: тромбин, Ха, XIIa, XIa и IXa. Ингибитор пути тканевого фактора ингибирует действие Ха и комплекса TF-VIIa. (Schwartz A.L. et al., Trends Cardiovasc Med. 1997; 7:234-239.)

Заболевание

Тромбоз представляет собой патологическое образование сгустков крови, а эмболия возникает в том случае, когда сгустки крови мигрируют в другую часть организма и препятствуют нормальному функционированию органов. Тромбоэмболия может вызывать такие состояния, как тромбоз глубокой вены, эмболия легких, инфаркт миокарда и инсульт. В основном, тромбоэмболия является главной причиной возникновения тяжелых заболеваний, и в Америке каждый год регистрируется 2 миллиона новых случаев развития такого заболевания (Adcock et al. American Journal of Clinical Pathology. 1997; 108:434-49). Хотя в большинстве случаев тромбоз вызывается приобретенными неприродными факторами, такими как хирургическая операция, рак и неподвижный образ жизни, однако, в некоторых случаях, тромбоз ассоциируется с генетической предрасположенностью, например, он может вызываться антифосфолипидным синдромом и аутосомно-доминантным состоянием, ассоциированным с присутствием фактора V Лейдена. (Bertina R.M. et al. Nature 1994; 369:64-67).

Лечение

Все наиболее часто используемые средства, такие как антикоагулянты, варфарин, гепарин и низкомолекулярный гепарин (НМГ) имеют множество недостатков.

Варфарин обычно используется для лечения пациентов, страдающих трепетанием предсердий. Такое лекарственное средство взаимодействует с активируемыми витамином К факторами свертывания крови, которыми являются факторы II, VII, IX и X. Белки-антикоагулянты C и S также ингибируются варфарином. Терапия лекарственными средствами, проводимая с использованием варфарина, также сталкивается с определенными проблемами, заключающимися в том, что варфарин взаимодействует с другими лекарственными средствами, включая лекарственные средства, используемые для лечения трепетания предсердий, такие как амиодарон. Поскольку исход терапии с использованием варфарина трудно предсказать, то для детектирования каких-либо признаков аномального кровотечения, пациент должен пройти тщательное обследование.

Гепарин действует путем активации антитромбина, который ингибирует тромбин и фактор X. (Bjork I, Lindahl U. Mol. Cell Biochem. 1982 48:161-182). Лечение гепарином может приводить к иммунным реакциям, стимулирующим агрегацию тромбоцитов в кровеносных сосудах, что может вызывать тромбоз. Такими известными побочными эффектами являются индуцированная гепарином тромбоцитопения (ГИТ), а поэтому необходимо проводить обследование пациента. Продолжительное лечение гепарином может также приводить к остеопорозу. НМГ может также ингибировать фактор 2, но в меньшей степени чем нефрагментированный гепарин (НФГ). НМГ участвует в развитии тромбоцитопении (ГИТ).

Таким образом, при применении современных антикоагулянтов невозможно предсказать исход и специфичность лечения, а поэтому, для предупреждения побочных эффектов, таких как аномальное кровотечение, необходимо тщательное обследование пациента. В настоящее время не существует антикоагулянтов, механизм действия которых относился бы только к «внешнему пути» или к «внутреннему пути».

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способам, соединениям и к композициям для модуляции экспрессии мРНК и белка фактора 11. В некоторых вариантах изобретения, специфические ингибиторы фактора 11 модулируют экспрессию мРНК и белка фактора 11. В некоторых вариантах изобретения, специфические ингибиторы фактора 11 представляют собой нуклеиновые кислоты, белки или небольшие молекулы.

В некоторых вариантах изобретения, модуляция может происходить в клетках или тканях. В некоторых вариантах изобретения, такими клетками или тканями являются клетки или ткани животного. В некоторых вариантах изобретения, указанным животным является человек. В некоторых вариантах изобретения, уровни мРНК фактора 11 являются пониженными. В некоторых вариантах изобретения, уровни белка фактора 11 являются пониженными. Такое снижение может зависеть от времени или от дозы.

Настоящее изобретение также относится к способам, соединениям и композициям, которые могут быть применены для предупреждения, лечения и ослабления симптомов заболеваний, расстройств и состояний. В некоторых вариантах изобретения, такие заболевания, расстройства и состояния представляют собой тромбоэмболические осложнения. Указанные тромбоэмболические осложнения включают тромбоз, эмболию и тромбоэмболию различных категорий. В некоторых вариантах изобретения, такими тромбоэмболическими осложнениями являются тромбоз глубокой вены, эмболия легких, инфаркт миокарда и инсульт.

Указанные заболевания, расстройства и состояния могут быть ассоциированы с одним или несколькими факторами риска и являются этиологическим фактором или наиболее частой причиной исхода заболевания. Некоторыми факторами риска и причиной развития тромбоэмболических осложнений являются неподвижный образ жизни, хирургическая операция (в частности, ортопедическая хирургическая операция), злокачественная опухоль, беременность, возрастные изменения, применение пероральных контрацептивов, трепетание предсердий, предшествующие тромбоэмболические осложнения, хроническое воспалительное заболевание и наследуемые или приобретенные расстройства, ассоциированные с образованием протромботических сгустков. Исходом некоторых заболеваний, ассоциированных с развитием тромбоэмболических осложнений, являются снижение потока крови через пораженные сосуды, гибель ткани и летальный исход.

В некоторых вариантах изобретения, способы лечения включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, специфического ингибитора фактора 11.

Подробное описание изобретения

Следует отметить, что представленное выше общее описание и нижеследующее подробное описание приводятся лишь в целях иллюстрации и лучшего понимания настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение заявленного изобретения. В настоящем описании, при употреблении слов в единственном числе подразумевается, что они могут быть использованы и во множественном числе, если это не оговорено особо. Используемый здесь союз «или» означает «и/или», если это не указано конкретно. Кроме того, используемый здесь термин «включая», а также другие его грамматические формы, такие как «включает» или «включенный», не имеют ограничивающего смысла. Кроме того, такие термины, как «элемент» или «компонент» охватывают как элементы, так и компоненты, включающие один объект, и элементы и компоненты, которые включают более чем один субэлемент или субкомпонент, если это не указано конкретно.

Заголовки разделов настоящего описания приводятся лишь в организационных целях и не должны рассматриваться как ограничение предмета изобретения. Все документы или их части, цитируемые в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, монографии и договора, вводятся в настоящее описание частично, а также во всей своей полноте посредством ссылки.

Определения

Если это не указано конкретно в разделе «Определения», номенклатура, используемая в соответствии с настоящим изобретением, а также процедуры и методы, применяемые в аналитической химии, химии органического синтеза, а также в медицинской и фармацевтической химии, и описанные в настоящей заявке, хорошо известны и широко применяются специалистами в данной области. Химический синтез и химический анализ могут быть осуществлены с применением стандартных методов. Все патенты, патентные заявки, опубликованные заявки и другие публикации, а также регистрационные номера GENBANK и представленная информация о последовательностях, полученная из баз данных, таких как базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI), и другая информация, если она приводится в описании настоящей заявки, вводятся в описание обсуждаемого документа частично, а также во всей своей полноте посредством ссылки.

Представленные ниже термины, если это не оговорено особо, имеют следующие значения:

Термин «2'-O-метоксиэтил» (также обозначаемый 2'-МОЕ и 2'-O(СН₂)₂-ОСН₃) означает О-метоксиэтильную модификацию во 2'-положении фурозильного кольца. Модифицированным сахаром является сахар, модифицированный 2'-O-метоксиэтилом.

Термин «2'-O-метоксиэтил-нуклеотид» означает нуклеотид, включающий сахарную группу, модифицированную 2'-О-метоксиэтилом.

Термин «5-метилцитозин» означает цитозин, модифицированный метальной группой, присоединенной в 5'-положении. 5-метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеотидное основание.

Термин «активное фармацевтическое средство» означает вещество или вещества, присутствующие в фармацевтической композиции, которая при ее введении индивидууму дает терапевтический эффект. Так, например, в некоторых вариантах изобретения активным фармацевтическим средством является антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на фактор 11.

Термины «активная область-мишень» или «область-мишень» означают область, на которую нацелены одно или несколько активных антисмысловых соединений. Термин «активные антисмысловые соединения» означает антисмысловые соединения, снижающие уровни нуклеиновой кислоты-мишени или белка-мишени.

Термин «сопутствующее введение» означает совместное введение двух средств любым способом, позволяющим продуцировать у пациента фармакологические эффекты в ответ на одновременное введение этих двух средств. Сопутствующее введение не означает, что оба средства должны быть обязательно введены в виде одной фармацевтической композиции или в виде одной лекарственной формы или одним и тем же способом введения. Эффекты от введения этих двух средств необязательно должны наблюдаться в одно и то же время. Такие эффекты должны лишь совпадать по времени и необязательно должны быть коэкстенсивными.

Термин «введение» означает доставку фармацевтического средства индивидууму, и этот термин включает, но не ограничивается ими, введение этого средства специалистом-медиком и самостоятельное введение.

Термин «улучшение» означает ослабление по меньшей мере одного показателя, признака или симптома, ассоциированного с указанным заболеванием, расстройством или состоянием. Тяжесть заболеваний может быть определена по субъективным или объективным критериям, известным специалистам.

Термин «животное» относится к человеку или к животному, не являющемуся человеком, включая, но не ограничиваясь ими, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и приматов, не являющихся человеком, включая, но не ограничиваясь ими, обезьян и шимпанзе.

Термин «соединение-антидот» означает соединение, обладающее способностью снижать интенсивность или продолжительность какой-либо активности, опосредуемой антисмысловой молекулой.

Термин «олигонуклеотид-антидот» означает соединение-антидот, включающее олигонуклеотид, который является комплементарным антисмысловому соединению и обладает способностью гибридизоваться с указанным соединением.

Термин «белок-антидот» означает соединение-антидот, содержащее пептид.

Термин «антитело» означает молекулу, характеризующуюся способностью специфически взаимодействовать с антигеном по соответствующему механизму, где определения каждого из терминов «антитело» и «антиген» взаимосвязаны друг с другом. Термин «антитело» может означать полноразмерную молекулу антитела или любой его фрагмент, или любую его область, такую как тяжелая цепь, легкая цепь, Fab-область и Fc-область.

Термин «антисмысловая активность» означает любую детектируемую или измеримую активность, направленную на гибридизацию антисмыслового соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах изобретения, антисмысловая активность означает снижение количества или уровня экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или белка-мишени, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью.

Термин «антисмысловое соединение» означает олигомерное соединение, обладающее способностью гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью посредством водородной связи.

Термин «ингибирование антисмысловым соединением» означает снижение уровней нуклеиновой кислоты-мишени или уровней белка-мишени в присутствии антисмысловоого соединения, комплементарного нуклеиновой кислоте-мишени, по сравнению с уровнями нуклеиновой кислоты-мишени или уровнями белка-мишени в отсутствии такого антисмыслового соединения.

Термин «антисмысловой олигонуклеотид» означает одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, которая способна гибридизироваться с соответствующей областью или с соответствующим сегментом нуклеиновой кислоты-мишени.

Термин «бициклический сахар» означает фурозильное кольцо, модифицированное мостиковой связью между двумя атомами неконденсированного кольца. Бициклический сахар представляет собой модифицированный сахар.

Термин «бициклическая нуклеиновая кислота» или «БНК» означают нуклеозид или нуклеотид, где фуранозная часть нуклеозида или нуклеотида включает мостик, соединяющий два атома углерода на фуранозном кольце, образуя, тем самым, бициклическую систему.

Термины «кэп-структура» или «концевая кэп-молекула» означают химические модификации, которые были введены у любого конца антисмыслового соединения.

Термин «химически отличающаяся область» означает область антисмыслового соединения, которая по своим химическим свойствам в определенной степени отличается от другой области того же самого антисмыслового соединения. Так, например, область, имеющая 2'-O-метоксиэтил-нуклеотиды, по своим химическим свойствам отличается от области, имеющей нуклеотиды, не содержащие 2'-O-метоксиэтиловых модификаций.

Термин «химерное антисмысловое соединение» означает антисмысловое соединение, имеющее по меньшей мере две химически отличающихся области.

Термин «совместное введение» означает введение индивидууму двух или более фармацевтических средств. Два или более фармацевтических средства могут присутствовать в одной фармацевтической композиции, либо не могут присутствовать в отдельных фармацевтических композициях. Каждое из двух или более фармацевтических средств может быть введено одним и тем же или различными способами введения. Термин «совместное введение» охватывает одновременное или последовательное введение.

Термин «фактор свертывания крови» означает любой из факторов I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, Χ, XI, XII, XIII или TAFI в каскаде реакций свертывания крови. Термин «нуклеиновая кислота фактора свертывания крови» означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор свертывания крови. Так, например, в некоторых вариантах изобретения, нуклеиновой кислотой, кодирующей фактор свертывания крови, являются, но не ограничиваются ими, последовательность ДНК, кодирующая фактор свертывания крови (включая геномную ДНК, содержащую интроны и экзоны), последовательность РНК, транскрибируемая из ДНК, кодирующей фактор свертывания крови, и последовательность мРНК, кодирующая фактор свертывания крови. Термин «мРНК фактора свертывания крови» означает мРНК, кодирующая белок фактора свертывания крови.

Термин «комплементарность» означает способность образовывать пары между нуклеотидными основаниями первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.

Термин «смежные нуклеотидные основания» означает нуклеотидные основания, расположенные непосредственно друг за другом.

Термин «разбавитель» означает ингредиент композиции, который не обладает фармакологической активностью, но обладает необходимыми или желательными фармацевтическими свойствами. Так, например, разбавитель в композиции, вводимой путем инъекции, может представлять собой жидкость, например, физиологический раствор.

Термин «доза» означает определенное количество фармацевтического средства, доставляемого путем однократного введения или введения в течение определенного периода времени. В некоторых вариантах изобретения, доза может быть введена в виде одной, двух или более болюсов, таблеток или инъекций. Так, например, в некоторых вариантах изобретения, где желательно подкожное введение, для доставки нужной дозы требуется объем, который невозможно ввести одной инъекцией, а поэтому для доставки необходимой дозы могут потребоваться две или более инъекции. В некоторых вариантах изобретения, фармацевтическое средство вводят путем вливания в течение длительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть определены как количество фармацевтического средства в час, в день, в неделю или в месяц.

Термин «эффективное количество» означает количество активного фармацевтического средства, достаточное для достижения желаемого физиологического эффекта у индивидуума, нуждающегося в введении такого средства. Эффективное количество может варьироваться у различных индивидуумов в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подвергаемого лечению, таксономической группы индивидуумов, подвергаемых лечению, способа приготовления композиции, тяжести патологического состояния у индивидуума и других релевантных факторов.

Термин «нуклеиновая кислота фактора 11» или «нуклеиновая кислота фактора XI» или «нуклеиновая кислота F 11» или «нуклеиновая кислота F XI» означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор 11. Так, например, в некоторых вариантах изобретения, нуклеиновая кислота фактора 11 включает последовательность ДНК, кодирующую фактор И, последовательность РНК, транскрибируемую из ДНК, кодирующей фактор 11 (включая геномную ДНК, содержащую интроны и экзоны), и последовательность мРНК, кодирующую фактор 11. Термин «мРНК фактора 11 » означает мРНК, кодирующую белок фактора 11.

Термин «специфический ингибитор фактора 11» означает любой агент, обладающий способностью специфически ингибировать экспрессию мРНК фактора 11 и/или белка фактора 11 на молекулярном уровне. Так, например, специфическими ингибиторами фактора 11 являются нуклеиновые кислоты (включая антисмысловые соединения), пептиды, антитела, небольшие молекулы и другие агенты, обладающие способностью ингибировать экспрессию мРНК фактора 11 и/или белка фактора 11. В некоторых вариантах изобретения, специфические ингибиторы фактора 11, благодаря их способности специфически модулировать экспрессию мРНК фактора 11 и/или экспрессию белка фактора 11, могут оказывать влияние на другие компоненты каскада реакций свертывания крови, включая компоненты, участвующие в последующем пути этих реакций. Аналогичным образом, в некоторых вариантах изобретения, специфические ингибиторы фактора 11 могут влиять и на другие молекулярные процессы у животного.

Термин «специфический антидот ингибитора фактора 11» означает соединение, обладающее способностью ослаблять действие специфического ингибитора фактора 11. В некоторых вариантах изобретения, антидот специфического ингибитора фактора 11 выбран из пептида фактора 11; олигонуклеотида-антидота фактора 11, включая соединение-антидот фактора 11, комплементарное антисмысловому соединению фактора 11, и любого соединения или белка, влияющего на внутренний или внешний путь каскада реакций свертывания крови.

Термин «полностью комплементарный» или «комплементарный на 100%» означает, что каждое нуклеотидное основание первой нуклеиновой кислоты комплементарно нуклеотидному основанию второй нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах изобретения, первой нуклеиновой кислотой является антисмысловое соединение, а нуклеиновой кислотой-мишенью является вторая нуклеиновая кислота.

Термин «гэпмер» означает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, имеющая множество нуклеозидов, обеспечивающих расщепление РНКазой Н, расположена между внешними областями, имеющими один или более нуклеозидов, где указанные нуклеозиды, составляющие внутреннюю область, по своим химическим свойствам отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, составляющих внешние области. Внутренняя область может называться «гэп-сегментом», а внешние области могут называться «сегментами-крыльями».

Термин «уширенный гэп» означает химерное антисмысловое соединение, имеющее гэп-сегмент длиной в 12 или более смежных 2'-дезоксирибонуклеозидов, расположенных между 5'- и 3'-сегментами-крыльями, имеющими от одного до шести нуклеозидов, и непосредственно смежных с этими сегментами.

Термин «гибридизация» означает отжиг комплементарных молекул нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах изобретения, комплементарными молекулами нуклеиновой кислоты являются антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота мишень.

Термин «идентификация животного с риском развития тромбоэмболических осложнений» означает идентификацию животного, у которого было диагностировано тромбоэмболическое осложнение, или идентификацию животного с предрасположенностью к развитию тромбоэмболического осложнения. Индивидуумами с предрасположенностью к развитию тромбоэмболического осложнения являются индивидуумы с одним или более факторами риска развития тромбоэмболических осложнений, включая неподвижный образ жизни, хирургическую операцию (а в частности, ортопедическую хирургическую операцию), злокачественную опухоль, беременность, возрастные изменения, применение пероральных контрацептивов, и наследуемые или приобретенные расстройства, ассоциированные с образованием протромботических сгустков. Такая идентификация может быть осуществлена любым методом, включая ознакомление с историей болезни пациента и стандартные клинические испытания или анализы.

Термин «непосредственно смежный» означает, что между непосредственно смежными элементами отсутствуют какие-либо встроенные элементы.

Термин «индивидуум» относится к человеку или к животному, не являющемуся человеком, которые были отобраны для лечения или терапии.

Термин «межнуклеозидная связь» означает химическую связь между нуклеозидами.

Термин «связанные нуклеозиды» означает смежные нуклеозиды, связанные друг с другом.

Термин «несоответствующее» или «некомплементарное нуклеотидное основание» означает нуклеотидное основание первой нуклеиновой кислоты, не обладающее способностью спариваться с соответствующим нуклеотидным основанием второй нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты-мишени.

Термин «модифицированная межнуклеозидная связь» означает замену или любую модификацию природной межнуклеозидной связи (то есть, фосфодиэфирной межнуклеозидной связи).

Термин «модифицированное нуклеотидное основание» означает любое нуклеотидное основание, за исключением аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. Термин «немодифицированное нуклеотидное основание» означает пуриновые основания, такие как аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания, такие как тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).

Термин «модифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, имеющий, независимо, модифицированную сахарную группу, модифицированную межнуклеозидную связь или модифицированное нуклеотидное основание. Термин «модифицированный нуклеозид» означает нуклеозид, имеющий, независимо, модифицированную сахарную группу или модифицированное нуклеотидное основание.

Термин «модифицированный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, включающий модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар или модифицированное нуклеотидное основание.

Термин «модифицированный сахар» означает природный сахар с замещением или модификацией.

Термин «мотив» означает набор химических отличающихся областей, присутствующих в антисмысловом соединении.

Термин «природная межнуклеозидная связь» означает фосфодиэфирную 3'- 5'-связь.

Термин «природная сахарная группа» означает сахар, присутствующий в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).

Термин «нуклеиновая кислота» означает молекулы, состоящие из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновыми кислотами являются рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты, двухцепочечные нуклеиновые кислоты, короткие интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (киРНК) и микроРНК (миРНК).

Термин «нуклеотидное основание» означает гетероциклическую молекулу, способную спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.

Термин «последовательность нуклеотидных оснований» означает порядок расположения смежных нуклеотидных оснований независимо от каких-либо модификаций сахаров, связей или нуклеотидных оснований.

Термин «нуклеозид» означает нуклеотидное основание, связанное с сахаром.

Термин «нуклеозидный миметик» включает структуры, используемые для замены сахара или сахара и основания и, необязательно, связи в одном или нескольких положениях олигомерного соединения, например, такие структуры, как нуклеозидные миметики, имеющие морфолино, циклогексенил, циклогексил, тетрагидропиранил; и бициклические или трициклические сахарные миметики, например, не-фуранозные сахарные звенья. Нуклеотидными миметиками являются структуры, используемые для замены нуклеозида и связи в одном или нескольких положениях олигомерного соединения, например, такие как связанные с пептидом нуклеиновые кислоты или морфолино-связи (морфолино-группы, связанные -N(Н)-С(=O)-O-связью или другой нефосфодиэфирной связью). Термин «сахарный суррогат» перекрывается с несколько более широким термином «нуклеозидный миметик», но указывает только на замену сахарного звена (фуранозного кольца). Используемые здесь тетрагидропиранильные кольца приводятся в иллюстративных целях, лишь в качестве примера сахарного суррогата, где фуранозная сахарная группа была заменена тетрагидропиранильной циклической системой.

Термин «нуклеотид» означает нуклеозид, имеющий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.

Термин «олигомерное соединение» или «олигомер» означает полимер, состоящий из мономерных связанных субъединиц, способных гибридизироваться по меньшей мере с одной областью молекулы нуклеиновой кислоты.

Термин «олигонуклеотид» означает полимер из связанных нуклеозидов, каждый из которых, независимо друг от друга, может быть модифицированным или немодифицированным.

Термин «парентеральное введение» означает введение путем инъекции или вливания. Парентеральным введением является подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное введение или интрацеребровентрикулярное введение.

Термин «пептид» означает молекулу, образованную посредством связывания по меньшей мере двух аминокислот амидными связями. Термин «пептид» относится к полипептидам и белкам.

Термин «фармацевтическая композиция» означает смесь веществ, подходящих для введения индивидууму. Так, например, фармацевтическая композиция может содержать одно или несколько активных фармацевтических средств и стерильный водный раствор.

Термин «фармацевтически приемлемые соли» означает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, то есть, соли, которые сохраняют нужную биологическую активность родительского олигонуклеотида и не дают каких-либо нежелательных токсических эффектов.

Термин «фосфортиоатная связь» означает связь между нуклеозидами, где указанную фосфодиэфирную связь модифицируют путем замещения одного немостикового атома кислорода атомом серы. Фосфортиоатная связь (P=S) представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.

Термин «часть» означает определенное число смежных (то есть, связанных) нуклеотидных оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах изобретения, термин «часть» означает определенное число смежных нуклеотидных оснований нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах изобретения, термин «часть» означает определенное число смежных нуклеотидных оснований антисмыслового соединения.

Термин «предупреждение» означает замедление или предотвращение начала или развития заболевания, расстройства или состояния на период времени от нескольких минут и до конца жизни. Термин «предупреждение» также означает снижение риска развития заболевания, расстройства или состояния.

Термин «пролекарство» означает терапевтическое средство, полученное в неактивной форме, которая затем превращается в активную форму в организме или в клетках под действием эндогенных ферментов или других химических соединений или в других условиях.

Термин «побочные эффекты» означает физиологические ответы, вырабатывающиеся в процессе лечения и являющиеся нежелательными эффектами. В некоторых вариантах изобретения, побочными эффектами являются реакции, возникающие в области инъекции; нарушения функции печени, выявленные в результате обследования; нарушения функции почек; гепатотоксичность; токсическое действие на почки; нарушения функции центральной нервной системы; миопатии; и недомогания. Так, например, на гепатотоксичность или нарушение функции печени могут указывать повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке. Так, например, на гепатотоксичность и нарушения функции печени могут указывать повышенные уровни билирубина.

Термин «одноцепочечный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, который не гибридизуется с комплементарной цепью.

Термин «специфически гибридизующийся» относится к антисмысловому соединению, в котором степень комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью является достаточной для достижения желаемого эффекта, но при этом оказывает минимальное действие или вообще не оказывает какого-либо действия на нуклеиновые кислоты, не являющиеся мишенями, в условиях, при которых такое специфическое связывание является желательным, то есть в физиологических условиях при проведении in vivo анализов и терапевтического лечения.

Термин «нацеливание» или «нацеленный» относится к способу конструирования и отбора антисмыслового соединения, которое будет специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью и давать желаемый эффект.

Термины «нуклеиновая кислота-мишень», «РНК-мишень» и «РНК-транскрипт, являющийся мишенью» означают нуклеиновую кислоту, на которую могут быть нацелены антисмысловые соединения.

Термин «сегмент-мишень» означает нуклеотидную последовательность нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено антисмысловое соединение. Термин «5'-сайт-мишень» означает самый крайний 5'-концевой нуклеотид сегмента-мишени. Термин «3'-сайт-мишень» означает самый крайний 3'-концевой нуклеотид сегмента-мишени.

Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество фармацевтического средства, достаточное для достижения у индивидуума терапевтического эффекта.

Термин «тромбоэмболическое осложнение» означает любое заболевание, расстройство или состояние, приводящее к эмболии, вызываемой тромбами. Примерами таких заболеваний, расстройств и состояний являются различные категории тромбоза, эмболии и тромбоэмболии. В некоторых вариантах изобретения, такими заболеваниями, расстройствами и состояниями являются тромбоз глубокой вены, эмболия легких, инфаркт миокарда и инсульт.

Термин «лечение» означает введение фармацевтической композиции для положительного изменения течения заболевания, расстройства или состояния или улучшение состояния здоровья пациента при таком заболевании, расстройстве или состоянии.

Термин «немодифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, состоящий из природных нуклеотидных оснований, сахарных групп и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах изобретения, немодифицированным нуклеотидом является РНК-нуклеотид (то есть β-D-рибонуклеозиды) или ДНК-нуклеотид (то есть β-D-дезоксирибонуклеозид).

Некоторые варианты осуществления изобретения

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам, соединениям и композициям, применяемым для снижения уровня экспрессии мРНК и белка фактора 11.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам, соединениям и композициям, применяемым для лечения, предупреждения или ослабления симптомов заболеваний, расстройств и состояний, ассоциированных с фактором 11 у индивидуума, нуждающегося в этом. В настоящем изобретении также рассматриваются способы и соединения, применяемые в целях приготовления лекарственного препарата для лечения, предупреждения или ослабления симптомов заболевания, расстройства и состояния, ассоциированных с фактором 11. Заболеваниями, расстройствами или состояниями, ассоциированными с фактором 11, являются тромбоэмболические осложнения, такие как тромбоз, эмболия, тромбоэмболия, тромбоз глубокой вены, эмболия легких, инфаркт миокарда и инсульт.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к применению специфического ингибитора фактора 11 для лечения, предупреждения или ослабления симптомов заболевания, ассоциированного с фактором 11. В некоторых вариантах изобретения, специфическими ингибиторами фактора 11 являются нуклеиновые кислоты (включая антисмысловые соединения), пептиды, антитела, небольшие молекулы и другие средства, обладающие способностью ингибировать экспрессию мРНК фактора 11 и/или белка фактора 11.

В некоторых вариантах изобретения, специфическими ингибиторами фактора 11 являются пептиды или белки, такие как, но не ограничивающиеся ими, ингибиторы протеазы альфа 1, антитромбин III, ингибиторы Cl и ингибиторы плазмина альфа 2, описанные в публикации J. Clin. Invest. 1982, 69:844-852; антитрипсин альфа 1 (альфа-1АТ), описанный в публикации Thromb. Res. 1987, 48:145-151; пептидные ингибиторы фактора 11, описанные в заявке USPPN 2008/021998 и в публикации Blood 1998, 92:4198-206; MAP4-RGKWC, описанный в публикации Thromb Res 2001, 104:451-465; GPI бета-2, описанный в публикации Proc. Natl. Acad. Sci. 2004, 101:3939-44; ингибитор протеазы Lentinus, описанный в публикации Eur. J. Biochem. 1999, 262:915-923; ингибитор протеиназы нексина-2/домена предшественника амилоидного бета-белка Кунитца (APPI) и антитромбин (AT), описанные в публикации J. Biol. Chem. 2004, 279:29485-29492; и апротинин, описанный в публикации J. Biol. Chem. 2005, 280:23523-30.

В некоторых вариантах настоящего изобретения, специфическими ингибиторами фактора 11 являются антитела, такие как, но не ограничивающиеся ими, антитела Winston-Salem (IgG3 каппа) и Baltimore (IgGl каппа), описанный в публикации Blood 1988, 72:1748-54; 5F4, 3Сl и IFl, описанные в публикации J. Biol. Chem. 1985, 260:10714-719; моноклональные антитела, описанные в публикации Throm Haemost 1990, 63:417-23; XI-5108, описанное в публикации J. Thromb. Haem. 2006, 4:1496-1501; моноклональные антитела 4-1, описанные в публикации Thromb. Res. 1986, 42:225-34; и антитело абциксимаб, описанное в примере 19 патента USPN 6566140.

В некоторых вариантах изобретения, специфическими ингибиторами фактора 11 являются небольшие молекулы, такие как, но не ограничивающиеся ими, диизопропилфторфосфаты (DFP); низкомолекулярные ингибиторы, описанные в примерах 1-7 заявки USPPN 2004/0180855; и п-аминобензамидин (рАВ), описанный в публикации J. Biol. Chem. 2005,280:23523-30.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к применению описанного здесь специфического ингибитора фактора 11 для лечения, предупреждения или ослабления симптомов тромбоэмболических осложнений, таких как тромбоз, эмболия, тромбоэмболия, тромбоз глубокой вены, эмболия легких, инфаркт миокарда и инсульт.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к применению описанных здесь специфических ингибиторов фактора 11 в целях приготовления лекарственного препарата для лечения, ослабления симптомов или предупреждения тромбоэмболических осложнений, таких как тромбоз, эмболия, тромбоэмболия, тромбоз глубокой вены, эмболия легких, инфаркт миокарда и инсульт.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к применению описанного здесь специфического ингибитора фактора 11 для лечения, предупреждения или ослабления симптомов тромбоэмболических осложнений, описанных в настоящей заявке, путем проведения комбинированной терапии вместе с дополнительным средством или дополнительной терапией, описанными в настоящей заявке. Введение лекарственных средств или проведение терапии могут быть осуществлены одновременно или последовательно.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к применению описанного здесь специфического ингибитора фактора 11 для лечения, предупреждения или ослабления симптомов тромбоэмболических осложнений, описанных в настоящей заявке, путем проведения комбинированной терапии в сочетании с дополнительным средством или терапии, описанной в настоящей заявке. Введение лекарственных средств или проведение терапии могут быть осуществлены одновременно или последовательно.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к применению описанного здесь специфического ингибитора фактора 11 для лечения, предупреждения или ослабления симптомов тромбоэмболических осложнений, описанных в настоящей заявке, у пациента, которому может быть затем введено дополнительное лекарственное средство или проведено лечение, как описано в настоящей заявке.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к набору для лечения, предупреждения или ослабления симптомов описанных здесь тромбоэмболических осложнений, где указанный набор включает: (i) описанный здесь специфический ингибитор фактора 11; и альтернативно, (ii) дополнительный агент или терапевтические средства, описанные в настоящей заявке.

Набор согласно изобретению может также включать инструкции по его применению для лечения, предупреждения или ослабления симптомов тромбоэмболических осложнений, описанных в настоящей заявке, путем проведения описанной здесь комбинированной терапии.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к антисмысловым соединениям, нацеленным на нуклеиновую кислоту фактора 11. В некоторых вариантах изобретения, нуклеиновой кислотой фактора 11 являются последовательность, имеющаяся в базе данных GENBANK per. № NM 000128.3 (представленная здесь как SEQ ID NO: 1); последовательность, имеющаяся в базе данных GENBANK per. № NT_022792.17 и усеченная в пределах от 19598000 до 19624000, (представленная здесь как SEQ ID NO: 2); последовательность, имеющаяся в базе данных GENBANK per. № NM_028066.1 (представленная здесь как SEQ ID NO: 6); экзоны 1-15 последовательности, имеющейся в базе данных GENBANK per. № NW_001118167.1 (представленной здесь как SEQ ID NO: 274).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, содержащему модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах изобретения, соединение согласно изобретению содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах изобретения, соединение согласно изобретению может включать модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. В некоторых вариантах изобретения, соединение согласно изобретению может включать модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 656-676 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 656-676 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 665-687 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных частей последовательности нуклеотидных оснований 665-687 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 675-704 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 675-704 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 677-704 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 677-704 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 678-697 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 678-697 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 70% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 680-703 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 680-703 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID ΝΟ: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3 и в примере 30).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 683-702 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарной части последовательности нуклеотидных оснований 683-702 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 738-759 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 738-759 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3 и в примере 30).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 738-760 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 738-760 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 60% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 738-762 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 738-762 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 45% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 1018-1042 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 1018-1042 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 1062-1089 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 1062-1089 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 70% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 1062-1090 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 1062-1090 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 60% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 1062-1091 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 1062-1091 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 20% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 1275-1301 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 1062-1091 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 1276-1301 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 1062-1091 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 30).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 1284-1308 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 1062-1091 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 1291-1317 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 1062-1091 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединению, включающему модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную по меньшей мере части последовательности нуклеотидных оснований 1275-1318 SEQ ID NO: 1. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований, комплементарных части последовательности нуклеотидных оснований 1275-1318 SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, которая на 100% комплементарна части последовательности SEQ ID NO: 1, имеющей такую же длину. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 70% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к соединениям, включающим модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов и имеющий нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 15-241.

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, или по меньшей мере 18 нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из ISIS NO: 22, 31, 32, 34, 36-38, 40, 41, 43, 51-53, 55, 56, 59, 60,64, 66,71,73, 75,96, 98-103, 105-109, 113-117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181-197, 199-211 и 213-232. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, 31, 32, 34, 36-38, 40, 41, 43, 51-53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98-103, 105-109, 113-117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181-197, 199-211 и 213-232. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 22, 31, 32, 34, 36-38, 40, 41, 43, 51-53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98-103, 105-109, 113-117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181-197, 199-211 и 213-232. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 70% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, или по меньшей мере 18 нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из ISIS NO: 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51-53, 60, 98, 100-102, 105-109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188-193, 195, 196, 199-210 и 213-232. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22, 31, 34, 37,40, 43, 51-53, 60, 98, 100-102, 105-109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188-193, 195, 196, 199-210 и 213-232. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51-53, 60, 98, 100-102, 105-109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186,188-193, 195, 196, 199-210 и 213-232. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, или по меньшей мере 18 нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из ISIS NO: 31, 37, 100, 105, 179, 190-193, 196, 202-207, 209, 210, 214-219, 221-224, 226, 227, 229 и 231. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 31, 37, 100, 105, 179, 190-193, 196, 202-207, 209, 210, 214-219, 221-224, 226, 227, 229 и 231. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 31, 37, 100, 105, 179, 190-193, 196, 202-207, 209, 210, 214-219, 221-224, 226, 227, 229 и 231. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 90% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 3).

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, или по меньшей мере 18 нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213-232, 242-260 и 262-266. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213-232, 242-260 и 262-266. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213-232, 242-260 и 262-266. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 70% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 30).

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, или по меньшей мере 18 нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213-216, 218-226, 243-246, 248, 249, 252-259, 264 и 265. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213-216, 218-226, 243-246, 248, 249, 252-259, 264 и 265. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213-216, 218-226, 243-246, 248, 249, 252-259, 264 и 265. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 80% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 30).

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, или по меньшей мере 18 нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 34, 190, 215, 222, 223, 226, 246 и 254. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 34, 190, 215, 222, 223, 226, 246 и 254. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид состоит из нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 34, 190, 215, 222, 223, 226, 246 и 254. Указанный модифицированный олигонуклеотид может по меньшей мере на 90% снижать уровни человеческой мРНК, как было определено с применением аналитического ОТ-ПЦР-метода, необязательно, в клетках HepG2 (например, как описано в примере 30).

В некоторых вариантах изобретения, указанное соединение состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов.

В некоторых вариантах изобретения, нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 274.

В некоторых вариантах изобретения, указанное соединение имеет по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах изобретения, указанной межнуклеозидной связью является фосфортиоатная межнуклеозидная связь.

В некоторых вариантах изобретения, указанное соединение имеет по меньшей мере один нуклеозид, содержащий модифицированный сахар. В некоторых вариантах изобретения, по меньшей мере одним модифицированным сахаром является бициклический сахар. В некоторых вариантах изобретения, по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтил.

В некоторых вариантах изобретения, указанным по меньшей мере одним модифицированным сахаром является бициклический сахар.

В некоторых вариантах изобретения, указанный по меньшей мере один бициклический сахар содержит 4'-(СН₂)_n-O-2'-мостик, где n равно 1 или 2.

В некоторых вариантах изобретения, указанный по меньшей мере один бициклический сахар содержит 4'-СН(СН₃)-O-2'-мостик.

В некоторых вариантах изобретения, указанный по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтильную группу.

В некоторых вариантах изобретения, указанный по меньшей мере один нуклеозид, модифицированный тетрагидропираном, имеет структуру:

В некоторых вариантах изобретения, указанное соединение имеет по меньшей мере один нуклеозид, содержащий модифицированное нуклеотидное основание. В некоторых вариантах изобретения, модифицированным нуклеотидным основанием является 5-метилцитозин.

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид указанного соединения включает:

(i) гэп-сегмент, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;

(ii) 5'-сегмент-крыло, состоящий из связанных нуклеозидов;

(ш) 3'-сегмент-крыло, состоящий из связанных нуклеозидов, где указанный гэп-сегмент расположен непосредственно между 5'-сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом и является смежным с этими сегментами, и где каждый нуклеозид каждого сегмента-крыла содержит модифицированный сахар. В некоторых таких вариантах, каждый цитозин в модифицированном олигонуклеотиде представляет собой 5-метилцитозин.

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид указанного соединения включает:

(i) гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;

(ii) 5'-сегмент-крыло, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;

(iii) 3'-сегмент-крыло, состоящий из пяти связанных нуклеозидов, где указанный гэп-сегмент расположен непосредственно между 5'-сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом и является смежным с этими сегментами, и где каждый нуклеозид каждого сегмента-крыла содержит 2'-O-метоксиэтилированный сахар; и где каждой межнуклеозидной связью является фосфортиоатная связь. В некоторых таких вариантах, каждый цитозин в модифицированном олигонуклеотиде представляет собой 5-метилцитозин.

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид указанного соединения включает:

(i) гэп-сегмент, состоящий из четырнадцати связанных дезоксинуклеозидов;

(ii) 5'-сегмент-крыло, состоящий из трех связанных нуклеозидов;

(iii) 3'-сегмент-крыло, состоящий из трех связанных нуклеозидов, где указанный гэп-сегмент расположен непосредственно между 5'-сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом и является смежным с этими сегментами, и где каждый нуклеозид каждого сегмента-крыла содержит 2'-O-метоксиэтилированный сахар; и где каждой межнуклеозидной связью является фосфортиоатная связь. В некоторых таких вариантах, каждый цитозин в модифицированном олигонуклеотиде представляет собой 5-метилцитозин.

В некоторых вариантах изобретения, модифицированный олигонуклеотид указанного соединения включает:

(i) гэп-сегмент, состоящий из тринадцати связанных дезоксинуклеозидов;

(ii) 5'-сегмент-крыло, состоящий из двух связанных нуклеозидов;

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов и имеющий нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 12 смежных нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 15-241, или его соли, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов и имеющий нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 12 смежных нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 15-269, или его соли, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов и имеющий нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 12 смежных нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 241-269, или его соли, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам, включающим введение животному соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов и имеющий нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований нуклеотидной последовательности, выбранной из нуклеотидных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 15-241.

Указанным животным является человек.

В некоторых вариантах изобретения, указанное введение предотвращает тромбоз глубокой вены или эмболию легких.

В некоторых вариантах изобретения, указанное соединение вводят вместе с любым соединением, выбранным из группы, состоящей из аспирина, клопидогреля, дипиридамола, гепарина, лепирудина, тиклопидина, варфарина, апиксабана, ривароксабана и LOVENOX.

В некоторых вариантах изобретения, указанное соединение вводят вместе с любым ингибитором фактора Ха.

В некоторых вариантах изобретения, ингибитором фактора Ха является любое из таких соединений, как ривароксабан, LY517717, YM150, апиксабан, PRT054021 и DU-176b.

В некоторых вариантах изобретения, указанное соединение вводят одновременно с любым соединением, выбранным из группы, состоящей из аспирина, клопидогреля, дипиридамола, гепарина, лепирудина, тиклопидина, варфарина, апиксабана, ривароксабана и LOVENOX.

В некоторых вариантах изобретения, указанным введением является парентеральное введение. В некоторых вариантах изобретения, указанным парентеральным введением является подкожное или внутривенное введение.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам, включающим идентификацию животного с риском развития тромбоэмболических осложнений и введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, где указанный модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте фактора 11.

В некоторых вариантах изобретения, тромбоэмболическими осложнениями являются тромбоз глубокой вены, эмболия легких или их комбинация.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам, включающим идентификацию животного, страдающего нарушением свертывания крови, путем введения указанному животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, где указанный модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте фактора 11.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам снижения риска развития тромбоэмболических осложнений у животного путем введения указанному животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, где указанный модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте фактора 11.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам лечения нарушения свертывания крови путем введения указанному животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, где указанный модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте фактора 11.

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам ингибирования экспрессии фактора 11 у животного путем введения указанному животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, где указанный модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте фактора 11.

В некоторых вариантах изобретения, ингибирование фактора 11 у животного блокируют путем введения антидота, нацеленного против модифицированного олигонуклеотида.

В некоторых вариантах изобретения, указанным антидотом является олигонуклеотид, комплементарный модифицированному олигонуклеотиду.

Антисмысловые соединения

Олигомерными соединениями являются, но не ограничиваются ими, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, олигонуклеотидные аналоги, олигонуклеотидные миметики, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и киРНК. Олигомерное соединение может быть «антисмысловым» по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени, что означает, что это соединение обладает способностью гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью посредством водородных связей.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловое соединение имеет нуклеотидную последовательность, которая, при ее записи в направлении 5'→3', содержит обратный комплемент сегмента-мишени целевой нуклеиновой кислоты, на которую нацелено это соединение. В некоторых таких вариантах, антисмысловой олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, которая, при ее записи в направлении 5'→3', содержит обратный комплемент сегмента-мишени целевой нуклеиновой кислоты, на которую нацелен этот олигонуклеотид.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловое соединение, нацеленное против нуклеиновой кислоты фактора 11, имеет длину в 12-30 субъединиц. Другими словами, указанные антисмысловые соединения имеют от 12 до 30 связанных субъединиц. В других вариантах изобретения, указанное антисмысловое соединение имеет 8-80, 12-50, 15-30, 18-24, 19-22 или 20 связанных субъединиц. В некоторых таких вариантах, указанные антисмысловые соединения имеют длину в 8, 9,10, 11,12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45,46, 47, 48,49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных субъединиц или длину в интервале, определенном любыми двумя из вышеуказанных значений. В некоторых вариантах изобретения, антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, а связанные субъединицы представляют собой нуклеотиды.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные против нуклеиновой кислоты фактора 11, могут быть укороченными или усеченными. Так, например, одна субъединица может быть делегирована у 5'-конца (усечение по 5'-концу), или альтернативно, у 3'-конца (усечение по 3'-концу). Укороченное или усеченное антисмысловое соединение, нацеленное против нуклеиновой кислоты фактора 11, может иметь делецию у 5'-конца в две субъединицы или, альтернативно, оно может иметь делецию у 3'-конца в две субъединицы. Альтернативно, делегированные нуклеозиды могут быть распределены по всему антисмысловому соединению, например, в данном антисмысловом соединении, один нуклеозид может быть делетирован у 5'-конца, а один нуклеозид может быть делетирован у 3'-конца.

Если в удлиненном антисмысловом соединении присутствует одна дополнительная субъединица, то такая дополнительная субъединица может быть локализована у 5'- или 3'-конца антисмыслового соединения. Если присутствуют две или более дополнительные субъединицы, то такие дополнительные субъединицы могут быть смежными друг с другом, например, в указанном антисмысловом соединении, две субъединицы могут быть добавлены у 5'-конца (5'-добавление) или, альтернативно, у 3'-конца (3'-добавление). Альтернативно, добавленные субъединицы могут быть распределены по всему антисмысловому соединению, например, в данном антисмысловом соединении, одна субъединица может быть добавлена у 5'-конца, а одна субъединица может быть добавлена у 3'-конца.

Длина антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, может быть увеличена или уменьшена, и/или в него могут быть введены несоответствующие основания с сохранением активности. Так, например, как описано в публикации Woolf et al. (Ргос. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), серию антисмысловых олигонуклеотидов длиной в 13-25 нуклеотидных оснований тестировали на способность индуцировать расщепление РНК-мишени в модели с инъекцией в ооцит. Антисмысловые олигонуклеотиды длиной в 25 нуклеотидных оснований, где у их концов имеются 8 или 11 несоответствующих оснований, обладали способностью направлять специфическое расщепление мРНК-мишени, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, не содержащие таких несоответствий. Аналогичным образом, специфическое расщепление мишени достигалось с использованием антисмысловых олигонуклеотидов длиной в 13 нуклеотидных оснований, включая 1 или 3 несоответствия.

В публикации Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) была продемонстрирована способность олигонуклеотида, который является на 100% комплементарным мРНК bcl-2 и имеет 3 несоответствия по сравнению с мРНК bcl-xL, снижать уровень экспрессии bcl-2 и bcl-xL in vitro и in vivo. Кроме того, этот олигонуклеотид обладал сильной противоопухолевой активностью in vivo.

В публикации Maher & Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988) было описано тестирование серии тандема из антисмысловых олигонуклеотидов длиной в 14 нуклеотидных оснований и антисмысловых олигонуклеотидов длиной в 28 и 42 нуклеотидных оснований, состоящей из последовательности двух или трех тандемных антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, на их способность прекращать трансляцию человеческой DHFR в анализе с использованием кроличьих ретикулоцитов. Каждый из трех отдельно взятых антисмысловых олигонуклеотидов длиной в 14 нуклеотидных оснований обладал способностью ингибировать трансляцию, хотя и в несколько меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды длиной в 28 или 42 нуклеотидных основания.

Мотивы антисмысловых соединений

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, нацеленные против нуклеиновой кислоты фактора 11, имеют химически модифицированные субъединицы, организованные в паттерны или мотивы, которые сообщают указанным антисмысловым соединениям такие свойства, как повышенная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или резистентность к разложению in vivo под действием нуклеаз.

Химерные антисмысловые соединения обычно содержат по меньшей мере одну область, модифицированную так, чтобы она сообщала повышенную резистентность к разложению нуклеазой, повышенную способность к поглощению клетками, повышенную аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью и/или повышенную ингибирующую активность. Вторая область химерного антисмыслового соединения может служить, но необязательно, в качестве субстрата для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая расщепляет РНК-цепь дуплекса РНК:ДНК.

Рассматриваемыми химерными антисмысловыми соединениями являются антисмысловые соединения, имеющие гэпмерный мотив. В гэпмере, внутренняя область, имеющая множество нуклеотидов, сообщающих способность к расщеплению РНказой Н, расположена между внешними областями, имеющими множество нуклеотидов, которые по своим химическим свойствам отличаются от нуклеозидов внутренней области. В случае антисмыслового олигонуклеотида, имеющего гэпмерный мотив, гэп-сегмент обычно служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазой, а сегменты-крылья содержат модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах изобретения, области гэпмера отличаются типами сахарных групп, составляющих каждую такую отличающуюся область. В некоторых вариантах изобретения, типами сахарных групп, используемыми для дифференциации областей гэпмера, могут быть β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такими 2'-модифицированными нуклеозидами могут быть 2'-МОЕ и 2'-O-СН₃ и т.п.) и нуклеозиды, модифицированные бициклическим сахаром (такими нуклеозидами, модифицированными бициклическим сахаром, могут быть нуклеозиды, имеющие 4'-(СН₂)n-O-2'-мостик, где n=1 или n=2). Каждая отдельная область предпочтительно, содержит одинаковые сахарные группы. Мотив «крыло-гэп-крыло» часто обозначается «X-Y-Z», где «X» означает длину области 5'-крыла, «Y» означает длину гэп-области, a «Z» означает длину области 3'-крыла. Используемый здесь гэпмер, обозначенный «X-Y-Z», имеет такую конфигурацию, при которой гэп-сегмент является непосредственно смежным с сегментом 5'-крыла и с сегментом 3'-крыла. Таким образом, между сегментом 5'-крыла и гэп-сегментом или гэп-сегментом и сегментом 3'-крыла отсутствуют какие-либо встроенные нуклеотиды. Любое из описанных здесь антисмысловых соединений может иметь гэпмерный мотив. В некоторых вариантах изобретения, X и Ζ являются одинаковыми, а в других вариантах они являются различными. В предпочтительном варианте изобретения, Y представляет собой область длиной в 8-15 нуклеотидов. Χ, Y или Ζ могут представлять собой любые области из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеотидов. Таким образом, гэпмерами согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими, например, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 5-8-5 или 6-8-6.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения содержат мотив «крыло »-мер, имеющий конфигурацию крыло-гэп или гэп-крыло, то есть конфигурацию Χ-Υ или Υ-Ζ, описанную выше для гэпмерной конфигурации. Таким образом, «крыло»-мерными конфигурациями согласно изобретению являются, но не ограничиваются ими, например, конфигурации 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13,5-8 или 6-8.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, имеют гэпмерный мотив 5-10-5.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, имеют гэпмерный мотив 3-14-3.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, имеют гэпмерный мотив 2-13-5.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, имеют гэпмерный мотив 5-8-5.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, имеют гэпмерный мотив 6-8-6.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловое соединение, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, имеет мотив с уширенным гэпом.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловой олигонуклеотид с уширенным гэпом, нацеленный против нуклеиновой кислоты фактора 11, имеет гэп-сегмент из четырнадцати 2'-дезоксирибонуклеотидов, расположенных между сегментами-крыльями, состоящими из трех химически модифицированных нуклеозидов и непосредственно смежных с этими сегментами. В некоторых вариантах изобретения, указанная химическая модификация включает 2'-сахарную модификацию. В другом варианте изобретения, указанная химическая модификация включает 2'-МОЕ-сахарную модификацию.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловой олигонуклеотид с уширенным гэпом, нацеленный против нуклеиновой кислоты фактора 11, имеет гэп-сегмент из тринадцати 2'-дезоксирибонуклеотидов, расположенных между 5'-сегментом-крылом, состоящим из трех химически модифицированных нуклеозидов, и 3'-сегментом-крылом, состоящим из пяти химически модифицированных нуклеозидов, и непосредственно смежных с этими сегментами. В некоторых вариантах изобретения, указанная химическая модификация включает 2'-сахарную модификацию. В другом варианте изобретения, указанная химическая модификация включает 2'-МОЕ-сахарную модификацию.

Нуклеиновые кислоты-мишени, области-мишени и нуклеотидные последовательности

Нуклеотидными последовательностями, кодирующими фактор 11, являются, но не ограничиваются ими: последовательность, впервые депонированная в GENBANK, рег. № NM_000128.3, 24 марта 1999 и представленная здесь как SEQ ID NO: 1; последовательность, усеченная в пределах от 19598000 до 19624000, которая была впервые депонирована в GENBANK pег. № NT_022792.17 29 ноября 2000 и представлена здесь как SEQ ID NO: 2; последовательность, впервые депонированная в GENBANK, pег. № NM_028066.1, 2 июня 2002 и представленная здесь как SEQ ID NO: 6; и экзоны 1-15 последовательности, впервые депонированной в GENBANK, pег. № GENBANK NW_001118167.1, 28 марта 2006, и представленной здесь как SEQ ID NO: 274.

Следует отметить, что последовательность, представленная в каждой SEQ ID NO в описанных здесь примерах, независимо представляет собой последовательность, имеющую модификацию сахарной группы, межнуклеозидной связи или нуклеотидного основания. Такие антисмысловые соединения, определенные в SEQ ID NO, могут независимо содержать одну или несколько модификаций сахарной группы, межнуклеозидной связи или нуклеотидного основания. Антисмысловые соединения, описанные под номером Isis (Isis №), представляют собой комбинацию последовательности нуклеотидных оснований и мотива.

В некоторых вариантах изобретения, областью-мишенью является область нуклеиновой кислоты-мишени с определенной структурой. Так, например, область-мишень может включать 3'UTR, 5'UTR, экзон, интрон, область стыка экзон/интрон, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Области фактора 11 с определенной структурой могут быть взяты из баз данных последовательностей, таких как NCBI, в которых они депонированы под соответствующим регистрационным номером, и такая информация вводится в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах изобретения, область-мишень может включать последовательность, простирающуюся от 5'-сайта-мишени одного сегмента-мишени в области-мишени до 3'-сайта-мишени другого сегмента-мишени в той же самой области-мишени.

Термин «нацеливание» включает определение по меньшей мере одного сегмента-мишени, с которым гибридизуется антисмысловое соединение, в результате чего достигается нужный эффект. В некоторых вариантах изобретения, указанным желаемым эффектом являются снижение уровней нуклеиновой кислоты, то есть мРНК-мишени. В некоторых вариантах изобретения, желаемым эффектом являются снижение уровней белка, кодируемого нуклеиновой кислотой-мишенью, или фенотипические изменения, ассоциированные с указанной нуклеиновой кислотой-мишенью.

Область-мишень может содержать один или несколько сегментов-мишеней. Множество сегментов-мишеней в области-мишени может быть перекрывающимся. Альтернативно, такие области могут быть неперекрывающимися. В некоторых вариантах изобретения, сегменты-мишени в области-мишени отделены друг от друга не более, чем примерно на 300 нуклеотидов. В некоторых вариантах изобретения, сегменты-мишени в области-мишени отделены друг от друга нуклеотидами, число которых составляет примерно, или не более, чем, или примерно не более, чем 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидов, присутствующих в нуклеиновой кислоте-мишени, или число в интервале, определенном любыми двумя из вышеуказанных величин. В некоторых вариантах изобретения, сегменты-мишени в области-мишени отделены друг от друга не более, чем, или не более, чем примерно 5 нуклеотидами, присутствующими в нуклеиновой кислоте-мишени. В некоторых вариантах изобретения, указанные сегменты-мишени являются смежными. В настоящем изобретении также рассматриваются области-мишени, определенные интервалом, имеющим исходную нуклеиновую кислоту, которая находится в любом положении указанного здесь 5'-сайта-мишени или 3'-сайта-мишени.

Подходящие сегменты-мишени могут присутствовать в 5'UTR, в кодирующей области, в 3'UTR, в интроне, в экзоне или в области стыка «экзон/интрон». Подходящими сегментами-мишенями также являются сегменты-мишени, содержащие старт-кодон или стоп-кодон. Подходящий сегмент-мишень может, в частности, не содержать некоторые области с определенной структурой, такие как старт-кодон или стоп-кодон.

Определение подходящих сегментов-мишеней может включать сравнение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с другими последовательностями, имеющимися в геноме. Так, например, для идентификации областей гомологии различных нуклеиновых кислот может быть использован алгоритм BLAST. Такое сравнение позволяет исключить отбор последовательностей антисмысловых соединений, которые могут неспецифически гибридизоваться с последовательностями, не являющимися выбранной нуклеиновой кислотой-мишенью (то есть, последовательностями, не являющимися мишенью, или нежелательными последовательностями).

Антисмысловые соединения в активной области-мишени могут отличаться по своей активности (например, определяемой по проценту снижения уровней нуклеиновой кислоты-мишени). В некоторых вариантах изобретения, снижение уровней мРНК фактора 11 является показателем ингибирования экспрессии фактора 11. Снижение уровней белка фактора 11 также является показателем ингибирования экспрессии мРНК-мишени. Кроме того, показателем ингибирования экспрессии фактора 11 являются фенотипические изменения. Так, например, показателем ингибирования экспрессии фактора 11 может служить более длительное время АПТВ (активированное парциальное тромбопластиновое время). В другом примере, показателем ингибирования экспрессии фактора 11 может служить более длительное время АПТВ в сочетании с нормальным временем ПВ. В другом примере, показателем ингибирования экспрессии фактора 11 может служить пониженное количество тромбоцитарного фактора 4 (PF-4). В другом примере, показателем ингибирования экспрессии фактора 11 может служить снижение уровня образования тромбов или увеличение времени образования тромбов.

Гибридизация

В некоторых вариантах изобретения, гибридизация происходит между антисмысловым соединением, описанным в настоящей заявке, и нуклеиновой кислотой фактора 11. Наиболее распространенный механизм гибридизации заключается в образовании водородных связей (например, водородных связей Уотсона-Крика, Хугстена или обратных водородных связей Хугстена) между комплементарными нуклеотидными основаниями молекул нуклеиновой кислоты.

Гибридизация может происходить в различных условиях. Условия жесткости зависят от последовательностей и определяются природой и составом гибридизующихся молекул нуклеиновой кислоты.

Методы идентификации специфической гибридизации последовательности с нуклеиновой кислотой-мишенью хорошо известны специалистам. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь антисмысловые соединения обладают способностью специфически гибридизоваться с нуклеиновой кислотой фактора 11.

Комплементарностъ

Антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота-мишень комплементарны друг другу в том случае, когда достаточное число нуклеотидных оснований антисмыслового соединения могут образовывать водородные связи с соответствующими нуклеотидными основаниями нуклеиновой кислоты-мишени, в результате чего будет достигаться желаемый эффект (например, ингибирование нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота фактора 11, антисмысловым соединением).

При этом, допускается присутствие некомплементарных нуклеотидных оснований между антисмысловым соединением и нуклеиновой кислотой фактора 11, при условии, что антисмысловое соединение будет сохранять свою способность специфически гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. Кроме того, антисмысловое соединение может гибридизироваться с одним или несколькими сегментами нуклеиновой кислоты фактора 11, таким образом, что промежуточные или соседние сегменты не будут участвовать в событии гибридизации (например, не будут образовывать петлевую структуру, структуру с несоответствиями или шпилечную структуру).

В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь антисмысловые соединения или их специфическая часть комплементарны или по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарны нуклеиновой кислоте фактора 11, области-мишени, сегменту-мишени или их специфической части. Процент комплементарности антисмыслового соединения нуклеиновой кислоте-мишени может быть определен рутинными методами.

Так, например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидных оснований антисмыслового соединения комплементарны области-мишени, а поэтому они могут специфически гибридизироваться с этой областью, рассматривается как соединение с 90%-ной комплементарностью. В этом примере, остальные не-комплементарные нуклеотидные основания могут присутствовать в виде кластера, либо они могут находиться между комплементарными нуклеотидными основаниями, но они необязательно должны быть смежными друг с другом или с комплементарными нуклеотидными основаниями. Такие антисмысловые соединения длиной в 18 нуклеотидных оснований, имеющей 4 (четыре) некомплементарных нуклеотидных основания, фланкированных двумя областями, которые являются полностью комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени, в основном, на 77,8% комплементарны нуклеиновой кислоте-мишени, а поэтому они входят в объем настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения по отношению к области нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен рутинным методом с использованием пакета программ BLAST (программ поиска локальных соответствий оснований выравниваемых последовательностей) и пакета программ PowerBLAST, известных специалистам (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичность или комплементарность последовательностей могут быть определены, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), с использованием параметров по умолчанию и алгоритма Смита и Уотермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2,482 489).

В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь антисмысловые соединения или их специфические части полностью комплементарны (то есть на 100% комплементарны) нуклеиновой кислоте-мишени или ее специфической части. Так, например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарным нуклеиновой кислоте фактора 11 или ее области-мишени, сегменту-мишени или последовательности-мишени. Используемый здесь термин «полностью комплементарный» означает, что каждое нуклеотидное основание антисмыслового соединения обладает способностью точно спариваться с соответствующими нуклеотидными основаниями нуклеиновой кислоты-мишени. Так, например, антисмысловое соединение из 20 нуклеотидных оснований являются полностью комплементарными последовательности-мишени длиной в 400 нуклеотидных оснований, при условии, что соответствующая часть нуклеиновой кислоты-мишени из 20 нуклеотидных оснований будет полностью комплементарна антисмысловому соединению. Термин «полностью комплементарный» может также употребляться и по отношению к специфической части первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Так, например, 20 нуклеотидных оснований, являющиеся частью антисмыслового соединения из 30 нуклеотидных оснований, могут быть «полностью комплементарными» последовательности-мишени длиной в 400 нуклеотидных оснований. 20 нуклеотидных оснований, являющиеся частью олигонуклеотида из 30 нуклеотидных оснований, полностью комплементарны последовательности-мишени, если указанная последовательность-мишень имеет соответствующую часть из 20 нуклеотидных оснований, где каждое нуклеотидное основание комплементарно 20 нуклеотидным основаниям, составляющим часть антисмыслового соединения. При этом, полноразмерное антисмысловое соединение из 30 нуклеотидных оснований может быть, а может и не быть, полностью комплементарным последовательности-мишени, в зависимости от того, являются ли остальные 10 нуклеотидных оснований антисмыслового соединения также комплементарными последовательности-мишени.

Некомплементарное нуклеотидное основание может присутствовать у 5'-конца или 3'-конца антисмыслового соединения. Альтернативно, некомплементарное нуклеотидное основание или некомплементарные нуклеотидные основания могут присутствовать во внутреннем положении антисмыслового соединения. Если присутствуют два или более некомплементарных нуклеотидных основания, то они могут быть смежными (то есть связанными) или несмежными. В одном из вариантов изобретения, некомплементарное нуклеотидное основание присутствует в сегменте-крыле антисмыслового олигонуклеотида-гэпмера.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, имеющие длину в 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидных оснований или менее, содержат не более, чем 4, не более, чем 3, не более, чем 2 или не более, чем 1 нуклеотидное основание, которое не является комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени, такой как нуклеиновая кислота фактора 11 или ее специфическая часть.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, имеющие длину в 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидных оснований или менее, содержат не более, чем 6, не более, чем 5, не более, чем 4, не более, чем 3, не более, чем 2 или не более, чем 1 нуклеотидное основание, которое не является комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени, такой как нуклеиновая кислота фактора 11 или ее специфическая часть.

Описанными здесь антисмысловыми соединениями также являются антисмысловые соединения, которые комплементарны части нуклеиновой кислоты-мишени. Используемый здесь термин «часть» означает определенное количество смежных (то есть, связанных) нуклеотидных оснований в области или сегменте нуклеиновой кислоты-мишени. Термин «часть» может также означать определенное число смежных нуклеотидных оснований антисмыслового соединения. В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения комплементарны по меньшей мере части сегмента-мишени из 8 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения комплементарны по меньшей мере части сегмента-мишени из 12 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения комплементарны по меньшей мере части сегмента-мишени из 15 нуклеотидных оснований. В настоящем изобретении также рассматриваются антисмысловые соединения, комплементарные по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеотидным основаниям, составляющим часть сегмента-мишени, или любому числу нуклеотидных оснований, входящему в интервалы между любыми двумя этими величинами.

Идентичность

Описанные здесь антисмысловые соединения могут также иметь определенный процент идентичности конкретной нуклеотидной последовательности, SEQ ID NO:, или соединению, имеющему конкретный номер по Isis, или его части. Используемое здесь антисмысловое соединение является идентичным описанной здесь последовательности, если это соединение обладает такой же самой способностью спариваться с нуклеотидными основаниями. Так, например, РНК, которая вместо тимидина, присутствующего в описанной здесь последовательности ДНК, содержит урацил, также должна рассматриваться как последовательность, идентичная последовательности ДНК, поскольку как урацил, так и тимидин спариваются с аденином. В настоящем изобретении также рассматриваются описанные здесь укороченные и удлиненные варианты антисмысловых соединений, а также соединения, имеющие основания, не идентичные основаниям описанных здесь антисмысловых соединений. Такие неидентичные основания могут быть смежными друг с другом или распределены по всему антисмысловому соединению. Процент идентичности антисмысловых соединений вычисляют по числу оснований, которые обнаруживают спаривание, идентичное спариванию оснований сравниваемой последовательности.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения или их части по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны одному или нескольким антисмысловым соединениям или SEQ ID NO:, или их частям, описанным в настоящей заявке.

В некоторых вариантах изобретения, часть антисмыслового соединения сравнивают с частью нуклеиновой кислоты-мишени, имеющей ту же самую длину. В некоторых вариантах изобретения, часть, имеющую 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных оснований, сравнивают с частью нуклеиновой кислоты-мишени, имеющей ту же самую длину.

В некоторых вариантах изобретения, часть антисмыслового олигонуклеотида сравнивают с частью нуклеиновой кислоты-мишени, имеющей ту же самую длину. В некоторых вариантах изобретения, часть, имеющую 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных оснований, сравнивают с частью нуклеиновой кислоты-мишени, имеющей ту же самую длину.

Модификации

Нуклеозидом является комбинация основания и сахара. Нуклеотидной частью (также известной как основание) нуклеозида обычно является молекула гетероциклического основания. Нуклеотидами также являются нуклеозиды, которые дополнительно включают фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. В нуклеозидах, включающих пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2'-, 3'- или 5'-гидроксильной частью сахара. Олигонуклеотиды, а именно, линейные полимерные олигонуклеотиды, образуются посредством ковалентной связи смежных нуклеозидов друг с другом. В олигонуклеотидной структуре, фосфатные группы обычно образуются посредством межнуклеозидных связей олигонуклеотида.

Модификации антисмысловых соединений включают замены или модификации в межнуклеозидных связях, сахарных группах или нуклеотидных основаниях. Модифицированные антисмысловые соединения часто являются более предпочтительными, чем их нативные формы, поскольку они обладают нужными свойствами, такими как, например, повышенный уровень поглощения клетками, повышенная аффинность по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени, повышенная стабильность в присутствии нуклеаз или повышенная ингибирующая активность.

Химически модифицированные нуклеозиды могут быть также использованы для повышения аффинности связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида с его нуклеиновой кислотой-мишенью. Следовательно, сравнимые результаты, в большинстве случаев, могут быть получены с использованием еще более коротких антисмысловых соединений, имеющих такие химически модифицированные нуклеозиды.

Модифицированные межнуклеозидные связи

Природной межнуклеозидной связью РНК и ДНК является 3'-5'-фосфодиэфирная связь. Антисмысловые соединения, имеющие одну или несколько модифицированных, то есть, неприродных межнуклеозидных связей, часто являются более предпочтительными по сравнению с антисмысловыми соединениями, имеющими природные межнуклеозидные связи, поскольку они обладают нужными свойствами, такими как, например, повышенный уровень поглощения клетками, повышенная аффинность по отношению к нуклеиновым кислотам-мишеням и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.

Олигонуклеотиды, имеющие модифицированные межнуклеозидные связи, включают межнуклеозидные связи, которые имеют атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, не имеющие атома фосфора. Репрезентативными фосфорсодержащими межнуклеозидными связями являются, но не ограничиваются ими, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидат и фосфортиоаты. Методы получения связей, содержащих и не содержащих фосфор, хорошо известны специалистам.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, содержат одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах изобретения, модифицированными межнуклеозидными связями являются фосфортиоатные связи. В некоторых вариантах изобретения, каждой межнуклеозидной связью антисмыслового соединения является фосфортиоатная межнуклеозидная связь.

Модифицированные сахарные группы

Антисмысловые соединения согласно изобретению могут содержать, но необязательно, один или несколько нуклеозидов, которые имеют модифицированную сахарную группу. Такие модифицированные сахаром нуклеозиды могут сообщать антисмысловым соединениям повышенную устойчивость к нуклеазе, повышенную аффинность связывания или некоторые другие желательные биологические свойства. В некоторых вариантах изобретения, нуклеозиды содержат химически модифицированные рибофуранозные циклические группы. Примерами получения химически модифицированных рибофуранозных циклических групп являются, но не ограничиваются ими, присоединение групп-заместителей (включая присоединение 5'- и 2'-групп заместителей, создание мостиковой связи между атомами неконденсированного кольца с образованием бициклических нуклеиновых кислот (BNA) и замену атома кислорода рибозильного кольца группами S, N(R), или C(R1)(R)2 (где R=H, С₁-С₁₂-алкил или защитная группа) и их комбинации. Примерами получения химически модифицированных сахаров являются получение 2'-F-5'-метил-замещенного нуклеозида (описание других 5',2'-бис-замещенных нуклеозидов можно найти в Международной заявке РСТ WO 2008/101157, опубликованной 8/21/08) или замена атома кислорода рибозильного кольца атомом S с дополнительным замещением в 2'-положении (см. заявку на патент США US2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005) или, альтернативно, 5'-замещение БНК (см. Международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, где LNA замещена, например, 5'-метильной или 5'-винильной группой).

Примерами нуклеозидов, имеющих модифицированные сахарные группы, являются, но не ограничиваются ими, нуклеозиды, содержащие группы-заместители, такие как 5'-винил, 5'-метил (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН₃ и 2'-O(СН₂)₂OСН₃. Заместитель в 2'-положении может быть также выбран из аллила, амино, азидо, тио, О-аллила, О-С₁-С₁₀-алкила, OCF₃, O(CH₂)₂SCH₃, O(CH₂)₂-O-N(Rm)(Rn) и O-CH₂-C(=O)-N(Rm)(Rn), где каждый из Rm и Rn независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный C₁-С₁₀-алкил.

Примерами бициклических нуклеиновых кислот (BNA) являются, но не ограничиваются ими, нуклеозиды, содержащие мостиковую связь между атомами 4'- и 2'-рибозильного кольца. В некоторых вариантах изобретения, описанными здесь антисмысловыми соединениями являются один или несколько нуклеозидов BNA, которые имеют мостиковую связь одной из формул: 4'-(СН₂)-O-2' (LNA); 4'-(CH₂)-S-2'; 4'-(СН₂)-O-2' (LNA); 4'-(СН₂)₂-O-2' (ENA); 4'-С(СН₃)₂-O-2' (см. PCT/US2008/068922); 4'-СН(СН₃)-O-2' и 4'-С-Н(СН₂ОСН₃)-O-2' (см. патент США 7399845, выданный 15 июля, 2008); 4'-СН₂-N(OCH₃)-2' (см. PCT/US2008/064591); 4'-CH₂-O-N(CH₃)-2' (см. заявку на патент США US2004-0171570, опубликованную 2 сентября, 2004); 4'-CH₂-N(R)-O-2' (см. патент США 7427672, выданный 23 сентября, 2008); 4'-СН₂-С(СН₃)-2' и 4'-СН₂-С-(=СН₂)-2' (см. PCT/US2008/066154), где R независимо представляет собой Н, С₁-С₁₂-алкил или защитную группу. Каждая из вышеупомянутых BNA имеет различные стереохимические сахарные конфигурации, включая, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу (см. Международную заявку PCT/DK98/00393, опубликованную 25 марта 1999 как WO 99/14226).

В некоторых вариантах изобретения, нуклеозиды модифицированы путем замены рибозильного кольца сахарным суррогатом. Такими модификациями являются, но не ограничиваются ими, замена рибозильного кольца суррогатной циклической системой (иногда называемой аналогами ДНК), такой как морфолино-кольцо, циклогексенильное кольцо, циклогексильное кольцо или тетрагидропиранильное кольцо, такое как кольцо, имеющее одну из нижеследующих формул:

Многие другие бицикло- и трицикло-системы циклических сахарных суррогатов, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов, включаемых в антисмысловые соединения, также известны специалистам (см., например, обзорную статью Leumann, J. С, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854). Такие циклические системы могут быть подвергнуты различным дополнительным замещениям для повышения активности.

Методы получения модифицированных сахаров хорошо известны специалистам.

В нуклеотидах, имеющих модифицированные сахарные группы, молекулы нуклеотидных оснований (природные, модифицированные или их комбинации) сохраняют для их гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, включают один или несколько нуклеотидов, имеющих модифицированные сахарные группы. В некоторых вариантах изобретения, модифицированной сахарной группой является 2'-МОЕ. В некоторых вариантах изобретения, 2'-МОЕ-модифицированные нуклеотиды присутствуют в мотиве гэпмера.

Модифицированные нуклеотидные основания

Модификации или замещения нуклеотидного основания (или основания) по своей структуре отличаются от природных или синтетических немодифицированных нуклеотидных оснований, но по своим функциям они эквивалентны таким основаниям. Природные и модифицированные нуклеотидные основания способны участвовать в образовании водородных связей. Такие нуклеотидные модификации могут сообщать антисмысловым соединениям устойчивость к нуклеазе, аффинность связывания или некоторые другие желательные биологические свойства. Модифицированными нуклеотидными основаниями являются синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как, например, 5-метилцитозин (5-me-С). Некоторые нуклеотидные замены, включая замены 5-метилцитозином, могут быть, в частности, использованы для повышения аффинности связывания антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью. Так, например, было показано, что замены 5-метилцитозином повышают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты при увеличении температуры на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, В., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).

Другими модифицированными нуклеотидными основаниями являются 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и -цитозин, 5-пропинил(-С≡С-СН₃)урацил и -цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, а в частности, 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, и 3-деазагуанин и 3-деазааденин.

Молекулами гетероциклических оснований могут быть также молекулы, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например, 7-деазааденином, 7-деазагуанозином, 2-аминопиридином и 2-пиридоном. Нуклеотидными основаниями, которые, в частности могут быть использованы для повышения аффинности связывания антисмысловых соединений, являются 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и O-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.

В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, содержат одно или несколько модифицированных нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые олигонуклеотиды с уширенным гэпом, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, содержат одно или несколько модифицированных нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах изобретения, модифицированный нуклеотидным основанием является 5-метилцитозин. В некоторых вариантах изобретения, каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.

Композиции и способы получения фармацевтических композиций

Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными или инертными веществами, подходящими для получения фармацевтических композиций или препаратов. Композиции и способы получения фармацевтических композиций зависят от ряда факторов, включая, но не ограничиваясь ими, способ введения, тяжесть заболевания или вводимую дозу.

Антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту фактора 11, может быть использовано в фармацевтических композициях в комбинации с подходящими фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем. Фармацевтически приемлемым разбавителем является забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). PBS представляет собой разбавитель, используемый в парентерально вводимых композициях. В соответствии с этим, в одном из вариантов изобретения, фармацевтическая композиция, используемая в описанных здесь способах, содержит антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту фактора 11, и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах изобретения, фармацевтически приемлемым разбавителем является PBS. В некоторых вариантах изобретения, антисмысловым соединением является антисмысловой олигонуклеотид.

Фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, включают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любой другой олигонуклеотид, которые, после их введения животному, включая человека, обладают способностью доставлять (прямо или опосредованно) биологически активный метаболит или его остаток. В соответствии с этим, например, в настоящем изобретении также описаны фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, пролекарства, фармацевтически приемлемые соли таких пролекарств и другие биоэквиваленты. Подходящими фармацевтически приемлемыми солями являются, но не ограничиваются ими, соли натрия и калия.

Введение пролекарства может означать включение дополнительных нуклеозидов у одного или обоих концов антисмыслового соединения, которое расщепляется в организме под действием эндогенных нуклеаз с образованием активного антисмыслового соединения.

Конъюгированные антисмысловые соединения

Антисмысловые соединения могут быть ковалентно связаны с одной или несколькими молекулами или конъюгатами, что может приводить к повышению активности и к улучшению распределения полученных антисмысловых олигонуклеотидов в клетках или их поглощения этими клетками. Типичными группами конъюгата являются молекулы холестерина и молекулы липида. Другими группами конъюгата являются углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители.

Антисмысловые соединения могут быть также модифицированы так, чтобы они содержали одну или несколько стабилизирующих групп, которые обычно присоединяются к одному или к обоим концам антисмысловых соединений, что приводит к улучшению их свойств, таких как, например, устойчивость к нуклеазе. В стабилизирующие группы также входят кэп-структуры. Такие концевые модификации защищают антисмысловое соединение, имеющее концевую нуклеиновую кислоту, от расщепления экзонуклеазой, и могут облегчать доставку такого соединения в клетку и/или его нужную локализацию в клетке. Кэп может присутствовать у 5'-конца (5'-кэп) или у 3'-конца (3'-кэп), либо он может присутствовать на обоих концах. Кэп-структуры хорошо известны специалистам, и такими структурами являются, например, инвертированные неосновные дезокси-кэпы. Другими 3'- и 5'- стабилизирующими группами, которые могут быть использованы для кэпирования одного или обоих концов антисмыслового соединения в целях сообщения ему устойчивости к нуклеазе, являются группы, описанные в заявке WO 03/004602, опубликованной 16 января 2003.

Клеточная культура и лечение антисмысловыми соединениями

Влияние антисмысловых соединений на уровни, активность или экспрессию нуклеиновых кислот фактора 11 может быть протестировано in vitro в клетках различных типов. Клетки различных типов, используемые для таких анализов, были закуплены у коммерческих фирм-поставщиков (например, в Американской коллекции типовых культур, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) и культивированы в соответствии с инструкциями производителей с использованием коммерчески доступных реагентов (например, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Репрезентативными клетками являются, но не ограничиваются ими, клетки HepG2, клетки НерЗВ и первичные гепатоциты.

In vitro тестирование антисмысловых олигонуклеотидов

В настоящем изобретении описаны методы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, где указанные методы могут быть соответствующим образом модифицированы для проведения лечения другими антисмысловыми соединениями.

В основном, клетки, при достижении ими приблизительно 60-80% конфлюентности в культуре, обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами.

Одним из реагентов, обычно используемых для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивированные клетки, является реагент для трансфекции катионного липида липофектина (LIPOFECTIN) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Антисмысловые олигонуклеотиды смешивают с липофектином в среде OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) для достижения нужной конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации липофектина, которая обычно составляет в пределах от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другим реагентом, обычно используемым для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивированные клетки, является липофектамин (LIPOFECTAMINE) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Антисмысловый олигонуклеотид смешивают с липофектамином в среде OPTI-MEM 1 с пониженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA) для достижения нужной конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации липофектамина, которая обычно составляет в пределах от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другим методом, применяемым для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивированные клетки, является электропорация.

Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами рутинными методами. Клетки обычно собирают через 16-24 часа после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами, а затем уровни РНК или белка, кодируемого нуклеиновыми кислотами-мишенями, измеряют методами, известными специалистам и описанными в настоящей заявке. В основном, если обработку проводят с множеством повторностей, то данные представляют как среднее величин, полученных при повторных обработках.

В различных клеточных линиях, концентрация используемого антисмыслового олигонуклеотида варьируется. Методы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида в конкретной клеточной линии хорошо известны специалистам. При трансфекции липофектамином, антисмысловые олигонуклеотиды обычно используются в концентрации от 1 нМ до 300 нМ. При трансфекции методом электропорации, антисмысловые олигонуклеотиды используются в более высокой концентрации, а именно, в пределах от 625 до 20000 нМ.

Выделение РНК

Анализ РНК может быть осуществлен на полноразмерной клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Методы выделения РНК хорошо известны специалистам. РНК получают методами, хорошо известными специалистам, например, с использованием реагента TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, СА) в соответствии с протоколами, рекомендованными производителями.

Анализ на ингибирование уровней или экспрессии мишеней

Ингибирование уровней или экспрессии нуклеиновой кислоты фактора 11 может быть проанализировано различными методами, известными специалистам. Так, например, уровни нуклеиновой кислоты-мишени могут быть количественно оценены, например, с помощью Нозерн-блот-анализа, конкурентной полимеразной цепной реакции (ПЦР) или количественной ПЦР в реальном времени. Анализ РНК может быть осуществлен на полноразмерной клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Методы выделения РНК хорошо известны специалистам. Нозерн-блот-анализ также является рутинным методом. Количественная ПЦР в реальном времени может быть легко осуществлена с помощью системы детектирования последовательностей на коммерчески доступном оборудовании ABI PRISM 7600, 7700 или 7900, поставляемом PE-Applied Biosystems, Foster City, СА, в соответствии с инструкциями производителей.

Анализ уровней РНК-мишени, проводимый с помощью количественной ПЦР в реальном времени

Количественная оценка уровней РНК-мишени может быть осуществлена путем количественной ПЦР в реальном времени с помощью системы детектирования последовательностей на коммерчески доступном оборудовании ABI PRISM 7600, 7700 или 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, СА) в соответствии с инструкциями производителей. Методы проведения количественной ПЦР в реальном времени хорошо известны специалистам.

Перед проведением ПЦР в реальном времени, выделенную РНК подвергают реакции с обратной транскриптазой (ОТ), в результате чего продуцируется комплементарная ДНК (кДНК), которую затем используют в качестве субстрата для ПЦР-амплификации в реальном времени. Реакции с ОТ и ПЦР в реальном времени осуществляют последовательно в одной и той же лунке с образцом. Реагенты для реакций ОТ и ПЦР в реальном времени закупают у Invitrogen (Carlsbad, СА). Реакции с ОТ и ПЦР в реальном времени осуществляют методами, хорошо известными специалистам.

Количества гена-мишени (или РНК-мишени), полученные с помощью ПЦР в реальном времени, нормализуют по уровню экспрессии гена, которая является постоянной, например, такого как ген циклофилина А, или по количеству полноразмерной РНК с использованием RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, СА). Экспрессию циклофилина А количественно оценивают одновременно или параллельно с мишенью, либо по отдельности, с помощью ПЦР в реальном времени. Полноразмерную РНК количественно оценивают с использованием реагента для количественного определения РНК, RIBOGREEN, (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Методы количественной оценки РНК с использованием RIBOGREEN описаны в публикации Jones, L. J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Измерение интенсивности флуоресценции RIBOGREEN проводят на оборудовании CYTOFLUOR 4000 (РЕ Applied Biosystems).

Зонды и праймеры конструируют так, чтобы они гибридизовались с нуклеиновой кислотой фактора 11. Методы конструирования зондов и праймеров для ПЦР в реальном времени хорошо известны специалистам, и могут быть осуществлены с использованием компьютерной программы, такой как PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Анализ уровней белка

Ингибирование нуклеиновых кислот фактора 11 антисмысловыми соединениями может быть оценено путем измерения уровней белка фактора 11. Уровни белка фактора 11 могут быть измерены или количественно оценены различными методами, хорошо известными специалистам, такими как иммунопреципитация, вестерн-блот-анализ (иммуноблоттинг), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), анализы для количественной оценки белков, анализы на активность белка (например, анализы на каспазную активность), иммуногистохимический анализ, иммуноцитохимический анализ или клеточный сортинг с активацией флуоресценции (FACS). Антитела, нацеленные против мишени, могут быть идентифицированы и получены из различных источников, таких как антитела каталога MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), либо они могут быть получены стандартными методами продуцирования моноклональных или поликлональных антител, хорошо известных специалистам. Антитела, используемые для детектирования фактора 11 у мышей, крыс, обезьян и человека, являются коммерчески доступными.

In vivo тестирование антисмысловых соединений

Антисмысловые соединения, например, антисмысловые олигонуклеотиды, присутствующие у животных, тестируют для оценки их способности ингибировать экспрессию фактора 11 и продуцировать фенотипические изменения, такие как длительное время АПТВ, более длительное время АПТВ в сочетании с нормальным временем ПВ, пониженное количество тромбоцитарного фактора 4 (PF-4), и пониженный уровень образования тромбов или повышенное время образования тромбов. Такое тестирование может быть проведено на нормальных животных или на экспериментальных моделях заболевания. Для введения животным, антисмысловые олигонуклеотиды получают в фармацевтически приемлемом разбавителе, таком как забуференный фосфатом физиологический раствор. Введение может быть осуществлено парентерально, например, внутрибрюшинно, внутривенно и подкожно. Вычисление доз и чистоты введения антисмысловых олигонуклеотидов может быть осуществлено самим специалистом в данной области, и результаты такого вычисления зависят от таких факторов, как способ введения и масса тела животного. После обработки антисмысловыми олигонуклеотидами, из ткани печени выделяют РНК и определяют изменение уровней экспрессии нуклеиновой кислоты фактора 11. Изменение уровней белка фактора 11 также определяют с помощью анализа на образование тромбина. Кроме того, влияние на время образования сгустков, например, ПВ и АПТВ определяют с использованием плазмы, взятой у обработанных животных.

Переносимость доз

В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь соединения дают минимальные побочные эффекты. Побочными эффектами являются ответы на введение антисмыслового соединения, которые обычно не имеют отношения к нацеливанию на фактор 11, например, такие как воспалительный ответ у животного. В некоторых вариантах изобретения, эти соединения хорошо переносятся животным. Улучшение переносимости доз может зависеть от ряда факторов, включая, но не ограничиваясь ими, нуклеотидную последовательность антисмыслового соединения, химические модификации нуклеотидов, конкретный мотив немодифицированных и модифицированных нуклеозидов в антисмысловом соединении или их комбинации. Переносимость дозы может быть определена по ряду факторов. Такими факторами являются масса тела, масса органа, функция печени, функция почек, число тромбоцитов и лейкоцитарная формула.

В некоторых вариантах изобретения, рассматриваемые здесь соединения оказывают минимальное действие на массу органов. В некоторых вариантах изобретения, указанные соединения дают менее, чем 7-кратное, 6-кратное, 5-кратное, 4-кратное, 3-кратное, 2-кратное увеличение массы селезенки и/или печени, либо вообще не оказывают значительного влияния на массу указанных органов.

В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь соединения оказывают минимальное действие на функцию печени. Факторами, используемыми для оценки функции печени, являются уровни ALT, уровни AST, уровни билирубина в плазме и уровни альбумина в плазме. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь соединения дают менее, чем 7-кратное, менее, чем 6-кратное, менее, чем 5-кратное, менее, чем 4-кратное, менее, чем 3-кратное или менее, чем 2-кратное увеличение уровней ALT или AST, либо вообще не оказывают значительного влияния на уровни ALT или AST. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь соединения дают менее, чем 3-кратное или менее, чем 2-кратное увеличение уровней билирубина в плазме, либо вообще не оказывают значительного влияния на уровни билирубина в плазме.

В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь соединения оказывают минимальное действие на функцию почек. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь соединения дают менее, чем 3-кратное или менее, чем 2-кратное увеличение концентрации азота мочевины в плазме крови (BUN), либо вообще не оказывают значительного влияния на концентрацию такого соединения. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь соединения дают менее, чем 6-кратное, 5-кратное, 4-кратное, 3-кратное или 2-кратное увеличение отношения «белок:креатинин» в моче, либо вообще не оказывают значительного влияния на такое отношение.

В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь соединения оказывают минимальное действие на гематологические факторы. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь соединения дают менее, чем 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% или 5%-ное снижение числа тромбоцитов. В некоторых вариантах изобретения, описанные здесь соединения дают менее, чем 4-кратное, 3-кратное или 2-кратное увеличение числа моноцитов, либо вообще не оказывают значительного влияния на число моноцитов.

В некоторых вариантах изобретения, указанные соединения также обладают желательными фармакокинетическими свойствами. В некоторых вариантах изобретения, антисмысловые соединения имеют относительно длительное время полужизни в соответствующих биологических жидкостях или тканях.

В некоторых вариантах изобретения, указанные соединения или композиции также имеют желательную вязкость. В некоторых вариантах изобретения, вязкость указанного соединения или композиции не превышает 40 сП при концентрации 165-185 мг/мл.

В других вариантах изобретения, указанные соединения имеют комбинацию вышеуказанных свойств и с высокой эффективностью снижают уровень экспрессии мРНК фактора 11 у животного-модели.

Некоторые показания

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума, включающим введение одной или нескольких фармацевтических композиций согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, указанный индивидуум страдает тромбоэмболическим осложнением. В некоторых вариантах изобретения, указанным индивидуумом является индивидуум с риском развития нарушения свертывания крови, включая, но не ограничиваясь ими, инфаркт, тромбоз, эмболию, тромбоэмболию, такую как тромбоз глубокой вены, эмболия легких, инфаркт миокарда и инсульт. Такими индивидуумами также являются индивидуумы с приобретенными нарушениями, заболеваниями или расстройствами, приводящими к риску развития тромбоза, например, к риску, связанному с хирургической операцией, раком, неподвижным образом жизни, сепсисом, атеросклерозом, трепетанием предсердий, а также с генетической предрасположенностью, например, с антифосфолипидным синдромом и аутосомно-доминантным состоянием, ассоциированным с фактором Лейдена V. В некоторых вариантах изобретения, таким индивидуумом является индивидуум, нуждающийся в терапии антикоагулянтами. Примерами таких индивидуумов являются, но не ограничиваются ими, индивидуумы, подвергавшиеся «большой» ортопедической хирургической операции (то есть восстановительной хирургической операции на колене/бедре или хирургической операции по поводу перелома бедра), и пациенты, которые, для предупреждения инсульта, нуждаются в постоянном лечении, такие как пациенты, у которых наблюдается трепетание предсердий. В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к способам профилактического снижения уровней экспрессии фактора 11 у индивидуума. Некоторые варианты изобретения включают лечение индивидуума, нуждающегося в этом, путем введения данному индивидууму терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту фактора 11.

В одном из вариантов изобретения, введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту фактора 11, осуществляют вместе с мониторингом уровней фактора 11 в сыворотке индивидуума для оценки ответа индивидуума на введение антисмыслового соединения. Ответ индивидуума на введение антисмыслового соединения используется лечащим врачом для определения количества соединения, необходимого для терапевтического лечения, и необходимости продолжения такого лечения.

В некоторых вариантах изобретения, введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту фактора 11 приводит к снижению уровня экспрессии фактора 11 по меньшей мере на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или на величину в пределах интервала, определяемого любыми двумя из указанных величин. В некоторых вариантах изобретения, введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту фактора 11 приводит к изменению показателя свертывания крови, измеренного с помощью стандартного теста, например, такого как, но не ограничивающегося ими, тест на активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), тест на протромбиновое время (ПВ), тест на тромбиновое время (ТТВ), время кровотечения или на уровни D-димера. В некоторых вариантах изобретения, введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту фактора 11 приводит к увеличению показателя свертывания крови по меньшей мере на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на величину в пределах интервала, определяемого любыми двумя из указанных величин. В некоторых вариантах изобретения, введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту фактора 11 приводит к снижению показателя свертывания крови по меньшей мере на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или на величину в пределах интервала, определяемого любыми двумя из указанных величин.

В некоторых вариантах изобретения, фармацевтические композиции, содержащие антисмысловое соединение, нацеленное на фактор 11, используют для приготовления лекарственного препарата для лечения пациента, страдающего тромбоэмболическими осложнениями или восприимчивого к тромбоэмболическим осложнениям.

Некоторые способы комбинированной терапии

В некоторых вариантах изобретения, одну или несколько фармацевтических композиций согласно изобретению вводят вместе с одним или несколькими другими фармацевтическими средствами. В некоторых вариантах изобретения, указанное одно или несколько других фармацевтических средств предназначены для лечения такого же заболевания, расстройства или состояния, которое может быть подвергнуто лечению одной или несколькими фармацевтическими композициями согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, указанное одно или несколько других фармацевтических средств предназначены для лечения другого заболевания, расстройства или состояния, отличающегося от того заболевания, расстройства или состояния, для лечения которого предназначены одна или несколько фармацевтических композиций согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, указанное одно или несколько других фармацевтических средств предназначены для устранения нежелательного побочного эффекта, вызываемого введением одной или нескольких фармацевтических композиций согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, одну или несколько других фармацевтических композиций согласно изобретению вводят вместе с другим фармацевтическим средством для устранения нежелательного эффекта, вызываемого введением другого фармацевтического средства. В некоторых вариантах изобретения, одну или несколько других фармацевтических композиций согласно изобретению вводят вместе с другим фармацевтическим средством для достижения комбинаторного эффекта. В некоторых вариантах изобретения, одну или несколько других фармацевтических композиций согласно изобретению вводят вместе с другим фармацевтическим средством для достижения синергического эффекта.

В некоторых вариантах изобретения, одну или несколько других фармацевтических композиций согласно изобретению вводят одновременно с одним или несколькими другими фармацевтическими средствами. В некоторых вариантах изобретения, одну или несколько других фармацевтических композиций согласно изобретению и одно или несколько других фармацевтических средств вводят в различные периоды времени. В некоторых вариантах изобретения, одну или несколько других фармацевтических композиций согласно изобретению и одно или несколько других фармацевтических средств получают вместе в одном препарате. В некоторых вариантах изобретения, одну или несколько других фармацевтических композиций согласно изобретению и одно или несколько других фармацевтических средств получают по отдельности.

В некоторых вариантах изобретения, фармацевтическими средствами, которые могут быть введены вместе с фармацевтической композицией согласно изобретению, являются антикоагулянты или антитромбоцитарные средства. В некоторых вариантах изобретения, фармацевтическими средствами, которые могут быть введены вместе с фармацевтической композицией согласно изобретению, являются ингибиторы НСПВС/циклооксигеназы, такие как аспирин. В некоторых вариантах изобретения, фармацевтическими средствами, которые могут быть введены вместе с фармацевтической композицией согласно изобретению, являются ингибиторы аденозиндифосфатного (АДФ) рецептора, такие как клопидогрель (PLAVIX) и тиклопидин (TICLID). В некоторых вариантах изобретения, фармацевтическими средствами, которые могут быть введены вместе с фармацевтической композицией согласно изобретению, являются ингибиторы фосфодиэстеразы, такие как цилостазол (PLETAL). В некоторых вариантах изобретения, фармацевтическими средствами, которые могут быть введены вместе с фармацевтической композицией согласно изобретению, являются ингибиторы гликопротеина ПВ/IIIА, такие как абциксимаб (REOPRO), эптифибатит (INTEGRILIN), тирофибан (AGGRASTAT) и дефибротид. В некоторых вариантах изобретения, фармацевтическими средствами, которые могут быть введены вместе с фармацевтической композицией согласно изобретению, являются ингибиторы поглощения аденозина, такие как дипиридамол (PERSANTINE). В некоторых вариантах изобретения, фармацевтическими средствами, которые могут быть введены вместе с фармацевтической композицией согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, варфарин (и родственные кумарины), гепарин, ингибиторы тромбина прямого действия (такие как лепирудин, бивалирудин), апиксабан, LOVENOX и низкомолекулярные соединения, которые непосредственно влияют на ферментативное действие конкретных факторов свертывания крови (например, ривароксабан, который ингибирует фактор Ха). В некоторых вариантах изобретения, фармацевтическими средствами, которые могут быть введены вместе со специфическим ингибитором фактора 11 согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, дополнительный ингибитор фактора 11. В некоторых вариантах изобретения, антикоагулянт и антитромобоцитарное средство вводят до введения фармацевтической композиции согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, антикоагулянт или антитромобоцитарное средство вводят после введения фармацевтической композиции согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, антикоагулянт и антитромобоцитарное средство вводят одновременно с фармацевтической композицией согласно изобретению. В некоторых вариантах изобретения, доза совместно вводимых антикоагулянта и антитромобоцитарного средства равна дозе антикоагулянта и антитромобоцитарного средства, вводимых отдельно. В некоторых вариантах изобретения, доза совместно вводимых антикоагулянта и антитромобоцитарного средства меньше дозы антикоагулянта и антитромобоцитарного средства, вводимых отдельно. В некоторых вариантах изобретения, доза совместно вводимых антикоагулянта и антитромбоцитарного средства выше дозы антикоагулянта и антитромбоцитарного средства, вводимых отдельно.

В некоторых вариантах изобретения, введение вместе со вторым соединением приводит к усилению антикоагулирующего действия первого соединения, а поэтому совместное введение этих соединений дает антикоагулирующий эффект, превышающий эффект от введения только первого соединения. В других вариантах изобретения, такое совместное введение дает антикоагулирующий эффект, равный аддитивному действию указанных соединений при их введении по отдельности. В некоторых вариантах изобретения, такое совместное введение дает антикоагулирующий эффект, превышающий аддитивное действие указанных соединений при их введении по отдельности. В некоторых вариантах изобретения, введение данного соединения вместе со вторым соединением приводит к усилению антитромботической активности, без увеличения риска возникновения кровотечения. В некоторых вариантах изобретения, указанным первым соединением является антисмысловое соединение. В некоторых вариантах изобретения, указанным вторым соединением является антисмысловое соединение.

В некоторых вариантах изобретения, антидот вводят в любое время после введения специфического ингибитора фактора 11. В некоторых вариантах изобретения, антидот вводят в любое время после введения антисмыслового олигонуклеотида, нацеленного на фактор 11. В некоторых вариантах изобретения, антидот вводят через несколько минут, часов, дней, недель или месяцев после введения антисмыслового соединения, нацеленного на фактор 11. В некоторых вариантах изобретения, антидот является комплементарным (например, является смысловой цепью) антисмысловому соединению, нацеленному на фактор 11. В некоторых вариантах изобретения, антидотом является белок фактора 7, фактора 7а, фактора 11 или фактора 11a. В некоторых вариантах изобретения, белком фактора 7, фактора 7а, фактора 11 или фактора 11а является белок человеческого фактора 7, человеческого фактора 7а, человеческого фактора 11 или человеческого фактора 11а. В некоторых вариантах изобретения, белком фактора 7 является NOVOSEVEN.

Некоторые способы терапии с одновременным введением антитромбоцитарного средства

В некоторых вариантах изобретения, ингибиторы фактора 11 вводят в комбинации с антитромбоцитарными терапевтическими средствами. В некоторых вариантах изобретения, введение ингибитора фактора 11 вместе с антитромбоцитарным терапевтическим средством дает незначительный риск либо вообще не дает заметного или обнаружимого увеличения риска возникновения кровотечения по сравнению с введением только одного антитромбоцитарного терапевтического средства. В некоторых вариантах изобретения, характер или показатели риска остаются неизменными по сравнению с характером или показателями, наблюдаемыми во время терапии с использованием антитромбоцитарного средства.

Комбинированная терапия с использованием антитромбоцитарного средства и антикоагулянта часто применяется в клинической практике для лечения пациентов, у которых были диагностированы, например, тромбоэмболия, трепетание предсердий, недостаточность сердечного клапана, порок сердечного клапана, инсульт и ИБС, а также пациентов с механическим клапаном. Преимущество такой комбинированной терапии заключается в вероятности продуцирования аддитивного эффекта, выражающегося в ингибировании активности тромбоцитов и фактора свертывания крови. Проведение такой комбинированной терапии может приводить к риску усиления кровотечения (Dowd, M. Plenary Sessions/Thrombosis Research 123 (2008)).

Было показано, что предварительное проведение комбинированной терапии антитромбоцитарным средством и антикоагулянтом повышает риск кровотечения по сравнению с терапией антикоагулянтом или антитромбоцитарным средством, используемыми по отдельности. Такими комбинированными методами лечения являются лечение ингибиторами FXa (например, апиксибаном и ривароксабаном) в комбинации с ингибиторами АДФ-рецептора/P2Y12 (тиенопиридинами, такими как клопидогрель - также известный как PLAVIX) и НСПВС (например, аспирином и напроксеном) (Kubitza, D. et al, Br. J. Clin. Pharmacol. 63:4 (2006); Wong, P.C. et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis 6 (2008); FDA Advisory Committee Briefing Document for New Drug Application 22-406 (2009)). Так, например, в публикации Wong сообщалось, что добавление некоторых доз апиксабана к дозам аспирина и к дозам аспирина + клопидогреля приводит к значительному увеличению периода кровотечения по сравнению с кровотечением, наблюдаемым при введении только аспирина и аспирина вместе с клопидогрелем. В публикации Kubitza сообщалось, что комбинированное введение ривороксабана и напроксена значительно увеличивает время кровотечения по сравнению с введением только одного напроксена.

ПРИМЕРЫ

Неограничивающее описание вариантов и ссылки на них

Хотя некоторые рассматриваемые здесь соединения, композиции и способы конкретно описаны со ссылками на некоторые из нижеследующих вариантов осуществления изобретения, однако, представленные ниже примеры приводятся лишь для иллюстрации описанных здесь соединений и не носят ограничительный характер. Каждая работа, цитируемая в настоящей заявке, во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Пример 1

Ингибирование человеческого фактора 11 в клетках HepG2 под действием антисмысловых соединений

Антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора 11, тестировали на их влияние на мРНК фактора 11 in vitro. Клетки HepG2, культивированные при плотности 10000 клеток на лунку, трансфицировали с использованием реагента липофектина вместе с 75 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После обработки в течение примерно 24 часов, из клеток выделяли РНК, и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, представленные в таблицах 1 и 2, были сконструированы в виде 5-10-5-МОЕ-гэпмеров. Эти гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') сегментами-крыльями, каждый из которых содержит 5 нуклеотидов. Каждый нуклеотид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеотид в 3'-сегменте-крыле имеют 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфортиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитидины. Термин «сайт инициации, являющийся мишенью» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен гэпмер. Термин «стоп-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер. Каждый гэпмер, представленный в таблице 1, нацелен на SEQ ID NO: 1 (GENBANK рег. № NM_000128.3), а каждый гэпмер, представленный в таблице 2, нацелен на SEQ ID NO: 2 (GENBANK рег. № NT_022792.17, усеченный от 19598000 до 19624000).

Пример 2

Дозозависимое ингибирование человеческого фактора 11 в клетках HepG2 под действием антисмысловых соединений

Двенадцать гэпмеров, обеспечивающих ингибирование человеческого фактора 11 in vitro на 84% или более, тестировали в различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 10000 клеток на лунку и трансфицировали реагентом липофектином вместе с антисмысловыми олигонуклеотидами, взятыми в концентрациях 9,375 нМ, 18,75 нМ, 37,5 нМ, 75 нМ и 150 нМ, как показано в таблице 3. После обработки в течение примерно 16 часов, из клеток выделяли РНК и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зонда для человеческого фактора 11, RTS 2966 (последовательность прямого праймера: CAGCCTGGAGCATCGTAACA, представленная здесь как SEQ ID NO: 3; последовательность обратного праймера: TTTATCGAGCTTCGTTATTCTGGTT, представленная здесь как SEQ ID NO: 4; последовательность зонда: TTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGAX, представленная здесь как SEQ ID NO: 5). Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам. Как проиллюстрировано в таблице 3, уровни мРНК фактора 11 в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, снижались в зависимости от дозы.

Пример 3

Ингибирование человеческого фактора 11 в клетках HepG2 под действием антисмысловых олигонуклеотидов, сконструированных методом «микропрогулки»

Дополнительные гэпмеры конструировали на основе гэпмеров, представленных в таблице 3. В результате такого конструирования получали гэпмеры, которые отличались от исходных гэпмеров, представленных в таблице 3, тем что они имели небольшие сдвиги в направлении вверх и вниз (то есть методом «микропрогулки»). Также были созданы гэпмеры с различными мотивами, например, 5-10-5 МОЕ, 3-14-3 МОЕ и 2-13-5 МОЕ. Эти гэпмеры тестировали in vitro. Клетки HepG2, культивированные при плотности 10000 клеток на лунку, трансфицировали с использованием реагента липофектина вместе с 75 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После обработки в течение примерно 24 часов, из клеток выделяли РНК, и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам.

Данные ингибирования in vitro для гэпмеров, сконструированных методом «микропрогулки», сравнивали с данными ингибирования in vitro для гэпмеров, представленных в таблице 3, как указано в таблицах 4, 5, 6, 7 и 8. Эти олигонуклеотиды представляли области на человеческой мРНК (GENBANK peг. № NM_000128.3), на которой они картированы.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, представленные в таблице 4, были сконструированы в виде 5-10-5-МОЕ-, 3-14-3-МОЕ-, и 2-13-5-МОЕ-гэпмеров. Первыми гэпмерами, представленными в таблице 4, являются исходные гэпмеры (см. таблицу 3), из которых были сконструированы остальные гэпмеры методом «микропрогулки» и которые показаны звездочкой. Эти 5-10-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') сегментами-крыльями, каждый из которых содержит 5 нуклеотидов. 3-14-3-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из четырнадцати 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждая из которых содержит 3 нуклеотида. 2-13-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из тринадцати 2'-дезоксинуклеотидов. Центральный гэп фланкирован у 5'-конца крылом, содержащим 2 нуклеотида, а у 3'-конца крылом, содержащим 5 нуклеотидов. В каждом мотиве (5-10-5, 3-14-3 и 2-13-5), каждый нуклеотид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеотид в 3'-сегменте-крыле имеют 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфортиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитидины. Термин «сайт инициации, являющийся мишенью» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен гэпмер. Термин «стоп-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер. Каждый гэпмер, представленный в таблице 4, нацелен на SEQ ID NO: 1 (GENBANK peг. № NM_000128.3).

Как показано в таблице 4, все 5-10-5-МОЕ-гэпмеры, 3-14-3-МОЕ-гэпмеры и 2-13-5-МОЕ-гэпмеры, нацеленные на область-мишень, начинающуюся со старт-сайта-мишени 656 и заканчивающуюся стоп-сайтом-мишенью 704 (то есть в пределах нуклеотидных оснований 656-704) SEQ ID NO: 1, ингибируют мРНК фактора 11 по меньшей мере на 20%. Многие из гэпмеров дают по меньшей мере 60%-ный ингибирующий эффект. Некоторые из гэпмеров, включая номера ISIS 416806, 416809, 416811, 416814, 416821, 416825, 416826, 416827, 416828, 416868, 416869, 416878, 416879, 416881, 416883, 416890, 416891, 416892, 416893, 416894, 416895, 416896, 416945, 416946, 416969, 416970, 416971, 416972, 416973, 412203, 413467, 413468, и 413469, дают по меньшей мере 80%-ный ингибирующий эффект. Гэпмеры, имеющие нижеследующие №№ ISIS 412203, 413467, 416825, 416826, 416827, 416868, 416878, 416879, 416892, 416893, 416895, 416896, 416945, 416972 и 416973, дают по меньшей мере 90%-ный ингибирующий эффект. Гэпмеры, имеющие нижеследующие №№ ISIS 416878, 416892, 416895 и 416896, дают по меньшей мере 95%-ный ингибирующий эффект.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, представленные в таблице 5, были сконструированы в виде 5-10-5-МОЕ-, 3-14-3-МОЕ- и 2-13-5-МОЕ-гэпмеров. Первыми гэпмерами, представленными в таблице 5, являются исходные гэпмеры (см. таблицу 3), из которых были сконструированы остальные гэпмеры методом «микропрогулки» и которые показаны звездочкой. Эти 5-10-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') сегментами-крыльями, каждый из которых содержит 5 нуклеотидов. 3-14-3-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из четырнадцати 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждая из которых содержит 3 нуклеотида. 2-13-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из тринадцати 2'-дезоксинуклеотидов. Центральный гэп фланкирован у 5'-конца крылом, содержащим 2 нуклеотида, а у 3'-конца крылом, содержащим 5 нуклеотидов. В каждом мотиве (5-10-5, 3-14-3 и 2-13-5), каждый нуклеотид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеотид в 3'-сегменте-крыле имеют 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфортиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитидины. Термин «сайт инициации, являющийся мишенью» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен гэпмер. Термин «стоп-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер. Каждый гэпмер, представленный в таблице 5, нацелен на SEQ ID NO: 1 (GENBANK peг. № NM_000128.3).

Как показано в таблице 5, все 5-10-5-МОЕ гэпмеры, 3-14-3-МОЕ-гэпмеры и 2-13-5-МОЕ-гэпмеры, нацеленные на область-мишень, начинающуюся со старт-сайта-мишени 738 и заканчивающуюся стоп-сайтом-мишенью 762 (то есть в пределах нуклеотидных оснований 738-762) SEQ ID NO: 1, ингибируют мРНК фактора 11 по меньшей мере на 45%. Большинство гэпмеров дают по меньшей мере 60%-ный ингибирующий эффект. Некоторые из гэпмеров, включая номера ISIS 412206, 416830, 416831, 416898, 416899, 416900, 416903, 416975, 416976, 416977 и 416980, дают по меньшей мере 80%-ный ингибирующий эффект. Гэпмеры, имеющие нижеследующие №№ ISIS 412206, 416831 и 416900, дают по меньшей мере 90%-ный ингибирующий эффект.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, представленные в таблице 6, были сконструированы в виде 5-10-5-МОЕ-, 3-14-3-МОЕ- и 2-13-5-МОЕ-гэпмеров. Первыми гэпмерами, представленными в таблице 6, являются исходные гэпмеры (см. таблицу 3), из которых были сконструированы остальные гэпмеры методом «микропрогулки» и которые показаны звездочкой. Эти 5-10-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') сегментами-крыльями, каждый из которых содержит 5 нуклеотидов. 3-14-3-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из четырнадцати 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждое из которых содержит 3 нуклеотида. 2-13-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из тринадцати 2'-дезоксинуклеотидов. Центральный гэп фланкирован у 5'-конца крылом, содержащим 2 нуклеотида, а у 3'-конца крылом, содержащим 5 нуклеотидов. В каждом мотиве (5-10-5, 3-14-3 и 2-13-5), каждый нуклеотид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеотид в 3'-сегменте-крыле имеют 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфортиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитидины. Термин «сайт инициации, являющийся мишенью» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен гэпмер. Термин «стоп-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер. Каждый гэпмер, представленный в таблице 6, нацелен на SEQ ID NO: 1 (GENBANK peг. № NM_000128.3).

Как показано в таблице 6, все 5-10-5-МОЕ гэпмеры, 3-14-3-МОЕ-гэпмеры и 2-13-5-МОЕ-гэпмеры, нацеленные на область-мишень, начинающуюся со старт-сайта-мишени 1018 и заканчивающуюся стоп-сайтом-мишенью 1042 (то есть, в пределах нуклеотидных оснований 1018-1042) SEQ ID NO: 1, ингибируют мРНК фактора 11 по меньшей мере на 80%. Гэпмеры, имеющие нижеследующие №№ ISIS 413474, 416837, 416838, 416904, 416907 и 416908, дают по меньшей мере 90%-ный ингибирующий эффект.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, представленные в таблице 7, были сконструированы в виде 5-10-5-МОЕ-, 3-14-3-МОЕ- и 2-13-5-МОЕ-гэпмеров. Первыми гэпмерами, представленными в таблице 7, являются исходные гэпмеры (см. таблицу 3), из которых были сконструированы остальные гэпмеры методом «микропрогулки» и которые показаны звездочкой. Эти 5-10-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') сегментами-крыльями, каждый из которых содержит 5 нуклеотидов. 3-14-3-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из четырнадцати 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждое из которых содержит 3 нуклеотида. 2-13-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из тринадцати 2'-дезоксинуклеотидов. Центральный гэп фланкирован у 5'-конца крылом, содержащим 2 нуклеотида, а у 3'-конца крылом, содержащим 5 нуклеотидов. В каждом мотиве (5-10-5, 3-14-3 и 2-13-5), каждый нуклеотид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеотид в 3'-сегменте-крыле имеют 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфортиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитидины. Термин «сайт инициации, являющийся мишенью» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен гэпмер. Термин «стоп-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер. Каждый гэпмер, представленный в таблице 5, нацелен на SEQ ID NO: 1 (GENBANK peг. № NM_000128.3).

Как показано в таблице 7, все 5-10-5-МОЕ гэпмеры, 3-14-3-МОЕ-гэпмеры и 2-13-5-МОЕ-гэпмеры, нацеленные на область-мишень, начинающуюся со старт-сайта-мишени 1062 и заканчивающуюся стоп-сайтом-мишенью 1091 (то есть в пределах нуклеотидных оснований 1062-1091) SEQ ID NO: 1, ингибируют мРНК фактора 11 по меньшей мере на 20%. Многие гэпмеры, включая 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416846, 416847, 416909, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416915, 416916, 416917, 416918, 416986, 416987, 416988, 416989, 416990, 416991, 416992, 416993, 416994, 416995, дают по меньшей мере 50%-ный ингибирующий эффект. Гэпмеры, имеющие нижеследующие №№ ISIS: 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416916, 416917, 416986, 416987, 416989, 416991, 416992, 416993 и 416994, дают по меньшей мере 80%-ный ингибирующий эффект. Гэпмеры, имеющие нижеследующие №№ ISIS: 413476, 413476,416842,416844, 416910,416911,416912,416913,416916,416917 и 416993, дают по меньшей мере 90%-ный ингибирующий эффект.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, представленные в таблице 8, были сконструированы в виде 5-10-5-МОЕ-, 3-14-3-МОЕ- и 2-13-5-МОЕ-гэпмеров. Первыми гэпмерами, представленными в таблице 8, являются исходные гэпмеры (см. таблицу 3), из которых были сконструированы остальные гэпмеры методом «микропрогулки» и которые показаны звездочкой. Эти 5-10-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') сегментами-крыльями, каждый из которых содержит 5 нуклеотидов. 3-14-3-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из четырнадцати 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждое из которых содержит 3 нуклеотида. 2-13-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из тринадцати 2'-дезоксинуклеотидов. Центральный гэп фланкирован у 5'-конца крылом, содержащим 2 нуклеотида, а у 3'-конца крылом, содержащим 5 нуклеотидов. В каждом мотиве (5-10-5, 3-14-3 и 2-13-5), каждый нуклеотид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеотид в 3'-сегменте-крыле имеют 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфортиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитидины. Термин «сайт инициации, являющийся мишенью» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен гэпмер. Термин «стоп-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер. Каждый гэпмер, представленный в таблице 8, нацелен на SEQ ID NO: 1 (GENBANK peг. № NM_000128.3).

Как показано в таблице 8, все 5-10-5-МОЕ гэпмеры, 3-14-3-МОЕ-гэпмеры и 2-13-5-МОЕ-гэпмеры, нацеленные на область-мишень, начинающуюся со старт-сайта-мишени 1275 и заканчивающуюся стоп-сайтом-мишенью 1318 (то есть в пределах нуклеотидных оснований 1275-1318) SEQ ID NO: 1, ингибируют мРНК фактора 11 по меньшей мере на 70%. Многие гэпмеры, включая 412223, 412224, 412225, 413482, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 416920, 416921, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416927, 416928, 416929, 416930, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416936, 416937, 416938, 416939, 416940, 416941, 416942, 416943, 416944, 416997, 416998, 416999, 417000, 417001, 417002, 417003, 417004, 417006, 417007, 417008, 417009, 417010, 417011, 417013, 417014, 417015, 417016, 417017, 417018, 417019 и 417020, дают по меньшей мере 80%-ный ингибирующий эффект. Гэпмеры, имеющие нижеследующие №№ ISIS: 412224, 416850, 416853, 416856, 416857, 416858, 416861, 416862, 416864, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416928, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416937, 416938, 416940, 416941, 416943, 416999, 417002, 416854 и 416859, дают по меньшей мере 90%-ный ингибирующий эффект.

Пример 4

Дозозависимое ингибирование человеческого фактора 11 в клетках HepG2 под действием антисмысловых соединений

Гэпмеры примера 3 (см. таблицы 4, 5, 6, 7 и 8), оказывающие ингибирующее действие in vitro на человеческий фактор 11, тестировали в различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 10000 клеток на лунку и трансфицировали реагентом липофектином вместе с антисмысловыми олигонуклеотидами, взятыми в концентрациях 9,375 нМ, 18,75 нМ, 37,5 нМ и 75 нМ, как показано в таблице 9. После обработки в течение примерно 16 часов, из клеток выделяли РНК и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зонда для человеческого фактора 11, RTS 2966. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам. Как проиллюстрировано в таблице 9, уровни мРНК фактора 11 в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, снижались в зависимости от дозы.

Гэпмеры также трансфицировали путем электропорации и измеряли уровень дозозависмого ингибирования человеческой мРНК фактора 11. Клетки высевали при плотности 20000 клеток на лунку и трансфицировали путем электропорации с использованием антисмыслового олигонуклеотида, взятого в концентрациях 0,7 мкМ, 2,2 мкМ, 6,7 мкМ и 20 мкМ, как показано в таблице 10. После обработки в течение примерно 16 часов, из клеток выделяли РНК, и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зонда для человеческого фактора 11, RTS 2966. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам. Как проиллюстрировано в таблице 10, уровни мРНК фактора 11 в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, снижались в зависимости от дозы.

Пример 5

Отбор и подтверждение эффективного дозозависимого ингибирования человеческого фактора 11 в клетках HepG2 под действием антисмысловых соединений

Гэпмеры, оказывающие значительное дозозависимое ингибирующее действие на человеческий фактор 11, как описано в примере 4, отбирали и тестировали в различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 10000 клеток на лунку и трансфицировали реагентом липофектином вместе с антисмысловыми олигонуклеотидами, взятыми в концентрациях 2,34 нМ, 4,69 нМ, 9,375 нМ, 18,75 нМ, 37,5 нМ и 75 нМ, как показано в таблице 11. После обработки в течение примерно 16 часов, из клеток выделяли РНК и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зонда для человеческого фактора 11, RTS 2966. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования человеческого фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам. Как показано в таблице 11, уровни мРНК фактора 11 в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, снижались в зависимости от дозы по сравнению с контролем.

Гэпмеры также трансфицировали путем электропорации и измеряли уровень дозозависимого ингибирования мРНК человеческого фактора 11. Клетки высевали при плотности 20000 клеток на лунку и трансфицировали путем электропорации с использованием антисмыслового олигонуклеотида, взятого в концентрациях 625 нМ, 1250 нМ, 2500 нМ, 5000 нМ, 10000 нМ и 20000 нМ, как показано в таблице 12. После обработки в течение примерно 16 часов, из клеток выделяли РНК и уровни мРНК человеческого фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зонда для человеческого фактора 11, RTS 2966. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора человеческого 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам. Как показано в таблице 12, уровни мРНК фактора 11 в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, снижались в зависимости от дозы по сравнению с контролем.

Пример 6

Отбор и подтверждение эффективного дозозависимого ингибирования человеческого фактора 11 в первичных гепатоцитах собакоподобных обезьян под действием антисмысловых соединений

Гэпмеры примера 4, оказывающие значительное дозозависимое ингибирующее действие in vitro на человеческий фактор 11, тестировали в различных дозах в первичных гепатоцитах собакоподобных обезьян. Клетки высевали при плотности 35000 клеток на лунку и трансфицировали путем электропорации с использованием антисмыслового олигонуклеотида, взятого в концентрациях 0,74 нМ, 2,2 нМ, 6,7 нМ, 20 нМ, 60 нМ и 180 нМ, как показано в таблице 13. После обработки в течение примерно 16 часов, из клеток выделяли РНК и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зонда для человеческого фактора 11, RTS 2966. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам. Как показано в таблице 13, уровни мРНК фактора 11 в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, снижались в зависимости от дозы по сравнению с контролем.

Пример 7

Отбор и подтверждение эффективного дозозависимого ингибирования человеческого фактора 11 в клетках НерВ3 под действием антисмысловых соединений с использованием гэпмеров

Гэпмеры примера 4, оказывающие ингибирующее действие in vitro на человеческий фактор 11, тестировали в различных дозах в человеческих клетках НерВ3. Клетки высевали при плотности 4000 клеток на лунку и трансфицировали с использованием реагента липофектина вместе с антисмысловым олигонуклеотидом, взятым в концентрациях 2,3 нМ, 4,7 нМ, 9,4 нМ, 18,75 нМ, 37,5 нМ и 75 нМ, как показано в таблице 14. После обработки в течение примерно 16 часов, из клеток выделяли РНК и уровни мРНК человеческого фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зонда для человеческого фактора 11, RTS 2966. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам. Как показано в таблице 14, уровни мРНК фактора 11 в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, снижались в зависимости от дозы по сравнению с контролем.

Гэпмеры также трансфицировали путем электропорации и измеряли уровень дозозависмого ингибирования мРНК человеческого фактора 11. Клетки высевали при плотности 20000 клеток на лунку и трансфицировали путем электропорации с использованием антисмыслового олигонуклеотида, взятого в концентрациях 41,15 нМ, 123,457 нМ, 370,37 нМ, 1111,11 нМ, 3333,33 нМ и 10000 нМ, как показано в таблице 15. После обработки в течение примерно 16 часов, из клеток выделяли РНК и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зонда для человеческого фактора 11, RTS 2966. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования человеческого фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам. Как показано в таблице 15, уровни мРНК фактора 11 в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, снижались в зависимости от дозы по сравнению с контролем.

Пример 8

Ингибирование мышиного фактора 11 в первичных мышиных гепатоцитах под действием антисмысловых соединений

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на мышиный фактор 11, конструировали в виде 5-10-5-МОЕ-гэпмеров, нацеленных на мышиный фактор 11 (последовательность GENBANK peг. № NM_028066.1, представленная здесь как SEQ ID NO: 6). Гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждое из которых содержит 5 нуклеотидов. Каждый нуклеотид в каждом сегменте-крыле имеет 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфортиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитидины. Антисмысловые олигонуклеотиды оценивали на их способность снижать уровни мышиной мРНК фактора 11 в первичных мышиных гепатоцитах.

Первичные мышиные гепатоциты обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами в концентрациях 6,25 нМ, 12,5 нМ, 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ и 200 нМ в течение примерно 24 часов. Из этих клеток выделяли РНК, и уровни мышиной мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зонда для мышиного фактора 11, RTS 2898 (последовательность прямого праймера ACATGACAGGCGCGATCTCT, представленная здесь как SEQ ID NO: 7; последовательность обратного праймера TCTAGGTTCACGTACACATCTTTGC, представленная здесь как SEQ ID NO: 8; последовательность зонда TTCCTTCAAGCAATGCCCTCAGCAATX, представленная здесь как SEQ ID NO: 9). Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Некоторые мышиные антисмысловые олигонуклеотиды давали дозозависимое снижение уровней мРНК фактора 11.

Пример 9

Ингибирование мышиного фактора 11 в первичных мышиных гепатоцитах под действием перекрестно-реагирующих антисмысловых олигонуклеотидов

Антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на мышиную нуклеиновую кислоту мышиного фактора 11, тестировали на их влияние на мРНК фактора 11 in vitro. Первичные мышиные гепатоциты, культивированные при плотности 10000 клеток на лунку, обрабатывали антисмысловым олигонуклеотидом в концентрации 100 нМ. После обработки в течение примерно 24 часов, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК мышиного фактора 11 с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, представленные в таблице 16, были сконструированы в виде 5-10-5-МОЕ-гэпмеров. Эти гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') сегментами-крыльями, каждый из которых содержит 5 нуклеотидов. Каждый нуклеотид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеотид в 3'-сегменте-крыле имеют 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфортиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитидины. Термин «мышиный сайт инициации, являющийся мишенью» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен гэпмер. Термин «мышиный стоп-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер. Все перечисленные мышиные олигонуклеотиды перекрестно реагируют с мРНК мышиного фактора 11 (GENBANK peг. № NM_028066.1), представленной здесь как SEQ ID NO: 6 и с мРНК человеческого фактора 11 (GENBANK peг. № NM_000128.3), представленной здесь как SEQ ID NO: 1. Термин «человеческий сайт инициации, являющийся мишенью» означает самый крайний 5'-нуклеотид в человеческой мРНК (GENBANK peг. № NM_000128.3), на которую нацелен указанный антисмысловой олигонуклеотид. Термин «человеческий стоп-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 3'-нуклеотид в человеческой мРНК (GENBANK peг. № NM_000128.3), на которую нацелен указанный антисмысловой олигонуклеотид. Термин «число несоответствий» означает число несоответствий между мышиным олигонуклеотидом и последовательностью человеческой мРНК.

Пример 10

Ингибирование in vivo мышиного фактора 11 антисмысловыми олигонуклеотидами Некоторые антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на мРНК мышиного фактора 11 (последовательность GENBANK peг. № NM_028066.1, представленную здесь как SEQ ID NO: 6) и обнаруживающие статистически значимое дозозависимое ингибирование, оценивали in vivo. Мышей BALB/c обрабатывали последовательностью ISIS 404057 (TCCTGGCATTCTCGAGCATT, старт-сайт-мишенью 487, представленной здесь как SEQ ID NO: 10) и последовательностью ISIS 404071 (TGGTAATCCACTTTCAGAGG, старт-сайт-мишенью 869, представленной здесь как SEQ ID NO: 11).

Обработка

Мышам BALB/c два раза в неделю в течение 3 недель инъецировали 5 мг/кг, 10 мг/кг, 25 мг/кг или 50 мг/кг ISIS 404057 или ISIS 404071. Мышам контрольной группы два раза в неделю в течение 3 недель инъецировали забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS). Через 5 дней после введения последней дозы, мышей умерщвляли. Целую печень брали для анализа РНК, а плазму брали для анализа свертывания крови (ПВ и АПТВ) и анализа на белок.

Анализ РНК

Из ткани печени экстрагировали РНК для анализа на фактор 11, проводимого с помощью ПЦР в реальном времени. Как показано в таблице 17, антисмысловые олигонуклеотиды давали дозозависимое снижение уровней мышиного фактора 11 по сравнению с PBS-контролем. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к контролю.

Анализ ПВ и АПТВ

Протромбиновое время (ПВ) и активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) измеряли с использованием обедненной тромбоцитами плазмы (РРР), взятой у мышей, обработанных последовательностями ISIS 404057 и ISIS 404071. Величины ПВ и АПТВ, представленные в таблице 18, выражали в Международных величинах нормализованных отношений (INR). Величины INR для ПВ и АПТВ вычисляли путем деления величин ПВ или АПТВ для каждой экспериментальной группы (то есть у животных, обработанных 5 мг/кг, 10 мг/кг, 25 мг/кг и 50 мг/кг ISIS 404057 или ISIS 404071) на величины ПВ или АПТВ для PBS-обработанной группы. Затем это отношение возводили в степень, равную Международной величине показателя чувствительности (ISI) используемого тканевого фактора. Как показано в таблице 18, ПВ значительно не увеличивалось у мышей, обработанных ISIS 404057 или ISIS 404071. Однако, АПТВ у мышей, обработанных ISIS 404057 или ISIS 404071, увеличивалось в зависимости от дозы. Эти данные дают основание предположить, что снижение уровня фактора 11 под действием антисмысловых олигонуклеотидов влияет на путь контактной активации, но не влияет на внешний путь реакции свертывания крови.

Анализ на белок

Уровень профермента фактора 11 в плазме мышей, обработанных ISIS 404071, измеряли с помощью анализа на F11, проводимого исходя из оценки времени свертывания крови. Время свертывания крови определяли с двумя повторностями на полуавтоматическом оборудовании для оценки свертывания крови ST4 (Diagnostica Stago, NJ). Тридцать микролитров обработанной цитратом пробы плазмы, разведенной 1/20 в HEPES-NaCl-буфере с BSA, инкубировали с 30 мкл реагента для АПТВ (реагент фактора 3 тромбоцитов плюс состоящий из частиц активатор) и 30 мкл обработанной цитратом плазмы, дефицитной по фактору 11 (врожденное заболевание человека, George King Bio-Medical Inc.) при 37°C для инициации свертывания крови. Результаты интерполировали по стандартной кривой для серийного разведения цитрат-содержащей контрольной мышиной плазмы.

Как показано в таблице 19, обработка ISIS 404071 приводила к значимому дозозависимому снижению уровня белка фактора 11. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к PBS-контролю.

Пример 11

Эффект in vivo ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом у животных с моделью FeCl₃-индуцированного венозного тромбоза (ВТ) по сравнению с варфарином

Обработка

ISIS 404071 и варфарин (COUMADIN) тестировали у мышей с моделью FeCl₃-индуцированного ВТ. Мышей BALB/c шести групп обрабатывали путем подкожного введения 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг или 40 мг/кг ISIS 404071 два раза в неделю в течение 3 недель. Через два дня после введения последней дозы ISIS 404071, мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 150 мг/кг кетамина в смеси с 10 мг/кг ксилазина. Мышей BALB/c других шести групп обрабатывали 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг и 5 мг/кг варфарина путем ежедневного внутрибрюшинного введения в течение 6 дней. Через четыре часа после введения последней дозы варфарина, мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 150 мг/кг кетамина в смеси с 10 мг/кг ксилазина. Мышей BALB/c двух контрольных групп обрабатывали PBS путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель. Через два дня после введения последней дозы PBS, мышей обеих групп анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 150 мг/кг кетамина в смеси с 10 мг/кг ксилазина. Образование тромбов индуцировали путем введения FeCl₃ мышам всех групп, за исключением мышей первой контрольной группы.

У мышей, подвергаемых FeCl₃-обработке, образование тромбов индуцировали путем нанесения непосредственно на полую вену кусочка фильтровальной бумаги (2×4 мм), предварительно пропитанной 10% раствором FeCl₃. После обработки в течение 3 минут, фильтровальную бумагу удаляли. Через тридцать минут после нанесения фильтровальной бумаги, вену фиксированной длины, имеющую тромб, вырезали для анализа на тромбоциты. Печень брали для анализа на РНК.

Анализ на РНК

Из ткани печени экстрагировали РНК для анализа на фактор 11, проводимого с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по сравнению с PBS-контролем. Как показано в таблице 20, обработка олигонуклеотидом ISIS 404071 приводила к значимому дозозависимому снижению уровня мРНК фактора 11 по сравнению с PBS-контролем. И наоборот, обработка варфарином не приводила к значимому снижению уровня фактора 11 по сравнению с PBS-контролем.

Количественная оценка тромбоцитарной формулы

Количественную оценку тромбоцитарного фактора-4 (PF-4), проводимую с помощью ПЦР в реальном времени, осуществляли для определения количества тромбоцитов в полой вене как показателя образования тромба. Результаты представлены как процент PF-4 у мышей, обработанных ISIS 404071 или варфарином, по отношению к PF-4 у двух контрольных PBS-обработанных групп. Как показано в таблице 21, обработка олигонуклеотидом ISIS 404071 приводила к дозозависимому снижению PF-4 по сравнению с PBS-контролем для доз 5 мг/кг и выше. Обработка варфарином приводила к снижению уровня PF-4 по сравнению с PBS-контролем при дозах 2 мг/кг и выше. Поэтому, снижение уровня фактора 11 под действием рассматриваемых здесь соединений является эффективным для ингибирования образования тромбов и сгустков крови.

Пример 12

Эффект in vivo ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом по сравнению с варфарином в анализе на кровотечение из хвоста

Обработка

Кровотечение из хвоста оценивали для того, чтобы определить, приводит ли обработка ISIS 404071 или варфарином к внутреннему кровоизлиянию у мышей. ISIS 404071 и варфарин (COUMADIN) оценивали в анализе на кровотечение из хвоста. Мышей BALB/c шести групп обрабатывали 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг или 40 мг/кг ISIS 404071 путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель. Мышей BALB/c других 6 групп обрабатывали 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг и 5 мг/кг варфарина путем ежедневного внутрибрюшинного введения в течение 6 дней. Мышей BALB/c отдельной контрольной группы обрабатывали PBS, который подкожно вводили два раза в неделю в течение 3 недель.

Анализ на кровотечение из хвоста

Через два дня после последней обработки ISIS 404071, варфарином или PBS, мышей помещали в камеру для анализа на кровотечение из хвоста. В данной камере, мышей анестезировали изофлураном, и стерильными ножницами отрезали небольшой кусочек хвоста (приблизительно 4 мм от кончика). Затем отрезанный кусочек хвоста сразу помещали в 15-миллилитровую пробирку Falcon, заполненную приблизительно 10 мл 0,9% буферного раствора NaCl, нагретого до 37°С. Забор крови осуществляли в течение 40 минут. Пробирки, заполненные физиологическим раствором, взвешивали до и после кровотечения. Результаты представлены в таблице 22.

Обработка ISIS 404071 не влияла на кровотечение по сравнению с PBS-обработанными мышами. Однако, у мышей, обработанных варфарином, наблюдалось усиление кровотечения по сравнению с контрольными PBS-обработанными мышами. Повышенные дозы варфарина прямо пропорционально коррелировали с увеличением потери крови. Полученные данные позволяют предположить, что рассматриваемые здесь соединения имеют низкую гемморагическую активность, особенно по сравнению с варфавином. Эти данные вместе с результатами, представленными в примере 11, позволяют предположить, что ингибирование фактора 11 описанными здесь соединениями является эффективным для достижения антитромбоцитарной активности и не ассоциируется с каким-либо риском возникновения кровотечения.

Пример 13

In vivo влияние ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом и варфарином на ПВ и АПТВ

Обработка

ПВ и АПТВ измеряли с использованием обедненной тромбоцитами плазмы (РРР), взятой у мышей, обработанных ISIS 404071 или варфарином. Мышей BALB/c шести групп обрабатывали 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг или 40 мг/кг ISIS 404071 путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель. Мышей BALB/c других 6 групп обрабатывали 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг и 5 мг/кг варфарина путем ежедневного внутрибрюшинного введения в течение 6 дней. Мышей BALB/c контрольной группы обрабатывали PBS путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель. Через два дня после введения последней дозы брали РРР и проводили анализы на ПВ и АПТВ.

Анализ на ПВ и АПТВ

Величины ПВ и АПТВ, представленные в таблице 16, были выражены как Международные величины нормализованных отношений (INR). Величины INR для ПВ и АПТВ были определены путем деления величины ПВ или АПТВ для каждой экспериментальной группы (то есть у животных, обработанных 5 мг/кг, 10 мг/кг, 25 мг/кг и 50 мг/кг ISIS 404071) на величину ПВ или АПТВ для PBS-обработанной группы. Затем это отношение возводили в степень, равную Международной величине показателя чувствительности (ISI) используемого тканевого фактора. Как показано в таблице 23, у мышей, обработанных варфарином, ПВ значительно увеличивалось в зависимости от дозы. У мышей, обработанных варфарином, АПТВ увеличивалось, в частности, при дозах 1 мг/кг и выше. ISIS 404071 не оказывал значительного влияния на ПВ, но увеличивал АПТВ, однако, такое увеличение не было таким значительным, как у мышей, обработанных варфарином. Эти данные дают основание предположить, что ISIS 404071 влияет на путь контактной активации, но не влияет на внешний путь реакции свертывания крови, тогда как варфарин влияет и на путь контактной активации и на внешний путь реакции свертывания крови.

Пример 14

Эффект in vivo ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом у животных с моделью FeCl₃-индуцированного венозного тромбоза (ВТ) по сравнению с апиксабаном

Обработка

ISIS 404071 и апиксабан тестировали у мышей с моделью FeCl₃-индуцированного ВТ. Мышей BALB/c шести групп обрабатывали путем подкожного введения 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг или 40 мг/кг ISIS 404071 два раза в неделю в течение 3 недель. Через два дня после введения последней дозы ISIS 404071, мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 150 мг/кг кетамина в смеси с 10 мг/кг ксилазина. Мышей BALB/c других шести групп обрабатывали 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг и 5 мг/кг апиксабана путем однократного подкожного введения. Через двадцать минут после введения апиксабана, мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 150 мг/кг кетамина в смеси с 10 мг/кг ксилазина. Мышей BALB/c двух контрольных групп обрабатывали PBS путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель. Через два дня после введения последней дозы PBS, мышей обеих групп анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 150 мг/кг кетамина в смеси с 10 мг/кг ксилазина. Образование тромбов индуцировали путем введения FeCb мышам всех групп, за исключением мышей первой контрольной группы.

Анализ на РНК

Из ткани печени экстрагировали РНК для анализа на фактор 11, проводимого с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к PBS-контролю. Как показано в таблице 24, обработка олигонуклеотидом ISIS 404071 приводила к значимому дозозависимому снижению уровня мРНК фактора 11 по сравнению с PBS-контролем. И наоборот, обработка апиксабаном не приводила к значимому снижению уровня фактора 11 по сравнению с PBS-контролем.

Количественная оценка тромбоцитарной формулы

Количественную оценку тромбоцитарного фактора-4 (PF-4), проводимую с помощью ПЦР в реальном времени, осуществляли для определения количества тромбоцитов в полой вене как показателя образования тромба. Как показано в таблице 25, обработка олигонуклеотидом ISIS 404071 приводила к снижению уровня PF-4 по сравнению с PBS-контролем. Обработка апиксабаном также приводила к снижению уровня PF-4 по сравнению с PBS-контролем. Результаты представлены как процент PF-4 у мышей, обработанных ISIS 404071 или апиксабаном, по отношению к PF-4 у мышей двух PBS-обработанных контрольных групп.

Пример 15

Эффект in vivo ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом по сравнению с апиксабаном в анализе на кровотечение из хвоста

Обработка

Кровотечение из хвоста оценивали для того, чтобы определить, приводит ли обработка ISIS 404071 или апиксабаном к внутреннему кровоизлиянию у мышей. ISIS 404071 и апиксабан оценивали в анализе на кровотечение из хвоста. Мышей BALB/c шести групп обрабатывали 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг или 40 мг/кг ISIS 404071 путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель. Мышей BALB/c других 6 групп обрабатывали 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг и 5 мг/кг апиксабана путем введения одной подкожной дозы. Мышей BALB/c отдельной контрольной группы обрабатывали PBS, который подкожно вводили два раза в неделю в течение 3 недель.

Анализ на кровотечение из хвоста

Через два дня после последней обработки ISIS 404071, апиксабаном или PBS, мышей помещали в камеру для анализа на кровотечение из хвоста. В данной камере, мышей анестезировали, и стерильными ножницами отрезали небольшой кусочек хвоста (приблизительно 4 мм от кончика). Затем отрезанный кусочек хвоста сразу помещали в 15-миллилитровую пробирку Falcon, заполненную приблизительно 10 мл 0,9% буферного раствора NaCl, нагретого до 37°С. Забор крови осуществляли в течение 40 минут. Пробирки, заполненные физиологическим раствором, взвешивали до и после забора крови.

Как показано в таблице 26, обработка ISIS 404071 не влияла на кровотечение по сравнению с PBS-обработанными мышами. Однако, у мышей, обработанных апиксабаном, наблюдалось усиление кровотечения по сравнению с PBS-контролем. Повышенные дозы апиксабана прямо пропорционально коррелировали с увеличением потери крови. Полученные данные позволяют предположить, что рассматриваемые здесь соединения имеют низкую гемморагическую активность, особенно по сравнению с апиксабаном. Эти данные вместе с результатами, представленными в примере 14, позволяют предположить, что ингибирование фактора 11 описанными здесь соединениями является эффективным для достижения антитромбоцитарной активности и не ассоциируется с каким-либо риском возникновения кровотечения.

Пример 16

Ex vivo эффект ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом в комбинации с LOVENOX

Обработка

Мышей BALB/c трех групп обрабатывали 10 мг/кг, 20 мг/кг или 40 мг/кг ISIS 404071 путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель. Мышей контрольной группы обрабатывали PBS путем введения два раза в неделю в течение 3 недель. Через пять дней после введения последней дозы, мышей умерщвляли и брали плазму. В полученную плазму ex vivo вводили низкомолекулярный (LMW) гепарин LOVENOX в различных концентрациях, составляющих 0 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 5,0 мкг/мл и 7,5 мкг/мл. ПВ и АПТВ измеряли через 20 минут после введения LOVENOX.

Анализ на ПВ и АПТВ

Как показано в таблице 27, обработка LOVENOX приводила к дозозависимому увеличению ПВ. Обработка ISIS 404071 не приводила к значительному увеличению ПВ. Обработка ISIS 404071 не оказывала значительного влияния на ПВ. Это указывало на то, что обработка плазмы ISIS 404071 и LOVENOX не оказывала комбинированного действия на ПВ.

Как показано в таблице 28, обработка LOVENOX приводила к дозозависимому увеличению АПТВ. Обработка ISIS 404071 также приводила к дозозависимому увеличению АПТВ. Кроме того, как было обнаружено, обработка комбинацией ISIS 404071 и LOVENOX оказывала синергическое действие на АПТВ.

Пример 17

In vivo эффект ингибирования мышиного фактора 11 под действием антисмыслового олигонуклеотида в комбинации с LOVENOX у мышей с моделью FeCl₃-индуцированного венозного тромбоза (ВТ)

Обработка

Комбинацию ISIS 404071 и LOVENOX тестировали у мышей с моделью FeCl₃-индуцированного ВТ. Мышей BALB/c четырех групп обрабатывали путем подкожного введения 15 мг/кг, 30 мг/кг, 45 мг/кг или 60 мг/кг LOVENOX один раз в день в течение 3 дней. Мышей BALB/c других 4 групп обрабатывали 20 мг/кг ISIS 404071 путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель. После введения последней дозы ISIS 404071, мышей обрабатывали 15 мг/кг, 30 мг/кг, 45 мг/кг или 60 мг/кг LOVENOX путем подкожного введения один раз в день в течение 3 дней. Мышей BALB/c двух контрольных групп обрабатывали PBS путем подкожного введения два раза в неделю в течение трех недель. Образование тромбов индуцировали путем введения FeCl₃ всем мышам, за исключением мышей первой контрольной группы. Всех мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 150 мг/кг кетамина в смеси с 10 мг/кг ксилазина.

Количественная оценка тромбоцитарной формулы

Количественную оценку PF-4, проводимую с помощью ПЦР в реальном времени, осуществляли для определения количества тромбоцитов в полой вене как показателя образования тромба. Как показано в таблице 29, обработка LOVENOX приводила к снижению уровня PF-4 по сравнению с PBS-контролем. Обработка LOVENOX в комбинации с ISIS 404071 приводила к значительному снижению уровня PF-4 по сравнению с обработкой одним LOVENOX.

Пример 18

Эффект in vivo ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом в комбинации с LOVENOX в анализе на кровотечение

Обработка

Кровотечение из хвоста оценивали для того, чтобы определить, приводит ли обработка ISIS 404071 и LOVENOX к внутреннему кровоизлиянию у мышей. ISIS 404071 вводили подкожно в дозе 20 мг/кг два раза в неделю в течение 3 недель мышам BALB/c четырех групп, a LOVENOX вводили подкожно в различных дозах, составляющих 15 мг/кг, 30 мг/кг, 45 мг/кг и 60 мг/кг, один раз в день в последние три дня обработки ISIS 404071. Мышам BALB/c пятой группы подкожно вводили ISIS 404071 в дозе 20 мг/кг два раза в неделю в течение 3 недель. Мышам BALB/c шестой группы подкожно вводили PBS два раза в неделю в течение трех недель в качестве контроля.

Анализ на кровотечение из хвоста

Через два дня после последней обработки, мышей помещали в камеру для анализа на кровотечение из хвоста. В данной камере, мышей анестезировали изофлураном, и стерильными ножницами отрезали небольшой кусочек хвоста (приблизительно 4 мм от кончика). Затем отрезанный кусочек хвоста сразу помещали в 15-миллилитровую пробирку Falcon, заполненную приблизительно 10 мл 0,9% буферного раствора NaCl, нагретого до 37°С. Забор крови осуществляли в течение 40 минут. Пробирки, заполненные физиологическим раствором, взвешивали до и после кровотечения.

Как показано в таблице 30, обработка LOVENOX приводила к повышению кровотечения у мышей по сравнению с PBS-обработанными мышами. Повышенные дозы LOVENOX прямо пропорционально коррелировали с усилением потери крови. Обработка комбинацией ISIS 404071 и LOVENOX не приводила к значительному увеличению кровотечения, тогда как обработка мышей одним лишь LOVENOX приводила к усилению потери крови.

Пример 19

In vivo влияние ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом в комбинации с LOVENOX на ПВ и АПТВ

Обработка

ПВ и АПТВ измеряли с использованием обедненной тромбоцитами плазмы (РРР), взятой у мышей, обработанных комбинацией ISIS 404071 и LOVENOX. Мышам BALB/c первой группы подкожно вводили ISIS 404071 в дозе 25 мг/кг два раза в неделю в течение 3 недель. Через 5 дней после введения последней дозы ISIS 404071, у этих мышей брали плазму. Мышам BALB/c второй группы подкожно вводили LOVENOX в дозе 20 мг/кг один раз в день в течение трех дней. Через 4 часа после введения последней дозы LOVENOX, у этих мышей брали плазму. Мышам BALB/c третьей группы подкожно вводили ISIS 404071 в дозе 20 мг/кг два раза в неделю в течение 3 недель, а через 2 дня после введения последней дозы ISIS 404071 подкожно вводили LOVENOX в дозе 20 мг/кг один раз в день. Через 4 часа после введения последней дозы LOVENOX, у этих мышей брали плазму. Мышам четвертой группы подкожно вводили PBS два раза в неделю в течение трех недель в качестве контроля. Через 5 дней после введения последней дозы, у этих мышей брали плазму.

Анализ на ПВ и АПТВ

Величины ПВ и АПТВ, представленные в таблице 31, были выражены как Международные величины нормализованных отношений (INR). Как показано в таблице 31, обработка ISIS 404071, LOVENOX или комбинацией ISIS 404071 и LOVENOX не оказывала значительного влияния на ПВ. Полученные данные позволяют предположить, что обработка комбинацией ISIS 404071 и LOVENOX не оказывает комбинированного действия на ПВ. Кроме того, как показано в таблице 31, обработка LOVENOX и обработка комбинацией ISIS 404071 и LOVENOX приводили к увеличению АПТВ. Полученные данные позволяют предположить, что обработка комбинацией ISIS 404071 и LOVENOX дает аддитивный эффект в отношении АПТВ.

Пример 20

In vivo влияние ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом в комбинации с апиксабаном на ПВ и АПТВ

Обработка

ПВ и АПТВ измеряли с использованием обедненной тромбоцитами плазмы (РРР), взятой у мышей, обработанных комбинацией ISIS 404071 и апиксабана. Мышам BALB/c первой группы подкожно вводили ISIS 404071 в дозе 25 мг/кг два раза в неделю в течение 3 недель. Через 5 дней после введения последней дозы ISIS 404071, у этих мышей брали плазму. Мышам BALB/c второй группы подкожно вводили апиксабан в дозе 6 мг/кг два раза в день в течение трех дней. Через 20 минут после введения последней дозы апиксабана, у этих мышей брали плазму. Мышам BALB/c третьей группы подкожно вводили ISIS 404071 в дозе 20 мг/кг два раза в неделю в течение 3 недель, и в последние три дня обработки ISIS 404071 ежедневно подкожно вводили апиксабан в дозе 6 мг/кг два раза в день. Через 20 минут после введения последней дозы апиксабана, у этих мышей брали плазму. Мышам четвертой группы подкожно вводили PBS два раза в неделю в течение 3 недель в качестве контроля. Через 5 дней после введения последней дозы PBS, у этих мышей брали плазму.

Анализ на ПВ и АПТВ

Величины ПВ и АПТВ, представленные в таблице 32, были выражены как Международные величины нормализованных отношений (INR). Как показано в таблице 32, обработка ISIS 404071 не оказывала значительного влияния на ПВ. Однако, обработка апиксабаном и комбинацией апиксабана и ISIS 404071 приводила к увеличению ПВ. Кроме того, как показано в таблице 32, обработка апиксабаном, ISIS 404071 и комбинацией ISIS 404071 и апиксабана приводила к увеличению АПТВ.

Пример 21

In vivo влияние ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом в комбинации с варфарином на ПВ и АПТВ

Обработка

ПВ и АПТВ измеряли с использованием обедненной тромбоцитами плазмы (РРР), взятой у мышей, обработанных комбинацией ISIS 404071 и варфарина. Мышам BALB/c двух групп подкожно вводили 25 мг/кг или 50 мг/кг ISIS 404071 два раза в неделю в течение 3 недель. Через 5 дней после введения последней дозы ISIS 404071, у мышей каждой группы брали плазму. Мышей BALB/c третьей группы обрабатывали 2 мг/кг варфарина один раз в день в течение 5 дней. Через 6 часов после введения последней дозы варфарина, у мышей брали плазму. Мышей BALB/c двух других групп обрабатывали 25 мг/кг или 50 мг/кг ISIS 404071 путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель, и в последние 5 дней обработки ISIS 404071, мышам ежедневно подкожно вводили варфарин в дозе 2 мг/кг. Через 6 часов после последней обработки варфарином, у мышей каждой группы брали плазму. Мышам BALB/c последней группы подкожно вводили PBS два раза в неделю в течение 3 недель в качестве контроля. Через 5 дней после последней обработки PBS, у этих мышей брали плазму.

Анализ на ПВ и АПТВ

Величины ПВ и АПТВ, представленные в таблице 33, были выражены как Международные величины нормализованных отношений (INR). Как показано в таблице 33, обработка PBS или ISIS 404071 в любой дозе не оказывала влияния на ПВ. Однако, обработка 2 мг/кг варфарина, 25 мг/кг ISIS 404071 в комбинации с 2 мг/кг варфарина и 50 мг/кг ISIS 404071 в комбинации с 2 мг/кг варфарина приводила к увеличению ПВ. Полученные данные позволяют предположить, что обработка комбинацией ISIS 404071 и варфарина оказывала аддитивное действие на ПВ. Кроме того, как показано в таблице 33, обработка ISIS 404071 и варфарином оказывала воздействие на АПТВ. Обработка комбинацией ISIS 404071 и варфарина приводила к большему увеличению АПТВ, чем обработка любым из отдельно взятых лекарственных средств. Полученные данные позволяют предположить, что обработка комбинацией ISIS 404071 и варфарина дает синергический эффект в отношении АПТВ.

Пример 22

Антитромботический эффект in vivo ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом в отношении тромбоза брыжеечной вены у мышей

Обработка

Мышам C57BL/6 первой группы подкожно вводили ISIS 404071 два раза в неделю в течение трех недель в дозе 50 мг/кг. Мышам C57BL/6 второй группы два раза в неделю в течение трех недель подкожно вводили 50 мг/кг контрольного олигонуклеотида ISIS 405277 (AAGGACCTACACTATGGAAT; антисмыслового олигонуклеотида для фактора 2), представленного здесь как SEQ ID NO: 12.

Получение тромбоцитов

У не подвергавшихся ранее обработке мышей C57BL/6, из ретроорбитального венозного сплетения брали кровь путем пункции, и эту кровь собирали в полипропиленовые пробирки, содержащие 300 мкл гепарина (30 ед/мл). Богатую тромбоцитами плазму (PRP) получали путем центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 минут. Затем PRP переносили в свежие пробирки, содержащие 2 мкл простагландина-I₂ (PGI₂) (2 мкг/мл) и инкубировали при 37°С в течение 5 минут. После центрифугирования при 2600 об/мин, осадок ресуспендировали в 1 мл модифицированного раствора Тироде-буфера HEPES (137 мМ NaCl, 0,3 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ KCl, 12 мМ NaHCO₃, 5 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 0,35% BSA, рН 7,2), содержащего 2 мкл PGI₂, и инкубировали при 37°С в течение 5 минут. Суспендированный осадок центрифугировали при 2600 об/мин в течение 5 минут. Для удаления PGI₂, стадию промывки повторяли два раза и тромбоциты подвергали флуоресцентному мечению 2,5 мкг/мл кальцеина AM (Molecular Probes, Eugene, OR) в течение 10 минут при комнатной температуре.

Микроскопический анализ жизненно важных органов на тромбоз

Мышам C57BL/6, обработанным ISIS 404071 и контрольным олигонуклеотидом, внутривенно инъецировали флуоресцентно меченные тромбоциты. Этих мышей анестезировали 2,5% авертином и в стенке брюшной полости делали разрез для обнажения брыжееечных вен, имеющих диаметр 250-300 мкм и скорость сдвига приблизительно 150 с^-1. Во время всего эксперимента, обнаженную брыжейку хранили во влажном состоянии путем периодического опрыскивания подогретым (37°С) PBS. Затем брыжейку просвечивали стабилизированным источником постоянного тока при 12 В, 100 В. Вены визуализировали на инвертированном микроскопе Цейсса (Германия) Axiovert 135 (объектив 32Х), подсоединенном к самописцу для видеозаписи в формате S-VHS (AG-6730; Panasonic, Tokyo, Japan) с использованием видеокамеры на ПЗС (Hamamatsu Photonic Systems, Hamamatsu City, Japan). Скорость группы специализированных эритроцитов (V_rbc) измеряли с использованием оптического допплеровского измерителя скорости (Microcirculation Research Institute, Texas A&M College of Medicine, College Station, TX). Скорость сдвига венулы (τ) вычисляли исходя из закона Пуазейля для ньютоновской жидкости τ=8(V_mean/D_v), где D_v означает диаметр венулы, a V_mean определяют исходя из значения V_rbC, полученного по уравнению эмпирической корреляции V_mean=V_rbc/l,6.

Результаты анализа

Тромбоз брыжеечной вены инициировали через два дня после последней инъекции антисмыслового олигонуклеотида. Тромбоз индуцировали путем нанесения на брыжеечную вену, на 5 минут, бумаги Whatman, пропитанной 10%-раствором FeCl₃. Мониторинг вены проводили в течение 40 минут или до ее закупорки. Время до образования первого тромба диаметром 30-50 мкм и время до остановки кровотока составляло 30 секунд.

Образование тромбов (диаметром 30 мкм) наблюдалось у мышей, обработанных ISIS 404071, через 14,8±1,7 минут. У контрольных мышей, образование тромбов (диаметром 30 мкм) наблюдалось через 8,9±0,6 минут. У контрольных мышей закупоривающие тромбы образовывались через 19,3±0,8 минут, и наблюдалась закупорка всех пораженных венул. В противоположность этому, закупорка большинства вен у мышей, обработанных ISIS 404071, не наблюдалась, и эта закупорка наблюдалась через 40 минут после повреждения, когда наблюдения завершали. При этом закупорка вен наблюдалась у ISIS 404071-обработанных мышей только через 29,5 минут, и эти вены снова открывались за 5 минут до конца исследования.

Пример 23

Действие смыслового олигонуклеотида-антидота на in vivo ингибирование мышиного фактора 11 антисмысловым соединением у мышей BALB/c

Обработка

Действие смыслового олигонуклеотида, специфичного к ISIS 404071, в качестве антидота, тестировали у мышей BALB/c. Мышам BALB/c первой группы подкожно вводили ISIS 404071 два раза в неделю в течение трех недель в дозе 40 мг/кг. Мышам BALB/c второй группы подкожно вводили ISIS 404057 два раза в неделю в течение трех недель в дозе 40 мг/кг. Через 48 часов после последней обработки ISIS 404071 или 404057, мышам обеих групп подкожно вводили одну инъекцию 90 мг/кг ISIS 404071-специфического антидота, ISIS 418026 (CCTCTGAAAGTGGATTACCA; комплементарного ISIS 404071), представленного здесь как SEQ ID NO: 13. Мышам BALB/c третьей группы подкожно вводили ISIS 404071 два раза в неделю в течение трех недель в дозе 40 мг/кг. После последней обработки ISIS 404071, мышам подкожно инъецировали PBS. Мышам BALB/c четвертой группы подкожно вводили ISIS 404057 два раза в неделю в течение трех недель в дозе 40 мг/кг. После последней обработки ISIS 404057, мышам подкожно инъецировали PBS. Через 12 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 7 дней и 14 дней после введения антидота, 4 мышей от каждой группы умерщвляли. Для анализа на РНК брали всю печень, а для анализа на АПТВ брали РРР.

Анализ на РНК

РНК экстрагировали из ткани печени для анализа на фактор 11 с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к PBS-контролю. Как показано в таблице 34, у мышей, обработанных ISIS 404071 в отсутствии антидота, наблюдалось прогрессирующее снижение уровня ингибирования в течение периода наблюдения, составляющего 14 дней. Однако, у мышей, обработанных ISIS 404071 и антидотом, в отличие от мышей, которым не вводили антидот, также наблюдалось быстрое снижение уровня ингибирования за период наблюдения в 14 дней. Как показано в таблице 34, обработка ISIS 418026 не оказывала влияния на ингибирование экспрессии мРНК фактора 11 у ISIS 404057-обработанных мышей.

Анализ на АПТВ

Как показано в таблице 35, у мышей, обработанных ISIS 404071 и антидотом (ISIS 418026), наблюдалось прогрессирующее снижение АПТВ за период наблюдения в 14 дней по сравнению с мышами, обработанными ISIS 404071 без антидота.

Пример 24

Действие антидота, а именно, белка фактора 7а на in vivo ингибирование мышиного фактора 11 антисмысловым соединением у мышей BALB/c

Обработка

Действие человеческого белка фактора 7а (фактора VIIa) в качестве антидота для ISIS 404071 тестировали у мышей BALB/c. Мышей BALB/c двух экспериментальных групп обрабатывали 20 мг/кг ISIS 404071 путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель. Мышей BALB/c двух контрольных групп обрабатывали PBS путем подкожного введения два раза в неделю в течение 3 недель. Образование тромбов индуцировали FeCl₃ у всех мышей, за исключением мышей первой контрольной группы. За 15 минут до FeCl₃-обработки, мышей первой экспериментальной группы обрабатывали 5 мкг/кг антидота, а именно, человеческого белка фактора 7а (продукт №407act, American Diagnostica Inc.). Через два дня после введения последней дозы, всех мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 150 мг/кг кетамина в смеси с 10 мг/кг ксилазина.

Количественная оценка тромбоцитарной формулы

Количественную оценку тромбоцитарного фактора-4 (PF-4), проводимую с помощью ПЦР в реальном времени, осуществляли для определения количества тромбоцитов в полой вене как показателя образования тромба. Результаты представлены как процент PF-4 у мышей, обработанных и не обработанных антидотом, по отношению к PF-4 у мышей двух PBS-обработанных контрольных групп. Как показано в таблице 36, у животных, обработанных антидотом, то есть, человеческим белком фактора 7а, уровень экспрессии PF-4 превышал уровень экспрессии PF-4 у животных, обработанных только ISIS 404071. Полученные данные показали, что человеческий фактор 7а с успехом обеспечивает сохранение эффекта ингибирования антисмысловым олигонуклеотидом.

Пример 25

In vivo ингибирование мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом у мышей с моделью индуцированного коллагеназой внутримозгового кровоизлияния

Обработка

Действие ISIS 404071 и варфарина (COUMADIN) оценивали на модели индуцированного коллагеназой внутримозгового кровоизлияния. Мышам BALB/c первой группы подкожно вводили ISIS 404071 два раза в неделю в течение двух недель в дозе 40 мг/кг. Мышам BALB/c второй группы подкожно вводили варфарин два раза в неделю в течение двух недель в дозе 2 мг/кг. Мышам BALB/c третьей группы подкожно вводили ISIS 421208 (TCGGAAGCGACTCTTATATG, имеющий 8 несоответствий по сравнению с мышиным фактором 11 и представленный здесь как SEQ ID NO: 14) два раза в неделю в течение двух недель в дозе 40 мг/кг. Мышам BALB/c четвертой группы вводили PBS два раза в неделю в течение двух недель.

Через два дня после введения последней дозы, всех мышей из всех групп анестезировали 5 мкг/г авертином. Затем, мышам на ~1 мм АР, на 1 мм RML, на ~4 мм DV от брегмы на черепной пластинке делали инъекцию 10 мкл-шприцем Гамильтона, содержащем 0,075 ед. коллагеназы (150 ед./мл). Коллагеназу вводили в течение 5 минут, и иглу оставляли в этом месте еще на 5 минут для предотвращения рефлюкса. Затем мышей анализировали на уровень кровоизлияния, степень неврологического расстройства и смертность.

В таблице 37 указан объем кровоизлияния у мышей после обработки коллагеназой, в таблице 38 указана степень неврологического расстройства у мышей, а в таблице 39 указаны данные смертности мышей. Степень неврологического расстройства измеряли по стандартной системе оценок, где отсутствие такого расстройства было оценено как балл 0, а тяжелое неврологическое расстройство было оценено как балл 5. В целом, полученные данные позволяют предположить, что обработка ISIS 404071 не оказывает значительного влияния на уровень кровоизлияния, степень неврологического расстройства или смертность у мышей. Таким образом, риск возникновения внутримозгового кровоизлияния (фактора риска у животных, обработанных варфарином) у мышей, обработанных ISIS 404071 был значительно ниже, чем у мышей, обработанных варфарином.

Пример 26

In vivo эффект ингибирования мышиного фактора 11 под действием антисмыслового олигонуклеотида в комбинации с PLAVIX у мышей с моделью FeCl₃-индуцированного венозного тромбоза (ВТ)

Обработка

Комбинацию ISIS 404071 и PLAVIX оценивали у мышей с моделью FeCl₃-индуцированного ВТ. Восемь мышей BALB/c в каждой из четырех групп, весом примерно 25 г каждая, обрабатывали 6,25 мг/кг, 12,50 мг/кг, 25,00 мг/кг или 50,00 мг/кг PLAVIX. Мышам вводили две дозы PLAVIX на 1-й день и одну дозу PLAVIX на 2-ой день за два часа до хирургической операции.

Восемь мышей BALB/c в каждой из четырех дополнительных групп, весом примерно 25 г каждая, обрабатывали 20 мг/кг ISIS 404071 путем подкожного введения два раза в неделю в течение трех недель. После введения последней дозы ISIS 404071, мышей обрабатывали 6,25 мг/кг, 12,50 мг/кг, 25,00 мг/кг или 50,00 мг/кг PLAVIX. Мышам вводили две дозы PLAVIX на 1-й день и одну дозу PLAVIX на 2-ой день за два часа до хирургической операции.

Восемь мышей BALB/c в каждой из двух контрольных групп, весом примерно 25 г каждая, не обрабатывали ISIS 404071 или PLAVIX. Восемь мышей BALB/c в каждой из двух дополнительных контрольных групп, весом примерно 25 г каждая, обрабатывали 20 мг/кг ISIS 404071 путем подкожного введения два раза в неделю в течение трех недель, но не обрабатывали PLAVIX. Образование тромбов индуцировали FeCl₃ у всех мышей, за исключением мышей первой и третьей контрольных групп. Всех мышей анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции 150 мг/кг кетамина в смеси 10 мг/кг ксилазина.

Количественная оценка тромбоцитарной формулы

Количественную оценку тромбоцитарного фактора-4 (PF-4), проводимую с помощью ПЦР в реальном времени, использовали для определения количества тромбоцитов в полой вене как показателя образования тромба. Как показано в таблице 40, обработка PLAVIX приводила к снижению уровня PF-4 по сравнению с PBS-контролем. Обработка PLAVIX в комбинации с ISIS 404071 приводила к еще большему снижению уровня PF-4 по сравнению с обработкой только PLAVIX. Поэтому, очевидно, что комбинированная антитромбоцитарная терапия вместе с терапией антисмысловым олигонуклеотидом фактора 11 приводила к увеличению антитромбоцитарной активности. Данные представлены как процент мРНК по отношению к PBS + FeCl₃-контролю.

Пример 27

Влияние in vivo ингибирования мышиного фактора 11 антисмысловым олигонуклеотидом в комбинации с PLAVIX на кровотечение из хвоста

Обработка

Кровотечение из хвоста оценивали для того, чтобы определить, приводит ли обработка ISIS 404071 в комбинации с PLAVIX к увеличению риска кровотечения. Восьми мышам BALB/c пяти групп подкожно вводили ISIS 404071 в дозе 20 мг/кг два раза в неделю в течение 3 недель. После введения последней дозы ISIS 404071, мышей обрабатывали 0 мг/кг, 6,25 мг/кг, 12,50 мг/кг, 25,00 мг/кг или 50,00 мг/кг PLAVIX. За два часа до забора крови, мышам вводили две дозы PLAVIX на 1-й день и одну дозу PLAVIX на 2-ой день.

Восемь мышей BALB/c дополнительных 5 групп обрабатывали аналогичным образом, за исключением того, что не вводили инъекции ISIS 404071.

Анализ на кровотечение из хвоста

Через два часа после последней обработки, мышей помещали в камеру для анализа на кровотечение из хвоста. В данной камере, мышей анестезировали изофлураном, и стерильными ножницами отрезали небольшой кусочек хвоста (приблизительно 4 мм от кончика). Затем отрезанный кусочек хвоста сразу помещали в 15-миллилитровую пробирку Falcon, заполненную приблизительно 10 мл 0,9% буферного раствора NaCl, нагретого до 37°С. Забор крови осуществляли в течение 40 минут. Пробирки, заполненные физиологическим раствором, взвешивали до и после забора крови.

Полученные данные, вместе с результатами, полученными как описано в примере 26, показали, что комбинированная антитромбоцитарная терапия вместе с антисмысловым олигонуклеотидом фактора 11 приводила к увеличению антитромбоцитарной активности, которое, при этом, не приводило к повышению риска кровотечения.

Пример 28

Влияние in vivo низкомолекулярного ингибитора, такого как фактор Ха, используемого в комбинации с PLAVIX на кровотечение из хвоста

Обработка

Кровотечение из хвоста оценивали для того, чтобы определить, приводит ли обработка низкомолекулярным фактором 10а в комбинации с PLAVIX к увеличению риска кровотечения. Восемь мышей BALB/c пяти групп обрабатывали 0 мг/кг, 6,25 мг/кг, 12,50 мг/кг, 25,00 мг/кг или 50,00 мг/кг PLAVIX. За два часа до забора крови, мышам вводили две дозы PLAVIX на 1-й день и одну дозу PLAVIX на 2-ой день.

Восемь мышей BALB/c дополнительных пяти групп обрабатывали 0 мг/кг, 6,25 мг/кг, 12,50 мг/кг, 25,00 мг/кг или 50,00 мг/кг PLAVIX. За два часа до забора крови, мышам вводили две дозы PLAVIX на 1-й день и одну дозу PLAVIX на 2-ой день. За 20 минут до забора крови, мышей также обрабатывали 0,5 мг/кг апиксабана, то есть низкомолекулярного фактора 10а - ингибитора, путем однократного внутрибрюшинного введения.

Анализ на кровотечение из хвоста

Через два часа после последней обработки, мышей помещали в камеру для анализа на кровотечение из хвоста. В данной камере мышей анестезировали изофлураном, и стерильными ножницами отрезали небольшой кусочек хвоста (приблизительно 4 мм от кончика). Затем отрезанный кусочек хвоста сразу помещали в 15-миллилитровую пробирку Falcon, заполненную приблизительно 10 мл 0,9% буферного раствора NaCl, нагретого до 37°С.Забор крови осуществляли в течение 40 минут.Пробирки, заполненные физиологическим раствором, взвешивали до и после забора крови.

Как показано ниже в таблице 42, полученные данные продемонстрировали, что комбинированная антитромбоцитарная терапия вместе с низкомолекулярным фактором 10а - ингибитором, таким как апиксабан, приводила к увеличению риска кровотечения. Поэтому, комбинированная антитромбоцитарная терапия вместе с антисмысловым олигонуклеотидом фактора 11 давала лучший профиль безопасности по сравнению с профилем безопасности, наблюдаемым при проведении комбинированной антитромбоцитарной терапии вместе с низкомолекулярным фактором 10а-ингибитором.

Пример 29

Время, за которое происходит снижение уровня мышиного фактора 11, опосредуемого антисмысловым олигонуклеотидом, и соответствующее отсутствие свертывание крови

Обработка

Время, за которое происходит снижение уровня мышиной мРНК фактора 11, опосредуемого антисмысловым олигонуклеотидом, наблюдали у мышей BALB/c. Мышам BALB/c подкожно вводили одну дозу 50 мг/кг ISIS 404071. Через 12 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 7 дней, 14 дней, 28 дней и 56 дней после введения ISIS 404071 мышей умерщвляли. Для анализа на РНК брали целую печень, а для анализа на АПТВ брали РРР. Мышам контрольной группы вводили одну подкожную дозу PBS.

Анализ на РНК

РНК экстрагировали из ткани печени для анализа на фактор 11 с помощью ПЦР в реальном времени. Результаты представлены по отношению к PBS-контролю. У мышей, обработанных ISIS 404071, наблюдалось значимое снижение уровня мРНК фактора 11 на день 1. На 14-й день, экспрессия мРНК фактора 11 у мышей начинала возобновляться. На день 28, экспрессия мРНК фактора 11 у мышей полностью восстанавливалась, а результаты, полученные на день 56, показали, что мРНК фактора 11 сохранялась на уровнях, наблюдаемых до обработки. Поэтому, у ISIS 404071-обработанных мышей не наблюдался эффект отмены.

Эффект отмены ранее наблюдался при антитело-опосредуемом снижении уровня фактора 11 (Blood, First Edition Paper, prepublished online October 22, 2008; Prevention of vascular graft occlusion and thrombus-associated thrombin generation by inhibition of factor XI). Поскольку сверхэкспрессия фактора 11 может быть предотвращена при увеличении свертываемости крови, полученные данные позволяют предположить, что ингибирование фактора 11, опосредуемое антисмысловым олигонуклеотидом, является более безопасным, чем опосредуемое антителом ингибирование фактора 11, поскольку ингибирование фактора 11, опосредуемое антисмысловым олигонуклеотидом, не дает эффекта отмены.

Анализ на АПТВ

Величины АПТВ, представленные в таблице 43, были выражены как Международные величины нормализованных отношений (INR). Величины INR для АПТВ были определены путем деления величины АПТВ для мышей, обработанных ISIS 404071, на величину АПТВ для PBS-обработанной группы. Затем это отношение возводили в степень, равную Международной величине показателя чувствительности (ISI) используемого тканевого фактора. Как показано в таблице 43, у мышей, обработанных ISIS 404071, наблюдалось прогрессирующее снижение АПТВ до дня 4, а затем прогрессирующее увеличение до уровней, наблюдаемых до обработки, со дня 7 до дня 28.

Пример 30

Ингибирование человеческого фактора 11 в клетках HepG2 под действием антисмысловых олигонуклеотидов. сконструированных методом «микропрогулки»

Дополнительные гэпмеры конструировали на основе ISIS 416850 и ISIS 416858 (см. выше таблицу 8). Эти гэпмеры имели небольшие сдвиги в направлении вверх и вниз (то есть были сконструированы на основе ISIS 416850 и ISIS 416858 методом «микропрогулки»). Гэпмеры, полученные методом «микропрогулки», были сконструированы так, что они имели мотивы 5-8-5 МОЕ или 6-8-6-МОЕ.

Эти гэпмеры, полученные методом «микропрогулки», тестировали in vitro. Клетки HepG2, культивированные при плотности 20000 клеток на лунку, трансфицировали путем электропорации с использованием антисмыслового олигонуклеотида в концентрации 8000 нМ. После обработки в течение примерно 24 часов, из клеток выделяли РНК, и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам.

ISIS 416850 и ISIS 416858, а также отобранные гэпмеры, представленные в таблицах 1 и 8 (то есть ISIS 412206, ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416825, ISIS 416848, ISIS 416849, ISIS 416850, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416853, ISIS 416854, ISIS 416855, ISIS 416856, ISIS 416857, ISIS 416858, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416862, ISIS 416863, ISIS 416864, ISIS 416865, ISIS 416866 и ISIS 416867) снова тестировали in vitro вместе с гэпмерами, полученными методом «микропрогулки», в условиях, описанных выше.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, представленные в таблице 44, были сконструированы в виде 5-10-5-МОЕ-, 5-8-5-МОЕ- или 6-8-6-МОЕ-гэпмеров. Первыми двумя гэпмерами, представленными в таблице 44, являются исходные гэпмеры (ISIS 416850 и ISIS 416858), из которых были сконструированы ISIS 445493-445543 методом «микропрогулки», и которые показаны звездочкой. Эти 5-10-5-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') сегментами-крыльями, каждый из которых содержит 5 нуклеотидов. 5-8-5-гэпмеры имеют длину в 18 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из восьми 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') сегментами-крыльями, каждый из которых содержит 5 нуклеотидов. 6-8-6-гэпмеры имеют длину в 20 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из восьми 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') сегментами-крыльями, каждый из которых содержит шесть нуклеотидов. В каждом мотиве (5-10-5, 5-8-5 и 6-8-6), каждый нуклеотид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеотид в 3'-сегменте-крыле имеют 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфортиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитидины. Термин «человеческий старт-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен гэпмер в человеческой последовательности. Термин «человеческий стоп-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер в человеческой последовательности. Каждый гэпмер, представленный в таблице 44, нацелен на SEQ ID NO: 1 (GENBANK peг. № NM_000128.3). Каждый гэпмер, представленный в таблице 44, также вступает в полную перекрестную реакцию с генной последовательностью фактора 11 маккак-резуса, представленной здесь как SEQ ID NO: 274 (экзоны 1-15 GENBANK peг. № NW_001118167.1). «Старт-сайт макак-резуса» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер в последовательности макак-резуса. «Стоп-сайт макак-резуса» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер в последовательности макак-резуса.

Как показано в таблице 44, все гэпмеры, сконструированные методом «микропрогулки» и нацеленные на область-мишень, начинающуюся со старт-сайта-мишени 1275 и заканчивающуюся стоп-сайтом-мишенью 1317 (то есть в пределах нуклеотидных оснований 1275-1317) SEQ ID NO: 1, ингибируют мРНК фактора 11 по меньшей мере на 60%. Аналогичным образом, все повторно тестированные гэпмеры, представленные в таблицах 1 и 8, дают по меньшей мере 60%-ный ингибирующий эффект.

Некоторые из гэпмеров дают по меньшей мере 70%-ный ингибирующий эффект, включая гэпмеры номеров ISIS: 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445499, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445511, 445512, 445513, 445514, 445515, 445516, 445517, 445518, 445519, 445520, 445521, 445522, 445523, 445524, 445525, 445526, 445527, 445528, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 445537, 455538, 445539, 445540, 445541, 445542 и 445543.

Некоторые из гэпмеров дают по меньшей мере 80%-ный ингибирующий эффект, включая гэпмеры номеров ISIS: 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860,416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445513, 445514, 445519, 445520, 445521, 445522, 445525, 445526, 445529, 445530,445531,445532,445533, 445534,445535,445536,455538,445541 и 445542.

Некоторые из гэпмеров дают по меньшей мере 90%-ный ингибирующий эффект, включая гэпмеры номеров ISIS: 412206, 416825, 416850, 416857, 416858, 416861, 445522 и 445531.

Пример 31

Дозозависимое ингибирование человеческого фактора 11 в клетках HepG2 под действием антисмысловых соединений

Гэпмеры примера 30, оказывающие ингибирующее действие in vitro на человеческий фактор 11, тестировали в различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 20000 клеток на лунку и трансфицировали путем электропорации вместе с антисмысловыми олигонуклеотидами, взятыми в концентрациях 123,46 нМ, 370,37 нМ, 1111,11 нМ, 3333,33 нМ и 10000 нМ как показано в таблице 45. После обработки в течение примерно 16 часов, из клеток выделяли РНК, и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для измерения уровней мРНК использовали набор праймеров и зонда для человеческого фактора 11, RTS 2966. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам. Как проиллюстрировано в таблице 45, уровни мРНК фактора 11 в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, снижались в зависимости от дозы.

Полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC₅₀) каждого олигонуклеотида вычисляли путем построения кривой зависимости концентраций используемых антисмысловых олигонуклеотидов от процента ингибирования экспрессии мРНК фактора 11, достигаемого при каждой концентрации, где указанная концентрация антисмыслового олигонуклеотида представляет собой концентрацию, при которой достигается 50% ингибирование мРНК фактора 11 по сравнению с PBS-контролем. Величины IC₅₀ представлены в таблице 45.

Пример 32

Дозозависимое ингибирование человеческого фактора 11 в клетках HepG2 под действием антисмысловых олигонуклеотидов. сконструированных методом «микропрогулки»

Эти гэпмеры тестировали в различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали при плотности 20000 клеток на лунку и трансфицировали путем электропорации с использованием антисмыслового олигонуклеотида в концентрациях 375 нМ, 750 нМ, 1500 нМ, 3000 нМ, 6000 нМ и 12000 нМ, как указано в таблице 47. После обработки в течение примерно 16 часов, из клеток выделяли РНК, и уровни мРНК фактора 11 измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Уровни мРНК фактора 11 корректировали на общее содержание РНК, как было измерено с использованием реагента RIBOGREEN. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к необработанным контрольным клеткам.

ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 445522 и ISIS 445531 (см. выше таблицу 45) снова тестировали in vitro вместе с гэпмерами, полученными методом «микропрогулки», в условиях, описанных выше.

Химерные антисмысловые олигонуклеотиды, представленные в таблице 46, были сконструированы в виде 3-8-3-МОЕ, 4-8-4-МОЕ, 2-10-2-МОЕ, 3-10-3-МОЕ или 4-10-4-МОЕ-гэпмеров. 3-8-3-гэпмер имеет длину в 14 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из восьми 2'дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждое из которых содержит три нуклеотида. 4-8-4-гэпмер имеет длину в 16 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из восьми 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждое из которых содержит четыре нуклеотида. 2-10-2-гэпмер имеет длину в 14 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждое из которых содержит два нуклеотида. 3-10-3-гэпмер имеет длину в 16 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждое из которых содержит три нуклеотида. 4-10-4-гэпмер имеет длину в 18 нуклеотидов, где центральный гэп-сегмент состоит из десяти 2'-дезоксинуклеотидов и фланкирован с обеих сторон (в направлении 5' и 3') крыльями, каждое из которых содержит четыре нуклеотида. В каждом мотиве (3-8-3, 4-8-4, 2-10-2, 3-10-3 и 4-10-4), каждый нуклеотид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеотид в 3'-сегменте-крыле имеют 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидными связями в каждом гэпмере являются фосфортиоатные (P=S) связи. Все цитидиновые остатки в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитидины. Термин «человеческий старт-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен гэпмер в человеческой последовательности. Термин «человеческий стоп-сайт, являющийся мишенью» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер в человеческой последовательности. Каждый гэпмер, представленный в таблице 46, нацелен на SEQ ID NO: 1 (GENBANK peг. № NM_000128.3). Каждый гэпмер, представленный в таблице 46, также вступает в полную перекрестную реакцию с генной последовательностью фактора 11 макак-резуса, представленной здесь как SEQ ID NO: 274 (экзоны 1-15 GENBANK peг. № NW_001118167.1). «Старт-сайт макак-резуса» означает самый крайний 5'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер в последовательности макак-резуса. «Стоп-сайт макак-резуса» означает самый крайний 3'-нуклеотид, на который нацелен данный гэпмер в последовательности макак-резуса.

Данные дозозависимого ингибирования представлены в таблице 47. Как показано в таблице 47, уровни мРНК фактора 11 в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, снижались в зависимости от дозы. Также вычисляли IC₅₀ каждого антисмыслового олигонуклеотида, и эти данные представлены в таблице 47. Первыми двумя гэпмерами, представленными в таблице 47, являются исходные гэпмеры (ISIS 416850 и ISIS 416858), из которых были сконструированы остальные гэпмеры методом «микропрогулки», и которые показаны звездочкой.

Пример 33

Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на человеческий фактор 11 у мышей CD1

Мышей CD1 обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, нацеленными на человеческий фактор 11, и оценивали на изменение уровней различных метаболических маркеров.

Обработка

Каждой мыши в группах из пяти животных CD1 подкожно инъецировали 50 мг/кг ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002 или ISIS 417003 два раза в неделю в течение 2, 4 или 6 недель. Пяти мышам контрольной группы подкожно инъецировали PBS в течение 2 недель. Мышей всех экспериментальных групп (то есть мышей, обработанных ASO через 2, 4, 6 недель) сравнивали с мышами контрольной группы (то есть PBS, 2 недели).

Через три дня после введения последней дозы мышам всех групп, этих мышей умерщвляли. Затем измеряли массу органов и брали кровь для последующего анализа.

Масса органов

По окончании исследования измеряли массу печени, селезенки и почек, и эти данные представлены в таблицах 48, 49 и 50 как процент от PBS-контроля, нормализованный по массе тела. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 6-кратное увеличение массы печени и селезенки по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Функция печени

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени, измеряли концентрации трансаминаз плазмы на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты измерений уровней аланинтрансаминазы (ALT) и аспартаттрансаминазы (AST) выражали в МЕ/л, и эти результаты представлены в таблицах 51 и 52. Уровни билирубина и альбумина в плазме также измеряли на том же самом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии, и выражали в мг/дл. Результаты представлены в таблицах 53 и 54. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 7-кратное увеличение уровней ALT/AST по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней билирубина по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований.

Функция почек

Анализ крови

Кровь, которую брали у мышей всех групп, посылали в Институт диагностических исследований (Antech Diagnostics) для определения гематокрита (НСТ), среднего объема эритроцитов (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (МСН), и средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (МСНС) и для их анализов, а также для определения числа различных клеток, таких как WBC (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты), эритроциты (RBC), тромбоциты и общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в таблицах 57-67. Проценты, представленные в этих таблицах, означают процент от общего числа форменных элементов крови. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 50% снижение числа тромбоцитов и/или более, чем 3-кратное увеличение числа моноцитов, отбирали для дальнейших исследований.

Пример 34

Оценка времени полужизни антисмыслового олигонуклеотида в печени мышей CD1

Мышей CD1 обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, нацеленными на человеческий фактор 11, а затем оценивали время полужизни олигонуклеотида, а также время разложения олигонуклеотида и время его элиминации из печени.

Обработка

Каждую мышь в группе из пятнадцати мышей CD1 подкожно инъецировали два раза в неделю в течение 2 недель 50 мг/кг ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002 или ISIS 417003. Через 3 дня, 28 дней и 56 дней после введения последней дозы, пять мышей в каждой группе умерщвляли. Затем брали печень для анализа.

Определение концентрации олигонуклеотидов

Была измерена концентрация полноразмерного олигонуклеотида, а также общая концентрация олигонуклеотидов (включая форму, образованную путем разложения). Применяемый метод представляет собой модификацию опубликованных ранее методов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), и этот метод состоит из стадии экстракции фенолом-хлороформом (жидким фенолом - жидким хлороформом) и стадии твердофазной экстракции. Перед экстракцией добавляли внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный фосфортиоатный олигонуклеотид, модифицированный 2'O-метоксиэтилом, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT и обозначенный здесь как SEQ ID NO: 270). Концентрации в образцах ткани вычисляли с помощью калибровочных кривых, где наименьший предел количественной оценки (LLOQ) составляет приблизительно 1,14 мкг/г. Затем определяли время полужизни с помощью программы WinNonlin (PHARSIGHT).

Результаты представлены в таблицах 68 и 69 и выражены в мкг/г ткани печени. Время полужизни каждого олигонуклеотида представлено в таблице 70.

Пример 35

Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на человеческий фактор 11 у крыс Sprague-Dawley

Крыс Sprague-Dawley обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, нацеленными на человеческий фактор 11, и оценивали на изменение уровней различных метаболических маркеров.

Обработка

Каждой крысе в группах из четырех крыс Sprague-Dawley подкожно инъецировали 50 мг/кг ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416848, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002 или ISIS 417003 два раза в неделю в течение 6 недель. Четырем крысам Sprague-Dawley контрольной группы подкожно инъецировали PBS два раза в неделю в течение 6 недель. До и во время проведения обработки измеряли массу тела. Перед началом обработки брали образцы мочи. Через три дня после введения последней дозы брали образцы мочи, после чего крыс умерщвляли. Затем измеряли массу органов и брали кровь для последующего анализа.

Масса тела и масса органов

Массу тела крыс измеряли в начале исследования, а затем два раза в неделю. Массы тела представлены в таблице 71 и выражены как процент изменения массы тела по отношению к массе тела в начале исследования. Массы печени, селезенки и почек измеряли в конце исследования, и полученные результаты представлены в таблице 71 как процент от контроля, обработанного физиологическим раствором, нормализованный по массе тела. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 6-кратное увеличение массы печени и селезенки по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Функция печени

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени, измеряли концентрации трансаминаз в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты измерений уровней аланинтрансаминазы (ALT) и аспартаттрансаминазы (AST) выражали в МЕ/л, и эти результаты представлены в таблице 72. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 7-кратное увеличение уровней ALT/AST по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований. Уровни билирубина и альбумина в плазме также измеряли на том же самом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии, и результаты, представленные в таблице 72, выражали в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней билирубина по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований.

Функция почек

Для оценки влияния олигонуклеотидов на функцию почек измеряли концентрации азота мочевины в плазме (BUN) и концентрации креатинина в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты представлены в таблице 73 и выражены в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней BUN по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований. Отношение количества белка в моче к количеству креатинина во всех образцах мочи также вычисляли до и после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами, и результаты представлены в таблице 74. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 5-кратное увеличение отношения белок/креатинин в моче по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Анализ крови

Кровь, которую брали у крыс всех групп, посылали в Институт диагностических исследований (Antech Diagnostics) для определения гематокрита (НСТ), среднего объема эритроцитов (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (МСН), и средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (МСНС) и для их анализов, а также для определения числа различных клеток, таких как WBC (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты), эритроциты (RBC) и тромбоциты, и для определения общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в таблицах 75 и 76. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 50% снижение числа тромбоцитов и более, чем 3-кратное увеличение числа моноцитов, отбирали для дальнейших исследований.

Пример 36

Оценка времени полужизни антисмыслового олигонуклеотида в печени и почках крыс Sprague-Dawley

Крыс Sprague-Dawley обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, нацеленными на человеческий фактор 11, а затем оценивали время полужизни олигонуклеотида, а также время разложения олигонуклеотида и время его элиминации из печени и почек.

Обработка

Каждой крысе в группе из четырех крыс Sprague-Dawley подкожно инъецировали два раза в неделю в течение 2 недель 20 мг/кг ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002 или ISIS 417003. Через 3 дня после введения последней дозы, крыс умерщвляли, и брали печень и почки для анализа.

Определение концентрации олигонуклеотидов

Была измерена концентрация полноразмерного олигонуклеотида, а также общая концентрация олигонуклеотидов (включая форму, образованную путем разложения). Применяемый метод представляет собой модификацию описанных ранее методов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которая состоит из стадии экстракции фенолом-хлороформом (жидким фенолом - жидким хлороформом) и стадии твердофазной экстракции. Перед экстракцией добавляли внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный фосфортиоатный олигонуклеотид, модифицированный 2'-O-метоксиэтилом, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, и обозначенный здесь как SEQ ID NO: 270). Концентрации в образцах ткани вычисляли с помощью калибровочных кривых, где наименьший предел количественной оценки (LLOQ) составлял приблизительно 1,14 мкг/г. Результаты, представленные в таблицах 77 и 78, выражали в мкг/г ткани печени или почек. Затем определяли время полужизни с помощью программы WinNonlin (PHARSIGHT).

Пример 37

Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на человеческий фактор 11 у мышей CD1

Обработка

Каждой мыши в группах из пяти мышей CD1 подкожно инъецировали 50 мг/кг ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416849, ISIS 416850, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416853, ISIS 416854, ISIS 416855, ISIS 416856, ISIS 416857, ISIS 416858, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416862, ISIS 416863, ISIS 416864, ISIS 416865, ISIS 416866 или ISIS 416867 два раза в неделю в течение 6 недель. Мышам контрольной группы из десяти мышей CD1 подкожно инъецировали PBS два раза в неделю в течение 6 недель. До и во время проведения обработки измеряли массу тела. Через три дня после введения последней дозы, мышей умерщвляли, измеряли массу органов и брали кровь для последующего анализа.

Масса тела и масса органов

Массу тела измеряли в начале исследования, а затем два раза в неделю. Массы тела мышей, представленные в таблице 80, выражены как увеличение количества в граммах по отношению к массе PBS-контроля до начала обработки. По окончании исследований измеряли массы тела печени, селезенки и почек, и результаты этих исследований также представлены в таблице 80 как процент по массе тела. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 6-кратное увеличение массы печени и селезенки по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Функция печени

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли концентрации трансаминаз в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты измерений уровней аланинтрансаминазы (ALT) и аспартаттрансаминазы (AST) выражали в МЕ/л, и эти результаты представлены в таблице 81. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 7-кратное увеличение уровней ALT/AST по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований. Уровни билирубина, холестерина и альбумина в плазме также измеряли на том же самом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии, и результаты, представленные в таблице 81, выражали в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней билирубина по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований.

Функция почек

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли концентрации азота мочевины в плазме (BUN) на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии, и результаты, представленные в таблице 82, выражали в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней BUN по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Анализ крови

Кровь, которую брали у мышей всех групп, посылали в Институт диагностических исследований (Antech Diagnostics) для определения гематокрита (НСТ), а также для определения числа различных клеток крови, таких как WBC (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты), эритроциты (RBC) и тромбоциты, и для определения общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в таблицах 83 и 84. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 50% снижение числа тромбоцитов и более, чем 3-кратное увеличение числа моноцитов, отбирали для дальнейших исследований.

Пример 38

Оценка времени полужизни антисмыслового олигонуклеотида в печени мышей CD1

Проводили дополнительную оценку пятнадцати антисмысловых олигонуклеотидов на мышах CD1 (пример 37). Мышей CD1 обрабатывали антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, а затем оценивали время полужизни олигонуклеотида, а также время разложения олигонуклеотида и время его выведения из печени.

Обработка

Каждой мыши в группе из пятнадцати мышей CD1 подкожно инъецировали два раза в неделю в течение 2 недель 50 мг/кг ISIS 412223, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866, ISIS 416867, ISIS 412224, ISIS 416848 или ISIS 416859. Через 3 дня, 28 дней и 56 дней после введения последней дозы, пять мышей в каждой группе умерщвляли, и брали печень для анализа.

Определение концентрации олигонуклеотидов

Была измерена концентрация полноразмерного олигонуклеотида. Применяемый метод представляет собой модификацию опубликованных ранее методов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которая состоит из стадии экстракции фенолом-хлороформом (жидким фенолом - жидким хлороформом) и стадии твердофазной экстракции. Перед экстракцией добавляли внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный фосфортиоатный олигонуклеотид, модифицированный 2'-O-метоксиэтилом, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT и обозначенный здесь как SEQ ID NO: 270). Концентрации в образцах ткани вычисляли с помощью калибровочных кривых, где наименьший предел количественной оценки (LLOQ) составляет приблизительно 1,14 мкг/г. Результаты, представленные в таблице 85, выражены в мкг/г ткани печени. Время полужизни каждого олигонуклеотида также представлено в таблице 85.

Пример 39

Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на человеческий фактор 11 у крыс Sprague-Dawley

Пятнадцать антисмысловых олигонуклеотидов, которые были проанализированы на мышах CD1 (пример 37), дополнительно оценивали на крысах Sprague-Dawley на изменение уровней различных метаболических маркеров.

Обработка

Каждой крысе в группах из четырех крыс Sprague-Dawley подкожно инъецировали 50 мг/кг ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866 или ISIS 416867 два раза в неделю в течение 6 недель. Четырем крысам Sprague-Dawley контрольной группы подкожно инъецировали PBS два раза в неделю в течение 6 недель. До и во время проведения обработки измеряли массу тела. Через три дня после введения последней дозы брали образцы мочи, после чего крыс умерщвляли, измеряли массу органов и брали кровь для последующего анализа.

Масса тела и масса органов

Массу тела крыс измеряли в начале исследования, а затем два раза в неделю. Массы тела представлены в таблице 86 и выражены как процент увеличение массы в граммах по отношению к массе тела PBS-контроля до начала обработки. По окончании исследований измеряли массы тела печени, селезенки и почек, и результаты этих исследований представлены в таблице 86 как процент по массе тела. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 6-кратное увеличение массы печени и селезенки по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Функция печени

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли концентрации трансаминаз в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты измерений уровней аланинтрансаминазы (ALT) и аспартаттрансаминазы (AST) выражали в МЕ/л, и эти результаты представлены в таблице 87. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 7-кратное увеличение уровней ALT/AST по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований. Уровни билирубина и альбумина в плазме также измеряли на том же самом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии, и результаты, представленные в таблице 87, выражали в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней билирубина по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований.

Функция почек

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли концентрации азота мочевины в плазме (BUN) и концентрации креатинина в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты представлены в таблице 88 и выражены в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней BUN по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований. Общий белок в моче и отношение количества белка к количеству креатинина в моче во всех образцах мочи вычисляли после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами, и результаты представлены в таблице 88. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 5-кратное увеличение отношения белок/креатинин в моче по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Анализ крови

Кровь, которую брали у крыс всех групп, посылали в Институт диагностических исследований (Antech Diagnostics) для определения гематокрита (НСТ), а также для определения числа различных клеток, таких как WBC (нейтрофилы и лимфоциты), эритроциты (RBC) и тромбоциты, и для определения общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в таблицах 89 и 90. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 50% снижение числа тромбоцитов и более, чем 3-кратное увеличение числа моноцитов, отбирали для дальнейших исследований.

Пример 40

Оценка времени полужизни антисмыслового олигонуклеотида в печени и почках крыс Sprague-Dawley

Обработка

Каждой крысе в группе из четырех крыс Sprague-Dawley подкожно инъецировали два раза в неделю в течение 2 недель 20 мг/кг ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866 или ISIS 416867. Через три дня после введения последней дозы, крыс умерщвляли, и брали печень и почки.

Определение концентрации олигонуклеотидов

Была измерена концентрация полноразмерного олигонуклеотида, а также общая концентрация олигонуклеотидов (включая форму, образованную путем разложения). Применяемый метод представляет собой модификацию опубликованных ранее методов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которая состоит из стадии экстракции фенолом-хлороформом (жидким фенолом - жидким хлороформом) и стадии твердофазной экстракции. Перед экстракцией добавляли внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный фосфортиоатный олигонуклеотид, модифицированный 2'-O-метоксиэтилом, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT и обозначенный здесь как SEQ ID NO: 270). Концентрации в образцах ткани вычисляли с помощью калибровочных кривых, где наименьший предел количественной оценки (LLOQ) составляет приблизительно 1,14 мкг/г. Результаты, представленные в таблицах 91 и 92, выражали в мкг/г ткани печени или почек. Затем определяли время полужизни с помощью программы WinNonlin (PHARSIGHT).

Пример 41

Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на человеческий фактор 11 у мышей CD1

Олигонуклеотиды ISIS с мотивами 6-8-6-МОЕ и 5-8-5-МОЕ, нацеленные на человеческий фактор 11, вводили мышам CD1 и оценивали на изменение уровней различных метаболических маркеров.

Обработка

Каждой мыши в группах из пяти мышей CD1 подкожно инъецировали 50 мг/кг ISIS 416850, ISIS 445498, ISIS 445503, ISIS 445504, ISIS 445505, ISIS 445509, ISIS 445513, ISIS 445522, ISIS 445530, ISIS 445531 или ISIS 445532 два раза в неделю в течение 6 недель. Мышам CD1 контрольной группы из пяти мышей CD1 подкожно инъецировали PBS два раза в неделю в течение 6 недель. До обработки и по окончании обработки измеряли массу тела. Через три дня после введения последней дозы, мышей умерщвляли, измеряли массу органов и брали кровь для последующего анализа.

Масса тела и масса органов

Изменения массы тела у мышей представлены в таблице 94 и выражены как увеличение массы тела в граммах по сравнению с массой тела PBS-контроля до начала обработки. По окончании исследований измеряли массы тела печени, селезенки и почек, и результаты этих исследований также представлены в таблице 94 как процент по массе тела. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 6-кратное увеличение массы печени и селезенки по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Функция печени

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли концентрации трансаминаз в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты измерений уровней аланинтрансаминазы (ALT) и аспартаттрансаминазы (AST) выражали в МЕ/л, и эти результаты представлены в таблице 95. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 7-кратное увеличение уровней ALT/AST по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований. Также измеряли уровни билирубина и альбумина в плазме, и результаты, представленные в таблице 95, выражали в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней билирубина по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований.

Функция почек

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли концентрации азота мочевины в плазме (BUN) на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты, представленные в таблице 96, выражали в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней BUN по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Анализ крови

Кровь, которую брали у мышей всех групп, посылали в Институт диагностических исследований (Antech Diagnostics) для определения гематокрита (НСТ), а также для определения числа различных клеток крови, таких как WBC (нейтрофилы и лимфоциты), эритроциты (RBC) и тромбоциты, и для определения общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в таблицах 97 и 98. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 50% снижение числа тромбоцитов и более, чем 3-кратное увеличение числа моноцитов, отбирали для дальнейших исследований.

Пример 42

Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов. нацеленных на человеческий фактор 11 у крыс Sprague-Dawley

Восемь антисмысловых олигонуклеотидов, которые были проанализированы на мышах CD1 (пример 41), дополнительно оценивали на крысах Sprague-Dawley на изменение уровней различных метаболических маркеров.

Обработка

Каждой крысе в группах из четырех крыс Sprague-Dawley подкожно инъецировали 50 мг/кг ISIS 445498, ISIS 445504, ISIS 445505, ISIS 445509, ISIS 445513, ISIS 445522, ISIS 445530 или ISIS 445531 два раза в неделю в течение 6 недель. Крысам Sprague-Dawley контрольной группы подкожно инъецировали PBS два раза в неделю в течение 6 недель. До и во время проведения обработки измеряли массу тела. Через три дня после введения последней дозы брали образцы мочи, после чего крыс умерщвляли, измеряли массу органов и брали кровь для последующего анализа.

Масса тела и масса органов

Массу тела крыс измеряли в начале исследования, а затем два раза в неделю. Массы тела представлены в таблице 99 и выражены как процент увеличения массы по отношению к массе тела PBS-контроля до начала обработки. Массы печени, селезенки и почек измеряли по окончании исследования, и полученные результаты представлены в таблице 99 как процент по массе тела. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 6-кратное увеличение массы печени и селезенки по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Функция печени

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли концентрации трансаминаз в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Затем измеряли концентрации ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы), и результаты, представленные в таблице 100, выражали в МЕ/л. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 7-кратное увеличение уровней ALT/AST по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований. Уровни билирубина и альбумина в плазме также измеряли на том же самом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии, и результаты, представленные в таблице 100, выражали в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней билирубина по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований.

Функция почек

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли концентрации азота мочевины в плазме (BUN) и концентрации креатинина в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты представлены в таблице 101 и выражены в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней BUN по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований. Общий белок в моче и отношение количества белка к количеству креатинина в моче во всех образцах мочи вычисляли после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами, и результаты представлены в таблице 101. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 5-кратное увеличение отношение белок/креатинин в моче по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Анализ крови

Кровь, которую брали у крыс всех групп, посылали в Институт диагностических исследований (Antech Diagnostics) для определения гематокрита (НСТ), а также для определения числа различных клеток, таких как WBC (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты), эритроциты (RBC) и тромбоциты, и для определения общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в таблицах 102 и 103. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 50% снижение числа тромбоцитов и более, чем 3-кратное увеличение числа моноцитов, отбирали для дальнейших исследований.

Пример 43

Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на человеческий фактор 11 у мышей CD1

Олигонуклеотиды ISIS с мотивами 4-8-4 МОЕ, 3-8-3 МОЕ, 2-10-2 МОЕ, 3-10-3 МОЕ и 4-10-4 МОЕ, нацеленные на человеческий фактор 11, вводили мышам CD1 и оценивали на изменение уровней различных метаболических маркеров.

Обработка

Каждой мыши в группах из пяти мышей CD1 подкожно инъецировали 50 мг/кг ISIS 449707, ISIS 449708, ISIS 449409, ISIS 449710 или ISIS 449711 два раза в неделю в течение 6 недель. Мышам CD1 контрольной группы из пяти мышей CD1 подкожно инъецировали PBS два раза в неделю в течение 6 недель. До и по окончании обработки измеряли массу тела. Через три дня после введения последней дозы, мышей умерщвляли, измеряли массу органов и брали кровь для последующего анализа.

Масса тела и масса органов

Масса тела у мышей, измеренная по окончании исследования, представлена в таблице 104 и выражена в граммах. Массы печени, селезенки и почек, также измеренные по окончании исследования, представлены в таблице 104 как процент по массе тела. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 6-кратное увеличение массы печени и селезенки по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Функция печени

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли концентрации трансаминаз в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Затем измеряли концентрации ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы) в плазме, и результаты, представленные в таблице 105, выражены в МЕ/л. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 7-кратное увеличение уровней ALT/AST по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований. Уровни билирубина и альбумина в плазме также измеряли на том же самом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии, и результаты, представленные в таблице 105, выражали в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней билирубина по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований.

Функция почек

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли концентрации азота мочевины в плазме (BUN) и креатинина в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты, представленные в таблице 106, выражали в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней BUN по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Анализ крови

Кровь, которую брали у мышей всех групп, посылали в Институт диагностических исследований (Antech Diagnostics) для определения гематокрита (НСТ), а также для определения числа различных клеток крови, таких как WBC (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты), эритроциты (RBC) и тромбоциты, и для определения общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в таблицах 107 и 108. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 50% снижение числа тромбоцитов и более, чем 3-кратное увеличение числа моноцитов, отбирали для дальнейших исследований.

Пример 44

Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов. нацеленных на человеческий фактор 11 у крыс Sprague-Dawley

Пять антисмысловых олигонуклеотидов, которые были проанализированы на мышах CD1 (пример 43), дополнительно оценивали на крысах Sprague-Dawley на изменение уровней различных метаболических маркеров.

Обработка

Каждой крысе в группах из четырех крыс Sprague-Dawley подкожно инъецировали 50 мг/кг ISIS 449707, ISIS 449708, ISIS 449709, ISIS 449710, или ISIS 449711 два раза в неделю в течение 6 недель. Четырем крысам Sprague-Dawley контрольной группы подкожно инъецировали PBS два раза в неделю в течение 6 недель. До и во время обработки измеряли массу тела. Через три дня после введения последней дозы брали образцы мочи, после чего крыс умерщвляли, измеряли массу органов и брали кровь для последующего анализа.

Масса тела и масса органов

Массу тела крыс измеряли в начале и по окончании исследования. Изменения массы тела представлены в таблице 99 и выражены как процент увеличения массы в граммах по отношению к массе тела PBS-контроля до начала обработки. По окончании исследования измеряли массы печени, селезенки и почек, и полученные результаты представлены в таблице 99 как процент по массе тела. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 6-кратное увеличение массы печени и селезенки по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Функция печени

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли концентрации ALT и AST в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Затем измеряли концентрации аланинтрансаминазы (ALT) и аспартаттрансаминазы (AST), и результаты, представленные в таблице 110, выражали в МЕ/л. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 7-кратное увеличение уровней ALT/AST по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований. Затем измеряли уровни билирубина и альбумина в плазме, и результаты, представленные в таблице 110, выражали в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней билирубина по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований.

Функция почек

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли концентрации азота мочевины в плазме (BUN) и концентрации креатинина в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты представлены в таблице 111 и выражены в мг/дл. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней BUN по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований. После обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли общий белок в моче и отношение белок/креатинин во всех образцах мочи, и полученные результаты также представлены в таблице 111. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 5-кратное увеличение отношения белок/креатинин в моче по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Анализ крови

Кровь, которую брали у крыс всех групп, посылали в Институт диагностических исследований (Antech Diagnostics) для определения гематокрита (НСТ), а также для определения числа различных клеток, таких как WBC (нейтрофилы, лимфоциты и моноциты), эритроциты (RBC) и тромбоциты, и для определения общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в таблицах 112 и 113. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 50% снижение числа тромбоцитов и более, чем 3-кратное увеличение числа моноцитов, отбирали для дальнейших исследований.

Пример 45

Дозозависимый фармакологический эффект антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на человеческий фактор 11, у собакоподобных обезьян

Несколько антисмысловых олигонуклеотидов тестировали у собакоподобных обезьян для определения фармакологического действия указанных олигонуклеотидов на активность фактора 11, свертывание крови и время кровотечения, и повреждающего действия на печень и почки, а также для оценки их переносимости. Все олигонуклеотиды ISIS, используемые в данном исследовании, нацелены на мРНК человеческого фактора 11 и также вступают в полную перекрестную реакцию с генной последовательностью макак-резусов (см. таблицу 44). Было высказано предположение, что олигонуклеотиды ISIS макак-резуса также вступают в полную перекрестную реакцию с генной последовательностью собакоподобных обезьян. Во время проведения исследования, геномная последовательность собакоподобных обезьян отсутствовала в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI), а поэтому перекрестная реакция с генной последовательностью собакоподобных обезьян не могла быть подтверждена.

Обработка

Группам обезьян, каждая из которых включала два самца и три самки обезьян, подкожно инъецировали ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864 или ISIS 417002 в возрастающих дозах. Антисмысловой олигонуклеотид вводили обезьянам в дозе 5 мг/кг три раза в неделю в течение 1-й недели; 5 мг/кг два раза в неделю в течение 2-й и 3-й недели; 10 мг/кг три раза в неделю в течение 4-й недели; 10 мг/кг два раза в неделю в течение 5-й и 6-й недели; 25 мг/кг три раза в неделю в течение 7-й недели; и 25 мг/кг два раза в неделю в течение 8-й, 9-й, 10-й, 11-й и 12-й недели. Одной контрольной группе, состоящей из двух самцов и трех самок обезьян, подкожно инъецировали PBS в соответствии с той же самой схемой введения доз. Дополнительной экспериментальной группе, состоящей из двух самцов и трех самок обезьян, подкожно инъецировали ISIS 416850 в режиме непрерывного введения более низких доз. Антисмысловой олигонуклеотид вводили обезьянам в дозе 5 мг/кг три раза в неделю в течение 1-й недели; 5 мг/кг два раза в неделю в течение 2-й и 3-й недели; 10 мг/кг три раза в неделю в течение 4-й недели и 10 мг/кг два раза в неделю в течение 5-12 недель. Массу тела измеряли каждую неделю. Пробы крови брали за 14 и 5 дней до начала обработки, а затем один раз в неделю для анализа на активность белка фактора 11 в плазме, измерения уровня фибриногена, вычисления ПВ и АПТВ, определения времени кровотечения и оценки различных гематологических факторов. На день 85, обезьян подвергали эвтаназии путем кровопускания под глубоким наркозом, и брали органы для последующего анализа.

Анализ на РНК

На день 85, из ткани печени экстрагировали РНК для анализа на фактор 11, проводимого с помощью ПЦР в реальном времени, с использованием набора праймеров и зонда LTS00301 (последовательность прямого праймера ACACGCATTААAAAGAGCAAAGC, представленная здесь как SEQ ID NO: 271; последовательность обратного праймера CAGTGTCATGGTAAAATGAAGAATGG, представленная здесь как SEQ ID NO: 272; и последовательность зонда TGCAGGCACAGCATCCCAGTGTTCTX, представленная здесь как SEQ ID NO: 273). Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к PBS-контролю. Как показано в таблице 114, обработка олигонуклеотидами ISIS приводила к значительному снижению уровней мРНК фактора 11 по сравнению с PBS-контролем.

Анализ белка

Пробы плазмы, взятые в различные дни у обезьян всех групп, анализировали с помощью «сэндвич»-ELISA-анализа (Affinity Biologicals Inc.) с использованием аффинно очищенного поликлонального антитела против фактора 11 в качестве антитела для захвата, и конъюгированного с пероксидазой поликлонального антитела против фактора 11 в качестве детектирующего антитела. Плазму обезьян разводили 1:50 для анализа. Пероксидазную активность экспрессировали путем инкубирования с субстратом о-фенилендиамином. Интенсивность окраски количественно оценивали на микропланшет-ридере на 490 нм и выражали как количество, пропорциональное концентрации фактора 11 в образцах.

Результаты, представленные в таблице 115, выражали как процент снижения по отношению к PBS-контролю. Обработка ISIS 416850 и ISIS 416858 приводила к зависимому от времени снижению уровней белка.

Анализ на ПВ и АПТВ

Пробы крови собирали в пробирки, содержащие цитрат натрия. ПВ и АПТВ определяли в дубликате на приборе для оценки свертывания крови ACL 9000 (Instrumentation Laboratory, Italy). Результаты интерполировали на стандартной кривой серийных разведений тестируемой цитрат-содержащей плазмы контрольных обезьян и выражали в процентах, отложенных по оси ординат.

Протромбиновое время (ПВ) и активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) измеряли с использованием обедненной тромбоцитами плазмы (ОТП), взятой у обезьян, обработанных олигонуклеотидами ISIS. Величины ПВ и АПТВ, представленные в таблицах 116 и 117, были выражены как Международные величины нормализованных отношений (INR). Величины INR для ПВ и АПТВ были определены путем деления величины ПВ и АПТВ для каждой экспериментальной группы на величины ПВ и АПТВ для PBS-обработанной группы. Затем это отношение возводили в степень, равную Международной величине показателя чувствительности (ISI) используемого тканевого фактора. Олигонуклеотид ISIS 416850, вводимый в соответствии со схемой непрерывного введения доз, отличался от других олигонуклеотидов, обозначенных звездочкой (*).

Как показано в таблице 116, ПВ значительно не увеличивалось у обезьян, обработанных олигонуклеотидами ISIS в соответствии со схемой введения возрастающих доз или со схемой непрерывного введения доз. Однако, АПТВ увеличивалось в зависимости от дозы, как показано в таблице 117. Полученные данные позволяют предположить, что снижение уровня фактора 11 под действием антисмысловых олигонуклеотидов влияет на путь контактной активации, но не на внешний путь свертывания крови. Поэтому, антисмысловые олигонуклеотиды, снижающие уровни фактора 11, могут быть использованы для ингибирования образования тромбов или сгустков крови, ассоциированного с патологическими изменениями стенок сосудов, но не с повреждением ткани.

Анализ на активность белка

Пробы крови брали в различные промежутки времени и измеряли уровень профермента фактора 11 в анализе на F11, проводимом исходя из времени свертывания крови. Время свертывания крови определяли в дубликате на полуавтоматическом приборе для оценки свертывания крови ST4 (Diagnostica Stago, N J). 30 мкл обработанной цитратом пробы плазмы, разведенной 1/20 в буфере HEPES-NaCl с BSA, инкубировали с 30 мкл реагента для оценки АПТВ (Automated аРТТ, Organon Technika, NC) и 30 мкл обработанной цитратом плазмы, дефицитной по фактору 11 (George King Bio-Medical Inc.) при 37°C в течение 5 минут с последующим добавлением 30 мкл 25 мМ CaCl₂ для инициации свертывания крови. Результаты интерполировали на стандартной кривой серийных разведений обработанной цитратом контрольной плазмы.

Результаты представлены в таблице 118 как процент ингибирования активности фактора 11 по отношению к PBS-контролю. Олигонуклеотид ISIS 416850, вводимый в соответствии со схемой непрерывного введения доз, отличался от других олигонуклеотидов, обозначенных звездочкой (*).

Анализ на фибриноген

Приготавливали образцы, содержащие девять частей свежей плазмы обезьян на одну часть тринатрийцитрата. Эти образцы оценивали на содержание фибриногена на приборе для оценки свертывания крови ACL 9000 (Instrumentation Laboratory, Italy). Результаты, представленные в таблице 119, выражены в мг/дл. Олигонуклеотид ISIS 416850, вводимый в соответствии со схемой непрерывного введения доз, отличался от других олигонуклеотидов, обозначенных звездочкой (*).

Анализ на кровотечение

В различные дни во время обработки проводили анализ на кровотечение с помощью устройства Surgicutt Jr. (ITC, New Jersey). Обезьян помещали на станок для обезьян так, чтобы их конечности находились в неподвижном положении. Конечности слегка выбривали, и на верхней конечности закрепляли сфигмоманометр. Манжету сфигмоманометра раздували до 40 мм рт.ст. и такое давление поддерживали во время всей процедуры. Разрезаемый участок на верхней конечности обрабатывали антисептическим тампоном и с помощью устройства Surgicutt Jr делали разрез на латеральной поверхности, волярной поверхности предплечья, параллельно и на 5 см ниже складки передней части локтя. Точное время разреза фиксировали секундомером. Через каждые 30 секунд, кровь из разреза удаляли с помощью промокательной бумаги, не дотрагиваясь до разреза, так, чтобы не нарушить процесс образования тромбоцитарной пробки. Кровь удаляли через каждые 30 минут до тех пор, пока на бумаге не оставалось пятен. Затем секундомер останавливали и определяли время кровотечения. Затем с конечности животного снимали сфигмоманометр, и участок разреза обрабатывали антисептическим тампоном, после чего рану закрывали повязкой. Результаты, представленные в таблице X, выражены в секундах. Полученные результаты представлены в таблице 120. Олигонуклеотид ISIS 416850, вводимый в соответствии со схемой непрерывного введения доз, отличался от других олигонуклеотидов, обозначенных звездочкой (*).

Эти данные позволяют предположить, что геморрагическая активность рассматриваемых здесь соединений является низкой.

Анализ на агрегацию тромбоцитов

Агрегацию тромбоцитов инициировали путем добавления 1 ммоль/л АДФ и/или 3 мкг коллагена (в зависимости от дня сбора как показано в таблице 121) в пробы плазмы, и эти пробы оставляли на 10 минут. Агрегацию охарактеризовывали путем регистрации изменения электрического сопротивления или импеданса, и изменения кривой первого порядка агрегации тромбоцитов после изменения их формы. Тест на агрегацию проводили два раза для каждой пробы в каждый день сбора, и брали среднюю величину. Олигонуклеотид ISIS 416850, вводимый в соответствии со схемой непрерывного введения доз, отличался от других олигонуклеотидов, обозначенных звездочкой (*).

Масса тела и органов

Массу тела определяли один раз в неделю во время введения доз. Результаты измерений для каждой группы представлены в таблице 122 и выражены в граммах. Результаты показали, что обработка антисмысловыми олигонуклеотидами не приводит к каким-либо негативным изменениям состояния здоровья животных, но может приводить к значительному изменению массы тела по сравнению с PBS-контролем. После того, как животные были подвергнуты эвтаназии, была измерена масса их органов, а затем у них брали почки и селезенку, и измеряли их массу. Результаты, представленные в таблице 123, также указывали на отсутствие какого-либо значительного изменения массы органов по сравнению с PBS-контролем, за исключением животных, обработанных олигонуклеотидом ISIS 416858, у которых наблюдалось увеличение массы селезенки. Олигонуклеотид ISIS 416850, вводимый в соответствии со схемой непрерывного введения доз, отличался от других олигонуклеотидов, обозначенных звездочкой (*).

Функция печени

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли концентрации трансаминаз в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Затем измеряли концентрации ALT (аланинтрансаминазы) и AST (аспартаттрансаминазы) в плазме, и полученные результаты представлены в МЕ/л в таблицах 124 и 125. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 7- кратное увеличение уровней ALT/AST по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований. Также измеряли уровни билирубина в плазме, и полученные результаты представлены в мг/дл в таблице 126. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 2-кратное увеличение уровней билирубина по сравнению с контрольными уровнями, отбирали для дальнейших исследований. Олигонуклеотид ISIS 416850, вводимый в соответствии со схемой непрерывного введения доз, отличался от других олигонуклеотидов, обозначенных звездочкой (*).

Функция почек

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек брали образцы мочи. Затем, после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами измеряли отношение количества белка к количеству креатинина в моче в образцах мочи, и полученные результаты представлены в таблице 127. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 5-кратное увеличение отношения белок/креатинин в моче по сравнению с PBS-контролем, отбирали для дальнейших исследований.

Определение концентрации олигонуклеотидов

Была измерена концентрация полноразмерного олигонуклеотида, а также было определено время разложения олигонуклеотидов и время их выведения из печени и почек. Применяемый метод представляет собой модификацию опубликованных ранее методов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которая состоит из стадии экстракции фенолом-хлороформом (жидким фенолом - жидким хлороформом) и стадии твердофазной экстракции. Перед экстракцией добавляли внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мерный фосфортиоатный олигонуклеотид, модифицированный 2'-О-метоксиэтилом, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT и обозначенный здесь как SEQ ID NO: 270). Концентрации в образцах ткани вычисляли с помощью калибровочных кривых, где наименьший предел количественной оценки (LLOQ) составляет приблизительно 1,14 мкг/г. Затем определяли время полужизни с помощью программы WinNonlin (PHARSIGHT). Результаты представлены в таблицах 128 и 129 и выражены в мкг/г ткани печени или почек.

Анализ крови

Кровь, которую брали у обезьян всех групп, посылали в Корейский Институт токсикологических исследований (KIT) для анализов на НСТ, MCV, МСН и МСНС, а также для определения числа различных клеток крови, таких как WBC (нейтрофилы, лимфоциты, моноциты, эозинофилы, базофилы, ретикулоциты), эритроциты (RBC) и тромбоциты, и для определения общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в таблицах 130-143. Антисмысловые олигонуклеотиды, которые не давали более, чем 50% снижение числа тромбоцитов и более, чем 3-кратное увеличение числа моноцитов, отбирали для дальнейших исследований. Олигонуклеотид ISIS 416850, вводимый в соответствии со схемой непрерывного введения доз, отличался от других олигонуклеотидов, обозначенных звездочкой (*).

Анализы на цитокины и хемокины

Пробы крови, взятые у групп обезьян, обработанных PBS, ISIS 416850 и ISIS 416858 в соответствии со схемой увеличения доз, посылали в Институт Pierce Biotechnology (Woburn, MA) для измерения уровней хемокинов и цитокинов. Уровни IL-1β, IL-6, IFN-γ и TNF-α измеряли с использованием соответствующих антител приматов, а уровни IL-8, MIP-1α, МСР-1, MIP-1β и RANTES измеряли с использованием соответствующих перекрестно реагирующих человеческих антител. Измерения проводили за 14 дней до начала обработки и на день 85, когда обезьянам делали эвтаназию. Результаты представлены в таблицах 144 и 145.

Пример 46

Фармакологический эффект обработки антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на человеческий фактор 11, у собакоподобных обезьян

Несколько антисмысловых олигонуклеотидов, выбранных в исследованиях на их переносимость грызунами (примеры 41-44), тестировали у собакоподобных обезьян для определения фармакологических эффектов, относительной эффективности по отношению к активности фактора 11, и переносимости этих олигонуклеотидов собакоподобными обезьянами, используемыми в качестве моделей. Антисмысловые олигонуклеотиды также сравнивали с олигонуклеотидами ISIS 416850 и ISIS 416858, выбранными в проведенных ранее исследованиях на обезьянах (пример 45). Все олигонуклеотиды ISIS, используемые в данном исследовании, были нацелены на мРНК человеческого фактора 11 и также вступали в полную перекрестную реакцию с генной последовательностью макак-резусов (см. таблицы 44 и 46). Было высказано предположение, что олигонуклеотиды ISIS макак-резуса также вступают в полную перекрестную реакцию с генной последовательностью собакоподобных обезьян. Во время проведения исследования, геномная последовательность собакоподобных обезьян отсутствовала в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI), а поэтому перекрестная реакция с генной последовательностью собакоподобных обезьян не могла быть подтверждена.

Обработка

Группам обезьян, каждая из которых включала два самца и две самки обезьян, подкожно инъецировали 25 мг/кг ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522, ISIS 449710, ISIS 449707, ISIS 449711, ISIS 449708, 416858 и ISIS 445531. Антисмысловой олигонуклеотид вводили обезьянам в дозе 25 мг/кг три раза в неделю в течение 1-ой недели и 25 мг/кг два раза в неделю в течение 2-8 недель. Контрольной группе, состоящей из двух самцов и двух самок обезьян, подкожно инъецировали PBS в соответствии с той же самой схемой введения доз. Массу тела измеряли за 14 и 7 дней до начала обработки, а затем еженедельно в течение всего периода обработки. Пробы крови брали за 14 и 7 дней до начала обработки, а затем несколько раз в течение всей процедуры введения доз для измерения ПВ и АПТВ и определения различных гематологических факторов. На день 55, обезьян подвергали эвтаназии путем кровопускания под глубоким наркозом, и брали органы для последующего анализа.

Анализ на РНК

На день 55, из ткани печени экстрагировали РНК для анализа на фактор 11, проводимого с помощью ПЦР в реальном времени, с использованием набора праймеров и зонда LTS00301. Результаты представлены как процент ингибирования фактора 11 по отношению к PBS-контролю. Как показано в таблице 146, обработка олигонуклеотидами ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522, ISIS 449710, ISIS 449707, ISIS 449708, 416858 и ISIS 445531 приводила к значительному снижению уровней мРНК фактора 11 по сравнению с PBS-контролем.

Анализ белка

Результаты, представленные в таблице 147, выражали как процент снижения по отношению к PBS-контролю. Обработка ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522 и ISIS 416858 приводила к зависимому от времени снижению уровней белка.

Анализ на ПВ и АПТВ

ПВ и АПТВ измеряли с использованием обедненной тромбоцитами плазмы (ОТП), взятой у мышей, обработанных олигонуклеотидами ISIS. Величины ПВ и АПТВ, представленные в таблицах 148 и 149, были выражены как Международные величины нормализованных отношений (INR). Величины INR для ПВ и АПТВ были определены путем деления величины ПВ и АПТВ для каждой экспериментальной группы на величины ПВ и АПТВ для PBS-обработанной группы. Затем это отношение возводили в степень, равную Международной величине показателя чувствительности (ISI) используемого тканевого фактора. Как показано в таблице 148, РТ значительно не увеличивалось у мышей, обработанных олигонуклеотидами ISIS. Однако, АПТВ значительно увеличивалось у групп, обработанных олигонуклеотидами ISIS 416850, ISIS 445522 и ISIS 416858, как показано в таблице 149. Полученные данные позволяют предположить, что снижение уровня фактора 11 под действием антисмысловых олигонуклеотидов влияет на путь контактной активации, но не на внешний путь свертывания крови. Поэтому, эти антисмысловые олигонуклеотиды ISIS, снижающие уровни фактора 11, могут быть использованы для ингибирования образования тромбов или сгустков крови, ассоциированного с патологическими изменениями стенок сосудов, но не с повреждением ткани.

Масса тела и органов

Массы тела животных каждой группы представлены в таблице 150 и выражены в граммах. Результаты показали, что обработка антисмысловыми олигонуклеотидами не приводит к каким-либо негативным изменениям состояния здоровья животных, но может приводить к значительному изменению массы тела по сравнению с PBS-контролем. После эвтаназии животных на день 55, измеряли массу органов, а затем у них брали печень, почки и селезенку. Результаты, представленные в таблице 150 и выраженные в процентах по массе тела, также указывали на отсутствие какого-либо значительного изменения массы органов по сравнению с PBS-контролем, за исключением животных, обработанных олигонуклеотидом ISIS 449711, у которых наблюдалось увеличение массы селезенки.

Функция печени

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли концентрации ALT и AST в плазме на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Затем измеряли концентрации аланинтрансаминазы (ALT) и аспартаттрансаминазы (AST) в плазме, и полученные результаты представлены в МЕ/л в таблицах 152 и 153. Также измеряли уровни билирубина в плазме, и результаты, представленные в таблице 154, выражали в мг/дл. Как показано в таблицах 152-154, какого-либо заметного увеличения уровней метаболических маркеров в печени после обрабоки антисмысловыми олигонуклеотидами не наблюдалось.

Функция почек

Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек брали образцы мочи в различные дни. Затем измеряли уровни BUN в различные периоды времени на автоматическом анализаторе, применяемом в методах медицинской химии (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY), и полученные результаты представлены в таблице 155. После обработки антисмысловыми олигонуклеотидами на день 49 также вычисляли отношение белок/креатинин в образцах мочи, и полученные результаты представлены в таблице 156. Как показано в таблицах 155 и 156, какого-либо заметного увеличения уровней метаболических маркеров в почках после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами не наблюдалось.

Анализ крови

Кровь, которую брали у обезьян всех групп в различные дни, посылали в Корейский Институт токсикологических исследований (KIT) для анализов на НСТ, MCV, МСН и МСНС, а также для определения числа различных клеток крови, таких как WBC (нейтрофилы и моноциты), эритроциты (RBC) и тромбоциты, и для определения общего содержания гемоглобина. Результаты представлены в таблицах 157-166.

Анализы на цитокины и хемокины

Пробы крови, взятые у обезьян всех групп, посылали в Институт Pierce Biotechnology (Woburn, MA) для измерения уровней хемокинов и цитокинов. Уровни IL-1β, IL-6, IFN-γ и TNF-α измеряли с использованием соответствующих антител приматов, а уровни IL-8, ΜΙΡ-1α, МСР-1, MIP-1β и RANTES измеряли с использованием соответствующих перекрестно реагирующих человеческих антител. Измерения проводили за 14 дней до начала обработки и на день 55, когда обезьянам делали эвтаназию. Результаты представлены в таблицах 167 и 168.

Пример 47

Измерение вязкости антисмысловых олигонуклеотидов ISIS, нацеленных на человеческий фактор 11

Вязкость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на человеческий фактор 11, измеряли путем скрининга на антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие вязкость более, чем 40 сП при концентрации 165-185 мг/мл.

Олигонуклеотиды ISIS (32-35 мг) взвешивали в стеклянном сосуде, а затем добавляли 120 мкл воды и антисмысловой олигонуклеотид растворяли в растворе путем нагревания сосуда до 50°С. Часть (75 мкл) предварительно нагретого образца пипетировали в микровискозиметр (Cambridge). Температуру микровискозиметра устанавливали на 25°С, и измеряли вязкость образца. Другую часть (20 мкл) предварительно нагретого образца пипетировали в 10 мл воды для УФ-считывания на 260 нм при 85°С (на УФ-устройстве Cary). Результаты представлены в таблице 169.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> АйЭсАйЭс ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК.

ФРЕЙЕР, Сьюзан, М.

МОНИЯ, Бретт, П.

ЧЖАН, Хун

ЧЖАО, Чэньгуан

КРОСБИ, Джеффри, Р.

СИВКОВСКИ, Эндрю, М.

<120> Модуляция экспрессии фактора 11

<130> BIOL0107WO

<150> 61/105,772

<151> 2008-10-15

<150> 61/174,461

<151> 2009-04-30

<160> 274

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 3278

<212> ДНК

<213> H. sapiens

<400> 1

aggcacacag gcaaaatcaa gttctacatc tgtccctgtg tatgtcactt gtttgaatac 60

gaaataaaat taaaaaaata aattcagtgt attgagaaag caagcaattc tctcaaggta 120

tatttctgac atactaagat tttaacgact ttcacaaata tgctgtactg agagagaatg 180

ttacataaca ttgagaacta gtacaagtaa atattaaagt gaagtgacca tttcctacac 240

aagctcattc agaggaggat gaagaccatt ttggaggaag aaaagcaccc ttattaagaa 300

ttgcagcaag taagccaaca aggtcttttc aggatgattt tcttatatca agtggtacat 360

ttcattttat ttacttcagt ttctggtgaa tgtgtgactc agttgttgaa ggacacctgc 420

tttgaaggag gggacattac tacggtcttc acaccaagcg ccaagtactg ccaggtagtc 480

tgcacttacc acccaagatg tttactcttc actttcacgg cggaatcacc atctgaggat 540

cccacccgat ggtttacttg tgtcctgaaa gacagtgtta cagaaacact gccaagagtg 600

aataggacag cagcgatttc tgggtattct ttcaagcaat gctcacacca aataagcgct 660

tgcaacaaag acatttatgt ggacctagac atgaagggca taaactataa cagctcagtt 720

gccaagagtg ctcaagaatg ccaagaaaga tgcacggatg acgtccactg ccactttttc 780

acgtacgcca caaggcagtt tcccagcctg gagcatcgta acatttgtct actgaagcac 840

acccaaacag ggacaccaac cagaataacg aagctcgata aagtggtgtc tggattttca 900

ctgaaatcct gtgcactttc taatctggct tgtattaggg acattttccc taatacggtg 960

tttgcagaca gcaacatcga cagtgtcatg gctcccgatg cttttgtctg tggccgaatc 1020

tgcactcatc atcccggttg cttgtttttt accttctttt cccaggaatg gcccaaagaa 1080

tctcaaagaa atctttgtct ccttaaaaca tctgagagtg gattgcccag tacacgcatt 1140

aaaaagagca aagctctttc tggtttcagt ctacaaagct gcaggcacag catcccagtg 1200

ttctgccatt cttcatttta ccatgacact gatttcttgg gagaagaact ggatattgtt 1260

gctgcaaaaa gtcacgaggc ctgccagaaa ctgtgcacca atgccgtccg ctgccagttt 1320

tttacctata ccccagccca agcatcctgc aacgaaggga agggcaagtg ttacttaaag 1380

ctttcttcaa acggatctcc aactaaaata cttcacggga gaggaggcat ctctggatac 1440

acattaaggt tgtgtaaaat ggataatgag tgtaccacca aaatcaagcc caggatcgtt 1500

ggaggaactg cgtctgttcg tggtgagtgg ccgtggcagg tgaccctgca cacaacctca 1560

cccactcaga gacacctgtg tggaggctcc atcattggaa accagtggat attaacagcc 1620

gctcactgtt tctatggggt agagtcacct aagattttgc gtgtctacag tggcatttta 1680

aatcaatctg aaataaaaga ggacacatct ttctttgggg ttcaagaaat aataatccat 1740

gatcagtata aaatggcaga aagcgggtat gatattgcct tgttgaaact ggaaaccaca 1800

gtgaattaca cagattctca acgacccata tgcctgcctt ccaaaggaga tagaaatgta 1860

atatacactg attgctgggt gactggatgg gggtacagaa aactaagaga caaaatacaa 1920

aatactctcc agaaagccaa gataccctta gtgaccaacg aagagtgcca gaagagatac 1980

agaggacata aaataaccca taagatgatc tgtgccggct acagggaagg agggaaggac 2040

gcttgcaagg gagattcggg aggccctctg tcctgcaaac acaatgaggt ctggcatctg 2100

gtaggcatca cgagctgggg cgaaggctgt gctcaaaggg agcggccagg tgtttacacc 2160

aacgtggtcg agtacgtgga ctggattctg gagaaaactc aagcagtgtg aatgggttcc 2220

caggggccat tggagtccct gaaggaccca ggatttgctg ggagagggtg ttgagttcac 2280

tgtgccagca tgcttcctcc acagtaacac gctgaagggg cttggtgttt gtaagaaaat 2340

gctagaagaa aacaaactgt cacaagttgt tatgtccaaa actcccgttc tatgatcgtt 2400

gtagtttgtt tgagcattca gtctctttgt ttttgatcac gcttctatgg agtccaagaa 2460

ttaccataag gcaatatttc tgaagattac tatataggca gatatagcag aaaataacca 2520

agtagtggca gtggggatca ggcagaagaa ctggtaaaag aagccaccat aaatagattt 2580

gttcgatgaa agatgaaaac tggaagaaag gagaacaaag acagtcttca ccattttgca 2640

ggaatctaca ctctgcctat gtgaacacat ttcttttgta aagaaagaaa ttgattgcat 2700

ttaatggcag attttcagaa tagtcaggaa ttcttgtcat ttccatttta aaatatatat 2760

taaaaaaaat cagttcgagt agacacgagc taagagtgaa tgtgaagata acagaatttc 2820

tgtgtggaag aggattacaa gcagcaattt acctggaagt gataccttag gggcaatctt 2880

gaagatacac tttcctgaaa aatgatttgt gatggattgt atatttattt aaaatatctt 2940

gggaggggag gctgatggag atagggagca tgctcaaacc tccctaagac aagctgctgc 3000

tgtgactatg ggctcccaaa gagctagatc gtatatttat ttgacaaaaa tcaccataga 3060

ctgcatccat actacagaga aaaaacaatt agggcgcaaa tggatagtta cagtaaagtc 3120

ttcagcaagc agctgcctgt attctaagca ctgggatttt ctgtttcgtg caaatattta 3180

tctcattatt gttgtgatct agttcaataa cctagaattt gaattgtcac cacatagctt 3240

tcaatctgtg ccaacaacta tacaattcat caagtgtg 3278

<210> 2

<211> 26001

<212> ДНК

<213> H. sapiens

<400> 2

atgccctcca taggctttca gaccttcttc aaggccaaag ggaaggcctt catggaaata 60

taattatgtg aaacacccca gaattttttc acaaactttc ctgcctataa acgccaggtc 120

ctaccactgt ccagtgtccc acttcccact gtccagtggg aagactccct ccaggacaaa 180

accacccttt ccttcaggga tgtgacgtgc tgtgctttcg ttgacagtca tgcagctgct 240

agacatgtca cttcctagct ctccattcgg gtctgtgtcc caggacctaa agaaagctaa 300

aagaagccgg gcgtggtggc tcatgcctgt catcccagca ttttgggagg ctgaggctgg 360

cggatcactg gagatcagga gtttgagacc agtctgacca gcatggtgaa accctgtctc 420

tactaaaaat acaaaaaaag aaaagaaaaa agaaaaaaaa ataagctggg cgtggtggcg 480

cgggcctgta gtcccagcta ctccggaggc ggaggcagga caatcacttg aacctggaag 540

gcggaggttg cagtgagctg agatcgcgtc attgcactcc agcctgtgcg acgagagact 600

ctgtctcaaa agaaagaaag aaagagagaa agaaagaaag aaagaaaaga aagaaagaaa 660

gaagaaagaa agaaaagaaa gaaagtaaga agcaagcaag ctgaaatagc ttatttttct 720

gttttaaaaa atagactttt agtgttcaca agtaagaata aaaaaaaaaa aagcttggcc 780

ttaggaggaa tcctatctgc ttaggcctct gagaggcagc gtcacctgaa gggaaactga 840

ctgggcaaga gccaggctct taggagctgt ctgtactttg cttcccatcc gtccgctctc 900

ccccagcagc caaagtctcc tccctccatt atattgcaaa tcaatgaatc cattagactt 960

tccatgtttt ctttttagac tttgagattc aaggtcagct agaattaatg gttaacagct 1020

gacaggtgaa agtgtggtta aatgcagctt tggctagcag gcacacaggc aaaatcaagt 1080

tctacatctg tccctgtgta tgtcacttgt ttgaatacga aataaaatta aaaaaataaa 1140

ttcagtgtat tgagaaagca agcaattctc tcaaggtata tttctgacat actaagattt 1200

taacgacttt cacaaatatg ctgtactgag agagaatgtt acataacatt gagaactagt 1260

acaagtaaat attaaagtga agtgaccatt tcctacacaa gctcattcag aggaggatga 1320

agaccatttt ggaggaagaa aagcaccctt attaagaatt gcagcaagta agccaacaag 1380

gtcttttcag gtacagtttc agaacttact atttaacatt cctctcaagc aaatacgcct 1440

tgaaatgctt tttttaaatc ataggaattt aaaaacactt tacaatagag aatgattgat 1500

ttttaaaatg tgtctgattt agctttgtag agatgttccg ctaatatcca taactaatct 1560

gagaggaaat gtggaacaac agaagagtaa cagtgtctac tcagtaacaa gcgttttacg 1620

agttaaaaag acatccaaat gcagtactga aaaatcagaa gtcttgattt gtctcactga 1680

tgactccgtt tttcctagag cagtctgttt aatgcttact ggagataaat agatttatag 1740

gtgaccaaga caatcgatta atgtatcagc cacagacttt tttaaataga aaattttcta 1800

agtaggaaat cattcatagc tctttgaaag atatagggag aggcctcaag gaaagaaaga 1860

aaggaaaaaa attgggaaag gaaacaaaga tgaaaaattg gggtggggag agcggtcaga 1920

tggtggccat gagaaggatc tgaacacaga gagcggcggg gccggcgggg aaggagggag 1980

gaggggagag cgctgcttcc ctgtgggttc cggcttctgc agagctgtaa gagttgaatg 2040

ccacacacag tcacactaag gaatgctcca ggattgggaa agaaaattca acattataat 2100

gagaacactg tgaatgctat tgaattaact actcccctct ctccctattt cttgtaagtc 2160

ttagtgtcag taaactaatt ataaatttac attttatgtt ctaaaagcat gcaccttttt 2220

ctcattgtag gatgattttc ttatatcaag tggtacattt cattttattt acttcagttt 2280

ctggtggtaa gtagagtgtt atcttaacta tgggctggga gagggaaatc acactgcaat 2340

ctccacacat gtgggagaat cccacaccat ttatgccggg aaggaaataa aatgttttta 2400

ttaacttcct gcctgaggct ccagaggttt tcaaagcagg gtaggaattg aggtgaaaaa 2460

attgtttgta ctggtaggaa tctgtgtcta tatgtgtacc atatctacat ccatgcctac 2520

atacatcatt catttaaatg atatttaaaa gcaatattaa aaagaagaaa tcttgatttg 2580

cctcactaat tagttggttt ttcataaagc agtcagttca atggaacata cacacacaca 2640

taaaatagga attttgtact gaaaaatgtt atgtaactat tcatacacag tttatgcatt 2700

tcaataattt aactaccctg ttaattctcc accctatgtc acatctgcta aatttgttta 2760

taaattactt agccaatatt aagtaggata tatcagtaca ggtattgttt agttccatga 2820

ccattcttta tttaaaatga aagctgaagc attcctttag aaaaatagct tatgtctaca 2880

tgttatattt aatttctgat actattgcta gcattttaag catagtaaat tctttttgct 2940

ggcctatgtg aaaaaaggca aacctaggtg aagatattaa aagtaaattc cacttaatat 3000

attaaattac acagctcata atttcaattt tctctgtgac aagactactg ctcaggttat 3060

aatattcctt tgttataatt atctggaaat tgtattgtta tttcattgat aaatatgtca 3120

gcgctaaata atttgatata ttttgaacac tggacccaat aactacataa acaattgacc 3180

ctgaatcagg ggttccacat ccatggattt aaacaacatt gaagtgaaat tttttaaaaa 3240

aaattatatc tgcactcaac atgtgcagag ttttttcttg tcattattcc cgaaacaaca 3300

cagtataaca acaatttgca tagtatttac attgtactag gtattataag taatctagag 3360

atgatttaaa gtacacagga ggctgtgagt aggttatatg taaatactat gccattttct 3420

atcagggact tgagcgttca tggattttgg tatctgcagg aggtctggca gccaatccct 3480

catagatatc aaggaatgat agtgtacata tttaggtcct ttatacatgc acatggaaca 3540

tttacaaata ttgaccacac acaagcctct gaaacaaggc tcaacaaatt ttaaggggtt 3600

aaaattatac tgatcatgtt attcaatcac cgtgaatggg agctagaata ataataaaaa 3660

gggaattgaa aatctgcaaa cgtttgaaaa ttgagtattt ataatcaccg tgaatgggag 3720

ctagaataat aataaaaagg gaattgaaaa tctgcaaatg tttgaaaatt gagtatttat 3780

acctttttag attaagatga atcagagatg aaatcacaat ggtaattaga aaaggaattg 3840

tacaataatg aaagtacagt atatcaaaac tttgagatgt aaccgaatca gtgttgagat 3900

caaatgtata gatttacatg tatacattag aatacagaaa agggaaaaat taatgatata 3960

agatgacaag aagatagaga atagcaactt aagtgctaag aaattagaag gcagaaagaa 4020

gaaatcgcag aaattaatta aatggaagac acacatattt gagaggtcaa cataacccct 4080

ttctagccca ttttataagg tcagggtaat cttgacacca aaatctgata ggaaaattct 4140

gaggaaaaaa agtcacaggt cttttatctt atgaacatat gtacaaatgt cctaaacaaa 4200

atattatcca acttaaccca gtagattgtt aaaaaaatta aaggatgatt acattgtgat 4260

attgtgacaa agttgggttt attccaggaa tgaaaagttg atttaacatt caaaaatcaa 4320

tagatgtgtg acttcggggt acataccgaa aaaaaagaag ggaaagcagg aactcacaca 4380

gatatacttg tacacccatc tcatagcagc attattcaca ctaacccaaa ggtggaagca 4440

gcccatgtgt ttatcaacag gtgactggat aaagtgtggt acatacatac aaaggaatat 4500

tactcaaccc taaaaagaaa ggaaattctg acacatgcta tgacatggat gaaccttgag 4560

gacattacgc taagtgaaat aagccagtca caaaagaaca aatactgtgg gatctcactg 4620

ataggaggta cttagggtag tcaatttcat caagacggaa attagaacag aggttgccag 4680

gggccgaggg gccaggggaa gggctgaggg ttggtgttta atgggcacag agcatcagct 4740

ggcgaagttg aaaagttctg gaggtggatg gtgctgatgg ttgcacagca atgtaaatac 4800

ccttagtgcc acagaactgt acactcaaga tggctacatg gcacatggta tgctatctgt 4860

cataataaaa aataaaaata attttaaatg ttaatatgtg ccgaaaaatg cttgctaaaa 4920

ttctattaat gatcaaaact ttaaataaac tggaaatgga agagaacttt catcagctat 4980

taaacgatat tttaaacaaa agcaaacaaa aatccaaacc aaaaatcttc aagaaacata 5040

atacgtaata gcggaatatt gaaagctttc ccaagggatt gagaatagga caagaatact 5100

tcccattatt tccatttact cttgactgga ggtactcgtt ggtgcggtaa ggaagggaaa 5160

taaaaggaaa acgattagga ggaacataag ctctcgtttt tcacagatga tgtgattgag 5220

tacctagaaa aatccaaaat taaccatcac ataaattatt tgagccaatt aattaaatga 5280

gtaagaagtc tcgatacaac gtcaatatac aacagcaagc acttgctcgt tcgcaaaagc 5340

agatgaacta gtttttactg acactagaag cagcatgtgt tccatgtgtt ccacatccat 5400

gcactcaaac aaccttgacg tgaaatattt tttaaaaaat tgtatctgta ctcaacgtgt 5460

gcagagtttt tttccaaaat tgttttccaa aaatttttaa atgtttatat gtttaggggg 5520

tgtaagtgca gatttcttac atacatatat tatgcggcgg tgaagtgccg gcttttggtg 5580

tacccatcac ccaagtagtg aacacagcct ccaacaggta atttttcaac gctcacccca 5640

ctcccatcct cccatctagt ggcatattga aaatcaattt gtcttgtaaa attaaataat 5700

ccaattagga gggggatata ttctaaggaa attagtgcat gatgcacaca cacacacaca 5760

cacagaacac gtgtgtgcgc atgtgcacat gagagagagt gagagagaaa ctgggtcttg 5820

ctctgtcgcc caggctggat tgcagtggta aaatcacagc tcactgcagc ctcaaactcc 5880

caggctcagg agatcctcct acctcagcct cccgagtagc tgggattaca ggtggaaaca 5940

accatgccca gctagtattt tttttttttt ttgtattttt tatagagaca gggtcttgcc 6000

atgttgccca ggctggtctt gaactcctca gctcaagcaa tctacctacc ttagcctccc 6060

aaagtgctgg gattacacgc atgagccact gcgcccactc cgcattatta aatatagaac 6120

atttatttga ttcatcagtt aatattcttc ttaaaagtac tattttaatg tagcaagatt 6180

gctttccacc aaaaggtggg gtttccacgg tggggtttcc aaattattct caatggggtg 6240

aggatgtgtg ttatcacacc cccgagccat cagatgctgt cagaaagtga tcactctgaa 6300

gtctttgttt caaataagca cagggtttgg ataaagagac gcaattagga aaggaaaaag 6360

cagaaggctc gttccagacc tggatgagat cctaaaaagc agcagctttt gccagtaaag 6420

atccttgaaa tgattcaatt accctcaaag cactccttgt ctccaagaca atcactcata 6480

agcacaattc cattgaagcc aacgtaccat tttgtgattt tcgtttccac ctgaggctgt 6540

tcattcaata aactcacata aaagtgttta ttgccttgat ttccaaattc aggcgtattt 6600

cctggtaagt agagctactt gccttgcctt tatgagatta ccacctaact agatgtatgc 6660

ccagtaaaat ccaacataac gcatgccatg tactacatca cagaatgtgt gactcagttg 6720

ttgaaggaca cctgctttga aggaggggac attactacgg tcttcacacc aagcgccaag 6780

tactgccagg tagtctgcac ttaccaccca agatgtttac tcttcacttt cacggcggaa 6840

tcaccatctg aggatcccac ccgatggtaa atgcttatgt ttctacatcg aggagacaga 6900

tttttaaagg gagattgcta ttcttaacac atttccatct aacattttat aaaatttaac 6960

attaacaact ggaagataaa ttgtctttca gttgaaatat tgttacagaa agaagtgatg 7020

gtgtttacgc aatttagaaa agaataaata tgcctccaag tgtagacttt ccagcctctc 7080

ctatagtctc atattaatgg tatgtttctt ctgtttgtct caatttttac acttcttaaa 7140

catttcacac tttgcttttc tatcgattat taatttttgt cgtgcttctc aacaaactgg 7200

aacttctccc aactatttta ttagaaaaaa ataaaatatt taaaaagaaa atttgaaaaa 7260

aagtacagta cagtgatccc cctgccacca ccaaaaccgc aatgtttgct atatttgtac 7320

agcaatatac aatatacaat acctatattt gtatacatgt ttaaccgttt gaaataattt 7380

taaaacatga cactttaccc ctaaatactt cagcatgcac tatcctacac aaaagacata 7440

cgaaatttaa caagaattcc tttatattat ttcagttttc cctcaaatat aatttatagt 7500

aattaaccag aatcttacca agagtcactc actgcattgg gtggtttgtc aggtttaaaa 7560

cattttaaac agtccaccaa ccatttgtat tcccatcctg agcttgaaaa tttaataata 7620

agcctttctg tagaattaag ttttcaacat ctttattatt gctacattca caggcattta 7680

tgtagcaccc agaacttata aaatttacta ttccagaacc tagagcaggg attggcaaat 7740

gtcttcttaa taacgcagag taaatatgtt aggctttgtg ggcaaaaccc acagtaaagc 7800

caaggatatt atttaagtat ttatgtcacc acttaaaatg taacaatttg aaaatataaa 7860

aatcattttg tatagctaac aggctaaaca gaaacacaca gatttttggt tgcattttac 7920

caacaggtcc tagttgacac attcctgttt gttcctatta gaaaggagta ttacatgcag 7980

tctcttaagt gtagggatat tgaagtaaaa aacaaactca gaatcttgct aagaaaatat 8040

ttgttttggc atgagataaa gtagtttgtt tccttctttt tggctttctg tgtgctgact 8100

tttaagatcc attattttaa aaacataaat tcctattcat taatatgtat tttttaaaaa 8160

aacaggttta cttgtgtcct gaaagacagt gttacagaaa cactgccaag agtgaatagg 8220

acagcagcga tttctgggta ttctttcaag caatgctcac accaaataag cggtaagata 8280

tgttctcaga atcaacaaat accagctgtg atgtacacat atcgccacat cggatgtggt 8340

tttaaggcta tgaaatgaaa cactgctatg tggaaataaa cccccttaat gaagttcttt 8400

cagtgtagag tataaactag tatacataca tgcctgccct ccaacacact gtaaaaacct 8460

ctttacctca tagaaagaca tatcttacta cctcacttcc catcatttat ttatattctt 8520

tctatttccc agcctaaaat cttaaatgaa agtctttttt tttttgagac agggtctcac 8580

tctgttgtcc aggctggagt gcagtggtgc aatcacagct cactccagcc tcaacctcct 8640

gggttcaagt gatcttcctg ccttagcctc tggagtagct gggaccagag gcatgcacca 8700

acattcccag ctaatttgtt catttttcct agagacaggg tctcactgta ttgcccaggc 8760

tggtctcaaa ctcttggcct caagtgatct gcccgcctcg gccttccaga gtgccgggat 8820

tccatggtgc ccagtcgaaa ttctttatta aacgtattaa tccaaattga aaggagcaaa 8880

tataaaggtt gaagtgacac ttgtcttaat agtgaataga tacttgaatc agttaattag 8940

cgaaataatc agtgcagtta gggagaagag aggctaggtc agaaaatcaa aatgtgaatt 9000

tacaagtcta aaattgttac agtgtaagaa ggacattggc attcttttac tgcttccatt 9060

caagaataag aattttgcag attaatataa cgaaagacct ctgaggaaag gtgggtgaaa 9120

aagttgaaag gatgagtcag gagggacagt tgcttaggtc attgccccta gaatctggaa 9180

ggtactcatg tcttctgctt ttatttccag cttgcaacaa agacatttat gtggacctag 9240

acatgaaggg cataaactat aacagctcag ttgccaagag tgctcaagaa tgccaagaaa 9300

gatgcacgga tgacgtccac tgccactttt tcacgtacgc cacaaggcag tttcccagcc 9360

tggagcatcg gtgagtgagt cccaggacat tcgagtggtc gatgaaaaac agaatcgtga 9420

tttactaaaa agcttttgcc atcaacttta tgccagaatt tattttgaac ccctaaaaga 9480

catttctata atagtactcc tagttttctt catgaaaaat acacttaaag cctaatttgg 9540

atgcatttca tttatggtaa ggagtctatc ttttaataac actgtcagaa aaatatatat 9600

acttggctaa tttcaaaagc gctacacttt taaattggca cttttgaaac agctgcaatt 9660

ggtatgattg tcagtgccct tcccagtcta aaaaatgtta cagtctaaca gaataaaaat 9720

aaaaacctac tctctctctc tctaaataac agttccttac ctaagacaaa atactcatgt 9780

aaaaagtctt atcctgctcc atactggatt ttgaaatatt tcaaggataa atctatcaca 9840

taaggattta aaaattatct gatctctaat aaccaaatct gtgttctcat ctttaaaaat 9900

ttactaggga aatagattat taatttgtat attcagaaat atttgagatg atttagattt 9960

tcatagtaaa ctgcatttat ctggaatcaa cagaaaagtg aaaaacattc aaattactaa 10020

tacttgcgtt ttaacattgg attttaacat tctgctctcc acattcacaa agaggagtga 10080

acagaaagca aacaaagcat caacgagtta tttcaaaaac aacagtggtg aaaaacacac 10140

acaccaaacc cctaaattca tgatttgact tgtaaggctt atctttagct cagctcagac 10200

gacagctttt atgtctaaga cttaacagaa tgtgaactgc aagacaagaa attggaggtt 10260

tctaagcaag ataaagttaa gtcattaaaa gtaagaagga cttagccagg cgcggtggct 10320

cacacctgta atcccagcac tttgggaggc cgaggcgggc agatcacctg aggtcaggag 10380

ttcgacacca gcctgaccaa tatggtgaaa ccccgtctct actaaaaaag aatacaaaaa 10440

ttagccaggc gcggtggtgg gcgcttgtaa tcccagctac ttgggaggct gagacaagag 10500

aatcgcttga acccaggagg cggaggttgc agtgagccaa gatcgtgcca ttgcactcca 10560

acctgggcaa cagagtgaga ctccgtctca aataaaaaaa aacaaaaaat gagaagggct 10620

tgagaagtca ttcattcatg cactctcctt cttcatgtgg tcactctctc aagctgtcat 10680

tatactgaag aagaaataaa cttacacaat tcacaggtgc ttagcaacac tgctgggacc 10740

atgcccagcc attcagcctc ccagatggat gcttcggggt ctcgcaggtc ctctctccaa 10800

aggggacttt cttaatatct catgtttttt cctccttgca gttggaagaa taagacactt 10860

ttcctttttc tttttattca gtaacatttg tctactgaag cacacccaaa cagggacacc 10920

aaccagaata acgaagctcg ataaagtggt gtctggattt tcactgaaat cctgtgcact 10980

ttctaatctg ggtaattatc gacttcttga tgatgtaatt caaccattaa atatgctgat 11040

gattacagta gatctcactc aggataccag cttatgctca cgatgaaacg gacccaaaga 11100

tctttacctt cttcatgtga tagatttcat catgtcctat acagttagat cctctattta 11160

aatttccagt ttaaaataat catgccattt tcttctaaat aaaaaaaaat taaaagatct 11220

tgggatacac ttaaattttt taatatggaa tttacacata ctgtgaccgg aattttcctg 11280

atagctggtg aattgagtcc ctgacatagt tcttccgtcg cgcagcttgt attagggaca 11340

ttttccctaa tacggtgttt gcagacagca acatcgacag tgtcatggct cccgatgctt 11400

ttgtctgtgg ccgaatctgc actcatcatc ccggttgctt gttttttacc ttcttttccc 11460

aggaatggcc caaagaatct caaaggtaag gagttaacaa gtaaggataa tttgttatct 11520

tctaaaaata gctgatcaaa atccatcatt aaaaattcca agtaactaaa aatttactct 11580

aaatgtcagt ataggataaa agttgcaaag aatttctagc ccctctccct ttctattccc 11640

cacctactta ccacaaaccc aacattaccg aggactcttt tttttttttt tttttttttg 11700

agatggagtc tcgctctgct gcccaggctg gagtgcggtg gcatgatttc agctcactgc 11760

aaccttcgcc tcccaggtcc aagcgattct cctgcctcag cctcctgagt agctgggact 11820

acaggcatgg gacaccacgc ccagtaattt tttttgtatt tttagtagag atggggtttc 11880

accatgttgg ccaggctggt ctcaaactcc tgacttcagg tgatccacct gcctcggcct 11940

cccaaagtgc tgagattaca gggttgggcc accgtgcccg gccagtaaat tttaaaataa 12000

atataaatat tacttcacct aaataaattt taggtacagg tacagttgtg ttacatggat 12060

atactgtgta gtggtgaagt ctgggctttc agtgtagcca aatagtatac attattccca 12120

ttagataatt tctcctgcct caccctcctc tatcctccca actctctgag tctccaatag 12180

ctttcattcc actgtctctg tgcctgtgta cactttattt agctcccact taaaagtgag 12240

aatctacaat atttgacttt ctgtttctga gttgtttcac ttgagataat agcctccagt 12300

tctatccatg ttgctgcaaa agatatgatt ttatgatttt tttatggcta agtaacattc 12360

tatagtatat tctatacacc acattttctt tatccattca tttgctgata gactcttagg 12420

ttgatccata tctttgttat tgtgaatagt gctgcagtaa acatgtgagt gtaggtatct 12480

ttgtgacatg attttttttt ctttcttttc ctttggctat gtacccagta gtgggattgc 12540

tggaggtctc caccttggca aaggggcagt tgtctagttc taaatgaaat gaagagattc 12600

catttccatt tcatgacaac taaaagacaa ttcagtccaa tgctttgttt aaaataattg 12660

aaccaggaac agaaagagct gaaaatgtca gtgaaatgtc aaacccaaag tggagagaga 12720

gagagaggtg gaaatgaatg tctccatcaa gtgggttagg gtggtggtgg agggaggttt 12780

gagaattgag tccctgtttc cttaccaatg gaaattaaca taggacatca gaaacagcat 12840

ggaaaatttc tttgattatc aaaagtacac tagctaaggt tgctgtccct cttttattta 12900

tttatttatt tgagacaggg tcttgctctg tcactcagat ttggttgcac tgggtgtgat 12960

ctcagcccac tgcagcctcc acttcctagg ctcaagcaat ccacccgtct catcctccca 13020

agttgctggg accacaggtg tgcaccacca cccccagcta atgtttgttt ttttgtagag 13080

acagagtttc gccatgttgg ccaggctggt ctagaactcc tggcctcaag caatccacct 13140

gccttggtct cccacagtgc agggattaca agcctgagcc actatgccca gcttgctatt 13200

cctcattgac aacattcact taaacaagca aacaaatatc cgtaaaatta agtcagcttt 13260

aaaacctggc ttgtatatat ctctgaattg gaactctcag agccctcagc acttgcctga 13320

ttggcctcct gttgatgaaa agttgtcctc cagacaactc agccaaggga ggccctgtgt 13380

gccttgccta tcacatgagc ctcactttcc actgagtgag gctgtcattt cagaagcacc 13440

gggtctgtca catgaaaata tatctgttac catcacttac taaacaaatt tagtagaatt 13500

tgtttggtgc ttattatgta tcaggcattg ttctgaaggc tggggatacc atttagtgaa 13560

ctaaatcgac aaaaactttg cctattggac cagagtggag atgagagaga agtgaccaga 13620

tcgatctgtg ttatcagcag acagccaata agatttgctg ataggttgga ccacggattg 13680

tgaaggagtc agtgatagca ccaagacttt tggcccaagg aactggaaag atggaaatgt 13740

caatgacaga atgtggagga tttcgcaagc agcagagtgt aggagaagca atgcccttgg 13800

ctcatctagg gcaaagggtt gaattggcaa ctggaaatag aagtcaaatt cagaagagag 13860

gtttatgtgg acatctgtgt ttaggtgtca ccaatataca gctgatactt tttaaaaatc 13920

tagtgaaatt atcaaagggt taaatgcaga gagggaagaa agtaggtcca aagatcaagc 13980

cttgggacat tggaagttta gaaataagaa agatgtcatt gtcacttgta attttgtgct 14040

agtcactgct ctttttcttt gtcttattac cttactgacc aattcctaga ataggaataa 14100

cacatttgat ctttaataca gtatgtgata ggaacatggc ttctataagc ccaaacttgg 14160

caatttaaat ttaaatttat taaaattaaa taaaactggc tgggtgcagt ggctcacgcc 14220

tgtaatccca gcactttggg aggccgaggc ggtgaatcac gaggtcagga gtacgagacc 14280

atcctggcca acatggtgaa accccgtctc tactaaaaat acaaaagtta gccaggtgtg 14340

gtggcatgtg cctgtaatcc cagctactca agaggctgag gcaggagaat cacttgaacc 14400

cgggaggcgg aggttgcagt gagccaagat cgcgacactg cactccagcc tgggtgacaa 14460

gagaaagact atgtctcaaa aaaaaaaaaa attttaaata aaactaaaaa ttcaccttcc 14520

cagctgtgtt agccacattt caagtgccca atagccacat gtagttggca gttactgtat 14580

tggatggcac aggcatagaa tatttccatc actgcagaaa gatctatgga cagtcttgct 14640

ctagactgtg attttgtcta cttaggaaaa gtcactcttt tccaggaaga tgcttccagg 14700

gtgtggagta aacgacggac ttcacccatc tccttataaa cctattgcaa ccctggatag 14760

gaggtttcta ggtagcatga agactcttga atctttaaga taggctggga gtgttgaaag 14820

gaaggaaatg aaaagggaag atactaggaa gactgacaat agagcaagct cagaaaattt 14880

ttatggaggt gatttagtta gaaaatttgt ctgcaaccta agggccatgg agtgtgactc 14940

catggtttat gggtgtaact ccgtggttta tgaagagtac tttcaaaata ggaaaatctt 15000

cacaactaag tgctagcatg agctgacttt actttctcta ggtgctgtaa aaatgttttt 15060

atgtgtttga tatgatatat ttctacttcc cttttgtttt tgttagaaat ctttgtctcc 15120

ttaaaacatc tgagagtgga ttgcccagta cacgcattaa aaagagcaaa gctctttctg 15180

gtttcagtct acaaagctgc aggcacagca tcccaggtaa actgagagtt ctgcattctg 15240

gctgagagtg accagccccg aggaggctga tacatgctga gggagggtct cactctgaca 15300

tgtggtctgc tgtctagtgt tctgccattc ttcattttac catgacactg atttcttggg 15360

agaagaactg gatattgttg ctgcaaaaag tcacgaggcc tgccagaaac tgtgcaccaa 15420

tgccgtccgc tgccagtttt ttacctatac cccagcccaa gcatcctgca acgaagggaa 15480

gtaagccata tgaagggtta tgcagacacc cttgtcccgt ctgcctgtga ggtgcattat 15540

gtttataccg ttttgtttcc aactgcaggg gcaagtgtta cttaaagctt tcttcaaacg 15600

gatctccaac taaaatactt cacgggagag gaggcatctc tggatacaca ttaaggttgt 15660

gtaaaatgga taatggtgag tataatgtca cttgaaaaaa tatagctgaa ggaattattc 15720

catgcttcat acatcacaat caagactgtc agttatagcc acagaaggga gaacattcag 15780

gaaataacaa attttgcaat tttctattat tttcactcct gtcactcaag ctgaccatgt 15840

tttaaaggta aatattgagg cttgactaaa ctgtacattg cctagtatta actaaatata 15900

tgctttaatt tgacacattt atacacctgg catttctgtt ttctttcttt cttttttttt 15960

tttttttttt tgagacacag tctcactctg ttgcccaggc tggagtgcag tgatgtggtc 16020

agtgttcact gcagcctctg gcttgaactc ctggactcga acaatcctcc caccttagct 16080

ccctgagtag ctggggctac aggcgtgcac cacaacactc ggctaatttg ttgtagagat 16140

gggatcttgc catgttgccc aggctggtct tgaactcctg ggctcaagca atcctcccgc 16200

tttggcctcc caaagttctg ggattacagg cttcagccac tgcacccagc cacaactggc 16260

atttcctaat gagacccaga ctctgccaac actcctgtta tcaaggccag taatctttcc 16320

tattatcctt tgtaagggaa ttatcgatca gcactttggt tagtcaaatt actaattttc 16380

ttccaaaaat tgtgtatcta ttcaagaaat actggagcac ctccttttta gggtctttat 16440

tcagattcca tgcagggttc tggagactta gggattggca aaggttaagg taaaacttta 16500

ctagtaacaa tgagtgtggt aggatggaaa taagtgttta gattacacga gacctgtaat 16560

aacataaaag ttacaataaa aatccaacca gcagtgtttc catcccagtg gccaatttct 16620

gagcatagtc acgagagatg ctttgtaggc aaacagaatt gttctaaggg acaaaatccc 16680

caacaggaaa gaacacacca caaacactcc tgcttaaatt accatagtaa cttaggatgg 16740

ctttactata tattgattta cataaagctg catgttctta tactgtttat tgccaaatgt 16800

ccaatattac aatacactat aaggtgcaac tgagatttaa tgaataaaat ggaagtaaca 16860

atcctgcctc gtgatagttt tagaagcaca aaaacattct gtgtcagatt atctgctgta 16920

ccgagaaggc gaatcaatcc ttaatttctg agaacttgtt ttgtagaaca taaagacgtt 16980

atattgcctc caacactggt atcctaacta acagactatg ccttcctaga gcttagaggc 17040

gctccgatga aaatctctgg atggctcaag acttcttaaa aagcaagtca attacgtcgt 17100

atctcataca ttctgttttc ctcacaataa atttccctaa gacaagaagg agcattcggc 17160

accattctgt tgtctttctt ctacttctaa gcgttagaag ggacacttag caaatgttgc 17220

tgttaagtaa tgttgacatg gtttaataaa atgggaatga gcacgtatac ctcaatacat 17280

tgcagactgc attttccccc ttccttcttc attatggttt tctctgttgg atttatagac 17340

tctggcctgt agaagttaca gaatatgcca ggtatagatt gatagctaca ggagaaaatg 17400

taagataaag gaaaataaag tcttacgtct tttcagtgca actttggagg gagtgaatta 17460

gataactagg tttttactgc gctgtatttg atgaaataac cccctaatgt gaaagggaat 17520

agctgcgtga gatatttatg gtgccttgtc tgtcactggt ctacaatgta acttaacttt 17580

ctgaagatag atagcagcac cattaaaata aacatttctt accacaaaat atgattctaa 17640

acacatattt tcagcatttc gtttaaactg agaaacagca taggatgaac ctcaaggcct 17700

ctcacctgga ccttgagtta tttctaaaat atcttagtta ctatttacct attaattttc 17760

ctaaaattta cctttatgac gcttcccacc ttgcagaaat tccagaatag atggccctcc 17820

aaaatgaatg ttcacccttc cggctctaaa atgagagcct ctgttcaggc ttccgaagtc 17880

acatcgtgct cgttctcacc tcagttgctg ttagctgctg tttccttccg aactccttct 17940

ctcatcctct cctcctattt gaaatctgcc ccagaattat acactcattt tcctaccaag 18000

gaaaaaaagg cctagaaagg ttgttttaca cccacaaaac tagtgaatgg accttctagg 18060

acccggcttc tcatcagtga ttcttctgtt aacttagact cctcccttag ctcaggacgc 18120

ggagccttct gagcacctga gcctggttat tctaaatgtg atctgggcac agcacattga 18180

catcacctgg gagcttgtta gaaagaattt caggacccac acagatgtta ctgagtcaga 18240

atctgcattt tgaaagctac acaggcaacc cacaggcaca taaattttga gtcgcatagg 18300

tgtgtgcgtg tgtgtgcgca tgtatgtgtg cgtgtgtttg tgtgcacgtg tgtgtgtgtg 18360

tgtctagaat actgctgtct acgaacaccc tattcccatc catctgtgtt ccatggctcc 18420

aaccgggagg gtgggttctt gtgtcgggca tccagtaagt agaaatagag ggcactgtcc 18480

tgtctaggca gccccaagag aaaagaaaca gagggatgag cctgagtcaa agtccctgaa 18540

aagtaccaag gaccccagag aatcccaaac tgtcaacaag gccaaaggtc agaggaagtt 18600

catagcagat cagtcttact ttggacgtgg gtggagcagg agtgactggg atcatggtca 18660

gcagagtcac tgggacaggg caggaactgg acaatggctg cagcctgcgg gcaaggtgct 18720

tgccttttct ttctaagagc agttctcaaa cgccagcagg gctggttcaa acacagatgg 18780

ctgagcttcc aggctggagt ttctcattca ctggatctga ggttgggctg aagaatgtgc 18840

atttctaaca cgttcccagg tgacgctgtt ggtctggaga ctgcacttga caaccactgg 18900

tttaaaaaca ccattcacgt tatcatttga aggagggtaa gacagccttg tagtaccaca 18960

caaggagggc tacattctta ggggtgtgta attacaagat gacttagtca attccatttt 19020

tcatgtgcat gttttgcttt ggcagcttga ttataaagtc tctgtaactc agggtcatga 19080

taaactattg acttgaggaa aggttttctt cttgttcctg aaggagcata attactgatg 19140

gaaaggaaga tgtaggaagc tgctcatcac aatgcttctg ttgcagagtg taccaccaaa 19200

atcaagccca ggatcgttgg aggaactgcg tctgttcgtg gtgagtggcc gtggcaggtg 19260

accctgcaca caacctcacc cactcagaga cacctgtgtg gaggctccat cattggaaac 19320

cagtggatat taacagccgc tcactgtttc tatgggtcag taccacggct gtttttatta 19380

gttcatcttc ttcacacatt tataaaaaat attactagca tgttaggaaa taaatacttt 19440

aaccaattag attgtcttat ttgcaaaatt aattaattgc ttcagtggta aaaaacgcaa 19500

aaaggaagag ctcatggtct cccagcatca gaacaggtgc aggtacaagg ctgcttgact 19560

gcctgctatt ccgcttccca tttaaccgca ttcacatccc caagggcctt catgttattc 19620

cctgcaagag catacctccc tctgtgcctc gctctgtgca ctgtgcccgg aactaaactc 19680

acagaggatt taccattgtc tgaatcaaat ttctaatatg tgtgtgtgtg tgtgtgcgtg 19740

tgtgtttaaa tacagaaagt ggccaggtgt ggtggttcac gcctgtcatc tcagcacttt 19800

gggtggctga ggtgggagga ttgctcaatg ccaggagtct gaggtcagcc tgggcaacat 19860

agtgagacct cgtctctaaa aaatatttaa aaactagcct ggcatggtgt tttgtgtgcc 19920

tgtagcacca gctgctcaga agtctgaggt aggaggattg cttgagccca agagttcaag 19980

ggtgcagtga gttactacag tgccactgtg ctccagcctg agcaacagag caagacccta 20040

tctctaagta aataaataaa atacagaacg agttcggtat gcatcctcac attggattcc 20100

ttacttaggt cactttcagc gttggccaaa caaaaaggct ccagctgggg gtatatatat 20160

tccagggaag ttaagttggc caaactttcc gtttgctact tcagtatcct ccgagttgtt 20220

tccagacaca gttttgtgtg ctttttagtt ttggttttct tttttaatca atctgcagca 20280

cactcatgtt aaactcaaga acacatgtga ggccaagagt tcccgttacc tgtcacatat 20340

gggaatggag tagcagaaag cctagtttct gtcacagcta gttactggcg agattgagac 20400

tgagtccagc ggtcttcgtg tgtgtgtgtg cgtgtgtgtc tgtgcagtgt gcgtgtgtgt 20460

gcgtgtctgt gtgtgcgtgt gcgggtgtgt gcgtgtgtgt gtgttggagc acggagggag 20520

tgctcattca ttttttgtgt ataatggatt ttctttatag ggtgaatatg ttttttatcc 20580

cgaaaaatct taggataaaa tcactttttt ctacctaaat gtccatcatt ggcagaaaat 20640

attagtaata attaaacagc cacacacttc acaatgtctg ggaattattt ttagtaaagg 20700

aaatttcttt ccctctgttg tttgctcctt agggtagagt cacctaagat tttgcgtgtc 20760

tacagtggca ttttaaatca atctgaaata aaagaggaca catctttctt tggggttcaa 20820

gaaataataa tccatgatca gtataaaatg gcagaaagcg ggtatgatat tgccttgttg 20880

aaactggaaa ccacagtgaa ttacacaggt acggagaatt ttatccggaa agttgtctcc 20940

aatggtgaac tggataaaat gtttaacact actagactta cggcctgacc ctgccaatct 21000

ctccatgcgt tatcatcatg aaagggagag ggcctggaat gctagtcatt cactctgcta 21060

aggctgacac actttcctgg ctattgaaac ttattttggg aatgtgggta aagagatacg 21120

ttttcctgag tcttcttcag gtgcatagaa tgacataatt tcataatact ttggaatagt 21180

aaagataatt tagtctaaag ataatttatt aaagataatt tagggatgaa ggattgaagg 21240

ttagaacaat taagcaactt gtgcaggatc aaagtgagtt ggatgaggag ttagcggtga 21300

gggtgaggct tgtctctctc tcgccctctc atcctggcac atgtgcgata tcgtgctgaa 21360

cctgagggag gaaaatacac gacaacaagg caaaaaatga atatagtaaa caaagaaaac 21420

acagataatg tacagtggaa gaagagtctc ttctggaaaa gaggatatat tttgcgtctc 21480

atatttaaac cacgattttt taaatttaga ttctcaacga cccatatgcc tgccttccaa 21540

aggagataga aatgtaatat acactgattg ctgggtgact ggatgggggt acagaaaact 21600

aagaggtaaa aatgatgttg ttatatgtgc tccatcctag aaatgaagag cggaaccttt 21660

tctgccctgt caagtcatgt agctgaagca caactcgagt cacactactc agttgcagga 21720

agcggattaa taaagatgga gaggcaaaaa tcacccaagt gaggctggtg cctcatatgt 21780

ttgattggaa attttaaatg tgactaaatc tctttaaaga ctaattatat ttaatgaagt 21840

ttaatgtgaa gcctagcact tttcagtaaa tgttctagcc tgctatccaa ttactttctt 21900

gggaagtcat tccagttaga gtcataatta atttttgaac ttaattaaca ttaacaaaat 21960

ggtacacgca atagtgggaa taatgtcttc ttcatacttg taattataaa aggtctgtga 22020

agtaaatcta acattttttc cttctagatt tttatataga catgagtttt gtgttgttgt 22080

tgttttgaga tggactctcg ctctgtcgcc caggctggag tgcagtggca cgatctcggc 22140

tcactgttac ctccacctcc cgggttcaag tgattctcct gcctcagcct cccgagtagc 22200

tgggattata ggtacccaac caccacccca agctaatttt ttgtattttt agtagagacg 22260

gggtttcatc atgttagcca ggatggtctc aatctcctga cctcgtgatc cacctgcctc 22320

ggccttccaa agtgctggaa ttacaggcgt gagcccccac acccgtccat gatttttatt 22380

ttaaatatat gtggcccagc accactggtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggga 22440

ggccaagatg ggtggatcac ttgaggtcag gagttcaaga ctggcctggc caacatggtg 22500

aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaaat tagctgggca tggtggtgtg tgcctgtaat 22560

cccagctact cgggaggctg aggcaagata atcgcttgaa cttgggaggt ggaggtagca 22620

gtgagctgag attgcaccac tgcactccag cctgggcgac agaaagagac tccgtctcaa 22680

ttaaaaatat atatatatat atatttatat gtatgcatat atgtttatgt gtattgtgta 22740

tggttattct acaaacgaac caaaaaaatt tttttcagac aaaatacaaa atactctcca 22800

gaaagccaag atacccttag tgaccaacga agagtgccag aagagataca gaggacataa 22860

aataacccat aagatgatct gtgccggcta cagggaagga gggaaggacg cttgcaaggt 22920

aacagagtgt tcttagccaa tggaatatat gcaaattgga atgcttaatg cgttggggtt 22980

tttttgtttg ttttgttttt tttgtttgtt tttttttgag acagagtctc gctctgttgc 23040

ccaggctgga gtgcagtggc tcgatctcag ctcactgcaa gctctgcctc ccaggttcac 23100

gccattctcc tgcctcagcc tcccaaatag ctgggactac aggcgccagc taccaagccc 23160

agctagcgtc tttttttttt ttagttttag tagagacggg gtttcaccat gttggccagg 23220

atggtctcga tctcctgacc tcatgatctg cctgcctggg cctcccaaag tgctgggatt 23280

acaggcgtga gccaccgcgc cgggccgctt aatgcatttt aaaaagcagt cttctgccaa 23340

tgagcaggga acacagtgta tttgtttgac ttagactgaa atcaaaagca aggagattga 23400

ctggatgaac gcaagcaccc aggttctctg cagtatatta aggggccaag acaacatttt 23460

aggcaaaatc agcctgagca agatgtgctg aagatgggaa gcgtctgagt tgatctgtgc 23520

accttttctt gtctcccctc gttctaggga gattcgggag gccctctgtc ctgcaaacac 23580

aatgaggtct ggcatctggt aggcatcacg agctggggcg aaggctgtgc tcaaagggag 23640

cggccaggtg tttacaccaa cgtggtcgag tacgtggact ggattctgga gaaaactcaa 23700

gcagtgtgaa tgggttccca ggggccattg gagtccctga aggacccagg atttgctggg 23760

agagggtgtt gagttcactg tgccagcatg cttcctccac agtaacacgc tgaaggggct 23820

tggtgtttgt aagaaaatgc tagaagaaaa caaactgtca caagttgtta tgtccaaaac 23880

tcccgttcta tgatcgttgt agtttgtttg agcattcagt ctctttgttt ttgatcacgc 23940

ttctatggag tccaagaatt accataaggc aatatttctg aagattacta tataggcaga 24000

tatagcagaa aataaccaag tagtggcagt ggggatcagg cagaagaact ggtaaaagaa 24060

gccaccataa atagatttgt tcgatgaaag atgaaaactg gaagaaagga gaacaaagac 24120

agtcttcacc attttgcagg aatctacact ctgcctatgt gaacacattt cttttgtaaa 24180

gaaagaaatt gattgcattt aatggcagat tttcagaata gtcaggaatt cttgtcattt 24240

ccattttaaa atatatatta aaaaaaatca gttcgagtag acacgagcta agagtgaatg 24300

tgaagataac agaatttctg tgtggaagag gattacaagc agcaatttac ctggaagtga 24360

taccttaggg gcaatcttga agatacactt tcctgaaaaa tgatttgtga tggattgtat 24420

atttatttaa aatatcttgg gaggggaggc tgatggagat agggagcatg ctcaaacctc 24480

cctaagacaa gctgctgctg tgactatggg ctcccaaaga gctagatcgt atatttattt 24540

gacaaaaatc accatagact gcatccatac tacagagaaa aaacaattag ggcgcaaatg 24600

gatagttaca gtaaagtctt cagcaagcag ctgcctgtat tctaagcact gggattttct 24660

gtttcgtgca aatatttatc tcattattgt tgtgatctag ttcaataacc tagaatttga 24720

attgtcacca catagctttc aatctgtgcc aacaactata caattcatca agtgtgattt 24780

tttttttttt tttttgagat gaagtctcac cctgttgccc aagctggagt gcagtggtgt 24840

gatctcggct cactgtaaac tctacctcct ggattcaagc gattgtcctg cctcagtctc 24900

ccaagtagct gagattacag gcacatgcca ccatgcccgg ctaatttttg tatttttagt 24960

agagacgggg tttcactatg ttggccaggc tggtcttgaa ctcctgacct cgtgatctgc 25020

ccacctcggc ctctcaaagt gctgggatta caggtgtgag tcactgcgtc tggccatgga 25080

aaatatttat tgagcacaat tatgtgagag catcatgctg agctttgaag atacagtggt 25140

gagcaaacat atatcctggc ttcatgaaga ttatactcta gttaacatga gcaacaaaat 25200

aaaataatca cacaaaatat ataggttcaa gctgaaatga gtggctgcac cagattctat 25260

gagataagaa aggaagaagg acatttttca ccaagttcaa agactgggat acaaaggaat 25320

ttgtcctgac aaaggcaaaa caaaaacaac aacaaacaaa aaacccaaaa gagcaaaatg 25380

acagtagaac ataacggggc cagatcaaaa atgctgacag gttcccaaaa gaataaaatg 25440

acggtaggac atgacggggc cagatccaaa atgctgacag gttcaaacaa aattggaatt 25500

gaaaatcaga gtgcgttcaa gagtatcaaa caatactatc ttgttacttg cttattacct 25560

tagtagactg gaagcaacac ttcacacaaa aaaagggttt ggatgtaatt tcggataaga 25620

agagatgttt ctgtaaagtc tttcctgaga agcatattat ttgagaaaaa cacatatttc 25680

tgtttttagt atttcacttt gtataatgtc ttaatttttg aagagctggt atattcctat 25740

gattcattaa tgaaagttct ataagatata aaatatacaa tgaggagatc tcctcttctg 25800

taccagaaga gtgcacattc tacacactgc gtagcacctt tctcacttac gttctgtctg 25860

ggcacacttc tgattgacac gcagagggct ctctctgtct ggggatattt ctgatgggta 25920

ccgagagagc ttcctctatc ttgggttatt tctgatgcgt agagaagggc tgcctctgtc 25980

cattatggaa ggctggtgtt c 26001

<210> 3

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 3

cagcctggag catcgtaaca 20

<210> 4

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 4

tttatcgagc ttcgttattc tggtt 25

<210> 5

<211> 29

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 5

ttgtctactg aagcacaccc aaacaggga 29

<210> 6

<211> 2246

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 6

ggataccggc tcacgtagaa aaaggacaag actataggaa agaaagcaaa cactccgccg 60

aggactacag caaagacaga aagtatctgc aggatgacct cattacatca ggtgttatat 120

tttatctttt ttgcctcagt ttctagtgaa tgcgttacta aggtcttcaa agacatcagc 180

tttcaaggag gtgacctgag tactgttttc acaccgagcg ccacatactg ccgcttggtc 240

tgcactcacc acccacggtg cttgctcttc acgttcatgg ctgagtcatc ttcggatgat 300

cctaccaaat ggtttgcctg catcctgaag gacagcgtca cagaaatatt gccaatggta 360

aacatgacag gcgcgatctc tggatattcc ttcaagcaat gccctcagca attaagtact 420

tgcagcaaag atgtgtacgt gaacctagac atgaagggca tgaactataa cagctctgtc 480

gtgaagaatg ctcgagaatg ccaggagaga tgcacagacg atgcccactg ccagtttttc 540

acatacgcaa cagggtattt tcccagtgtg gaccatcgta aaatgtgtct tttgaagtac 600

acccgaacgg ggacgccaac cacaataacg aagctcaatg gcgtggtatc tggattttca 660

ctgaagtcct gtggactttc aaacttggct tgtatcaggg acattttccc taacacggtg 720

ctggcagacc ttaacattga cagcgtggtg gccccagatg cttttgtctg tcgtcgcatc 780

tgcacgcatc accccacttg tttgttcttc acattctttt cccaagcatg gccgaaagaa 840

tctcagagac atctttgtct ccttaaaacc tctgaaagtg gattaccaag cacacgcatt 900

acaaagagcc acgccctttc gggcttcagt ctccagcact gcaggcacag tgtcccagta 960

ttctgccatc cgtcctttta caacgacact gatttcttgg gagaagagct ggacatcgtc 1020

gatgtgaaag gccaagaaac ctgtcagaaa acgtgtacca ataacgcccg ctgccagttc 1080

tttacctact atccatcgca cagactgtgc aatgagagga accgcagggg cagatgttac 1140

ctaaagcttt cctccaatgg atctccaacg agaatacttc atgggagggg aggcatctct 1200

ggatactcac tgaggctgtg caaaatggat aatgtgtgca caactaaaat caaccccaga 1260

gtggtaggag gagctgcgtc tgttcacggt gagtggccat ggcaggtgac tctgcacatc 1320

agccagggac acctgtgtgg aggctccatc attggaaacc aatggatact gacagcagct 1380

cattgtttct ctgggataga gacacctaaa aagctgcgtg tctacggtgg cattgtaaat 1440

caatcagaaa taaatgaagg gactgctttc ttcagggttc aagaaatgat aattcatgat 1500

cagtatacga cagcagaaag tgggtatgat attgccctgt taaaactgga atcagccatg 1560

aattacacag attttcagcg gccaatatgc ctgccttcca aaggagatag aaacgcagtg 1620

cacacagaat gctgggtgac tggatggggg tacacagcac taagaggtga agtacaaagt 1680

actcttcaga aagccaaggt tccattggtg tcaaatgaag aatgtcagac aagatacaga 1740

agacacaaaa taaccaataa gatgatctgt gcaggctaca aagaaggagg gaaggatacg 1800

tgcaagggag attctggagg gcccctgtcc tgcaaataca atggggtctg gcacttggtg 1860

ggcatcacaa gctggggtga aggctgtggt cagaaggaga gaccgggggt ctacacgaac 1920

gtggccaagt acgtggactg gattctggag aaaactcaaa cagtctgaaa gagttcaact 1980

ggtatcactt tgtggccctg gaagattatt ccatagaaat gagcttgacg tctctgatga 2040

agacactggg atactgactc ttccactgta accaattgaa tggccttgat gtacgtaaga 2100

acacccagaa agaaaactat tattttcaga attcctgatc tgggagaacc actggttgtt 2160

ttctgcatcc agctactact caaggaaaca aatacagcaa ggagatttta aaaataaaaa 2220

cacatcagat atataaggaa aatatc 2246

<210> 7

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 7

acatgacagg cgcgatctct 20

<210> 8

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 8

tctaggttca cgtacacatc tttgc 25

<210> 9

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 9

ttccttcaag caatgccctc agcaat 26

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 10

tcctggcatt ctcgagcatt 20

<210> 11

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 11

tggtaatcca ctttcagagg 20

<210> 12

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 12

aaggacctac actatggaat 20

<210> 13

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 13

cctctgaaag tggattacca 20

<210> 14

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 14

tcggaagcga ctcttatatg 20

<210> 15

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 15

ttcaaacaag tgacatacac 20

<210> 16

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 16

tgagagaatt gcttgctttc 20

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 17

aaatatacct tgagagaatt 20

<210> 18

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 18

agtatgtcag aaatatacct 20

<210> 19

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 19

ttaaaatctt agtatgtcag 20

<210> 20

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 20

cagcatattt gtgaaagtcg 20

<210> 21

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 21

tgtgtaggaa atggtcactt 20

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 22

tgcaattctt aataagggtg 20

<210> 23

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 23

aaatcatcct gaaaagacct 20

<210> 24

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 24

tgatataaga aaatcatcct 20

<210> 25

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 25

acacattcac cagaaactga 20

<210> 26

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 26

ttcaggacac aagtaaacca 20

<210> 27

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 27

ttcactcttg gcagtgtttc 20

<210> 28

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 28

aagaataccc agaaatcgct 20

<210> 29

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 29

cattgcttga aagaataccc 20

<210> 30

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 30

ttggtgtgag cattgcttga 20

<210> 31

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 31

aatgtctttg ttgcaagcgc 20

<210> 32

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 32

ttcatgtcta ggtccacata 20

<210> 33

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 33

gtttatgccc ttcatgtcta 20

<210> 34

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 34

ccgtgcatct ttcttggcat 20

<210> 35

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 35

cgtgaaaaag tggcagtgga 20

<210> 36

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 36

agacaaatgt tacgatgctc 20

<210> 37

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 37

gtgcttcagt agacaaatgt 20

<210> 38

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 38

tgcacaggat ttcagtgaaa 20

<210> 39

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 39

gattagaaag tgcacaggat 20

<210> 40

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 40

ccgggatgat gagtgcagat 20

<210> 41

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 41

aaacaagcaa ccgggatgat 20

<210> 42

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 42

tcctgggaaa agaaggtaaa 20

<210> 43

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 43

attctttggg ccattcctgg 20

<210> 44

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 44

aaagatttct ttgagattct 20

<210> 45

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 45

aatccactct cagatgtttt 20

<210> 46

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 46

aaccagaaag agctttgctc 20

<210> 47

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 47

ggcagaacac tgggatgctg 20

<210> 48

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 48

tggtaaaatg aagaatggca 20

<210> 49

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 49

atcagtgtca tggtaaaatg 20

<210> 50

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 50

aacaatatcc agttcttctc 20

<210> 51

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 51

acagtttctg gcaggcctcg 20

<210> 52

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 52

gcattggtgc acagtttctg 20

<210> 53

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 53

gcagcggacg gcattggtgc 20

<210> 54

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 54

ttgaagaaag ctttaagtaa 20

<210> 55

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 55

agtattttag ttggagatcc 20

<210> 56

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 56

atgtgtatcc agagatgcct 20

<210> 57

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 57

gtacactcat tatccatttt 20

<210> 58

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 58

gattttggtg gtacactcat 20

<210> 59

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 59

tcctgggctt gattttggtg 20

<210> 60

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 60

ggccactcac cacgaacaga 20

<210> 61

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 61

tgtctctgag tgggtgaggt 20

<210> 62

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 62

gtttccaatg atggagcctc 20

<210> 63

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 63

atatccactg gtttccaatg 20

<210> 64

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 64

ccatagaaac agtgagcggc 20

<210> 65

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 65

tgactctacc ccatagaaac 20

<210> 66

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 66

cgcaaaatct taggtgactc 20

<210> 67

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 67

ttcagattga tttaaaatgc 20

<210> 68

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 68

tgaaccccaa agaaagatgt 20

<210> 69

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 69

tattatttct tgaaccccaa 20

<210> 70

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 70

aacaaggcaa tatcataccc 20

<210> 71

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 71

ttccagtttc aacaaggcaa 20

<210> 72

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 72

gaaggcaggc atatgggtcg 20

<210> 73

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 73

gtcactaagg gtatcttggc 20

<210> 74

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 74

agatcatctt atgggttatt 20

<210> 75

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 75

tagccggcac agatcatctt 20

<210> 76

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 76

ccagatgcca gacctcattg 20

<210> 77

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 77

cattcacact gcttgagttt 20

<210> 78

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 78

tggcacagtg aactcaacac 20

<210> 79

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 79

ctagcatttt cttacaaaca 20

<210> 80

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 80

ttatggtaat tcttggactc 20

<210> 81

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 81

aaatattgcc ttatggtaat 20

<210> 82

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 82

tatctgccta tatagtaatc 20

<210> 83

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 83

gccactactt ggttattttc 20

<210> 84

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 84

aacaaatcta tttatggtgg 20

<210> 85

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 85

ctgcaaaatg gtgaagactg 20

<210> 86

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 86

gtgtagattc ctgcaaaatg 20

<210> 87

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 87

ttttcaggaa agtgtatctt 20

<210> 88

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 88

cacaaatcat ttttcaggaa 20

<210> 89

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 89

tcccaagata ttttaaataa 20

<210> 90

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 90

aatgagataa atatttgcac 20

<210> 91

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 91

tgaaagctat gtggtgacaa 20

<210> 92

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 92

cacacttgat gaattgtata 20

<210> 93

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 93

taccttgaga gaattgcttg 20

<210> 94

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 94

gtcagaaata taccttgaga 20

<210> 95

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 95

atcttagtat gtcagaaata 20

<210> 96

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 96

gagtcacaca ttcaccagaa 20

<210> 97

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 97

gtgagcattg cttgaaagaa 20

<210> 98

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 98

cttatttggt gtgagcattg 20

<210> 99

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 99

acataaatgt ctttgttgca 20

<210> 100

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 100

ggtccacata aatgtctttg 20

<210> 101

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 101

gtctaggtcc acataaatgt 20

<210> 102

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 102

tgcccttcat gtctaggtcc 20

<210> 103

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 103

gttatagttt atgcccttca 20

<210> 104

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 104

tcagtagaca aatgttacga 20

<210> 105

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 105

tgggtgtgct tcagtagaca 20

<210> 106

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 106

agccagatta gaaagtgcac 20

<210> 107

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 107

agcaaccggg atgatgagtg 20

<210> 108

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 108

gccattcctg ggaaaagaag 20

<210> 109

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 109

ttgagattct ttgggccatt 20

<210> 110

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 110

actgaaacca gaaagagctt 20

<210> 111

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 111

agaatggcag aacactggga 20

<210> 112

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 112

tgtcatggta aaatgaagaa 20

<210> 113

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 113

aagaaatcag tgtcatggta 20

<210> 114

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 114

ggtgcacagt ttctggcagg 20

<210> 115

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 115

ggacggcatt ggtgcacagt 20

<210> 116

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 116

aactggcagc ggacggcatt 20

<210> 117

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 117

ccttaatgtg tatccagaga 20

<210> 118

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 118

tggtggtaca ctcattatcc 20

<210> 119

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 119

ggcttgattt tggtggtaca 20

<210> 120

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 120

aacgatcctg ggcttgattt 20

<210> 121

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 121

acaggtgtct ctgagtgggt 20

<210> 122

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 122

cactggtttc caatgatgga 20

<210> 123

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 123

ctaccccata gaaacagtga 20

<210> 124

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 124

ttaggtgact ctaccccata 20

<210> 125

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 125

agacacgcaa aatcttaggt 20

<210> 126

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 126

tttcttgaac cccaaagaaa 20

<210> 127

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 127

gtggtttcca gtttcaacaa 20

<210> 128

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 128

ttggctttct ggagagtatt 20

<210> 129

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 129

ggcacagatc atcttatggg 20

<210> 130

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 130

gattcctgca aaatggtgaa 20

<210> 131

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 131

gcagagtgta gattcctgca 20

<210> 132

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 132

atcatttttc aggaaagtgt 20

<210> 133

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 133

gtgagacaaa tcaagacttc 20

<210> 134

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 134

ttagtttact gacactaaga 20

<210> 135

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 135

ctgctttatg aaaaaccaac 20

<210> 136

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 136

atacctagta caatgtaaat 20

<210> 137

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 137

ggcttgtgtg tggtcaatat 20

<210> 138

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 138

tgggaaagct ttcaatattc 20

<210> 139

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 139

atggaattgt gcttatgagt 20

<210> 140

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 140

tttcaagctc aggatgggaa 20

<210> 141

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 141

gttggtaaaa tgcaaccaaa 20

<210> 142

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 142

tcaggacaca agtaaacctg 20

<210> 143

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 143

tgcaagctgg aaataaaagc 20

<210> 144

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 144

tgccaattta aaagtgtagc 20

<210> 145

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 145

atatttcaaa atccagtatg 20

<210> 146

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 146

ttctgaatat acaaattaat 20

<210> 147

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 147

tttactatga aaatctaaat 20

<210> 148

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 148

ggtatcctga gtgagatcta 20

<210> 149

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 149

ccagctatca ggaaaattcc 20

<210> 150

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 150

aaagctattg gagactcaga 20

<210> 151

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 151

atggaatctc ttcatttcat 20

<210> 152

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 152

atggagacat tcatttccac 20

<210> 153

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 153

gctctgagag ttccaattca 20

<210> 154

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 154

ctgggaaggt gaatttttag 20

<210> 155

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 155

tcaagagtct tcatgctacc 20

<210> 156

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 156

tcagtttacc tgggatgctg 20

<210> 157

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 157

gacattatac tcaccattat 20

<210> 158

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 158

gtataaatgt gtcaaattaa 20

<210> 159

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 159

gtaaagtttt accttaacct 20

<210> 160

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 160

ccataatgaa gaaggaaggg 20

<210> 161

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 161

ttaagttaca ttgtagacca 20

<210> 162

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 162

tgtgtgggtc ctgaaattct 20

<210> 163

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 163

atcttgtaat tacacacccc 20

<210> 164

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 164

gtacactctg caacagaagc 20

<210> 165

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 165

agggaataac atgaaggccc 20

<210> 166

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 166

atccagttca ccattggaga 20

<210> 167

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 167

ttttccagaa gagactcttc 20

<210> 168

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 168

gtcacattta aaatttccaa 20

<210> 169

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 169

ttaatatact gcagagaacc 20

<210> 170

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 170

agaaatatcc ccagacagag 20

<210> 171

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 171

aaatgtcttt gttgcaagcg 20

<210> 172

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 172

taaatgtctt tgttgcaagc 20

<210> 173

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 173

ataaatgtct ttgttgcaag 20

<210> 174

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 174

cataaatgtc tttgttgcaa 20

<210> 175

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 175

cacataaatg tctttgttgc 20

<210> 176

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 176

ccacataaat gtctttgttg 20

<210> 177

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 177

tccacataaa tgtctttgtt 20

<210> 178

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 178

gtccacataa atgtctttgt 20

<210> 179

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 179

aggtccacat aaatgtcttt 20

<210> 180

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 180

taggtccaca taaatgtctt 20

<210> 181

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 181

ctaggtccac ataaatgtct 20

<210> 182

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 182

tctaggtcca cataaatgtc 20

<210> 183

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 183

tgtctaggtc cacataaatg 20

<210> 184

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 184

atgtctaggt ccacataaat 20

<210> 185

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 185

catgtctagg tccacataaa 20

<210> 186

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 186

tcatgtctag gtccacataa 20

<210> 187

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 187

cttcatgtct aggtccacat 20

<210> 188

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 188

ccttcatgtc taggtccaca 20

<210> 189

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 189

cccttcatgt ctaggtccac 20

<210> 190

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 190

gcccttcatg tctaggtcca 20

<210> 191

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 191

atgcccttca tgtctaggtc 20

<210> 192

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 192

tatgcccttc atgtctaggt 20

<210> 193

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 193

ttatgccctt catgtctagg 20

<210> 194

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 194

tttatgccct tcatgtctag 20

<210> 195

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 195

tccgtgcatc tttcttggca 20

<210> 196

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 196

atccgtgcat ctttcttggc 20

<210> 197

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 197

catccgtgca tctttcttgg 20

<210> 198

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 198

tcatccgtgc atctttcttg 20

<210> 199

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 199

gtcatccgtg catctttctt 20

<210> 200

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 200

accgggatga tgagtgcaga 20

<210> 201

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 201

aaccgggatg atgagtgcag 20

<210> 202

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 202

caaccgggat gatgagtgca 20

<210> 203

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 203

gcaaccggga tgatgagtgc 20

<210> 204

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 204

gattctttgg gccattcctg 20

<210> 205

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 205

agattctttg ggccattcct 20

<210> 206

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 206

gagattcttt gggccattcc 20

<210> 207

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 207

tgagattctt tgggccattc 20

<210> 208

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 208

tttgagattc tttgggccat 20

<210> 209

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 209

ctttgagatt ctttgggcca 20

<210> 210

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 210

tctttgagat tctttgggcc 20

<210> 211

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 211

ttctttgaga ttctttgggc 20

<210> 212

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 212

tttctttgag attctttggg 20

<210> 213

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 213

cacagtttct ggcaggcctc 20

<210> 214

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 214

gcacagtttc tggcaggcct 20

<210> 215

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 215

tgcacagttt ctggcaggcc 20

<210> 216

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 216

gtgcacagtt tctggcaggc 20

<210> 217

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 217

tggtgcacag tttctggcag 20

<210> 218

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 218

ttggtgcaca gtttctggca 20

<210> 219

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 219

attggtgcac agtttctggc 20

<210> 220

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 220

cattggtgca cagtttctgg 20

<210> 221

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 221

ggcattggtg cacagtttct 20

<210> 222

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 222

cggcattggt gcacagtttc 20

<210> 223

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 223

acggcattgg tgcacagttt 20

<210> 224

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 224

gacggcattg gtgcacagtt 20

<210> 225

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 225

cggacggcat tggtgcacag 20

<210> 226

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 226

gcggacggca ttggtgcaca 20

<210> 227

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 227

agcggacggc attggtgcac 20

<210> 228

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 228

cagcggacgg cattggtgca 20

<210> 229

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 229

ggcagcggac ggcattggtg 20

<210> 230

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 230

tggcagcgga cggcattggt 20

<210> 231

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 231

ctggcagcgg acggcattgg 20

<210> 232

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 232

actggcagcg gacggcattg 20

<210> 233

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 233

tgcttgaagg aatatccaga 20

<210> 234

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 234

tagttcatgc ccttcatgtc 20

<210> 235

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 235

tgttatagtt catgcccttc 20

<210> 236

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 236

aatgtccctg atacaagcca 20

<210> 237

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 237

gggaaaatgt ccctgataca 20

<210> 238

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 238

tgtgcagagt cacctgccat 20

<210> 239

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 239

ttcttgaacc ctgaagaaag 20

<210> 240

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 240

tgaattatca tttcttgaac 20

<210> 241

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 241

tgatcatgaa ttatcatttc 20

<210> 242

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 242

agtttctggc aggcctcg 18

<210> 243

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 243

cagtttctgg caggcctc 18

<210> 244

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 244

acagtttctg gcaggcct 18

<210> 245

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 245

cacagtttct ggcaggcc 18

<210> 246

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 246

gcacagtttc tggcaggc 18

<210> 247

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 247

gtgcacagtt tctggcag 18

<210> 248

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 248

ggtgcacagt ttctggca 18

<210> 249

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 249

tggtgcacag tttctggc 18

<210> 250

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 250

ttggtgcaca gtttctgg 18

<210> 251

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 251

attggtgcac agtttctg 18

<210> 252

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 252

cattggtgca cagtttct 18

<210> 253

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 253

gcattggtgc acagtttc 18

<210> 254

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 254

ggcattggtg cacagttt 18

<210> 255

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 255

cggcattggt gcacagtt 18

<210> 256

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 256

acggcattgg tgcacagt 18

<210> 257

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 257

gacggcattg gtgcacag 18

<210> 258

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 258

ggacggcatt ggtgcaca 18

<210> 259

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 259

cggacggcat tggtgcac 18

<210> 260

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 260

gcggacggca ttggtgca 18

<210> 261

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 261

agcggacggc attggtgc 18

<210> 262

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 262

cagcggacgg cattggtg 18

<210> 263

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 263

gcagcggacg gcattggt 18

<210> 264

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 264

ggcagcggac ggcattgg 18

<210> 265

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 265

tggcagcgga cggcattg 18

<210> 266

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 266

ctggcagcgg acggcatt 18

<210> 267

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 267

tgcacagttt ctggcagg 18

<210> 268

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 268

cacagtttct ggcagg 16

<210> 269

<211> 14

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 269

acagtttctg gcag 14

<210> 270

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> синтетический олигонуклеотид

<400> 270

gcgtttgctc ttcttcttgc gtttttt 27

<210> 271

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 271

acacgcatta aaaagagcaa agc 23

<210> 272

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер

<400> 272

cagtgtcatg gtaaaatgaa gaatgg 26

<210> 273

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зонд

<400> 273

tgcaggcaca gcatcccagt gttct 25

<210> 274

<211> 3275

<212> ДНК

<213> Macaca mulatta

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)...(3275)

<223> n=A,T,C или G

<400> 274

aggcacacag acaaaatcaa gctctacagc tgtctgtgtg tatgtcactt gtttgaatat 60

gaattaaaat taaaatataa attcaatgta ttgagaaagc aagcaattct ctcaaggtat 120

atttctgaca tactaagatt ttaacgactt tcacaaatat gctgcaccga gagacaatgt 180

tacacaacac tgagaaccag tacaagtaaa tattaaagtt aagtgaccat ttcctacaca 240

cgctcattca gaggaggatg aggatcaatt tggaagaaga aaaacaccct tattaagaat 300

tgcagcaaat aagcaaacga ggtcttttca ggatgatttt cttatatcaa atggtacatt 360

tcattctatt tacgtcagtt tctggtgaat gtgtgactcg gttgttcaag gacatccact 420

ttgaaggagg ggacattgct acggttttca caccaagcgc caagcactgc caggtggtct 480

gcactcacca cccacgatgt ctgctcttca ctttcacggg ggaatctgca tctgaggatc 540

ctacccagtg gtttacttgt gtcctgaagg acagtgttac agaaacactg ccaagagtga 600

ataggacagg agcgatttct gggtattctt tcaagcaatg ctcacaccaa ataagcgctt 660

gcaacaaaga catttatgtg gacctagaca tgaagggcat aaactataac agctcacttg 720

ccaagagtgc tcaagaatgc caagaaagat gcacggatga catccactgc cactttttca 780

cgtatgccac aaggcagttt cccagtctgg agcatcgtaa catttgtcta ctgaagcaca 840

cccaaacggg gacaccaacc ggaataatga agctcgataa agtggtgact ggattttcac 900

tgaaatcctg tgcactttct aatctggctt gtatcaggga cgttttcccc aacacggtgt 960

ttgcggacag caacatcgat agtgtcatgg ctccagatgc ctttgtctgt cgccggatct 1020

gcactcatca tcccggttgc ttgtttttta ccttcttttc ccaggaatgg cccaaagaat 1080

ctcaaagaaa tctttgtctc cttaaaacat ctgagagtgg attacccagt acacgcatta 1140

aaaagagcaa agctctttct ggtttcagtc tccaaagctg caggcacagc atcccagtgt 1200

tctgccattc ttcattttac catgacactg atttcttggg agaagaactg gatattgttg 1260

ctgtgaaagg tcacgaggcc tgccagaaac tgtgcaccaa tgccgtccgc tgccagtttt 1320

ttacctatgc cccagctcaa gcatcttgca acgaagggaa gggcaaatgt tacttaaagc 1380

tttcttcaaa tggatctcca actaaaatac ttcgcgggac aggaggcatc tctggataca 1440

cattaaggct gtgtaaaatg gataatgagt gtaccaccaa aatcaagccc aggatcgttg 1500

gaggaactgc atctgttcgt ggtgagtggc catggcaggt gactctgcac accacctcac 1560

ccactcagag acacctgtgt ggaggctcca tcattggaaa ccagtggata ttaacggccg 1620

ctcactgttt ctatggggta gagtcaccta agattttgcg tgtctacatt ggcattttaa 1680

atcaatctga aataaaagag gatacatctt tctttggggt tcaagaaata ataatccatg 1740

atcaatataa aatggcagaa agtgggtatg atattgcctt gttgaaactg gaaaccacag 1800

tgaattacac agattctcaa cgacccatat gcctgccttc aaaaggagat agaaatgtga 1860

tatacactga ctgctgggtg actggatggg ggtacagaaa attaagagac aaaatacaga 1920

atactctcca gaaagccaag atacccttag tgaccaatga cgagtgccag aagagataca 1980

gaggacataa aataacccat aagatgatct gtgccggcta cagggaagga gggaaggatg 2040

cttgcaagnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2100

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2160

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2220

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2280

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnggc ttggtgctgg taggaaaatg 2340

ccagaagaaa acaaactgtc acaagctgtt atgtccaaag ctcccgttct atgatcattg 2400

tagtttgttt cagcatccag tgtctttgtt tctgatcacg cttctaagga gtccaagaat 2460

taccataagg caatatttct gatgattact atataggcag atatatcaga aaataaccaa 2520

gtagtggcag cagggatcag gtagaagaac tgataaaaga aaccaccata aatagatttg 2580

ttcaatgaaa aatgaaaact ggaagaaagg ataacaaaga cagtcttcac cattttgcag 2640

gaatctacac tctgcctgtg tgaacacatt tctttgtaaa gaaagaattt gattgcattt 2700

actggcagat tttcagaata gtcaggaatt catgttattt ccattttaaa acatgtttaa 2760

aaaaatcagt ttgagtagac acaagctaag agtgaatgtg aaggtaccag aatttctgta 2820

tggaagaggg tgacaagcag caatgtacct ggaagtggta ccttaggacc aatcttaaag 2880

atacactttc ctgaaaaatg atttgtgatg gatcgtatat ttatttaaaa tatcttggga 2940

gggagaggct gatggcgata gggaggcaag ctgaagcctc cataagacaa gctgctactg 3000

cgactgtggc ccccaaagag ctacaccgca tatttatttg acaaaagtca ccattgacta 3060

catccgtact acagagaaaa aacaatttgg gcacaaatgg atggttacag taaagtcttc 3120

agcaagcagc tccctgtatt ctaagtactg ggcttttctg tttggtgcaa atatttatct 3180

cattattgct gtgatctagt ccagtaacct agaatttgat ttgtcaccac atagctttca 3240

acctgtgcca acaattatac aattcatcaa gtgtg 3275

<---

Реферат

Группа изобретений относится к биотехнологии и медицине. Предложены антисмысловые модифицированные олигонуклеотиды, композиции и способы для ингибирования экспрессии мРНК и белка фактора 11. Предложенные антисмысловые олигонуклеотиды могут быть использованы для ингибирования образования тромбов или сгустков крови, ассоциированных с патологическими изменениями стенок сосудов. Также предложены способы лечения или предупреждения тромбоэмболических осложнений у индивидуума, нуждающегося в этом, в частности, тромбоза глубокой вены, эмболии легких, инфаркта миокарда и инсульта. Ингибирование фактора 11, опосредуемое предложенными антисмысловыми олигонуклеотидами, является более безопасным и не дает эффекта отмены. 18 н. и 50 з.п. ф-лы, 169 табл., 47 пр.

Формула

1. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14-30 связанных нуклеозидов, в котором последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна части, имеющей такую же длину в SEQ ID NO: 1, и где последовательность нуклеотидных оснований включает часть по меньшей мере из 8 смежных нуклеотидных оснований, которая комплементарна имеющей такую же длину части нуклеотидных оснований 675-704 в SEQ ID NO: 1, и где олигонуклеотид обладает способностью ингибировать экспрессию Фактора 11.

2. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14-30 связанных нуклеозидов, в котором последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна части, имеющей такую же длину в SEQ ID NO: 1, и где последовательность нуклеотидных оснований включает часть по меньшей мере из 8 смежных нуклеотидных оснований, которая комплементарна имеющей такую же длину части нуклеотидных оснований 1062-1090 в SEQ ID NO: 1, и где олигонуклеотид обладает способностью ингибировать экспрессию Фактора 11.

3. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14-30 связанных нуклеозидов, в котором последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна части, имеющей такую же длину в SEQ ID NO: 1, и где последовательность нуклеотидных оснований включает часть по меньшей мере из 8 смежных нуклеотидных оснований, которая комплементарна имеющей такую же длину части нуклеотидных оснований 656-676 в SEQ ID NO: 1, и где олигонуклеотид обладает способностью ингибировать экспрессию Фактора 11.

4. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14-30 связанных нуклеозидов, в котором последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна части, имеющей такую же длину в SEQ ID NO: 1, и где последовательность нуклеотидных оснований включает часть по меньшей мере из 8 смежных нуклеотидных оснований, которая комплементарна имеющей такую же длину части нуклеотидных оснований 665-687 в SEQ ID NO: 1, и где олигонуклеотид обладает способностью ингибировать экспрессию Фактора 11.

5. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14-30 связанных нуклеозидов, в котором последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна части, имеющей такую же длину в SEQ ID NO: 1, и где последовательность нуклеотидных оснований включает часть по меньшей мере из 8 смежных нуклеотидных оснований, которая комплементарна имеющей такую же длину части нуклеотидных оснований 738-762 в SEQ ID NO: 1, и где олигонуклеотид обладает способностью ингибировать экспрессию Фактора 11.

6. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14-30 связанных нуклеозидов, в котором последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна части, имеющей такую же длину в SEQ ID NO: 1, и где последовательность нуклеотидных оснований включает часть по меньшей мере из 8 смежных нуклеотидных оснований, которая комплементарна имеющей такую же длину части нуклеотидных оснований 1018-1042 в SEQ ID NO: 1, и где олигонуклеотид обладает способностью ингибировать экспрессию Фактора 11.

7. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 14-30 связанных нуклеозидов, в котором последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна части, имеющей такую же длину в SEQ ID NO: 1, и где последовательность нуклеотидных оснований включает часть по меньшей мере из 8 смежных нуклеотидных оснований, которая комплементарна имеющей такую же длину части нуклеотидных оснований 1275-1318 в SEQ ID NO: 1, и где олигонуклеотид обладает способностью ингибировать экспрессию Фактора 11.

8. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, в котором последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% комплементарна части, имеющей такую же длину в SEQ ID NO: 1.

9. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, в котором:

(i) последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 32,102,186,187,188,189,190, 191,192,193 или 194;

(ii) последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 43, 109, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210 или 211;

(iii) последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 31 или 171;

(iv) последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 100, 178, 179 или 180;

(v) последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 34, 195, 196, 197, 198 или 199;

(vi) последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 40, 107, 200, 201, 202 или 203; или

(vii) последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида включает по меньшей мере 8, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 14, по меньшей мере 16, по меньшей мере 18 или 20 смежных нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 223, 217, 51, 52, 53, 114, 115, 213, 214, 215, 216, 218, 219, 220, 221, 222, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 242, 243, 245, 246, 247, 248, 250,251,252,253, 254, 255,256, 257,258,259, 260, 261,262, 263, 264, 265, 266,267,268 или 269.

10. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-30, 18-24, 19-22 или 20 связанных нуклеозидов.

11. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, состоящий из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида.

12. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, в котором по меньшей мере одной межнуклеозидной связью является модифицированная межнуклеозидная связь.

13. Модифицированный олигонуклеотид по п. 12, в котором каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфортиоатную межнуклеозидную связь.

14. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, в котором по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированный сахар.

15. Модифицированный олигонуклеотид по п. 14, в котором по меньшей мере одним модифицированным сахаром является бициклический сахар.

16. Модифицированный олигонуклеотид по п. 15, в котором каждый из по меньшей мере одного бициклического сахара содержит 4'-(СН₂)_n-O-2'-мостик, где n равно 1 или 2.

17. Модифицированный олигонуклеотид по п. 15, в котором каждый из по меньшей мере одного бициклического сахара содержит 4'-СН(СН₃)-O-2'-мостик.

18. Модифицированный олигонуклеотид по п. 14, в котором по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтильную группу.

19. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, включающий по меньшей мере один модифицированный тетрагидропираном нуклеозид, в котором фуранозное кольцо заменено тетрагидропирановым кольцом.

20. Модифицированный олигонуклеотид по п. 19, в котором каждый из по меньшей мере одного модифицированного тетрагидропираном нуклеозида имеет структуру:

где Вх представляет собой необязательно защищенную гетероциклическую основную группу.

21. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, в котором по меньшей мере один нуклеозид включает модифицированное нуклеотидное основание.

22. Модифицированный олигонуклеотид по п. 21, в котором модифицированное нуклеотидное основание представляет собой 5-метилцитозин.

23. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, где модифицированный олигонуклеотид включает:

гэп-сегмент, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;

5'-сегмент-крыло, состоящий из связанных нуклеозидов;

3'-сегмент-крыло, состоящий из связанных нуклеозидов,

24. Модифицированный олигонуклеотид по п. 23, где модифицированный олигонуклеотид включает:

гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;

5'-сегмент-крыло, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;

3'-сегмент-крыло, состоящий из пяти связанных нуклеозидов,

25. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов.

26. Модифицированный олигонуклеотид по п. 25, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов.

27. Модифицированный олигонуклеотид по п. 25, в котором каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.

28. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7, где модифицированный олигонуклеотид ковалентно связывают с одной или несколькими молекулами для получения конъюгата.

29. Модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 20 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую 20 смежных нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 223, где модифицированный олигонуклеотид включает:

гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;

5'-сегмент-крыло, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;

3'-сегмент-крыло, состоящий из пяти связанных нуклеозидов;

где указанный гэп-сегмент расположен непосредственно между 5'-сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом и является смежным с этими сегментами, и где каждый нуклеозид каждого сегмента-крыла содержит 2'-О-метоксиэтилированный сахар; и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и где олигонуклеотид обладает способностью ингибировать экспрессию Фактора 11.

30. Модифицированный олигонуклеотид по п. 29, в котором по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой фосфортиоатную межнуклеозидную связь.

31. Модифицированный олигонуклеотид по п. 29, в котором модифицированный олигонуклеотид ковалентно связывают с одной или несколькими молекулами для получения конъюгата.

32. Соединение, состоящее из модифицированного олигонуклеотида, ковалентно связанного с одной или несколькими молекулами, где модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов и имеет последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 223, и где модифицированный олигонуклеотид состоит из:

гэп-сегмента, состоящего из десяти связанных дезоксинуклеозидов;

5'-сегмента-крыла, состоящего из пяти связанных нуклеозидов;

3'-сегмента-крыла, состоящего из пяти связанных нуклеозидов;

где указанный гэп-сегмент расположен непосредственно между 5'- сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом и является смежным с этими сегментами, и где каждый нуклеозид каждого сегмента-крыла содержит 2'-O-метоксиэтилированный сахар; по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой фосфортиоатную межнуклеозидную связь и каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и где соединение обладает способностью ингибировать экспрессию Фактора 11.

33. Композиция для ингибирования экспрессии Фактора 11 у животного, содержащая модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7 или 29 или соединение по п. 32 в эффективном количестве для ингибирования экспрессии Фактора 11 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

34. Композиция по п. 33, в которой модифицированный олигонуклеотид представлен в виде натриевой соли.

35. Композиция по п. 33, в которой фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель представляет собой забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS).

36. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7 или 29 или соединение по п. 32 для применения в лечении или предупреждении тромбоэмболического осложнения у животного, где тромбоэмболическое осложнение выбрано из тромбоза глубокой вены, эмболии легких, инфаркта миокарда и инсульта.

37. Композиция по п. 33 для применения в лечении или предупреждении тромбоэмболического осложнения у животного, где тромбоэмболическое осложнение выбрано из тромбоза глубокой вены, эмболии легких, инфаркта миокарда и инсульта.

38. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7 или 29 или соединение по п. 32 для применения в лечении нарушения свертывания крови у животного.

39. Композиция по п. 33 для применения в лечении нарушения свертывания крови у животного.

40. Способ лечения или предупреждения тромбоэмболического осложнения у животного, включающий введение животному, нуждающемуся в этом, эффективного количества модифицированного олигонуклеотида по любому из пп. 1-7 или 29 или соединения по п. 32, где тромбоэмболическое осложнение выбрано из тромбоза глубокой вены, эмболии легких, инфаркта миокарда и инсульта.

41. Способ лечения или предупреждения тромбоэмболического осложнения у животного, включающий введение животному, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции по п. 33, где тромбоэмболическое осложнение выбрано из тромбоза глубокой вены, эмболии легких, инфаркта миокарда и инсульта.

42. Способ лечения или предупреждения нарушения свертывания крови у животного, включающий введение животному, нуждающемуся в этом, эффективного количества модифицированного олигонуклеотида по любому из пп. 1-7 или 29 или соединения по п. 32.

43. Способ лечения или предупреждения нарушения свертывания крови у животного, включающий введение животному, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции по п. 33.

44. Способ ингибирования экспрессии Фактора 11 у животного, включающий введение животному эффективного количества модифицированного олигонуклеотида по любому из пп. 1-7 или 29 или соединения по п. 32.

45. Способ ингибирования экспрессии Фактора 11 у животного, включающий введение животному эффективного количества композиции по п. 33.

46. Модифицированный олигонуклеотид или соединение по п. 36, где животное является человеком.

47. Модифицированный олигонуклеотид или соединение по п. 38, где животное является человеком.

48. Композиция по п. 33, где животное является человеком.

49. Способ по п. 40, где животное является человеком.

50. Способ по п. 41, где животное является человеком.

51. Способ по п. 42, где животное является человеком.

52. Способ по п. 43, где животное является человеком.

53. Способ по п. 44, где животное является человеком.

54. Способ по п. 45, где животное является человеком.

55. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7 или 29 или соединение по п. 32 для применения в лечении тромбоэмболических осложнений путем совместного введения со средством, выбранным из аспирина, клопидогреля, дипиридамола, гепарина, лепирудина, тиклопидина, варфарина, апиксабана, ривароксабана и LOVENOX.

56. Композиция по п. 33 для применения в лечении тромбоэмболических осложнений путем совместного введения со средством, выбранным из аспирина, клопидогреля, дипиридамола, гепарина, лепирудина, тиклопидина, варфарина, апиксабана, ривароксабана и LOVENOX.

57. Способ лечения тромбоэмболических осложнений, включающий введение животному, нуждающемуся в этом, эффективного количества модифицированного олигонуклеотида по любому из пп. 1-7 или 29 или соединения по п. 32 путем совместного введения со средством, выбранным из аспирина, клопидогреля, дипиридамола, гепарина, лепирудина, тиклопидина, варфарина, апиксабана, ривароксабана и LOVENOX.

58. Способ лечения тромбоэмболических осложнений, включающий введение животному, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции по п. 33 путем совместного введения со средством, выбранным из аспирина, клопидогреля, дипиридамола, гепарина, лепирудина, тиклопидина, варфарина, апиксабана, ривароксабана и LOVENOX.

59. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7 или 29 или соединение по п. 32, где модифицированный олигонуклеотид предназначен для совместного введения или одновременного введения со средством, выбранным из аспирина, клопидогреля, дипиридамола, гепарина, лепирудина, тиклопидина, варфарина, апиксабана, ривароксабана, LOVENOX и ингибитора фактора Ха.

60. Композиция по п. 33, где композиция предназначена для совместного введения или одновременного введения со средством, выбранным из аспирина, клопидогреля, дипиридамола, гепарина, лепирудина, тиклопидина, варфарина, апиксабана, ривароксабана, LOVENOX и ингибитора фактора Ха.

61. Модифицированный олигонуклеотид по любому из пп. 1-7 или 29 или соединение по п. 32, где модифицированный олигонуклеотид предназначен для совместного введения с антитромбоцитарным средством.

62. Композиция по п. 33, где композиция предназначена для совместного введения с антитромбоцитарным средством.

63. Модифицированный олигонуклеотид п. 61, где антитромбоцитарное средство выбирают из группы, состоящей из ингибитора рецептора АДФ, НСПВС, ингибитора фосфодиэстеразы, ингибитора гликопротеина IIВ/IIIА или ингибитора поглощения аденозина или их комбинации.

64. Композиция п. 62, где антитромбоцитарное средство выбирают из группы, состоящей из ингибитора рецептора АДФ, НСПВС, ингибитора фосфодиэстеразы, ингибитора гликопротеина IIВ/IIIА или ингибитора поглощения аденозина или их комбинации.

65. Модифицированный олигонуклеотид по п. 63, где НСПВС представляет собой аспирин, напроксен или их комбинацию.

66. Композиция по п. 64, где НСПВС представляет собой аспирин, напроксен или их комбинацию.

67. Модифицированный олигонуклеотид по п. 63, где ингибитором рецептора АДФ является тиенопиридин.

68. Композиция по п. 64, где ингибитором рецептора АДФ является тиенопиридин.

Документы, цитированные в отчёте о поиске

Полипептид с биологической активностью ингибитораиндуцируемой коллагеном адгезии тромбоцитов, его получение и применение

Авторы

ФРЕЙЕР Сьюзан М. (US)

МОНИЯ Бретт П. (US)

ЧЖАН Хун (US)

ЧЖАО Чэньгуан (US)

КРОСБИ Джеффри Р. (US)

СИВКОВСКИ Эндрю М. (US)

FREIER SUSAN M

MONIA BRETT P

ZHANG HONG

ZHAO CHENGUANG

CROSBY JEFFREY R

SIWKOWSKI ANDREW M

FREIER Susan M.

MONIA Brett P.

ZHANG Hong

ZHAO Chenguang

CROSBY Jeffrey R.

SIWKOWSKI Andrew M.

Патентообладатели

IONIS PHARMACEUTICALS INC

IONIS PHARMACEUTICALS, INC.

Заявители

IONIS PHARMACEUTICALS INC

IONIS PHARMACEUTICALS, INC.

СПК: A61K31/366 A61K31/4365 A61K31/4545 A61K31/70 A61K31/7088 A61K31/7125 A61K31/713 A61K31/727 A61K31/737 A61K48/00 A61P7/00 A61P7/02 A61P9/00 A61P9/04 A61P9/10 A61P9/14 A61P11/00 A61P25/00 A61P43/00 C07H21/00 C12N15/113 C12N15/1137 C12N2310/11 C12N2310/315 C12N2310/321 C12N2310/3341 C12N2310/341 C12N2310/346 C12Y304/21027

МПК: A61K31/7088 A61P7/02 A61P9/10

Публикация: 2020-12-28

Дата подачи заявки: 2014-08-22

РОССТИП

Поиск по товарам

Добавить свой товар

Сообщества

Товары

Участники

Патенты

Запросов

Поставщикам

О сервисе

Блогерам

Помощь