Оптимальные локусы маиса - RU2709734C2

Чертежи

Показать все 23 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно 35 U.S.C. §119(e) Предварительной патентной заявки США; No. 61/899541, поданной 4 ноября 2013 года, и Предварительной патентной заявки США; No. 61/899575, поданной 4 ноября 2013 года, полное содержание которых включено в настоящую заявку в качестве ссылки.

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДОСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОЙ ФОРМЕ

Официальная копия списка последовательностей предоставлена в электронной форме через EFS-Web в качестве списка последовательностей в формате ASCII под названием «232296_SEQ LIST_ST25.txt», созданного 28 октября 2014 года и имеющего размер 12,3 мегабайт, и поданного одновременно с описанием. Список последовательностей, содержащийся в этом документе в формате ASCII, является частью описания и включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ТАБЛИЦ, ПРЕДОСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОЙ ФОРМЕ

Официальная копия перечня таблиц предоставлена в электронной форме через EFS-Web в качестве перечня таблиц в формате.PDF с названием файла «Table3», созданного 04 ноября 2013 года и имеющего размер 8 мегабайт, и поданного одновременно с настоящим описанием. Перечень таблиц, содержащийся в этом документе в формате.PDF, является частью описания и включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Геном многочисленных типов однодольных растений был успешно трансформирован трансгенами в ранних 1990-х годах. На протяжении последних двадцати лет были разработаны многочисленные методологии для трансформации генома однодольных растений, например, где трансген стабильно встраивается в геном однодольных растений, таких как растения маиса. Эта эволюция способов трансформации однодольных растений привела к возможности успешно встраивать трансген, содержащий агрономический признак, в геном однодольных растений, таких как растения маиса. Внесение признаков устойчивости к насекомым и признаков толерантности к гербицидам в однодольные растения в поздние 1990-е годы предоставило производителям новую и удобную технологическую инновацию для борьбы с насекомыми и широким спектром сорняков, которая не имела себе равных в сельскохозяйственных способах культивирования. В настоящее время трансгенные однодольные растения, например, растения маиса, являются коммерчески доступными по всему миру и новые трансгенные продукты, такие как кукуруза Enlist™, предлагают усовершенствованные решения для все возрастающей проблемы сорняков. Использование трансгенных однодольных растений, подобных растениям маиса, в современной агрономической практике невозможно, однако возможно их использование для разработки и улучшения способов трансформации.

Однако современные способы трансформации основаны на случайном встраивании трансгенов в геном однодольных растений. Зависимость от случайного встраивания генов в геном имеет несколько недостатков. Трансгенные события могут случайно интегрировать в транскрибируемые последовательности генов, тем самым, прерывая экспрессию эндогенных признаков и изменяя рост и развитие растения. Кроме того, трансгенные события могут беспорядочно интегрировать в положениях генома, которые являются подверженными сайленсингу генов, что приводит к уменьшению или полному ингибированию экспрессии трансгена либо в первом, либо в последующих поколениях трансгенных растений. Наконец, случайная интеграция трансгенов в геном растений требует значительных усилий и затрат для идентификации положения трансгенного события и селекции трансгенных событий, которые функционируют намеченным образом без агрономических последствий для растения. Для определения точного положения интегрированного трансгена для такого трансгенного события, например, в растении маиса, необходимо постоянно разрабатывать новые анализы. Случайных характер способов трансформации растений приводит к «эффекту положения» интегрировнного трансгена, который препятствует эффективности и продуктивности способов трансформации.

Направленная модификация генома является давней и труднодостижимой целью как прикладных, так и фундаментальных исследований. Нацеливание генов и пакетов генов в конкретные положения в геноме однодольных растений, таких как растения маиса, может повысить качество трансгенных событий, снизить стоимость осуществления трансгенных событий и обеспечить новые способы получения трансгенных растительных продуктов, такие как последовательное пакетирование генов. В целом, нацеливание трансгенов в конкретные геномные области, вероятно, является коммерчески целесообразным. В последние несколько лет были достигнуты значительные достижения в направлении разработки способов и композиций для нацеливания на геномную ДНК и расщепления ее специфическими нуклеазами (например, нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN), мегануклеазы, подобные активаторам транскрипции эффекторные нуклеазы (TALEN) и нуклеаза, ассоциированная с кластерными регулярно расположенными короткими палиндромными повторами/CRISPR (CRISPR/Cas) со сконструированной crRNA/tracr РНК), для индукции направленного мутагенеза, индукции направленных делеций клеточных последовательностей ДНК и облегчения направленной рекомбинации экзогенного донорного ДНК-полинуклеотида в заданном геномном локусе. См., например, публикацию патентов США No. 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; и 20060188987, и международную Патентную публикацию No. WO 2007/014275, полное содержание которых включено в качестве ссылки в полном объеме для всех целей. В публикации патента США No. 20080182332 описано применение неканонических нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN) для направленной модификации геномов растений, и в публикации патента США No. 20090205083 описана опосредуемая ZFN направленная модификация геномного локуса EPSP растений. Современные способы направленного встраивания экзогенной ДНК, как правило, включают совместную трансформацию ткани растения донорным ДНК-полинуклеотидом, содержащим по меньшей мере один трансген, и сайт-специфической нуклеазой (например, ZFN), которая разработанв для связывания и расщепления конкретного геномного локуса активно транскрибируемой кодирующей последовательности. Это приводит к стабильному встраиванию донорного ДНК-полинуклеотида в расщепленный геномный локус, что приводит к направленной вставке гена в конкретный геномный локус, содержащий активно транскрибируемую кодирующую последовательность.

Альтернативным способом является нацеливание трансгена на предварительно выбранные внегенные локусы-мишени в геноме однодольных растений, таких как растения маиса. В последние годы было разработано и применено к клеткам растений несколько технологий для направленной доставки трансгена в геном однодольных растений, таких как растения маиса. Однако значительно меньше известно о характеристиках геномных участков, которые пригодны для нацеливания. Исторически в качестве локусов для нацеливания используют не являющиеся необходимыми гены и участки встраивания (вирусных) патогенов в геномах. Количество таких участков в геномах является довольно ограниченным и, таким образом, существует необходимость в идентификации и характеризации оптимальных для нацеливания геномных локусов, которые можно использовать для нацеливания донорных полинуклеотидных последовательностей. В дополнение к возможности нацеливания, ожидают, что оптимальные геномные локусы будут представлять собой нейтральные участки, которые могут способствовать экспрессии трансгена и применению в разведении. Существует необходимость в композициях и способах, определяющих критерии для идентификации оптимальных внегенных локусов в геноме однодольных растений, таких как растения маиса, для направленной интеграции трансгенов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Один из вариантов осуществления по настоящему описанию относится к способам идентификации оптимальных участков в геноме маиса для вставки экзогенных последовательностей. В литературе существуют документы, которые позволяют предпологать, что хромосомные области растений являются пригодными для нацеливания и поддерживают экспрессию. Авторы настоящего изобретения разработали набор критериев для идентификации областей природных геномных последовательностей маиса, которые являются оптимальными участками для сайт-специфической направленной вставки. Более конкретно, в соответствии с одним из вариантов осуществления, оптимальный локус должен являться внегенным, пригодным для нацеливания, поддерживающим экспрессию гена, агрономически нейтральным и обладающим признаками рекомбинации. Как описано в настоящем документе, авторы настоящего изобретения открыли ряд локусов в геноме маиса, которые соответствуют этим критериям и таким образом, представляют собой оптимальные участки для вставки экзогенных последовательностей.

В соответствии с одним из вариантов осуществления в настоящем документе описана рекомбинантная последовательность маиса, где рекомбинантная последовательность содержит внегенную геномную последовательность маиса по меньшей мере 1 т.п.о. и представляющую интерес ДНК, где внегенную геномную последовательность маиса модифицируют для вставки представляющей интерес ДНК. В одном из вариантов осуществления природная внегенная последовательность маиса является гипометилированной, поддающейся экспрессии, демонстрирует признаки рекомбинации и является локализованной в близком положении от генной области в геноме маиса. В одном из вариантов осуществления внегенная последовательность имеет длину в диапазоне от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 8,3 т.п.о. В одном из вариантов осуществления представляющая интерес ДНК содержит экзогенные последовательности ДНК, включая, например, регуляторные последовательности, участки рестрикционного расщепления, кодирующие РНК области или кодирующие белок области. В одном из вариантов осуществления представляющая интерес ДНК содержит экспрессирующую генную кассету, содержащую один или несколько трансгенов.

В соответствии с одним из вариантов осуществления представлена рекомбинантная последовательность, содержащая оптимальную внегенную геномную последовательность маиса от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 9 т.п.о., и представляющая интерес ДНК внегенная геномная последовательность маиса обладает 1, 2, 3, 4 или 5 из следующих свойств или характеристик:

a) имеет известную или прогнозируемую кодирующую последовательностью маиса в пределах 40 т.п.о. указанной геномной последовательности маиса;

b) имеет последовательность, содержащую 2 т.п.о. выше и/или 1 т.п.о. ниже известного гена маиса в пределах 40 т.п.о. от одного конца указанной геномной последовательности маиса;

c) не содержит более 1% ДНК метилирования в геномной последовательности маиса;

d) не содержит последовательность 1 т.п.о., обладающую более чем 40% идентичностью последовательности с любой другой последовательностью в геноме маиса; и

e) демонстрирует признаки рекомбинации с частотой рекомбинации более 0,00041 сМ/млн.п.о.

В соответствии с одним из вариантов осуществления представлены растение маиса, часть растения маиса или клетка растения маиса, содержащие представляющую интерес ДНК, вставленную в идентифицированную и нацеленную внегенную геномную последовательность маиса из растения маиса, части растения маиса или клетки растения маиса. В одном из вариантов осуществления внегенная геномная последовательность маиса из растения маиса, части растения маиса или клетки растения маиса является гипометилированной, поддающейся экспрессии, демонстрирует признаки рекомбинации и является локализованной в ближнем положении от генной области в геноме маиса. В одном из вариантов осуществления внегенная геномная последовательность маиса из растения маиса, части растения маиса или клетки растения маиса имеет длину от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 9 т.п.о., является гипометилированной и обладает 1, 2, 3, 4 или 5 из следующих свойств или характеристик:

a) имеет известную или прогнозируемую кодирующую последовательностью маиса в пределах 40 т.п.о. указанной геномной последовательности маиса;

b) имеет последовательность, содержащую 2 т.п.о. выше и/или 1 т.п.о. ниже известного гена маиса в пределах 40 т.п.о. от одного конца указанной геномной последовательности маиса;

c) не содержит более 1% ДНК метилирования в геномной последовательности маиса;

d) не содержит последовательность 1 т.п.о., обладающую более чем 40% идентичностью последовательности с любой другой последовательностью в геноме маиса; и

e) демонстрирует признаки рекомбинации с частотой рекомбинации более 0,00041 сМ/млн.п.о.

В одном из вариантов осуществления представлен способ получения трансгенной клетки растения, содержащей представляющую интерес ДНК, нацеленную на внегенную геномную последовательность маиса, где способ включает:

a) выбор оптимального внегенного геномного локуса маиса;

b) введение сайт-специфической нуклеазы в клетку растения, где сайт-специфическая нуклеаза расщепляет указанную внегенную последовательность;

c) введение представляющей интерес ДНК в клетку растения;

d) нацеливание представляющей интерес ДНК на указанную внегенную последовательность, где расщепление указанной внегенной последовательности стимулирует интеграцию полинуклеотидной последовательности в указанную внегенную последовательность; и

e) отбор трансгенных клеток растений, содержащих представляющую интерес ДНК, нацеленную на указанную внегенную последовательность.

В соответствии с одним из вариантов осуществления выбранная внегенная последовательность обладает 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 из следующих характеристик:

a) внегенная последовательность не содержит метилированный полинуклеотид;

b) внегенная последовательность обладает частотой рекомбинации в геноме маиса 0,00041-62,42 сМ/млн.п.о.;

c) внегенная последовательность обладает уровнем занятости нуклеосомами 0-0,962 в геноме маиса;

d) внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью 1 т.п.о., содержащейся в геноме маиса;

e) внегенная последовательность обладает значением относительного расположения с отношением геномного расстояния от центромеры хромосомы маиса 0,00373-0,99908;

f) внегенная последовательность обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне 25,17-68,3%;

g) внегенная последовательность локализована вблизи генной последовательности; и,

h) область 1 млн.п.о. геномной последовательности маиса, содержащая указанную внегенную последовательность, содержит одну или несколько внегенных последовательностей.

Вариант осуществления по настоящему описанию относится к способам идентификации внегенной геномной последовательности маиса, включающим стадии:

a) идентификации геномных последовательностей маиса длиной по меньшей мере 1 т.п.о., которые не обладают более чем 1% уровнем метилирования для получения первого пула последовательностей;

b) исключения любых геномных последовательностей маиса, кодирующих транскрипты маиса, из первого пула последовательностей;

c) исключения любых геномных последовательностей маиса, которые не обладают признаками рекомбинации, из первого пула последовательностей;

d) исключения любых геномных последовательностей маиса, которые содержат последовательность 1 т.п.о., разделяющую 40% или более высокую идентичность последовательности с другой последовательностью 1 т.п.о., содержащейся в геноме маиса, из первого пула последовательностей;

e) исключения любых геномных последовательностей маиса, не имеющих известного гена маиса в пределах 40 т.п.о. от идентифицированной последовательности, из первого пула последовательностей; и

f) идентификации оставшихся геномных последовательностей маиса в пуле последовательностей как внегенные геномные последовательности маиса. После идентификации последовательностей, с ними можно проводить манипуляции с использованием рекомбинантных способов, для нацеливания вставки последовательностей нуклеиновой кислоты, не обнаруженной в локусах нативного генома.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, любые геномные последовательности маиса, не имеющие известного гена маиса, или по меньшей мере 2 т.п.о. выше или 1 т.п.о. ниже последовательности известного гена, локализованных в пределах 40 т.п.о. от геномной последовательности маиса, исключают из пула внегенных геномных последовательностей маиса.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, любые геномные последовательности маиса, не имеющие гена, экспрессирующего белок маиса, локализованного в пределах 40 т.п.о. от геномной последовательности маиса, исключают из пула внегенных геномных последовательностей маиса.

В соответствии с одним из вариантов осуществления в настоящем документе описана очищенная полинуклеотидная последовательность маиса, где очищенная последовательность содержит внегенную геномную последовательность маиса из по меньшей мере 1 т.п.о. В одном из вариантов осуществления внегенная последовательность маиса является гипометилированной, поддающейся экспрессии, демонстрирует признаки рекомбинации и является локализованной в ближнем положении от генной области в геноме маиса. В одном из вариантов осуществления внегенная последовательность имеет длину в диапазоне от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 4,3 т.п.о. В одном из вариантов осуществления представляющая интерес ДНК содержит экзогенные последовательности ДНК, включая, например, регуляторные последовательности, участки рестрикционного расщепления, кодирующие РНК области или кодирующие белок области. В одном из вариантов осуществления представляющая интерес ДНК содержит экспрессирующую генную кассету, содержащую один или несколько трансгенов.

В соответствии с одним из вариантов осуществления представлена очищенная полинуклеотидная последовательность маиса, содержащая оптимальную внегенную геномную последовательность маиса от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 4,3 т.п.о. и представляющую интерес ДНК где внегенная геномная последовательность маиса обладает 1, 2, 3, 4 или 5 из следующих свойств или характеристик:

a) имеет известную или прогнозируемую кодирующую последовательностью маиса в пределах 40 т.п.о. от указанной геномной последовательности маиса;

b) имеет последовательность, содержащую 2 т.п.о. выше и/или 1 т.п.о. ниже известного гена маиса в пределах 40 т.п.о. от одного конца указанной геномной последовательности маиса;

c) не содержит метилированный полинуклеотид;

d) не содержит последовательность 1 т.п.о., обладающую более чем 40% идентичностью последовательности с любой другой последовательностью в геноме маиса; и

e) демонстрирует признаки рекомбинации с частотой рекомбинации более 0,00041 сМ/млн.п.о.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, представлена очищенная полинуклеотидная последовательность маиса, содержащая выбранную внегенную последовательность. Выбранная внегенная последовательность обладает 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 из следующих характеристик:

a) внегенная последовательность не содержит метилированный полинуклеотид;

b) внегенная последовательность обладает частотой рекомбинации в геноме маиса 0,00041-62,42 сМ/млн.п.о. сМ/млн.п.о.;

c) внегенная последовательность обладает уровнем занятости нуклеосомами в геноме маиса 0-0,962;

d) внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью 1 т.п.о., содержащейся в геноме маиса;

e) внегенная последовательность обладает значением относительного расположения с отношением геномного расстояния от центромеры хромосомы маиса 0,00373-0,99908;

f) внегенная последовательность обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне 25,17-68,3%;

g) внегенная последовательность локализована вблизи генной последовательности; и,

h) область 1 млн.п.о. геномной последовательности маиса, содержащая указанную внегенную последовательность, содержит одну или несколько внегенных последовательностей.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, любые геномные последовательности маиса, не демонстрирующие признаков рекомбинации с частотой рекомбинации более 0,00041 сМ/млн.п.о. исключают из пула внегенных геномных последовательностей маиса.

В соответствии с одним из вариантов осуществления выбранная внегенная последовательность обладает следующими характеристиками:

a) внегенная последовательность не содержит более 1% метилирования ДНК в последовательности

b) внегенная последовательность обладает значением относительного расположения с отношением геномного расстояния от центромеры хромосомы маиса 0,0984-0,973;

c) внегенная последовательность обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне 34,38-61,2%; и,

d) внегенная последовательность имеет длину от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 4,9 т.п.о.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. иллюстрирует образец снимка экрана графика колебаний для профиля метилирования ДНК тканей корней и побегов, полученных из хромосомы номер 1 Zea mays c.v. B73.

Фиг. 2. иллюстрирует распределение длины последовательностей полученных гипометилированных геномных положений в геноме Zea mays c.v. B73.

На фиг. 3. представлен трехмерный график 5286 оптимальных локусов маиса. Статистический способ анализа главных компонентов (PCA) использовали для кластеризации набора из 5286 идентифицированных оптимальных геномных локусов на 32 отдельных кластера на основании значений их признаков (см. Пример 1). В ходе процесса PCA получено пять главных компонентов (PC), где три лучших PC включали приблизительно 90% общей изменчивости набора данных. Эти три лучших PCA использовали для графического представления 32 кластеров в трехмерном графике, как показано на фиг. 3.

На фиг. 4. представлено схематическое изображение, указывающее на хромосомное распределение 81 оптимальных геномных локусов и их относительные положения на хромосомах маиса.

На фиг. 5. представлен график, показывающий перекрывание 72 оптимальных геномных локусов в базах данных геномов Zea mays c.v. B104 и c.v.Hi-II, выбранных для валидации нацеливания.

На фиг. 6. представлено схематическое изображение, показывающее локализацию на хромосомах Zea mays 72 оптимальных геномных локусов, выбранных для валидации нацеливания.

На фиг. 7. представлена карта плазмиды pDAB111845 (SEQ ID NO:5418). Пронумерованные элементы (т.е., 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 25 и 26) соответствуют последовательностям связывания нуклеазы с цинковыми пальцами длиной приблизительно от 20 до 35 пар оснований, узнаваемым и расщепляемым соответствующими нуклеазными белками с цинковыми пальцами. Эти последовательности связывания цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой область матрицы размером 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету.

На фиг. 8. представлена последовательность универсального донорного полинуклеотида для интеграции посредством негомологичного соединения концов (NHEJ). Представлены два предложенных вектора, где представляющая интерес ДНК (ДНК X) содержит один или несколько (т.е., «1-N») участков связывания цинковых пальцев (ZFN BS) на любом конце представляющей интерес ДНК. Вертикальными стрелками показаны уникальные участки рестрикции, и горизонтальными стрелками показаны потенциальные участки праймеров для ПЦР.

На фиг. 9. представлена последовательность универсального донорного полинуклеотида для интеграции посредством направляемой гомологией репарации (HDR). Представляющая интерес ДНК (ДНК X) содержит две области гомологичных последовательностей (HA), фланкирующие представляющую интерес ДНК с участками связывания нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) с разных сторон последовательностей ДНК X и HA. Вертикальными стрелками показаны уникальные участки рестрикции, и горизонтальными стрелками показаны потенциальные участки праймеров для ПЦР.

На фиг. 10A-10C. проиллюстрированы конструкции, использованные для нацеливания и валидации интеграции универсальной донорной полинуклеотидной системы в оптимальных геномных локусах Zea mays. Фиг. 10A) Пространственный дизайн ZFN с локализацией пар ZFN, как показано ранее в pDAB111845 на фигуре 5. Пары ZFN отмечены нумерацией и соответствуют специфическим последовательностям связывания ZFN, специфически узнаваемым белками ZFN для связывания и расщепления. Фиг. 10B) Конфигурация экспрессирующей белок ZFN конструкции. Экспрессирующая ZFN конструкция содержит конститутивный промотор растений (Zm Ubi1), используемый для управления экспрессией белка ZFN. Белок ZFN содержит последовательность ядерной локализации (NLS), белки с цинковыми пальцами (ZFP-L и ZFP-R, где L обозначает связывающий белок ZFN «левой руки», и R обозначает связывающий белок ZFN «правой руки»), эндонуклеазу Fok-1 (Fok1) и самогидролизующийся 2A (2A). Фиг. 10C) Универсальный донорный полинуклеотид для опосредованного NHEJ нацеливания на оптимальные геномные локусы Zea mays. Z1-Z6 представляют участки связывания ZFN, специфические для оптимальных геномных локусов-мишеней Zea mays. Количество участков ZFN может меняться от 3 до 6. Вертикальными стрелками показаны уникальные участки рестрикции, и горизонтальными стрелками показаны потенциальные участки праймеров для ПЦР. Универсальная донорная полинуклеотидная система представляет собой короткую (110 п.о.) последовательность, которая является общей для доноров, используемых для интеграции в оптимальные геномные локусы Zea mays.

Фиг. 11. Карта плазмиды pDAB8393.

Фиг. 12. Активность расщепления ZFN в мишенях выбранных геномных локусов Zea mays. Активность расщепления представлена как количество последовательностей с инделами (вставками и делециями) в участке расщепления ZFN на 1 миллион прочтений высокого качества.

Фиг. 13. Валидация мишеней в выбранных геномных локусах Zea mays с использованием способа анализа быстрого нацеливания (RTA) на основе NHEJ.

Фиг. 14 и 14B. Плазмидные конструкции, трансформированные в Zea mays посредством случайной интеграции, включающие события, использованные для анализа фланкирующей последовательности и исследований экспрессии трансгена. На фиг. 14 представлена вставка pDAB105817, фрагмент 1871 п.о.; на фиг. 14B представлена вставка фрагмента 6128 п.о. из pEPS105817.

Фиг. 15. Карта плазмиды pDAB111846 (SEQ ID NO:5419). Пронумерованные элементы (т.е., 1, 2, 5, 6, 11, 12, 15, 16, 21, 22, 29 и 30) соответствуют последовательностям связывания нуклеазы с цинковыми пальцами длиной приблизительно от 20 до 35 пар оснований, узнаваемым и расщепляемым соответствующими нуклеазными белками с цинковыми пальцами. Эти последовательности связывания цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой область матрицы размером 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету.

Фиг. 16. Карта плазмиды of pDAB117415 (SEQ ID NO:5420). Пронумерованные элементы (т.е., ZFN51 и ZFN52) соответствуют последовательностям связывания нуклеазы с цинковыми пальцами длиной приблизительно от 20 до 35 пар оснований, узнаваемым и расщепляемым соответствующими нуклеазными белками с цинковыми пальцами. Эти последовательности связывания цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой область матрицы размером 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Кроме того, в эту плазмидную конструкцию включена «область перекрывания 104113», которая представляет собой последовательности, обладающие гомологией с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е., посредством сборки Гибсона).

Фиг. 17. Карта плазмиды pDAB117416 (SEQ ID NO:5421). Пронумерованные элементы (т.е., ZFN54 и ZFN53) соответствуют последовательностям связывания нуклеазы с цинковыми пальцами длиной приблизительно от 20 до 35 пар оснований, узнаваемым и расщепляемым соответствующими нуклеазными белками с цинковыми пальцами. Эти последовательности связывания цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой область матрицы размером 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Кроме того, в эту плазмидную конструкцию включена «область перекрывания 104113», которая представляет собой последовательности, обладающие гомологией с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е., посредством сборки Гибсона).

Фиг. 18. Карта плазмиды pDAB117417 (SEQ ID NO:5422). Пронумерованный элемент (т.е., ZFN55) соответствуют последовательностям связывания нуклеазы с цинковыми пальцами длиной приблизительно от 20 до 35 пар оснований, узнаваемым и расщепляемым соответствующими нуклеазными белками с цинковыми пальцами. Эти последовательности связывания цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой область матрицы размером 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Кроме того, в эту плазмидную конструкцию включена «область перекрывания 104113», которая представляет собой последовательности, обладающие гомологией с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е., посредством сборки Гибсона).

Фиг. 19. Карта плазмиды pDAB117419 (SEQ ID NO:5423). Пронумерованные элементы (т.е., ZFN59 и ZFN60) соответствуют последовательностям связывания нуклеазы с цинковыми пальцами длиной приблизительно от 20 до 35 пар оснований, узнаваемым и расщепляемым соответствующими нуклеазными белками с цинковыми пальцами. Эти последовательности связывания цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой область матрицы размером 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Кроме того, в эту плазмидную конструкцию включена «область перекрывания 104113», которая представляет собой последовательности, обладающие гомологией с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е., посредством сборки Гибсона).

Фиг. 20. Карта плазмиды pDAB117434 (SEQ ID NO:5424). Пронумерованные элементы (т.е., ZFN66, ZFN67, ZFN68 и ZFN69) соответствуют последовательностям связывания нуклеазы с цинковыми пальцами длиной приблизительно от 20 до 35 пар оснований, узнаваемым и расщепляемым соответствующими нуклеазными белками с цинковыми пальцами. Эти последовательности связывания цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой область матрицы размером 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Кроме того, в эту плазмидную конструкцию включена «область перекрывания 104113», которая представляет собой последовательности, обладающие гомологией с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е., посредством сборки Гибсона).

Фиг. 21. Карта плазмиды pDAB117418 (SEQ ID NO:5425). Пронумерованные элементы (т.е., ZFN56, ZFN57, и ZFN58) соответствуют последовательностям связывания нуклеазы с цинковыми пальцами длиной приблизительно от 20 до 35 пар оснований, узнаваемым и расщепляемым соответствующими нуклеазными белками с цинковыми пальцами. Эти последовательности связывания цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой область матрицы размером 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Кроме того, в эту плазмидную конструкцию включена «область перекрывания 104113», которая представляет собой последовательности, обладающие гомологией с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е., посредством сборки Гибсона).

Фиг. 22. Карта плазмиды pDAB117420 (SEQ ID NO:5426). Пронумерованные элементы (т.е., ZFN61 и ZFN62) соответствуют последовательностям связывания нуклеазы с цинковыми пальцами длиной приблизительно от 20 до 35 пар оснований, узнаваемым и расщепляемым соответствующими нуклеазными белками с цинковыми пальцами. Эти последовательности связывания цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой область матрицы размером 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Кроме того, в эту плазмидную конструкцию включена «область перекрывания 104113», которая представляет собой последовательности, обладающие гомологией с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е., посредством сборки Гибсона).

Фиг. 23. Карта плазмиды pDAB117421 (SEQ ID NO:5427). Пронумерованные элементы (т.е., пара 3 PPL17, пара 1 PPL17 и пара 2 PPL17) соответствуют последовательностям связывания нуклеазы с цинковыми пальцами длиной приблизительно от 20 до 35 пар оснований, узнаваемым и расщепляемым соответствующими нуклеазными белками с цинковыми пальцами. Эти последовательности связывания цинковых пальцев и аннотированная «последовательность UZI» (которая представляет собой область матрицы размером 100-150 п.о., содержащую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующие последовательности) содержат универсальную донорную кассету. Кроме того, в эту плазмидную конструкцию включена «область перекрывания 104113», которая представляет собой последовательности, обладающие гомологией с плазмидным вектором для высокопроизводительной сборки универсальных донорных кассет в плазмидном векторе (т.е., посредством сборки Гибсона).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

При описании и составлении формулы изобретения используют следующую терминологию в соответствии с определениями, приведенными ниже.

Термин «приблизительно», как применяют в настоящем документе, означает больше или меньше, чем указанное значение или диапазон значений на 10 процентов, но не предназначен для отнесения какого-либо значения или диапазона значений только к этому более широкому определению. Каждое значение или диапазон значений, которым предшествует термин «приблизительно», предназначены также для включения варианта осуществления указанного абсолютного значения или диапазона значений.

Как применяют в настоящем документе, термин «растение» включает целое растение и любого потомка, клетку, ткань или часть растения. Термин «части растений» включают любую часть(части) растения, включая, в качестве неограничивающих примеров: семена (включая зрелые семена и незрелые семена); черенки растений; клетку растения; культуру клеток растений; орган растения (например, пыльцу, зародыши, цветки, плоды, побеги, листья, корни, стебли и эксплантаты). Ткань растения или орган растения могут представлять собой семя, протопласт, каллюс или любую другую группу клеток растений, которые организованы в структурную или функциональную единицу. Культура клеток или тканей растений может являться способной к регенерации растения, обладающего физиологическими и морфологическими характеристиками растения, из которого получена клетка или ткань, и к регенерации растения, обладающего по существу таким же генотипом, что и родительское растение. В отличие от этого, некоторые клетки растения не способны регенерировать с образованием растений. Регенерирующие клетки в культуре клеток или тканей растений могут представлять собой зародыши, протопласты, клетки меристемы, каллюс, пыльцу, листья, пыльники, корни, верхушки корней, метелки, цветки, зерна, початки, стержни початков, пленки или ножки.

Части растений включают пожинаемые части и части, пригодные для размножения потомков растений. Части растений, пригодные для размножения, включают в качестве неограничивающих примеров: семя; плод; черенок; проросток; клубень и корневище. Пожинаемая часть растения может представлять собой любую пригодную часть растения, включая в качестве неограничивающих примеров: цветок; пыльцу; семя; клубень; лист; стебель; плод; семя и корень.

Клетка растения представляет собой структурную и физиологическую единицу растения. Клетки растения, как применяют в настоящем документе, включают протопласты и протопласты с клеточной стенкой. Клетка растения может находиться в форме выделенной единичной клетки или агрегата клеток (например, ломкий каллюс и культивируемая клетка) и может являться частью более высокоорганизованной единицы (например, ткань растения, орган растения и растение). Таким образом, клетка растения может представлять собой протопласт, образующую гаметы клетку, или клетку или коллекцию клеток, которые могут регенерировать в целое растение. По существу, семя, которое содержит множество клеток растений и способно регенерировать в целое растение, считают «частью растения» в вариантах осуществления в настоящем документе.

Термин «протопласт», как применяют в настоящем документе, относится к клетке растения, из которой клеточная стенка полностью или частично удалена, и в которой липидная бислойная мембрана обнажена. Как правило, протопласт представляет собой выделенную клетку растения без клеточной стенки, которая обладает способностью к регенерации в клеточную культуру или целое растение.

Как применяют в настоящем документе, термины «нативный» или «природный» определяют состояние, обнаруженное в природе. «Нативная последовательность ДНК» представляет собой последовательность ДНК, встречающуюся в природе, которая продуцирована естественными путями или традиционными способами скрещивания, но не получена способами генной инженерии (например, с использованием способов молекулярной биологии/трансформации).

Как применяют в настоящем документе, «эндогенная последовательность» определяет нативную форму полинуклеотида, гена или полипептида в его природном положении в организме или в геноме организма.

Термин «выделенный», как применяют в настоящем документе, означает извлеченный из его природного окружения.

Термин «очищенный», как применяют в настоящем документе, относится к выделению молекулы или соединения в форме, по существу свободной от примесей, обычно ассоциированных с молекулой или соединением в нативном или природном окружении, и означает увеличение чистоты в результате отделения от других компонентов первоначальной композиции. Термин «очищенная нуклеиновая кислота» используют в настоящем документе для описания последовательности нуклеиновой кислоты, которая отделена от других соединений, включая, но без ограничения, полипептиды, липиды и углеводы.

Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используют взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термин применим также к полимерам аминокислот, в которых одна или несколько аминокислот являются химическими аналогами или модифицированными производными соответствующих встречающихся в природе аминокислот.

Как применяют в настоящем документе, «оптимальные геномные локусы однодольных растений», «оптимальные внегенные локусы однодольных растений», «оптимальные внегенные локусы» или «оптимальные геномные локусы (OGL)» используют взаимозаменяемо для обозначения нативной последовательности ДНК, обнаруженной в ядерном геноме однодольного растения, которая обладает следующими свойствами: является внегенной, гипометилированной, является поддающейся нацеливанию и локализована вблизи генной области, где геномная область вокруг оптимальных геномных локусов однодольных растений обладает признаками рекомбинации.

Как применяют в настоящем документе, «оптимальные геномные локусы маиса», «оптимальные внегенные локусы маиса», «оптимальные внегенные локусы» или «оптимальные геномные локусы (OGL)» используют взаимозаменяемо для обозначения нативной последовательности ДНК, обнаруженной в ядерном геноме растения маиса, которая обладает следующими свойствами: является внегенной, гипометилированной, является поддающейся нацеливанию и локализована вблизи генной области, где геномная область вокруг оптимальных геномных локусов маиса обладает признаками рекомбинации.

Как применяют в настоящем документе, «внегенная последовательность однодольных растений» или «внегенная геномная последовательность однодольных растений» представляет собой нативную последовательность ДНК, обнаруженную в ядерном геноме однодольного растения, имеющую длину по меньшей мере 1 т.п.о. и лишенную каких-либо открытых рамок считывания, генных последовательностей или регуляторных последовательностей генов. Более того, внегенная последовательность однодольных растений не содержит какой-либо последовательности интрона (т.е. интроны исключены из определения внегенной последовательности). Внегенная последовательность не может быть транскрибирована или транслирована в белок. Многие геномы растений содержат внегенные области. Вплоть до 95% генома могут являться внегенными, и эти области могут содержать в основном повторяющуюся ДНК.

Как применяют в настоящем документе, «внегенная последовательность маиса» или «внегенная геномная последовательность маиса» представляет собой нативную последовательность ДНК, встречающуюся в ядерном геноме растения маиса, имеющую длину по меньшей мере 1 т.п.о. и лишенную каких-либо открытых рамок считывания, генных последовательностей или регуляторных последовательностей генов. Более того, внегенная последовательность маиса не содержит какой-либо последовательности интрона (т.е. интроны исключены из определения внегенной последовательности). Внегенная последовательность не может быть транскрибирована или транслирована в белок. Многие геномы растений содержат внегенные области. Вплоть до 95% генома могут являться внегенными, и эти области могут содержать в основном повторяющуюся ДНК.

Как применяют в настоящем документе, «генную область» определяют как полинуклеотидную последовательность, которая содержит открытую рамку считывания, кодирующую РНК и/или полипептид. Генная область также может охватывать любые поддающиеся идентификации соседние 5′ и 3′-некодирующие нуклеотидные последовательности, вовлеченные в регуляцию экспрессии открытой рамки считывания вплоть до приблизительно на 2 т.п.о. выше кодирующей области и на 1 т.п.о. ниже кодирующей области, но возможно еще выше или ниже. Кроме того, генная область включает любые интроны, которые могут присутствовать в генной области. Кроме того, генная область может содержать одну последовательность гена или множество последовательностей генов, между которыми располагаются короткие участки (менее 1 т.п.о.) внегенных последовательностей.

Как применяют в настоящем документе «представляющую интерес нуклеиновую кислоту», «представляющую интерес ДНК» или «донор» определяют как последовательность нуклеиновой кислоты/ДНК, которая выбрана для сайт-специфического нацеленного встраивания в геном однодольного растения или маиса. Представляющая интерес нуклеиновая кислота может иметь любую длину, например, от 2 до 50000 нуклеотидов (или любое целое число между ними или выше), предпочтительно, длину приблизительно от 1000 до 5000 нуклеотидов (или любое целое число между ними). Представляющая интерес нуклеиновая кислота может содержать одну или несколько экспрессирующих генных кассет, которые дополнительно содержат активно транскрибируемые и/или транслируемые генные последовательности. В отличие от этого, представляющая интерес нуклеиновая кислота может содержать полинуклеотидную последовательность, которая не содержит функциональную экспрессирующую генную кассету или целый ген (например, может просто содержать регуляторные последовательности, такие как промотор), или может не содержать какие-либо идентифицируемые элементы экспрессии генов или какую-либо активно транскрибируемую генную последовательность. Представляющая интерес нуклеиновая кислота необязательно может содержать аналитический домен. При вставке представляющей интерес нуклеиновой кислоты в геном однодольного растения или маиса, например, встроенные последовательности обозначают как «встроенную представляющую интерес ДНК». Кроме того, представляющая интерес нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК, может являться линейной или кольцевой, и может являться одноцепочечной или двухцепочечной. Ее можно доставлять в клетку в качестве голой нуклеиновой кислоты, в качестве комплекса с одним или несколькими средствами для доставки (например, липосомы, полоксамеры, T-цепь, инкапсулированная в белки, и т.д.), или она содержится в бактериальном или вирусном носителе для доставки, например, таком как Agrobacterium tumefaciens, или аденовирус, или аденоассоциированный вирус (AAV), соответственно.

Как применяют в настоящем документе термин «аналитический домен» определяет последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит функциональные элементы, способствующие направленной вставке последовательностей нуклеиновой кислоты. Например, аналитический домен может содержать специально разработанные участки для ферментов рестрикции, участки связывания цинковых пальцев, сконструированные посадочные площадки или сконструированные платформы для интеграции трансгенов, и он может содержать или может не содержать регуляторные элементы генов или открытую рамку считывания. См., например, публикацию патента США NO 20110191899, полное содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Как применяют в настоящем документе, термин «выбранная последовательность однодольного растения» обозначает нативную последовательность геномной ДНК однодольного растения, выбранную для анализа для определения того, отвечает ли последовательность требованиям оптимальных внегенных геномных локусов однодольных растений.

Как применяют в настоящем документе термин «выбранная последовательность маиса» обозначает нативную геномную последовательность ДНК маиса, выбранную для анализа для определения того, отвечает ли последовательность требованиям оптимальных внегенных геномных локусов маиса.

Как применяют в настоящем документе, термин «гипометилирование» или «гипометилированный», в отношении последовательности ДНК определяет состояние уменьшенного метилирования нуклеотидных остатков ДНК в данной последовательности ДНК. Как правило, уменьшенное метилирование относится к количеству метилированных остатков аденина или цитозина относительно среднего уровня метилирования, встречающегося в внегенных последовательностях, присутствующих в геноме маиса или однодольного растения.

Как применяют в настоящем документе, «поддающаяся нацеливанию последовательность» представляет собой полинуклеотидную последовательность, которая является достаточно уникальной в ядерном геноме, чтобы обеспечить сайт-специфическую направленную вставку представляющей интерес нуклеиновой кислоты в одну конкретную последовательность.

Как применяют в настоящем документе, термин «неповторяющаяся» последовательность определяют как последовательность длиной по меньшей мере 1 т.п.о., которая обладает менее чем 40% идентичностью с любой другой последовательностью в геноме однодольного растения или в геноме Zea mays. Расчет идентичности последовательности можно проводить с использованием любого стандартного способа, известного специалистам в данной области, включая, например, сканирование выбранной геномной последовательности против генома однодольного растения, например, генома Zea mays c.v. B73, с использованием поиска гомологии на основе BLAST™ с использованием программного обеспечения NCBI BLAST™ (версия 2.2.23) с настройками параметров по умолчанию (Stephen F. Altschul et al (1997), «Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs», Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). Например, по мере того как анализировали выбранные последовательности маиса (из генома Zea mays c.v. B73), первый идентифицированный положительный результат такого поиска в BLAST™ представлял собой последовательность однодольного растения, например, саму последовательность Zea mays c.v. B73. Идентифицировали второй положительный результат BLAST™ для каждой выбранной последовательности маиса, и перекрывание выравнивания (представленное как процент выбранной последовательности маиса, охватываемой положительным результатом BLAST™) для положительного результата использовали в качестве показателя уникальности выбранной последовательности маиса в геноме однодольного растения, т.е., в геноме Zea mays. Эти значения перекрывания выравнивания для второго положительного результата BLAST™ лежали в диапазоне от минимум 0% до максимум 39,98% идентичности последовательностей. Любые последовательности, выравниваемые с более высокими уровнями идентичности последовательностей, не рассматривали.

Термин «вблизи генной области», при применении по отношению к внегенной последовательности, определяет положение внегенной последовательности относительно генной области. В частности, анализировали количество генных областей в окружении в пределах 40 т.п.о. (т.е. в пределах 40 т.п.о. от любого конца выбранной последовательности оптимального геномного локуса маиса). Этот анализ проводили посредством анализа аннотирующей информации генов и локализации известных генов в геноме известных однодольных растений, которая извлечена из базы данных для однодольных растений, например, Maize Genome Database. Для каждого из 5286 оптимальных внегенных геномных локусов маиса, определяли окно 40 т.п.о. вокруг оптимальной последовательности геномного локуса, и подсчитывали количество аннотированных генов с положениями, перекрывающими это окно. Количество генных областей в окружении 40 т.п.о. лежало в диапазоне от минимум 1 гена до максимум 9 генов.

Термин «известная кодирующая последовательность однодольных растений», как применяют в настоящем документе, относится к любой полинуклеотидной последовательности, идентифицированной из любой базы данных геномов однодольных растений, включая Maize Genomic Database (доступную на www.maizegdb.org and Monaco, M., et al., Maize Metabolic Network Construction and Transcriptome Analysis. doi:10,3835/plantgenome2012,09,0025; Posted online 23 Jan. 2013), которая содержит открытую рамку считывания, либо до, либо после процессинга интронных последовательностей, и транскрибируется в мРНК и необязательно транслируется в белковую последовательность, при помещении под контроль соответствующих генетических регуляторных элементов. Известная кодирующая последовательность однодольных растений может представлять собой последовательность кДНК или геномную последовательность. В некоторых случаях известная кодирующая последовательность однодольных растений может являться аннотированой как функциональный белок. В других случаях известная кодирующая последовательность однодольных растений может не являться аннотированной.

Термин «известная кодирующая последовательность маиса», как применяют в настоящем документе, относится к любой полинуклеотидной последовательности, идентифицированной из Maize Genomic Database (доступной на www.maizegdb.org and Monaco, M., et al., Maize Metabolic Network Construction and Transcriptome Analysis. doi:10,3835/plantgenome2012,09,0025; Posted online 23 Jan. 2013), которая содержит открытую рамку считывания, либо до, либо после процессинга интронных последовательностей, и транскрибируется в мРНК и необязательно транслируется в белковую последовательность при помещении под контроль соответствующих генетических регуляторных элементов. Известная кодирующая последовательность маиса может представлять собой последовательность кДНК или геномную последовательность. В некоторых случаях известная кодирующая последовательность маиса может являться аннотированной как функциональный белок. В других случаях известная кодирующая последовательность маиса может не являться аннотированной.

Термин «прогнозируемая кодирующая последовательность однодольного растения», как применяют в настоящем документе, относится к любым полинуклеотидным последовательностям маркеров экспрессируемой последовательности (EST), описанным в базе данных геномов однодольных растений, например, в базе данных Maize Genomic Database. EST идентифицируют из библиотек кДНК, сконструированных с использованием олиго(dT)-праймеров для прямого синтеза первой цепи посредством обратной транскриптазы. Полученные EST представляют собой данные однократных прочтений секвенирования размером менее 500 п.о., полученные либо с 5′-конца, либо с 3′-конца вставки кДНК. Множество EST можно выравнивать до одного контига. Идентифицированные последовательности EST загружают в базу данных геномов однодольных растений, например, Maize Genomic Database, и можно проводить их поиск биоинформатическими способами для прогнозирования соответствующих геномных полинуклеотидных последовательностей, содержащих кодирующую последовательность, которая транскрибируется в мРНК и необязательно транслируется в белковую последовательность при помещении под контроль соответствующих генетических регуляторных элементов.

Термин «прогнозируемая кодирующая последовательность маиса», как применяют в настоящем документе, относится к любым полинуклеотидным последовательностям маркеров экспрессируемой последовательности (EST), описанным в Maize Genomic Database. EST идентифицируют из библиотек кДНК, сконструированных с использованием олиго(dT)-праймеров для прямого синтеза первой цепи посредством обратной транскриптазы. Полученные EST представляют собой данные однократных прочтений секвенирования размером менее 500 п.о., полученные либо с 5′-конца, либо с 3′-конца вставки кДНК. Множество EST можно выравнивать до одного контига. Идентифицированные последовательности EST загружают в Maize Genomic Database, и можно проводить их поиск биоинформатическими способами для прогнозирования соответствующих геномных полинуклеотидных последовательностей, содержащих кодирующую последовательность, которая транскрибируется в мРНК и необязательно транслируется в белковую последовательность при помещении под контроль соответствующих генетических регуляторных элементов.

Термин «признак рекомбинации», как применяют в настоящем документе, относится к частоте мейотической рекомбинации между любой парой геномных маркеров однодольных растений, например, Zea mays, на протяжении области хромосомы, содержащей выбранную последовательность маиса. Частоты рекомбинации рассчитывают на основании отношения генетического расстояния между маркерами (в сантиморганах (cM)) к физическому расстоянию между маркерами (в миллионах пар оснований (млн.п.о.)). Чтобы выбранная последовательность маиса обладала признаками рекомбинации, выбранная последовательность маиса должна иметь по меньшей мере одно событие рекомбинации между двумя маркерами, фланкирующими выбранную последовательность маиса, как детектируют с использованием высокоразрешающего набора данных маркеров из множества картированных популяций. (См., например, Jafar Mammadov, Wei Chen, Anastasia Chueva, Karthik Muthuraman, Ruihua Ren, David Meyer, and Siva Kumpatla. 2011. Distribution of Recombinant Frequencies across the Maize Genome. 52^nd Annual Maize Genetics Conference).

Как применяют в настоящем документе, термин «значение относительного расположения» представляет собой расчетное значение, определяющее расстояние геномного локуса от его соответствующей хромосомной центромеры. Для каждой выбранной последовательности маиса измеряют геномное расстояние от нативного положения выбранной последовательности маиса до центромеры хромосомы, на которой она расположена (в п.о.). Относительное положение выбранной последовательности маиса на хромосоме представляют как отношение ее геномного расстояния до центромеры к длине конкретного плеча хромосомы (измеренной в п.о.), на котором она расположена. Эти значения относительного расположения для набора данных оптимальных внегенных геномных локусов маиса лежат в диапазоне от минимального отношения геномных расстояний 0,00373 до максимального отношения геномных расстояний 0,99908.

Термин «экзогенная последовательность ДНК», как применяют в настоящем документе, представляет собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, которая извлечена из ее нативного положения и встроена в новое положение, с изменением последовательностей, фланкирующих последовательность нуклеиновой кислоты, которая была перемещена. Например, экзогенная последовательность ДНК может содержать последовательность из другого вида.

«Связывание» относится к специфическому для последовательности взаимодействию между макромолекулами (например, между белком и нуклеиновой кислотой). Не все компоненты связывающего взаимодействия должны являться специфическими для последовательности (например, контактируют с фосфатными остатками в остове ДНК), при условии, что взаимодействие в целом является специфическим для последовательности. Такие взаимодействия, как правило, характеризуют посредством константы диссоциации (Kd). «Аффинность» относится к прочности связывания: увеличенная аффинность связывания коррелирует с более низкой константой связывания (Kd).

«Связывающий белок» представляет собой белок, способный связываться с другой молекулой. Связывающий белок может связываться, например, с молекулой ДНК (ДНК-связывающий белок), молекулой РНК (РНК-связывающий белок) и/или с молекулой белка (белок-связывающий белок). В случае белок-связывающего белка, он может связываться сам с собой (с формированием гомодимеров, гомотримеров и т.д.) и/или он может связываться с одной или несколькими молекулами другого белка или белков. Связывающий белок может иметь более одного типа активности связывания. Например, белки с цинковыми пальцами обладают активностью связывания ДНК, активностью связывания РНК и активностью связывания белка.

Как применяют в настоящем документе, термин «цинковые пальцы» определяет области аминокислотной последовательности в связывающем домене ДНК-связывающего белка, структура которых стабилизирована посредством координации ионом цинка.

«ДНК-связывающий белок с цинковыми пальцами» (или связывающий домен) представляет собой белок или домен в более крупном белке, который связывает ДНК специфическим для последовательности образом через один или несколько цинковых пальцев, представляющих собой области аминокислотной последовательности в связывающем домене, структура которых стабилизирована координационной связью с ионом цинка. Термин «ДНК-связывающий белок с цинковыми пальцами» часто сокращенно обозначают как белок с цинковыми пальцами или ZFP. Связывающие домены цинковых пальцев можно «конструировать» для связывания с предопределенной нуклеотидной последовательностью. Неограничивающими примеры способов конструирования белков с цинковыми пальцами являются дизайн и отбор. Сконструированный белок с цинковыми пальцами представляет собой белок, не встречающийся в природе, дизайн/состав которого принципиально является результатом использования рациональных критериев. Рациональные критерии для дизайна включают применение правил замены и компьютеризованных алгоритмов обработки информации в базе данных, хранящей информацию о дизайне существующих ZFP и данные о связывании. См., например, патенты США No. 6140081; 6453242; 6534261 и 6794136; см. также WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 и WO 03/016496.

«ДНК-связывающий домен TALE» или «TALE» представляет собой полипептид, содержащий один или несколько доменов/единиц повтора TALE. Домены повторов вовлечены в связывание TALE с узнаваемой им последовательностью ДНК-мишени. Одна «единица повтора» (обозначенная также как «повтор»), как правило, имеет длину 33-35 аминокислот и обладает по меньшей мере некоторой гомологией последовательности с другими последовательностями повтора TALE во встречающемся в природе белке TALE. См., например, публикацию патента США No. 20110301073, полное содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Система нуклеаз CRISPR (короткие палиндромные повторы, расположенные кластерами, равномерно удаленными друг от друга)/Cas (ассоциированная с CRISPR). В кратком изложении, «ДНК-связывающий домен CRISPR» представляет собой молекулу РНК с короткой цепью, которая совместно с ферментом CAS может избирательно узнавать, связывать и расщеплять геномную ДНК. Систему CRISPR/Cas можно конструировать для внесения двухцепочечного разрыва (DSB) в желаемую мишень в геноме, и на репарацию DSB можно влиять с использованием ингибиторов репарации для обеспечения репарации с пониженной точностью. См., например, Jinek et al (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2:e00471, и David Segal, (2013) eLife 2:e00563).

Связывающие домены цинковых пальцев, CRISPR и TALE можно «конструировать» для связывания с предопределенной нуклеотидной последовательностью, например посредством конструирования (изменения одной или нескольких аминокислот) спирального участка узнавания природного цинкового пальца. Подобным образом, TALE можно «конструировать» для связывания с предопределенной нуклеотидной последовательностью, например, посредством конструирования аминокислот, вовлеченных в связывание ДНК (область повтора двух вариабельных остатков или область RYD). Таким образом, сконструированные ДНК-связывающие белки (цинковые пальцы или TALE) представляют собой белки, не встречающиеся в природе. Неограничивающими примерами способов конструирования ДНК-связывающих белков являются дизайн и отбор. Сконструированный ДНК-связывающий белок представляет собой белок, не встречающийся в природе, дизайн/состав которого в основном является результатом использования рациональных критериев. Рациональные критерии для дизайна включают применение правил замены и компьютеризованных алгоритмов обработки информации в базе данных, хранящей информацию о дизайне существующих ZFP и/или TALE, и данные о связывании. См., например, патенты США 6140081; 6453242 и 6534261; также см. WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 и WO 03/016496 и Патентные публикации США No. 20110301073, 20110239315 и 20119145940.

«Выбранный» белок с цинковыми пальцами, CRISPR или TALE представляет собой белок, не обнаруженный в природе, получение которого является результатом в основном эмпирического процесса, такого как фаговый дисплей, ловушка взаимодействий или гибридный отбор. См. например, патенты США No. 5789538; US 5925523; US 6007988; US 6013453; US 6200759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197 и WO 02/099084 и Патентные публикации США No. 20110301073, 20110239315 и 20119145940.

«Рекомбинация» относится к процессу обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами, включая, но без ограничения, фиксацию донора посредством соединения негомологичных концов (NHEJ) и гомологичной рекомбинации. Для целей настоящего описания «гомологичная рекомбинация (HR)» относится к специализированной форме такого обмена, который происходит, например, в процессе репарации двухцепочечных разрывов в клетках посредством механизмов направляемой гомологией репарации. Этот процесс требует гомологии нуклеотидных последовательностей, использует «донорную» молекулу в качестве матрицы для репарации молекулы-«мишени» (т.е. нуклеотидной последовательности, молекулы, подвергнутой двухцепочечному разрыву) и является известным под разными названиями как «конверсия генов без кроссинговера» или «конверсия коротких участков генов», поскольку он приводит к переносу генетической информации от донора к мишени. Без намерения быть связанными какой-либо конкретной теорией, такой перенос может вовлекать коррекцию несоответствующих оснований в гетеродуплексной ДНК, фомирующейся между имеющей разрывы мишенью и донором, и/или «зависимую от синтеза гибридизацию цепей», в которой донор используют для повторного синтеза генетической информации, которая становится частью мишени, и/или родственные процессы. Такая специализированная HR часто приводит к изменению последовательности молекулы-мишени, так что часть или вся последовательность донорного полинуклеотида включена в полинуклеотид-мишень. Для направляемой HR интеграции, донорная молекула содержит по меньшей мере 2 области гомологии с геномом («плечи гомологии») длиной по меньшей мере 50-100 пар оснований. См., например, публикацию патента США No. 20110281361.

В способах по изобретению одна или несколько направленных нуклеаз, как описано в настоящем документе, вносят двухцепочечный разрыв в последовательность-мишень (например, клеточный хроматин) в предопределенном участке, и «донорный» полинуклеотид, обладающий гомологией с нуклеотидной последовательностью в области разрыва для опосредуемой HR интеграции или не обладающий гомологией с нуклеотидной последовательностью в области разрыва для опосредуемой NHEJ интеграции, можно вводить в клетку. Показано, что присутствие двухцепочечного разрыва облегчает интеграцию донорной последовательности. Донорная последовательность может быть физически интегрирована или, альтернативно, донорный полинуклеотид используют в качестве матрицы для репарации разрыва посредством гомологичной рекомбинации, приводящей к введению всей или части нуклеотидной последовательности в качестве донора в клеточный хроматин. Таким образом, первая последовательность в клеточном хроматине может быть изменена и, в конкретных вариантах осуществления может быть конвертирована в последовательность, присутствующую в донорном полинуклеотиде. Таким образом, применение терминов «заменить» или «замена» можно понимать как представляющее замену одной нуклеотидной последовательности на другую (т.е., замену последовательности в информационном смысле), и оно не обязательно требует физической или химической замены одного полинуклеотида другим. В любом из способов, описанных в настоящем документе, можно использовать дополнительные пары белков с цинковыми пальцами, CRISPRS или TALEN для дополнительного двухцепочечного расщепления дополнительных участков-мишеней в клетке.

Любые из способов, описанных в настоящем документе, можно использовать для вставки донора любого размера и/или частичной или полной инактивации одной или нескольких последовательностей-мишеней в клетке посредством направленной интеграции донорной последовательности, нарушающей экспрессию представляющих интерес гена(генов). Представлены также линии клеток с частично или полностью инактивированными генами.

Более того, способы направленной интеграции, как описано в настоящем документе, также можно использовать для интеграции одной или нескольких экзогенных последовательностей. Экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты может содержать, например, один или несколько генов или молекул кДНК, или любой тип кодирующий или некодирующей последовательности, так же как один или несколько контрольных элементов (например, промоторов). Кроме того, экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты (трансген) может продуцировать одну или несколько молекул РНК (например, короткие шпилечные РНК (кшРНК), ингибирующие РНК (РНКи), микроРНК (мкРНК) и т.д.) или белок.

«Расщепление», как применяют в настоящем документе, определяет разрыв фосфатно-сахарного остова молекулы ДНК. Расщепление можно инициировать множеством способов, включая, но без ограничения, ферментативный или химический гидролиз фосфодиэфирной связи. Возможно как одноцепочечное расщепление, так и двухцепочечное расщепление, и двухцепочечное расщепление может происходить в результате двух отдельных событий одноцепочечного расщепления. Расщепление ДНК может приводить к образованию либо тупых концов, либо ступенчатых концов. В определенных вариантах осуществления слитые полипептиды используют для направленного расщепления двухцепочечной ДНК. «Домен расщепления» содержит одну или несколько полипептидных последовательностей, которые обладают каталитической активностью расщепления ДНК. Домен расщепления может содержаться в одной полипептидной цепи или активность расщепления может являться результатом ассоциации двух (или более) полипептидов.

«Полудомен расщепления» представляет собой полипептидную последовательность, которая, в сочетании с вторым полипептидом (либо идентичным, либо отличающимся) формирует комплекс, обладающий активностью расщепления (предпочтительно, активностью двухцепочечного расщепления). Термины «первый и второй полудомены расщепления» «+ и - полудомены расщепления» и «правый и левый полудомены расщепления» используют взаимозаменяемо для обозначения пар полудоменов расщепления расщепления, которые димеризуются.

«Сконструированный полудомен расщепления» представляет собой полудомен расщепления, модифицированный так, чтобы формировать облигатные гетеродимеры с другим полудоменом расщепления (например, другим сконструированным полудоменом расщепления). См., также Публикации Патентов США No. 2005/0064474, 20070218528, 2008/0131962 и 2011/0201055, полное содержание которых включено в настоящий документ в качестве ссылки.

«Участок-мишень» или «последовательность-мишень» относится к части нуклеиновой кислоты, с которой связывается связывающая молекула при условии существования подходящих условий для связывания.

Нуклеиновые кислоты включают ДНК и РНК, могут являться одноцепочечными и двухцепочечными; могут являться линейными, разветвленными или кольцевыми; и могут иметь любую длину. Нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, способные формировать дуплексы, а также формирующие триплексы нуклеиновые кислоты. См., например, патенты США No. 5176996 и 5422251. Белки включают, но без ограничения, ДНК-связывающие белки, факторы транскрипции, ремоделирующие хроматин факторы, белки, связывающие метилированную ДНК, полимеразы, метилазы, деметилазы, ацетилазы, деацетилазы, киназы, фосфатазы, интегразы, рекомбиназы, лигазы, топоизомеразы, гиразы и хеликазы.

«Продукт экзогенной нуклеиновой кислоты» включает как полинуклеотидные, так и полипептидные продукты, например, продукты транскрипции (полинуклеотиды, такие как РНК) и продукты трансляции (полипептиды).

«Слитая» молекула представляет собой молекулу, в которой две или более молекулы субъединиц связаны, например, ковалентно. Молекулы субъединиц могут представлять собой молекулы одного и того же типа, или они могут представлять собой молекулы различных химических типов. Примеры первого типа слитых молекул включают, но без ограничения, слитые белки (например, слитый белок между ДНК-связывающим доменом ZFP и доменом расщепления) и слитые нуклеиновые кислоты (например, нуклеиновая кислота, кодирующая слитый белок, описанный выше). Примеры второго типа слитых молекул включают, но без ограничения, слитую молекулу между формирующей триплекс нуклеиновой кислотой и полипептидом, и слитую молекулу между связывающую малую бороздку молекулой и нуклеиновой кислотой. Экспрессия слитого белка в клетке может происходить в результате доставки слитого белка в клетку или доставки полинуклеотида, кодирующего слитый белок, в клетку, где полинуклеотид транскрибируется и транскрипт транслируется, для получения слитого белка. Транс-сплайсинг, расщепление полипептида и лигирование полипептида могут быть также вовлечены в экспрессию белка в клетке. Способы доставки полинуклеотида и полипептида в клетки представлены в другом месте в этом описании.

Для целей настоящего изобретения «ген» включает область ДНК, кодирующую продукт гена (см. ниже), так же как все области ДНК, регулирующие получение продукта гена, вне зависимости от того, являются или нет такие регуляторные последовательности соседними с кодирующими и/или транскрибируемыми последовательностями. Соответственно, ген включает промоторные последовательности, терминаторы, регуляторные последовательности для трансляции, такие как участки связывания рибосом и внутренние участки связывания рибосом, энхансеры, сайленсеры, инсуляторы, пограничные элементы, точки начала репликации, участки присоединения матрикса и контрольные области локусов, но не обязательно ограничивается ими.

«Экспрессия гена» относится к переводу информации, содержащейся в гене, в продукт гена. Продукт гена может представлять собой прямой продукт транскрипции гена (например, мРНК, тРНК, рРНК, антисмысловую РНК, интерферирующую РНК, рибозим, структурную РНК или любой другой тип РНК) или белок, полученный посредством трансляции мРНК. Продукты генов также включают РНК, модифицированные посредством таких процессов, как кэпирование, полиаденилирование, метилирование и редактирование, и белки, модифицированные, например, посредством метилирования, ацетилирования, фосфорилирования, убиквитинилирования, АДФ-рибозилирования, миристилирования и гликозилирования.

Идентичность последовательностей: как применяют в настоящем документе, термины «идентичность последовательностей» или «идентичность» в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствии на протяжении определенного окна сравнения.

Как применяют в настоящем документе, термин «процент идентичности последовательностей» относится к значению, определенному посредством сравнения двух оптимально выровненных последовательностей (например, последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей) на протяжении окна сравнения, где часть последовательности в окне сравнения может содержать вставки или делеции (т.е. пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит вставок или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают посредством определения количества положений, в которых идентичные остатки нуклеиновой кислоты или аминокислотные остатки встречаются в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления этого количества совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения и умножения результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей.

Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области. Различные программы и алгоритмы выравнивания описаны, например, в: Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Подробное обсуждение способов выравнивания последовательностей и расчета гомологии можно обнаружить, например, в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990)) от National Center for Biotechnology Information (NCBI) доступен из нескольких источников, включая National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD) и Интернет, для применения совместно с несколькими программами анализа последовательностей. Описание того, как определять идентичность последовательностей с использованием этой программы, доступно через Интернет в разделе «help» для BLAST™. Для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот можно использовать функцию «Blast 2 sequences» программы BLAST™ (Blastn) с использованием параметров по умолчанию. Для последовательностей нуклеиновых кислот с более высоким сходством с эталонными последовательности показывают возрастающую процентную идентичность при оценке этим способом.

Специфически гибридизующийся/специфически комплементарный: как применяют в настоящем документе, термины «специфически гибридизующийся» или «специфически комплементарный» представляют собой термины, которые указывают на достаточную степени комплементарности, чтобы происходило стабильное и специфическое связывание между молекулой нуклеиновой кислоты и молекулой нуклеиновой кислоты-мишенью. Гибридизация между двумя молекулами нуклеиновой кислоты вовлекает формирование антипараллельное выравнивание последовательностей двух молекул нуклеиновой кислоты. Затем эти две молекулы способны образовывать водородные связи с соответствующими основаниями на противоположной цепи с образованием дуплексной молекулы, которая, если является достаточно стабильной, поддается обнаружению с использованием способов, хорошо известных в данной области. Молекула нуклеиновой кислоты не должна быть на 100% комплементарной ее последовательности-мишени, чтобы поддаваться специфической гибридизации. Однако значение комплементарности последовательностей, которая должна существовать для того, чтобы гибридизация была специфической, зависит от используемых условий гибридизации.

Условия гибридизации, приводящие к определенным степеням строгости, меняют в зависимости от характера выбранного способа гибридизации и состава и длины гибридизующихся последовательностей нуклеиновых кислот. Как правило, температура гибридизации и ионная сила (особенно, концентрация Na⁺ и/или Mg⁺⁺) буфера для гибридизации обеспечивают строгость гибридизации, хотя на строгость влияет также время отмывки. Расчеты, относящиеся к условиям гибридизации, требуемым для достижения конкретных степеней строгости, известны специалистам в данной области и рассмотрены, например, в Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11; и Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Дополнительную подробную инструкцию и руководство в отношении гибридизации нуклеиновых кислот можно обнаружить, например, в Tijssen, «Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays», в Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; и Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.

Как применяют в настоящем документе, «строгие условия» охватывают условия, в которых гибридизация происходит, только если существует менее 20% несоответствий между гибридизуемой молекулой и последовательностью в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени. «Строгие условия» включают дополнительные конкретные уровни строгости. Таким образом, как применяют в настоящем документе, условия «умеренной строгости» представляют собой условия, в которых молекулы с более чем 20% несоответствием последовательностей не будут гибридизоваться; условия «высокой строгости» представляют собой условия, в которых последовательности с более чем 10% несоответствием оснований не будут гибридизоваться; и условия «очень высокой строгости» представляют собой условия, в которых последовательности с более чем 5% несоответствием оснований не будут гибридизоваться. Ниже представлены репрезентативные неограничивающие условия гибридизации.

Условия высокой строгости (детектируют последовательности, разделяющие по меньшей мере 90% идентичности последовательностей): гибридизация в 5x буфере SSC (где буфер SSC содержит детергент, такой как SDS, и дополнительные реагенты, такие как ДНК спермы лосося, EDTA и т.д.) при 65°C в течение 16 часов; отмывка дважды в 2x буфере SSC (где буфер SSC содержит детергент, такой как SDS, и дополнительные реагенты, такие как ДНК спермы лосося, EDTA и т.д.) при комнатной температуре в течение 15 минут каждый раз; и отмывка дважды в 0,5x буфере SSC (где буфер SSC содержит детергент, такой как SDS, и дополнительные реагенты, такие как ДНК спермы лосося, EDTA и т.д.) при 65°C в течение 20 минут каждый раз.

Условия умеренной строгости (детектируют последовательности, разделяющие по меньшей мере 80% идентичности последовательностей): гибридизация в 5-6x буфере SSC (где буфер SSC содержит детергент, такой как SDS, и дополнительные реагенты, такие как ДНК спермы лосося, EDTA и т.д.) при 65-70°C в течение 16-20 часов; отмывка дважды в 2x буфере SSC (где буфер SSC содержит детергент, такой как SDS, и дополнительные реагенты, такие как ДНК спермы лосося, EDTA и т.д.) при комнатной температуре в течение 5-20 минут каждый раз; и отмывка дважды в 1x буфере SSC (где буфер SSC содержит детергент, такой как SDS, и дополнительные реагенты, такие как ДНК спермы лосося, EDTA и т.д.) при 55-70°C в течение 30 минут каждый раз.

Нестрогие контрольные условия (гибридизуются последовательности, разделяющие по меньшей мере 50% идентичности последовательностей): гибридизация в 6x буфере SSC (где буфер SSC содержит детергент, такой как SDS, и дополнительные реагенты, такие как ДНК спермы лосося, EDTA и т.д.) при температуре от комнатной температуры до 55°C в течение 16-20 часов; отмывка по меньшей мере дважды в 2x-3x SSC (где буфер SSC содержит детергент, такой как SDS, и дополнительные реагенты, такие как ДНК спермы лосося, EDTA и т.д.) от комнатной температуры до 55°C в течение 20-30 минут каждый раз.

Как применяют в настоящем документе, термин «по существу гомологичный» или «существенная гомология» в отношении непрерывной последовательности нуклеиновой кислоты, относится к непрерывным нуклеотидным последовательностям, которые гибридизуются в строгих условиях с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, последовательности нуклеиновой кислоты, которые по существу гомологичны эталонной последовательности нуклеиновой кислоты, представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются в строгих условиях (например, условиях умеренной строгости, указанных выше) с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты. По существу гомологичные последовательности могут обладать по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей. Например, по существу гомологичные последовательности могут обладать приблизительно от 80% до 100% идентичностью последовательностей, например, приблизительно 81%; приблизительно 82%; приблизительно 83%; приблизительно 84%; приблизительно 85%; приблизительно 86%; приблизительно 87%; приблизительно 88%; приблизительно 89%; приблизительно 90%; приблизительно 91%; приблизительно 92%; приблизительно 93%; приблизительно 94% приблизительно 95%; приблизительно 96%; приблизительно 97%; приблизительно 98%; приблизительно 98,5%; приблизительно 99%; приблизительно 99,5% и приблизительно 100%. Свойство существенной гомологии является тесно связанным со специфической гибридизацией. Например, молекула нуклеиновой кислоты поддается специфической гибридизации, когда существует достаточная степень комплементарности, чтобы избегать неспецифического связывания нуклеиновой кислоты с не являющимися мишенью последовательностями в условиях, где является желательным специфическое связывание, например, в строгих условиях гибридизации.

В некоторых случаях «гомологичный» можно использовать для обозначения взаимосвязи первого гена и второго гена из-за происхождения от общей предковой последовательности ДНК. В таких случаях термин «гомолог» указывает на взаимосвязь между генами, разобщенными процессом видообразования (см. ортолог) или на взаимосвязь между генами, разобщенными событием генетической дупликации (см. паралог). В других случаях «гомологичный» можно использовать для обозначения уровня идентичности последовательностей между одной или несколькими полинуклеотидными последовательностями, в таких случаях одна или несколько полинуклеотидных последовательностей не обязательно происходят из общей предковой последовательности ДНК. Специалистам в данной области известно о взаимозаменяемом применении термина «гомологичный» и понятно, как надлежит использовать этот термин.

Как применяют в настоящем документе, термин «ортолог» (или «ортологичный») относится к гену в двух или более видах, который эволюционировал из общей предковой нуклеотидной последовательности и может сохранять одну и ту же функцию в двух или более видах.

Как применяют в настоящем документе, термин «паралогичный» относится к генам, которые являются родственными посредством дупликации в геноме. Ортологи сохранят одну и ту же функцию в ходе эволюции, в то время как у паралогов развиваются новые функции, даже если эти новые функции не связаны с исходной функцией гена.

Как применяют в настоящем документе, две последовательности нуклеиновых кислот называют обладающими «полной комплементарностью», когда каждый нуклеотид последовательности, читаемой в направлении от 5' к 3', является комплементарным каждому нуклеотиду другой последовательности, читаемой в направлении от 3' к 5'. Нуклеотидная последовательность, комплементарная эталонной нуклеотидной последовательности, обладает последовательностью, идентичной обратной комплементарной последовательности для эталонной нуклеотидной последовательности. Эти термины и описания хорошо определены в данной области и понятны специалистам в данной области.

Специалистам в данной области хорошо известно, что при определении процентной идентичности последовательностей между аминокислотными последовательностями идентичность аминокислот в данном положении, обеспечиваемая выравниванием, может отличаться без влияния на желательные свойства полипептидов, содержащих выровненные последовательности. В этих случаях в процентную идентичность последовательностей можно вносить поправку для учета сходства между консервативно замененными аминокислотами. Эти поправки являются хорошо известными и общепринятыми для специалистов в данной области. См., например, Myers and Miller (1988), Computer Applications in Biosciences 4:11-7. Статистические способы известны в данной области, и их можно использовать для анализа 5286 идентифицированных оптимальных геномных локусов.

В качестве одного из вариантов осуществления, идентифицированные оптимальные геномные локусы, содержащие 5286 индивидуальных оптимальных последовательностей геномных локусов, можно анализировать с использованием критерия F-распределения. В теории вероятности и статистике F-распределение представляет собой непрерывное распределение вероятности. Критерий F-распределения представляет собой критерий статистической значимости, который имеет F-распределение и используется при сравнении статистических моделей, приведенных в соответствие с набором данных, для идентификации модели наилучшего соответствия. F-распределение является непрерывным распределением вероятности и также известно как F-распределение Снедекора или распределение Фишера-Снедекора. F-распределение часто предстает как нулевое распределение статистики критерия, особенно в дисперсионном анализе. F-распределение представляет собой скошенное вправо распределение. F-распределение является асимметричным распределением, которое обладает минимальным значением 0, но не имеет максимального значения. Кривая достигает пика недалеко от 0 справа, а затем постепенно приближается к горизонтальной оси по мере увеличения значения F. F-распределение приближается к горизонтальной оси, но никогда действительно не достигает ее. Следует понимать, что в других вариантах осуществления, специалист в данной области может выводить и использовать варианты этого уравнения или действительно отличающиеся уравнения, и они являются применимыми для анализа 5286 индивидуальных последовательностей оптимальных геномных локусов.

Функционально связанный: первая нуклеотидная последовательность является «функционально связанной» с второй нуклеотидной последовательностью, когда первая нуклеотидная последовательность находится в функциональной взаимосвязи с второй нуклеотидной последовательностью. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. В случае рекомбинантной продукции функционально связанные нуклеотидные последовательности, как правило, являются соседними и, когда необходимо соединить две кодирующие белок области, находятся в одной и той же рамке считывания. Однако нуклеотидные последовательности не должны являться соседними, чтобы являться функционально связанными.

Термин «функционально связанный», при использовании в отношении регуляторной последовательности и кодирующей последовательности, означает, что регуляторная последовательность влияет на экспрессию связанной с ней кодирующей последовательности. «Регуляторные последовательности», «регуляторные элементы» или «контрольные элементы» относятся к нуклеотидным последовательностям, влияющим на время и уровень/величину транскрипции, процессинга или стабильности РНК, или трансляции ассоциированной с ними кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности могут включать промоторы; лидерные последовательности трансляции; интроны; энхансеры; структуры стебель-петля; связывающие репрессор последовательности; последовательности терминации; узнающие полиаденилирование последовательности и т.д. Конкретные регуляторные последовательности могут быть расположены выше и/или ниже кодирующей последовательности, функционально связанной с ними. Также, конкретные регуляторные последовательности, функционально связанные с кодирующей последовательностью, могут быть расположены на ассоциированной с ними комплементарной цепи двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты.

При использовании в отношении двух или более аминокислотных последовательностей, термин «функционально связанный» означает, что первая аминокислотная последовательность находится в функциональной взаимосвязи по меньшей мере с одной из дополнительных аминокислотных последовательностей.

Описанные способы и композиции включают слитые белки, содержащие домен расщепления, функционально связанный с ДНК-связывающим доменом (например, ZFP), где ДНК-связывающий домен посредством связывания с последовательностью в оптимальном геномном локусе однодольного растения или маиса, направляет активность домена расщепления в участок вблизи этой последовательности и, таким образом, индуцирует двухцепочечный разрыв в оптимальном геномном локусе. Как указано в другом месте этого описания, домен цинковых пальцев можно конструировать для связывания практически с любой желательной последовательностью. Соответственно, один или несколько ДНК-связывающих доменов можно конструировать для связывания с одной или несколькими последовательностями в оптимальном геномном локусе. Экспрессия слитого белка, содержащего ДНК-связывающий домен и домен расщепления, в клетке влияет на расщепление в участке-мишени или вблизи участка-мишени.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Нацеливание трансгенов и пакетов трансгенов в конкретные положения в геноме однодольных растений, таких как растение Zea mays, может улучшить качество трансгенных событий, снизить стоимость, ассоциированную с осуществлением трансгенных событий, и предоставить новые способы получения трансгенных растительных продуктов, таких как последовательное пакетирование генов. В целом, нацеливание трансгсенов в конкретные участки генома, вероятно, будет коммерчески выгодным. За последние несколько лет достигнуты значительные результаты в отношении разработки сайт-специфических нуклеаз, таких как ZFN, CRISPR и TALEN, которые могут способствовать встраиванию донорных полинуклеотидов в заранее выбранные участки в растительных и других геномах. Однако значительно меньше известно о признаках геномных участков, которые пригодны для нацеливания. Исторически в качестве локусов для нацеливания используют не являющиеся необходимыми гены и участки интграции (вирусных) патогенов в геномах. Количество таких участков в геномах является довольно ограниченным и, таким образом, существует необходимость в идентификации и характеризации оптимальных геномных локусов, которые можно использовать для нацеливания донорных полинуклеотидных последовательностей. Ожидают, что в дополнение к возможности нацеливания, оптимальные геномные локусы будут представлять собой нейтральные участки, которые могут способствовать экспрессии трансгена и применению в разведении.

Заявители осознали, что являются желательными дополнительные критерии для участков вставки и объединили эти критерии для идентификации и выбора оптимальных участков в геноме однодольных растений, таком как геном маиса, для вставки экзогенных последовательностей. Для целей нацеливания выбранный участок для вставки должен быть уникальным и находящимся в не повторяющейся области генома однодольного растения, такого как геном Zea mays. Подобным образом, оптимальный геномный участок для встраивания должен обладать минимальными нежелательными фенотипическими эффектами и должен поддаваться событиям рекомбинации для облегчения интрогрессии в агрономические элитные линии с использованием традиционных способов разведения. Для идентификации геномных локусов, удовлетворяющих перечисленным критериям, геном однодольного растения, такой как геном Zea mays, сканировали с использованием специализированного биоинформатического способа и наборов данных геномного масштаба для идентификации новых геномных локусов, обладающих характеристиками, которые являются благоприятными для интеграции донорной полинуклеотидной последовательности и последующей экспрессии вставленной кодирующей последовательности.

I. Идентификация внегенных геномных локусов маиса

В соответствии с одним вариантом осуществления представлен способ идентификации оптимальной внегенной геномной последовательности маиса для вставки экзогенных последовательностей. Способ включает стадии первоначальной идентификации геномных последовательностей однодольных растений из маиса длиной по меньшей мере 1 т.п.о., которые являются гипометилированными. В одном варианте осуществления гипометилированная геномная последовательность имеет длину 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 т.п.о. В одном варианте осуществления гипометилированная геномная последовательность имеет длину от приблизительно 1 до приблизительно 4 т.п.о. и в следующем варианте осуществления имеет длину приблизительно 2 т.п.о. Последовательность считают гипометилированной, если она обладает метилированием ДНК в пределах последовательности менее 1%. В одном варианте осуществления статус метилирования определяю на основании присутствия 5-метилцитозина в одном или нескольких CpG-динуклеотидов, CHG- или CHH-тринуклеотидов в выбранной последовательности маиса относительно количества всех остатков цитозина, встречающихся в соответствующих CpG-динуклеотидах, CHG- или CHH-тринуклеотидах в нормальном контрольном образце ДНК. Метилирование CHH обозначает 5-метилцитозин с двумя последующими нуклеотидами, которые могут не являться гуанином, и метилирование CHG относится к 5-метилцитозину, предшествующему основанию аденина, тимина или цитозина с последующим гуанином. Более конкретно, в одном варианте осуществления выбранная последовательность маиса имеет менее 1, 2 или 3 метилированных нуклеотидов на 500 нуклеотидов выбранной последовательности маиса. В одном варианте осуществления выбранная последовательность маиса имеет менее одного, двух или трех остатков 5-метилцитозина в CpG-динуклеотидах на 500 нуклеотидов выбранной последовательности маиса. В одном варианте осуществления выбранная последовательность маиса имеет длину от 1 до 4 т.п.о. и содержит последовательность размером 1 т.п.о., лишенную остатков 5-метилцитозина. В одном варианте осуществления выбранная последовательность маиса имеет длину 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8 или 8,5 т.п.о. и содержит 1 или 0 метилированных нуклеотидов по всей ее длине. В одном варианте осуществления выбранная последовательность маиса имеет длину 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8 или 8,5 т.п.о. и не содержит остатков 5-метилцитозина в CpG-динуклеотидах по всей ее длине. В соответствии с одним вариантом осуществления метилирование выбранной последовательности маиса может меняться в зависимости от ткани-источника. В таких вариантах осуществление уровни метилирования, используемые для определения того, является ли последовательность гипометилированной, представляют среднее значение метилирования в последовательностях, выделенных из двух или более тканей (например, из корня и побега).

В дополнение к требованию, чтобы оптимальный геномный участок являлся гипометилированным, выбранная последовательность маиса также должна являться внегенной. Соответственно, все гипометилированные геномные последовательности подвергают дальнейшему скринингу для исключения гипометилированных последовательностей, содержащих генную область. Это включает любые открытые рамки считывания независимо от того, кодирует ли транскрипт белок. Гипометилированные геномные последовательности, которые включают генные области, включая любые поддающиеся идентификации соседние 5′- и 3′-некодирующие нуклеотидные последовательности, вовлеченные в регуляцию экспрессии открытой рамки считывания, и любые интроны, которые могут присутствовать в геномной области, исключены из оптимального внегенного геномного локуса маиса по настоящему изобретению.

Оптимальные внегенные геномные локусы маиса также должны представлять собой последовательности, демонстрирующие признаки рекомбинации. В одном варианте осуществления выбранная последовательность маиса должна представлять собой последовательность, в которой детектировано по меньшей мере одно событие рекомбинации между двумя маркерами, фланкирующими выбранную последовательность маиса, как детектировано с использованием высокоразрешающего набора данных маркеров, полученных для множества картированных популяций. В одном варианте осуществления пару маркеров, фланкирующих геномную последовательность однодольных растений из маиса размером 0,5, 1, 1,5 млн.п.о., содержащую выбранную последовательность маиса, используют для расчета частоты рекомбинации для выбранной последовательности маиса. Частоты рекомбинации между каждой парой маркеров (измеряемые в сантиморганах (cM)) для геномного физического расстояния между маркерами (в млн.п.о.)) должны превышать 0 cM/млн.п.о. В одном варианте осуществления частота рекомбинации для геномной последовательности однодольных растений размером 1 млн.п.о., такой как геномная последовательность маиса, содержащая выбранную последовательность маиса, лежит в диапазоне от приблизительно 0,00041 до приблизительно 4,0. В одном варианте осуществления частота рекомбинации для геномной последовательности однодольных растений размером 1 млн.п.о. из маиса, содержащая выбранную последовательность маиса, лежит в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,0. В одном варианте осуществления оптимальные геномные локусы представляют собой локусы, где в выбранной последовательности маиса детектированы события рекомбинации.

Оптимальные внегенные геномные локусы маиса также являются поддающейся нацеливанию последовательностью, т.е. последовательностью, которая относительно уникальна в геноме однодольного растения маиса, так что ген, нацеленный на выбранную последовательность маиса, будет встраиваться только в одно положение в геноме однодольного растения маиса. В одном варианте осуществления вся длина оптимальной геномной последовательности разделяет менее 30%, 35% или 40% идентичности последовательности с другой последовательностью сходной длины, содержащейся в геноме однодольного растения маиса. Соответственно, в одном варианте осуществления выбранная последовательность маиса не может содержать последовательность размером 1 т.п.о., разделяющую более 25%, 30%, 35% или 40% идентичности последовательности с другой последовательностью размером 1 т.п.о., содержащейся в геноме однодольного растения маиса. В следующем варианте осуществления выбранная последовательность маиса не может содержать последовательность размером 500 п.о., разделяющую более 30%, 35% или 40% идентичностью последовательности с другой последовательностью размером 500 п.о., содержащейся в геноме однодольного растения маиса. В одном варианте осуществления выбранная последовательность маиса не может содержать последовательность размером 1 т.п.о., разделяющую более 40% идентичности последовательности с другой последовательностью размером 1 т.п.о., содержащейся в геноме однодольного растения, такого как маис.

Оптимальные внегенные геномные локусы маиса также находятся вблизи генной области. Более конкретно, выбранная последовательность маиса должна быть расположена вблизи генной области (например, генная область должна быть расположена в пределах 40 т.п.о. от геномной последовательности, фланкирующей и соседней с любым из концов выбранной последовательности маиса, как обнаружено в нативном геноме). В одном варианте осуществления генная область расположена в пределах 10, 20, 30 или 40 т.п.о. соседней геномной последовательности, расположенной с любой стороны от выбранной последовательности маиса, как обнаружено в нативном геноме однодольного растения маиса. В одном варианте осуществления две или более генных области расположены в пределах 10, 20, 30 или 40 т.п.о. соседней геномной последовательности, фланкирующей два конца выбранной последовательности маиса. В одном варианте осуществления 1-9 генных областей расположены в пределах 10, 20, 30 или 40 т.п.о. соседней геномной последовательности, фланкирующей два конца выбранной последовательности маиса. В одном варианте осуществления две или более генных области расположены в пределах 20, 30 или 40 т.п.о. геномной последовательности, содержащей выбранную последовательность маиса. В одном варианте осуществления 1-9 генных областей расположены в пределах 40 т.п.о. геномной последовательности, содержащей выбранную последовательность маиса. В одном варианте осуществления генная область, расположенная в пределах 10, 20, 30 или 40 т.п.о. соседней геномной последовательности, фланкирующей выбранную последовательность маиса, содержит известный ген генома однодольного растения, такого как растение маиса.

В соответствии с одним вариантом осуществления представлены модифицированные внегенные геномные локусы маиса, где локусы имеют длину по меньшей мере 1 т.п.о., являются внегенными, не содержат метилированных остатков цитозина, обладают частотой рекомбинации более 0,00041 cM/млн.п.о. на протяжении геномной области размером 1 млн.п.о., охватывающей геномные локусы однодольных растений, такие как геномные локусы маиса, и последовательность размером 1 т.п.о. геномных локусов однодольных растений разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью размером 1 т.п.о., содержащейся в геноме однодольного растения, где внегенные геномные локусы однодольных растений модифицированы посредством вставки представляющей интерес ДНК в внегенные геномные локусы однодольных растений, например, внегенные геномные локусы маиса.

В соответствии с одним из вариантов осуществления представлен способ идентификации оптимальных внегенных геномных локусов однодольных растений, включая, внегенные геномные локусы маиса. В некоторых вариантах осуществления способ включает первоначальный скрининг генома однодольного растения маиса для получения первого пула выбранных последовательностей маиса, которые имеют минимальную длину 1 т.п.о. и являются гипометилированными, необязательно где геномная последовательность обладает менее 1% метилирования или где геномная последовательность лишена каких-либо метилированных остатков цитозина. Этот первый пул выбранных последовательностей маиса можно подвергать дальнейшему скринингу для исключения локусов, не удовлетворяющих требованиям для оптимальных внегенных геномных локусов маиса. Геномные последовательности однодольных растений, например, геномные последовательности маиса, которые кодируют транскрипты, разделяют более 40% или выше идентичности последовательности с другой последовательностью сходной длины, не демонстрируют признаков рекомбинации и не обладают известной открытой рамкой считывания в пределах 40 т.п.о. от выбранной последовательности маиса, исключают из первого пула последовательностей, оставляя второй пул последовательностей, которые определяют как оптимальные внегенные локусы маиса. В одном варианте осуществления любые выбранные последовательности маиса, которые не имеют известного гена маиса, или последовательности, содержащей область на 2 т.п.о. выше и/или 1 т.п.о. ниже известного гена, в пределах 40 т.п.о. от одного конца указанной внегенной последовательности, исключают из первого пула последовательностей. В одном варианте осуществления любые выбранные последовательности маиса, которые не содержат известного гена, экспрессирующего белок, в пределах 40 т.п.о. выбранной последовательности маиса, исключают. В одном варианте осуществления любые выбранные последовательности маиса, которые не обладают частотой рекомбинации выше 0,00041 cM/млн.п.о., исключают.

С использованием этих критериев отбора заявители идентифицировали выбранные оптимальные геномные локусы маиса, служащие оптимальными внегенными геномными локусами маиса, последовательности которых описаны как SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5286. Настоящее изобретение охватывает также природные варианты или модифицированные производные идентифицированных оптимальных внегенных геномных локусов маиса, где варианты или производные локусов включают последовательность, которая отличается от любой из последовательностей SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5286 на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. В одном варианте осуществления оптимальные внегенные геномные локусы маиса для применения в соответствии с настоящим описанием включают последовательности, выбранные из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5286, или последовательности, которые обладают 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5286.

В другом варианте осуществления однодольные растения для применения в соответствии с настоящим описанием включают любое растение, выбранное из группы, состоящей из растения кукурузы, растения пшеницы или растения риса. Однодольные растения, которые можно использовать, включают в качестве неограничивающих примеров, кукурузу (Zea mays), рис (Oryza sativa), рожь (Secale cereale), сорго (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), просо (например, просо жемчужное (Pennisetum glaucum), просо посевное (Panicum miliaceum), просо итальянское (Setaria italica), просо пальчатое (Eleusine coracana)), пшеницу (Triticum aestivum), сахарный тростник (Saccharum spp.), овес (Avena), ячмень (Hordeum), ананас (Ananas comosus), банан (Musa spp.), пальмы, декоративные растения и травы.

В другом варианте осуществления оптимальные внегенные геномные локусы маиса для применения в соответствии с настоящим описанием включают последовательности, выбранные из любого сорта растений маиса или кукурузы. В следующем варианте осуществления оптимальные внегенные геномные локусы маиса для применения в соответствии с настоящим описанием включают последовательности, выбранные из инбредных растений желтозерной кукурузы. Соответственно, инбредное растение желтозерной кукурузы включает инбредные растения зубовидной или кремнистой желтозерной кукурузы, включая ее агрономически элитные сорта. В следующем варианте осуществления оптимальные внегенные геномные локусы маиса для применения в соответствии с настоящим описанием включают последовательности, выбранные из поддающихся трансформации линий кукурузы. В одном варианте осуществления репрезентативные поддающиеся трансформации линии кукурузы включают: Hi-II, B73, B104, Mo 17, W22, A188, H99 и их производные. Специалисту в данной области понятно, что в результате филогенетической дивергенции различные типы линий кукурузы не содержат идентичных геномных последовательности ДНК, и что в геномных последовательностях могут присутствовать полиморфизмы или аллельные варианты. В одном варианте осуществления настоящее изобретение охватывает такой полиморфизм или аллельные варианты идентифицированных оптимальных внегенных геномных локусов маиса, где полиморфизмы или аллельные варианты содержат последовательность, которая отличается от любой из последовательностей SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 5286 на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. В следующем варианте осуществления настоящее изобретение охватывает такие полиморфизмы или аллельные варианты идентифицированных оптимальных внегенных геномных локусов маиса, где последовательности, содержащие полиморфизмы или аллельные варианты, обладают 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с любой из последовательностей SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 5286.

Идентифицированные оптимальные геномные локусы, содержащие 5286 индивидуальных последовательностей, могут быть категоризированы на различные подгруппы посредством дальнейшего анализа с использованием способа многофакторного анализа. Программы для многофакторного статистического анализа используют для выявления скрытой структуры (размерности) набора переменных. Можно использовать ряд различных типов многофакторных алгоритмов, например, набор данных можно анализировать с использованием множественного регрессионного анализа, логистического регрессионного анализа, дискриминантного анализа, многофакторного дисперсионного анализа (MANOVA), факторного анализа (включая как обычный факторный анализ, так и анализ главных компонентов), кластерного анализа, многомерного масштабирования, анализа соответствий, анализа совмещения, канонического анализа, канонической корреляции и моделирования структурными уравнениями.

В соответствии с одним вариантом осуществления оптимальные внегенные геномные локусы маиса далее анализируют с использованием многофакторного анализа данных, такого как анализ главных компонентов (PCA). В настоящем документе дано только краткое описание, больше информации можно обнаружить в H. Martens, T. Naes, Multivariate Calibration, Wiley, N.Y., 1989. PCA оценивает базовую размерность (скрытые переменные) данных и дает обзор доминирующих профилей и основных тенденций в данных. В одном варианте осуществления оптимальные внегенные геномные локусы маиса можно сортировать на кластеры с использованием статистического способа анализа главных компонентов (PCA). PCA представляет собой математический способ с использованием ортогонального преобразования для конвертирования набора наблюдений для возможно коррелированных переменных в набор значений линейно некоррелированных переменных, называемых главными компонентами. Количество главных компонентов меньше или равно количеству исходных переменных. Это преобразование определяют таким образом, что первый главной компонент имеет наибольшую возможную дисперсию (т.п. ответственен за максимальную возможную вариабельность данных), и каждый последующий компонент в свою очередь имеет наиболее высокую возможную дисперсию при условии, что он является ортогональным для предшествующих компонентов (т.е. не коррелированным с ними). Гарантировано, что главные компоненты являются независимыми, если набор данных совокупно обладает нормальным распределением. PCA является чувствительным к относительному масштабированию исходных переменных. Примеры применения PCA для кластеризации набора элементов на основе признаков элементов включают: Ciampitti, I. et al., (2012) Crop Science, 52(6); 2728-2742, Chemometrics: A Practical Guide, Kenneth R. Beebe, Randy J. Pell, и Mary Beth Seasholtz, Wiley-Interscience, 1 edition, 1998, патент США No. 8385662 и Европейский патент No. 2340975.

В соответствии с одним вариантом осуществления анализ главных компонентов (PCA) проводили для 5286 оптимальных геномных локусов маиса с использованием следующих 10 признаков для каждого идентифицированного оптимального геномного локуса маиса:

1. Длина гипометилированной области в окружении оптимальных геномных локусов (OGL) маиса

a. Полногеномные профили метилирования ДНК тканей корней и побегов получали с использованием данных параллельного секвенирования Illumina/Solexa 1G после расщепления геномной ДНК чувствительным к метилированию рестрикционным ферментом (Wang et al., (2009) Genome-Wide and Organ-Specific Landscapes of Epigenetic Modifications and Their Relationships to mRNA and Small RNA Transcriptomes in Maize. Plant Cell 21(4): 1053-1069). Картирование последовательностей в геноме показало присутствие метилирования ДНК в картированных положениях, и для отрезков хромосом без картированных последовательностей показано отсутствие метилирования (гипометилирование). Длину гипометилированной области в окружении каждого из OGL рассчитывали с использованием описанных профилей метилирования. 2. Частота рекомбинации в области 1 млн.п.о. в окружении OGL

a. Для каждого OGL идентифицировали пару маркеров с каждой стороны OGL в пределах окна размером 1 млн.п.о. Частоту рекомбинаций между каждой парой маркеров на хромосоме рассчитывали на основании отношения генетического расстояния между маркерами (в сантиморганах (cM)) к геномному физическому расстоянию между маркерами (в млн.п.о.).

3. Уровень уникальности последовательности OGL

a. Для каждого OGL нуклеотидную последовательность OGL сканировали против генома однодольного растения, например, генома Zea mays c.v. B73, с использованием поиска гомологии на основе BLAST. Поскольку эти последовательности OGL идентифицированы из генома однодольного растения, например, генома Zea mays c.v. B73 genome, первый положительный результат в BLAST, идентифицированный посредством этого поиска, представляет собой саму последовательность OGL. Идентифицировали второй положительный результат BLAST для каждого OGL, и перекрывание выравнивания для положительного результата использовали в качестве меры уникальности последовательности OGL в геноме однодольного растения, такого как Zea mays.

4. Расстояние от OGL до ближайшего соседнего гена

a. Аннотирующую информацию о генах и положение известных генов в геноме однодольных растений, например, в геноме Zea mays c.v. B73, извлекали из известной базы данных геномов однодольных растений, например, Maize Genome database (www.maizegdb.org). Для каждого OGL идентифицировали наиболее близкий аннотированный ген выше или ниже в окружении и измеряли расстояние между последовательностью OGL и геном (в п.о.).

5. GC% в окружении OGL

a. Для каждого OGL анализировали нуклеотидную последовательность для оценки количества присутствующих гуаниновых и цитозиновых оснований. Это количество представлено как процент от длины последовательности каждого OGL и является мерой GC%.

6. Количество генов в окружении OGL в пределах 40 т.п.о.

a. Аннотирующую информацию о генах и локализацию известных генов в геноме однодольных растений, например, в геноме Zea mays c.v. B73, получали из базы данных геномов однодольных растений, например, Maize Genome database (www.maizegdb.org). Для каждого OGL определяли окно размером 40 т.п.о. вокруг OGL и подсчитывали количество аннотированных генов в областях, перекрывающих это окно.

7. Средняя экспрессия генов в окружении OGL в пределах 40 т.п.о.

a. Уровень экспрессии транскриптов генов однодольных растений измеряли посредством анализа данных профилирования транскриптома, полученных для тканей корней и побегов однодольного растения, например, Zea mays c.v. B73, с использованием способа RNAseq. Для каждого OGL, идентифицировали аннотированные гены в геноме однодольного растения, например, в геноме Zea mays c.v. B73, которые присутствовали в окружении OGL в пределах 40 т.п.о. Уровни экспрессии для каждого из генов в этом окне получали из профилей транскриптома и рассчитывали средний уровень экспрессии генов.

8. Уровень занятости нуклеосомами в окружении OGL

a. Определение уровня занятости нуклеосомами для конкретной нуклеотидной последовательности обеспечивает информацию о хромосомных функциях и геномном контексте последовательности. Статистический пакет NuPoP™ обеспечивает удобный для пользователя программный инструмент для прогнозирования занятости нуклеосомами и карты наиболее вероятного расположения нуклеосом для геномных последовательностей любого размера (Xi, L., Fondufe-Mittendor, Y., Xia, L., Flatow, J., Widom, J. and Wang, J.-P., Predicting nucleosome positioning using a duration Hidden Markov Model, BMC Bioinformatics, 2010, doi:10.1186/1471-2105-11-346). Для каждого OGL, нуклеотидную последовательность вводили в программное обеспечение NuPoP™ и вычисляли показатель занятости нуклеосомами.

9. Относительное положение на хромосоме (близость к центромере)

a. Информацию о положении центромеры на каждой из хромосом однодольного растения, например, хромосом маиса, и длине плеч хромосомы извлекали из геномной базы данных однодольных растений, например, Soybean Genome Database (www.soybase.org). Для каждого OGL измеряли геномное расстояние от последовательности OGL до центромеры хромосомы, на которой он расположен (в п.о.). Относительное положение OGL в хромосоме представляют как отношение его геномного расстояния до центромеры к длине конкретного плеча хромосомы, на котором он расположен.

10. Количество OGL в области 1 млн.п.о. в окружении OGL

a. Для каждого OGL, определяют геномное окно размером 1 млн.п.о. вокруг положения OGL и подсчитывают количество OGL в наборе данных для OGL однодольных растений размером 1 т.п.о., геномное положение которых перекрывается с этим окном.

Результаты или значения для оценки признаков и свойств каждого оптимального внегенного геномного локуса маиса далее описаны в таблице 3 примера 2. Полученный набор данных использовали в статистическом методе PCA для кластеризации 5286 идентифицированных оптимальных внегенных геномных локусов маиса на кластеры. В процессе кластеризации после оценки «p» главных компонентов оптимальных геномных локусов, следовало отнесение оптимальных геномных локусов к одному из 32 кластеров в «p»-мерном евклидовом пространстве. Каждую ось «p» делили на «k» интервалов. Оптимальные геномные локусы, отнесенные к одному интервалу, группировали вместе в кластеры. С использованием этого анализа каждую ось PCA делили на два интервала, которые были выбраны на основе предшествующей информации, касающейся количества кластеров, необходимых для экспериментальной валидации. Весь анализ и визуализацию полученных кластеров проводили с использованием программного обеспечения Molecular Operating Environment™ (MOE) от Chemical Computing Group Inc. (Montreal, Quebec, Canada). Способ PCA использовали для кластеризации набора из 5286 оптимальных геномных локусов маиса в 32 отдельных кластера на основе их характерных значений, описанных выше.

В ходе процесса PCA получено пять главных компонентов (PC), причем наилучшие три PC включали приблизительно 90% от всех вариаций в наборе данных (таблица 4). Эти три PC использовали для графического представления 32 кластеров в трехмерном графике (см. фиг. 3). После завершения процесса кластеризации из каждого кластера выбирали один репрезентативный оптимальный геномный локус. Это осуществляли посредством выбора оптимального геномного локуса внутри каждого кластера, который был наиболее близким к центроиду этого кластера, с использованием вычислительных способов (таблица 4). Положения на хромосомах 32 репрезентативных геномных локусов являются равномерно распределенными на хромосомах маиса, как показано на фиг. 4.

В одном варианте осуществления представлена выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса, выбранная из любого кластера, описанного в таблице 6 из примера 2. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 2. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 3. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 4. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 5. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 6. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 7. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 8. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 9. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 10. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 11. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 12. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 13. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 14. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 15. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 16. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 17. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 18. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 19. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 20. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 21. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 22. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 23. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 24. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 25. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 26. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 27. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 28. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 29. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 30. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 31. В одном из вариантов осуществления выделенная или очищенная последовательность оптимальных внегенных геномных локусов маиса представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 32.

В соответствии с одним из вариантов осуществления представлены модифицированные оптимальные внегенные геномные локусы маиса, где оптимальные внегенные геномные локусы маиса модифицированы и содержат одну или несколько нуклеотидных замен, делеций или вставок. В одном из вариантов осуществления оптимальные внегенные геномные локусы маиса модифицированы посредством вставки представляющей интерес ДНК, необязательно, сопровождаемой дополнительными нуклеотидными дупликациями, делециями или вставками последовательностей геномных локусов.

В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из любого кластера, описанного в таблице 6 из примера 2. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 2. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 3. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 4. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 5. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 6. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 7. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 8. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 9. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 10. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 11. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 12. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 13. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 14. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 15. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 16. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 17. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 18. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 19. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 20. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 21. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 22. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 23. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 24. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 25. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 26. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 27. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 28. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 29. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 30. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 31. В одном из вариантов осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 32.

В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, или 25. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, или 24. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, или 9. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, или 6. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4 или 5. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3 или 4. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2 или 3. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1 или 2.

В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 32.

В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32.В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 32.

В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, или 32.

В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 9, 10, 11, 12, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 15, 16, 17, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 21, 22, 23, 24, 30, 31 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или 32. В дополнительном варианте осуществления оптимальный внегенный геномный локус маиса, подлежащий модификации, представляет собой геномную последовательность, выбранную из кластера 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 или 31.

В одном из вариантов осуществления оптимальные внегенные геномные локусы маиса выбраны из геномных последовательностей loci_59517_G1 (SEQ ID NO: 1), loci_159525_G1 (SEQ ID NO: 199), loci_9811_G1 (SEQ ID NO: 365), loci_7507_G1 (SEQ ID NO: 543), loci_178978_G1 (SEQ ID NO: 687), loci_285621_G1 (SEQ ID NO: 875), loci_221721_G1 (SEQ ID NO: 1089), loci_83937_G1 (SEQ ID NO: 1233), loci_37146_G1 (SEQ ID NO: 1369), loci_156393_G1 (SEQ ID NO: 1571), loci_343678_G1 (SEQ ID NO: 1795), loci_60209_G1 (SEQ ID NO: 1980), loci_282323_G1 (SEQ ID NO: 2171), loci_64542_G1 (SEQ ID NO: 2349), loci_162531_G1 (SEQ ID NO: 2557), loci_337001_G1 (SEQ ID NO: 2693), loci_66202_G1 (SEQ ID NO: 2855), loci_185454_G1 (SEQ ID NO: 3004), loci_239863_G1 (SEQ ID NO: 3151), loci_257541_G1 (SEQ ID NO: 3289), loci_217939_G1 (SEQ ID NO: 3455), loci_326869_G1 (SEQ ID NO: 3586), loci_31710_G1 (SEQ ID NO: 3731), loci_81941_G1 (SEQ ID NO: 3849), loci_198387_G1 (SEQ ID NO: 3981), loci_197372_G1 (SEQ ID NO: 4192), loci_106202_G1 (SEQ ID NO: 4401), loci_232228_G1 (SEQ ID NO: 4529), loci_244324_G1 (SEQ ID NO: 4646), loci_157315_G1 (SEQ ID NO: 4836), loci_137489_G1 (SEQ ID NO: 5046) и loci_31764_G1 (SEQ ID NO: 5162).

В одном из вариантов осуществления оптимальные внегенные геномные локусы маиса выбраны из геномных последовательностей loci_59517_G1 (SEQ ID NO: 1), loci_25001_G1 (SEQ ID NO: 100), loci_112632_G1 (SEQ ID NO: 203), loci_28905_G1 (SEQ ID NO: 295), loci_129164_G1 (SEQ ID NO: 384), loci_204726_G1 (SEQ ID NO: 424), loci_2425_G1 (SEQ ID NO: 451), loci_122036_G1 (SEQ ID NO: 547), loci_5735_G1 (SEQ ID NO: 671), loci_178978_G1 (SEQ ID NO: 687), loci_288388_G1 (SEQ ID NO: 781), loci_60310_G1 (SEQ ID NO: 843), loci_285621_G1 (SEQ ID NO: 875), loci_243330_G1 (SEQ ID NO: 967), loci_127038_G1 (SEQ ID NO: 1107), loci_262784_G1 (SEQ ID NO: 1147), loci_344662_G1 (SEQ ID NO: 1190), loci_153894_G1 (SEQ ID NO: 1252), loci_28771_G1 (SEQ ID NO: 1300), loci_1098_G1 (SEQ ID NO: 1371), loci_97772_G1 (SEQ ID NO: 1569), loci_156393_G1 (SEQ ID NO: 1571), loci_236662_G1 (SEQ ID NO: 1663), loci_139485_G1 (SEQ ID NO: 1822), loci_301175_G1 (SEQ ID NO: 1906), loci_152337_G1 (SEQ ID NO: 2003), loci_202616_G1 (SEQ ID NO: 2027), loci_203704_G1 (SEQ ID NO: 2033), loci_282323_G1 (SEQ ID NO: 2171), loci_262782_G1 (SEQ ID NO: 2256), loci_64542_G1 (SEQ ID NO: 2349), loci_236455_G1 (SEQ ID NO: 2428), loci_162531_G1 (SEQ ID NO: 2557), loci_301774_G1 (SEQ ID NO: 2632), loci_344663_G1 (SEQ ID NO: 2649), loci_337001_G1 (SEQ ID NO: 2693), loci_204637_G1 (SEQ ID NO: 2731), loci_238100_G1 (SEQ ID NO: 2753), loci_66202_G1 (SEQ ID NO: 2855), loci_264359_G1 (SEQ ID NO: 2934), loci_282653_G1 (SEQ ID NO: 3086), loci_80282_G1 (SEQ ID NO: 3139), loci_291068_G1 (SEQ ID NO: 3230), loci_56395_G1 (SEQ ID NO: 3270), loci_200497_G1 (SEQ ID NO: 3334), loci_232222_G1 (SEQ ID NO: 3357), loci_43577_G1 (SEQ ID NO: 3428), loci_5607_G1 (SEQ ID NO: 3435), loci_114664_G1 (SEQ ID NO: 3457), loci_228254_G1 (SEQ ID NO: 3497), loci_120993_G1 (SEQ ID NO: 3593), loci_53137_G1 (SEQ ID NO: 3702), loci_31710_G1 (SEQ ID NO: 3731), loci_344664_G1 (SEQ ID NO: 3815), loci_81941_G1 (SEQ ID NO: 3849), loci_321514_G1 (SEQ ID NO: 3939), loci_198387_G1 (SEQ ID NO: 3981), loci_301180_G1 (SEQ ID NO: 4113), loci_197372_G1 (SEQ ID NO: 4192), loci_348776_G1 (SEQ ID NO: 4350), loci_244439_G1 (SEQ ID NO: 4458), loci_348258_G1 (SEQ ID NO: 4487), loci_232228_G1 (SEQ ID NO: 4529), loci_322501_G1 (SEQ ID NO: 4610), loci_244324_G1 (SEQ ID NO: 4646), loci_97232_G1 (SEQ ID NO: 4832), loci_157315_G1 (SEQ ID NO: 4836), loci_282499_G1 (SEQ ID NO: 4953), loci_155031_G1 (SEQ ID NO: 5060), loci_301773_G1 (SEQ ID NO: 5110), loci_283161_G1 (SEQ ID NO:5213), loci_55524_G1 (SEQ ID NO: 5264), loci_127268_G1 (SEQ ID NO:2709), loci_136086_G1 (SEQ ID NO: 4425), loci_232484_G1 (SEQ ID NO: 2053), loci_3733_G1 (SEQ ID NO:1923), loci_168286_G1 (SEQ ID NO:571), loci_128078_G1 (SEQ ID NO:560), loci_265551_G1 (SEQ ID NO:463) и loci_137693_G1 (SEQ ID NO:387).

В одном из вариантов осуществления в оптимальные внегенные геномные локусы маиса нацеливают представляющую интерес ДНК, где представляющую интерес ДНК интегрируют внутри или вблизи участков-мишеней для нуклеаз с цинковыми пальцами. В соответствии с одним из вариантов осуществления, иллюстративные участки-мишени для цинковых пальцев из выбранных оптимальных геномных локусов маиса представлены в таблице 8. В соответствии с одним из вариантов осуществления, интеграция представляющей интерес ДНК происходит внутри или вблизи иллюстративных участков-мишеней: 111879ZFN5 и 111879ZFN7; 111885ZFN1 и 111885ZFN2; SIG115737_31v1 и SIG115737_32v1; SIG120523_11v1 и SIG120523_12v1; SIG115246_5 и SIG115246_6; SIG115636_1v1 и SIG115636_2v1; SIG120417_11v1 и SIG120417_12v1; SIG120621_15v1 и SIG120621_16v1; SIG12078_11v1 и SIG12078_12v1; и, SIG157315_1v1 и SIG157315_2v1, ZFN_ _1 и ZFN_binding_2, ZFN_binding_3 и ZFN_binding_4, ZFN_binding_5 и ZFN_binding_6, ZFN_binding_7 и ZFN_binding_8, ZFN_binding_9 и ZFN_binding_10, ZFN_binding_11 и ZFN_binding_12, ZFN_binding_13 и ZFN_binding_14, ZFN_binding_15 и ZFN_binding_16, ZFN_binding_17 и ZFN_binding_18, ZFN_binding_19 и ZFN_binding_20, ZFN_binding_21 и ZFN_binding_22, ZFN_binding_23 и ZFN_binding_24, ZFN_binding_25 и ZFN_binding_26, ZFN_binding_27 и ZFN_binding_28, ZFN_binding_29 и ZFN_binding_30, ZFN_binding_31 и ZFN_binding_32, ZFN_binding_33 и ZFN_binding_34, ZFN_binding_35 и ZFN_binding_36, ZFN_binding_37 и ZFN_binding_38, ZFN_binding_39 и ZFN_binding_40, ZFN_binding_41 и ZFN_binding_42, ZFN_binding_43 и ZFN_binding_44, ZFN_binding_45 и ZFN_binding_46, ZFN_binding_47 и ZFN_binding_48, ZFN_binding_49 и ZFN_binding_50, ZFN_binding_51 и ZFN_binding_52, ZFN_binding_53 и ZFN_binding_54, ZFN_binding_55 и ZFN_binding_56, ZFN_binding_57 и ZFN_binding_58, ZFN_binding_59 и ZFN_binding_60, ZFN_binding_61 и ZFN_binding_62, ZFN_binding_63 и ZFN_binding_64, ZFN_binding_65 и ZFN_binding_66, ZFN_binding_67 и ZFN_binding_68, ZFN_binding_69 и ZFN_binding_70, ZFN_binding_71 и ZFN_binding_72, ZFN_binding_73 и ZFN_binding_74, ZFN_binding_75 и ZFN_binding_76, ZFN_binding_77 и ZFN_binding_78, ZFN_binding_79 и ZFN_binding_80, ZFN_binding_81 и ZFN_binding_82, ZFN_binding_83 и ZFN_binding_84, ZFN_binding_85 и ZFN_binding_86, ZFN_binding_87 и ZFN_binding_88, ZFN_binding_89 и ZFN_binding_90, ZFN_binding_91 и ZFN_binding_92, ZFN_binding_93 и ZFN_binding_94, ZFN_binding_95 и ZFN_binding_96, ZFN_binding_97 и ZFN_binding_98, ZFN_binding_99 и ZFN_binding_100, ZFN_binding_101 и ZFN_binding_102, ZFN_binding_103 и ZFN_binding_104, ZFN_binding_105 и ZFN_binding_106, ZFN_binding_107 и ZFN_binding_108, ZFN_binding_109 и ZFN_binding_110, ZFN_binding_111 и ZFN_binding_112, ZFN_binding_113 и ZFN_binding_114, ZFN_binding_115 и ZFN_binding_116, ZFN_binding_117 и ZFN_binding_118, ZFN_binding_119 и ZFN_binding_120, ZFN_binding_121 и ZFN_binding_122, ZFN_binding_123 и ZFN_binding_124, ZFN_binding_125 и ZFN_binding_126, ZFN_binding_127 и ZFN_binding_128, ZFN_binding_129 и ZFN_binding_130, ZFN_binding_131 и ZFN_binding_132.

В соответствии с одним из вариантов осуществления нуклеаза с цинковыми пальцами связывается с участком-мишенью цинковых пальцев и расщепляет уникальные геномные полинуклеотидные участки-мишени маиса, при этом представляющая интерес ДНК интегрирует внутри или вблизи геномных полинуклеотидных участков-мишеней маиса. В одном варианте осуществления интеграция представляющей интерес ДНК в участок-мишень цинковых пальцев может приводить к реорганизации. В соответствии с одним из вариантов осуществления, реорганизация может включать делеции, вставки, инверсии и повторы. В одном варианте осуществления интеграция представляющей интерес ДНК происходит вблизи участка-мишени цинковых пальцев. В соответствии с одним аспектом этого варианта осуществления, интеграция ДНК происходит вблизи участка-мишени цинковых пальцев, и может происходить в пределах 1,5 т.п.о., 1,25 т.п.о., 1,0 т.п.о., 0,75 т.п.о., 0,5 т.п.о. или 0,25 т.п.о. от участка-мишени цинковых пальцев. Вставка в геномную область вблизи участка-мишени цинковых пальцев известна в данной области, см. публикацию Патента США No. 2010/0257638 A1 (полное содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки).

В соответствии с одним из вариантов осуществления выбранная внегенная последовательность обладает следующими характеристиками:

a) внегенная последовательность не имеет более 1% метилирования ДНК в последовательности;

b) внегенная последовательность обладает значением относительного расположения с соотношением геномных расстояний от центромеры хромосомы однодольных растений, например, центромеры хромосомы маиса, от 0,0984 до 0,973;

c) внегенная последовательность обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне от 34,38 до 61,2%; и

d) внегенная последовательность имеет длину от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 4,9 т.п.о.

II. Рекомбинантные производные идентифицированных оптимальных внегенных геномных локусов маиса

В соответствии с одним вариантом осуществления, после идентификации геномных локусов однодольного растения, такого как маис, в качестве в высокой степени желательного положения для вставки полинуклеотидных донорных последовательностей, одну или несколько представляющих интерес нуклеиновых кислот можно вставлять в идентифицированный геномный локус. В одном варианте осуществления представляющая интерес нуклеиновая кислота содержит экзогенные последовательности генов или другие желательные полинуклеотидные донорные последовательности. В другом варианте осуществления после идентификации геномных локусов однодольного растения, такого как маис, в качестве в высокой степени желательного положения для вставки полинуклеотидных донорных последовательностей, одну или несколько представляющих интерес нуклеиновых кислот из оптимальных внегенных геномных локусов маиса необязательно можно делетировать, вырезать или удалять с последующей интеграцией представляющей интерес ДНК в идентифицированный геномный локус. В одном варианте осуществления вставка представляющей интерес нуклеиновой кислоты в оптимальные внегенные геномные локусы маиса, включает удаление, делецию или вырезание экзогенных последовательностей генов или других желательных полинуклеотидных донорных последовательностей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам и композициям для направленной интеграции в выбранный геномный локус маиса с использованием ZFN и полинуклеотидной донорной конструкции. В способах вставки представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в оптимальные внегенные геномные локусы маиса, если не указано иначе, используют общепринятые технологии молекулярной биологии, биохимии, анализа структуры хроматина, культивирования клеток, рекомбинантной ДНК и родственных областей, известных в данной области. Эти способы полностью описаны в литературе. См., например, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, и третье издание 2001 года; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987, и периодические переиздания; серию METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolfe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, третье издание, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, «Chromatin» (P. M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; и METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, «Chromatin Protocols» (P. B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Способы вставки нуклеиновых кислот в геном маиса

В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любые хорошо известные способы введения полинуклеотидных донорных последовательностей и последовательностей нуклеаз в качестве конструкции ДНК в клетки-хозяева. Они включают применение трансфекции с фосфатом кальция, способ с полибреном, слияние протопластов, способ с PEG, электропорацию, ультразвуковые способы (например, сонопорацию), способ с липосомами, микроинъекцию, способ с голой ДНК, способ с плазмидными векторами, способ с вирусными векторами, как эписомными, так и интегрирующими, и любой из других хорошо известных способов введения клонированной геномной ДНК, кДНК, синтетической ДНК или другого чужеродного генетического материала в клетку-хозяина (см., например, Sambrook et al., выше). Необходимо только, чтобы конкретный способ вставки нуклеиновой кислоты являлся способным успешно вводить по меньшей мере один ген в клетку-хозяина, способную экспрессировать выбранный белок.

Как отмечено выше, конструкции ДНК можно вводить в геном желательного вида растения различными общепринятыми способами. Обзор таких способов см., например, в Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463; и Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9. Конструкцию ДНК можно вносить напрямую в геномную ДНК клетки растения с использованием таких способов, как электропорация и микроинъекция протопластов клеток растений, посредством встряхивания с волокнами из карбида кремния (см., например, Патенты США 5302523 и 5464765), или конструкции ДНК можно вводить напрямую в ткань растения с использованием биолистических способов, таких как бомбардировка частицами с ДНК (см., например, Klein et al. (1987) Nature 327:70-73). Альтернативно, конструкцию ДНК можно вводить в клетку растений посредством трансформации наночастицами (см., например, публикацию Патента США No. 20090104700, полное содержание которой включена в настоящее описание в качестве ссылки). Альтернативно, конструкции ДНК можно комбинировать с подходящими пограничными/фланкирующими областями T-ДНК и вставлять в общепринятый вектор-хозяин Agrobacterium tumefaciens. Способы опосредуемой Agrobacterium tumefaciens трансформации, включая обезоруживание и применение бинарных векторов, подробно описаны в научной литературе. См., например Horsch et al. (1984) Science 233:496-498, и Fraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803.

Кроме того, перенос генов можно осуществлять с использованием не относящихся к Agrobacterium бактерий, или вирусов, таких как Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, вирус X картофеля, вирус мозаики цветной капусты и вирус мозаики прожилок маниоки, и/или вирус табачной мозаики, См., например, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4. Функции вирулентности хозяина Agrobacterium tumefaciens могут направлять вставку T-цепи, содержащей конструкцию и соседний маркер, в ДНК клетки растения, когда клетка растения инфицирована бактериями с использованием бинарного вектора T-ДНК (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721) или методики совместного культивирования (Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231). Как правило, систему трансформации Agrobacterium используют для конструирования двудольных растений (Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). Систему трансформации Agrobacterium можно также использовать для трансформации, так же как для переноса ДНК в однодольные растения и клетки растений. См. патент США No. 5591616; Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; и Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434.

Альтернативные способы переноса и трансформации генов включают, но без ограничения, трансформацию протопластов посредством опосредуемого кальцием, полиэтиленгликолем (PEG) или электропорацией захвата голой ДНК (см. Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; и Shimamoto (1989) Nature 338:274-276), и посредством электропорации тканей растений (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505). Дополнительные способы трансформации клеток растений включают микроинъекцию, опосредуемый карбидом кремния захват ДНК (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418) и бомбардировку микрочастицами (см. Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; и Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618).

В одном варианте осуществления представляющая интерес нуклеиновая кислота, введенная в клетку-хозяина для направленной вставки в геном, содержит гомологичные фланкирующие последовательности на одном или обоих концах представляющей интерес нацеленной нуклеиновой кислоты. В таком варианте осуществления гомологичные фланкирующие последовательности обладают достаточными уровнями идентичности последовательности с геномной последовательностью однодольного растения, например, геномной последовательностью маиса, для поддержания гомологичной рекомбинации между ней и геномной последовательностью, гомологией с которой она обладает. Идентичность последовательностей из приблизительно 25, 50, 100, 200, 500, 750, 1000, 1500 или 2000 нуклеотидов или более, лежащая в диапазоне от 70% до 100%, между донорной и геномной последовательностями (или из любого целого числа между 10 и 200 нуклеотидами, или более) может способствовать гомологичной рекомбинации между ними.

В другом варианте осуществления представляющая интерес нацеленная нуклеиновая кислота лишена гомологичных фланкирующих последовательностей и представляющая интерес нацеленная нуклеиновая кислота разделяет от низких до очень низких уровней идентичности последовательности с геномной последовательностью.

В других вариантах осуществления направленной рекомбинации, и/или замены, и/или изменения последовательности в представляющей интерес области клеточного хроматина, хромосомную последовательность изменяют посредством гомологичной рекомбинации с экзогенной «донорной» нуклеотидной последовательностью. Такую гомологичную рекомбинацию стимулируются присутствием двухцепочечного разрыва в клеточном хроматине, если присутствуют последовательности, гомологичные области разрыва. Двухцепочечные разрывы в клеточном хроматине также могут стимулировать клеточные механизмы соединения негомологичных концов. В любых из способов, описанных в настоящем документе, первая нуклеотидная последовательность («донорная последовательность») может содержать последовательности, которые являются гомологичными, но не идентичными, геномным последовательностям в представляющей интерес области, тем самым стимулируя гомологичную рекомбинацию для вставки неидентичной последовательности в представляющую интерес область. Таким образом, в определенных вариантах осуществления участки донорной последовательности, гомологичные последовательностям в представляющей интерес области, обладают идентичностью последовательности приблизительно от 80, 85, 90, 95, 97,5 до 99% (или любого целого числа между ними) с геномной последовательностью, которую заменяют. В других вариантах осуществления гомология между донорной и геномной последовательностью превышает 99%, например, если только 1 нуклеотид отличается между донорной и геномной последовательностями из более чем 100 последовательных пар оснований.

В определенных случаях негомологичная часть донорной последовательности может содержать последовательности, не присутствующие в представляющей интерес области, так что в представляющую интерес область вносят новые последовательности. В этих случаях негомологичная последовательность, как правило, фланкирована последовательностями из 50-2000 пар оснований (или любого целого числа между ними) или любым количеством пар оснований, превышающим 2000, которые гомологичны или идентичны последовательностям в представляющей интерес области. В других вариантах осуществления донорная последовательность является негомологичной первой последовательности, и ее вставляют в геном посредством механизмов негомологичной рекомбинации.

В соответствии с одним вариантом осуществлением нуклеазу с цинковыми пальцами (ZFN) используют для внесения двухцепочечного разрыва в заданный геномный локус для облегчения вставки представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Выбор участка-мишени в выбранном геномном локусе для связывания доменом с цинковыми пальцами можно проводить, например, в соответствии со способами, описанными в Патенте США 6453242, содержание которого включено в настоящее описание, где также описаны способы конструирования белков с цинковыми пальцами (ZFP) для связывания с выбранной последовательностью. Специалистам в данной области очевидно, что для выбора участка-мишени можно использовать также простое визуальное исследование нуклеотидной последовательности. Таким образом, любые средства для выбора участка-мишени можно использовать в способах, описанных в настоящем документе.

Для ДНК-связывающих доменов ZFP участки-мишени обычно состоят из множеств соседних субучастков-мишеней. Субучасток-мишень относится к последовательности, обычно либо к нуклеотидному триплету, либо к нуклеотидному квадруплету, который может перекрываться на один нуклеотид с соседним квадруплетом, связываемым индивидуальным цинковым пальцем. См., например, WO 02/077227, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. Участок-мишень, как правило, имеет длину по меньшей мере 9 нуклеотидов и, соответственно, связывается связывающим доменом с цинковыми пальцами, содержащим по меньшей мере три цинковых пальца. Однако также является возможным связывание, например, связывающего домена с 4 пальцами с участком-мишенью из 12 нуклеотидов, связывающего домена с 5 пальцами с участком-мишенью из 15 нуклеотидов, или связывающего домена с 6 пальцами с участком-мишенью из 18-нуклеотидов. Очевидно, что настоящее описание предусматривает также связывание более крупных связывающих доменов (например, с 7, 8, 9 пальцами и более) с более длинными участками-мишенями.

В соответствии с одним вариантом осуществления, участок-мишень не обязательно представляет собой участок из множества тройных нуклеотидов. В случаях, когда происходят перекрестные взаимодействия цепей (см., например, патент США 6453242 и WO 02/077227), один или несколько индивидуальных цинковых пальцев связывающего домена с множеством цинковых пальцев могут связываться с перекрывающимися квадруплетными субучастками. В результате белок с тремя цинковыми пальцами может связывать последовательность из 10 нуклеотидов, где десятый нуклеотид является частью квадруплета, связываемого концевым пальцем, белок с четырьмя пальцами может связывать последовательность из 13 нуклеотидов, где тринадцатый нуклеотид является частью квадруплета, связываемого концевым пальцем, и т.д.

Длина и характер аминокислотных линкерных последовательностей между индивидуальными цинковыми пальцами в связывающем домене с множеством пальцев также влияют на связывание с последовательностью-мишенью. Например, присутствие так называемого «неканонического линкера», «длинного линкера» или «структурированного линкера» между соседними цинковыми пальцами в связывающем домене с множеством пальцев может позволить этим пальцам связывать субучастки, которые не являются непосредственно соседними. Неограничивающие примеры таких линкеров описаны, например, в патентах США No. 6479626 и WO 01/53480. Соответственно, один или несколько субучастков в участке-мишени связывающего домена с цинковыми пальцами могут быть отделены друг от друга 1, 2, 3, 4, 5 или более нуклеотидами. Одним из неограничивающих примеров является связывающий домен с четырьмя пальцами, который связывается с участком-мишенью из 13 нуклеотидов, содержащим, последовательно, два соседних субучастка из 3-нуклеотидов, промежуточный нуклеотид и два соседних триплетных субучастка.

В то время как ДНК-связывающие полипептиды, идентифицированные в белках, существующих в природе, как правило, связываются с определенной нуклеотидной последовательностью или мотивом (например, консенсусной последовательностью узнавания), в данной области существуют и известны способы модификации многих таких ДНК-связывающих полипептидов так, чтобы они узнавали отличающуюся нуклеотидную последовательность или мотив. ДНК-связывающие полипептиды включают, в качестве неограничивающих примеров: ДНК-связывающие домены с цинковыми пальцами; лейциновые молнии; ДНК-связывающие домены UPA; GAL4; TAL; LexA; репрессор Tet; LacR и рецептор стероидных гормонов.

В некоторых примерах ДНК-связывающий полипептид представляет собой цинковый палец. Индивидуальные мотивы цинковых пальцев можно разрабатывать для нацеливания и специфического связывания с любым из большого диапазона участков ДНК. Канонические полипептиды с цинковыми пальцами Cys₂His₂ (а также неканонические Cys₃His) связывают ДНК путем вставки α-спирали в большую бороздку двойной спирали ДНК-мишени. Узнавание ДНК цинковым пальцем является модульным; каждый палец контактирует в основном с тремя последовательно расположенными парами оснований в мишени, и узнавание опосредуют несколько ключевых остатков в полипептиде. Посредством включения нескольких ДНК-связывающих доменов с цинковыми пальцами в нацеливающую эндонуклеазу, специфичность связывания ДНК у нацеливающей эндонуклеазы можно дополнительно увеличивать (и, таким образом, также можно увеличивать специфичность любых сообщаемых ею эффектов регуляции генов). См., например, Urnov et al. (2005) Nature 435:646-51. Таким образом, один или несколько ДНК-связывающих полипептидов с цинковыми пальцами можно конструировать и использовать таким образом, чтобы нацеливающая эндонуклеаза, введенная в клетку-хозяина, взаимодействовала с последовательностью ДНК, которая является уникальной в геноме клетки-хозяина. Предпочтительно, белок с цинковыми пальцами не является встречающимся в природе, а является сконструированным для связывания выбранного участка-мишени. См., например, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Патенты США No. 6453242; 6534261; 6599692; 6503717; 6689558; 7030215; 6794136; 7067317; 7262054; 7070934; 7361635; 7253273; и публикации патентов США No. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061, полное содержание всех из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Сконструированный связывающий домен с цинковыми пальцами может обладать новой специфичностью связывания по сравнению со встречающимся в природе белком с цинковыми пальцами. Способы конструирования включают, но без ограничения, рациональный дизайн и различные типы отбора. Рациональный дизайн включает, например, использование баз данных, содержащих триплетные (или квадруплетные) нуклеотидные последовательности и индивидуальные аминокислотные последовательности цинковых пальцев, в которых каждая триплетная или квадруплетная нуклеотидная последовательность ассоциирована с одной или несколькими аминокислотными последовательностями цинковых пальцев, которые связывают конкретную триплетную или квадруплетную последовательность. См., например, Патенты США того же заявителя 6453242 и 6534261, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Альтернативно ДНК-связывающий домен может происходить из нуклеазы. Например, известны последовательности узнавания эндонуклеаз хоминга и мегануклеаз, таких как I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII,. См. также Патент США No. 5420032; Патент США No. 6833252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 и каталог New England Biolabs. Кроме того, специфичность связывания ДНК эндонуклеазами хоминга и мегануклеазами можно конструировать для связывания с неприродными участками-мишенями. См., например, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; публикацию патента США No. 20070117128.

В качестве другой альтернативы, ДНК-связывающий домен может происходить из белка с лейциновой молнией. Лейциновые молнии представляют собой класс белков, вовлеченных в белок-белковые взаимодействия во многих эукариотических регуляторных белках, которые являются важными факторами транскрипции, ассоциированными с экспрессией генов. Лейциновая молния относится к общему структурному мотиву, разделяемому этими факторами транскрипции среди нескольких царств, включая животных, растения, дрожжи и т.д. Лейциновая молния образована двумя полипептидами (гомодимер или гетеродимер), которые связываются с конкретными последовательностями ДНК, где остатки лейцина равномерно распределены в α-спирали, так что остатки лейцина двух полипептидов оканчиваются на одной и той же поверхности спирали. Специфичность связывания ДНК лейциновых молний можно использовать в ДНК-связывающих доменах, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления ДНК-связывающий домен представляет собой сконструированный домен из эффектора TAL, происходящего из патогена растений Xanthomonas (см., Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29(2):143-8; Boch et al, (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1 126/science.117881) и Moscou and Bogdanove, (2009) Science 29 Oct 2009 (10.1 126/science.1178817; и публикации патентов США No. 20110239315, 20110145940 и 20110301073).

Система нуклеаз CRISPR (короткие палиндромные повторы, расположенные кластерами, равномерно удаленными друг от друга)/Cas (ассоциированная с CRISPR) представляет собой недавно сконструированную систему нуклеаз на основе бактериальной системы, которую можно использовать для геномной инженерии. Оно основана на части адаптивного иммунного ответа многих бактерий и архей. Когда вирус или плазмида проникает в бактерию, фрагменты проникающей ДНК конвертируются в РНК CRISPR (crRNA) посредством «иммунного» ответа. Затем эта crRNA связывается через область частичной комплементарности с другим типом РНК, называемым tracrRNA, направляя нуклеазу Cas9 в область, гомологичную crRNA в ДНК-мишени, называемую «протоспейсером». Cas9 расщепляет ДНК с образованием тупых концов в DSB в участках, определяемых 20-нуклеотидной направляющей последовательностью, содержащейся в транскрипте crRNA. Для сайт-специфического узнавания и расщепления ДНК Cas9 требует как crRNA, так и tracrRNA. Эта система в настоящее время сконструирована так, что crRNA и tracrRNA могут быть объединены в одну молекулу («единую направляющую РНК»), и эквивалентную crRNA часть единой направляющей РНК можно конструировать так, чтобы она направляла нуклеазу Cas9 для нацеливания на любую желательную последовательность (см. Jinek et al (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2:e00471, и David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Таким образом, систему CRISPR/Cas можно конструировать для внесения двухцепочечного разрыва DSB) в желательную мишень в геноме, и на репарацию DSB можно влиять посредством использования ингибиторов репарации для обеспечения увеличения репарации с пониженной точностью.

В определенных вариантах осуществления белок Cas может представлять собой «функциональное производное» встречающегося в природе белка Cas. «Функциональное производное» полипептида с нативной последовательностью представляет собой соединение, имеющее качественное биологическое свойство, общее с полипептидом с нативной последовательностью. «Функциональные производные» включают, но без ограничения, фрагменты нативной последовательности, и производные полипептида с нативной последовательностью и его фрагменты при условии, что они обладают биологической активностью, общей с соответствующим полипептидом с нативной последовательностью. Биологическая активность, предусматриваемая в настоящем документе, представляет собой способность функционального производного гидролизовать ДНК-субстрат на фрагменты. Термин «производное» охватывает как варианты аминокислотной последовательности полипептида, его ковалентные модификации, так и слитые конструкции. Подходящие производные полипептида Cas или его фрагмента включают, но без ограничения, мутанты, слитые конструкции, ковалентные модификации белка Cas или его фрагмента. Белок Cas, который включает белок Cas или его фрагмент, так же как производные белка Cas или его фрагмента, можно получать из клетки или синтезировать химически или посредством комбинирования этих двух способов. Клетка может представлять собой клетку, которая естественным образом продуцирует белок Cas, или клетку, которая естественным образом продуцирует белок Cas и модифицирована способами инженерии для продукции эндогенного белка Cas на более высоком уровне экспрессии или для продукции белка Cas с экзогенно введенной нуклеиновой кислоты, которая кодирует Cas, который является таким же или отличается от эндогенного Cas. В некоторых случаях клетка естественным образом не продуцирует белок Cas и является генетически модифицированной для продукции белка Cas. Белок Cas функционирует в клетках млекопитающих (и предположительно в клетках растений) посредством совместной экспрессии нуклеазы Cas с направляющей РНК. Для облегчения опосредуемого Cas расщепления генома можно использовать две формы направляющих РНК, как описано в Le Cong, F., et al., (2013) Science 339(6121):819-823.

В других вариантах осуществления ДНК-связывающий домен может являться ассоциированным с доменом расщепления (нуклеазным доменом). Например, можно модифицировать эндонуклеазы хоминга по специфичности их связывания ДНК при сохранении нуклеазной функции. Кроме того, белки с цинковыми пальцами также можно сливать с доменом расщепления с образованием нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN). Часть домена расщепления в слитых белках, описанных в настоящем документе, можно получать из любой эндонуклеазы или экзонуклеазы. Иллюстративные эндонуклеазы, из которых может происходить домен расщепления, включают, но без ограничения, эндонуклеазы рестрикции и эндонуклеазы хоминга. См., например, каталог 2002-2003, New England Biolabs, Beverly, MA; и Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Известны дополнительные ферменты, расщепляющие ДНК, (например, нуклеаза S1; нуклеаза золотистой фасоли; панкреатическая ДНКаза I; нуклеаза микрококков; эндонуклеаза HO дрожжей; также см. Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Известны неограничивающие примеры эндонуклеаз хоминга и мегануклеаз, включающие I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII. Также см. Патент США No. 5420032; Патент США No. 6833252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 и каталог New England Biolabs. Один или несколько из этих ферментов (или их функциональных фрагментов) можно использовать в качестве источника доменов расщепления и полудоменов расщепления.

Рестрикционные эндонуклеазы (рестрикционные ферменты) присутствуют во многих видах и являются способными к специфическому для последовательности связыванию с ДНК (в участке узнавания), и расщеплению ДНК внутри или вблизи участка связывания. Конкретные рестрикционные ферменты (например, типа IIS) расщепляют ДНК в участках, удаленных от участка узнавания, и имеют отдельные домены связывания и расщепления. Например, фермент FokI типа IIS катализирует двухцепочечное расщепление ДНК на расстоянии 9 нуклеотидов от его участка узнавания на одной цепи и на расстоянии 13 нуклеотидов от его участка узнавания на другой цепи. См., например, Патенты США 5356802; 5436150 и 5487994; а также Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31.978-31.982. Таким образом, в одном варианте осуществления слитые белки содержат домен расщепления (или полудомен расщепления) по меньшей мере из одного рестрикционного фермента типа IIS и один или несколько связывающих доменов с цинковыми пальцами, которые могут являться или могут не являться сконструированными.

Иллюстративным рестрикционным ферментом типа IIS, домен расщепления которого является отделяемым от связывающего домена, является FokI. Этот конкретный фермент является активным в форме димера. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 10.570-10.575. Соответственно, для целей по настоящему описанию часть фермента FokI, используемую в описанных слитых белках, рассматривают как полудомен расщепления. Таким образом, для направленного двухцепочечного расщепления и/или направленной замены клеточных последовательностей с использованием слитых белков с цинковыми пальцами-fokI можно использовать два слитых белка, каждый из которых содержит полудомен расщепления FokI, чтобы восстановить каталитически активный домен расщепления. Альтернативно, можно использовать также одну полипептидную молекулу, содержащую связывающий домен с цинковыми пальцами и два полудомена расщепления FokI. Параметры направленного расщепления и направленного изменения последовательности с использованием слитых белков с цинковыми пальцами-FokI представлены в другом месте настоящего описания.

Домен расщепления или полудомен расщепления может представлять собой любую часть белка, которая сохраняет активность расщепления или которая сохраняет способность к мультимеризации (например, димеризации) для формирования функционального домена расщепления. Иллюстративные ферменты рестрикции типа IIS описаны в международной публикации WO 2007/014275, полное содержание которой включено в настоящее описание.

Для повышения специфичности расщепления можно также модифицировать домены расщепления. В конкретных вариантах осуществления используют варианты полудоменов расщепления, где эти варианты минимизируют или предотвращают гомодимеризацию полудоменов расщепления. Неограничивающие примеры таких модифицированных полудоменов расщепления подробно описаны в WO 2007/014275, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. В конкретных вариантах осуществления домен расщепления содержит сконструированный полудомен расщепления (также обозначаемый как мутант домена димеризации), который минимизирует или предотвращает гомодимеризацию. Такие варианты осуществления известны специалистам в данной области и описаны, например, в публикациях Патентов США No. 20050064474; 20060188987; 20070305346 и 20080131962, полное содержание всех из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Все аминокислотные остатки в положениях 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 и 538 FokI являются мишенями для влияния на димеризацию полудоменов расщепления FokI.

Дополнительные сконструированные полудомены расщепления FokI, которые формируют облигатные гетеродимеры, также можно использовать в ZFN, описанных в настоящем документе. Иллюстративные сконструированные полудомены расщепления Fok I, формирующие облигатные гетеродимеры, включают пару, в которой первый полудомен расщепления включает мутации аминокислотных остатков в положениях 490 и 538 Fok I, и второй полудомен расщепления включает мутации аминокислотных остатков 486 и 499. В одном варианте осуществления мутация в положении 490 заменяет Glu (E) на Lys (K); мутация в положении 538 заменяет Iso (I) на Lys (K); мутация в положении 486 заменяет Gln (Q) на Glu (E); и мутация в положении 499 заменяет Iso (I) на Lys (K). Конкретно, сконструированные полудомены расщепления, описанные в настоящем документе, получали посредством введения мутаций в положения 490 (E_→K) и 538 (I_→K) одного полудомена расщепления с получением сконструированного полудомена расщепления, обозначенного «E490K:I538K», и посредством введения мутаций в положения 486 (Q_→E) и 499 (I_→L) другого полудомена расщепления с получением сконструированного полудомена расщепления, обозначенного «Q486E:I499L». Сконструированные полудомены расщепления, описанные в настоящем документе, представляют собой облигатно гетеродимерные мутанты, в которых неправильное расщепление минимизировано или исключено. См., например, публикацию Патента США No. 2008/0131962, полное содержание которой включено в качестве ссылки для всех целей. В конкретных вариантах осуществления сконструированный полудомен расщепления содержит мутации в положениях 486, 499 и 496 (пронумерованы относительно FokI дикого типа), например, мутации, заменяющие остаток Gln (Q) дикого типа в положении 486 на остаток Glu (E), остаток Iso (I) дикого типа в положении 499 на остаток Leu (L) и остаток Asn (N) дикого типа в положении 496 на остаток Asp (D) или Glu (E) (также обозначены как домены «ELD» и «ELE», соответственно). В других вариантах осуществления сконструированный полудомен расщепления содержит мутации в положениях 490, 538 и 537 (пронумерованы относительно FokI дикого типа), например, мутации, заменяющие остаток Glu (E) дикого типа в положении 490 на остаток Lys (K), остаток Iso (I) дикого типа в положении 538 на остаток Lys (K), и остаток His (H) дикого типа в положении 537 на остаток Lys (K) или остаток Arg (R) (также обозначены как домены «KKK» и «KKR», соответственно). В других вариантах осуществления сконструированный полудомен расщепления содержит мутации в положениях 490 и 537 (пронумерованы относительно FokI дикого типа), например, мутации, заменяющие остаток Glu (E) дикого типа в положении 490 на остаток Lys (K) и остаток His (H) дикого типа в положении 537 на остаток Lys (K) или остаток Arg (R) (также обозначены как домены «KIK» и «KIR», соответственно). (См. публикацию патента США No. 20110201055). В других вариантах осуществления сконструированный полудомен расщепления содержит мутации «Sharkey» и/или «Sharkey'» (см. Guo et al, (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107).

Сконструированные полудомены расщепления, описанные в настоящем документе, можно получать с использованием любого подходящего способа, например, посредством сайт-направленного мутагенеза полудоменов расщепления дикого типа (Fok I), как описано в публикациях патентов США No. 20050064474; 20080131962 и 20110201055. Альтернативно, нуклеазы можно собирать in vivo в участке-мишени нуклеиновой кислоты с использованием так называемого способа «расщепленных ферментов» (см., например, Публикацию патента США No. 20090068164). Компоненты таких расщепленных ферментов либо можно экспрессировать на отдельных экспрессирующих конструкциях, либо можно соединять в одной открытой рамке считывания, где индивидуальные компоненты разделены, например, посредством последовательности саморасщепляющегося пептида 2A или IRES. Компоненты могут представлять собой индивидуальные связывающие домены с цинковыми пальцами или домены связывающего нуклеиновую кислоту домена мегануклеазы.

Можно проводить скрининг нуклеаз по активности перед использованием, например, в системе на основе хромосомы дрожжей, как описано в WO 2009/042163 и 20090068164. Конструкции для экспрессии нуклеаз можно можно легко разрабатывать с использованием способов, известных в данной области. См., например, публикации патентов США 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231 и международную публикацию WO 07/014275. Экспрессия нуклеазы может происходить под контролем конститутивного промотора или индуцируемого промотора, например, промотора галактокиназы, который является активированным (дерепрессированным) в присутствии рафинозы и/или галактозы и репрессированным в присутствии глюкозы.

Расстояние между участками-мишенями относится к количеству нуклеотидов или пар нуклеотидов, встроенных между двумя участками-мишенями при измерении от ближайших друг к другу краев последовательностей. В конкретных вариантах осуществления, в которых расщепление зависит от связывания двух слитых молекул домен с цинковыми пальцами/полудомен расщепления для разделения участков-мишеней, два участка-мишени могут находиться на противоположных цепях ДНК. В других вариантах осуществления оба участка-мишени находятся на одной цепи ДНК. Для направленного интеграции в оптимальный геномный локус одну или несколько ZFP конструируют для связывания участка-мишени внутри или вблизи предопределенного участка расщепления, и слитый белок, содержащий сконструированный ДНК-связывающий домен и домен расщепления, экспрессируют в клетке. При связывании части слитого белка, содержащей цинковые пальцы, с участком-мишенью, ДНК расщепляется доменом расщепления, предпочтительно посредством двухцепочечного разрыва, вблизи участка-мишени.

Присутствие двухцепочечного разрыва в оптимальном геномном локусе облегчает интеграцию экзогенных последовательностей посредством гомологичной рекомбинации. Таким образом, в одном варианте осуществления полинуклеотид, содержащий представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты, подлежащую вставке в намеченный геномный локус, включает одну или несколько областей гомологии в заданном геномном локусе для облегчения гомологичной рекомбинации.

В дополнение к слитым молекулам, описанным в настоящем документе, направленная замена выбранной геномной последовательности также вовлекает введение донорной последовательности. Полинуклеотидную донорную последовательность можно вводить в клетку до, во время или после экспрессии слитого белка(белков). В одном варианте осуществления донорный полинуклеотид обладает достаточной гомологией с оптимальным геномным локусом для поддержания гомологичной рекомбинации между ним и геномной последовательностью оптимального геномного локуса, с которой он имеет гомологию. Гомология последовательностей, составляющая приблизительно 25, 50, 100, 200, 500, 750, 1000, 1500, 2000 нуклеотидов или более между донорной и геномной последовательностью, или любое целое число между 10 и 2000 нуклеотидами или более, может способствовать гомологичной рекомбинации. В конкретных вариантах осуществления плечи гомологии имеют длину менее 1000 пар оснований. В других вариантах осуществления плечи гомологии имеют длину менее 750 пар оснований. В одном варианте осуществления, донорные полинуклеотидные последовательности могут содержать молекулу вектора, содержащую последовательности, которые не являются гомологичными представляющей интерес области в клеточном хроматине. Донорная полинуклеотидная молекула может содержать несколько прерывающихся областей гомологии с клеточным хроматином. Например, для направленной вставки последовательностей, в норме не присутствующих в представляющей интерес области, указанные последовательности могут присутствовать в донорной молекуле нуклеиновой кислоты и являться фланкированными областями гомологии с последовательностью в представляющей интерес области. Донорный полинуклеотид может представлять собой ДНК или РНК, может являться одноцепочечным или двухцепочечным, и его можно вводить в клетку в линейной или кольцевой форме. См., например, публикации патентов США No. 20100047805; 20110281361 и 20110207221 и заявку США No. 13/889162. При введении в линейной форме концы донорной последовательности можно защищать (например, от экзонуклеолитической деградации) способами, известными специалистам в данной области. Например, один или несколько дидезоксинуклеотидных остатков добавляют на 3'-конец линейной молекулы, и/или самокомплементарные олигонуклеотиды лигируют по одному или обоим концам. См., например, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Дополнительные способы защиты экзогенных полинуклеотидов от деградации включают, но без ограничения, добавление концевой аминогруппы(аминогрупп) и использование модифицированных межнуклеотидных связей, например, таких как фосфоротиоаты, фосфорамидаты, и остатков O-метилрибозы или дезоксирибозы.

В соответствии с одним вариантом осуществления представлен способ получения трансгенного однодольного растения, такого как трансгенное растение маиса, где представляющая интерес ДНК вставлена в оптимальный внегенный геномный локус маиса. Способ включает стадии:

a. выбора оптимального внегенного локуса маиса в качестве мишени для вставки представляющей интерес нуклеиновой кислоты;

b. введения сайт-специфической нуклеазы в клетку однодольного растения, такую как клетка растения маиса, где сайт-специфическая нуклеаза расщепляет внегенную последовательность;

c. введения представляющей интерес ДНК в клетку растения; и

d. отбора трансгенных клеток растений, содержащих представляющую интерес ДНК, нацеленную на указанную внегенную последовательность.

В соответствии с одним вариантом осуществления представлен способ получения трансгенного протопласта клетки однодольного растения, такого как трансгенный протопласт клетки маиса, где представляющая интерес ДНК вставлена в оптимальный внегенный геномный локус маиса. Способ включает стадии:

a. выбора оптимального внегенного локуса маиса в качестве мишени для вставки представляющей интерес нуклеиновой кислоты;

b. введения сайт-специфической нуклеазы в протопласт клетки маиса, где сайт-специфическая нуклеаза расщепляет внегенную последовательность;

c. введения представляющей интерес ДНК в протопласт клетки маиса; и

d. отбора трансгенного протопласта клетки маиса, содержащего представляющую интерес ДНК, нацеленную на указанную внегенную последовательность.

В одном варианте осуществления сайт-специфическая нуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы с цинковыми пальцами, нуклеазы CRISPR, нуклеазы TALEN или мегануклеазы, и, более конкретно, в одном варианте осуществления сайт-специфическая нуклеаза представляет собой нуклеазу с цинковыми пальцами. В соответствии с одним вариантом осуществления представляющую интерес ДНК интегрируют в указанную внегенную последовательность способом направляемой гомологией репарации. Альтернативно в некоторых вариантах осуществления представляющую интерес ДНК интегрируют в указанную внегенную последовательность способом соединения негомологичных концов. В дополнительных вариантах осуществления представляющую интерес ДНК интегрируют в указанную внегенную последовательность посредством не описанного ранее способа интеграции. В одном варианте осуществления способ включает выбор оптимального внегенного геномного локуса маиса для направленной вставки представляющей интерес ДНК, обладающего 2, 3, 4, 5, 6, 7, или 8 из следующих характеристик:

a. внегенная последовательность имеет длину по меньшей мере 1 т.п.о. и не обладает более 1% метилирования ДНК в последовательности

b. внегенная последовательность обладает частотой рекомбинации 0,00041-62,42 сМ/млн.п.о. в геноме однодольного растения, таком как геном маиса;

c. внегенная последовательность обладает уровнем занятости нуклеосомами 0-0,962 в геноме однодольного растения, таком как геном маиса;

d. внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью 1 т.п.о., содержащейся в геноме однодольного растения, таком как геном маиса;

e. внегенная последовательность обладает значением относительного расположения с отношением геномного расстояния от центромеры хромосомы однодольного растения, такой как центромеры хромосомы маиса, 0,00373-0,99908;

f. внегенная последовательность обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне 25,17-68,3%;

g. внегенная последовательность локализована вблизи генной последовательности; и

h. область 1 млн.п.о. геномной последовательности однодольного растения, такой как геномная последовательность маиса, содержащая указанную внегенную последовательность, содержит одну или несколько дополнительных внегенных последовательностей. В одном варианте осуществления оптимальный внегенный локус маиса выбран из локусов кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32.

Доставка

Донорные молекулы, описанные в настоящем документе, интегрируют в геном клетки посредством направленных не зависимых от гомологии и/или зависимых от гомологии способов. Для такого направленной интеграции геном расщепляют в желательном положении (или положениях) с использованием нуклеазы, например, слитой конструкции ДНК-связывающего домена (например, связывающего домена с цинковыми пальцами, эффекторного домена CRISPR или TAL, сконструированного для связывания с участком-мишенью внутри или вблизи предопределенного участка расщепления) и нуклеазного домена (например, домена расщепления или полудомена расщепления). В конкретных вариантах осуществления два слитых белка, каждый из которых содержит ДНК-связывающий домен и полудомен расщепления, экспрессируются в клетке и связываются с участками-мишенями, которые расположены рядом таким образом, что восстанавливается функциональный домен расщепления, и ДНК расщепляется вблизи участков-мишеней. В одном варианте осуществления расщепление происходит между участками-мишенями двух ДНК-связывающих доменов. Один или оба из ДНК-связывающих доменов могут являться сконструированными. Также см. Патент США No. 7888121; публикацию Патента США 20050064474 и международные публикации патентов WO05/084190, WO05/014791 и WO 03/080809.

Нуклеазы, как описано в настоящем документе, можно вводить в форме полипептидов и/или полинуклеотидов. Например, два полинуклеотида, каждый из которых содержит последовательности, кодирующие один из указанных выше полипептидов, можно вводить в клетку, и когда полипептиды экспрессируются, и каждый связывается со своей последовательностью-мишенью, расщепление происходит внутри или вблизи последовательности-мишени. Альтернативно, один полинуклеотид, содержащий последовательности, кодирующие оба слитых полипептида, вводят в клетку. Полинуклеотиды могут представлять собой ДНК, РНК, или любые модифицированные формы или аналоги ДНК и/или РНК.

После внесения двухцепочечного разрыва в представляющую интерес область, интеграцию трансгена осуществляют в представляющую интерес область направленным образом независимыми от гомологии способами (например, соединением негомологичных концов (NHEJ)) после линеаризации двухцепочечной донорной молекулы, как описано в настоящем документе. Двухцепочечный донор предпочтительно линеаризуют in vivo с помощью нуклеазы, например одной или нескольких из тех же нуклеаз, что использовали для внесения в геном двухцепочечного разрыва, или отличающихся нуклеаз. Синхронизированное расщепление хромосомы и донора в клетке может ограничивать деградацию донорной ДНК (по сравнению с линеаризацией донорной молекулы перед введением в клетку). Участки-мишени нуклеаз, используемые для линеаризации донора, предпочтительно не прерывают последовательность(последовательности) трансгсена(трансгсенов).

Трансген можно интегрировать в геном в направлении, ожидаемом для простого лигирования выступающих концов, образованных нуклеазой (обозначено как «прямая» ориентация или «AB») или в альтернативном направлении (обозначено как «обратная» ориентация или «BA»). В конкретных вариантах осуществления интеграцию трансгена осуществляют после точного лигирования выступающих концов донора и хромосомы. В других вариантах осуществления интеграция трансгена в ориентации либо BA, либо или AB, приводит к делеции нескольких нуклеотидов.

С использованием таких способов, как эти, можно осуществлять стабильную трансформацию клеток практически любого вида. В некоторых вариантах осуществления трансформирующая ДНК интегрирует в геном клетки-хозяина. В случае многоклеточного вида, трансгенные клетки можно регенерировать в трансгенный организм. Любой из этих способов можно использовать Для получения трансгенного растения, например, содержащего одну или несколько донорных полинуклеотидных последовательностей в геноме трансгенного растения.

В некоторых вариантах осуществления доставку нуклеиновых кислот в клетку растения можно осуществлять любым способом, известным специалистам в данной области, включая, в качестве неограничивающих примеров: трансформацию протопластов (см., например, патент США 5508184); опосредуемый обезвоживанием/ингибированием захват ДНК (см., например, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8); электропорацию (см., например, патент США 5384253); встряхивание с волокнами из карбида кремния (см., например, Патенты США 5302523 и 5464765); опосредуемую Agrobacterium трансформацию (см., например, Патенты США 5563055, 5591616, 5693512, 5824877, 5981840 и 6384301); ускорение покрытых ДНК частиц (см., например, Патенты США 5015580, 5550318, 5538880, 6160208, 6399861 и 6403865) и использование наночастиц, наноносителей и проникающих в клетку пептидов (WO201126644A2; WO2009046384A1; WO2008148223A1) в способах доставки ДНК, РНК, пептидов и/или белков, или комбинаций нуклеиновых кислот и пептидов в клетки растений.

Наиболее широко используемый способ введения экспрессирующего вектора в растения основан на природной системе трансформации Agrobacterium. A. tumefaciens и A. rhizogenes представляют собой патогенные для растений бактерии почвы, которые генетически трансформируют клетки растений. Плазмиды T_i и R_i A. tumefaciens и A. rhizogenes, соответственно, содержат гены, ответственные за генетическую трансформацию растений. Плазмиды T_i (индуцирующие опухоли) содержат большой фрагмент, известный как T-ДНК, переносимый в трансформированные растения. Другой фрагмент плазмиды T_i, область vir, является ответственным за перенос T-ДНК. Область T-ДНК ограничена левой и правой границами, каждая из которых состоит из концевых повторяющихся нуклеотидных последовательностей. В некоторых модифицированных бинарных векторах индуцирующие опухоль гены делетируют и функции области vir используют для переноса чужеродной ДНК, ограниченной последовательностями границ T-ДНК. T-область также может содержать, например, селективный маркер для эффективного выделения трансгенных растений и клеток, и участок множественного клонирования для вставки последовательностей для переноса такой нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый белок по изобретению.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления вектор для трансформации растений получен из плазмиды T_i A. tumefaciens (см., например, Патенты США No. 4536475, 4693977, 4886937 и 5501967; и Европейский патент EP 0 122 791) или плазмиды R_i A. rhizogenes. Дополнительные векторы для трансформации растений включают, в качестве неограничивающих примеров, векторы, описанные в Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983), выше; Klee et al. (1985) Bio Technol. 3: 637-42; и в Европейском патенте EP 0 120 516, и векторы, полученные из любого из вышеописанных. Другие бактерии, такие как Sinorhizobium, Rhizobium и Mesorhizobium, которые в природе взаимодействуют с растениями, можно модифицировать, чтобы опосредовать перенос генов в ряд разнообразных растений. Эти ассоциированные с растениями симбиотические бактерии можно делать компетентными для переноса генов путем введения как обезоруженной плазмиды T_i, так и подходящего бинарного вектора.

Представляющая интерес нуклеиновая кислота

Полинуклеотидные донорные последовательности для направленной вставки в геномный локус однодольного растения, такого как растение маиса, как правило, имеют длину в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 5000 нуклеотидов. Однако можно использовать существенно более длинные нуклеотиды, вплоть до 20000 нуклеотидов, включая последовательности длиной приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12 т.п.о. Кроме того, донорные последовательности могут содержать векторную молекулу, содержащую последовательности, которые не являются гомологичными заменяемой области. В одном варианте осуществления представляющая интерес нуклеиновая кислота включает одну или несколько областей, разделяющих гомологию с геномными локусами-мишенями. Как правило, гомологичная область(области) представляющей интерес нуклеиновой кислоты обладают по меньшей мере 50% идентичностью последовательности с геномной последовательностью, с которой желательна рекомбинация. В определенных вариантах осуществления гомологичная область(области) представляющей интерес нуклеиновой кислоты обладает 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 99,9% идентичностью последовательности с последовательностями, локализованными в геномном локусе-мишени. Однако может присутствовать любое значение идентичности последовательностей от 1% до 100%, в зависимости от длины представляющей интерес нуклеиновой кислоты.

Представляющая интерес нуклеиновая кислота может содержать несколько прерывающихся областей последовательности, разделяющих относительно высокую идентичность последовательности с клеточным хроматином. Например, для направленного встраивания последовательностей, обычно не присутствующих в геномном локусе-мишени, в донорной молекуле могут присутствовать уникальные последовательности, и они могут быть фланкированы областями последовательностей, разделяющими относительно высокую идентичность последовательности с последовательностью, присутствующей в геномном локусе-мишени.

Представляющую интерес нуклеиновую кислоту также можно вставлять в геномный локус-мишень, чтобы она служила резервуаром для последующего применения. Например, первую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности, гомологичные внегенной области генома однодольного растения, такого как растение маиса, но содержащую представляющую интерес нуклеиновую кислоту (необязательно, кодирующую ZFN под контролем индуцируемого промотора), можно вставлять в геномный локус-мишень. Затем в клетку вводят вторую последовательность нуклеиновой кислоты для индукции встраивания представляющей интерес ДНК в оптимальный внегенный геномный локус однодольного растения, такого как растение маиса. Либо первая последовательность нуклеиновой кислоты содержит ZFN, специфичную к оптимальному внегенному геномному локусу маиса, а вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит представляющую интерес последовательность ДНК, либо наоборот. В одном варианте осуществления ZFN расщепляет как оптимальный внегенный геномный локус маиса, так и представляющую интерес нуклеиновую кислоту. Затем полученный двухцепочечный разрыв в геноме может стать участком интеграции для представляющей интерес нуклеиновой кислоты, высвободившейся из оптимального геномного локуса. Альтернативно экспрессию ZFN, уже локализованной в геноме, можно индуцировать после введения представляющей интерес ДНК для индукции двухцепочечного разрыва в геноме, который затем может стать участком интеграции для введенной представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Таким образом, эффективность направленной интеграции представляющей интерес ДНК в любую представляющую интерес область можно улучшать, поскольку способ не основан на одновременном захвате обеих нуклеиновых кислот, кодирующих ZFN и представляющую интерес ДНК.

Представляющую интерес нуклеиновую кислоту можно также вставлять в оптимальный внегенный геномный локус маиса, чтобы она служила в качестве участка-мишени для последующих вставок. Например, в локус можно вставлять представляющую интерес нуклеиновую кислоту, содержащую последовательности ДНК, которые содержат участки узнавания для дополнительных конструкций ZFN. Затем можно получать дополнительные конструкции ZFN и экспрессировать их в клетках, так чтобы расщеплялась представляющую интерес исходную нуклеиновую кислоту и модифицировать посредством репарации или гомологичной рекомбинации. Таким образом, может происходить многократное встраивание представляющей интерес нуклеиновой кислоты в оптимальный внегенный геномный локус однодольного растения, такого как растение маиса.

Иллюстративные экзогенные последовательности, которые можно вставлять в оптимальный внегенный геномный локус маиса, включают, но без ограничения, любую кодирующую полипептид последовательность (например, кДНК), промотор, энхансер и другие регуляторные последовательности (например, последовательности интерферирующих РНК, кшРНК, экспрессирующие кассеты, эпитопные метки, маркерные гены, участки узнавания ферментов расщепления и различные типы экспрессирующих конструкций. Такие последовательности можно легко получать с использованием стандартных молекулярно-биологических способов (клонирование, синтез и т.д.) и/или они являются коммерчески доступными.

Для экспрессии ZFN последовательности, кодирующие слитые белки, как правило, субклонируют в экспрессирующий вектор, содержащий промотор для контроля транскрипции. Пригодные прокариотические и эукариотические промоторы хорошо известны в данной области и описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3^rd ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); и Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., выше). Бактериальные экспрессирующие системы для экспрессии ZFN доступны, например, в E. coli, Bacillus sp. и Salmonella (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)). Наборы для таких экспрессирующих систем являются коммерчески доступными. Эукариотические экспрессирующие системы для клеток млекопитающих, дрожжей и насекомых хорошо известны специалистам в данной области и также являются коммерчески доступными.

Конкретный экспрессирующий вектор, используемый для переноса генетического материала в клетку, выбирают в соответствии с предполагаемым применением слитых белков, например, экспрессией в растениях, животных, бактериях, грибах, простейших и т.д. (см. экспрессирующие векторы, описанные ниже). Стандартные экспрессирующие векторы для бактерий и животных известны в данной области и подробно описаны, например, в публикации Патента США 20050064474A1 и международных публикациях патентов WO 05/084190, WO 05/014791 и WO 03/080809.

Стандартные способы трансфекции можно использовать для получения линий клеток бактерий, растений, млекопитающих, дрожжей или насекомых, которые экспрессируют большие количества белков, которые затем можно очищать с использованием стандартных способов (см., например, Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)). Трансформацию эукариотических и прокариотических клеток проводят стандартными способами (см., например, Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds., 1983).

Описанные способы и композиции можно использовать для вставки полинуклеотидных донорных последовательностей в заданное положение, такое как один из оптимальных внегенных геномных локусов маиса. Это является полезным, поскольку экспрессия введенного трансгена в геноме однодольного растения, например, в геноме маиса, принципиально зависит от участка его интеграции. Таким образом, гены, кодирующие толерантность к гербицидам, устойчивость к насекомым, питательные вещества, антибиотики или терапевтические молекулы, можно встраивать посредством направленной рекомбинации.

В одном варианте осуществления нуклеиновую кислоту вставки комбинируют или подвергают «пакетированию» с кодирующими гены последовательностями, которые обеспечивают дополнительную устойчивость или толерантность к глифосату или другому гербициду и/или обеспечивают устойчивость к выбранным насекомым или заболеваниям и/или повышение пищевой ценности, и/или улучшенные агрономические характеристики, и/или белки или другие продукты, пригодные для использования в продуктах питания, кормах, промышленности, фармацевтике или других применениях. «Пакетирование» двух или более представляющих интерес последовательностей нуклеиновых кислот в геноме растения можно проводить, например, посредством общепринятого разведения растений с использованием двух или более трансгенных событий, трансформации растения конструкцией, содержащей представляющие интерес последовательности, повторной трансформации трансгенного растения или добавления новых признаков посредством направленной интеграции путем гомологичной рекомбинации.

Такие представляющие интерес полинуклеотидные донорные последовательности включают, но без ограничения, примеры, приведенные ниже:

1. Гены или кодирующие последовательности (например иРНК), придающие устойчивость к вредителям или заболеваниям

(A) Гены устойчивости к заболеваниям растений. Защита растений часто активируется посредством специфического взаимодействия между продуктом гена устойчивости к заболеванию (R) в растении и продуктом соответствующего гена авирулентности (Avr) в патогене. Сорт растений можно трансформировать клонированным геном устойчивости для конструирования растений, которые являются устойчивыми к конкретным патогенным штаммам. Примеры таких генов включают ген Cf-9 томата для устойчивости к Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266:789), ген Pto томата, кодирующий протеинкиназу, для устойчивости к Pseudomonas syringae pv. tomato (Martin et al., 1993 Science 262:1432), и ген RSSP2 Arabidopsis для устойчивости к Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089).

(B) Белок Bacillus thuringiensis, его производное или синтетический полипептид, смоделированный на его основе, такой как нуклеотидная последовательность гена δ-эндотоксина Bt (Geiser et al., 1986 Gene 48:109) и растительный инсектицидный ген (VIP) (см., например, Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94). Более того, молекулы ДНК, кодирующие гены δ-эндотоксина, можно закупать в American Type Culture Collection (Rockville, Md.), под номерами доступа ATCC 40098, 67136, 31995 и 31998.

(C) Лектин, такой как нуклеотидные последовательности нескольких генов связывающих маннозу лектинов Clivia miniata (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825).

(D) Связывающий витамин белок, такой как авидин и гомологи авидина, которые можно использовать в качестве ларвицидов против насекомых-вредителей. См. патент США No. 5659026.

(E) Ингибитор фермента, например, ингибитор протеазы или ингибитор амилазы. Примеры таких генов включает ингибитор цистеиновой протеазы риса (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), ингибитор протеазы табака I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985) и ингибитор α-амилазы (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243).

(F) Специфичный к насекомым гормон или феромон, такой как экдистероид и ювенильный гормон, их вариант, миметик на их основе, или их антагонист или агонист, как например, бакуловирусная экспрессия клонированной эстеразы ювенильного гормона, инактиватора ювенильного гормона (Hammock et al., 1990 Nature 344:458).

(G) Специфичный для насекомых пептид или нейропептид, который при экспрессии нарушает физиологию находящегося под его воздействием паразита (J. Biol. Chem. 269:9). Примеры таких генов включают рецептор диуретического гормона насекомых (Regan, 1994), аллостатин, идентифицированный в Diploptera punctata (Pratt, 1989), и специфичные для насекомых паралитические нейротоксины (патент США No. 5266361).

(H) Специфичный для насекомых яд, продуцируемый в природе змеями, пчелами и т.д., такой как инсектотоксический пептид скорпиона (Pang, 1992 Gene 116:165).

(I) Фермент, ответственный за избыточное накопление монотерпенов, сесквитерпенов, стероидов, гидроксамовой кислоты, фенилпропаноидного производного или другой небелковой молекулы с инсектицидной активностью.

(J) Фермент, вовлеченный в модификацию, включая посттрансляионную модификацию, биологически активной молекулы; например, гликолитический фермент, протеолитический фермент, липолитический фермент, нуклеаза, циклаза, трансаминаза, эстераза, гидролаза, фосфатаза, киназа, фосфорилаза, полимераза, эластаза, хитиназа и глюканаза, как природные, так и синтетические. Примеры таких генов включают ген callas (опубликованная заявка PCT WO93/02197), кодирующие хитиназу последовательности (которые можно получать, например, из ATCC под номерами доступа 3999637 и 67152), хитиназу анкилостоматид табака (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691) и ген полиубиквитина ubi4-2 петрушки (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673).

(K) Молекула, стимулирующая передачу сигнала. Примеры таких молекул включают нуклеотидные последовательности для клонов кДНК кальмодулина золотистой фасоли (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) и нуклеотидную последовательность клона кДНК кальмодулина маиса (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467).

(L) Пептид с гидрофобным моментом. См. патенты США No. 5659026 и 5607914; в последнем из которых объяснены синтетические противомикробные пептиды, которые сообщают устойчивость к заболеваниям.

(M) Мембранная пермеаза, формирователь каналов или блокатор каналов, такой как аналог литического пептида цекропина-β (Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43), который сообщает трансгенным растениям табака устойчивость к Pseudomonas solanacearum.

(N) Вирусный инвазивный белок или происходящий из него комплексный токсин. Например, накопление белков оболочки вируса в трансформированных клетках растений сообщает устойчивость к вирусной инфекции и/или развитию заболевания, вызванного вирусом, из которого происходит ген белка оболочки, так же как родственными вирусами. Опосредуемую белком оболочки устойчивость сообщают трансформированным растениям против вируса мозаики люцерны, вируса мозаики огурца, вируса полосатости табака, вируса X картофеля, вируса Y картофеля, вируса гравировки табака, вируса погремковости табака и вируса табачной мозаики. См., например, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451.

(O) Специфичное для насекомых антитело или иммунотоксин, происходящий из него. Таким образом, антитело, нацеленное на критическую метаболическую функцию в кишечнике насекомого, инактивирует фермент, на который оно воздействует, вызывая гибель насекомого. Например, в Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions показана инактивация фермента трансгенного табака посредством продукции одноцепочечных фрагментов антител.

(P) Вирус-специфическое антитело. См., например, Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469, где показано, что трансгенные растения, экспрессирующие рекомбинантные гены антител, защищены от вирусной атаки.

(Q) Останавливающий развитие белок, продуцируемый в природе патогеном или паразитом. Таким образом, эндо-α-1,4-D полигалактуроназы грибов способствуют колонизации грибов и высвобождению питательных веществ растений посредством солюбилизирующей клеточную стенки растений гомо-α-1,4-D-галактуроназы (Lamb et al., 1992) Bio/Technology 10:1436. Клонирование и характеризация гена, который кодирует белок, ингибирующий эндополигалактуроназу, описаны Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367).

(R) Останавливающий развитие белок, продуцируемый в природе растением, такой как инактивирующий рибосомы ген ячменя, который обеспечивает увеличенную устойчивость к вызываемому грибами заболеванию (Longemann et al., 1992). Bio/Technology 10:3305.

(S) РНК-интерференция, при которой молекулу РНК используют для ингибирования экспрессии гена-мишени. Молекула РНК в одном примере является частично или полностью двухцепочечной, запуская ответ сайленсинга, вызывающий расщепление дцРНК на малые интерферирующие РНК, которые затем включаются в нацеливающий комплекс, разрушающий гомологичные мРНК. См., например, Fire et al., Патент США 6506559; Graham et al. Патент США 6573099.

2. Гены, сообщающие устойчивость к гербицидам

(A) Гены, кодирующие устойчивость или толерантность к гербициду, который ингибирует конус нарастания или меристему, такой как гербицид на основе имидазалинона, сульфонанилида или сульфонилмочевины. Иллюстративные гены в этой категории кодируют мутантную ацетолактатсинтазу (ALS) (Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241), известную также как фермент синтаза ацетогидроксикислот (AHAS) (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449).

(B) Один или несколько дополнительных генов, кодирующих устойчивость или толерантность к глифосату, сообщаемую мутантной синтазой EPSP и генами aroA, или метаболической инактивацией посредством таких генов, как DGT-28, 2mEPSPS, GAT (глифосатацетилтрансфераза) или GOX (глифосатоксидаза) и другие фосфоносоединения, такие как глюфосинат (гены pat, bar и dsm-2) и арилоксифеноксипропионовые кислоты и циклогександионы (гены, кодирующие ингибитор ACCазы). См., например, Патент США No. 4940835, в котором описана нуклеотидная последовательность формы EPSP, которая может сообщать устойчивость к глифосату. Молекулу ДНК, кодирующую мутантный ген aroA, можно получать под номером доступа ATCC 39256, и нуклеотидная последовательность мутантного гена описана в патенте США No. 4769061. В Европейской патентной заявке No. 0 333 033 и Патенте США No. 4975374 описаны нуклеотидные последовательности генов глутаминсинтазы, которые сообщают устойчивость к гербицидам, таким как L-фосфинотрицин. Нуклеотидная последовательность гена фосфинотрицинацетилтрансферазы представлена в Европейской заявке No. 0 242 246. В De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61 описано получение трансгенных растений, которые экспрессируют химерные гены bar, кодирующие активность фосфинотрицинацетилтрансферазы. Иллюстративными генами, сообщающими устойчивость к арилоксифеноксипропионовым кислотам и циклогександионам, таким как сетоксидим и галоксифоп, являются гены Accl-S1, Accl-S2 и Accl-S3, описанные Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.

(C) Гены, кодирующие устойчивость или толерантность к гербициду, который ингибирует фотосинтез, такому как триазин (гены psbA и gs+) и бензонитрил (ген нитрилазы). В Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169 описано применение плазмид, кодирующих мутантные гены psbA, для трансформации Chlamydomonas. Нуклеотидные последовательности для генов нитрилазы описаны в Патенте США No. 4810648, и молекулы ДНК, содержащие эти гены, доступны под номерами доступа ATCC 53435, 67441 и 67442. Клонирование и экспрессия ДНК, кодирующей глутатион-S-трансферазу, описано в Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173.

(D) Гены, кодирующие устойчивость или толерантность к гербициду, которые связываются с гидроксифенилпируватдиоксигеназами (HPPD), ферментами, катализирующими реакцию преобразования пара-гидроксифенилпирувата (HPP) в гомогентизат. Они включают гербициды, такие как изоксазолы (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Патент США No. 5424276), в частности, изоксафлутол, который является селективным гербицидом маиса, дикетонитрилы (EP496630, EP496631), в частности, 2-циано-3-циклопропил-1-(2-SO2CH3-4-CF3-фенил)пропан-1,3-дион и 2-циано-3-циклопропил-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2-фенил)пропан-1,3-дион, трикетоны (EP625505, EP625508, патент США No. 5506195), в частности, сулькотрион и пиразолинаты. Ген, который продуцирует избыток HPPD в растениях, может обеспечивать толерантность или устойчивость к таким гербицидам, включая, например, гены, описанные в патентах США No. 6268549 и 6245968, и публикации патентной заявки США No. 20030066102.

(E) Гены, которые кодируют устойчивость или толерантность к феноксиауксиновым гербицидам, таким как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D), и которые могут также сообщать устойчивость или толерантность к арилоксифеноксипропионатным (AOPP) гербицидам. Примеры таких генов включают ген зависимого от α-кетоглутарата фермента диоксигеназы (aad-1), описанный в патенте США No. 7838733.

(F) Гены, которые кодируют устойчивость или толерантность к феноксиауксиновым гербицидам, таким как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D), и которые также могут сообщать устойчивость или толерантность к пиридилоксиауксиновым гербицидам, таким как флуроксипир или триклопир. Примеры таких генов включают ген зависимого от α-кетоглутарата фермента (aad-12), описанный в WO 2007/053482 A2.

(G) Гены, кодирующие устойчивость или толерантность к дикамбе (см., например, публикацию Патента США No. 20030135879).

(H) Гены, обеспечивающие устойчивость или толерантность к гербицидам, ингибирующим протопорфириногеноксидазу (PPO) (см. Патент США No. 5767373).

(I) Гены, обеспечивающие устойчивость или толерантность к триазиновым гербицидам (таким как атразин) и производным мочевины (таким как диурон), которые связываются с коровыми белками реакционных центров фотосистемы II (PS II) (См. Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245.

3. Гены, которые сообщают полезный признак или вносят вклад в полезный признак

(A) Модифицированный метаболизм жирных кислот, например, путем трансформации маиса или Brassica антисмысловым геном или стеароил-ACP-десатуразой для увеличения содержания стеариновой кислоты в растении (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624.

(B) Сниженное содержание фитатов

(1) Введение кодирующего фитазу гена, такого как ген фитазы Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87), усиливает расщепление фитатов, увеличивая содержание свободного фосфата в трансформированном растении.

(2) Можно вводить ген, который снижает содержание фитатов. В маисе этого можно достигать, например, путем клонирования, а затем повторного введения ДНК, ассоциированной с одним аллелем, ответственным за мутанты маиса, характеризующиеся низкими уровнями фитиновой кислоты (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383).

(C) Модифицированный углеводный состав, достигаемый, например, посредством трансформации растений геном, кодирующим фермент, который изменяет характер ветвления крахмала. Примеры таких ферментов включают ген фруктозилтрансферазы Streptococcus mucus (Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810, ген левансахаразы Bacillus subtilis (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220), α-амилазы Bacillus licheniformis (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), гены инвертазы томата (Elliot et al., 1993), ген амилазы ячменя (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480) и фермент ветвления крахмала эндосперма маиса II (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450).

III. Рекомбинантные конструкции

Как описано в настоящем документе, настоящее изобретение относится к рекомбинантным геномным последовательностям, содержащим оптимальную внегенную геномную последовательность маиса размером по меньшей мере 1 т.п.о. и представляющую интерес ДНК, где вставленная представляющая интерес ДНК вставлена в указанную внегенную последовательность. В одном варианте осуществления представляющая интерес ДНК представляет собой аналитический домен, ген или кодирующую последовательность (например, иРНК), которая сообщает устойчивость к паразитам или заболеванию, гены, которые сообщают устойчивость к гербициду, или гены, которые сообщают полезный признак или вносят вклад в полезный признак, и оптимальная внегенная геномная последовательность маиса обладает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 из следующих характеристик:

a. внегенная последовательность имеет длину от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 8,3 т.п.о. и не содержит метилированный полинуклеотид;

b. внегенная последовательность обладает частотой рекомбинации от 0,00041 до 62,42 cM/млн.п.о. в геноме однодольного растения, такого как растение маиса;

c. внегенная последовательность проявляет уровень занятости нуклеосомами от 0 до 0,962 в геноме однодольного растения, такого как геном маиса;

d. внегенная последовательность обладает менее чем 40% идентичностью последовательности с любой другой последовательностью, содержащейся в геноме однодольного растения, таком как геном маиса;

e. внегенная последовательность обладает значением относительного расположения, равным отношением от 0,00373 до 0,99908, для геномного расстояния от центромеры хромосомы однодольного растения, такой как центромера хромосомы маиса;

f. внегенная последовательность обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне от 25,17 до 68,3%;

g. внегенная последовательность расположена вблизи генной последовательности, содержащей известную или прогнозируемую кодирующую последовательность однодольного растения, такую как кодирующая последовательность маиса, в пределах 40 т.п.о. непрерывной геномной ДНК, содержащей нативную внегенную последовательность; и,

h. внегенная последовательность расположена в области геномной последовательности однодольного растения размером 1 млн.п.о., такой как геномная последовательность маиса, которая содержит по меньшей мере вторую внегенную последовательность. В одном варианте осуществления оптимальная внегенная геномная последовательность маиса далее охарактеризована как имеющая генную область, содержащую от 1 до 9 известных или прогнозируемых кодирующих последовательностей однодольных растений, таких как кодирующие последовательности маиса, в пределах 40 т.п.о. непрерывной геномной ДНК, содержащей нативную внегенную последовательность. В одном варианте осуществления оптимальный внегенный локус маиса выбран из локусов кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 или 32.

IV. Трансгенные растения

Также в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения представлены трансгенные растения, содержащие рекомбинантные оптимальные внегенные локусы маиса. Такие трансгенные растения можно получать с использованием способов, известных специалистам в данной области.

Трансформированную клетку, каллюс, ткань или растение однодольного растения (такие как клетка, каллюс, ткань или растение маиса) можно идентифицировать и выделять посредством отбора или скрининга сконструированного растительного материала по признакам, кодируемым маркерными генами, присутствующими на трансформирующей ДНК. Например, отбор можно проводить посредством выращивания сконструированного растительного материала на средах, содержащих ингибирующее количество антибиотика или гербицида, к которым трансформирующая генная конструкция сообщает устойчивость. Кроме того, трансформированные клетки также можно идентифицировать посредством скрининга по активности любых генов видимых маркеров (например, гены желтого флуоресцентного белка, зеленого флуоресцентного белка, красного флуоресцентного белка, бета-глюкуронидазы, люциферазы, B или C1), которые могут присутствовать в рекомбинантных конструкциях нуклеиновых кислот. Такие способы отбора и скрининга хорошо известны специалистам в данной области.

Физические и биохимические способы также можно использовать для идентификации трансформантов растений или клеток растений, содержащих вставленные генные конструкции. Эти способы включают, но без ограничения: 1) саузерн-анализ или амплификацию ПЦР для детекции и определения структуры вставки рекомбинантной ДНК; 2) нозерн-блоттинг, защиту от РНКазы S1, удлинение праймера или амплификацию ПЦР с использованием обратной транскриптазы для обнаружения и исследования транскриптов РНК генных конструкций; 3) ферментные анализы для обнаружения активности фермента или рибозима, где такие продукты генов кодированы генной конструкцией; 4) электрофорез белков в геле, способы вестерн-блоттинга, иммунопреципитацию или твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), где продуктами генной конструкции являются белки. Дополнительные способы, такие как гибридизация in situ, окрашивание ферментом и иммунное окрашивание, также можно использовать для детекции присутствия или экспрессии рекомбинантной конструкции в конкретных органах и тканях. Способы проведения всех этих анализов хорошо известны специалистам в данной области.

Эффекты манипуляции с генами с использованием способов, описанных в настоящем документе, можно наблюдать, например, с использованием нозерн-блоттинга РНК (например, мРНК), выделенной из представляющих интерес тканей. Как правило, если мРНК присутствует или количество мРНК увеличивается, можно предположить, что соответствующий трансген экспрессируется. Можно использовать другие способы измерения активности гена и/или кодируемого полипептида. Можно использовать различные типы ферментных анализов, в зависимости от используемого субстрата и способа детекции увеличения или уменьшения количества продукта реакции или побочного продукта. Кроме того, уровни экспрессированного полипептида можно измерять иммунохимически, т.е. с использованием ELISA, RIA, EIA и других анализов на основе антител, хорошо известных специалистам в данной области, таких как анализы с электрофоретической детекцией (либо посредством окрашивания, либо можно использовать вестерн-блоттинга). В качестве одного неограничивающего примера детекция белков AAD-12 (арилоксиалканоатдиоксигеназы; см. WO 2011/066360) и PAT (фосфинотрицин-N-ацетил-трансферазы (PAT)) с использованием анализа ELISA описана в публикации Патента США No. 20090093366, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. Трансген может селективно экспрессироваться в некоторых тканях растения или на некоторых стадиях развития, или трансген может экспрессироваться по существу во всех тканях растений, по существу на протяжении всего их жизненного цикла. Однако применим также любой комбинаторный способ экспрессии.

Специалисту в данной области понятно, что после стабильного включения экзогенной полинуклеотидной донорной последовательности в трансгенные растения и подтверждения ее функциональности, ее можно вводить в другие растения посредством полового скрещивания. Можно использовать любой из ряда стандартных способов разведения, в зависимости от вида, подлежащего скрещиванию.

Настоящее изобретение также охватывает семена трансгенных растений, описанных выше, где семя обладает трансгеном или генной конструкцией. Кроме того, настоящее изобретение охватывает потомство, клоны, клеточные линии или клетки трансгенных растений, описанных выше, где указанное потомство, клон, клеточная линия или клетка обладают трансгеном или генной конструкцией.

Трансформированные клетки растений, полученные любыми из описанных выше способов трансформации, можно культивировать для регенерации целого растения, обладающего трансформированным генотипом и, таким образом, желательным фенотипом. Такие способы регенерации основаны на манипуляции определенными фитогормонами в среде для роста культуры тканей, как правило, на основе биоцидного и/или гербицидного маркера, который введен вместе с желательными нуклеотидными последовательностями. Регенерация растений из культивируемых протопластов описана в Evans, et al., «Protoplasts Isolation and Culture», Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; и Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Регенерацию также можно осуществлять из каллюса, эксплантатов, органов, пыльцы, зародышей или частей растений. Такие способы регенерации описаны в общем в Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.

Трансгенное растение или растительный материал, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, в некоторых вариантах осуществления могут обладать одной или несколькими из следующих характеристик: экспрессия полипептида в клетке растения; экспрессия части полипептида в пластиде клетки растения; импорт полипептида из цитозоля клетки растения в пластиду клетки; специфическая для пластид экспрессия полипептида в клетке растения; и/или локализация полипептида в клетке растения. Такое растение, кроме того, может обладать одним или несколькими желательными признаками, отличными от экспрессии кодируемого полипептида. Такие признаки могут включать, например: устойчивость к насекомым, другим вредителям и возбудителям заболеваний; толерантность к гербицидам; повышенную стабильность, выход и срок хранения; устойчивость к условиям окружающей среды; фармацевтическую продукцию; продукцию промышленных продуктов и повышение питательной ценности.

В соответствии с одним вариантом осуществления представлен трансгенный протопласт однодольного растения, содержащий рекомбинантный оптимальный внегенный локус однодольного растения. Более конкретно, представлен протопласт однодольного растения, содержащий представляющую интерес ДНК, вставленную в оптимальные внегенные геномные локусы протопластов однодольных растений, где указанные внегенные геномные локусы однодольных растений имеют длину от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 8,3 т.п.о. и лишены каких-либо метилированных нуклеотидов. В одном варианте осуществления трансгсенный протопласт однодольного растения содержит представляющую интерес ДНК, вставленную в оптимальный внегенный геномный локус однодольного растения, где представляющая интерес ДНК содержит аналитический домен и/или открытую рамку считывания. В одном варианте осуществления вставленная представляющая интерес ДНК кодирует пептид, и в следующем варианте осуществления представляющая интерес ДНК содержит по меньшей мере одну кассету для экспрессии гена, содержащую трансген.

В соответствии с одним вариантом осуществления представлен трансгенный протопласт маиса, содержащий рекомбинантный оптимальный внегенный локус маиса. Более конкретно, представлен протопласт маиса, содержащий представляющую интерес ДНК, вставленную в оптимальные внегенные геномные локусы протопластов однодольных растений, где указанные внегенные геномные локусы маиса имеют длину от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 8,3 т.п.о. и лишены каких-либо метилированных нуклеотидов. В одном варианте осуществления трансгсенный протопласт маиса содержит представляющую интерес ДНК, вставленную в оптимальный внегенный геномный локус маиса, где представляющая интерес ДНК содержит аналитический домен и/или открытую рамку считывания. В одном варианте осуществления вставленная представляющая интерес ДНК кодирует пептид, и в следующем варианте осуществления представляющая интерес ДНК содержит по меньшей мере одну кассету для экспрессии гена, содержащую трансген.

В соответствии с одним вариантом осуществления представлено трансгенное однодольное растение, часть однодольного растения или клетка однодольного растения, содержащие рекомбинантный оптимальный внегенный локус однодольного растения. Более конкретно, представлено однодольное растение, часть однодольного растения или клетка однодольного растения, содержащие представляющую интерес ДНК, встапвленную в оптимальные внегенные геномные локусы однодольного растения, части однодольного растения или клетки однодольного растения, где указанные внегенные геномные локусы однодольного растения имеют длину от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 8,5 т.п.о. и лишены каких-либо метилированных нуклеотидов. В одном варианте осуществления трансгенное однодольное растение, часть однодольного растения или клетка однодольного растения содержат представляющую интерес ДНК, вставленную в оптимальный внегенный геномный локус однодольного растения, где представляющая интерес ДНК содержит аналитический домен и/или открытую рамку считывания. В одном варианте осуществления встроенная представляющая интерес ДНК кодирует пептид, а в следующем варианте осуществления - трансген.

В соответствии с одним вариантом осуществления представлено трансгенное растение маиса, часть растения маиса или клетка растения маиса, содержащие рекомбинантный оптимальный внегенный локус маиса. Более конкретно, представлено растение маиса, часть растения маиса или клетка растения маиса, содержащие представляющую интерес ДНК, встапвленную в оптимальные внегенные геномные локусы маиса, части растения маиса или клетки растения маиса, где указанные внегенные геномные локусы маиса имеют длину от приблизительно 1 т.п.о. до приблизительно 8,5 т.п.о. и лишены каких-либо метилированных нуклеотидов. В одном варианте осуществления трансгенное растение маиса, часть растения маиса или клетка растения маиса содержат представляющую интерес ДНК, вставленную в оптимальный внегенный геномный локус маиса, где представляющая интерес ДНК содержит аналитический домен и/или открытую рамку считывания. В одном варианте осуществления встроенная представляющая интерес ДНК кодирует пептид, а в следующем варианте осуществления представляющая интерес ДНК содержит по меньшей мере одну кассету для экспрессии гена, содержащую трансген.

В соответствии с вариантом осуществления 1, представлена рекомбинантная последовательность, где указанная рекомбинантная последовательность содержит

внегенную геномную последовательность маиса из по меньшей мере 1 т.п.о., где указанная внегенная последовательность является гипометилированной, поддающейся нацеливанию, является локализованной вблзи генной области в геноме маиса и демонстрирует признаки рекомбинации; и

представляющую интерес ДНК, где представляющая интерес ДНК вставлена в указанную внегенную последовательность. В соответствии с вариантом осуществления 2, представлена рекомбинантная последовательность из варианта осуществления 1, где указанная внегенная последовательность обладает следующими характеристиками:

a. уровень метилирования указанной внегенной последовательности составляет 1% или менее;

b. указанная внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью, содержащейся в геноме Zea mays;

c. указанная внегенная последовательность локализована в пределах области 40 т.п.о. от известной или прогнозируемой экспрессируемой кодирующей последовательности маиса; и

d. указанная внегенная последовательность обладает частотой рекомбинации в геноме маиса более 0,00041 сМ/млн.п.о. В соответствии с вариантом осуществления 3, представлена рекомбинантная последовательность из варианта осуществления 1 или 2, где указанная внегенная последовательность обладает максимальной длиной 8,3 т.п.о. В соответствии с вариантом осуществления 4, представлена рекомбинантная последовательность из любого из вариантов осуществления 1-3, где указанная внегенная последовательность обладает 1% или менее метилирования нуклеотидов. В соответствии с вариантом осуществления 5, представлена рекомбинантная последовательность из любого из вариантов осуществления 1-4, где указанная внегенная последовательность имеет длину 1 т.п.о. - 8,3 т.п.о. и не содержит метилированных остатков цитозина. В соответствии с вариантом осуществления 6, представлена рекомбинантная последовательность из любого из вариантов осуществления 1-5, где указанная внегенная последовательность не выравнивается с более чем 40% идентичностью последовательности с любой другой последовательностью в геноме Zea mays. В соответствии с вариантом осуществления 7, представлена рекомбинантная последовательность из любого из вариантов осуществления 1-5, где указанная внегенная последовательность демонстрирует признаки рекомбинации с частотой рекомбинации более 0,00041 сМ/млн.п.о. В соответствии с вариантом осуществления 8, представлена рекомбинантная последовательность из любого из вариантов осуществления 1-5, где область 40 т.п.о. нативного генома маиса, содержащая указанную внегенную последовательность, содержит также по меньшей мере одну известную или прогнозируемую кодирующую последовательность маиса, или последовательность, содержащую 2 т.п.о. выше и/или 1 т.п.о. ниже последовательности известного гена маиса. В соответствии с вариантом осуществления 9, представлена рекомбинантная последовательность из любого из вариантов осуществления 1-8, где указанная известная или прогнозируемая кодирующая последовательность маиса экспрессирует белок маиса. В соответствии с вариантом осуществления 10, представлена рекомбинантная последовательность из любого из вариантов осуществления 1-9, где указанная внегенная последовательность не содержит метилированный полинуклеотид. В соответствии с вариантом осуществления 11, представлена рекомбинантная последовательность из любого из вариантов осуществления 1-10, где один конец указанной внегенной последовательности находится в пределах 40 т.п.о. от экспрессируемого эндогенного гена. В соответствии с вариантом осуществления 12, представлена рекомбинантная последовательность из любого из вариантов осуществления 1-11, где указанная рекомбинантная последовательность содержит представляющую интерес ДНК, содержащую аналитический домен. В одном из вариантов осуществления представляющая интерес ДНК из варианта осуществления 12 не кодирует пептид. В одном из вариантов осуществления представляющая интерес ДНК кодирует пептид, необязательно, в варианте осуществления 15, представляющая интерес ДНК содержит экспрессирующую генную кассету, содержащую ген устойчивости к инсектицидам, ген устойчивости к гербицидам, ген эффективности усвоения азота, ген эффективности усвоения воды, ген пищевой ценности, ген связывающего ДНК белка и ген селективного маркера.

В соответствии с вариантом осуществления 16, представлена рекомбинантная последовательность из варианта осуществления 1, где указанная рекомбинантная последовательность обладает следующими характеристиками:

a. указанная внегенная последовательность содержит менее 1% метилирования ДНК;

b. указанная внегенная последовательность обладает частотой рекомбинации в геноме маиса 0,00041-62,42 сМ/млн.п.о.;

c. указанная внегенная последовательность обладает уровнем занятости нуклеосомами в геноме маиса 0-0,962;

d. указанная внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью, содержащейся в геноме маиса;

e. указанная внегенная последовательность обладает значением относительного расположения с отношением геномного расстояния от центромеры хромосомы маиса 0,00373-0,99908;

f. указанная внегенная последовательность обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне 25,17-68,3%;

g. указанная внегенная последовательность локализована вблизи генной последовательности; и,

h. указанная внегенная последовательность локализована в области 1 млн.п.о. геномной последовательности маиса, содержащей одну или несколько дополнительных внегенных последовательностей. В варианте осуществления 17 представлены растение маиса, часть растения маиса или клетка растения маиса, содержащие рекомбинантную последовательность из любого из вариантов осуществления 1-16. В соответствии с вариантом осуществления 18, представлены растение маиса, часть растения маиса или клетка растения маиса из варианта осуществления 17, где указанная известная или прогнозируемая кодирующая последовательность маиса экспрессируется на уровне, лежащем в диапазоне от 0,00369 до 2233,06. В соответствии с вариантом осуществления 19, представлены растение маиса, часть растения маиса или клетка растения маиса из варианта осуществления 17 или 18 с рекомбинантной последовательностью из вариантов осуществления 1-16, где указанная представляющая интерес ДНК и/или указанная внегенная последовательность модифицированы посредством вставки указанной представляющей интерес ДНК в указанную внегенную последовательность.

В соответствии с вариантом осуществления 32, представлена рекомбинантная поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса, содержащая:

внегенную последовательность из по меньшей мере 1 т.п.о., выбранную из группы, состоящей из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или последовательности, разделяющей 99% идентичности последовательности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 и соответствующих комплементарных им последовательностей, где указанные кластеры получены по статистическому алгоритму PCA, включающему значения PCA, определенные в таблице 6; и

представляющую интерес ДНК, вставленную в указанную внегенную последовательность. В соответствии с вариантом осуществления 33 представлена поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса из варианта осуществления 32, где указанная представляющая интерес ДНК содержит аналитический домен. В соответствии с вариантом осуществления 34, представлена поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса из любого из вариантов осуществления 32 или 33, где указанная представляющая интерес ДНК кодирует пептид. В соответствии с вариантом осуществления 35, представлена поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса из любого из варианта осуществления 32-34, где указанная представляющая интерес ДНК содержит экспрессирующую генную кассету, содержащую трансген. В соответствии с вариантом осуществления 36, представлена поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса из любого из вариантов осуществления 32-35, где указанная представляющая интерес ДНК содержит сайт-специфический участок расщепления, где, необязательно, указанный сайт-специфический участок расщепления расщепляется нуклеазой, включая, например, нуклеазу с цинковыми пальцами, нуклеазу CRISPR, TALEN, эндонуклеазу хоминга или мегануклеазу. В соответствии с вариантом осуществления 39, представлена поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса из любого из вариантов осуществления 32-36, где вставка указанной представляющей интерес ДНК в указанную внегенную последовательность приводит к модификации указанной представляющей интерес ДНК и/или указанной внегенной последовательности.

В соответствии с вариантом осуществления 40, представлена очищенная внегенная геномная последовательность маиса из по меньшей мере 1 т.п.о., где указанная внегенная последовательность является гипометилированной, поддающейся нацеливанию, расположенной вблизи генной области в геноме маиса, и демонстрирующей признаки рекомбинации. В соответствии с вариантом осуществления 41, представлена очищенная последовательность из варианта осуществления 40, где указанная внегенная последовательность обладает следующими характеристиками:

a. уровень метилирования указанной внегенной последовательности составляет 1% или менее;

b. указанная внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью, содержащейся в геноме Zea mays;

c. указанная внегенная последовательность локализована в области 40 т.п.о. от известной или прогнозируемой экспрессируемой кодирующей последовательности маиса; и

d. указанная внегенная последовательность обладает частотой рекомбинации в геноме маиса более 0,00041 сМ/млн.п.о. В соответствии с вариантом осуществления 42, представлена очищенная внегенная геномная последовательность маиса из любого из вариантов осуществления 40-41, где указанная внегенная последовательность обладает максимальной длиной 8,3 т.п.о. В соответствии с вариантом осуществления 43, представлена очищенная последовательность из любого из вариантов осуществления 40-42, где указанная последовательность обладает следующими характеристиками:

a. указанная внегенная последовательность содержит менее 1% метилирования ДНК в ее нативной локализации;

b. указанная внегенная последовательность, в ее нативной локализации, обладает частотой рекомбинации в геноме маиса 0,00041-62,42 сМ/млн.п.о.;

c. указанная внегенная последовательность обладает уровнем занятости нуклеосомами в геноме маиса 0-0,962, в ее нативной локализации;

d. указанная внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью, содержащейся в геноме маиса;

e. указанная внегенная последовательность обладает значением относительного расположения с отношением геномного расстояния от центромеры хромосомы маиса 0,00373-0,99908, в ее нативной локализации;

f. указанная внегенная последовательность обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне 25,17-68,3%;

g. указанная внегенная последовательность локализована в пределах 40 т.п.о. от известной или прогнозируемой кодирующей последовательности маиса, или последовательности, содержащей область 2 т.п.о. выше и 1 т.п.о. ниже известного гена, в ее нативной локализации; и

h. указанная внегенная последовательность локализована в области 1 млн.п.о. геномной последовательности маиса, содержащей одну или несколько дополнительных внегенных последовательностей, в ее нативной локализации.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Идентификация поддающихся нацеливанию геномных локусов в Zea mays

Геном Zea mays подвергали скринингу с помощью биоинформатического подхода с использованием конкретных критериев для выбора оптимальных геномных локусов для нацеливания полинуклеотидного донора. Конкретные критерии, используемые для выбора геномных локусов, разрабатывали с учетом аспектов оптимальной экспрессии трансгена в геноме растения, аспектов оптимального связывания геномной ДНК сайт-специфическим ДНК-связывающим белком и требований по разработке трансгенного растительного продукта. Для идентификации и отбора геномных локусов базы геномных и эпигеномных данных для генома Zea mays сканировали с использованием биоинформатического способа. Скрининг баз геномных и эпигеномных данных привел к выбору локусов, удовлетворяющих следующим критериям: 1) гипометилированные и превышающие 1 т.п.о. в длину; 2) поддающиеся нацеливанию через опосредуемую сайт-специфической нуклеазой интеграцию полинуклеотидного донора; 3) агрономически нейтральные или внегенные; 4) области, с которых можно экспрессировать интегрированный трансген; и 5) области с рекомбинацией в локусе/вокруг локуса. Соответственно, с использованием этих конкретных критериев идентифицировано всего 5286 геномных локусов (SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5286). Эти конкретные критерии дополнительно подробно описаны ниже.

Гипометилирование

Геном Zea mays сканировали для выбора оптимальных геномных локусов, превышающих 1 т.п.о., обладающих гипометилированной ДНК. Уровни метилирования ДНК по всему геному тканей корней и побегов, выделенных из Zea mays c.v. B73, получали посредством биоинформатического способа с использованием данных параллельного секвенирования Illumina^™/Solexa^™ 1G. Данные получали для геномной ДНК, выделенной из вышеописанных тканей растения Zea mays согласно способу, описанному Wang et al., (2009) Genome-Wide and Organ-Specific Landscapes of Epigenetic Modifications and Their Relationships to mRNA and Small RNA Transcriptomes in Maize. Plant Cell 21(4): 1053-1069). Эти данные доступны в NCBI Genbank, номер доступа; GEO:GSE1 5286. Необработанные прочтения секвенирования собирали и картировали в эталонном геноме Zea mays c.v. B73 с использованием программного обеспечения для картирования Bismark^™, как описано в Krueger F, Andrews SR (2011) Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications (Bioinformatics 27: 1571-1572).

Уровень метилирования для каждого основания цитозина в геноме вычисляли как процент от количества метилированных считанных последовательностей, картирующих конкретное положение остатка цитозина, к общему количеству считанных последовательностей, картирующих это положение. Ниже представлено гипотетическое объяснение того, каким образом уровни метилирования рассчитывали для каждого основания в геноме Zea mays. Например, можно рассмотреть случай, когда существует цитозиновое основание в положении 100 эталонной последовательности хромосомы 1 Zea mays c.v. B73. Если существует всего 20 считанных последовательностей, картирующих остаток цитозина в положении 100, и 10 из этих считанных последовательностей являются метилированными, тогда уровень метилирования для основания цитозина в положении 100 хромосомы 1 оценивают как 50%. Соответственно, рассчитывали профиль уровня метилирования для всех пар оснований геномной ДНК, полученной из ткани корней и побегов Zea mays. Считанные последовательности, которые нельзя было правильно картировать в уникальных положениях в геноме Zea mays, соответствовали повторяющимся последовательностям, которые широко распространены в геноме Zea mays, и как известно в данной области, являются преимущественно метилированными.

С использованием вышеописанного способа измеряли уровни метилирования для генома Zea mays c.v. B73. По существу области генома Zea mays, содержащие данные о наличии метилирования, показали, что эти области генома Zea mays являлись метилированными. Напротив, области генома Zea mays, в которых отсутствовали данные о наличии метилирования, показали, что эти области генома Zea mays являлись неметилированными. Области генома Zea mays из тканей побегов и корней, которые являлись неметилированными и не содержали каких-либо данных о наличии метилирования, считали «гипометилированными» областями. Чтобы сделать профили метилирования в корнях и побегах доступными для визуализации, для каждой из хромосом Zea mays c.v. B73 строили графики колебаний (http://useast.ensembl.org/info/website/upload/wig.html). Образец снимка экрана графика колебаний для профиля метилирования ДНК тканей корней и побегов, полученных из хромосомы номер 1 Zea mays c.v. B73, показан на фигуре 1.

Профили метилирования, идентифицированные для тканей корней и побегов Zea mays c.v. B73, как описано выше, объединяли с получением консенсусного профиля метилирования и использовали для идентификации гипометилированных областей в геноме Zea mays c.v. B73. Полученный геномный консенсусный профиль метилирования Zea mays сканировали для идентификации геномных положений без признаков метилирования, т.е. не содержащих данных о картировании метилирования. Идентифицировали фрагменты геномной ДНК длиннее 100 п.о., которые являлись гипометилированными. Конкретную длину каждой из этих гипометилированных областей рассчитывали посредством определения общего количества пар оснований между двумя геномными областями, демонстрирующими признаки метилирования. В таблице 1 обобщены идентифицированные гипометилированные области. Кроме того, распределение длины гипометилированных областей генома Zea mays c.v. B73 показано на фигуре 2.

Эти гипометилированные области генома Zea mays c.v. B73 далее характеризовали для идентификации и выбора конкретных геномных локусов, поскольку свободный от метилирования контекст этих областей указывал на присутствие открытого хроматина. Таким образом, все последующие анализы проводили на идентифицированных гипометилированных областях.

Возможность нацеливания

Гипометилированные участки, идентифицированные в Zea mays c.v. B73, далее анализировали для определения того, какие участки являлись поддающимися нацеливанию посредством опосредуемого сайт-специфической нуклеазой интеграции полинуклеотидного донора. В данной области известно, что геном Zea mays содержит длинные участки высокоповторяющейся ДНК которые являются метилированными и имеют высокие уровни дупликации последовательности. Аннотирующую информацию об известных повторяющихся областях в геноме Zea mays получали из Maize Genome Database (доступной на http://www.maizegdb.org/, и Lawrence, CJ et al (2008) MaizeGDB: The Maize Model Organism Database for Basic, Translational, and Applied Research. Int J Plant Genomics. 2008:496957).

Соответственно, гипометилированные участки, идентифицированные выше, подвергали скринингу для удаления каких-либо участков, выравнивающихся с известными повторяющимися областями, аннотированными в геноме маиса. Оставшиеся гипометилированные участки, прошедшие этот первый скрининг, затем сканировали с использованием поиска гомологии на основе BLAST™ в базе данных генома маиса посредством запуска программного обеспечения NCBI BLAST™ (версия 2.2.23) с использованием настроек с параметрами по умолчанию (Stephen F. Altschul et al (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). В результате скрининга BLAST™, любые гипометилированные участки, обладающие значительным совпадением где-либо в геноме, с охватом выравнивания последовательностей более 40%, исключали из дальнейшего анализа.

Агрономически нейтральные или внегенные локусы

Гипометилированные участки, идентифицированные в Zea mays c.v. B73 далее анализировали для определения того, какие участки являлись агрономически нейтральными или внегенными. Таким образом, гипометилированные участки, описанные выше, подвергали скринингу для удаления каких-либо участков, перекрывающих или содержащих любую из известных или прогнозируемых эндогенных кодирующих последовательностей Zea mays c.v. B73. Для этой цели аннотирующие данные известных генов и информацию о данных картирования маркеров экспрессируемой последовательности (EST) получали из Maize Genomic Database (доступной на www.maizegdb.org и Monaco, M., et al., Maize Metabolic Network Construction and Transcriptome Analysis. doi:10.3835/plantgenome2012.09.0025; Posted online 23 Jan. 2013). Рассматривали также любую геномную область непосредственно на 2 т.п.о. выше и на 1 т.п.о. ниже открытой рамки считывания. Эти вышележащие и нижележащие области могут содержать известные или неизвестные консервативные регуляторные элементы, которые необходимы для функции гена. Гипометилированные участки, ранее описанные выше, анализировали по присутствию известных генов (включая области 2 т.п.о. выше и 1 т.п.о. ниже) и EST. Любые гипометилированные участки, которые выравнивались или перекрывались с известными генами (включая области 2 т.п.о. выше и 1 т.п.о. ниже) или EST, исключали из последующего анализа.

Экспрессия

Гипометилированные участки, идентифицированные в Zea mays c.v. B73, далее анализировали для определения того, какие участки находятся вблизи экспрессируемого гена маиса. Уровень экспрессии транскриптов генов Zea mays измеряли посредством анализа данных профилирования транскриптома, полученных для тканей корней и побегов Zea mays c.v. B73, с использованием способа RNAseq™, как описано в Wang et al., (2009) Genome-Wide and Organ-Specific Landscapes of Epigenetic Modifications and Their Relationships to mRNA and Small RNA Transcriptomes in Maize. Plant Cell. 21(4): 1053-1069. Для каждого гипометилированного участка проводили анализ для идентификации любых аннотированных генов, присутствующих в пределах области 40 т.п.о. вблизи гипометилированного участка, и среднего уровня экспрессии аннотированного гена(генов), расположенных вблизи гипометилированного участка. Гипометилированные участки, расположенные более чем на 40 т.п.о. от аннотированного гена с отличным от нуля средним уровнем экспрессии, определяли как не являющиеся расположенными близко к экспрессируемому гену Zea mays и исключали из дальнейших анализов.

Рекомбинация

Гипометилированные участки, идентифицированные в Zea mays c.v. B73, далее анализировали для определения того, какие участки имеют признаки рекомбинации и могут облегчать интрогрессию оптимальных геномных локусов в другие линии Zea mays посредством общепринятого скрещивания. Разнообразные генотипы Zea mays обычно скрещивают в процессе общепринятого разведения для разработки новых и усовершенствованных линий Zea mays, обладающих признаками, представляющими агрономический интерес. Таким образом, агрономические признаки, которые передаются путем интрогрессии в оптимальные геномные локусы в линии Zea mays посредством опосредуемой растением трансформации трансгеном, должны являться способными к дальнейшей интрогрессии в другие линии Zea mays, особенно элитные линии, посредством мейотической рекомбинации в процессе общепринятой селекции растений. Гипометилированные участки, описанные выше, подвергали скринингу для идентификации и отбора участков, обладающих некоторым уровнем мейотической рекомбинации. Любые гипометилированные участки, которые присутствовали в хромосомных областях, охарактеризованных как «холодные области» рекомбинации, идентифицировали и исключали. В Zea mays эти холодные области определяли с использованием набора данных о высоко разрешающих маркерах, полученных для множества популяций для картирования (Jafar Mammadov, Wei Chen, Anastasia Chueva, Karthik Muthuraman, Ruihua Ren, David Meyer, and Siva Kumpatla. 2011. Distribution of Recombinant Frequencies across the Maize Genome. 52^nd Annual Maize Genetics Conference).

Частоту мейотической рекомбинации между любой парой геномных маркеров Zea mays на хромосоме рассчитывали на основании соотношения генетического расстояния между маркерами (в сантиморганах (cM)) и физического расстояния между маркерами (в миллионах пар оснований (млн.п.о.)). Например, если генетическое расстояние между парой маркеров составляло 1 cM, и физическое расстояние между парой маркеров составляло 2 млн.п.о., тогда определяли, что рассчитанная частота рекомбинации составляет 0,5 cM/млн.п.о. Для каждого гипометилированного участка, идентифицированного выше, выбирали пару маркеров на расстоянии по меньшей мере 1 млн.п.о. и вычисляли частоту рекомбинации. Этот способ использовали для рассчета частоты рекомбинации в гипометилированных участках. Любые гипометилированные участки с частотой рекомбинации 0,00041 cM/млн.п.о. идентифицировали и исключали из дальнейшего анализа. Остальные гипометилированные области, имеющие частоту рекомбинации более 0,000410 cM/млн.п.о., выбирали для дальнейшего анализа.

Идентификация оптимальных геномных локусов

Использование критериев отбора, описанных выше, привело к идентификации всего 52885 оптимальных геномных локусов из генома Zea mays. В таблице 2 обобщены длины идентифицированных оптимальных геномных локусов. Эти оптимальные геномные локусы обладают следующими характеристиками: 1) гипометилированные геномные локусы длиной более 1 т.п.о.; 2) геномные локусы, поддающиеся нацеливанию посредством опосредуемой сайт-специфической нуклеазой интеграции полинуклеотидного донора; 3) геномные локусы, которые являются агрономически нейтральными или внегенными; 4) геномные локусы, с которых может экспрессироваться трансген; и 5) признаки рекомбинации в геномных локусах. Из всех оптимальных геномных локусов, описанных в таблице 2, только оптимальные геномные локусы, которые имели размер более 1 т.п.о., далее анализировали и использовали для нацеливания донорной полинуклеотидной последовательности. Последовательности этих оптимальных геномных локусов описаны в качестве SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5286. В совокупности, эти оптимальные геномные локусы представляют собой положения в геноме Zea mays, на которые можно нацеливать донорную полинуклеотидную последовательность, как дополнительно продемонстрировано в настоящем документе ниже.

Пример 2: F-распределение и анализ главных компонентов для кластеризации оптимальных геномных локусов из Zea mays

5286 идентифицированных оптимальных геномных локусов (SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 5286) далее анализировали с использованием статистических способов анализа F-распределения и анализа главных компонентов для определения репрезентативной выборки и кластеров для группировки оптимальных геномных локусов.

Анализ F-распределения

Идентифицированные 5286 оптимальных геномных локусов статистически анализировали с использованием статистического анализа непрерывного распределения вероятностей. В качестве варианта осуществления статистического анализа непрерывного распределения вероятностей, проводили тест F-распределения для определения репрезентативного количества оптимальных геномных локусов. Анализ критерия F-распределения проводили с использованием уравнений и способов, известных специалистам в данной области. Для более подробного руководства, анализ критерия F-распределения, как описано в K.M Remund, D. Dixon, DL. Wright and LR. Holden. Statistical considerations in seed purity testing for transgenic traits. Seed Science Research (2001) 11, 101-119, включенной в настоящее описание в качестве ссылки, является неограничивающим примером теста F-распределения. Тест F-распределения предполагает случайный выбор оптимальных геномных локусов, чтобы любые неприменимые локусы были равномерно распределены среди 5286 оптимальных геномных локусов, и это количество отобранных оптимальных геномных локусов составляло 10% или менее от общей выборки из 5286 оптимальных геномных локусов.

Анализ F-распределения показал, что 72 из 5286 оптимальных геномных локусов обеспечили репрезентативное количество для 5286 оптимальных геномных локусов с доверительным интервалом 95%. Соответственно, анализ F-распределения показал, что если бы тестировали 72 оптимальных геномных локуса и все они являлись поддающимися нацеливанию с помощью донорной полинуклеотидной последовательности, тогда эти результаты указывали бы на то, что 96% или более из 5286 оптимальных геномных локусов являются положительными с 95% доверительным интервалом. Наилучшей оценкой для валидации общего процента из 5286 оптимальных геномных локусов, было бы то, что 100% из 72 тестированных оптимальных геномных локусов являются поддающимися нацеливанию. Соответственно, 96% фактически является нижней границей истинного процента, валидированного при доверительном интервале 95%. Эта нижняя граница основана на 0,95 квантиле F-распределения для 95% доверительного интервала (Remund K, Dixon D, Wright D, и Holden L. Statistical considerations in seed purity testing for transgenic traits. Seed Science Research (2001) 11, 101-119).

Анализ главных компонентов

Затем осуществляли статистический способ анализа главных компонентов (PCA) для дальнейшей оценки и визуализации сходств и отличий в наборе данных, содержащем 5286 идентифицированных оптимальных геномных локусов, чтобы позволить отбор различных локусов для валидации нацеливания. PCA вовлекает математический алгоритм, который преобразует большее число коррелированных переменных в меньшее число некоррелированных переменных, называемых главными компонентами.

PCA выполняли для 5286 идентифицированных оптимальных геномных локусов посредством получения набора поддающихся расчету признаков или свойств, которые можно использовать для описания 5286 идентифицированных оптимальных геномных локусов. Каждый признак поддается численному расчету и определен специально для охвата геномного и эпигеномного контекста 5286 идентифицированных оптимальных геномных локусов. Идентифицирован набор из 10 признаков для каждого оптимального геномного локуса Zea mays, и он более подробно описан ниже.

1. Длина оптимальных геномных локусов

a. Длина оптимальных геномных локусов в этом наборе данных лежала в диапазоне от минимум 1000 п.о. до максимум 8267 п.о.

2. Частота рекомбинации в области 1 млн.п.о. вокруг оптимальных геномных локусов

a. В маисе частоту рекомбинации для положения на хромосоме определяли с использованием внутреннего высокоразрешающего набора данных о маркерах, полученного для множества популяций для картирования (Jafar Mammadov, Wei Chen, Anastasia Chueva, Karthik Muthuraman, Ruihua Ren, David Meyer, and Siva Kumpatla. 2011. Distribution of Recombinant Frequencies across the Maize Genome. 52nd Annual Maize Genetics Conference).

b. Частоты рекомбинации между любыми парами маркеров на хромосоме вычисляли, исходя из отношения генетического расстояния между маркерами (в сантиморганах (cM)) к физическому расстоянию между маркерами (в млн.п.о.). Например, если генетическое расстояние между парой маркеров составляет 1 cM, и физическое расстояние между той же парой маркеров составляет 2 млн.п.о., рассчитанная частота рекомбинации составляет 0,5 cM/млн.п.о. Для каждого оптимального геномного локуса выбирали пару маркеров на расстоянии по меньшей мере 1 млн.п.о. и рассчитывали частоту рекомбинации этим способом. Эти значения рекомбинации лежали в диапазоне от минимум 0,00041 cM/млн.п.о. до максимум 62,42 cM/млн.п.о.

3. Уровень уникальности последовательности оптимальных геномных локусов

a. Для каждого оптимального геномного локуса нуклеотидную последовательность оптимальных геномных локусов сканировали против генома Zea mays c.v. B73 с использованием поиска гомологии на основе BLAST™ с использованием программного обеспечения NCBI BLAST™⁺ (версии 2.2.23) с использованием настроек с параметрами по умолчанию (Stephen F. Altschul et al (1997), «Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs», Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Поскольку эти оптимальные последовательности геномных локусов идентифицированы из генома Zea mays c.v. B73, первый положительный результат, идентифицированный в таком поиске, представляет собой саму последовательность Zea mays c.v. B73. Идентифицировали второй положительный результат BLAST™ для каждой последовательности оптимального геномного локуса, и охват выравнивания (представленный как процент оптимальных геномных локусов, охватываемых положительным результатом BLAST™) для положительного результата использовали в качестве показателя уникальности последовательности оптимального геномного локуса в геноме Zea mays. Эти значения охвата выравнивания для второго положительного результата BLAST™ лежали в диапазоне от минимум 0% до максимум 39,98% идентичности последовательностей. Любые последовательности, которые выравнивались при более высоких уровнях идентичности последовательностей, не рассматривали.

4. Расстояние от оптимальных геномных локусов до наиболее близкорасположенного гена в окружении

a. Аннотирующую информацию о генах и локализации известных генов в геноме Zea mays получали из Maize Genome Database (доступной на www.maizegdb.org, и Monaco, M., et al., Maize Metabolic Network Construction and Transcriptome Analysis. doi:10.3835/plantgenome2012.09.0025; Posted online 23 Jan. 2013). Для каждого оптимального геномного локуса идентифицировали наиболее близкий аннотированный ген, учитывая как вышележащие, так и нижележащие положения, и измеряли расстояние между последовательностью оптимального геномного локуса и геном (в п.о.). Например, если оптимальный геномный локус локализован на хромосоме 1 от положения 500 до положения 1500, и наиболее близкорасположенный ген к этому оптимальному геномному локусу локализован на хромосоме 1 от положения 2000 до положения 3000, расстояние от оптимальных геномных локусов до этого наиболее близкорасположенного гена вычисляют как 500 п.о. Эти значения для всего набора данных для 5286 оптимальных геномных локусов лежали в диапазоне от минимум 1001 п.о. до максимум 34809 п.о.

5. % GC в последовательности оптимальных геномных локусов

a. Для каждого оптимального геномного локуса анализировали нуклеотидную последовательность для оценки количества присутствующих остатков гуанина и цитозина. Это количество представляли в качестве процента от длины последовательности каждого оптимального геномного локуса, и оно обеспечивает измерение для % GC. Эти значения % GC для набора данных для оптимальных геномных локусов маиса лежат в диапазоне от 25,17% до 68,3%.

6. Количество генов в пределах 40 т.п.о. в окружении последовательностей оптимальных геномных локусов

a. Аннотирующую информацию о гене и локализацию известных генов в геноме Zea mays c.v. B73 получали из Maize Genome Database. Для каждой из 5286 последовательностей оптимальных геномных локусов определяли окно размером 40 т.п.о. вокруг последовательности оптимальных геномных локусов и подсчитывали количество аннотированных генов с положениями, перекрывающими это окно. Эти значения лежали в диапазоне от минимум 1 гена до максимум 9 генов в окружении 40 т.п.о.

7. Средняя экспрессия генов в окружении 40 т.п.о. вокруг оптимальных геномных локусов

a. Уровень экспрессии транскриптов генов маиса измеряли посредством анализа доступных данных профилирования транскриптома, полученных для тканей корней и побегов Zea mays c.v. B73 с использованием технологии RNAseq™ (Mortazavi, A. et al., Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat. Methods. 5, 621-628 (2008); Wang et al., Genome-Wide and Organ-Specific Landscapes of Epigenetic Modifications and Their Relationships to mRNA and Small RNA Transcriptomes in Maize. Plant Cell. 2009 April; 21(4): 1053-1069). Аннотирующую информацию о генах и локализацию известных генов в геноме Zea mays c.v. B73 получали из Maize Genome Database. Для каждого оптимального геномного локуса идентифицировали аннотированные гены в геноме Zea mays c.v. B73, которые присутствовали в окружении 40 т.п.о. вокруг оптимальных геномных локусов. Уровни экспрессии для каждого из генов получали из профилей транскриптома, описанных в указанных выше литературных источниках, и рассчитывали средний уровень экспрессии генов. Значения экспрессии всех генов в геноме Zea mays значительно меняются. Минимальное значение экспрессии составляло 0, и макимальное значение экспрессии составляло 2511,397, со средним значением экспрессии 18,489 и медианным значением экспрессии 3,604. Средние значения экспрессии для набора данных для всех из 5286 оптимальных геномных локусов лежало в диапазоне от миниммума 0,00369 до максимума 2233,06.

8. Уровень занятости нуклеосомами вокруг оптимальных геномных локусов

a. Определение уровня занятости нуклеосомами для конкретной нуклеотидной последовательности обеспечивает информацию о хромосомных функциях и геномном контексте последовательности. Статистический пакет NuPoP™ использовали для прогнозирования занятости нуклеосомами и карты наиболее вероятного расположения нуклеосом для геномных последовательностей любого размера (Xi, L., Fondufe-Mittendor, Y., Xia, L., Flatow, J., Widom, J. and Wang, J.-P., Predicting nucleosome positioning using a duration Hidden Markov Model, BMC Bioinformatics, 2010, doi:10.1186/1471-2105-11-346). Для каждого из 5286 оптимальных геномных локусов нуклеотидную последовательность предоставляли для анализа с использованием программного обеспечения NuPoP™ и рассчитывали показатель занятости нуклеосомами. Эти показатели занятости нуклеосомами для набора данных для оптимальных геномных локусов маиса лежали в диапазоне от минимума 0 до максимума 0,962.

9. Относительное расположение в хромосоме (близость к центромере)

a. Центромера представляет собой область на хромосоме, которая связывает две сестринских хроматиды. Участки хромосомы с любой стороны центромеры известны как плечи хромосом. Геномные положения центромер на всех 10 хромосомах маиса идентифицировали в опубликованной эталонной последовательности Zea mays c.v. B73 (Schnable, P., et al., (2009) The B73 maize genome: complexity, diversity and dynamics. Science, 326(5956): 1112-1115). Информацию о положении центромеры в каждой из хромосом Zea mays и длине плеч хромосомы получали из Maize Genome Database. Для каждого оптимального геномного локуса измеряли геномное расстояние от последовательности оптимального геномного локуса до центромеры хромосомы, на которой она расположена (в п.о.). Относительное расположение оптимального геномного локуса на хромосоме представляют как соотношение его геномного расстояния до центромеры к длине конкретного плеча хромосомы, на которой он расположен. Эти значения относительного расположения для набора данных для оптимальных геномных локусов маиса лежали в диапазоне отношений геномных расстояний от минимум 0,00373 до максимум 0,99908.

10. Количество оптимальных геномных локусов в области 1 млн.п.о.

a. Для каждого оптимального геномного локуса определяли геномное окно размером 1 млн.п.о. вокруг положения оптимальных локусов и рассчитывали количество других дополнительных оптимальных геномных локусов, присутствующих в этой области или перекрывающих ее, включая рассматриваемые оптимальные геномные локусы. Количество оптимальных геномных локусов в 1 млн.п.о. лежало в диапазоне от минимума 1 до максимума 22.

Все из 5286 оптимальных геномных локусов анализировали с использованием признаков и свойств, описанных выше. Результаты или значения для признаков и атрибутов каждого геномного локуса дополнительно описаны в таблице 3 (включенной в настоящее описание в качестве ссылки в форме отдельного электронного файла). Полученный набор данных использовали в статистическом способе PCA для кластеризации 5286 идентифицированных оптимальных геномных локусов на кластеры. В процессе кластеризации после оценки «p» главных компонентов оптимальных геномных локусов, следовало отнесение оптимальных геномных локусов к одному из 32 кластеров в «p»-мерном евклидовом пространстве. Каждую ось «p» делили на «k» интервалов. Оптимальные геномные локусы, отнесенные к одному интервалу, группировали вместе с формированием кластеров. С использованием этого анализа каждую ось PCA делили на два интервала, которые были выбраны на основе предшествующей информации, касающейся количества кластеров, требуемых для экспериментальной валидации. Весь анализ и визуализацию полученных кластеров проводили с использованием программного обеспечения Molecular Operating Environment™ (MOE) от Chemical Computing Group Inc. (Montreal, Quebec, Canada).

Способ PCA использовали для кластеризации набора из 5286 оптимальных геномных локусов на 32 отдельных кластера на основе их характерных значений, описанных выше. В процессе PCA получено пять главных компонентов (PC), причем наилучшие три PC включали приблизительно 90% от всех вариаций в наборе данных (таблица 4). Эти три PCA использовали для графического представления 32 кластеров в трехмерном графике (фигура 3). После завершения процесса кластеризации из каждого кластера выбирали один репрезентативный оптимальный геномный локус. Это осуществляли посредством выбора отдельного оптимального геномного локуса внутри каждого кластера, который был наиболее близким к центроиду этого кластера (таблица 4). Положения на хромосомах 32 репрезентативных геномных локусов являются равномерно распределенными на 10 хромосомах маиса и не смещены в направлении какого-либо конкретного геномного положения, как показано на фигуре 4.

Окончательный отбор 72 геномных локусов для нацеливания полинуклеотидной донорной последовательности

Всего 72 геномных локуса идентифицировано и выбрано для нацеливания донорной полинуклеотидной последовательности из 5286 геномных локусов, которые были кластеризованы в 32 отдельных кластера. Для каждого из 32 кластеров выбирали репрезентативный геномный локус (наиболее близкий к центроиду кластера, как описано выше в таблице 4) и дополнительный локус внутри каждого кластера. Дополнительные оптимальные геномные локусы выбирали посредством первого скрининга всех 5286 выбранных оптимальных геномных последовательностей против полногеномной базы данных, состоящей из данных о геномных последовательностях ДНК как для Zea mays c.v. Hi-II (линия для скрининга по нацеливанию), так и для Zea mays c.v. B104 (линия для трансформации) для определения перекрывания (как много оптимальных геномных локусов присутствовали в обоих геномах) и процента идентичности последовательностей в геноме обеих линий. Дополнительные оптимальные геномные локусы с 100% перекрыванием (с выравниванием полной длины последовательности оптимальных локусов между обоими геномами) и 100% идентичностью в базах данных обоих геномов Hi-II и B104, выбирали для валидации нацеливания (фигура 5). Сравнительно небольшое количество репрезентативных геномных локусов обладали идентичностью последовательности, составляющей менее 100% перекрывания и идентичности в базах данных обоих геномов Hi-II and B104 (фигура 5). Другие критерии, такие как размер геномных локусов, степень уникальности, % содержание GC и распределение оптимальных геномных локусов на хромосомах, также принимали во внимание при выборе дополнительных геномных локусов. Положение 72 выбранных оптимальных локусов на хромосомах и конкретная геномная конфигурация каждого оптимального геномного локуса Zea mays показаны на фигуре 6 и в таблице 5, соответственно.

В геноме Zea mays идентифицирован большой набор из 5286 геномных положений в качестве оптимальных геномных локусов для нацеливания донорной полинуклеотидной последовательности с использованием способов точной инженерии генома. Использован способ статистического анализа для группировки 5286 выбранных геномных локусов на 32 кластера со сходным геномным контекстом и для идентификации подгруппы из 72 выбранных геномных локусов, репрезентативных для набора из 5286 выбранных геномных локусов. 72 репрезентативных локуса подтверждены в качестве оптимальных геномных локусов посредством нацеливания донорной полинуклеотидной последовательности. Посредством проведения статистического анализа PCA для числовых значений, полученных для десяти наборов признаков или атрибутов, описанных выше, десять признаков или атрибутов рассчитывали в качестве компонентов PCA с меньшими размерностями. По существу, компоненты PCA сводили к пяти размерностям, которые являются репрезентативными для десяти признаков или атрибутов, описанных выше (таблица 6). Каждый компонент PCA эквивалентен комбинации десяти признаков или атрибутов, описанных выше. Из этих компонентов PCA, содержащих пять размерностей, как рассчитано с использованием статистического анализа PCA, определены 32 кластера.

Пример 3: Дизайн цинковых пальцев для связывания геномных локусов в Zea mays

Белки с цинковыми пальцами, направленные против идентифицированных последовательностей ДНК репрезентативных геномных локусов, конструировали, как описано ранее. См., например, Urnov et al., (2005) Nature 435:646-551. Иллюстративная последовательность-мишень и узнающие спирали представлены в таблице 7 (дизайн областей узнающих спиралей) и в таблице 8 (участки-мишени). В таблице 8 нуклеотиды в участке-мишени, контактирующие с узнающими спиралями ZFP, указаны заглавными буками, и не контактирующие нуклеотиды указаны строчными буквами. Участки-мишени нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) конструировали для всех из описанных выше 72 отобранных оптимальных геномных локусов. Многочисленные конструкции ZFP разработаны и тестированы для идентификации пальцев, которые связываются с наибольшим уровнем эффективности с 72 различными репрезентативными участками-мишенями геномных локусов, которые идентифицированы в Zea mays и отобраны, как описано выше. Конкретные узнающие спирали ZFP (таблица 7), которые связываются с наиболее высоким уровнем эффективности с последовательностями узнавания цинковых пальцев, использовали для нацеливания и интеграции донорной последовательности в геноме Zea mays.

Репрезентативные конструкции цинковых пальцев для геномных локусов Zea mays вставляли в векторы для экспрессии цинковых пальцев, кодирующие белок, обладающий по меньшей мере одним пальцем со структурой CCHC. См. публикацию Патента США No. 2008/0182332. В частности, последний палец в каждом белке обладал остовом CCHC для узнающей спирали. Неканонические последовательности, кодирующие цинковые пальцы, сливали с нуклеазным доменом рестрикционного фермента типа IIS FokI (аминокислоты 384-579 последовательности из Wah et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569) через линкер ZC из четырех аминокислот и сигнал ядерной локализации opaque-2, полученный из Zea mays, для формирования нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN). См. Патент США No. 7888121. Цинковые пальцы для различных функциональных доменов выбирали для применения in vivo. Из многочисленных ZFN, которые были сконструированы, продуцированы и протестированы для связывания с предполагаемым геномным участком-мишенью, ZFN, описанные в таблице 8 выше, идентифицированы как обладающие активностью in vivo, и были охарактеризованы как способные эффективно связывать и расщеплять уникальные геномные полинуклеотидные участки-мишени Zea mays in planta.

Сборка конструкции ZFN

Плазмидные векторы, содержащие экспрессирующие ген ZFN конструкции, идентифицированные, как описано ранее, конструировали и получали с использованием квалификации и способов, общеизвестных в данной области (см., например, Ausubel или Maniatis). Каждую кодирующую ZFN последовательность сливали с последовательностью, кодирующей сигнал ядерной локализации opaque-2 (Maddaloni et al. (1989) Nuc. Acids Res. 17(18):7532), расположенный выше нуклеазы с цинковыми пальцами. Неканонические кодирующие цинковые пальцы последовательности сливали с нуклеазаным доменом рестрикционного фермента FokI типа IIS (аминокислоты 384-579 последовательности из Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569). Экспрессию слитых белков контролировали сильным конститутивным промотором из гена убиквитина Zea mays (включающим 5'-нетранслируемую область (UTR) (Toki et al., (1992) Plant Physiology 100; 1503-07). Экспрессирующая кассета включала также 3'-UTR (содержащую терминатор транскрипции и участок полиаденилирования) из гена пероксидазы 5 Zea mays (Per5) (публикация Патента США No. 2004/0158887). Кодирующую самогидролизующийся 2A нуклеотидную последовательность из вируса Thosea asigna (Szymczak et al., (2004) Nat Biotechnol. 22:760-760) добавляли между двумя слитыми белками нуклеаз с цинковыми пальцами, клонированными в конструкцию.

Плазмидные векторы собирали с использованием способа IN-FUSION™ Advantage (Clontech, Mountain View, CA). Рестрикционные эндонуклеазы получали из New England BioLabs (Ipswich, MA), и ДНК-лигазу T4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) использовали для лигирования ДНК. Выделение плазмид проводили с использованием набора для выделения плазмид NUCLEOSPIN® (Macherey-Nagel Inc., Bethlehem, PA) или набора для выделения плазмид Midi (Qiagen), следуя инструкциям производителей. Фрагменты ДНК выделяли с использованием набора для выделения из геля QIAQUICK™ (Qiagen) после электрофореза в агарозном геле с Трис-ацетатом. Скрининг колоний после всех реакций лигирования первоначально проводили посредством расщепления минипрепарата ДНК. Плазмидную ДНК избранных клонов секвенировали у коммерческого исполнителя секвенирования (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL). Данные о последовательности составляли и анализировали с использованием программного обеспечения SEQUENCHER™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).

Плазмиды конструировали и подтверждали посредством расщепления рестрикционным ферментом и секвенирования ДНК.

Клонирование цинковых пальцев посредством автоматизированного процесса

Подгруппу векторов для нуклеаз с цинковыми пальцами клонировали с использованием автоматизированной конвейерной системы для конструирования ДНК. В целом, автоматизированная конвейерная система обеспечила векторные конструкции с идентичной архитектурой ZFN, как описано ранее. Каждый мономер цинкового пальца, придающий ZFN специфичность связывания ДНК, был разделен на 2-3 уникальных последовательности в области аминокислотного мотива KPF. Как 5'-, так и 3'-концы фрагментов ZFN были модифицированы включением участка узнавания BsaI (GGTCTCN) и образующихся в результате выступающих концов. Выступающие концы были размещены так, чтобы сборная конструкция из 6-8 частей могла обеспечить только желаемый полноразмерный экспрессирующийся клон. Модифицированные фрагменты ДНК синтезировали de novo (Synthetic Genomics Incorporated, La Jolla, CA). Во всех конструкциях ZFN для маиса использовали один остов для маиса pDAB118791. Он содержал промотор ZmUbi1 и NLS Opaque2, а также домен FokI и 3'-UTR ZmPer5. Домен, клонированный между NLS Opaque 2 и FokI, представлял собой ген SacB из Bacillus subtilis, фланкированный BsaI. Когда для предполагаемых событий лигирования проводили посев на среды, содержащие сахарозу, кассета SacB выступала в качестве агента отрицательной селекции, снижающего или устраняющего контаминацию остовом вектора. Вторая часть, многократно использованная во всех конструкциях, представляла собой pDAB117462. Этот вектор содержит первый мономерный домен Fok1, последовательность статтера t2A и 2-й мономер NLS Opaque2, все из которых были фланкированы участками BsaI.

С использованием этих материалов в качестве библиотеки частей ДНК ZFN, система Freedom Evo 150® (TECAN, Mannedorf, Швейцария) осуществляла добавление 75-100 нг каждой плазмидной ДНК или синтезированного фрагмента из пробирок, кодируемых 2D-штрих-кодом, в планшет для ПЦР (ThermoFisher, Waltham, MA). В реакционную смесь добавляли BsaI (NEB, Ipswich, MA) и ДНК-лигазу T4 (NEB, Ipswich, MA), дополненные бычьим сывороточным альбумином (NEB, Ipswich, MA) и буфером для ДНК-лигазы T4 (NEB, Ipswich, MA). Проводили циклические реакции (25X) с инкубациями в течение 3 минут при 37°C и 4 минут при 16°C в термоциклере C1000 Touch (BioRad, Hercules CA). Лигированный материал подвергали трансформации и скринингу в клетках Top10 (Life Technologies Carlsbad, CA) вручную или с использованием устройства для сбора колоний Qpix460 и LabChip GX® (Perkin Elmer, Waltham, MA). Для правильно расщепляемых колоний проводили подтверждение последовательностей для трансформации растений.

Сборка универсальных донорных конструкций

Для обеспечения быстрого исследования большого количества локусов-мишеней, разрабатывали и конструировали новую гибкую универсальную последовательность донорной системы. Универсальная донорная полинуклеотидная последовательность являлась совместимой с высокопроизводительными способами конструирования векторов и анализа. Универсальная донорная система состояла по меньшей мере из трех модульных доменов: вариабельный связывающий домен ZFN, невариабельный аналитический домен и домен с определяемыми пользователем признаками, и простого плазмидного остова для увеличения количества вектора. Невариабельная универсальная донорная полинуклеотидная последовательность являлась общей для всех доноров и позволяла разработку конечного набора анализов, которые можно использовать для всех участков-мишеней Zea mays, таким образом, обеспечивая единообразие оценки нацеливания и уменьшение количества циклов анализа. Модульная природа этих доменов обеспечивала высокопроизводительную сборку донора. Кроме того, универсальная донорная полинуклеотидная последовательность обладает другими уникальными признаками, нацеленные на упрощение последующего анализа и улучшение интерпретации результатов. Она содержит асимметричную последовательность участка рестрикции, позволяеющую расщепление продуктов ПЦР до диагностически прогнозируемых размеров. Последовательности, содержащие вторичные структуры с ожидаемой проблематичностью для амплификации ПЦР, удаляли. Универсальная донорная полинуклеотидная последовательность имела малый размер (менее 3,0 т.п.о.). Наконец, универсальная донорная полинуклеотидная последовательность была сконструирована на высококопийном остове pUC19, который позволяет объединение большого количества тестируемых ДНК по времени.

В качестве варианта осуществления иллюстративная плазмида, содержавшая универсальную донорную полинуклеотидную последовательность, представлена как SEQ ID NO:5418 и фигура 7. В дополнительном варианте осуществления универсальная донорная полинуклеотидная последовательность представлена как: pDAB11846, SEQ ID NO:5419, фигура 15; pDAB117415, SEQ ID NO:5420, фигура 16; pDAB117416, SEQ ID NO:5421, фигура 17; pDAB117417, SEQ ID NO:5422, фигура 18; pDAB117419, SEQ ID NO:5423, фигура 19; pDAB117434 SEQ ID NO:5424, фигура 20; pDAB117418, SEQ ID NO:5425, фигура 21; pDAB117420, SEQ ID NO:5426, фигура 22; и pDAB117421, SEQ ID NO:5427, фигура 23. В другом варианте осуществления можно конструировать дополнительные последовательности, содержащие универсальную донорную полинуклеотидную последовательность с функциональной экспрессирующейся кодирующей последовательностью или нефункциональной (лишенной промотора) экспрессирующейся кодирующей последовательностью.

В другом варианте осуществления, универсальная донорная полинуклеотидная последовательность представляет собой небольшую модульную донорную систему размером 2-3 т.п.о., доставляемую в форме плазмиды. Она представляет собой минимальный донор, содержащий любое количество участков связывания ZFN, короткую матричную область размером 100-150 п.о., обозначенную «ДНК X» или «последовательность UZI» (SEQ ID NO:5428), несущую участки рестрикции и последовательности ДНК для конструирования праймеров или кодирующих последовательностей, и простой плазмидный остов (фигура 8). Целая плазмида вставлялась посредством NHEJ после двухцепочечных разрывов ДНК в соответствующем участке связывания ZFN; участки связывания ZFN можно включать тандемно. Этот вариант осуществления универсальной донорной полинуклеотидной последовательности являлся наиболее пригодным для быстрого скрининга участков-мишеней и ZFN, и последовательности, которые трудно амплифицировать, были минимизированы в доноре.

В следующем варианте осуществления универсальная донорная полинуклеотидная последовательность составлена по меньшей мере из 4 модулей и несет участки связывания ZFN, плечи гомологии, ДНК X либо только с аналитическим фрагментом размером приблизительно 100 п.о., либо с кодирующими последовательностями. Этот вариант осуществления универсальной донорной полинуклеотидной последовательности являлся пригодным для проверки опосредуемой HDR вставки гена в различные участки-мишени с использованием нескольких ZFN (фигура 9).

Универсальную донорную полинуклеотидную последовательность можно использовать со всеми нацеливающими молекулами с определенными ДНК-связывающими доменами с двумя способами направленной вставки донора (NHEJ/HDR). По существу, когда универсальную донорную полинуклеотидную последовательность совместно доставляли с соответствующей конструкцией для экспрессии ZFN, донорный вектор и геном маиса расщепляли в одном конкретном положении, определяемом связыванием конкретной ZFN. После линеаризации донор можно включать в геном посредством NHEJ или HDR. Затем можно использовать определенные аналитические факторы в конструировании векторов для определения цинкового пальца, который максимизирует эффективное осуществление направленной интеграции. (фигура 10).

Пример 4: Способы трансформации Zea mays

Перед доставкой в протопласты Zea mays c.v. Hi-II, плазмидную ДНК для каждой конструкции ZFN получали из культур E. coli с использованием системы Pure Yield PLASMID Maxiprep® (Promega Corporation, Madison, WI) или набора PLASMID Maxi Kit® (Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителей.

Выделение протопластов

Суспензию клеток Zea mays c.v. Hi-II поддерживали по расписанию поддержания в течение 3,5 суток, 4 мл объема осажденных клеток (PCV) из клеток собирали и переносили в 50-мл стерильные конические пробирки (Fisher Scientific), содержащие по 20 мл раствора ферментов (0,6% пектолиаза™, 6% целлюлаза™ («Onozuka» R10; Yakult Pharmaceuticals, Japan), 4 мМ MES (pH 5,7), 0,6 М маннит, 15 мМ MgCl₂). Пробирки с культурой закрывали крышкой и заворачивали в PARAFILM™, и помещали на качалку с платформой (Thermo Scientific, качалка с платформой Vari Mix) с установкой скорости на 10 для инкубации в течение 16-18 часов при комнатной температуре до высвобождения протопластов. После инкубации каплю культуры клеток проверяли под микроскопом для проверки качества расщепления, и расщепленные клетки фильтровали через сито для клеток 100 мкм, промывали 10 мл среды W5 [2мМ MES (pH 5,7), 205 мМ NaCl, 167 мМ CaCl₂, 6,7 мМ KCl], с последующей фильтрацией через сита для клеток 70 мкм и 40 мкм. Сита 100 мкм и 40 мкм промывали 10 мл среды W5. Фильтрованные протопласты вместе со средой для промывки собирали в 50 мл пробирку для центрифугирования, и конечный объем составлял приблизительно 40 мл. Затем 8 мл «тяжелого градиентного раствора» [500 мМ сахароза, 1 мМ CaCl₂, 5 мМ MES (pH 6,0)] медленно добавляли на дно раствора протопластов/фермента, центрифугировали на центрифуге с качающимся бакет-ротором в течение 15 минут при 300-350×g. После центрифугирования приблизительно 7-8 мл из полосы протопластов отбирали, промывали 25 мл W5 и центрифугировали в течение 15 минут при 180-200×g. Затем протопласты ресуспендировали в 10 мл раствора MMG [4 мМ MES (pH 5,7), 0,6 M маннит, 15 мМ MgCl₂]. Протопласты подсчитывали с использованием гемоцитометра или проточного цитометра и разводили до 1,67 миллионов на мл с использованием MMG.

Трансформация протопластов, полученных из суспензионной культуры Zea mays c.v. HI-II, с использованием PEG

Приблизительно по 0,5 миллионов протопластов (300 мкл в растворе MMG) переносили в 2 мл пробирки и смешивали с 40 мкл ДНК, и инкубировали при комнатной температуре в течение 5-10 минут. Затем добавляли 300 мкл свежеприготовленного раствора PEG [36% PEG 4000, 0,3 М маннит, 0,4 М CaCl₂], и смесь инкубировали при комнатной температуре 15-20 минут с периодическим перемешиванием посредством переворачивания. После инкубации медленно добавляли 1 мл W5 для промывки и осторожно перемешивали, и протопласты осаждали посредством центрифугирования при 180-200×g в течение 15 минут. Осадок ресуспендировали в 1 мл среды WI [4 мм MES (pH 5,7), 0,6 М маннит, 20 мМ KCl], и содержащую протопласты пробирку заворачивали в алюминиевую фольгу и инкубировали при комнатной температуре ночь в течение приблизительно 16 часов.

Трансформация ZFN и донором

Для каждого из выбранных геномных локусов из таблицы 5 протопласты Zea mays трансфицировали контрольной конструкцией для экспрессии гена yfp, ZFN отдельно, донором отдельно и смесью ZFN и донора в соотношении 1:10 (по массе). Общее количество ДНК для трансфекции 0,5 миллиона протопластов составляло 80 мкг. Все обработки проводили в 3 или 6 повторах. Контрольная конструкция для экспрессии гена yfp представляла собой pDAB8393 (фигура 11), содержащую экспрессирующие генные кассеты промотор убиквитина 1 Zea mays - последовательность, кодирующая желтый флуоресцентный белок - 3'UTR Per5 Zea mays и промотор актина 1 риса - последовательность, кодирующая pat - 3'UTR липазы Zea mays. Для обеспечения соответствующего общего количества ДНК для трансфекции, либо сперму лосося, либо плазмиду, содержащую ген yfp, использовали в качестве наполнителя при необходимости. В типичном эксперименте по нацеливанию, проводили трансфекцию с 4 мкг ZFN отдельно или с 36 мкг донора, и соответствующее количество ДНК спермы лосося или плазмид pUC19 добавляли для доведения общего количества ДНК до 80 мкг. Включение плазмиды, экспрессирующей ген yfp, в качестве наполнителя позволяет оценку качества трансфекции среди множества локусов и повторных обработок.

Пример 5: Расщепление геномных локусов в Zea mays посредством нуклеазы с цинковыми пальцами

Трансфицированные ZFN протопласты Zea mays c.v. Hi-II собирали через 24 часа после трансфекции посредством центрифугирования при 1600 об/мин в 2 мл пробирках EPPENDORF™, и супернатант полностью удаляли. Геномную ДНК экстрагировали из осадков протопластов с использованием QIAGEN PLANT DNA EXTRACTION KIT™ (Qiagen, Valencia, CA). Выделенную ДНК ресуспендировали в 50 мкл воды и концентрацию определяли с использованием NANODROP^® (Invitrogen, Grand Island, NY). Целостность ДНК оценивали путем разделения образцов электрофорезом в геле из 0,8% агарозы. Все образцы нормализовали (20-25 нг/мкл) для амплификации ПЦР, чтобы получить ампликоны для секвенирования (Illumina, Inc., SanDiego, CA). Праймеры для ПЦР со штрих-кодами для амплификации областей, охватывающих каждую тестируемую последовательность узнавания ZFN из обработанных и контрольных образцов, конструировали и закупали из IDT (Coralville, IA, очищенные ВЭЖХ). Оптимальные условия амплификации идентифицировали посредством градиентной ПЦР с использованием 0,2 мкМ соответствующих праймеров со штрих-кодами ACCUPRIME PFX SUPERMIX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) и 100 нг матричной геномной ДНК в реакционной смеси объемом 23,5 мкл. Параметры циклов представляли собой первоначальную денатурацию при 95°C (5 мин), с последующими 35 циклами денатурации (95°C, 15 с), отжига (55-72°C, 30 с), удлинения (68°C, 1 мин) и конечного удлинения (68°C, 7 мин). Продукты амплификации анализировали в 3,5% агарозных гелях с TAE, и соответствующую температуру отжига для каждой комбинации праймеров определяли и использовали для амплификации ампликонов из контрольных и обработанных ZFN образцов, как описано выше. Все ампликоны очищали в 3,5% агарозных гелях с TAE, элюировали в воде, и концентрации определяли с использованием NANODROP™. Для секвенирования нового поколения 100 нг ампликона ПЦР из обработанных ZFN и соответствующих не обработанных контрольных протопластов маиса объединяли вместе и секвенировали с использованием секвенирования нового поколения Ilumina (NGS).

Анализировали активность расщепления соответствующих ZFN в каждом из выбранных оптимальных геномных локусов Zea mays. Короткие ампликоны, охватывающие участки расщепления ZFN, из обработанных ZFN и контрольных протопластов амплифицировали с геномной ДНК и подвергали NGS Illumina. Индуцированное ZFN расщепление или двухцепочечный разрыв ДНК устраняли с помощью клеточного пути репарации NHEJ посредством вставки или делеции нуклеотидов (инделов) в участке расщепления, и присутствие инделов в участке расщепления, таким образом, являлось показателем активности ZFN, и его определяли посредством NGS. Активность расщепления специфичных для мишени ZFN оценивали как количество последовательностей с инделами на 1 миллион высококачественных последовательностей с использованием программного обеспечения для анализа NGS (публикация патента 2012-0173153, анализ данных последовательностей ДНК). (фигура 12). Активность в диапазоне в 5-100 раз выше контрольной наблюдали для выбранных геномных локусов-мишеней Zea mays и далее подтверждали посредством выравнивания последовательностей, которое демонстрировало разнообразные отпечатки инделов в каждом участке расщепления ZFN. Эти данные позволяют предполагать, что выбранные геномные локусы Zea mays были подвержены расщеплению ZFN. Дифференциальная активность в отношении каждой мишени отражала состояние ее хроматина и подверженность расщеплению, а также эффективность экспрессии каждой ZFN.

Пример 6: Быстрый анализ нацеливания в отношении интеграции полинуклеотидного донора

Валидацию нацеливания универсальной донорной полинуклеотидной последовательности на выбранные геномные локусы-мишени Zea mays посредством вставки донора, опосредуемого соединением негомологичных концов (NHEJ), проводили с использованием полупромышленного способа анализа с использованием способа анализа для быстрого тестирования. Для каждого выбранного геномного локуса-мишени Zea mays тестировали 3-6 типов дизайна ZFN, и нацеливание оценивали путем измерения опосредуемого ZFN расщепления с использованием способов секвенирования нового поколения (фигура 12) и встраивания донора с использованием внутренней-внешней ПЦР участков стыковки (фигура 13). Выбранные геномные локусы Zea mays, которые были положительными в обоих анализах, идентифицированы в качестве поддающегося нацеливанию локуса.

Анализ встраивания донора посредством ZFN с использованием быстрого тестирования

Для определения того, можно ли осуществлять нацеливание на геномные локусы-мишени Zea mays для вставки донора, конструкцию ZFN и универсальную донорную полинуклеотидную конструкцию совместно доставляли в протопласты маиса, которые инкубировали в течение 24 часов перед экстракцией геномной ДНК для анализа. Если экспрессируемая ZFN являлась способной расщеплять участок связывания-мишень как в выбранных геномных локусах-мишенях Zea mays, так и в доноре, то линеаризованный донор затем мог встраиваться в расщепленный участок-мишень в геноме маиса посредством пути соединения негомологичных концов (NHEJ). Подтверждение направленного встраивания в выбранные геномные локусы-мишени Zea mays проводили на основе способа «внутренней-внешней» ПЦР, где «внутренний» праймер узнает последовательность в нативном оптимальном геномном локусе, и «внешний» праймер связывается с последовательностью в донорной ДНК. Праймеры конструировали таким образом, что, только когда донорная ДНК встраивалась в выбранный геномный локус-мишень Zea mays, в анализе с использованием ПЦР получали продукт амплификации ожидаемого размера. Анализ с использованием внутренней-внешней ПЦР проводили как в 5'-, так и в 3'-концах точки стыковки вставки. Праймеры, использованные для анализа интегрированных полинуклеотидных донорных последовательностей, представлены в таблице 9.

Встраивание донора посредством ZFN в локусы-мишени с использованием гнездовой «внутренней-внешней» ПЦР

Все амплификации ПЦР проводили с использованием набора TAKARA EX TAQ HS™ (Clonetech, Mountain View, CA). Первую внутреннюю-внешнюю ПЦР проводили в конечном реакционном объеме 20 мкл, содержащем 1X буфер TAKARA EX TAQ HS™, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкМ «внешний» праймер, 0,05 мкМ «внутренний» праймер (сконструированный из универсальной донорной кассеты, описанной выше), 0,75 единиц полимеразы TAKARA EX TAQ HS™ и 10 нг экстрагированной ДНК протопластов маиса. Затем реакцию проводили с использованием программы ПЦР, состоящей из 94°C в течение 2 мин, 20 циклов при 98°C в течение 12 с и 68°C в течение 2 мин, с последующими 72°C в течение 10 мин и поддержанием при 4°C. Конечные продукты ПЦР разделяли в агарозном геле вместе с 1KB PLUS DNA LADDER™ (Life Technologies, Grand Island, NY) для визуализации.

Гнездовую внутреннюю-внешнюю ПЦР проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 1X буфер TAKARA EX TAQ HS™, 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкМ «внешний» праймер (таблица 9), 0,1 мкМ «внутренний» праймер (сконструированный из универсальной донорной кассеты, описанной выше, таблица 10), 0,75 единицы полимеразы TAKARA EX TAQ HS™ и 1 мкл первого продукта ПЦР. Затем реакцию проводили с использованием программы ПЦР, состоящей из 94°C в течение 2 мин, 31 цикла при 98°C в течение 12 с, 66°C в течение 30 с и 68°C в течение 45 с, с последующими 72°C в течение 10 мин и поддержанием при 4°C. Конечные продукты ПЦР разделяли в агарозном геле вместе с 1KB PLUS DNA LADDER™ (Life Technologies, Grand Island, NY) для визуализации.

Использование анализа посредством внутренней-внешней ПЦР в системе нацеливания на протопласты являлось особенно затруднительным, поскольку для трансфекции использовали большие количества плазмидной ДНК, и большое количество ДНК оставалось в системе нацеливания на протопласты, а затем экстрагировалось с клеточной геномной ДНК. Остаточная плазмидная ДНК может разбавлять относительную концентрацию геномной ДНК и снижать общую чувствительность обнаружения, а также может являться существенной причиной неспецифических, аберрантных реакций ПЦР. Индуцируемая ZFN вставка донора на основе NHEJ обычно происходит либо в прямой, либо в обратной ориентации. При анализе ДНК посредством внутренней-внешней ПЦР для встраивания в прямой ориентации часто выявляют ложноположительные полосы, возможно, вследствие общих областей гомологии вокруг участка связывания ZFN в мишени и доноре, которые могут привести к гибридизации праймеров и удлинению невстроенной донорной ДНК в процессе амплификации. Ложноположительных результатов не наблюдали в анализах, исследующих продукты вставки в обратной ориентации, и таким образом, весь анализ направленной интеграции донора проводили для изучения обратной вставки донора в RTA. Для дальнейшего увеличения специфичности и уменьшения фона, также использовали способ гнездовой ПЦР. В способе гнездовой ПЦР использовали вторую реакцию ПЦР, амплифицирующую более короткую область внутри первого продукта амплификации первой реакции ПЦР. С применением асимметричных количеств «внутренних» и «внешних» праймеров далее оптимизировали ПЦР участков стыковки для быстрого анализа нацеливания в выбранные геномные локусы.

Результаты анализа внутренней-внешней ПЦР визуализировали в агарозном геле. Для всех выбранных геномных локусов Zea mays, приведенных в таблице 12, «обработка ZFN+донор» обеспечивала полосу близкого к ожидаемому размера на 5'- и 3'-концах. Обработка контрольной ZFN или донором отдельно приводила к отрицательным результатам ПЦР, что позволяет предполагать, что способ специфически оценивал интеграцию донора в участке-мишени по меньшей мере 72 оптимальных внегенных геномных локусов маиса. Все обработки проводили в 3-6 повторах, и присутствие ожидаемого продукта ПЦР в множестве реплик (>2 на обоих концах) использовали для подтверждения нацеливания. Вставка донора посредством NHEJ часто приводит к побочным продуктам с более низкой интенсивностью, которые образовывались вследствие процессинга линеаризованных концов в участках ZFN мишени и/или донора. Кроме того, обнаружено, что различные ZFN приводили к различным уровням эффективности направленной интеграции, где некоторые из ZFN обеспечивали устойчивые высокие уровни встраивания донора, некоторые ZFN обеспечивали менее устойчивые уровни интеграции донора, а другие ZFN приводили к отсутствию интеграции. В целом, для каждого из выбранных геномных локусов-мишеней Zea mays, которые тестировали, продемонстрирована направленная интеграция в репрезентативные геномные локусы-мишени Zea mays посредством одной или нескольких ZFN, что подтверждает, что каждый из этих локусов поддавался нацеливанию. Более того, каждый из выбранных геномных локусов-мишеней Zea mays являлся пригодным для точной трансформации генами. Валидацию этих выбранных геномных локусов-мишеней Zea mays повторяли несколько раз с получением каждый раз сходных результатов, таким образом, подтверждая воспроизводимость процесса валидации, который включает дизайн и конструирование плазмид, трансформацию протопластов, обработку образцов и анализ образцов.

Заключение

Донорную плазмиду и одну ZFN, сконструированную для специфического расщепления выбранных геномных локусов-мишеней Zea mays, трансфицировали в протопласты Zea mays c.v. Hi-II и через 24 часа собирали клетки. Анализ геномной ДНК, выделенной из контрольных, обработанных ZFN и обработанных ZFN с донором протопластов, посредством внутренней-внешней ПЦР участков стыковки, показал направленную вставку универсального донорного полинуклеотида в результате расщепления геномной ДНК посредством ZFN (таблица 12). Эти исследования показывают, что универсальную донорную полинуклеотидную систему можно использовать для оценки нацеливания в эндогенные участки и для скрининга ZFN-кандидатов. Наконец, быстрый анализ нацеливания на основе протопластов и новые системы универсальных донорных полинуклеотидов обеспечивают быстрый способ скрининга геномных мишеней и ZFN для попыток точной инженерии генома в растениях. Способы можно расширять до оценки сайт-специфического расщепления и встраивания донора в геномных мишенях в любой представляющей интерес системе с использованием любой нуклеазы, которая индуцирует двухцепочечные и одноцепочечные разрывы ДНК.

Пример 7: Экспрессия полинуклеотидной донорной последовательности внутри геномных локусов Zea mays

Случайным образом интегрированные события трансформации маиса получали посредством трансформации плазмидами pDAB105817 и pEPS1027, содержащими трансген aad-1, описанный в Патенте США No. 7838733. (фигура 14). Получили большое количество событий и 1027 стабильных событий анализировали для определения того, содержало ли какое-либо из событий случайным образом интегрированный трансген в выбранных геномных локусах-мишенях Zea mays, способом анализа геномного фланкирования, описанного в Патентной заявке США No. 2012/0258867. Таким образом, хромосомная локализация интегрированного трансгена в 223 событиях картирована в геноме Zea mays. Данные, таблица 13, указывают на то, что для хромосомной локализации интегрированных трансгенов показана интеграция внутри гипометилированных областей (45-73%) и в транскрипционных единицах (промотор/ген/3'UTR) ниже областей по меньшей мере 1 т.п.о. (60%).

Картированные события далее анализировали с использованием критериев прогнозирования оптимальных локусов, описанных в примерах 1 и 2 (гипометилированные области, уникальные области, внегенные, без повторов, вблизи генов в окружении 40 т.п.о., с признаками активной экспрессии в корнях/побегах, с признаками рекомбинации) и несколько случайным образом интегрированных событий идентифицировали в выбранных геномных локусах-мишенях Zea mays (таблица 14). Например, нацеливание внутри выбранных геномных локусов-мишеней Zea mays optimal_loci_232222 и optimal_loci_127268 показано с использованием анализа быстрого тестирования и посредством нацеливания in planta, соответственно.

Средняя длина экспериментальных выбранных геномных локусов-мишеней Zea mays составляла приблизительно 1 т.п.о., и различные степени экспрессии aad-1 наблюдали в каждом из выбранных геномных локусов-мишеней Zea mays (таблица 14). Анализ средней экспрессии aad-1 проводили на стадии трансформации растения Ti посредством анализа ПЦР с детекцией в реальном времени выделенного материала трансгенного листа. Таким образом, события случайной интеграции в геноме Zea mays являлись способными к экспрессии трансгена внутри экспериментальных выбранных геномных локусов-мишеней Zea mays.