Агонисты рецепторов нейротрофинов и их применение в качестве лекарственных средств - RU2606622C2

Чертежи

Показать все 20 чертежа(ей)

Описание

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по более ранней дате подачи предварительной заявки на патент США №61/378823, поданной 31 августа 2010 года, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.

Область техники

[0002] Настоящее изобретение относится к области терапии неврологических, психических расстройств и старения. В частности, оно относится к нейропротекторному эффекту низкомолекулярных агонистов рецепторов нейротрофинов (фактора роста нервов (ФРН, NGF) или нейротрофического фактора головного мозга (BDNF)) и применению указанных агонистов в качестве лекарственных средств.

Уровень техники

[0003] Старение, неврологические и психические расстройства вызывают гибель и повреждение нервных клеток. Частые и соответствующие повреждения нервной системы могут возникать, среди прочего, в результате дегенерации нейронов, ишемии, воспаления, иммунных ответов, травмы и рака. Как следствие этого, нервные клетки могут погибнуть в течение минут или часов или пережить это первичное повреждение в пораженном состоянии, которое активирует нейродегенерацию и, равным образом, приводит к клеточной гибели.

[0004] С учетом важной роли нервной системы в обеспечении основных двигательных функций и восприятия, существует заинтересованность в поиске терапевтических средств для защиты нервной системы.

[0005] Нейропротекция ориентирована на сохранение, восстановление, лечение или регенерацию нервной системы, ее клеток, структуры и функции (Vajda et al., 2002). Целью нейропротекции является предотвращение или минимизация эффектов первоначального повреждения нервной системы или предотвращение или минимизация последствий эндогенных или экзогенных вредоносных процессов, вызывающих повреждение аксонов, нейронов, синапсов и дендритов.

[0006] В общем случае стратегии лечения часто основаны на модулировании единственного предполагаемого поражающего фактора. Несмотря на то, что была показана эффективность таких способов лечения в весьма ограниченных животных моделях, они с гораздо меньшей вероятностью окажутся эффективными в более сложном случае расстройства у человека, включающем более вариабельные степени тяжести поражения в генетически разнообразной популяции (Faden and Stoica, 2007). Важно отметить, что поскольку предполагаемые механизмы гибели нейронов являются сложными и многообразными, например, окислительный стресс, митохондриальная дисфункция, агрегация белков, апоптоз и воспаление (Youdim et al., 2005), желательно получение индивидуальных соединений, обладающих полипотентным действием на множественные механизмы поражения.

[0007] В стадии исследования находятся несколько нейропротекторных лекарственных средств, включая следующие классы: противовоспалительные агенты, NMDA-антагонисты (антагонисты N-метил-D-аспартатного (NMDA) рецептора), АМРА-антагонисты (антагонисты рецептора α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМРА)), дексанабинол, блокаторы натриевых каналов, тиреотропин-рилизинг-гормон (ТРГ), факторы роста, глюкокортикоиды, кофеинол, антагонисты опиоидных рецепторов, ингибиторы апоптоза, ловушки/скэвенджеры свободных радикалов, эритропоэтин, блокаторы кальциевых каналов, сульфат магния и статины.

[0008] Способность этих фармакологических агентов ограничивать вторичное биохимическое повреждение и гибель клеток не оправдала надежд (Faden and Stoica, 2007).

[0009] Нейротрофины представляют собой факторы роста, которые регулируют развитие и поддержание периферической и центральной нервных систем (Lewin and Barde, 1996). Фактор роста нервов (ФРН) является первым обнаруженным и лучше всего изученным представителем семейства нейротрофинов, включающего другие структурно родственные белки, такие как нейротрофический фактор головного мозга (BDNF). Фактор роста нервов (ФРН) представляет собой гомодимерный белок из семейства нейротрофинов, который играет ключевую роль в выживаемости, дифференцировке и росте нейронов (Levi-Montalcini, 1987) и связывает два различных клеточных рецептора; тирозинкиназный рецептор TrkA и рецептор р75 (Chao, 2003). Связывание ФРН с TrkA активирует внутреннюю тирозинкиназную активность рецептора, вызывая фосфорилирование тирозина TrkA и связанных партнеров в сигнальном пути, что приводит к стимулированию выживания или дифференцировки клеток (Kaplan and Miller, 2000). Рецептор р75 является представителем суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли. В зависимости от клеточного окружения и типа лиганда, р75 может действовать в качестве трансдуктора сигналов выживания, апоптоза или дифференцировки (Barker, 1998; Rabizadeh et al., 1999; Zaccaro et al., 2001; Saragovi and Zaccaro, 2002). Соответственно, в зависимости от метаболического пути, связывание либо с рецептором TrkA, либо с рецептором р75 может запускать сигналы, в зависимости от рассматриваемого типа клеток, непонятным образом связанные с дифференцировкой и/или выживаемостью клеток. Нейротрофины действуют посредством двух основных сигнальных путей: пути фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K)-AKT и пути митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK)-MEK (оба пути вовлечены в ингибирование апоптоза). Нейротрофические факторы, как известно, действуют также на зрелые нейроны и, в частности, на пораженные и дегенеративные клетки (Lindvall et al. 1994; Tuszynski and Gage 1995; Lykissas et al. 2007; Song et al. 2009).

[0010] Потенциал ФРН в качестве терапевтического средства для ряда заболеваний был показан несколькими исследователями. Такие заболевания включают нейродегенеративные расстройства, воспаления нервов и некоторые типы рака, рассеянный склероз, нейромиелит зрительного нерва, боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, атаксию Фридрейха, болезнь Хантингтона, деменцию с тельцами Леви, спинальную мышечную атрофию, большое депрессивное расстройство, шизофрению, глаукому или периферические невропатии (диабетическую невропатию или невропатию при СПИДе) (Longo et al, 2007; Schulte-Herbruggen, 2007; Shi, 2007; Hellveg, 2008; Shoval, 2005; Apfel, 2002; Anand, 2004). ФРН обладает значительными иммунорегуляторными свойствами при воспалениях в ЦНС, участвуя в сохранении иммунной привилегии ЦНС (Villoslada and Genain, 2004). В модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) на мартышках ФРН подавлял развитие клинических симптомов при интрацеребровентрикулярном введении путем непрерывной инфузии, по-видимому, вследствие своей способности индуцировать иммуносупрессивное микроокружение в ЦНС, которое приводит к пониженной инфильтрации ЦНС (Villoslada et al., 2000). Тот факт, что ФРН вызывает подавление иммунного ответа при аутоиммунной демиелинизации в дополнение к его нейропротекторным свойствам в нейронах и олигодендроцитах делает его отличным кандидатом для лечения воспалительных заболеваний ЦНС, таких как рассеянный склероз (PC). Однако ФРН не является идеальным кандидатом на роль лекарственного средства из-за его неспособности проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) (Poduslo and Curran, 1996), короткого периода полувыведения и побочных эффектов (Apfel, 2002). Было приложено много усилий для поиска малых молекул, обладающих активностью агонистов рецепторов ФРН, с улучшенными фармакокинетическими свойствами и меньшими побочными эффектами. Для достижения этой цели были опробованы различные подходы (Poduslo and Curran, 1996; Longo et al., 1997; Maliartchouk et al., 2000a; Maliartchouk et al., 2000b; Peleshok and Saragovi, 2006).

[0011] Таким образом, существует насущная потребность в обеспечении лекарственных средств, в частности миметиков ФРН, с нейропротекторными свойствами, имеющих предпочтительно полипотентное действие, но без присущих ФРН недостатков. Авторами настоящего изобретения было разработано семейство соединений, отличных от уже известных в данной области техники. Семейство соединений согласно изобретению представляет собой пептидомиметики нейротрофинов (ФРН, BDNF) и агонисты специфичных рецепторов TrkA, TrkB и р75. Некоторые из соединений согласно изобретению стимулируют, например, выживание клеток даже в более высокой степени, чем сам ФРН. Соединения согласно изобретению рассматриваются в качестве пептидомиметиков нейротрофинов, и все они имеют общую структуру N-алкилглициновых тримеров.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] Настоящее изобретение относится к применению пептоидных соединений нижеприведенных Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей и пролекарств в качестве агонистов рецепторов нейротрофинов и, в частности, рецепторов фактора роста нервов (ФРН) и рецепторов нейротрофического фактора головного мозга (BDNF).

[0013] Соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, ранее не были описаны в литературе. Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к новым соединениям Формул I-V, а также их фармацевтически приемлемым солям и пролекарствам.

[0014] Другой аспект изобретения относится к применению соединений любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей и пролекарств в качестве агонистов рецепторов ФРН. Другой аспект изобретения относится к применению соединений любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей и пролекарств в качестве агонистов рецепторов BDNF.

[0015] Согласно следующему аспекту изобретения предложено соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство для применения в качестве лекарственного средства. В одном аспекте изобретения лекарственный препарат предназначен для применения для предотвращения или лечения гибели или повреждения нервных клеток. В одном аспекте изобретения лекарственное средство предназначено для применения для нейропротекции. В одном аспекте изобретения лекарственное средство предназначено для применения для регенерации нервных клеток. В одном аспекте изобретения лекарственное средство предназначено для применения для усиления когнитивных функций. В одном аспекте лекарственное средство предназначено для применения для предотвращения или лечения неврологического или психического заболевания. В одном аспекте изобретения лекарственное средство предназначено для применения для предотвращения или лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из неврологического заболевания, предпочтительно нейродегенеративного расстройства (такого как боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, атаксия Фридрейха, болезнь Хантингтона, деменция с тельцами Леви и спинальная мышечная атрофия), воспаления нервов (такого как рассеянный склероз и нейромиелит зрительного нерва), большого депрессивного расстройства, шизофрении, глаукомы, периферической невропатии (такой как диабетическая невропатия или невропатия при СПИДе) и рака (такого как глиобластома, астроцитома, медуллобластома, невринома, нейробластома, менингиома, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак предстательной железы, лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, остеосаркома, гепатоцеллюлярная карцинома, карцинома яичника, аденокарцинома легкого и карцинома пищевода).

[0016] Согласно следующему аспекту изобретения предложено соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство для применения в качестве лекарственного средства для лечения рассеянного склероза.

[0017] Согласно следующему аспекту изобретения предложено соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство для применения в качестве лекарственного средства, при этом лекарственное средство представляет собой лекарственное средство для лечения нейродегенеративных заболеваний.

[0018] Согласно следующему аспекту изобретения предложено соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство для применения в качестве лекарственного средства, при этом лекарственное средство представляет собой иммуномодулятор.

[0019] Согласно следующему аспекту изобретения предложено соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство для применения в качестве лекарственного средства, при этом лекарственное средство обладает комбинированным нейропротекторным и иммуномодулирующим действием.

[0020] Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства и фармацевтически приемлемый носитель.

[0021] Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения гибели или повреждения нервных клеток.

[0022] Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства для получения лекарственного средства для обеспечения нейропротекции.

[0023] Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства для получения лекарственного средства для регенерации нервных клеток.

[0024] Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения неврологического заболевания или психического заболевания.

[0025] Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из неврологического заболевания, предпочтительно нейродегенеративного расстройства (такого как боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, атаксия Фридрейха, болезнь Хантингтона, деменция с тельцами Леви и спинальная мышечная атрофия), воспаления нервов (такого как рассеянный склероз и нейромиелит зрительного нерва), большого депрессивного расстройства, шизофрении, глаукомы, периферической невропатии (такой как диабетическая невропатия или невропатия при СПИДе) и рака (такого как глиобластома, астроцитома, медуллобластома, невринома, нейробластома, менингиома, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак предстательной железы, лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, остеосаркома, гепатоцеллюлярная карцинома, карцинома яичника, аденокарцинома легкого и карцинома пищевода).

[0026] Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения рассеянного склероза.

[0027] Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства для получения нейрорегенеративного лекарственного средства.

[0028] Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства для получения иммуномодулятора.

[0029] Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства для получения лекарственного средства, обладающего комбинированным нейропротекторным и иммуномодулирующим действием.

[0030] Согласно следующему аспекту изобретения предложено применение соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства для получения нейростимулирующего лекарственного средства.

[0031] Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ предотвращения или лечения гибели или повреждения нервных клеток, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

[0032] Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ обеспечения нейропротекции, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

[0033] Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ обеспечения иммуномодулирования, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

[0034] Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ регенерации нервных клеток, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

[0035] Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ предотвращения или лечения заболевания, выбранного из группы, состоящей из неврологического заболевания, предпочтительно нейродегенеративного расстройства (такого как боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, атаксия Фридрейха, болезнь Хантингтона, деменция с тельцами Леви и спинальная мышечная атрофия), воспаления нервов (такого как рассеянный склероз и нейромиелит зрительного нерва), большого депрессивного расстройства, шизофрении, глаукомы, периферической невропатии (такой как диабетическая невропатия или невропатия при СПИДе) и рака (такого как глиобластома, астроцитома, медуллобластома, невринома, нейробластома, менингиома, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак предстательной железы, лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, остеосаркома, гепатоцеллюлярная карцинома, карцинома яичника, аденокарцинома легкого и карцинома пищевода), включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

[0036] Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ предотвращения или лечения рассеянного склероза, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона или глаукомы, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства или эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

[0037] Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ лечения заболевания, восприимчивого к стимулированию активности нейротрофинов или рецептора нейротрофинов, у млекопитающего, страдающего от недостаточного стимулирования указанной активности, включающий введение эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства.

[0038] Согласно следующему аспекту изобретения предложено соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство для применения для стимулирования активности нейротрофинов или рецептора нейротрофинов.

[0039] Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ стимулирования активности рецепторов нейротрофинов у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. В одном варианте реализации рецептор нейротрофинов представляет собой рецептор TrkA, рецептор TrkB или рецептор р75.

[0040] Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ лечения заболевания, восприимчивого к стимулированию активности фактора роста нервов или рецептора фактора роста нервов, у млекопитающего, страдающего от недостаточного стимулирования указанной активности, включающий введение эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства.

[0041] Согласно следующему аспекту изобретения предложено соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство для применения для стимулирования активности фактора роста нервов или рецептора фактора роста нервов.

[0042] Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ стимулирования активности рецептора фактора роста нервов у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. В одном варианте реализации рецептор фактора роста нервов представляет собой рецептор TrkA или рецептор р75.

[0043] Согласно следующему аспекту изобретения предложен способ лечения заболевания, восприимчивого к стимулированию активности нейротрофического фактора головного мозга или рецептора нейротрофического фактора головного мозга, у млекопитающего, страдающего от недостаточного стимулирования указанной активности, включающий введение эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства.

[0044] Согласно следующему аспекту изобретения предложено соединение любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство для применения в стимулировании активности нейротрофического фактора головного мозга или рецептора нейротрофического фактора головного мозга.

[0045] Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ стимулирования активности рецептора нейротрофического фактора головного мозга у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. В одном варианте реализации рецептор фактора роста нервов представляет собой рецептор TrkB или рецептор р75.

[0046] Согласно следующему аспекту настоящего изобретения предложен способ получения фармацевтической композиции, включающий смешивание эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства с фармацевтически приемлемым носителем.

[0047] Дополнительные варианты реализации и преимущества изобретения частично изложены в описании ниже и следуют из описания или могут быть обнаружены при реализации изобретения. Варианты реализации и преимущества изобретения будут осуществлены и достигнуты посредством элементов и комбинаций, отдельно указанных в прилагаемой формуле изобретения.

[0048] Следует понимать, что и вышеприведенное краткое описание, и последующее подробное описание представлены исключительно в качестве примера и пояснения и не ограничивают заявленное изобретение.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ/ФИГУР

[0049] ФИГ.1 иллюстрирует результаты согласно Примеру 2 для соединений G79, G80 и G81 в анализе влияния величины дозы на дифференцировку на линии клеток PC12. На ФИГ.1A показаны изображения клеток PC12, дифференцировавшихся в присутствии соединения G79. На ФИГ.1B показаны изображения клеток PC12, дифференцировавшихся в присутствии соединения G80. На ФИГ.1C показаны изображения клеток PC12, дифференцировавшихся в присутствии соединения G81. ФИГ.1D иллюстрирует количество дифференцированных клеток в анализе влияния величины дозы на дифференцировку. ФИГ.1E иллюстрирует процент дифференцированных клеток, рассчитанный относительно ФРН-индуцированной дифференцировки. Данные представляют собой средние значения ± среднеквадратическое отклонение из по меньшей мере трех экспериментов, каждый из которых был проведен в двух повторностях.

[0050] ФИГ.2 иллюстрирует действие соединений G79, G80 и G81 по стимулированию выживания клеток RN22. Представлены средние значения ± среднеквадратическая ошибка из трех экспериментов, каждый из которых был проведен в двух повторностях. *p<0,05, **p<0,01 (дисперсионный анализ; ANOVA) относительно контроля, подвергнутого стрессу.

[0051] ФИГ.3 иллюстрирует действие соединений G79, G80 и G81 в анализе стимулирования секреции (ФИГ.3A), в анализе синергической активности (ФИГ.3B), в анализе активации TrkA (ФИГ.3C), в анализе ингибирования передачи сигналов в присутствии ингибитора PI3K LY294002 (ФИГ.3D) и в анализе ингибирования передачи сигналов в присутствии ингибитора киназы MAPK PD98059 (ФИГ.3E). ФИГ.3F-3J иллюстрируют действие, показанное на ФИГ.3A-3E, соответственно, в виде процентов дифференцированных клеток, рассчитанных относительно ФРН-индуцированной дифференцировки.

[0052] ФИГ.4 иллюстрирует результаты для соединения G79 в модели глаукомы. ФИГ.4A иллюстрирует подсчет ганглионарных клеток сетчатки для контроля, плацебо, ФРН в концентрации 200 мкг/мл, соединения G79 в концентрации 200 мкг/мл и соединения G79 в концентрации 400 мкг/мл. ФИГ.4B иллюстрирует срезы сетчатки после обработки контролем, плацебо, ФРН в концентрации 200 мкг/мл, соединением G79 в концентрации 200 мкг/мл и соединением G79 в концентрации 400 мкг/мл. ФИГ.4C иллюстрирует подсчет ганглионарных клеток сетчатки для контроля, плацебо, соединения G79 в концентрации 200 мкг/мл, противоглаукомного препарата Тимолол и соединения G79 в концентрации 200 мкг/мл и Тимолола.

[0053] ФИГ.5 иллюстрирует результаты для соединений G79, G80 и G81 в модели болезни Паркинсона (ФИГ.5A) и в модели окислительного стресса (ФИГ.5B).

[0054] ФИГ.6 иллюстрирует полученные методом флуоресцентной детекции изображения результатов анализа посредством Вестерн-блоттинга клеток PC12, обработанных соединением G79 в концентрации 100 нг/мл.

[0055] ФИГ.7 иллюстрирует внутриклеточный сигнальный путь, активируемый путем фосфорилирования рецепторной тирозинкиназы (РТК).

[0056] ФИГ.8 иллюстрирует действие соединения G79 и BDNF на уровни активации фосфопротеинов ATF-2, HSP-27, JNK и STAT-1, исследованное с применением технологии Luminex.

[0057] ФИГ.9 иллюстрирует действие соединения G79 в цитометрическом анализе связывания согласно Примеру 13. ФИГ.9A иллюстрирует среднеканальную флуоресценцию (СКФ) в анализе конкурентного связывания на клетках PC12 (ФРН/G79-ФИТЦ). ФИГ.9B иллюстрирует СКФ в анализе конкурентного связывания на клетках PC12 (ФРН/G79-ФИТЦ) с применением антител против TrkA. ФИГ.9C иллюстрирует СКФ в анализе конкурентного связывания на клетках PC12 (ФРН/G79-ФИТЦ) с применением антител против р76. ФИГ.9D иллюстрирует СКФ в анализе конкурентного связывания на клетках SH-SY5Y (BDNF/G79-ФИТЦ).

[0058] ФИГ.10 иллюстрирует результаты для соединений G79, G80 и G81 в модели бокового амиотрофического склероза (БАС) in vitro.

[0059] ФИГ.11 иллюстрирует результаты для соединения G79, амида гарциниевой кислоты (Gambogic amide) и препарата Ксалипроден при профилактическом применении в модели PC in vivo после и.п. введения соединения G79 или амида гарциниевой кислоты (ФИГ.11A) и после перорального введения Ксалипродена (ФИГ.11B).

[0060] ФИГ.12 иллюстрирует результаты для соединения G79, амида гарциниевой кислоты и препарата Ксалипроден при лечебном применении в модели PC in vivo после перорального введения.

[0061] ФИГ.13 иллюстрирует действие соединения G79 в индукции фермента индуцибельной NO-синтазы (iNOS) в течение 48 часов.

[0062] ФИГ.14 иллюстрирует результаты для соединения G79 в модели нейровоспаления in vitro. ФИГ.14A иллюстрирует выработку ФНОα в органотипической культуре; мозжечка, а ФИГ.14B иллюстрирует выработку ИЛ-1β в органотипической культуре мозжечка.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0063] Один аспект изобретения основан на применении соединений Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей и пролекарств в качестве агонистов рецепторов нейротрофинов и, в особенности, агонистов рецепторов фактора роста нервов (ФРН) и рецепторов нейротрофического фактора головного мозга (BDNF). Благодаря указанному свойству, соединения Формул I-V и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства подходят для предотвращения или лечения заболеваний, отвечающих на стимулирование рецепторов нейротрофинов и, в особенности, фактора роста нервов или рецептора фактора роста нервов или нейротрофического фактора головного мозга или рецептора нейротрофического фактора головного мозга.

[0064] Соединения любой из Формул I-V демонстрируют достаточную ФРН-подобную активность "in vitro" посредством индукции дифференцировки клеток PC12 и стимулирования выживания клеток RN22 и, таким образом, обладают нейропротекторными свойствами.

[0065] Соединения согласно этому аспекту изобретения представляют собой соединения Формулы I:

и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства, где

[0066] R₁ представляет собой фенил, замещенный галогеном или трифторметилом и дополнительно возможно замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-6алкила, (C_1-6)алкокси и галоген(C_1-6)алкила; или

[0067] R₁ представляет собой пирролидин-1-ил;

[0068] R₂ представляет собой 2-оксопирролидин-1-илметил или сульфамоилфенил; и

[0069] R₃ выбран из пропила, 1-метилэтила, бутила, 2-метилпропила, пентила, 1-метилбутила, 2-метилбутила, гексила, 4-метилпентила, 3-метилпентила, 2-метилпентила и 1-метилпентила.

[0070] В одном варианте реализации соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, представляют собой соединения Формулы I, где R₁ представляет собой фторфенил. В одном варианте реализации фторфенильная группа представляет собой 2-фторфенил, 3-фторфенил или 4-фторфенил. Предпочтительно, R₁ представляет собой 2-фторфенил. В одном варианте реализации фторфенильная группа дополнительно замещена одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-6алкила, (C_1-6)алкокси и галоген(C_1-6)алкила; предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-4алкила, (C_1-4)алкокси и галоген(C_1-4)алкила; более предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, метила, этила, пропила, изопропила, метокси, этокси, фторметила и трифторметила.

[0071] В одном варианте реализации соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, представляют собой соединения Формулы I, где R₁ представляет собой хлорфенил. В одном варианте реализации хлорфенильная группа представляет собой 2-хлорфенил, 3-хлорфенил или 4-хлорфенил. В одном варианте реализации R₁ представляет собой 2-хлорфенил. В одном варианте реализации хлорфенильная группа дополнительно замещена одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-6алкила, (C_1-6)алкокси и галоген(C_1-6)алкила; предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-4алкила, (C_1-4)алкокси и галоген(C_1-4)алкила; более предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, метила, этила, пропила, изопропила, метокси, этокси, фторметила и трифторметила.

[0072] В одном варианте реализации соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, представляют собой соединения Формулы I, где R₁ представляет собой бромфенил. В одном варианте реализации бромфенильная группа представляет собой 2-бромфенил, 3-бромфенил или 4-бромфенил. В одном варианте реализации R₁ представляет собой 2-бромфенил. В одном варианте реализации бромфенильная группа дополнительно замещена одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-6алкила, (C_1-6)алкокси и галоген(C_1-6)алкила; предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-4алкила, (C_1-4)алкокси и галоген(C_1-4)алкила; более предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, метила, этила, пропила, изопропила, метокси, этокси, фторметила и трифторметила.

[0073] В одном варианте реализации соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, представляют собой соединения Формулы I, где R₁ представляет собой йодфенил. В одном варианте реализации йодфенильная группа представляет собой 2-йодфенил, 3-йодфенил или 4-йодфенил. В одном варианте реализации R₁ представляет собой 2-йодфенил. В одном варианте реализации йодфенильная группа дополнительно замещена одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-6алкила, (C_1-6)алкокси и галоген(C_1-6)алкила; предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-4алкила, (C_1-4)алкокси и галоген(C_1-4)алкила; более предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, метила, этила, пропила, изопропила, метокси, этокси, фторметила и трифторметила.

[0074] В одном варианте реализации соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, представляют собой соединения Формулы I, где R₁ представляет собой трифторметилфенил. В одном варианте реализации трифторметилфенильная группа представляет собой 2-трифторметилфенил, 3-трифторметилфенил или 4-трифторметилфенил. Подходящие соединения включают те, в которых R₁ представляет собой 2-трифторметилфенил. В одном варианте реализации трифторметилфенильная группа дополнительно замещена одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-6алкила, (C_1-6)алкокси и галоген(C_1-6)алкила; предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, C_1-4алкила, (C_1-4)алкокси и галоген(C_1-4)алкила; более предпочтительно одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, метила, этила, пропила, изопропила, метокси, этокси, фторметила и трифторметила.

[0075] В одном варианте реализации соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, представляют собой соединения Формулы I, где R₁ представляет собой пирролидин-1-ил.

[0076] В одном варианте реализации соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, представляют собой соединения Формулы I, где R₂ представляет собой 2-оксопирролидин-1-илметил.

[0077] В одном варианте реализации соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, представляют собой соединения Формулы I, где R₂ представляет собой сульфамоилфенил. В одном варианте реализации сульфамоилфенильная группа представляет собой 2-сульфамоилфенил, 3-сульфамоилфенил или 4-сульфамоилфенил. Предпочтительно, R₂ представляет собой 4-сульфамоилэтил.

[0078] В одном варианте реализации соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, представляют собой соединения Формулы I, где R₃ представляет собой 2-метилпропил, имеющие Формулу II:

и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства, где R₁ и R₂ имеют значения, определенные выше для Формулы I.

[0079] В одном варианте реализации соединения, подходящие согласно настоящему изобретению, представляют собой соединения Формул I-II и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства, где R₁ представляет собой 2-фторфенил или пирролидин-1-ил и R² представляет собой 2-оксопирролидин-1-илметил или 4-сульфамоилфенил, как указано ниже:

[0080] Предпочтительные соединения в соответствии с настоящим изобретением представляют собой соединения Формулы I, имеющие любую из следующих Формул III-V, и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства:

[0081] Формула III:

[N-(2-(2'-Фторфенил)этил)глицил]-[N-(2-метилпропил)глицил]-N-[3-(2'-оксопирролидинил)пропил]глицинамид (G79);

[0082] Формула IV:

[N-(2-(2'-Фторфенил)этил)глицил]-[N-(2-метилпропил)глицил]-N-[2-(4’-сульфамоилфенил)этил]глицинамид (G80); и

[0083] Формула V:

[N-(2-(1-Пирролидинил)этил)глицил]-[N-(2-метилпропил)глицил]-№[2-(4'-сульфамоилфенил)этил]глицинамид (G81),

и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства.

[0084] В одном варианте реализации соединение Формулы I представляет собой соединение Формулы III или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

[0085] В одном варианте реализации соединение Формулы I представляет собой соединение Формулы IV или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

[0086] В одном варианте реализации соединение Формулы I представляет собой соединение Формулы V или его фармацевтически приемлемую соль или пролекарство.

[0087] Подходящие галогеновые группы включают фтор, хлор, бром и йод.

[0088] Подходящие алкильные группы выбраны из неразветвленных и разветвленных C_1-6алкильных групп и более предпочтительно неразветвленных C_1-4алкильных групп и разветвленных C_1-4алкильных групп. Типичные C_1-6алкильные группы включают, в числе прочих, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, трет-бутил, изо-бутил, 3-пентил, гексил.

[0089] Подходящие галоген(C_1-6)алкильные группы включают любые из вышеупомянутых C_1-6алкильных групп, замещенные одним или более атомами фтора, хлора, брома или йода (например, фторметильная, дифторметильная, трифторметильная, пентафторэтильная, 1,1-дифторэтильная и трихлорметильная группы). Предпочтительно, галоген(C_1-6)алкильная группа представляет собой трифторметил.

[0090] Подходящие C_1-6алкоксигруппы включают кислород, замещенный одной из вышеупомянутых C_1-6алкильных групп (например, метокси, этокси, пропокси, изо-пропокси, бутокси, трет-бутокси, изо-бутокси, втор-бутокси и пентилокси).

[0091] Было обнаружено, что соединения Формул III-V индуцируют дифференцировку в клетках PC12 и выживание клеток RN22 после воздействия стресса. Был исследован механизм действия соединений Формул III-V. Соответственно, был проверен эффект соединений Формул III-V совместно с ФРН в культуре. Если соединения функционируют в качестве лигандов или вмешиваются в ФРН-индуцируемый сигнальный путь, они могут ингибировать активность ФРН. В противном случае, если соединения вызывают аддитивный эффект, они могут функционировать посредством параллельного механизма. В результате авторами было обнаружено, что соединения G79, G80 и G81 не вызывают аддитивного эффекта в комбинации с ФРН. Нет большого различия в количестве дифференцированных клеток при обработке соединением в отдельности по сравнению с комбинированной обработкой. Это означает, что соединения Формул III-V действуют посредством того же пути, что и ФРН. Уменьшение нейротрофного ответа на ФРН соответствует профилю частичного агониста ФРН.

[0092] Для лучшего понимания процеса связывания соединений Формул III-V с поверхностью клеток, клетки PC12 обрабатывали ФРН или соединениями в присутствии антител против TrkA, которые блокируют сайт связывания TrkA с ФРН во внеклеточном домене. Следовательно, если пептидомиметики проявляют свою активность путем активации сайта связывания, присутствие этих антител будет препятствовать проявлению их активности. В противном случае, если активность ФРН-опосредованного сигнального пути сохраняется, это будет указывать на то, что пептидомиметики нейротрофинов проявляют свою активность путем активации TrkA в другом участке молекулы, отличном от сайта связывания TrkA с ФРН. Результаты указывают на то, что, в то время как нейротрофная активность ФРН понижалась при добавлении в культуру антител против TrkA, процент дифференцировки между обработкой соединениями в отдельности или соединениями в комбинации с антителами не очень различался. Можно предположить, что активность соединений не опосредована связыванием с внеклеточным участком рецептора TrkA. Однако данный результат не исключает того, что соединения Формул III-V связывают либо внутриклеточный участок TrkA, либо других представителей внутриклеточного сигнального пути. Было также обнаружено, что соединение G79 конкурирует с ФРН и BDNF за связывание с рецепторами нейротрофинов. Этот эффект может быть обусловлен конкуренцией за рецептор р75, который значительно сильнее экспрессируется на поверхности клеток клеточных линий, взятых для экспериментов.

[0093] Также была рассмотрена возможность того, что соединения Формул III-V могут действовать как стимуляторы секреции, воздействуя посредством увеличения синтеза ФРН. Было обнаружено, что, в то время как обработка ФРН совместно с антителами против ФРН индуцирует снижение дифференцировки клеток PC12, нет различия в процентах дифференцировки, индуцированной соединениями G79, G80 и G81 в присутствии тех же антител по сравнению с обработкой соединениями в отдельности. По этой причине соединения G79, G80 и G81 не действуют как стимуляторы секреции.

[0094] Для изучения механизма действия соединений Формул III-V была исследована зависимость нейротрофной активности молекул от активации ERK и AKT, двух основных путей для сигнального пути TrkA. Было обнаружено, что, тогда как обработка ФРН в сочетании с ингибиторами LY294002 или PD98059 снижает процент дифференцировки в клетах РС12 по сравнению с обработкой ФРН в отдельности, также процент дифференцировки для соединений G79, G80 и G81 в комбинации с ингибиторами понижен по сравнению с обработкой соединениями в отдельности.

[0095] В заключение, ФРН-подобные малые молекулы согласно настоящему изобретению индуцируют дифференцировку без активации синтеза ФРН. Они также действуют посредством активации сигнальных путей TrkA с участием PI3K/AKT и MAPK/ERK без связывания с внеклеточным участком TrkA.

[0096] Способность соединений Формул III-V активировать нейротрофиновые пути была исследована в анализах дифференцировки в присутствии ингибиторов путей PI3K и МАР-киназы совместно с анализами с применением технологии Luminex. В соответствии с результатами, соединения G79, G80 и G81 активируют сигнальный путь нейротрофинов. Например, белки теплового шока, такие как HSP-27, могут быть активированы различными агентами и нейротрофическими факторами (Liu H. et al, J Neurochem., 86, 1553-1563, 2003; Yuan Y et al, Eur. J. Pharmacol. 586, 100-105, 2008; O'Reilly AM et al, Mol Neurobiol, 42, 124-132, 2010). Проведенные эксперименты показали, что HSP-27 значительно активировался после стимулирования in vitro соединением G79, аналогично стимулированию ФРН.

[0097] Также было исследовано действие соединений Формул III-V на моделях нейродегенеративных заболеваний in vivo и in vitro. Был показан нейропротекторный эффект соединения G79 in vitro в моделях БП, БАС и нейровоспаления. Также, соединение G79 демонстрировало полезный эффект in vivo в животных моделях PC и глаукомы, улучшая клинические показатели у животных, страдающих от ЭАЭ и уменьшая гибель ГКС в глаукоматозных глазах. Также была проверена способность соединений Формул III-V к проникновению через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). В соответствии с результатами, соединение G79 демонстрировало лучшее проникновение через ГЭБ за счет активного транспорта, что объяснет его лучший профиль, чем у соединений G80 и G81. Эта форма транспорта обеспечивает более специфичную доставку лекарственного средства и постоянное присутствие последнего в мозге по сравнению с пассивным транспортом.

[0098] В заключение, результаты указывают на то, что нейротрофинподобные молекулы могут предложить хорошую терапевтическую стратегию для преодоления проблемы доставки нейротрофинов в мозг, сохранения и даже увеличения положительных эффектов самих нейротрофинов для лечения нейродегенеративных заболеваний.

[0099] Термин "пролекарство" в настоящей заявке включает любое соединение, полученное из соединений любой из Формул I-V, например, сложный эфир, амид, фосфат и т.д., которое при введении индивидууму способно прямо или косвенно обеспечивать доставку соединений любой Формул I-V или их фармацевтически приемлемых солей в организм указанного индивидуума. Предпочтительно, указанное производное представляет собой соединение, которое увеличивает биодоступность соединений любой из Формул I-V при введении индивидууму или которое обеспечивает высвобождение соединений любой из Формул I-V в биологический компартмент. Природа указанного производного не важна при условии, что оно может быть введено индивидууму и что оно обеспечивает доставку соединений любой из Формул I-V в биологический компартмент индивидуума. Указанное пролекарство может быть получено с помощью обычных способов, известных специалистам в данной области техники. Традиционные способы отбора и получения подходящих производных-пролекарств описаны в, например, Design of Prodrugs, H. Bundgaard ed., Elsevier (1985). Примером пролекарства для соединений любой из Формул I-V может являться их инкапсулирование в липосомы. Согласно этой методике, пептоид обрабатывают подходящим предшественником липосомы (комбинацией фосфолипида, такого как лецитин, холестерина и воды) с целью инкапсулирования. В зависимости от липофильности пептоида, соединение будет задерживаться в липофильной части липосомы или в водной внутренней части. Что касается терапевтического полимера, пептоид может быть присоединен к полимеру посредством ковалентных связей, созданных после региоселективного гидролиза концевого карбоксамида. Этот гидролиз приводит к образованию свободной карбоновой кислоты, которая может быть сконденсирована с амино или гидроксильной активированной группой полимера.

[00100] Термин "фармацевтически приемлемый" обозначает, что соединение или комбинация соединений достаточно совместимо с другими ингредиентами состава и не является вредным для пациента вплоть до тех уровней, которые допустимы в промышленных стандартах.

[00101] Для терапевтического применения соли соединений любой из Формул I-V представляют собой те, в которых противоион является фармацевтически приемлемым.

[00102] Термин "соль", как указано в настоящей заявке, включает любые стабильные соли, которые соединения любой из Формул I-V способны образовывать. Предпочтительны фармацевтически приемлемые соли. Соли, не являющиеся фармацевтически приемлемыми, также включены в рамки настоящего изобретения, поскольку они относятся к промежуточным соединениям, которые могут подходить для получения соединений с фармакологической активностью.

[00103] Соли могут быть без труда получены путем обработки соединений любой из Формул I-V в форме основания такими подходящими кислотами, как неорганические кислоты, такие как соляная или бромоводородная кислота, серная, азотная, фосфорная кислоты и т.п.; или органические кислоты, такие как, например, уксусная, пропановая, гидроксиуксусная, молочная, пировиноградная, щавелевая (т.е. этандиовая), малоновая, янтарная (т.е. бутандиовая кислота), малеиновая, фумаровая, яблочная (т.е. гидроксибутандионовая кислота), винная, лимонная, метансульфоновая, этансульфоновая, бензолсульфоновая, п-толуолсульфоновая, цикламовая, салициловая, п-аминосалициловая, памоевая кислоты и т.п.

[00104] Фармацевтически приемлемые соли могут быть получены путем обработки соединений любой из Формул I-V в форме основания такими подходящими фармацевтически приемлемыми кислотами, как неорганические кислоты, например, включая соляную, бромоводородную и т.п.; серную кислоту; азотную кислоту; фосфорную кислоту и т.п.; или органические кислоты, например, уксусная, пропановая, гидроксиуксусная, 2-гидроксипропановая, 2-оксопропановая, щавелевая, малоновая, янтарная, малеиновая, фумаровая, яблочная, винная, 2-гидрокси-1,2,3-пропантрикарбоновая, метансульфоновая, этансульфоновая, бензолсульфоновая, 4-метилбензолсульфоновая, циклогексансульфаминовая, 2-гидроксибензойная, 4-амино-2-гидрооксибензойная кислоты и т.п.

[00105] Солевая форма, наоборот, может быть превращена щелочной обработкой в форму свободного основания.

[00106] Термин "фармацевтическая композиция" обозначает в рамках настоящего изобретения любую композицию, которая содержит активное соединение, которому приписывают, полностью или частично, терапевтический (например, фармацевтический) эффект, по меньшей мере одно из соединений согласно изобретению или их комбинации и которая может необязательно также содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый неактивный ингредиент, такой как вспомогательное вещество, носитель и т.п.

[00107] Термин "предотвращающий" относится к препятствованию возникновения, существования или, альтернативно, задерживанию начала или рецидива заболевания, расстройства или состояния, к которому такой термин применяют, или одного или более симптомов, ассоциированных с заболеванием, расстройством или состоянием. Термин "предотвращение" относится к акту предотвращения, как "предотвращающий", определенный непосредственно выше.

[00108] Термин "лечащий" в настоящей заявке относится к достижению регрессии, облегчению или подавлению развития заболевания или состояния, к которому такой термин применяют, или одного или более симптомов таких расстройств или состояний. Термин "лечение" относится к акту лечения, как "лечащий", определенный непосредственно выше.

[00109] Термин "субъект" обозначает животных, в частности, млекопитающих, таких как собаки, кошки, коровы, лошади, овцы, гуси и люди. Особенно предпочтительными субъектами являются млекопитающие, включая людей обоих полов.

[00110] "Эффективное количество" соединений любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей или пролекарств может находиться в диапазоне от 0,01 мг до 50 г в сутки, от 0,02 мг до 40 г в сутки, от 0,05 мг до 30 г в сутки, от 0,1 мг до 20 г в сутки, от 0,2 мг до 10 г в сутки, от 0,5 мг до 5 г в сутки, от 1 мг до 3 г в сутки, от 2 мг до 2 г в сутки, от 5 мг до 1,5 г в сутки, от 10 мг до 1 г в сутки, от 10 мг до 500 мг в сутки.

[00111] Нервные клетки включают клетки из любой области головного мозга, спинного мозга, зрительного нерва, сетчатки и периферических ганглиев. Нейроны включают нейроны эмбриональной, фетальной или зрелой нервной ткани, включая ткань гиппокампа, мозжечка, спинного мозга, коры головного мозга (например, двигательной зоны коры или соматосенсорной коры), полосатого тела, базальных отделов переднего мозга (холинергические нейроны), вентральной области среднего мозга (клетки черного вещества) и голубого пятна (нейроадреналиновые клетки центральной нервной системы).

[00112] Изобретение также охватывает применение соединений любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей и пролекарств в качестве активных ингредиентов для получения лекарственных средств для предотвращения или лечения гибели или повреждения нервных клеток. Другими словами, настоящее изобретение относится к соединениям любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемым солям и пролекарствам для применения в предотвращении или лечении гибели или повреждения нервных клеток. Аналогично, настоящее изобретение относится к способу нейропротекции, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства.

[00113] В одном варианте реализации настоящего изобретения соединения любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства могут быть применены для предотвращения или лечения одного или более, предпочтительно двух или более, патологических или опасных состояний, связанных с гибелью или повреждением нервных клеток, выбранных из, но без ограничения, воздействия химических веществ, таких как условия окислительного стресса, токсичных веществ, инфекционных организмов, излучения, травматического повреждения, гипоксии, ишемии, аномальных неправильно свернутых белков, эксайтотоксинов, свободных радикалов, индукторов стресса эндоплазматического ретикулума, индукторов митохондриального стресса, включая, но без ограничения, ингибиторы электронтранспортной цепи, антагонистов аппарата Гольджи, повреждения или потери аксонов, демиелинизации, воспаления, патологических нейронных импульсов (судорог). Также предпочтительно, применения и способы согласно настоящему изобретению направлены на предотвращение или лечение гибели или повреждения нервных клеток независимо от причины.

[00114] Термины "нейропротекция", "нейропротекторный" или "нейропротекторный эффект" относятся к способности предотвращать или уменьшать гибель или повреждение нервных клеток, включая нейроны и глию, или спасению, реанимированию или восстановлению нервных клеток, например, после патологических или опасных состояний головного мозга, центральной нервной системы или периферической нервной системы. Таким образом, этот нейропротекторный эффект включает приобретенную способность нервных клеток сохранять или восстанавливать свои нейрональные функции. Указанный эффект стабилизирует клеточную мембрану нервной клетки или способствует нормализации функций нервной клетки. Это предотвращает потерю жизнеспособности или функций нервных клеток. Нейропротекция включает подавление прогрессирующей деградации нейронов, которая приводит к гибели клеток. Это относится к любой обнаруживаемой защите нейронов от стресса. Нейропротекция включает регенерацию нервных клеток, т.е. повторный рост популяции нервных клеток после заболевания или травмы.

[00115] В настоящее время для большинства неврологических и психических заболеваний отсутствуют специфические средства для лечения, направленные на остановку или улучшение течения заболевания, которые называют "лекарственными средствами, модифицирующими течение болезни". Они контрастируют с симптоматическими видами терапии, которые являются общепринятыми для таких заболеваний, но не изменяют течение болезни. Нейропротекторное лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, изменяющее течение болезни (DMD), для лечения заболеваний мозга.

[00116] В связи с этим, в одном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению соединений любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей и пролекарств в качестве активных ингредиентов для получения лекарственного средства для регенерации нервных клеток. Другими словами, настоящее изобретение относится к соединениям любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемым солям и пролекарствам для применения для регенерации нервных клеток. Аналогично, настоящее изобретение относится к способу регенерации нервных клеток, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства.

[00117] Нейропротекция может быть непосредственно определена путем, например, измерения задерживания или предотвращения гибели нейронов, таким, как, например, измерение уменьшения числа апоптотических нейронов в культурах цереброкортикальных нейронов после стресса. Нейропротекции также может быть непосредственно определена путем, например, измерения тяжести или степени повреждения или потери функций ткани или органа нервной системы после такого стресса, таким как, например, измерение уменьшения размера инфаркных участков мозга после окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) или реперфузионного повреждения. Кроме того, нейропротекция может быть идентифицирована посредством магнитно-резонансной томографии (измерение объема мозга, трактография, измерение уровней N-ацетиласпартата с помощью спектроскопии, оптическая когерентная томография). Альтернативно, нейропротекция может быть косвенно определена путем детекции активации одного или более биологических механизмов защиты нейронов, включая, но без ограничения, детекцию активации сигнального пути Keap1/Nrf2 или индукции одного или более ферментов фазы 2, включая, но без ограничения, гемоксигеназу-1 (ГО-1). Способы детекции и измерения защиты нейронов предложены в Примерах ниже, и другие такие способы известны в данной области техники.

[00118] Различные использования и способы применения соединений любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей и/или пролекарств согласно настоящему изобретению включают однократное введение, т.е. осуществляемое в течение периода от нескольких минут до примерно нескольких часов после поражения, или длительное введение, подходящее для хронических неврологических или психических заболеваний.

[00119] В одном варианте реализации настоящего изобретения в различных применениях и способах нейропротекции или предотвращения или лечения гибели или повреждения нервных клеток соединения любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства вводят субъекту, страдающему неврологическим или психическим заболеванием.

[00120] Неврологические заболевания представляют собой расстройства центральной и периферической нервной системы, включая расстройства головного мозга, спинного мозга, черепно-мозговых нервов, периферических нервов, нервных корешков, вегетативной нервной системы, нервно-мышечных соединений и мышц.

[00121] Заболевания центральной и периферической нервной системы, которые можно предотвращать и/или лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают, без ограничения, поскольку знания клинических проявлений заболеваний совершенствуются, отсутствие прозрачной перегородки, заболевание, вызванное недостаточностью кислой липазы, дефицит кислой мальтазы, приобретенную эпилептиформную афазию, острый диссеминированный энцефаломиелит, зрачок Эйди, синдром Эйди, адренолейкодистрофию, агенезию мозолистого тела, агнозию, синдром Айкарди, синдром Айкарди-Гутьереса, неврологические осложнения СПИДа, болезнь Александера, болезнь Альпера, альтернирующую гемиплегию, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, анэнцефалию, аневризму, синдром Ангельмана, ангиоматоз, аноксию, антифосфолипидный синдром, афазию, апраксию, арахноидальные кисты, арахноидит, мальформацию Арнольда-Киари, артериовенозную мальформацию, синдром Аспергера, атаксию, атаксию-телеангиэктазию, атаксии и церебеллярную или спиноцеребеллярную дегенерацию, фибрилляцию предсердий и инсульт, синдром дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ), аутизм, вегетативную дисфункцию, боль в спине, синдром Барта, болезнь Баттена, миотонию Беккера, болезнь Бехчета, паралич Белла, доброкачественный эссенциальный блефароспазм, доброкачественную фокальную амиотрофию, доброкачественную внутричерепную гипертензию, синдром Бернгардта-Рота, болезнь Бинсвангера, блефароспазм, синдром Блоха-Сульцбергера, родовые повреждения плечевого сплетения, повреждения плечевого сплетения, синдром Бредбери-Эгглстона, опухоли головного и спинного мозга, аневризму головного мозга, инфаркт головного мозга, ишемию головного мозга, травму головного мозга, синдром Броун-Секара, бульбарную спинномозговую мышечную атрофию, церебральную аутосомно-доминантную артериопатию с субкортикальными инфарктами и лейкоэнцефалопатией (CADASIL), болезнь Канавана, синдром запястного канала, каузалгию, каверномы, кавернозную ангиому, кавернозную мальформацию, центральный (спастический) паралич, пирамидный паралич, центральный болевой синдром, центральный понтинный миелинолиз, цефалические расстройства, дефицит церамидазы, церебеллярную дегенерацию, церебеллярную гипоплазию, аневризму сосудов головного мозга, церебральный артериосклероз, церебральную атрофию, церебральный авитаминоз, церебральную кавернозную мальформацию, церебральный гигантизм, церебральную гипоксию, церебральный паралич, цереброокулофациоскелетный синдром, болезнь Шарко-Мари-Тута, мальформацию Киари, болезнь накопления эфиров холестерина, хорею, хореоакантоцитоз, хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию (ХВДП), хроническую ортостатическую неустойчивость, хроническую боль, синдром Коккейна II типа, синдром Коффина-Лоури, COFS (цереброокулофациоскелетный синдром), колпоцефалию, кому, комплексный региональный болевой синдром, врожденную лицевую диплегию, врожденную миастению, врожденную миопатию, врожденные сосудистые кавернозные мальформации, кортикобазальную дегенерацию, височный артериит, краниосиностоз, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, кумулятивные травматические расстройства, синдром Кушинга, инклюзионную цитомегалию, цитомегаловирусную инфекцию, синдром танцующих глаз-танцующих ног, синдром Денди-Уокера, болезнь Доусона, синдром Де Морсье, глубокую стимуляцию мозга для лечения болезни Паркинсона, паралич Дежерин-Клюмпке, деменцию, мультиинфарктную деменцию, семантическую деменцию, субкортикальную деменцию, деменцию с тельцами Леви, прогрессирующую церебеллярную атаксию, дентаторубральную атрофию, дерматомиозит, диспраксию развития, синдром Девика, диабетическую невропатию, диффузный склероз, синдром Драве, вегетативную дистонию, дисграфию, дислексию, дисфагию, диспраксию, мозжечковую миоклоническую диссинергию, прогрессирующую мозжечковую диссинергию, дистонии, раннюю инфантильную эпилептическую энцефалопатию, синдром пустого турецкого седла, энцефалит, летаргический энцефалит, энцефалоцеле, энцефалопатию, семейную инфантильную энцефалопатию с внутричерепной кальцификацией и хроническим лимфоцитозом ликвора; энцефалит Кри; синдром псевдо-TORCH; псевдотоксоплазмоз, энцефалотригеминальный ангиоматоз, эпилепсию, эпилептическую гемиплегию, параличи Эрба-Дюшена и Дежерин-Клюмпке, паралич Эрба, эссенциальный тремор, экстрапонтинный миелинолиз, болезнь Фабри, синдром Фара, потерю сознания, семейную вегетативную дистонию, семейную гемангиому, семейную идиопатическую кальцификацию базальных ганглиев, семейные периодические параличи, семейный спастический паралич, болезнь Фарбера, фебрильные судороги, фиброзно-мышечную дисплазию, синдром Фишера, синдром Оппенгейма, свисающую стопу, атаксию Фридрейха, лобно-височную деменцию, ганглиозидозы, болезнь Гоше, синдром Герстманна, синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера, гигантскую аксональную невропатию, гигантоклеточный артериит, гигантоклеточную инклюзионную болезнь, глобоидно-клеточную лейкодистрофию, невралгию языкоглоточного нерва, болезнь накопления гликогена, синдром Гийена-Барре, болезнь Галлервордена-Шпатца, травму головы, головную боль, продолжительную гемикранию, гемифациальный спазм, альтернирующую гемиплегию, наследственные невропатии, наследственную спастическую параплегию, наследственную полиневропатическую атаксию, опоясывающий герпес, синдром коленчатого узла, синдром Хираямы, синдром Холмса-Эйди, голопрозэнцефалию, HTLV-1-ассоциированную миелопатию (миелопатию, ассоциированную с вирусом Т-клеточного лейкоза человека), синдром Хьюза, болезнь Хантингтона, гидроанэнцефалию, гидроцефалию, гидроцефалию нормального давления, гидромиелию, гиперкортицизм, гиперсомнию, гипертонию, гипотонию, гипоксию, иммуноопосредованный энцефаломиелит, миозит с включениями телец, недержание пигмента, инфантильную гипотонию, младенческую нейроаксональную дистрофию, инфантильную форму болезни накопления фитановой кислоты, инфантильную болезнь Рефсума, инфантильные спазмы, воспалительные миопатии, инэнцефалию, кишечную липодистрофию, внутричерепные кисты, внутричерепную гипертензию, синдром Исаакса, синдром Жубера, синдром Кернса-Сейра, болезнь Кеннеди, синдром Кинсбурна, синдром Клейне-Левина, синдром Клиппеля-Фейля, синдром Клиппеля-Треноне (СКТ), синдром Клювера-Бьюси, амнестический синдром Корсакова, болезнь Краббе, болезнь Кугельберга-Веландер, куру, миастенический синдром Ламберта-Итона, синдром Ландау-Клеффнера, невропатию латерального кожного нерва бедра, боковой медуллярный синдром (синдром Валленберга), необучаемость, болезнь Лея, синдром Леннокса-Гасто, синдром Леша-Нихена, лейкодистрофию, синдром Левина-Критчли, деменцию с тельцами Леви, болезни накопления липидов, липоидный протеиноз (болезнь Урбаха-Вите), лиссэнцефалию, синдром окружения, болезнь Лу Герига, неврологические осложнения после волчанки, неврологические осложнения болезни Лайма, болезнь Мачадо-Джозефа, макроэнцефалию, мегацефалию, синдром Мелькерссона-Розенталя, менингит, менингит и энцефалит, болезнь Менкеса, парестетическую мералгию, метахроматическую лейкодистрофию, микроцефалию, мигрень, синдром Миллера-Фишера, умеренные когнитивные нарушения, мини-инсульты, митохондриальные миопатии, синдром Мебиуса, мономелическую амиотрофию, болезни двигательных нейронов, болезнь мойя-мойя, муколипидозы, мукополисахаридозы, моторную мультифокальную невропатию, мультиинфарктную деменцию, рассеянный склероз, множественную системную атрофию, множественную системную атрофию с ортостатической гипотензией, мышечную дистрофию, врожденную миастению, тяжелую псевдопаралитическую миастению, диффузный миелинокластический склероз, раннюю миоклоническую энцефалопатию, миоклонус, миопатию, врожденную миопатию, тиреотоксическую миопатию, миотонию, врожденную миотонию, нарколепсию, нейроакантоцитоз, нейродегенерацию с накоплением железа в головном мозге, нейрофиброматоз, злокачественный нейролептический синдром, неврологические осложнения СПИДа, неврологические осложнения болезни Лайма, неврологические последствия цитомегаловирусной инфекции, неврологические проявления болезни Помпе, неврологические осложнения после волчанки, нейромиелит зрительного нерва, нейромиотонию, нейрональный цероидный липофусциноз, нарушения миграции нейронов, наследственную невропатию, нейросаркоидоз, нейротоксичность, кавернозный (пещеристый) невус, болезнь Ниманна-Пика, гидроцефалию нормального давления, затылочную невралгию, синдром Охтахара, оливопонтоцеребеллярную атрофию, опсоклонус-миоклонус синдром, ортостатическую гипотензию, синдром О'Салливана-МакЛауда, синдром перегрузки, хроническую боль, нейродегенерацию, ассоциированную с пантотенаткиназой, паранеопластические синдромы, парестезию, болезнь Паркинсона, пароксизмальный хореоатетоз, пароксизмальную гемикранию, синдром Парри-Ромберга, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, синдром II Пена-Шокейра, периневральные кисты, периодические параличи, периферическую невропатию, перивентрикулярную лейкомаляцию, устойчивое вегетативное состояние, первазивные расстройства развития, болезнь накопления фитановой кислоты, болезнь Пика, защемление нерва, синдром грушевидной мышцы, опухоли гипофиза, полимиозит, болезнь Помпе, порэнцефалию, постгерпетическую невралгию, постинфекционный энцефаломиелит, постполиомиелитный синдром, постуральную гипотензию, синдром постуральной ортостатической тахикардии, синдром постуральной тахикардии, прогрессирующий мозжечковый тремор, первичный боковой склероз, первичную прогрессирующую афазию, прионные заболевания, прогрессирующую гемифациальную атрофию, прогрессирующую локомоторную атаксию, прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию, прогрессирующую склерозирующую полиодистрофию, прогрессирующий надъядерный паралич, прозопагнозию, доброкачественную внутричерепную гипертензию, синдром Рамсея-Ханта типа I (ранее известный как мозжечковая миоклоническая диссинергия, прогрессирующая мозжечковая диссинергия, дентаторубральная дегенерация или мозжечковый синдром Рамсея-Ханта), синдром Рамсея-Ханта типа II (ранее известный как синдром коленчатого узла), энцефалит Расмуссена, синдром рефлекторной симпатической дистрофии, болезнь Рефсума, инфантильную болезнь Рефсума, повторяющиеся расстройства движения, туннельный синдром, синдром беспокойных ног, миелопатию, ассоциированную с ретровирусной инфекцией, синдром Ретта, синдром Рейе, ревматический энцефалит, синдром Райли-Дея, околокорневые кисты крестцового нерва, пляску Святого Витта, заболевание слюнных желез, болезнь Сандхоффа, болезнь Шильдера, шизэнцефалию, болезнь Зейтельбергера, эпилепсию, семантическую деменцию, септо-оптическую дисплазию, тяжелую миоклоническую эпилепсию младенчества (ТМЭМ), синдром детского сотрясения, опоясывающий лишай, синдром Шая-Дрейджера, синдром Шегрена, апноэ во сне, сонную болезнь, синдром Сотоса, спастичность, расщепленный позвоночник, инфаркт спинного мозга, повреждение спинного мозга, опухоли спинного мозга, спинальную мышечную атрофию, спиноцеребеллярную атрофию, спиноцеребеллярную дегенерацию, синдром Стила-Ричардсона-Ольшевского, синдром мышечной скованности, стриатонигральную дегенерацию, инсульт, синдром Стерджа-Вебера, подострый склерозирующий панэнцефалит, подкорковую атеросклеротическую энцефалопатию, короткие приступы односторонней невралгической головной боли с конъюнктивальной инъекцией и слезоотделением (SUNCT), нарушения глотательного рефлекса, хорею Сиденгама, обморок, сифилитический склероз позвоночника, сирингогидромиелию, сирингомиелию, системную красную волчанку, сухотку спинного мозга, позднюю дискинезию, кисты Тарлова, болезнь Тея-Сакса, височный артериит, синдром фиксированного спинного мозга, болезнь Томсена, синдром верхней апертуры грудной клетки, тиреотоксическую миопатию, невралгию тройничного нерва, паралич Тодда, синдром Туретта, транзиторную ишемическую атаку, трансмиссивные спонгиоформные энцефалопатии, поперечный миелит, черепно-мозговую травму, тремор, тригеминальную невралгию, тропический спастический парапарез, синдром Тройера, туберозный склероз, сосудистую каверному, синдромы васкулита центральной и периферической нервных систем, болезнь фон Экономо, болезнь Гиппеля-Линдау (БГЛ), болезнь Реклингхаузена, синдром Валленберга, болезнь Верднига-Гоффмана, синдром Вернике-Корсакова, синдром Веста, хлыстовую травму, болезнь Уиппла, синдром Вильямса, болезнь Вильсона, болезнь Вольмана, Х-сцепленную спинально-бульбарную амиотрофию, синдром Цельвегера, неврит зрительного нерва, синдром хронической усталости, фибромиалгию, психические заболевания, такие как расстройства настроения, большой депрессивный эпизод, биполярный синдром, психоз, шизофрения, обсессивно-компульсивный синдром и т.д., заболевания, связанные с употреблением токсических или наркотических веществ, такие как алкоголизм и наркотическая зависимость, энцефалопатию, такую как печеночная энцефалопатия.

[00122] Психические расстройства, которые можно предотвращать и/или лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают расстройства, перечисленные в четвертом издании Руководства по диагностике и статистическому учету психических расстройств (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition; DSM-IV), опубликованном Американской ассоциацией психиатров, и охватывают все расстройства психического здоровья у детей и взрослых. В частности, психические расстройства включают расстройство, выбранное из острого стрессового расстройства; неуточненного расстройства адаптации; расстройства адаптации с тревогой; расстройства адаптации с депрессивным настроением; расстройства адаптации с нарушением поведенческой сферы; расстройства адаптации со смешанным тревожным и депрессивным настроением; расстройства адаптации со смешанным нарушением эмоциональной и поведенческой сферы; агорафобии без панического расстройства; нервной анорексии; диссоциального расстройства личности; тревожного расстройства, связанного с медицинским состоянием; неуточненного тревожного расстройства; избегающего расстройства личности; неуточненного биполярного расстройства; биполярного расстройства I типа, характеризующегося депрессивным последним эпизодом, в полной ремиссии; биполярного расстройства I типа, характеризующегося депрессивным последним эпизодом, в частичной ремиссии; биполярного расстройства I типа, характеризующегося депрессивным последним эпизодом, в легкой форме; биполярного расстройства I типа, характеризующегося депрессивным последним эпизодом, в умеренной форме; биполярного расстройства I типа, характеризующегося депрессивным последним эпизодом, в тяжелой форме с психотическими признаками; биполярного расстройства I типа, характеризующегося депрессивным последним эпизодом, в тяжелой форме без психотических признаков; неуточненного биполярного расстройства I типа, характеризующегося депрессивным последним эпизодом; биполярного расстройства I типа, характеризующегося маниакальным последним эпизодом, в полной ремиссии; биполярного расстройства I типа, характеризующегося маниакальным последним эпизодом, в частичной ремиссии; биполярного расстройства I типа, характеризующегося маниакальным последним эпизодом, в легкой форме; биполярного расстройства I типа, характеризующегося маниакальным последним эпизодом, в умеренной форме; биполярного расстройства I типа, характеризующегося маниакальным последним эпизодом, в тяжелой форме с психотическими признаками; биполярного расстройства I типа, характеризующегося маниакальным последним эпизодом, в тяжелой форме без психотических признаков; неуточненного биполярного расстройства I типа, характеризующегося маниакальным последним эпизодом; биполярного расстройства I типа, характеризующегося смешанным последним эпизодом, в полной ремиссии; биполярного расстройства I типа, характеризующегося смешанным последним эпизодом, в частичной ремиссии; биполярного расстройства I типа, характеризующегося смешанным последним эпизодом, в легкой форме; биполярного расстройства I типа, характеризующегося смешанным последним эпизодом, в умеренной форме; биполярного расстройства I типа, характеризующегося смешанным последним эпизодом, в тяжелой форме с психотическими признаками; биполярного расстройства I типа, характеризующегося смешанным последним эпизодом, в тяжелой форме без психотических признаков; неуточненного биполярного расстройства I типа, характеризующегося смешанным последним эпизодом; биполярного расстройства I типа, характеризующегося неуточненным последним эпизодом; биполярного расстройства I типа, характеризующегося гипоманиакальным последним эпизодом; биполярного расстройства I типа, характеризующегося единственным маниакальным эпизодом, в полной ремиссии; биполярного расстройства I типа, характеризующегося единственным маниакальным эпизодом, в частичной ремиссии; биполярного расстройства I типа, характеризующегося единственным маниакальным эпизодом, в легкой форме; биполярного расстройства I типа, характеризующегося единственным маниакальным эпизодом, в умеренной форме; биполярного расстройства I типа, характеризующегося единственным маниакальным эпизодом, в тяжелой форме с психотическими признаками; биполярного расстройства I типа, характеризующегося единственным маниакальным эпизодом, в тяжелой форме без психотических признаков; неуточненного биполярного расстройства I типа, характеризующегося единственным маниакальным эпизодом; биполярного расстройства II типа; дисморфофобии; пограничного расстройства личности; расстройства сна, связанного с дыханием; кратковременного психотического расстройства; нервной булимии; расстройства циркадного ритма сна; конверсионного расстройства; циклотимического расстройства; бредового расстройства; зависимого расстройства личности; расстройства деперсонализации; неуточненного депрессивного расстройства; диссоциативной амнезии; неуточненного диссоциативного расстройства; диссоциативной фуги; диссоциативного расстройства идентичности; диспареунии; неуточненной диссомнии; диссомнии, связанной с другим расстройством; дистимического расстройства; неуточненного расстройства пищевого поведения; эксгибиционизма; диспареунии у женщин, связанной с медицинским состоянием; гипоактивного расстройства полового влечения у женщин, связанного с медицинским состоянием; нарушения оргазма у женщин; расстройства полового возбуждения у женщин; фетишизма; фроттеризма; расстройства гендерной идентичности у подростков или взрослых; расстройства гендерной идентичности у детей; неуточненного расстройства гендерной идентичности; генерализованного тревожного расстройства; истерического расстройства личности; гипоактивного расстройства полового влечения; ипохондрии; неуточненного расстройства импульсного контроля; бессонницы, связанной с другим расстройством; синдрома эпизодического нарушения контроля; клептомании; рецидивирующего большого депрессивного расстройства в полной ремиссии; рецидивирующего большого депрессивного расстройства в частичной ремиссии; рецидивирующего большого депрессивного расстройства в легкой форме; рецидивирующего большого депрессивного расстройства в умеренной форме; рецидивирующего большого депрессивного расстройства в тяжелой форме с психотическими признаками; рецидивирующего большого депрессивного расстройства в тяжелой форме без психотических признаков; неуточненного рецидивирующего большого депрессивного расстройства; большого депрессивного расстройства, характеризующегося единственным эпизодом, в полной ремиссии; большого депрессивного расстройства, характеризующегося единственным эпизодом, в частичной ремиссии; большого депрессивного расстройства, характеризующегося единственным эпизодом, в легкой форме; большого депрессивного расстройства, характеризующегося единственным эпизодом, в умеренной форме; большого депрессивного расстройства, характеризующегося единственным эпизодом, в тяжелой форме с психотическими признаками; большого депрессивного расстройства, характеризующегося единственным эпизодом, в тяжелой форме без психотических признаков; неуточненного большого депрессивного расстройства, характеризующегося единственным эпизодом; диспареунии у мужчин, связанной с медицинским состоянием; эректильного расстройства у мужчин; эректильного расстройства у мужчин, связанного с медицинским состоянием; гипоактивного расстройства полового влечения у мужчин, связанного с медицинским состоянием; нарушения оргазма у мужчин; аффективного расстройства, связанного с медицинским состоянием; нарциссического расстройства личности; нарколепсии; расстройства в виде кошмарных сновидений; обсессивно-компульсивного расстройства; обсессивно-компульсивного расстройства личности; другой половой дисфункции у женщин, связанной с медицинским состоянием; другой половой дисфункции у мужчин, связанной с медицинским состоянием; болевого расстройства, ассоциированного с психологическими факторами и медицинскими состояниями; болевого расстройства, ассоциированного с психологическими особенностями; панического расстройства с агорафобией; панического расстройства без агорафобии; параноидного расстройства личности; неуточненной парафилии; неуточненной парасомнии; патологического влечения к азартным играм (игромании); педофилии; неуточненного расстройства личности; посттравматического стрессового расстройства; преждевременного семяизвержения; первичной гиперсомнии; первичной бессонницы; психотического расстройства с бредом, связанного с медицинским состоянием; психотического расстройства с галлюцинациями, связанного с медицинским состоянием; неуточненного психотического расстройства; пиромании; шизоаффективного расстройства; шизоидного расстройства личности; кататонической шизофрении; дезорганизованной шизофрении; параноидной шизофрении; резидуальной (остаточной) шизофрении; недифференцированной шизофрении; шизофреноформного расстройства; шизотипического расстройства личности; отвращения к половым сношениям; неуточненного полового расстройства; неуточненной половой дисфункции; полового мазохизма; полового садизма; индуцированного психотического расстройства; расстройства сна гиперсомнического типа, связанного с медицинским состоянием; расстройства сна инсомнического типа, связанного с медицинским состоянием; расстройства сна смешанного типа, связанного с медицинским состоянием; расстройства сна парасомнического типа, связанного с медицинским состоянием; нарушения сна, связанного со страхом; сомнамбулического расстройства; социальной фобии; соматизированного расстройства; неуточненного соматоформного расстройства; специфической фобии, фетишистского трансвестизма; трихотилломании; недифференцированного соматоформного расстройства; вагинизма; и вуайеризма.

[00123] Предпочтительно соединения любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства могут быть применены для лечения заболеваний, при которых, как было доказано ранее в уровне техники, ФРН или другие нейротрофины являются эффективными, in vivo или in vitro, благодаря их улучшающим воздействиям на дифференцировку клеток и выживаемость клеток посредством сигнальных путей TrkA, TrkB и/или р75. Следовательно, соединения, охраняемые патентом согласно настоящему изобретению, могут быть применены для лечения неврологических заболеваний, выбранных из: нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, атаксия Фридрейха, болезнь Хантингтона, деменция с тельцами Леви, спинальная мышечная атрофия; воспаления нерва, такого как рассеянный склероз и нейромиелит зрительного нерва; большого депрессивного расстройства; шизофрении; глаукомы; или периферических невропатий, таких как диабетическая невропатия или невропатия при СПИДе. Кроме того, соединения согласно изобретению могут также быть показаны для лечения рака путем модулирования ФРН активности дифференцировки клеток и остановки пролиферации клеток. Среди типов рака, при которых, как было доказано ранее в уровне техники, ФРН является эффективным, in vivo или in vitro, благодаря улучшающим воздействиям на дифференцировку клеток и выживаемость клеток посредством сигнальных путей TrkA и/или р75, могут быть приведены следующие: глиобластома, астроцитома, медуллобластома, невринома, нейробластома, менингиома, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак предстательной железы, лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, остеосаркома, гепатоцеллюлярная карцинома, карцинома яичника, аденокарцинома легкого или карцинома пищевода.

[00124] В одном варианте реализации настоящего изобретения в различных применениях и способах нейропротекции или предотвращения или лечения гибели или повреждения нервных клеток соединения любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства вводят здоровому субъекту, предпочтительно здоровому субъекту старше 18 лет, более предпочтительно здоровому субъекту старше 45 лет, еще более предпочтительно здоровому субъекту старше 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 лет.

[00125] Термин "здоровый субъект" включает его общепринятое значение, а также субъектов, которые могут страдать от одного или более патологических состояний, отличных от неврологического или психического заболевания.

[00126] Нейропротекторные свойства соединений любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей и пролекарств обеспечивают в результате частичное или полное предотвращение или лечение различных расстройств функций нервной системы, вызванных гибелью или повреждением нервных клеток. Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению соединений любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей и пролекарств в качестве активных ингредиентов для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения неврологического или психического заболевания. Другими словами, настоящее изобретение также относится к соединениям любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемым солям и пролекарствам для применения в предотвращении или лечении неврологического или психического заболевания. Аналогично, настоящее изобретение также относится к способу предотвращения или лечения неврологического или психического заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения любой из Формул I-V или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. Неврологическое или психическое заболевание может представлять собой любое из перечисленных выше.

[00127] Предпочтительно, неврологическое или психическое заболевание выбрано из нейродегенеративных расстройств, воспаления и некоторых типов рака, рассеянного склероза, нейромиелита зрительного нерва, бокового амиотрофического склероза (БАС), болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, атаксии Фридрейха, болезни Хантингтона, деменции с тельцами Леви, спинальной мышечной атрофии, большого депрессивного расстройства, шизофрении, глаукомы или периферических невропатий (диабетической невропатии или невропатии при СПИДе).

|00128] Еще одной целью настоящего изобретения является применение соединений любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемых солей и пролекарств в качестве нейростимулирующих лекарственных средств или применение для получения нейростимулирующих лекарственных средств.

[00129] Нейростимулирующие лекарственные средства включают средства, которые улучшают обучение и память, внимание, настроение, коммуникативные навыки и половое поведение. Примерами лекарственных средств, усиливающих когнитивные функции, являются средства, нацеленные на длительную синаптическую потенциацию (ДП) или длительную синаптическую депрессию (ДД), модулирование кальциевых каналов или связывающего цАМФ-чувствительный элемент белка (CREB). цАМФ представляет собой аббревиатуру для циклического аденозинмонофосфата. Конкретные примеры нейростимулирующих лекарственных средств представляют собой ингибиторы фосфодиэстеразы, такие как ролипрам; донепезил; агонисты глутаматных NMDA-рецепторов, такие как D-циклосерин; ампакины; модафинил; метилфенидат.

[00130] Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть введена посредством любых путей, которые позволяют достичь намеченной для нее цели. Например, путь введения может быть пероральным, парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, интраперитонеальным, трансдермальным, интраназальным, введением через слизистую, ректальным или буккальным. В одном варианте реализации фармацевтическую композицию вводят перорально.

[00131] Соединения любой из Формул I-V и их фармацевтически приемлемые соли и пролекарства могут быть приготовлены в виде различных фармацевтических форм для введения. В качестве подходящих композиций могут быть приведены все композиции, обычно применяемые для системного введения лекарственных средств, например, любая твердая (например, таблетки, капсулы, гранулы и т.д.) или жидкая композиция (например, растворы, суспензии, эмульсии и т.д.). Для получения фармацевтических композиций, содержащих соединения любой из Формул I-V, эффективное количество соединения любой из Формул I-V, необязательно в форме соли или пролекарства, в качестве активного ингредиента комбинируют в однородную смесь с фармацевтически приемлемым носителем, который может принимать широкое разнообразие форм в зависимости от формы препарата, требуемого для введения. Желательно получение этих фармацевтических композиций в виде единичной лекарственной формы, подходящей, в частности, для введения перорально, ректально, чрескожно, интратекально, внутривенно или посредством парентеральной инъекции. Например, при получении композиций в виде пероральной лекарственной формы могут быть применены любые из обычных фармацевтических сред, таких как, например, вода, гликоли, масла, спирты и т.п. в случае пероральных жидких препаратов, таких как суспензии, сиропы, эликсиры, эмульсии и растворы; или твердые носители, такие как крахмалы, сахара, каолин, смазывающие вещества, связующие вещества, дезинтегранты и т.п. в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток. Вследствие легкости их введения, таблетки и капсулы представляют собой наиболее предпочтительные пероральные единичные лекарственные формы, в случае которых применяют, очевидно, твердые фармацевтические носители. Для парентеральных композиций носитель обычно содержит стерильную воду, по меньшей мере в большей части, хотя могут быть включены и другие ингредиенты, например, способствующие растворимости. Например, могут быть получены растворы для инъекций, в которых носитель содержит солевой раствор, раствор глюкозы или смесь солевого раствора и раствора глюкозы. Могут также быть получены суспензии для инъекций, в случае которых могут быть применены подходящие жидкие носители, суспендирующие агенты и т.п. Также включены препараты в твердой форме, которые предназначены для превращения в препараты в жидкой форме непосредственно перед применением. В композициях, подходящих для чрескожного введения, носитель необязательно содержит агент, усиливающий проникновение, или подходящий увлажнитель, или оба, необязательно объединенные с подходящими добавками любой природы в незначительных количествах, которые не оказывают выраженного вредного воздействия на кожу. Обзор по различным фармацевтическим формам для введения лекарственных средств и их получению можно найти в книге "Tratado de Farmacia Galenica", de C. Fault i Trillo, 10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones.

[00132] Особенно предпочтительно приготовление вышеупомянутых фармацевтических композиций в виде единичной лекарственной формы из-за удобства введения и однородности дозировки. Термин "единичная лекарственная форма", используемый в настоящей заявке, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз, при этом каждая единица содержит заранее определенное количество активного ингредиента, рассчитанное для обеспечения желаемого терапевтического действия, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Примерами таких единичных лекарственных форм являются таблетки (включая таблетки с насечкой или с покрытием), капсулы, пилюли, суппозитории, порошки в пакетиках, капсулы-имплантаты, растворы или суспензии для инъекций и т.п. и их раздельные кратные формы.

[00133] Композиции в соответствии с настоящим изобретением, включающие единичные лекарственные формы, могут содержать активный ингредиент в количестве, которое находится в диапазоне от примерно 0,1% до 70%, или от примерно 0,5% до 50%, или от примерно 1% до 25%, или от примерно 5% до 20%, причем, остальная часть содержит носитель, при этом вышеуказанные проценты представляют собой отношение масс./масс. из расчета на общую массу композиции или лекарственной формы.

[00134] Доза соединения любой из Формул I-V, его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, подлежащая введению, зависит от индивидуального случая и, как обычно, должна быть адаптирована к условиям индивидуального случая для достижения оптимального эффекта. Таким образом, она, несомненно, зависит от частоты введения и от эффективности и продолжительности действия соединения, применяемого в каждом случае для терапии или профилактики, но также от природы и тяжести заболевания и симптомов и от пола, возраста, массы тела, приема сопутствующих лекарственных препаратов и индивидуальной восприимчивости субъекта, подлежащего лечению, и от того, является ли терапия экстренной или профилактической. Дозы могут быть адаптированы в зависимости от веса и для применения в педиатрии. Суточные дозы могут быть введены один раз в сутки или в нескольких количествах, таких как два раза в сутки, три раза в сутки или четыре раза в сутки.

Синтез соединений

[00135] Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены с применением способов, известных специалистам в данной области техники в свете настоящего описания. Например, соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены, как описано в Masip, et al., 2005.

Исследование соединений

[00136] В дополнение к анализам, описанным в Примерах, соединения согласно настоящему изобретению могут быть исследованы в моделях болезни Альцгеймера in vitro следующим образом: применяют линию клеток SH-SY5Y нейробластомы человека для исследования нейропротекторного эффекта изучаемого соединения при болезни Альцгеймера. Клетки предварительно обрабатывают в течение 3 часов изучаемым соединением в разных концентрациях (20 нг/мл, 100 нг/мл, 2 мкг/мл, 20 мкг/мл и 50 мкг/мл) изучаемым соединением (100 нг/мл). Затем добавляют фибриллы бета-амилоида (100 мкМ) и инкубируют в течение 24 ч. На следующий день определяют количество выживших клеток посредством анализа с применением 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-теста).

[00137] Индукция фосфорилирования TrkA, IκBα и SAPK/JNK соединениями согласно настоящему изобретению может быть исследована следующим образом. Активация TrkA представляет собой первое событие в сигнальном каскаде, ведущем к дифференцировке и выживанию чувствительных к действию ФРН нейронов и клеток PC12 (Greene and Tischler, 1976; Chao, 2003; Huang and Reichardt, 2003). Для оценки того, является ли нейротрофная активность ФРН-подобных пептоидов опосредованной взаимодействием с рецептором TrkA, может быть проанализирована способность пептоидов индуцировать фосфорилирование TrkA в клетках PC12. Активность пептоидов может быть проверена в диапазоне концентраций, которые были эффективны в опытах по изучению дифференцировки клеток PC12.

[00138] Анализ посредством Вестерн-блоттинга. Субконфлюэнтные клетки выращивают в течение ночи в среде, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 1% лошадиной сыворотки (ЛС), и стимулируют обработкой 100 нг/мл ФРН и ФРН-подобных малых молекул для указанных временных точек. Затем клетки промывают холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и быстро разрушают ультразвуком в буфере для образцов, содержащем ДСН (содержащем β-меркаптоэтанол и 2 мМ ПМСФ). Лизаты (200 мкг общего белка) разделяют посредством электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН и переносят на нитроцеллюлозу (Whatman, Dassel, Germany). После блокирования 5% обезжиренным молоком в Трис-солевом буфере с добавлением Твина 20 (ТСБТ) (10 мМ Трис pH 7,5; 150 мМ NaCl/0,2% Твин 20) блоты выдерживают в течение ночи при 4°C с антителами против фосфо-TrkA (Tyr 490) (1:1000), антителами против TrkA (1:1000), мышиными антителами (5А5) против фосфо-IκBα (Ser 32/36) (1/1000), мышиными антителами (L35A5) против IκBα (1:1000), антителами против фосфо-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (1:1000) или антителами против SAPK/JNK (1/1000) (все антитела от Cell Signaling) с последующей инкубацией с конъюгированным с пероксидазой хрена IgG (Jackson ImmunoResearch) в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ). Детекцию фосфорилированных форм проводят с применением метода усиленной хемилюминесценции (enhanced chemiluminescence, ECL) (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ).

[00139] Для исследования того, активируют ли соединения согласно настоящему изобретению р75, может быть проанализирована активация сигнального пути NF-κВ (Bonizzi G, Karin M. 2004) и сигнального пути SAPK/JNK (гибель клеток) в клеточных линиях PC12 и RN22. Клетки RN22 экспрессируют высокие уровни мРНК и белка рецептора р75, в то время как экспрессия ими TrkA не может быть обнаружена (Gentry et al., 2000). NF-κВ функционально активен в качестве регулятора транскрипции при нахождении в димерной форме, состоящей из гомо- или гетеродимеров, при этом прототипный димер NF-κВ состоит из субъединиц р65 и р50. Активация NF-κВ происходит преимущественно за счет деградации белков IκВ, представителей семейства ингибиторных белков; связывающихся с димерами NF-κВ. В ответ на активирующие стимулы ингибиторные белки фосфорилируются, что направляет их по пути убиквитинирования и последующей деградации. Один представитель семейства ингибиторных белков, IκBα, подвергается деградации в ответ на действие большинства активаторов NF-κВ (Ghosh et al., 1998). Для изучения активации NF-κВ в ответ на ФРН и разные выбранные пептоиды иммуноблоты тотальных клеточных экстрактов из клеток RN22 и PC12, обработанных ФРН и пептоидами в течение различных периодов времени, инкубируют с антителами против фосфо-IκBα.

[00140] В нескольких нейронных системах активация JNK была причинно связана с индукцией программируемой клеточной смерти (Bhakar et al., 2003). В культуре клеток передача сигналов ФРН посредством р75 приводила к активации и NF-κВ, и JNK, в конечном итоге вызывая программируемую гибель клеток (Yoon et al., 1998). Для исследования активности JNK в клетках RN22 может быть проведен Вестерн-блоттинг с применением антител против фосфо-SAPK/JNK для оценки активации данного сигнального пути.

[00141] Эффект пептидомиметиков нейротрофинов (например, ФРН-миметических пептоидов) в модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) может быть оценен следующим образом:

[00142] Животные, индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита и лечение. Клинические исследования одобрены Комитетом по содержанию животных Университета Барселоны (University of Barcelona Committee on Animal Care). Мышей-самок линии C57BL/6 от Harlan (в возрасте 8-12 недель) подкожно иммунизируют в обе задние лапы 300 мкг пептида 35-55 миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (МОГ) (Spikem, Firenze), эмульгированного с 50 мкг Mycobacterium tuberculosis (штамм H37Ra; Difco, Detroit, MI) в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ), как описано ранее (Palacios et al. 2007). Мышам вводят посредством интраперитонеальной инъекции Pertussis toxin (Sigma) (500 нг) во время иммунизации и через 2 дня. Животных взвешивают и проверяют на наличие клинических признаков заболевания каждый день посредством независимого наблюдения. Тяжесть ЭАЭ оценивают в соответствии со следующей шкалой: 0 = норма; 0,5 = обмякший хвост в легкой степени; 1 = обмякший хвост; 2 = легкий парапарез задних конечностей, неустойчивая походка; 3 = умеренный парапарез, произвольные движения еще возможны; 4 = параплегия или тетрапарез; 5 = состояние агонии. Приведенные данные клинических исследований представляют собой результаты двух независимых экспериментов, проведенных с указанным числом животных (Moreno et al., 2006).

[00143] Растворы исследуемых соединений готовят в воде с добавлением 5% ДМСО. Животных обрабатывают исследуемым соединением (25, 50 и 100 мг/кг) или плацебо (вода + 5% ДМСО) посредством ежедневной интраперитонеальной инъекции, начиная после иммунизации. В конце исследования мышам вводят анестезию и вводят в полость сердца раствор 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,6). Головной мозг, спинной мозг и селезенку препарируют и либо фиксируют, либо замораживают до применения. У всех животных, включенных в исследование, отбирают сыворотку и измеряют уровни трансаминаз.

[00144] Для оценки действия пептидомиметиков нейротрофинов (например, ФРН-подобных пептоидов) "in vivo" может быть изучено действие пептидомиметиков нейротрофинов (например, ФРН-миметических пептоидов) в животной модели PC. Мышей линии C57BL/6, иммунизированных пептидом 35-55 МОГ, ежедневно обрабатывают исследуемым соединением посредством интраперитонеального введения со дня 0 по день 25 при разных концентрациях соединения. Действие соединений согласно настоящему изобретению на ЦНС и периферическое воспаление может быть проверено следующим образом.

[00145] Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Образцы головного и спинного мозга мышей, полученные на момент смерти, гомогенизируют в лизирующем буфере для выделения РНК. Тотальную РНК экстрагируют с применением набора RNeasy Mini Kit для выделения РНК (Qiagen, Chatwworth, CA), включая обработку ДНКазой с помощью препарата ДНКазы, не содержащего РНКаз (Quiagen). Тотальную РНК (35 мкг) вводят в реакцию обратной транскрипции с применением системы для обратной транскрипции (High Capacity cDNA Archive Kit; Applied Biosystems, Foster City, CA). Реакцию в режиме реального времени проводят при 25°C в течение 10 минут, далее при 37°C в течение 2 часов и в конце продукты реакции хранят при 4°C. Праймеры и мишень-специфичные зонды TaqMan с флуоресцентными метками могут быть приобретены в Applied Biosystems (системы для анализа экспрессии генов TaqMan). Например, может быть применен универсальный мастер-микс (концентрированная смесь компонентов для проведения ПЦР) TaqMan (Applied Biosystems). Амплификацию комплементарной ДНК осуществляют с помощью термоциклера DNA Engine Opticon 2 Real-Time System (MJ Research, Watertown, MA) с применением 0,9 мкМ каждого праймера и 0,25 мкМ зонда и 20 нг комплементарной ДНК. Условия реакции представляют собой: первые 2 минуты при 50°C с последующими 10 минутами при 95°C и 40 циклами по 15 секунд при 95°C и 1 минуте при 60°C. Анализ каждого образца выполняют в трех повторностях, и в каждом планшете ДНК-мишень и внутренний контроль амплифицируют в разных лунках. Экспрессию исследуемого гена определяют количественно относительно уровня гена "домашнего хозяйства" 18rRNA (Palacios et al., 2008).

[00146] Иммуногистохимическое исследование. Гистологическую оценку выполняют на фиксированных параформальдегидом и залитых в парафин срезах головного и спинного мозга. Срезы толщиной 10 мкм окрашивают гематоксилином и красителем для миелина Luxol Fast Blue для оценки воспаления и демиелинизации. Полуколичественную гистологическую оценку воспаления и демиелинизации проводят и подсчитывают с помощью слепого метода с применением следующей шкалы: 0 = норма; 1 = периваскулярные инфильтраты в количестве 1-3/срез с минимальной демиелинизацией; 2 = периваскулярные инфильтраты в количестве 3-10/срез, сопровождаемые умеренной демиелинизацией; 3 = широко распространенная периваскулярная инфильтрация, обширная демиелинизация с большими сливными очагами (Villoslada et al., 2001).

[00147] Иммуногистохимические процедуры выполняют на залитых в парафин срезах головного и спинного мозга толщиной 10 мкм, как описано ранее (Villoslada et al., 2001). Первичные антитела добавляют в концентрации 1/1000 для антител МСА500 (крысиные антитела против CD3 мыши от Serotec) и 1/500 для антител МСА1107 (крысиные антитела против CD4 мыши от Serotec). Специфичность иммунных реакций определяют путем инкубации срезов без первичных антител или с применением соответствующих изотипических контролей, не обладающих иммунореактивностью.

[00148] Анализ пролиферации. Спленоциты из интактных, не иммунизированных мышей линии C57BL/6 получают для оценки in vitro действия исследуемых соединений на пролиферацию клеток. Анализ пролиферации спленоцитов проводят, как описано ранее (Martinez-Forero et al., 2008).

[00149] Для оценки действия исследуемых соединений на периферический иммунный ответ оценивают пролиферативный ответ против иммунизирующего антигена (МОГ) в спленоцитах интактных животных и профиль цитокинов в клетках селезенки животных, получавших плацебо и исследуемые вещества. Экспрессия генов интерлейкина 2 (ИЛ2), интерферона γ (ИФНγ), фактора некроза опухоли α (ФНОα), индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и интерлейкина 10 (ИЛ10) в спленоцитах животных, получавших плацебо и исследуемые вещества, в конце эксперимента может быть исследована посредством количественной ПЦР с обратной транскрипцией.

[00150] Статистический анализ. Статистические анализы могут быть выполнены с помощью двухстороннего U-критерия Манна-Уитни для сравнения оценок тяжести ЭАЭ, критерия хи-квадрат для сравнения заболеваемости и кривых Каплана-Мейера для различий дня начала ЭАЭ. P-величины, меньшие чем 0,05, указывают на статистически значимое различие. Статистическую оценку проводят с использованием статистической программы SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL).

[00151] Следующие примеры являются иллюстративными, но не ограничивающими примерами соединений, композиций и способов согласно настоящему изобретению. Подходящие модификации и усовершенствования множества условий и параметров, обычно встречающиеся в клинической терапии и очевидные специалистам в данной области техники в свете настоящего описания, находятся в рамках настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1 Конструирование агонистов ФРН с применением комбинаторной химии

[00152] Общие положения. Растворители, амины и другие реагенты были приобретены у коммерческих поставщиков и использованы без дополнительной очистки. Реакции, протекающие под воздействием микроволнового излучения, проводили в круглодонной колбе объемом 100 мл, снабженной холодильником Димрота. Колбу помещали в одномодовый резонатор микроволнового реактора модели СЕМ Discover. ЯМР-спектры регистрировали на спектрометре Varian Inova 500 (¹H ЯМР, 500 МГц;¹³C ЯМР, 125 МГц) и на спектрометре Unity 300 (¹H ЯМР, 300 МГц;¹³C ЯМР, 75 МГц). При необходимости отнесения пиков для соединений в¹H и¹³C ЯМР-спектрах подтверждали с помощью экспериментов gDQCOSY и gHSQC. Появление различных конформеров привело к весьма сложному виду спектров; значения химических сдвигов, приведенные ниже, относятся к основному конформеру, присутствующему в образце. Анализы посредством обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) проводили в модульной системе Hewlett Packard Series 1100 (УФ-детектор 1315А) с применением колонки с обращенной фазой Kromasil 100 C8 (25×0,46 см, 5 мкм) со смесями CH₃CN-буфер формиат аммония (20 мМ, pH=5,0) в качестве подвижной фазы при скорости потока 1 мл/мин и детектированием на длине волны 220 нм. Полупрепаративную ОФ-ВЭЖХ проводили в системе Waters (Milford, MA, U.S.A.). Анализы посредством масс-спектрометрии высокого разрешения с бомбардировкой ускоренными атомами (HRMS-FAB) проводили в Каталонском институте химических исследований (Institute de Quimica Avanzada de Cataluna, IQAC) (Испания).

[00153] Синтез индивидуальных пептоидов. Синтез индивидуальных пептоидов G79, G80 и G81 для анализов in vitro и in vivo проводили, следуя основополагающей методике, описанной группой исследователя Zuckermann, с некоторыми модификациями (Zuckermann et al, 1992).

[00154] Синтез проводили на полистирольной смоле AM RAM со степенью поперечной сшивки, составляющей 1%, содержащей защищенный флуоренилметоксикарбонилом (Fmoc) амидный линкер Ринка (0,79 ммоль/г, Rapp Polymer; Germany). Суспензию 4 г смолы в 50 мл ДМФ помещали в круглодонную колбу объемом 100 мл, снабженную магнитной мешалкой. Суспензию перемешивали в течение 5 мин при 20°C, растворитель удаляли посредством фильтрования через полипропиленовый шприц объемом 60 мл, снабженный пористым фильтром из полиэтилена. Затем смолу снова переносили в реакционную колбу.

[00155] 1. Снятие Fmoc-защиты. Раствор 60 мл 20% пиперидина в ДМФ добавляли в круглодонную колбу, содержащую смолу. Смесь оставляли для протекания реакции при активации микроволновым излучением в течение 5 мин при 60°C и 150 Вт. Смолу осушали в шприце объемом 60 мл и промывали 40 мл ДМФ. Обработку проводили дважды. Затем смолу фильтровали и промывали ДМФ (3×40 мл), iPrOH (3×40 мл) и CH₂Cl₂ (3×40 мл). Наконец, смолу осушали в течение 2 мин и переносили в реакционную колбу. Реакцию снятия защиты контролировали посредством анализа с применением тринитробензолсульфоновой (ТНБС) кислоты (красное окрашивание означало положительный ответ).

[00156] 2. Первое ацилирование. Смолу обрабатывали раствором 5 эквивалентов бромуксусной кислоты (2,2 г, 15,8 ммоль) и 5 эквивалентов N,N-диизопропилкарбодиимида (2,5 мл, 15,8 ммоль) в 50 мл ДМФ. Ацилирование проводили под воздействием микроволнового излучения (5 мин, 60°C, 150 Вт). Затем смолу фильтровали с помощью шприца и промывали 40 мл ДМФ. Реакцию проводили дважды. Впоследствии смолу фильтровали и промывали ДМФ (3×40 мл), iPrOH (3×40 мл) и CH₂Cl₂ (4×10 мл). Далее смолу осушали в течение 2 мин, и отсутствие первичного амина оценивали посредством ТНБС-теста.

[00157] 3. Первое аминирование. Суспензию ацилированной смолы в 50 мл ДМФ обрабатывали подходящим первичным амином в соответствии с конечным соединением: 5 эквивалентов (2,2 мл, 15,8 ммоль) 2,2 мл 1-(3-аминопропил)-2-пирролидинона или 5 эквивалентов (3,2 г, 15,8 ммоль) 4-(2-аминоэтил) бензолсульфонамида. Реакцию проводили под воздействием микроволнового излучения (7 мин, 80°C, 150 Вт). Реакцию проводили дважды, промывая и осушая смолу с помощью шприца между обработками. Наконец, смолу осушали в течение 2 мин и переносили в колбу. Включение амина подтверждали посредством анализа с применением хлоранила (зеленое окрашивание для вторичных аминов).

[00158] 4. Вторая и третья стадии ацилирования. Указанные стадии проводили аналогично первой стадии ацилирования. В этом случае двух процедур ацилирования было достаточно для завершения реакции.

[00159] 5. Вторая и третья стадии аминирования. Указанные стадии проводили аналогично первой стадии аминирования путем применения соответствующих первичных аминов. Таким образом, 5 эквивалентов (1,8 мл, 15,8 ммоль) 2-метил-1-пропанамина применяли для второго аминирования. Для третьего аминирования 5 эквивалентов (2,0 мл, 15,8 ммоль) 2-(2-фторфенил)этанамина или 5 эквивалентов (2,0 мл, 15,8 ммоль) 2-(1-пирролидинил)этанамина применяли согласно составу соответствующего пептоида.

[00160] 6. Расщепление. После осушения смолы ее разделяли на четыре аликвоты и каждую обрабатывали 20 мл смеси для расщепления (60:40:2 (об/об/об) ТФУ/CH₂Cl₂/H₂O). Смеси перемешивали в течение 30 мин при 20°C и фильтровали через полипропиленовые шприцы объемом 10 мл, снабженные пористым диском из полиэтилена. Фильтраты собирали в колбу объемом 250 мл, и растворители удаляли при пониженном давлении. Наконец, остаток в виде желтого масла, полученный в случае каждого пептоида, снова растворяли в смеси H₂O/АЦН и лиофилизовали с получением 1,25-1,80 г желаемого неочищенного пептоида с чистотой выше 85% по данным ВЭЖХ.

[00161] 7. Очистка и химическая характеризация. Соединения очищали посредством полупрепаративной ВЭЖХ с применением колонки Waters PrePack^®-C₁₈ (47×300 мм, 15-20 мкм) с элюированием смесями CH₃CN/H₂O, содержащими 0,1% ТФУ, в качестве подвижной фазы и скоростью потока 60 мл/мин. Конечные соединения получали с чистотой выше 98% по данным ВЭЖХ. Полученные количества составляли: 10,64 мг соединения G79 (чистота 99%; ВЭЖХ), 7,55 мг соединения G80 (чистота 99%; ВЭЖХ) и 12,68 мг соединения G81 (чистота 99%; ВЭЖХ).

[00162] [N-(2-(2'-Фторфенил)этил)глицил]-[N-(2-метилпропил)глицил]-N-[3-(2'-оксопирролидинил)пропил]глицинамид (G79). Химическая формула: C₂₅H₃₈FN₅O₄; MM 491,5987.

[00163] [N-(2-(2'-Фторфенил)этил)глицил]-[N-(2-метилпропил)глицил]-N-[2-(4'-сульфамоилфенил)этил]глицинамид (G80). Химическая формула: C₂₆H₃₆FN₅O₅S; MM 549,658.

[00164] [N-(2-(1-Пирролидинил)этил)глицил]-[N-(2-метилпропил)глицил]-N-[2-(4'-сульфамоилфенил)этил]глицинамид (G81). Химическая формула: C₂₄H₄₀N₆O₅S; MM 524,6766.

ПРИМЕР 2

Анализ влияния величины дозы на дифференцировку на линии клеток РС12

[00165] Культура клеток. Сток клеток PC12 поддерживали в среде Хэма F12 с добавлением 2,5% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 15% лошадиной сыворотки (ЛС) и 1% пенициллина/стрептомицина. Клеточную культуру поддерживали в атмосфере 5% CO₂ при 37°C.

[00166] Дифференцировку клеток PC12 оценивали путем обработки клеток всеми исследуемыми соединениями (G79, G80 и G81) в различных концентрациях (2-20-100 нг/мл и 2-20-50 мкг/мл). Сначала клетки высевали в покрытые коллагеном 24-луночные планшеты с 2,5% ФБС в среде с целью пребывания в недифференцированном состоянии. Через 72 ч добавляли исследуемые соединения и ФРН (Sigma Aldrich; 100 нг/мл) в качестве положительного контроля дифференцировки. Количество дифференцированных клеток с аксонами, большими чем два тела клетки в длину, подсчитывали через 3 дня после обработки. Подсчет клеток выполняли в трех выбранных случайным образом полях, содержащих 100 клеток.

[00167] Соединения G79, G80 и G81 индуцировали дифференцировку клеток PC12 (ФИГ.1A-1D). Положительный контроль ФРН индуцировал дифференцировку 16,1±1,9 клеток в поле 100 клеток. Соединение G79 индуцировало значительную дифференцировку по сравнению с контрольными необработанными клетками РС12 дозозависимым образом (2-20-100 нг/мл и 2-20 мкг/мл). Лучшая действующая концентрация составляла 20 мкг/мл (количество клеток: 11,3±2,68). При концентрации 50 мкг/мл количество дифференцированных клеток уменьшалось.

[00168] Соединение G80 индуцировало достаточную дифференцировку с очень длинными аксонами в клетках PC12. Лучшая действующая концентрация составляла 20 нг/мл. Соединение G81 индуцировало значительную дифференцировку по сравнению с контрольными необработанными клетками РС12 дозозависимым образом до концентрации 100 нг/мл, представлявшей собой лучшую действующую концентрацию (количество клеток: 9,2±3,9). При более высокой концентрации количество дифференцированных клеток уменьшалось. Процент дифференцированных клеток рассчитывали относительно ФРН-индуцированной дифференцировки (ФИГ.1E).

ПРИМЕР 3

Анализы выживаемости

Пептидомиметики нейротрофинов G79, G80 и G81 стимулируют выживание клеток.

[00169] Культура клеток. Клетки шванномы крыс линии RN22 культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина. Клеточную культуру поддерживали в атмосфере 5% CO₂ при 37°C.

[00170] Клетки RN22 высевали в 24-луночные планшеты в концентрации 30000 клеток/лунка в среде без сыворотки. Через 24 ч исследуемые соединения G79, G80 и G81 добавляли в различных концентрациях (1-10-50 нг/мл и 1-10 мкг/мл), и ФРН применяли в качестве положительного контроля выживаемости. Клетки инкубировали таким образом в течение 2 ч. Окислительный стресс индуцировали добавлением сульфата меди (CuSO₄) в конечной концентрации, составляющей 150 мкг/мл. После инкубации в течение ночи определяли жизнеспособность клеток путем считывания поглощения после добавления МТТ (Sigma Aldrich).

[00171] Процент выживших клеток рассчитывали относительно ФРН-индуцированной дифференцировки (ФИГ.2). Соединение G79 увеличивало жизнеспособность клеток во всех исследованных концентрациях (1-10-50 нг/мл и 1-10 мкг/мл) с лучшей действующей концентрацией, составляющей 10 нг/мл (98,11% жизнеспособности клеток в % относительно контроля, не подвергнутого стессу). Соединение G80 увеличивало жизнеспособность клеток во всех исследованных концентрациях (1-10-50 нг/мл и 1-10 мкг/мл) с лучшей действующей концентрацией, составляющей 50 нг/мл (99,86% жизнеспособности клеток в % относительно контроля, не подвергнутого стессу). Соединение G81 увеличивало жизнеспособность клеток во всех исследованных концентрациях (1-10-50 нг/мл и 1-10 мкг/мл) с лучшей действующей концентрацией, составляющей 50 нг/мл (101,86% жизнеспособности клеток в % относительно контроля, не подвергнутого стессу).

ПРИМЕР 4

Анализ стимулирования секреции

Соединения G79, G80 и G81 не стимулируют секрецию ФРН.

[00172] Для оценки того, выступают ли исследуемые соединения, G79, G80 и G81, в качестве стимуляторов секреции, вызывая нейротрофную активность посредством синтеза ФРН, клетки PC 12 высевали в покрытые коллагеном 24-луночные планшеты с добавлением исключительно 2,5% ФБС и через 72 ч клетки обрабатывали исследуемыми соединениями (каждое в концентрации 100 нг/мл) совместно с антителами против ФРН (1 мкг/мл, AbCam). Через три дня после обработки оценивали дифференцировку. Подсчет клеток выполняли в трех i выбранных случайным образом полях, содержащих 100 клеток.

[00173] Обработка соединениями G79, G80 или G81 совместно с антителами против ФРН индуцировала дифференцировку клеток PC12 одинаковым образом по сравнению с дифференцировкой, индуцированной исследуемыми соединениями в отдельности (ФИГ.3A). В то время как число дифференцированных под действием ФРН клеток уменьшалось при добавлении антител против ФРН (12,8±6,3 в сравнении с 20,7±7,1), число дифференцированных клеток оказалось довольно схожим при сравнении обработки исследуемыми соединениями в отдельности с обработкой этими соединениями совместно с антителами против ФРН. Обработка соединением G79/антителами против ФРН приводила к получению числа дифференцированных клеток для каждого поля, равного 18,8±4,9, в сравнении с 11,5±2,8 для обработки соединением G79 в отдельности; в случае обработки соединением G80/антителами против ФРН число дифференцированных клеток составляло 14,1±1,8 в сравнении с 15,1±6,3 для обработки соединением G80 в отдельности; в случае обработки соединением G81/антителами против ФРН число дифференцированных клеток составляло 15,5±4,1 в сравнении с 14,1±3,3. Процент дифференцированных клеток рассчитывали относительно ФРН-индуцированной дифференцировки (ФИГ.3F).

ПРИМЕР 5

Анализ синергической активности

Соединения G79, G80 и G81 не обладают синергической активностью с ФРН.

[00174] Для оценки того, препятствуют ли малые молекулы G79, G80 и G81 максимальной активности ФРН или приводят ли к аддитивным эффектам, клетки PC12 высевали в покрытые коллагеном 24-луночные планшеты с добавлением 2,5% ФБС и обрабатывали через 72 ч низкомолекулярными веществами (каждое в концентрации 100 нг/мл) в комбинации с ФРН в концентрации 100 нг/мл. В этом же эксперименте клетки PC12 обрабатывали низкомолекулярными соединениями или ФРН в отдельности в качестве контролей. Число дифференцированных клеток оценивали через три дня после обработки. Подсчет клеток выполняли в трех выбранных случайным образом полях, содержащих 100 клеток.

[00175] Результаты представлены на ФИГ.3B. Обработка молекулами G79, G80 или G81 совместно с ФРН снижала активность ФРН, приводя к уменьшению числа дифференцированных клеток при комбинированной обработке ФРН/G79-G80-G81. В то время как число дифференцированных под действием ФРН клеток в данном эксперименте составляло 20±7,1, число дифференцированных клеток, полученное посредством обработки ФРН/G79 оказалось равным 11,3±2,6. В случае обработки ФРН/G80 полученное число дифференцированных клеток составляло 13±5,9. В случае обработки ФРН/G81 полученное число дифференцированных клеток составляло 13,3±3,8. В целом приведенные результаты исключают возможность того, что соединения G79, G80 или G81 могут обладать аддитивными, синергическими или антагонистическими эффектами с ФРН. Процент дифференцированных клеток рассчитывали относительно ФРН-индуцированной дифференцировки (ФИГ.3G).

ПРИМЕР 6

Анализ активации рецептора

[00176] Гипотеза о том, что соединения G79, G80 и G81 могут действовать посредством связывания с внеклеточным участком (сайтом связывания) TrkA и активировать тирозинкиназный рецептор, была проверена путем обработки клеток PC12 низкомолекулярными веществами в комбинации с антителами против TrkA или K252a, ингибитором тирозинкиназы. С этой целью клетки PC12 высевали в покрытые коллагеном 24-луночные планшеты с добавлением 2,5% ФБС и через 72 ч инкубировали с низкомолекулярными соединениями в отдельности или в комбинации с антителами против TrkA (AbCam, 1:2000) или K252a. ФРН (100 нг/мл) применяли в качестве контроля и добавляли в отдельности или в комбинации с антителами против TrkA или K252a. Число дифференцированных клеток оценивали через три дня после обработки. Подсчет клеток выполняли в трех выбранных случайным образом полях, содержащих 100 клеток. Результаты представлены на ФИГ.3C.

[00177] Обработка молекулами G79, G80 и G81 совместно с антителами против TrkA не ингибировала дифференцировку клеток PC12. В то время как число дифференцированных под действием ФРН клеток уменьшалось путем добавления антител против TrkA (12,8±6,3 в сравнении с 20,7±7,1), число дифференцированных клеток оказалось схожим. Обработка соединением G79/антителами против TrkA индуцировала дифференцировку клеток PC12: 19,6±8,1 в сравнении с 11,5±2,8 для обработки соединением G79 в отдельности; в случае обработки соединением G80/антителами против TrkA число дифференцированных клеток составляло 14,6±4,1 в сравнении с 15,1±6,3 для обработки соединением G80 в отдельности; в случае обработки соединением G81/антителами против TrkA число дифференцированных клеток составляло 16,5±5,9 в сравнении с 14,1±3,3. Процент дифференцированных клеток рассчитывали относительно ФРН-индуцированной дифференцировки (ФИГ.3H).

ПРИМЕР 7

Анализы ингибирования передачи сигналов

Соединения G79, G80 и G81 активируют сигнальные пути дифференцировки ФРН.

[00178] Для оценки того, включает ли путь передачи сигнала, индуцируемый соединениями G79, G80 и G81, активацию AKT и ERK, клетки PC12 обрабатывали исследуемыми соединениями в присутствии LY2 94002, ингибитора PI3K (вышележащего активатора AKT), и PD98059, ингибитора киназы МАРК (вышележащего активатора ERK). С этой целью клетки PC12 высевали в покрытые коллагеном 24-луночные планшеты с добавлением 2,5% ФБС и через 72 ч клетки обрабатывали низкомолекулярными соединениями в комбинации с LY294002 (Sigma Aldrich, 10 мкМ) или PD98059 (Sigma Aldrich, 50 мкМ). ФРН (100 нг/мл) применяли в качестве контроля и добавляли отдельно или в комбинации с ингибиторами.

[00179] Для оценки того, модулируют ли соединения G79, G80 или G81 сигнальный путь TrkA, применяли ингибиторы сигнальных путей АКТ и ERK. Обработка ФРН плюс LY294002 (ФИГ.3D) уменьшала число дифференцированных клеток по сравнению с ФРН в отдельности (6,8±2,7 в сравнении с 20,7±7,1). Таким же образом обработка соединением G79 плюс LY294002 уменьшала число дифференцированных клеток по сравнению с соединением G79 в отдельности (5,28±2,54 в сравнении с 11,5±2,8). Обработка соединением G80 плюс LY294002 уменьшала число дифференцированных клеток по сравнению с соединением G80 в отдельности (8,5±2,6 в сравнении с 15,1±6,3). Обработка соединением G81 плюс LY294002 уменьшала число дифференцированных клеток по сравнению с соединением G81 в отдельности (6,6±4,02 в сравнении с 14,1±3,3). Процент дифференцированных клеток рассчитывали относительно ФРН-индуцированной дифференцировки (ФИГ.3I).

[00180] Обработка ФРН плюс PD98059 (ФИГ.3E) уменьшала число дифференцированных клеток по сравнению с ФРН в отдельности (2,1±1,9 в сравнении с 20,7±7,1). Таким же образом обработка соединением G79 плюс PD98059 уменьшала число дифференцированных клеток по сравнению с соединением G79 в отдельности (3,1±1,06 в сравнении с 11,5±2,8). Обработка соединением G80 плюс PD98059 уменьшала число дифференцированных клеток по сравнению с соединением G80 в отдельности (4±2,3 в сравнении с 15,1±6,3). Обработка соединением G81 плюс PD98059 уменьшала число дифференцированных клеток по сравнению с соединением G81 в отдельности (1,6±1,1 в сравнении с 14,1±3,3). Процент дифференцированных клеток рассчитывали относительно ФРН-индуцированной дифференцировки (ФИГ.3J).

ПРИМЕР 8

Анализ связывания

[00181] Связывание исследуемых соединений, G79, G80 и G81, рецепторами TrkA или р75 было изучено посредством клеточного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). Сначала клетки PC12 высевали в 96-луночные планшеты (Fisher Scientific) и инкубировали до слияния на 85%-90%. Для проверки связывания исследуемых соединений с рецептором TrkA рецептор р75, экспрессируемый на поверхности клеток PC12, ингибировали посредством связывания блокирующих антител против р75 (AbCam), которые связывают внеклеточный домен рецептора. Клетки инкубировали в течение 45 мин с ФРН в разных возрастающих концентрациях (0,01-0,1-1 нМ) в присутствии или в отсутствие каждого из низкомолекулярных соединений в качестве конкурентов при постоянной концентрации последних. После одной промывки в холодном ФСБ клетки фиксировали в течение 15 мин 4% ПФА. Далее клетки промывали ФСБ и инкубировали с антителами против ФРН (1 мкг/мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки дважды промывали ФСБ и инкубировали с вторичными антителами против ФРН в течение 1 ч при комнатной температуре (1:500; DyLight 488-conjugated antibody, Jackson ImmunoResearch). Клетки промывали и считывали показания флуоресценции с применением спектрофлуориметра при длине волны 488 нм.

ПРИМЕР 9

Модель глаукомы

Соединение G79 предотвращает гибель нейронов в животной модели глаукомы.

[00182] 12 крыс линии Sprague Dawley (в возрасте 4 месяцев) анестезировали изобутаном и подвергали инъекции гипертонического солевого раствора в эписклеральную вену правого глаза. Внутриглазное давление (ВГД) измеряли до операции и контролировали один раз в неделю с помощью тонометра TonoLab в течение 7 недель. Введение соединения G79 было начато через одну неделю после индукции глаукомы путем местного применения на конъюктиву. Были проведены два разных эксперимента.

[00183] В первом эксперименте соединение G79 растворяли в физиологическом растворе и применяли в двух разных концентрациях (200 мкг/мл и 400 мкг/мл). ФРН применяли в качестве положительного контроля (200 мкг/мл), а физиологический раствор, используемый для растворения всех веществ, выступал в качестве плацебо. Животные были разделены на 4 группы (по 3 животных в каждой группе): глаукома-G79 200 мкг/мл; глаукома-G79 400 мкг/мл; глаукома-ФРН; глаукома-плацебо. Левый глаз служил контролем отсутствия глаукомы. В обоих экспериментах через семь недель после индукции глаукомы животных умерщвляли путем передозировки анестетиком и их глаза забирали и фиксировали в 4% ПФА. Глаза помещали в парафин и разделяли на срезы толщиной 20 мкм для применения в гистологических исследованиях (окрашивание гематоксилином и эозином). Подсчет числа ганглионарных клеток сетчатки (ГКС) выполняли случайным образом в десяти различных полях для каждого глаза.

[00184] Крысам вводили в глаз гипертонический раствор, индуцировавший высокое внутриглазное давление, в течение пяти недель. Животным вводили глазные капли, содержащие ФРН (200 мкМ/мл), соединение G79 (200-400 мкМ/мл) или плацебо, каждый день в течение пяти недель. Животные с глаукомой, получавшие плацебо (физиологический раствор), демонстрировали значительное уменьшение числа ганглионарных клеток сетчатки по сравнению с контролем. Наоборот, животные, обработанные каплями, содержащими ФРН, а также животные, получавшие соединение G79, демонстрировали значительную защиту ганглионарных клеток (ФИГ.4A). Данные результаты позволяют предположить, что лечение соединением G79 оказывает нейропротекторное действие на ганглионарные клетки сетчатки (ГКС).

[00185] Во втором эксперименте применяли соединение G79 в концентрации 200 мкг/мл. Цель этого второго эксперимента состояла в сравнении эффективности соединения G79 с эффективностью препарата Тимолол, наиболее часто применяемой терапии глаукомы, которая действует за счет снижения внутриглазного давления. Также в этом эксперименте было проведено комбинаторное лечение с применением соединения G79 и Тимолола. Животные были разделены на 4 группы, каждая из которых включала 4 животных: глаукома-G79 (200 мкг/мл) (n=4); глаукома-Тимолол (n=4); глаукома-G79/Тимолол (n=4); глаукома-плацебо (n=4). Левый глаз служил контролем отсутствия глаукомы. Результаты представлены на ФИГ.4C, где соединение G79 сравнивали с современной терапией для ВГД при глаукоме, т.е. Тимололом. Индукция ВГД значительно уменьшала число ГКС, и это уменьшение было статистически значимым по сравнению с контрольными глазами (C) (p<0,0001) и со всеми исследованными типами лечения (p<0,0001). Комбинированное лечение не показало аддитивного эффекта в защите ГКС (**ГЛ/Тимолол + G79 в сравнении с контролем, p=0,02; § ГЛ/Тимолол в сравнении с ГЛ/Тимолол + G79, p=0,003).

ПРИМЕР 10

Модель болезни Паркинсона in vitro (МФП-индуцируемый стресс)

Соединения G79, G80 и G81 предотвращают гибель нейронов в модели болезни Паркинсона in vitro.

[00186] Культура клеток. Клетки линии SH-SY5Y нейробластомы человека поддерживали в культуре в 50% среде Хэма F12 и 50% минимальной питательной среде Игла (ЕМЕМ) с добавлением 10% ФБС, 2 нМ L-глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина. Клеточную культуру поддерживали в увлажненной атмосфере, содержащей 95% воздуха и CO₂, при 37°C.

[00187] Клетки линии SH-SY5Y нейробластомы человека применяли для изучения нейропротекторного эффекта низкомолекулярных соединений в болезни Паркинсона. Клетки SH-SY5Y после дифференцировки в нейрональный фенотип под действием ретиноевой кислоты предварительно обрабатывали в течение 3 часов исследуемыми соединениями в разных концентрациях (20 нг/мл, 100 нг/мл, 2 мкг/мл, 20 мкг/мл и 50 мкг/мл) или BDNF (20 нг/мл) в качестве положительного контроля. Затем добавляли 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП) (100 мкМ) и инкубировали в течение 24 ч. Число выживших клеток определяли на следующий день посредством анализа с применением 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-теста).

[00188] Клетки линии SH-SY5Y нейробластомы человека подвергали воздействию МФТП, которое повреждает нейроны путем окислительного стресса. Клетки обрабатывали BDNF, соединениями G79, G80, G81 или плацебо каждый день в течение пяти недель. Клетки, обработанные плацебо (физиологический раствор), демонстрировали значительную потерю клеток по сравнению с контролем. Наоборот, клетки, предварительно обработанные BDNF, а также соединением G79, демонстрировали значительную защиту нервных клеток (ФИГ.5A).

ПРИМЕР 11

Окислительный стресс в клетках человека линии SH-SY5Y

[00189] Клетки линии SH-SY5Y нейробластомы человека применяли для изучения нейропротекторного эффекта исследуемых соединений G79, G80 и G81 при окислительном стрессе. Клетки предварительно обрабатывали в течение 3 часов исследуемыми соединениями в разных концентрациях (20 нг/мл, 100 нг/мл, 2 мкг/мл, 20 мкг/мл и 50 мкг/мл) или BDNF (20 нг/мл) в качестве положительного контроля. Затем добавляли H₂O₂ (100 мкМ) и инкубировали в течение 24 ч. Число выживших клеток определяли посредством МТТ-теста. Защитный эффект был обнаружен для соединений G79, G80 и G81 при применении H₂O₂ для индукции окислительного стресса в нервных клетках линии SH-SY5Y с более устойчивым антиоксидантным действием у соединения G79 по сравнению с BDNF (ФИГ.5B). На ФИГ.5B жизнеспособность клеток, обработанных BDNF, была принята за 100%. Воздействие H₂O₂ вызывало уменьшение процента жизнеспособности клеток (контроль, не подвергнутый стрессу, в сравнении с H₂O₂=100±2% в сравнении с 95,9±0,5%). Соединение G79 по сравнению с соединениями G80 и G81 оказывало лучший защитный эффект в концентрации 20 нг/мл (BDNF в сравнении с G79=100±2,6 в сравнении с 107,4±5,8).

ПРИМЕР 12

Анализ посредством Вестерн-блоттинга и анализ передачи сигнала с применением технологии Luminex

Соединение G79 активирует нейротрофиновый сигнальный путь

[00190] Анализ посредством Вестерн-блоттинга. Активацию (фосфорилирование) нейротрофиновых рецепторов TrkA и TrkB оценивали с применением Вестерн-блоттинга следующим образом: клетки PC12, растущие в 24-луночных планшетах, обрабатывали средой с низким содержанием сыворотки (0,5% ФБС) для уменьшения исходного уровня фосфорилирования. Через 24 часа клетки PC12 обрабатывали соединением G79 (100 нг/мл), затем собирали и лизировали в 300 мкл ледяного буфера для лизиса (Sigma Aldrich) в моменты времени 5-15-30-60 мин. После разрушения ультразвуком остатки клеток удаляли посредством центрифугирования (14000 об/мин в течение 10 мин) и равные количества супернатанта (30-35 мкг/лунка) наносили в лунки и разделяли посредством электрофореза в 10% полиакриламидном геле (ПААГ-электрофореза) и затем переносили под действием электрического тока на поливинилиденфторидные (ПВДФ) мембраны. Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком и далее последовательно инкубировали с первичными антителами [против фосфо-TrkA, Tyr490 (Cell Signaling) или фосфо-TrkB, Tyr515 (NovusBiological)] в разведении 1:1000 в течение ночи и вторичными антителами в разведении 1:2000 в течение 1 ч при комнатной температуре. Блоты обрабатывали с целью визуализации с применением системы хемилюминесценции (Amersham) и выдерживали с пленкой Kodak для визуализации флуорографического изображения. Как показано на ФИГ.6, оба рецептора находились в фосфорилированной форме уже через 5 мин.

[00191] Анализ передачи сигнала с применением технологии Luminex. Клетки линии SH-SY5Y нейробластомы человека применяли для проведения анализов передачи сигнала на основе технологии Luminex с применением набора 10-Plex MAPK/SAPK Signaling Kit-Phosphoprotein (Millipore). Эта клеточная линия экспрессирует рецептор TrkB, и сигнальный путь MAPK/SAPK, как правило, активируется посредством тирозинкиназных рецепторов. Антитела к фосфопротеинам, входящие в состав набора, представляли собой следующие: антитела против ERK/MAP-киназы (Thr185/Tyr187); STAT-1 (Tyr701); JNK (Thr183/Tyr185); MEK-1 (Ser212); ATF-2 (Thr69/71); р53 (Ser15); HSP27 (Ser78); c-Jun (Ser73); p38 (Thr180/Tyr182); киназы р70 S6 (Thr412); IκBα (Ser32) (приобретен в Millipore).

[00192] Клетки выращивали и затем высевали в 24-луночные планшеты (30000 клеток/лунка). Через 24 часа клетки обрабатывали двумя разными концентрациями агониста G79 рецептора ФРН: 100 нг/мл и 20 мкг/мл. После добавления соединения G79 в среду клетки собирали в буфере для лизиса, входящего в набор, в следующие моменты времени: 30 мин, 1 ч, 2 ч и 6 ч. Анализ проводили таким образом для оценки влияния и времени, и дозы при сравнении обработанных образцов с необработанными клетками, применяемыми в качестве отрицательных контролей (нестимулированные клетки SH-SY5Y). В качестве положительного контроля применяли BDNF в концентрации 20 нг/мл, которая представляет собой лучшую действующую концентрацию, известную в литературе. В планшете Luminex каждый образец был добавлен в лунку в двух повторностях. После добавления всех образцов добавляли специфические положительные и отрицательные контроли фосфорилирования, входящие в набор Luminex. Аналитический буфер также добавляли в двух повторностях в качестве контроля фона.

[00193] ФИГ.7 иллюстрирует внутриклеточный сигнальный путь, активируемый путем фосфорилирования рецепторной тирозинкиназы (РТК). В белых кругах показаны активируемые факторы, тогда как в серых кругах показаны исследуемые факторы. Эффекты сигнального пути клеточной линии SY-SY5Y в фосфорилировании нескольких сигнальных путей оценивали с применением мультиплексного (хМАР) анализа от Luminex. ФИГ.8 иллюстрирует уровни активации фосфопротеинов, проверенные с помощью технологии Luminex. Уровни активации выражены в виде средней интенсивности флуоресценции (СИФ). Как показано с помощью технологии Luminex, наблюдались модулирование и значительная активация посредством фосфорилирования белков ATF-2, HSP-27, JNK и STAT-1 по сравнению с нестимулированными контролями. На ФИГ.8 показаны графические данные СИФ для обработок соединением G79 и BDNF в разных временных точках.

[00194] ATF-2 заметно активировался через 6 часов после обработки соединением G79 (20 мкг/мл) по сравнению с нестимулированным контролем (*p<0,05). Контроль BDNF показывал значительную активацию ATF-2 через 2 ч после обработки (§ p<0,05). HSP-27 был значительно активирован через 1 ч после обработки соединением G79 (как при 20 мкг/мл, так и при 100 нг/мл) по сравнению с нестимулированным контролем (*p<0,05). BDNF не активировал HSP-27. JNK значительно активировалась через 6 ч после обработки G79 (как при 20 мкг/мл, так и при 100 нг/мл) по сравнению с нестимулированным контролем (* и § p<0,05). Контроль BDNF демонстрировал значительную активацию JNK через 2 ч после обработки (⃞ p<0,05). STAT-1 был значительно активирован через 6 ч после обработки соединением G79 (20 мкг/мл) по сравнению с нестимулированным контролем (*p<0,05). BDNF не активировал STAT-1.

ПРИМЕР 13

Анализ связывания с применением цитометрии

Соединение G79 конкурирует с ФРН и BDNF за связывание с рецепторами нейротрофинов.

[00195] Для оценки связывания соединения G79 с рецепторами TrkA (клетки PC12) и TrkB (SH-SY5Y) авторами настоящего изобретения были проведены анализы конкурентного связывания посредством проточной цитометрии. Для оценки конкуренции за связывание между р75 и TrkA клетки PC12, экспрессирующие и рецептор TrkA, и рецептор р75, культивировали в нормальной ростовой среде. После отсоединения клеток с помощью раствора трипсина, клетки в концентрации 200000 клеток/лунка добавляли в пробирки для последующих инкубации. Одна пробирка содержала контрольные необработанные клетки. В других пробирках клетки предварительно инкубировали в течение 45 минут с разными концентрациями ФРН (0-10-20-50-100 нг/мл), в которых ФРН мог непосредственно связывать и рецептор TrkA, и рецептор р75, блокируя возможное связывание соединения G79, если оно конкурировало за те же рецепторы. Далее, не выполняя промывку клеток, добавляли соединение G79, конъюгированное с флуоресцентной меткой ФИТЦ (100 нг/мл), и клетки инкубировали таким образом в течение 1 часа. Показания для образцов считывали с помощью цитометра (FCAScan).

[00196] Для обнаружения связывания отдельно с каждым из рецепторов проводили предварительную инкубацию клеток (до инкубации с ФРН) с блокирующими антителами. Клетки предварительно инкубировали в течение 1 часа с блокирующими антителами против р75 (1:100; Chemicon Int.) для обнаружения связывания с TrkA или блокирующими антителами против TrkA (1:200; AbCam) для обнаружения связывания с р75. Тот же экспериментальный протокол повторяли с клеточной линией SH-SY5Y для обнаружения связывания с рецепторами TrkB и р75 в этих клетках. В этом случае в качестве конкурента за связывание с TrkB и р75 применяли BDNF. Все результаты выражали в виде среднеканальной флуоресценции (СКФ), которая представляла собой меру флуоресценции на поверхности клеток, обусловленной связыванием G79-ФИТЦ.

[00197] ФИГ.9А демонстрирует, что сигнал (СКФ) уменьшался в присутствии возрастающей концентрации ФРН; это означало, что соединение G79 конкурирует за связывание с тем же рецептором ФРН. Для оценки связывания с рецептором р75 клетки предварительно инкубировали с антителами против TrkA, причем, было обнаружено, что сигнал (СКФ) все еще уменьшался, что указывало на то, что соединение G79 было способно связываться с рецептором р75 (ФИГ.9B). При оценке связывания с TrkA предварительная инкубации с антителами против р75 не изменяла величину сигнала (СКФ), означая, что соединение G79, вероятно, не конкурировало с ФРН за связывание с TrkA (ФИГ.9C). Однако на данный результат могло повлиять наличие очень малых количеств TrkA на поверхности клеток по сравнению со значительно большим присутствием р75 (~75000 рецепторов на клетку). Аналогично, связывание соединения G79 с TrkB оценивали с применением клеточной линии SH-SY5Y (ФИГ.9D). В этом случае сигнал (СКФ) уменьшался в присутствии возрастающих концентраций BDNF, указывая на то, что соединение G79 конкурировало с BDNF за один из его рецепторов.

ПРИМЕР 14

Модель бокового амиотрофического склероза (БАС) in vitro

Соединения G79, G80 и G81 являются нейропротекторами в модели БАС in vitro.

[00198] Культура клеток. Мышиные мотонейроноподобные клетки линии NCS-34 культивировали в среде DMEM (Gibco) с добавлением 10% инактивированной нагреванием ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина. Клеточную культуру поддерживали в увлажненной атмосфере, состоящей из 95% воздуха и CO₂, при 37°C.

[00199] Стресс в результате лишения питания мотонейронов осуществляли, как описано ранее в Masahito T. et al., J. Neuropathol. Exp. Neural. 65(8):816-825 (2006). Для оценки влияния состояния трофического стресса на протекание БАС исследовали наличие апоптоза с применением депривации сыворотки. Клетки NSC-34 высевали в 24-луночные обработанные полилизином планшеты в концентрации 30000 клеток/лунка и предварительно инкубировали в течение 24 ч в среде DMEM плюс 10% ФБС с разными дозами соединений G79, G80 и G81 (20 нг/мл, 100 нг/мл, 2 мкг/мл, 20 мкг/мл, 50 мкг/мл) и Г-КСФ (2 мкг/мл) или BDNF (20 нг/мл), оба из которых применяли в качестве положительных контролей (Masahito Т. et al., ibid; Elliot J.L., Neurobiology of Disease 6:310-320 (1999)). Затем среду удаляли и заменяли на свежую среду DMEM, не содержащую ФБС. Через 48 ч анализировали жизнеспособность клеток посредством МТТ-теста, как описано ранее.

[00200] Как показано на ФИГ.10, соединения G79, G80 и G81 оказывали нейропротекторное действие на мотонейроны, подвергнутые трофическому стрессу путем депривации сыворотки. Жизнеспособность клеток выражали в процентах относительно контроля, не подвергнутого стрессу. Соединение G79 демонстрировало лучший нейропротекторный эффект в концентрации 100 нг/мл со статистически значимым повышением жизнеспособности клеток по сравнению с подвергнутым стрессу контролем (98,11±6,14% в сравнении с 69,64±10,12%; p=0,02). Также соединение G79 демонстрировало повышенную жизнеспособность клеток по сравнению с обоими положительными контролями, Г-КСФ и BDNF, хотя и статистически незначимо (жизнеспособность клеток для Г-КСФ: 76,50±8,3%; жизнеспособность клеток для BDNF: 80,62±5,2).

ПРИМЕР 15

Модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ)

Соединение G79 улучшает состояние в животной модели рассеянного склероза (PC).

[00201] Эффект соединения G79 проверяли в животной модели PC, экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЭАЭ), путем проведения клинического исследования по предотвращению (в котором терапию начинали в момент индукции заболевания) и клинического исследования по лечению (в котором терапию начинали в момент, когда животные уже страдали от заболевания). Мышей-самок линии C57BL/6 от Harlan (в возрасте 8-12 недель) подкожно иммунизировали в обе задние лапы 300 мкг пептида 35-55 миелин-олигодендроцитарного гликопротеина (МОГ) (Spikem, Firenze), эмульгированного с 50 мкг Mycobacterium tuberculosis (штамм H37Ra; Difco, Detroit, MI) в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ), как описано ранее в Palacios et al., 2007. Мышам вводили посредством интраперитонеальной инъекции Pertussis toxin (Sigma) (500 нг) во время иммунизации и через 2 дня. Животных взвешивали и проверяли на наличие клинических признаков заболевания посредством независимого наблюдения каждый день. Тяжесть ЭАЭ оценивали в течение 30 дней в соответствии со следующей шкалой: 0 = норма; 0,5 = обмякший хвост в легкой степени; 1 = обмякший хвост; 2 = легкий парапарез задних конечностей, неустойчивая походка; 3 = умеренный парапарез, произвольные движения еще возможны; 4 = параплегия или тетрапарез; 5 = состояние агонии. В конце исследования мышам вводили анестезию и вводили в полость сердца раствор 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,6). Головной мозг, спинной мозг и селезенку препарировали и либо фиксировали, либо замораживали до применения. Также отбирали сыворотку у всех исследуемых животных. Данная процедура была одобрена Комитетом по содержанию животных Университета Барселоны.

[00202] Проводили два различных эксперимента для оценки как профилактического, так и лечебного действия соединения G79 по сравнению с другими лекарственными средствами, нацеленными на сигнальные пути нейротрофинов (амидом гарциниевой кислоты и Ксалипроденом), или одним из видов терапии первой линии для лечения PC, т.е. глатирамера ацетатом.

[00203] В случае клинического исследования по предотвращению 10 животным вводили посредством интраперитонеальной инъекции соединение G79 в дозе 40 мг/кг, 10 животным вводили посредством интраперитонеальной инъекции соединение G79 в дозе 100 мг/кг, 10 животным вводили посредством интраперитонеальной инъекции амид гарциниевой кислоты в дозе 2 мг/кг, 10 животным вводили перорально Ксалипроден в дозе 10 мг/кг. Поскольку амид гарциниевой кислоты и Ксалипроден были разведены в растворах с разным процентным содержанием ДМСО, 5 животным плацебо вводили посредством интраперитонеальной инъекции (физиологический раствор плюс 1% ДМСО), а другим 5 животным плацебо вводили перорально (физиологический раствор плюс 2,5% ДМСО), соответственно. Введения выполняли ежесуточно начиная после дня иммунизации.

[00204] В случае клинического исследования по лечению для уменьшения несоответствия между пероральным введением и интраперитонеальными инъекциями, поскольку стресс может глубоко повлиять на развитие клинических показателей у животных, все введения осуществляли посредством интраперитонеальных инъекций. Для этого исследования 8 животным вводили соединение G79 в дозе 40 мг/кг, 8 животным вводили соединение G79 в дозе 100 мг/кг, 8 животным вводили амид гарциниевой кислоты в дозе 2 мг/кг, 8 животным вводили Ксалипроден в дозе 10 мг/кг, 8 животным вводили глатирамера ацетат в дозе 5 мг/кг, 8 животным вводили плацебо (физиологический раствор плюс 2,5% ДМСО). Введения выполняли ежесуточно начиная после увеличения клинического показателя до 2 баллов (после второго дня при этом показателе).

[00205] ФИГ.1A и ФИГ.11B иллюстрируют результаты профилактического применения соединения G79 в модели PC in vivo (начало терапии в день индукции заболевания). Графики представляют клинический показатель мышей, страдающих ЭАЭ и получавших разные лекарственные препараты начиная со дня иммунизации. Согласно ФИГ.11A, животные, получавшие соединение G79, демонстрировали задерживание появления заболевания, хотя и статистически незначимо. В частности, доза 100 мг/кг была более эффективной для задерживания заболевания. Кроме того, конечный клинический показатель на 30-й день у животных, получавших соединение G79 в дозе 100 мг/кг, было ниже по сравнению с показателем у животных, получавших плацебо.

[00206] ФИГ.12 иллюстрирует результаты клинического исследования по лечению. Соединение G79 в дозе 100 мг/кг демонстрировало наибольший терапевтический эффект по улучшению клинического показателя. В частности, соединение G79, по сравнению с плацебо, значимо уменьшало клинический показатель между 16-м и 23-м днями (16-й день: клинический показатель для G79 2,8±1,2 в сравнении с клиническим показателем для плацебо 4±0,7, p=0,01; 19-й день: клинический показатель для G79 1,75±1 в сравнении с клиническим показателем для плацебо 3,3±0,5, р=0,003; клинический показатель для G79 1,6±0,8 в сравнении с клиническим показателем для плацебо 2,8±0,8, p=0,02). Также соединение G79 в дозе 100 мг/кг оказывало лучший терапевтический эффект по сравнению с другими исследуемыми видами лечения (амидом гарциниевой кислоты, Ксалипроденом, глатирамера ацетатом).

ПРИМЕР 16

Модель нейровоспаления in vitro

Соединение G79 уменьшает нейровоспаление в модели нейровоспаления in vitro.

[00207] Воспаление мозга является общим процессом при многих неврологических заболеваниях, и оно значительно выражено в случае PC. Для оценки действия соединения G79 при воспалении мозга его действие было проверено в модели нейровоспаления in vitro с применением органотипических культур мозжечка, подвергнутых воздействию эндотоксина. Сначала исследовали действие соединения G79 в индукции фермента iNOS, обеспечивающего выработку оксида азота и способствующего воспалению. Как показано на ФИГ.13, соединение G79 понижало экспрессию iNOS. Образцы, предварительно обработанные соединением G79, демонстрировали понижение экспрессии iNOS через 24 ч после воздействия ЛПС по сравнению образцами, предварительно обработанными плацебо.

[00208] Что касается действия соединения G79 на высвобождение провоспалительных цитокинов, были проверены уровни ФНОα и ИЛ-1β в супернатантах от органотипических культур мозжечка, подвергнутых воздействию ЛПС. ФИГ.14A иллюстрирует выработку ФНОα в органотипической культуре мозжечка. Выработка ФНОα была уменьшена в моменты времени 6 и 12 часов в органотипической культуре, предварительно обработанной соединением G79, по сравнению с плацебо. ФИГ.14B иллюстрирует выработку ИЛ-1β в органотипической культуре мозжечка. Предварительная обработка соединением G79 не влияла на высвобождение ИЛ-1β.

[00209] Модель нейровоспаления in vitro в срезе органотипической культуры мозжечка. Новорожденных мышей (8-й день после рождения (Р8)) декапитировали после анестезирующей интраперитонеальной инъекции, и мозг целиком удаляли в асептических условиях. Мозжечок отделяли от остальной части мозга и помещали на металлическую пластину вибратома. Как только мозжечок прикрепляли к поверхности пластины, делали сагиттальные срезы толщиной 400 мкм с использованием вибратома. Затем срезы переносили с помощью пластиковой пипетки Пастера в планшет для клеточных культур, содержащий среду для органотипических культур (5% CO₂ в 50% базальной среды с солями Эрла, 25% солевого буфера Хенкса, 25% инактивированной лошадиной сыворотки, 5 мг/мл глюкозы, 0,25 мМ L-глутамина и 25 мкг/мл пенициллина/стрептомицина). После отделения и изолирования каждого среза препараты мозжечка переносили в 6-луночные планшеты (3 среза в каждую лунку), содержащие вкладыш диаметром 30 мм с размером пор 0,4 мкм (Millipore), и добавляли в каждую лунку ниже вкладыша 1 мл полной культуральной среды, предварительно подготовленной путем инкубирования в течение по меньшей мере 2 часов при 37°C и 5% CO₂. Шестилуночные планшеты хранили при 37°C в атмосфере 5% CO₂, и каждые 2 дня заменяли половину объема среды. Все эксперименты проводили через 1 неделю культивирования в таких условиях.

[00210] Через одну неделю после получения органотипической культуры мозжечка среду в каждой лунке заменяли свежей средой, и в лунки добавляли соединение G79 (100 нг/мл) или плацебо (физиологический раствор) и инкубировали в течение 1 часа. Затем добавляли липополисахарид (ЛПС) (15 мкг/мл) и оставляли для инкубации. Срезы и среду из органотипической культуры собирали в различные моменты времени: 0 ч, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч. Для каждой временной точки получали необработанные контрольные срезы, обработанные ЛПС/плацебо срезы и обработанные ЛПС/G79 срезы. Срезы собирали в трех разных экспериментах для экстракции РНК. С этой целью срезы собирали непосредственно в лизирующем буфере для выделения РНК (Qiagen) и замораживали при -20°C в том же буфере. В других трех разных экспериментах срезы собирали для иммунофлуоресцентного анализа и фиксировали в 4% параформальдегиде (ПФА) в течение 45 минут при комнатной температуре. Во всех экспериментах среду из органотипической культуры собирали и хранили при -20°C для исследования посредством ИФА.

[00211] Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Органотипические срезы, собранные в эксперименте со стимулированием ЛПС, гомогенизировали в лизирующем буфере для выделения РНК. Тотальную РНК экстрагировали с применением набора RNeasy Mini Kit для выделения РНК (Qiagen, Chatwworth, CA), включая обработку ДНКазой с помощью препарата ДНКазы, не содержащего РНКаз (Quiagen). Тотальную РНК (35 мкг) вводили в реакцию обратной транскрипции с применением системы для обратной транскрипции (High Capacity cDNA Archive Kit; Applied Biosystems, Foster City, CA). Реакцию в режиме реального времени проводили при 25°C в течение 10 минут, далее при 37°C в течение 2 часов и в конце продукты реакции хранили при 4°C. Праймеры и мишень-специфичные зонды TaqMan с флуоресцентными метками были приобретены в Applied Biosystems (системы для анализа экспрессии генов TaqMan). Применяли праймер для гена iNOS. Применяли универсальный мастер-микс TaqMan (Applied Biosystems). Амплификацию комплементарной ДНК осуществляли с помощью термоциклера DNA Engine Opticon 2 Real-Time System (MJ Research, Watertown, MA) с применением 0,9 мкМ каждого праймера и 0,25 мкМ зонда и 20 нг комплементарной ДНК. Условия реакции представляли собой: первые 2 минуты при 50°C с последующими 10 минутами при 95°C и 40 циклами по 15 секунд при 95°C и 1 минуте при 60°C. Анализ каждого образца выполняли в трех повторностях, и в каждом планшете ДНК-мишень и внутренний контроль амплифицировали в одних и тех же лунках. Экспрессию исследуемого гена определяли количественно относительно уровня гена "домашнего хозяйства" GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы).

[00212] Иммуноферментный анализ (ИФА). Супернатанты от среды из органотипической культуры мозжечка применяли для анализа выработки цитокинов, таких как ИЛ-1β и ФНО-α посредством ИФА. Для ИЛ-1β применяли набор Quantikine Immunoassay IL-1-β kit (R&D System), а для ФНО-α - набор для определения мышиного ФНО-α (Peprotec). Все анализы ИФА проводили согласно инструкциям производителей.

ПРИМЕР 17

Транспорт через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ)

[00213] Способность соединений G79, G80 и G81 проникать через гематоэнцефалический барьер была проверена с применением двух моделей in vitro. Пассивный транспорт изучали посредством анализа проникающей способности с параллельным применением искусственных мембран (Parallel Artificial Membrane Permeability Assay, РАМРА), а активный транспорт изучали с применением модели ГЭБ in vitro путем совместного культивирования гематоэнцефалических эндотелиальных клеток (BBEC) и астроцитов. В результате было обнаружено, что соединение G79 не было способно пересекать ГЭБ в модели РАМРА по сравнению с другими лекарственными средствами с хорошей способностью к пересечению ГЭБ в модели РАМРА, такими как пропранолол и карбамазепин (эффективная проницаемость (эп) пропранолола = 11,5; эп карбамазепина = 10,3; эп G79=0×10-6 см/с). Наоборот, в клеточной модели ГЭБ in vitro все три молекулы демонстрировали среднюю или высокую способность пересекать ГЭБ за счет активного транспорта (эп G79=4,1; эп G80=2,8; эп G81=2,1×10-6 см/с).

[00214] Анализ проникающей способности с параллельным применением искусственных мембран (PAMPA). Метод PAMPA применяют в качестве модели in vitro пассивной проницаемости ГЭБ. Искусственную мембрану, иммобилизованную на фильтре, помещают между донорным и акцепторным компартментами. В начале исследования лекарственное средство вводят в донорный компартмент. После периода проникновения, концентрацию лекарственного средства в донорном и акцепторном компартментах измеряют с применением УФ-спектроскопии. Следовательно, проникающая способность любого содержащего УФ-хромофор соединения может быть определена с помощью этого способа.

[00215] Стоковые растворы исследуемых соединений разводили в 200 раз в универсальном буфере при pH 7,4 и добавляли в донорные лунки. Мембрана фильтра была покрыта лейкоцитами периферической крови (ЛПК; PBL) в додекане, а акцепторные лунки были заполнены буфером с pH 7,4. Акцепторная фильтрующая пластина была аккуратно помещена на донорную пластину с образованием "сэндвича" (состоящего из водного донора с исследуемым соединением на дне, искусственной липидной мембраны в середине и водного акцептора сверху). Исследуемое соединение диффундировало из донорной лунки через липидную мембрану и в акцепторную лунку. "Сэндвич" оставляли нетронутым на 18 ч, в течение которых осуществлялось проникновение. Концентрацию исследуемого соединения в акцепторной, донорной и контрольной лунках определяли с применением УФ-спектрофотометра для прочтения планшетов. Эффективную проницаемость (эп) каждого соединения рассчитывали с помощью программного обеспечения pION PSR4p. Образцы анализировали в трех повторностях и приводили среднее значение из трех экспериментов. Стандарты контроля качества исследовали одновременно с каждым набором образцов для контроля соответствия совокупности данных.

[00216] Клеточная in vitro модель транспорта через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Клеточная in vitro модель была создана с применением совместной культуры гематоэнцефалических эндотелиальных клеток (ВВЕС) и астроцитов новорожденных крыс. Вкратце, перед совместным культивированием клеток (24-луночные поликарбонатные планшеты со стерильными прозрачными вкладышами с площадью поверхности 0,33 см² и размером пор 0,4 мкм, Corning Costar) верхнюю поверхность вкладышей планшета покрывали коллагеном IV типа и фибронектином. Далее вкладыши переворачивали вверх дном в большой чашке Петри и на дно каждого фильтра помещали 40 мкл суспензии (содержащей приблизительно 45000 астроцитов). Чашку Петри помещали в инкубатор на 1 ч, и 40 мкл свежей среды DMEM со стандартными добавками добавляли на дно каждого фильтра каждые 15 минут. Вкладыши затем переносили обратно в планшет и инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение трех дней. По истечении этого времени за 2 часа до посева эндотелиальных клеток среду заменяли средой DMEM со стандартными добавками с добавлением 125 мкг/мл гепарина. Через два часа клетки высевали во вкладыши (45000 клеток на фильтр). Планшет выдерживали в инкубаторе при температуре 37°C, 5% CO₂ в течение еще трех дней. После трех дней совместного культивирования среду заменяли средой DMEM со стандартными добавками с добавлением цАМФ и ингибитора фосфодиэстеразы RO-20-1724 и выдерживали при 37°C и 5% CO₂. На 8 день совместного культивирования измерения трансэндотелиального электрического сопротивления (ТЭЭС, TEER) показали, что система была готова для исследований транспорта. Для проверки зрелости модели в тот же день эксперимента анализы проникающей способности проводили параллельно с красителем lucifer yellow (LY) в качестве маркера целостности барьера in vitro. При проведении анализов проникающей способности образцы инкубировали с LY в концентрации 20 мкМ для оценки целостности клеточного монослоя в процессе анализа.

[00217] ТЭЭС определяли с применением омметра Millicell ERS (MERS 00001, Millipore). Измерения ТЭЭС подтверждали образование функционально интактного ГЭБ in vitro к 8-му дню совместного культивирования. Величины ТЭЭС представляли герметичность или целостность ГЭБ in vitro. Значение ТЭЭС (среднее ± СО) для всех лунок составляло 141±5,7 Ом/см².

[00218] В приведенном выше уравнении (1), (dQ/dt) представляет собой количество соединения, присутствующее в акцепторном компартменте, в зависимости от времени (нмоль/с), A представляет собой площадь вкладыша (см²) и C₀ представляет собой начальную концентрацию соединения, помещаемого в донорный компартмент (нмоль/мл).

[00219] Во время исследований транспорта соединения инкубировали вместе с LY (20 мкМ) с целью подтверждения целостности клеточной мембраны во время анализа транспорта.

[00220] Ознакомившись полностью с описанием настоящего изобретения специалистам в данной области техники будет понятно, что то же может быть выполнено в широком и эквивалентном диапазоне условий, составов и других параметров, не влияя на рамки настоящего изобретения или любого его варианта реализации.

[00221] Другие варианты реализации изобретения будут очевидны для специалистов в данной области из рассмотрения описания и практического применения изобретения, предложенного в настоящей заявке. Подразумевают, что описание и примеры должны рассматриваться только как иллюстративные, тогда как истинный объем изобретения указан в последующей формуле изобретения.

[00222] Содержание всех патентов и публикаций, упомянутых в настоящем описании, полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Ссылки

[00223] Aloe L, Calza L (2004) Progress in brain research. Vol 146, ФРН and related molecules in health and diseases. Amsterdam: Elsevier.

[00224] Anand P. Neurotrophic factors and their receptors in human sensory neuropathies. Prog Brain Res. 2004; 146:477-92.

[00225] Apfel S (2002) Nerve growth factor for the treatment of diabetic neuropathy: what went wrong, what went right, and what does the future hold? Int Rev Neurobiol 50:393-413.

[00226] Barker P (1998) p75NTR: A study in contrasts. Cell Death Differ 5:346-356.

[00227] Bhakar A, Howell J, Paul C, Salehi A, Becker E, Said F, Bonni A, Barker P (2003) Apoptosis induced by p75NTR overexpression requires Jun kinase-dependent phosphorylation of Bad. J Neurosci 23:11373-11381.

[00228] Chao M (2003) Neurotrophins and their receptors: a convergence point for many signalling pathways. Nat Rev Neurosci 4:299-309.

[00229] Faden AI, Stoica B. Neuroprotection: challenges and opportunities. Arch Neurol. 2007 Jun; 64(6):794-800.

[00230] Foehr E, Lin X, O'Mahony A, Geleziunas R, Bradshaw R, Greene W (2000) NF-kappa В signaling promotes both cell survival and neurite process formation in nerve growth factor-stimulated PC12 cells. J Neurosci 20:7556-7563.

[00231] Frade J (2005) Nuclear translocation of the p75 neurotrophin receptor; cytoplasmic domain in response to neurotrophin binding. J Neurosci 25:1407-1411.

[00232] Gentry J, Casaccia-Bonnefil P, Carter В (2000) Nerve growth factor activation of nuclear factor kappaB through its p75 receptor is an anti-apoptotic signal in RN22 schwannoma cells. J Biol Chem 275:7558-7565.

[00233] Ghosh S, May M, Kopp E (1998) NF-kappa В and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Annu Rev Immunol 16:225-260.

[00234] Greene L, Tischler A (1976) Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci USA 73:2424-2428.

[00235] Hellweg R, Ziegenhorn A, Heuser I, Deuschle M. Serum concentrations of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor in depressed patients before and after antidepressant treatment. Pharmacopsychiatry. 2008 Mar; 41(2):66-71.

[00236] Huang E, Reichardt L (2003) Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annu Rev Biochem 72:609-642. Epub 2003 Mar 2027.

[00237] Kaplan D, Miller F (2000) Neurotrophin signal transduction in the nervous system. Curr Opin Neurobiol 10:381-391.

[00238] Levi-Montalcini R (1987) The nerve growth factor 35 years later. Science 237:1154-1162.

[00239] Lewin G, Barde Y (1996) Physiology of the neurotrophins. Annu Rev Neurosci 19:289-317.

[00240] Longo F, Manthorpe M, Xie Y, Varon S (1997) Synthetic ФРН peptide derivatives prevent neuronal death via a p75 receptor-dependent mechanism. J Neurosci Res 48:1-17.

[00241] Longo FM, Yang T, Knowles JK, Xie Y, Moore LA, Massa SM. Small molecule neurotrophin receptor ligands: novel strategies for targeting Alzheimer's disease mechanisms. Curr Alzheimer Res. 2007 Dec; 4(5):503-6.

[00242] Maliartchouk S, Debeir Т, Beglova N, Cuello A, Gehring K, Saragovi H (2000a) Genuine monovalent ligands of TrkA nerve growth factor receptors reveal a novel pharmacological mechanism of action. J Biol Chem 275:9946-9956.

[00243] Maliartchouk S, Feng Y, Ivanisevic L, Debeir T, Cuello A, Burgess K, Saragovi H (2000b) A designed peptidomimetic agonistic ligand of TrkA nerve growth factor receptors. Mol Pharmacol 57:385-391.

[00244] Martinez-Forero I, Garcia-Munoz R, Martinez-Pasamar S, Inoges S, Lopez-Diaz de Cerio A, Palacios R, Sepulcre J, Moreno B, Gonzalez Z, Fernandez-Diez B, Melero I, Bendandi M, Villoslada P (2008) IL-10 suppressor activity and ex vivo Tr1 cell function are impaired in multiple sclerosis. Eur J Immunol 38:576-586.

[00245] Masip, I.; Cortes, N.; Abad, M.; Guardiola, M.; Perez-Paya, E.; Ferragut, J.; Ferrer-Montiel, A.; Messeguer, A. (2005). Design and synthesis of an optimized positional scanning library of peptoids: identification of novel multidrug resistance reversal agents. Bioorg. Med. Chem. 13, 1923-1929.

[00246] Miller S, Simon R, NG S, Zuckermann R, Kerr J, Moos W (1994) Bioorg Med Chem Letter 4:2657-2662.

[00247] Moreno B, Hevia H, Santamaria M, Sepulcre J, Munoz J, Garcia-Trevijano E, Berasain C, Corrales F, Avila M, Villoslada P (2006) Methylthioadenosine reverses brain autoimmune disease. Ann Neurol 60:323-334.

[00248] Palacios, et al., PloSONE 2007; 2(11): e1222.

[00249] Palacios R, Comas D, Elorza J, Villoslada P (2008) Genomic regulation of CTLA4 and multiple sclerosis. J Neuroimmunol 203:108-115.

[00250] Peleshok J, Saragovi H (2006) Functional mimetics of neurotrophins and their receptors. Biochem Soc Trans 34:612-617.

[00251] Poduslo J, Curran G (1996) Permeability at the blood-brain and blood-nerve barriers of the neurotrophic factors: ФРН, CNTF, NT-3, BDNF. Brain Res Mol Brain Res 36:280-286.

[00252] Price RD, Milne SA, Sharkey J, Matsuoka N. Advances in small molecules promoting neurotrophic function. Pharmacol Ther. 2007 Aug; 115(2):292-306.

[00253] Rabizadeh S, Ye X, Wang J, Bredesen D (1999) Neurotrophin dependence mediated by p75NTR: contrast between rescue by BDNF and ФРН. Cell Death Differ 6:1222-1227.

[00254] Saragovi H, Zaccaro M (2002) Small molecule peptidomimetic ligands of neurotrophin receptors, identifying binding sites, activation sites and regulatory sites. Curr Pharm Des 8:2201-2216.

[00255] Schulte-Herbruggen O, Braun A, Rochlitzer S, Jockers-Scherubl MC, Hellweg R. Neurotrophic factors - a tool for therapeutic strategies in neurological, neuropsychiatric and neuroimmunological diseases? Curr Med Chem. 2007; 14(22):2318-29.

[00256] Sen, S., Roach, S. A convenient Two-step procedure for the Synthesis of Substituted Allylic amines from Allylic Alcohols. Synthesis, 1995, 756-758.

[00257] Shi Z, Birman E, Saragovi HU. Neurotrophic rationale in glaucoma: a TrkA agonist, but not ФРН or a p75 antagonist, protects retinal ganglion cells in vivo. Dev Neurobiol. 2007 Jun; 67(7):884-94.

[00258] Shoval G, Weizman A. The possible role of neurotrophins in the pathogenesis and therapy of schizophrenia. Eur Neuropsychopharmacol. 2005 May; 15(3):319-29.

[00259] Vajda FJ. Neuroprotection and neurodegenerative disease. J Clin Neurosci. 2002 Jan; 9(1):4-8.

[00260] Villoslada P, Genain С (2004) Role of nerve growth factor and other trophic factors in brain inflammation. Prog Brain Res 146:403-414.

[00261] Villoslada P, Abel K, Heald N, Goertsches R, Hauser S, Genain С (2001) Frequency, heterogeneity and encephalitogenicity of Т cells specific for myelin oligodendrocyte glycoprotein in naive outbred primates. Eur J Immunol 31:2942-2950.

[00262] Villoslada P, Hauser S, Bartke I, Unger J, Heald N, Rosenberg D, Cheung S, Mobley W, Fisher S, Genain С (2000) Human nerve growth factor protects common marmosets against autoimmune encephalomyelitis by switching the balance of Т helper cell type 1 and 2 cytokines within the central nervous system. J Exp Med 191:1799-1806.

[00263] Williams В, Eriksdotter-Jonhagen M, Granholm A (2006) Nerve growth factor in treatment and pathogenesis of Alzheimer's disease. Prog Neurobiol 80:114-128. Epub 2006 Nov 2002.

[00264] Youdim MB, Buccafusco JJ. Multi-functional drugs for various CNS targets in the treatment of neurodegenerative disorders. Trends Pharmacol Sci. 2005 Jan; 26(1):27-35.

[00265] Yoon S, Casaccia-Bonnefil P, Carter B, Chao M (1998) Competitive signaling between TrkA and p75 nerve growth factor receptors determines cell survival. J Neurosci 18:3273-3281.

[00266] Zaccaro M, Ivanisevic L, Perez P, Meakin S, Saragovi H (2001) p75 Co-receptors regulate ligand-dependent and ligand-independent Trk receptor activation, in part by: altering Trk docking subdomains. J Biol Chem 276:31023-31029.

Zuckermann, R.N., Kerr, J.M., Kent, S.B.H., Moos, W.H. (1992). Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647.

Реферат

Изобретение относится к соединениям, имеющим формулу II, или их фармацевтически приемлемым солям, которые обладают активностью агонистов рецепторов нейротрофинов. В формуле II Rпредставляет собой фенил, замещенный галогеном или трифторметилом и дополнительно возможно замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, Cалкила, (C)алкокси и галоген(C)алкила; Rпредставляет собой 2-оксопирролидин-1-илметил или сульфамоилфенил. Изобретение относится также к фармацевтической композиции, способу ее получения, применению указанных соединений в качестве активного ингредиента для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения различных заболеваний, в том числе для предотвращения или лечения гибели или повреждения нервных клеток, способам предотвращения или лечения гибели или повреждения нервных клеток, нейропротекции, регенерации нервных клеток, стимулирования активности рецептора нейротрофинового фактора, способам предотвращения или лечения различных заболеваний, в том числе восприимчивых к стимулированию активности фактора роста нервов или рецептора фактора роста нервов, нейротрофинового фактора или рецептора нейротрофинового фактора. 22 н. и 35 з.п. ф-лы, 14 ил., 17 пр.

Формула

,

,

,