Молекулярные конструкции с нацеливающими и эффекторными элементами - RU2696378C2

Код документа: RU2696378C2

Чертежи

Показать все 110 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[1] Настоящая заявка является родственной предварительной заявке на патент США №62/104405, поданной 16 января 2015 г., предварительной заявке на патент США №62/114427, поданной 10 февраля 2015 г., и предварительной заявке на патент США №62/137737, поданной 24 марта 2015 г., и заявляет их преимущество; содержание данных заявок включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[2] 1. Область техники, к которой относится изобретение

[3] Настоящее раскрытие относится к области фармацевтики; более конкретно, к многофункциональным молекулярным конструкциям, например, имеющим нацеливающие и эффекторные элементы для доставки эффектора (например, терапевтического лекарственного средства) в участки-мишени.

[4] 2. Описание предшествующего уровня техники

[5] Непрерывное усовершенствование широкого спектра методов скрининга и отбора моноклональных антител (mAb) для антигенов-мишеней способствовало разработке большого количества терапевтических антител против многих заболеваний, которые считались неизлечимыми всего несколько лет назад. Согласно Therapeutic Antibody Database примерно 2800 антител были исследованы или планируется исследовать в клинических испытаниях с участием людей, и примерно 80 антител были одобрены государственными органами по регулированию оборота лекарственных средств для клинических путей применения. Большое количество данных о терапевтических эффектах антител предоставило информацию, касающуюся фармакологических механизмов действия антител в качестве терапевтических средств.

[6] Один из основных фармакологических механизмов действия антител в качестве терапевтических средств заключается в том, что антитела могут нейтрализовать или захватывать болезнетворные медиаторы, которые могут представлять собой цитокины или компоненты иммунной системы, присутствующие в кровотоке, интерстициальном пространстве или в лимфатических узлах. Нейтрализующая активность ингибирует взаимодействие болезнетворных медиаторов с их рецепторами. Следует отметить, что в качестве терапевтических средств также были разработаны белки слияния на основе растворимых рецепторов или внеклеточных частей рецепторов цитокинов и Fc-части IgG, которые действуют путем нейтрализации цитокинов или иммунных факторов аналогично нейтрализующим антителам.

[7] Некоторые терапевтические антитела, которые были одобрены для клинических путей применения или подвергались клиническим разработкам, опосредуют свои фармакологические эффекты путем связывания с рецепторами, блокируя таким образом взаимодействие рецепторов с их лигандами. Для этих лекарственных средств на основе антител Fc-опосредованные механизмы, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-опосредованный цитолиз (CMC), не являются намеченными механизмами действия антител.

[8] Некоторые терапевтические антитела связываются с определенными поверхностными антигенами на клетках-мишенях и оказывают воздействие на клетки-мишени посредством Fc-опосредованных функций и других механизмов. Наиболее важными Fc-опосредованными механизмами являются антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-опосредованный цитолиз (CMC), оба из которых вызывают лизис клеток-мишеней, связанных с антителами. Некоторые антитела, связывающиеся с определенными антигенами клеточной поверхности, могут индуцировать апоптоз связанных клеток-мишеней.

[9] Антитела также могут служить в качестве носителей цитотоксических молекул или других терапевтических средств, при этом антитела не служат для выполнения очевидных терапевтических эффекторных функций. Как правило, эти антитела связываются с "опухолеассоциированными" антигенами на клетках-мишенях, но сами по себе не могут вызывать лизис клеток. Антитела, специфичные к CD19 и CD22 в В-клеточных лимфомах, хорошо известны. В течение многих лет эти антитела изучали в качестве носителей цитотоксических средств, в том числе радиоактивных нуклидов с очень короткими периодами полураспада, таких как⁹⁰Y,¹³¹I и¹⁷⁷Lu. Некоторые антитела также изучали в качестве нацеливающих средств для липосом, нагруженных цитотоксическими лекарственными средствами, такими как доксорубицин, паклитаксел и амфотерицин В. В области конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC) в последние годы происходила фаза бурных исследований и разработки, объясняемая главным образом разработкой крайне цитотоксических лекарственных средств, таких как ауристатин, майтанзин, калихеамицин и камптотецин, и методов конъюгирования цитотоксических молекул с молекулами антител. Эти ADC были сконструированы для нацеливания на диффузные (или жидкие) опухоли крови, лимфоидной системы и костного мозга, в том числе различные типы лимфом и лейкозных опухолей, экспрессирующих один или более уникальных CD-маркеров. Некоторые ADC также разрабатываются для солидных опухолей. Несколько из этих конъюгатов антитело-лекарственное средство нового поколения были одобрены для клинических путей применения, и многие находятся на стадии клинических испытаний.

[10] Однако, в ADC первого поколения молекулы цитотоксических лекарственных средств неселективно связаны с цистеиновыми или лизиновыми остатками антитела с получением в результате неоднородной смеси ADC с различными количествами молекул лекарственных средств на один ADC. Данный подход приводит к некоторым проблемам безопасности и эффективности. Например, первый одобренный FDA ADC гемтузумаб-озогамицин для лечения острого миелогенного лейкоза в настоящее время отозван с рынка ввиду неприемлемой токсичности.

[11] Идея и метод получения антител с двойной специфичностью созрели более чем три десятилетия назад. В последний год усовершенствование методов создания рекомбинантных антител и стремление к разработке улучшенных медицинских препаратов стимулировало разработку биспецифических антител, принимающих большое разнообразие структурных конфигураций.

[12] Например, двухвалентные или поливалентные антитела могут содержать два или более антигенсвязывающих участка. Сообщали о ряде способов получения поливалентных антител путем ковалентного связывания трех или четырех Fab-фрагментов с помощью присоединяющей структуры. Например, были созданы антитела, в которых представлены тандемные повторы из трех или четырех Fab.

[13] Были раскрыты некоторые способы получения поливалентных антител путем использования синтетических сшивающих средств для объединения различных антител или связывающих фрагментов химическим путем. Один подход включает химическую сшивку трех, четырех и более отдельных Fab-фрагментов с помощью различных линкеров. Был представлен другой способ получения конструкции с несколькими Fab, собранными в одномерный ДНК-каркас. Эти различные поливалентные конструкции Ab, предназначенные для связывания с молекулами-мишенями, отличаются друг от друга по размеру, показателям периода полувыведения, гибкости конформации и способности модулировать иммунную систему. Ввиду вышеизложенного было сделано несколько сообщений о получении молекулярных конструкций с фиксированным количеством эффекторных элементов или с двумя или более различными видами функциональных элементов (например, по меньшей мере одним нацеливающим элементом и по меньшей мере одним эффекторным элементом). Однако, построение молекулярной конструкции с конкретной комбинацией нацеливающих и эффекторных элементов с применением химического синтеза либо рекомбинантной технологии часто является затруднительным. Соответственно, в уровне техники существует необходимость в обеспечении новых молекулярных платформ для построения более универсальной молекулы, подходящей для охвата путей применения при широком диапазоне заболеваний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[14] Далее представлено упрощенное краткое описание настоящего раскрытия в целях обеспечения базового понимания для читающего. Данное краткое описание не является широким обзором настоящего раскрытия, и в нем не определены ключевые/критически важные элементы настоящего изобретения и не очерчен объем настоящего изобретения. Его единственной целью является представление некоторых идей, раскрытых в данном документе, в упрощенной форме в качестве вступления к более подробному описанию, представленному позже.

[15] Многоветвевые линкеры на основе пептидной сердцевины

[16] В первом аспекте настоящее раскрытие направлено на линкерное звено, с которым связаны по меньшей мере два функциональных элемента. Например, с линкерным звеном могут быть связаны два различных эффекторных элемента, один нацеливающий элемент и один эффекторный элемент или один эффекторный элемент и цепь полиэтиленгликоля (PEG) для увеличения времени циркуляции в крови линкерного звена. Линкерное звено по настоящему изобретению сконструировано таким образом, чтобы оно имело по меньшей мере две различные функциональные группы, так чтобы функциональные элементы могли связываться с ним посредством реакции с соответствующими функциональными группами. Соответственно, линкерное звено по настоящему изобретению может служить в качестве платформы для получения молекулярной конструкции с двумя или более функциональными элементами.

[17] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия линкерное звено содержит центральную сердцевину и множество связывающих ветвей. Центральная сердцевина представляет собой полипептидную сердцевину, содержащую (1) множество лизиновых (K) остатков, при этом каждый остаток K отделен от следующего остатка K вставочной последовательностью, содержащей глициновые (G) и сериновые (S) остатки, и количество остатков K находится в диапазоне от 2 до 15; или (2) последовательность (Х_аа-K)_n, где Х_аа представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую 2-12 повторяющихся этиленгликолевых (EG) звеньев, а n представляет собой целое число от 2 до 15. Вставочная последовательность необязательно состоит из 2-20 аминокислотных остатков. В различных вариантах осуществления вставочная последовательность может иметь последовательность GS, GGS, GSG или SEQ ID NO: 1-16. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина содержит 2-15 звеньев с последовательностью G_1-5SK; центральная сердцевина предпочтительно содержит последовательность (GSK)_2-15. Каждая из связывающих ветвей связана с остатками K центральной сердцевины посредством образования амидной связи между остатком K и связывающей ветвью. Связывающая ветвь, связанная с центральной сердцевиной, имеет малеимидную группу на своем свободном конце. Кроме того, аминокислотный остаток на N- или С-конце центральной сердцевины имеет азидную группу или алкиновую группу; в качестве альтернативы или дополнительно, аминокислотный остаток на N- или С-конце центральной сердцевины представляет собой цистеиновый (С) остаток, в котором тиольная группа аминокислотного остатка связана с соединяющей ветвью, имеющей азидную группу, алкиновую группу, тетразиновую группу или напряженную алкиновую группу на свободном конце соединяющей ветви.

[18] В некоторых вариантах осуществления связывающая ветвь представляет собой цепь PEG, предпочтительно имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев. Кроме того, соединяющая ветвь представляет собой цепь PEG, предпочтительно имеющую 2-12 повторяющихся EG-звеньев.

[19] Что касается аминокислотных остатков, имеющих азидную группу, неограничивающие примеры указанных аминокислотных остатков включают L-азидогомоаланин (AHA), 4-азидо-L-фенилаланин, 4-азидо-D-фенилаланин, 3-азидо-L-аланин, 3-азидо-D-аланин, 4-азидо-L-гомоаланин, 4-азидо-D-гомоаланин, 5-азидо-L-орнитин, 5-азидо-D-орнитин, 6-азидо-L-лизин и 6-азидо-D-лизин. Что касается аминокислотных остатков, имеющих алкиновую группу, их иллюстративные примеры включают L-гомопропаргилглицин (L-HPG), D-гомопропаргилглицин (D-HPG) и бета-гомопропаргилглицин (β-HPG).

[20] Если аминокислотный остаток на N- или С-конце центральной сердцевины представляет собой цистеиновый остаток, то напряженная алкиновая группа на свободном конце соединяющей ветви может представлять собой циклооктеновую группу, такую как транс-циклооктеновая (ТСО) группа; или циклооктиновую группу, например, дибензоциклооктиновую (DBCO), дифторциклооктиновую (DIFO), бициклонониновую (BCN) и дибензоциклооктиновую (DICO) группу. В качестве альтернативы, тетразиновая группа на свободном конце соединяющей ветви включает без ограничения 1,2,3,4-тетразиновую, 1,2,3,5-тетразиновую и 1,2,4,5-тетразиновую группы, а также их производные, такие как 6-метилтетразиновая группа.

[21] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия линкерное звено дополнительно содержит множество первых элементов. Каждый из первых элементов связан с одной из связывающих ветвей посредством реакции тиольной и малеимидной групп.В соответствии с различными необязательными вариантами осуществления настоящего раскрытия первый элемент представляет собой эффекторный элемент, подходящий для вызывания намеченного эффекта (например, терапевтического эффекта) у субъекта. В качестве альтернативы, первый элемент может представлять собой нацеливающий элемент для направления линкерного звена в участок, представляющий интерес.

[22] Опять же необязательно, линкерное звено дополнительно содержит второй элемент, отличный от первых элементов. В некоторых вариантах осуществления второй элемент имеет азидную или алкиновую группу, так что он связывается с центральной сердцевиной или соединяющей ветвью путем соединения с соответствующей алкиновой или азидной группой центральной сердцевины или соединяющей ветви в присутствии Cu (I) в качестве катализатора в ходе реакции, называемой "химической клик-реакцией азид-алкинового циклоприсоединения, катализируемого Cu (I) (CuAAC)". В качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления второй элемент, имеющий азидную или циклооктиновую группу, связан с центральной сердцевиной или соединяющей ветвью путем соединения с соответствующей циклооктиновой или азидной группой центральной сердцевины или соединяющей ветви посредством "химической азид-алкиновой клик-реакции,, промотируемой напряжением (SPAAC)". Опять же в качестве альтернативы, в определенных вариантах осуществления второй элемент, имеющий тетразиновую или циклооктеновую группу, связан с центральной сердцевиной или соединяющей ветвью путем соединения с соответствующей циклооктеновой или тетразиновой группой центральной сердцевины или соединяющей ветви посредством "реакции Дильса-Альдера с обратными электронными требованиями (iEDDA)". В необязательных вариантах осуществления настоящего раскрытия в тех случаях, когда первый элемент представляет собой эффекторный элемент, второй элемент может представлять собой другой эффекторный элемент, который действует аддитивно или синергично с первым элементом или независимо от него; в качестве альтернативы, второй элемент может представлять собой нацеливающий элемент или элемент для улучшения фармакокинетического свойства линкерного звена, такого как растворимость, коэффициент очищения, период полувыведения и биодоступность. В некоторых других необязательных вариантах осуществления в тех случаях, когда первый элемент представляет собой нацеливающий элемент, второй элемент предпочтительно представляет собой эффекторный элемент или элемент для улучшения фармакокинетического свойства линкерного звена.

[23] В определенных вариантах осуществления линкерное звено дополнительно содержит необязательный третий элемент, отличный от первого и второго элементов. В случае, когда второй элемент непосредственно связан с центральной сердцевиной, другой конец (т.е. свободный конец, не связанный со вторым элементом) центральной сердцевины необязательно представляет собой цистеиновый остаток, который можно применять для введения необязательного третьего элемента. В частности, тиольную группу цистеинового остатка подвергают реакции с малеимидной группой цепи PEG; и связываемую таким образом цепь PEG обозначают как соединяющую ветвь, которая имеет тетразиновую группу или напряженную алкиновую группу на своем свободном конце. Соответственно, третий элемент затем связывается с соединяющей ветвью посредством реакции iEDDA. В случае, когда линкерное звено содержит как второй, так и третий элементы, предпочтительно, чтобы по меньшей мере один из первого и второго элементов представлял собой эффектор, описанный выше, тогда как третий элемент может представлять собой элемент для улучшения фармакокинетического свойства линкерного звена. Одним примером элемента для улучшения фармакокинетического свойства является длинная цепь PEG, имеющая молекулярный вес, составляющий приблизительно 20000-50000 дальтонов.

[24] Пути применения многоветвевых линкеров на основе пептидной сердцевины

[25] Линкерное звено в соответствии с первым аспектом настоящего раскрытия может оказываться полезным в клинической медицине для лечения различных заболеваний. Следовательно, второй аспект настоящего раскрытия направлен на способ лечения этих заболеваний. В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия способ лечения конкретного заболевания включает этап введения субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества линкерного звена в соответствии с вышеупомянутым аспектом и вариантами осуществления настоящего раскрытия. Как можно понять, указанное линкерное звено можно вводить в фармацевтическом составе, который содержит фармацевтически приемлемый наполнитель, подходящий для намеченного или желаемого пути введения, в дополнение к линкерному звену по настоящему изобретению.

[26] Различные иллюстративные комбинации первого и второго элементов линкерного звена по настоящему изобретению для лечения некоторых конкретных заболеваний раскрыты ниже для облегчения понимания некоторых вариантов осуществления настоящего раскрытия.

[27] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой первый элемент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), специфичный к цитокину или рецептору цитокина; или растворимый рецептор цитокина, а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к тканевому белку внеклеточного матрикса, является применимой в лечении иммунологического нарушения. В этих случаях первый элемент представляет собой эффекторный элемент для лечения одного или более иммунологических нарушений, а второй элемент представляет собой нацеливающий элемент, который облегчает доставку линкерного звена в пораженный участок.

[28] Неограничивающие примеры цитокина включают фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкин-17 (IL-17), IL-1, IL-6, IL-12/IL-23 и фактор активации В-клеток (BAFF), а неограничивающими примерами рецептора цитокина являются рецепторы, специфичные к IL-6 (т.е. IL-6R) или IL-17 (т.е. IL-17R). Что касается растворимого рецептора цитокина, его примеры включают без ограничения растворимый рецептор цитокина, специфичный к TNF-α или IL-1. Иллюстративные примеры тканевого белка внеклеточного матрикса включают без ограничения α-аггрекан, коллаген I типа, коллаген II типа, коллаген III типа, коллаген V типа, коллаген VII типа, коллаген IX типа и коллаген XI типа.

[29] В соответствии с некоторыми конкретными, но иллюстративными примерами линкерных звеньев, подходящих для лечения псориаза, первый элемент представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, IL-12/IL-23, IL-17 или IL-17R; а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа.

[30] В некоторых необязательных примерах линкерные звенья, подходящие для лечения иммунологических нарушений, таких как системная красная волчанка (SLE), кожная волчанка или синдром Шегрена, содержат scFv, специфичный к BAFF, в качестве первого элемента и scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа, в качестве второго элемента.

[31] Иллюстративные линкерные звенья для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилоартрита содержат первый элемент, который представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12/IL-23, IL-17, IL-6R или IL-17R; и второй элемент, который представляет собой scFv, специфичный к коллагену II типа, коллагену IX типа, коллагену XI типа или α-аггрекану.

[32] Линкерные звенья также подходят для лечения воспалительных заболеваний кишечника, например, в числе прочих, болезни Крона и неспецифического язвенного колита. В этих случаях в линкерном звене по настоящему изобретению применяется scFv, специфичный к TNF-α, в качестве первого элемента и scFv, специфичный к коллагену III типа или коллагену V типа, в качестве второго элемента.

[33] Другой группой заболеваний, поддающихся лечению с помощью линкерного звена по настоящему изобретению, являются диффузные опухоли, включающие без ограничения острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому и миелому. В этих вариантах осуществления первый элемент может представлять собой нацеливающий элемент, такой как scFv, специфичный к первому антигену клеточной поверхности, тогда как второй элемент может представлять собой эффекторный элемент, такой как scFv, специфичный ко второму антигену клеточной поверхности.

[34] Первый антиген клеточной поверхности, подходящий для применения в качестве нацеливающего элемента для лечения диффузных опухолей, включает без ограничения CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD72a, CD78, CD79a, CD79b, CD86, CD134, CD137, CD138 и CD319. В то же время неограничивающие примеры второго антигена клеточной поверхности, подходящего для применения в качестве эффекторного элемента, включают CD3 и CD16a.

[35] Для лечения лимфомы или лейкоза, происходящих из В-лимфоцитов, иллюстративный первый элемент представляет собой scFv, специфичный к CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD37, CD79a или CD79b, а иллюстративный второй элемент представляет собой scFv, специфичный к CD3 или CD16a.

[36] Для лечения плазмоцитомы или множественной миеломы иллюстративный первый элемент представляет собой scFv, специфичный к CD38, CD78, CD138 или CD319, а иллюстративный второй элемент представляет собой scFv, специфичный к CD3 или CD16a.

[37] Что касается лимфомы или лейкоза, происходящих из Т-клеток, иллюстративный первый элемент для их лечения представляет собой scFv, специфичный к CD5, CD30 или CD43, а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к CD3 или CD16a.

[38] Для лечения миелогенного лейкоза иллюстративный первый элемент представляет собой scFv, специфичный к CD33 или CD34, а иллюстративный второй элемент представляет собой scFv, специфичный к CD3 или CD16а.

[39] Еще одной группой заболеваний, которые можно лечить с помощью линкерного звена по настоящему изобретению, являются солидные опухоли, включающие без ограничения формы меланомы, формы карциномы пищевода, формы карциномы желудка, опухоль головного мозга, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак почки, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичника, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичка и плоскоклеточную карциному головы и шеи. Дополнительно, линкерное звено по настоящему изобретению также подходит для лечения запущенных, злокачественных или метастатических солидных опухолей.

[40] Для конструирования линкерного звена для лечения солидных опухолей первый элемент (т.е. нацеливающий элемент) выбирают из пептидного гормона, фактора роста и первого scFv, специфичного к опухолеассоциированному антигену; тогда как второй элемент (т.е. эффекторный элемент) представляет собой второй scFv, специфичный к антигену клеточной поверхности.

[41] Например, пептидный гормон представляет собой секретин, холецистокинин (CCK), соматостатин или тиреостимулирующий гормон (TSH). Что касается фактора роста, он может представлять собой эпидермальный фактор роста (EGF), мутантный EGF, эпирегулин, гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), основной фактор роста фибробластов (bFGF) или фактор роста гепатоцитов (HGF). Иллюстративные примеры опухолеассоциированного антигена включают рецептор 1 человеческого эпидермального фактора роста (HER1), HER2, HER3, HER4, углеводный антиген 19-9 (СА 19-9), углеводный антиген 125 (СА 125), раково-эмбриональный антиген (СЕА), муцин 1 (MUC 1), ганглиозид GD2, антиген, ассоциированный с меланомой (MAGE), простатический специфический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA), мезотелин, Tn, родственный муцину, сиалированный Tn, глобо-Н, стадиеспецифический эмбриональный антиген 4 (SSEA-4) и молекулу адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ). Что касается антигена клеточной поверхности, он может представлять собой CD3 или CD16a.

[42] В некоторых случаях опухолеассоциированный антиген может "слущиваться" с поверхности солидной опухоли субъекта и уходить в его систему кровообращения. В этих случаях способ лечения солидной опухоли по настоящему изобретению включает этапы (а) проведения субъекту процедуры диализа крови с применением антитела, специфичного к одному или более опухолеассоциированным антигенам, для удаления опухолеассоциированных антигенов, "слущивающихся" с поверхности опухоли и уходящих в систему кровообращения субъекта; и (b) введения линкерного звена по настоящему изобретению для лечения солидной опухоли.

[43] Еще одним типичным заболеванием, поддающимся лечению с помощью линкерного звена по настоящему изобретению, является остеопороз. Иллюстративные линкерные звенья, подходящие для лечения остеопороза, содержат первый элемент (в данном случае эффекторный элемент), который представляет собой первый scFv, специфичный к лиганду рецептора-активатора ядерного фактора кВ (RANKL); и второй элемент (или нацеливающий элемент), который представляет собой второй scFv, специфичный к коллагену I типа или остеонектину.

[44] Возрастная макулярная дегенерация (AMD) является другим примером заболеваний, поддающихся лечению с помощью линкерного звена по настоящему изобретению. Иллюстративные линкерные звенья, подходящие для лечения AMD, содержат scFv, специфичный к VEGF-A, в качестве первого элемента и длинную цепь PEG, имеющую молекулярный вес, составляющий приблизительно 20000-50000 дальтонов, в качестве второго элемента. В этом случае первый элемент представляет собой эффекторный элемент для лечения AMD, а второй элемент применяется для усиления фармакокинетического свойства линкерного звена.

[45] Молекулярные конструкции с нацеливающими и эффекторными компонентами

[46] В третьем аспекте настоящее раскрытие направлено на молекулярную конструкцию, содержащую два линкерных звена, соединенных друг с другом непосредственно либо опосредованно, в которой сердцевина одного линкерного звена способна связываться по меньшей мере с одним нацеливающим элементом, а сердцевина другого линкерного звена способна связываться по меньшей мере с одним эффекторным элементом. Молекулярная конструкция по настоящему изобретению является преимущественной в том, что два линкерных звена соединены друг с другом посредством реакции iEDDA, реакции SPAAC или реакции CuAAC. Данная архитектура обеспечивает возможность проведения легкого синтеза молекулярной конструкции со сложной структурой. В соответствии с принципами и сущностью настоящего раскрытия два линкерных звена, соответственно несущих различные количества и/или типы функциональных элементов, можно получить независимо и затем конъюгировать друг с другом. Таким образом, для специалиста в данной области становится практически осуществимым конструирование библиотек молекулярных конструкций, соответственно несущих различные функциональные элементы, и последующие отбор и объединение двух молекулярных конструкций (или линкерных звеньев) из библиотек с образованием желаемых конструкций в зависимости от потребностей и/или намеченных путей применения. Кроме того, можно контролировать количество функциональных элементов на одно линкерное звено путем регулирования количества конкретных функциональных групп в сердцевине.

[47] В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция содержит первое линкерное звено и второе линкерное звено. В частности, первое линкерное звено содержит первую центральную сердцевину и одну или более связывающих ветвей (в дальнейшем именуемых первыми связывающими ветвями) и необязательно соединяющую ветвь (в дальнейшем именуемую первой соединяющей ветвью), которые соответственно связаны с первой центральной сердцевиной; второе линкерное звено содержит вторую центральную сердцевину и одну или более связывающих ветвей (в дальнейшем именуемых вторыми связывающими ветвями) и необязательно соединяющую ветвь (в дальнейшем именуемую второй соединяющей ветвью), которые соответственно связаны со второй центральной сердцевиной. Первое и второе линкерные звенья соединяются друг с другом посредством реакции iEDDA, SPAAC или CuAAC, происходящей между любыми из следующих: первой и второй центральными сердцевинами, первой соединяющей ветвью и второй центральной сердцевиной, первой и второй соединяющими ветвями или первой центральной сердцевиной и второй соединяющей ветвью.

[48] В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия как первая, так и вторая центральные сердцевины имеют множество аминогрупп. Каждая из связывающих ветвей связывается с центральной сердцевиной посредством образования амидной связи между ними, например, между N-гидроксисукцинимидильной (NHS) группой и аминогруппой. После связывания с центральной сердцевиной связывающая ветвь, таким образом, имеет малеимидную группу на своем свободном конце. В присутствии малеимидной группы первый нацеливающий элемент и первый эффекторный элемент связываются соответственно с первой и второй связывающими ветвями посредством реакции тиольной и малеимидной групп.

[49] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия каждая из связывающих ветвей представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев. Кроме того, каждая из соединяющих ветвей представляет собой цепь PEG, имеющую 2-12 повторяющихся EG-звеньев.

[50] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия каждая из первой и второй центральных сердцевин может представлять собой сердцевину на основе химического соединения или полипептидную сердцевину. В некоторых примерах как первая, так и вторая центральные сердцевины представляют собой сердцевины на основе химических соединений из одинаковых или разных химических соединений. В определенных предпочтительных вариантах осуществления как первая, так и вторая центральные сердцевины представляют собой полипептидные сердцевины, имеющие одинаковые или разные последовательности. В качестве альтернативы, одна из двух сердцевин представляет собой сердцевину на основе химического соединения, а другая представляет собой полипептидную сердцевину.

[51] Неограничивающие примеры химического соединения, подходящего для применения в качестве сердцевины на основе химического соединения по настоящему изобретению, включают бензол-1,3,5-триамин, 2-(аминометил)-2-метилпропан-1,3-диамин, трис(2-аминоэтил)амин, бензол-1,2,4,5-тетраамин, 3,3',5,5'-тетраамин-1,1'-бифенил, тетракис(2-аминоэтил)метан, тетракис(этиламин)гидразин, N,N,N',N'-тетракис(аминоэтил)этилендиамин, бензол-1,2,3,4,5,6-гексаамин, 1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-гексакис(метиламин)бензол-1,3,5-триамин, 1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N-октакис(метиламин)бензол-1,2,4,5-триамин и N,N-бис[(1-амино-3,3-диаминоэтил)пентил]метандиамин.

[52] В случае, когда центральная сердцевина представляет собой сердцевину на основе химического соединения, соединяющая ветвь связана с одной из множества аминогрупп центральной сердцевины путем образования амидной связи между соединяющей ветвью и центральной сердцевиной. В то же время свободный конец соединяющей ветви имеет азидную, алкиновую, напряженную алкиновую или тетразиновую группу.

[53] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия полипептид, подходящий для применения в качестве полипептидной сердцевины по настоящему изобретению, содержит множество лизиновых (K) остатков; необязательно 2-15 остатков K. Кроме того, каждый остаток K отделен от следующего остатка K вставочной последовательностью, содержащей глициновые (G) и сериновые (S) остатки; вставочная последовательность необязательно состоит из 2-20 аминокислотных остатков. В различных вариантах осуществления вставочная последовательность может иметь последовательность GS, GGS, GSG или SEQ ID NO: 1-16. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит 2-15 звеньев с последовательностью G_1-5SK, например, (GSK)_2-15. В одном варианте осуществления полипептидная сердцевина имеет последовательность SEQ ID NO: 17, 18, 19, 21, 22, 23 или 24.

[54] В качестве альтернативы, полипептидная сердцевина может содержать последовательность (Х_аа-K)_n, где Х_аа представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую 2-12 повторяющихся этиленгликолевых (EG) звеньев, а n представляет собой целое число от 2 до 15. В одном варианте осуществления полипептидная сердцевина имеет последовательность SEQ ID NO: 25 или 26.

[55] В случае, когда центральная сердцевина представляет собой полипептидную сердцевину, она может содержать цистеиновый остаток на своем N- или С-конце. В этих случаях соединяющая ветвь связана с цистеиновым остатком центральной сердцевины посредством реакции тиольной и малеимидной групп.Соединяющая ветвь, связанная с цистеиновым остатком, имеет азидную, алкиновую, напряженную алкиновую или тетразиновую группу на своем свободном конце.

[56] Первое и второе линкерные звенья могут соединяться посредством различных конфигураций, которые подробно описаны ниже, в зависимости от наличия или отсутствия первой и второй соединяющих ветвей. Для линкерного звена, имеющего сердцевину на основе химического соединения, предпочтительно, чтобы оно было связано с другим линкерным звеном посредством соединяющей ветви (т.е. первой или второй соединяющей ветви), а для линкерного звена, имеющего полипептидную сердцевину, необходимость в соединяющей ветви становится необязательной.

[57] Если первое и второе линкерные звенья соответственно содержат соединяющие ветви, то одна из соединяющих ветвей (допустим, например, первая соединяющая ветвь) имеет тетразиновую группу на своем свободном конце, а другая соединяющая ветвь (в данном случае вторая соединяющая ветвь) имеет напряженную алкиновую группу на своем свободном конце, так что два линкерных звена соединяются посредством реакции iEDDA, происходящей между двумя соединяющими ветвями (т.е. первой и второй соединяющими ветвями). Тетразиновая группа предпочтительно представляет собой 1,2,3,4-тетразиновую, 1,2,3,5-тетразиновую и 1,2,4,5-тетразиновую группы или их производные, такие как 6-метилтетразиновая группа; а напряженная алкиновая группа представляет собой ТСО-группу. Это же правило также является применимым в случае, когда свободные концы обеих соединяющих ветвей имеют соответственно азидную группу и алкиновую группу; в этом случае два линкерных звена соединяются посредством реакции CuAAC, происходящей между двумя соединяющими ветвями (т.е. первой и второй соединяющими ветвями). В качестве альтернативы, одна соединяющая ветвь имеет азидную группу, а другая соединяющая ветвь имеет напряженную алкиновую группу (предпочтительно DBCO, DIFO, BCN или DICO); соответственно, две соединяющие ветви могут соединяться посредством реакции SPAAC. Эти конфигурации могут иметь место между двумя линкерными звеньями в случаях, когда оба звена имеют сердцевины на основе химического соединения либо полипептидные сердцевины, а также в ситуациях, когда одно линкерное звено имеет сердцевину на основе химического соединения, а другое имеет полипептидную сердцевину.

[58] Если только одно линкерное звено имеет соединяющую ветвь (в качестве примера, первое линкерное звено с первой соединяющей ветвью), то центральная сердцевина другого линкерного звена (например, вторая центральная сердцевина) представляет собой полипептидную сердцевину. В этом случае первый аминокислотный остаток на N- или С-конце одной второй центральной сердцевины представляет собой аминокислотный остаток, имеющий азидную группу или алкиновую группу. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток, имеющий азидную или алкиновую группу, будет подвергаться реакции CuAAC с соответствующей алкиновой или азидной группой первой соединяющей ветви первого линкерного звена с соединением таким образом первого и второго линкерных звеньев. В качестве альтернативы, первый аминокислотный остаток на N- или С-конце одной второй центральной сердцевины представляет собой аминокислотный остаток, имеющий азидную группу, которая может связываться с соединяющей ветвью первого линкерного звена, имеющего напряженную алкиновую группу (предпочтительно DBCO, DIFO, BCN или DICO) на свободном конце, посредством реакции SPAAC. Эта конфигурация может иметь место между двумя линкерными звеньями в случаях, когда оба звена имеют полипептидные сердцевины, или в ситуациях, когда одно линкерное звено имеет сердцевину на основе химического соединения, а другое имеет полипептидную сердцевину.

[59] Также возможно, чтобы первое и второе линкерные звенья были соединены без наличия каких-либо соединяющих ветвей (то есть первой и второй соединяющих ветвей). Иными словами, первое и второе линкерные звенья непосредственно связаны друг с другом. Эта конфигурация чаще всего имеет место между двумя полипептидными сердцевинами. В частности, одна из двух центральных сердцевин (допустим, например, первая центральная сердцевина) имеет аминокислотный остаток, имеющий азидную группу, на своем N- или С-конце, а другая центральная сердцевина (как, например, вторая центральная сердцевина) имеет аминокислотный остаток, имеющий алкиновую группу, на своем N- или С-конце. Таким образом, азидная группа первой центральной сердцевины реагирует с алкиновой группой второй центральной сердцевины с соединением таким образом первого и второго линкерных звеньев.

[60] Неограничивающие примеры аминокислотных остатков, имеющих азидную группу, включают L-азидогомоаланин (AHA), 4-азидо-L-фенилаланин, 4-азидо-D-фенилаланин, 3-азидо-L-аланин, 3-азидо-D-аланин, 4-азидо-L-гомоаланин, 4-азидо-D-гомоаланин, 5-азидо-L-орнитин, 5-азидо-D-орнитин, 6-азидо-L-лизин и 6-азидо-D-лизин. Иллюстративные примеры аминокислотных остатков, имеющих алкиновую группу, включают без ограничения L-гомопропаргилглицин (L-HPG), D-гомопропаргилглицин (D-HPG) и бета-гомопропаргилглицин (β-HPG).

[61] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия одно из первого и второго линкерных звеньев молекулярной конструкции дополнительно содержит дополнительную связывающую ветвь (в дальнейшем именуемую третьей связывающей ветвью), связанную с первым или вторым линкерным звеном.

[62] В некоторых вариантах осуществления третья связывающая ветвь способна связываться с длинной цепью PEG, имеющей молекулярный вес, составляющий приблизительно 20000-50000 дальтонов, посредством реакции тиольной и малеимидной групп. Третья связывающая ветвь необязательно способна связываться с одним scFv в качестве нацеливающего элемента либо эффекторного элемента. В некоторых примерах первая и вторая связывающие ветви присоединены к двум различным эффекторным элементам, а нацеливающий элемент, связанный с третьей связывающей ветвью, представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа, коллагену II типа, коллагену III типа, коллагену V типа, коллагену VII типа, коллагену IX типа, коллагену XI типа, аггрекану или остеонектину. В других примерах первая и вторая связывающие ветви присоединены к двум различным нацеливающим элементам, а эффекторный элемент, связанный с третьей связывающей ветвью представляет собой scFv, специфичный к CD3 или CD16a.

[63] В других вариантах осуществления молекулярная конструкция по настоящему изобретению дополнительно содержит третье линкерное звено. Третье линкерное звено содержит третью центральную сердцевину, связывающую ветвь (в дальнейшем именуемую третьей связывающей ветвью) и необязательно соединяющую ветвь (в дальнейшем именуемую третьей соединяющей ветвью). В этом случае третье линкерное звено связано с первым или вторым линкерным звеном посредством реакции CuAAC, реакции iEDDA или реакции SPAAC, происходящей между любыми из следующих: первой или второй соединяющей ветвью и третьей соединяющей ветвью, первой или второй центральной сердцевиной и третьей соединяющей ветвью, первой или второй соединяющей ветвью и третьей центральной сердцевиной или первой или второй центральной сердцевиной и третьей центральной сердцевиной.

[64] Что касается третьей связывающей ветви третьего линкерного звена, она может иметь малеимидную группу на своем свободном конце, которая применяется для связывания со вторым эффекторным элементом или нацеливающим элементом посредством реакции тиольной и малеимидной групп.

[65] Как будет понятно, нацеливающий/эффекторный элемент (такой как лекарственное средство), имеющий группу NHS, может быть непосредственно связан с остатком К первой, второй и/или третьей центральной сердцевины посредством образования амидной связи между группой NHS и остатком К без наличия связывающей ветви (т.е. первой, второй или третьей связывающей ветви).

[66] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия первая, вторая и необязательно третья центральные сердцевины могут быть одинаковыми или разными.

[67] Пути применения молекулярных конструкций с нацеливающими и эффекторными компонентами

[68] Молекулярная конструкция в соответствии с третьим аспектом настоящего раскрытия может оказываться полезным в клинической медицине для лечения различных заболеваний. Следовательно, четвертый аспект настоящего раскрытия направлен на способ лечения этих заболеваний. В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия способ лечения конкретного заболевания включает этап введения субъекту, нуждающемуся в этом, молекулярной конструкции в соответствии с третьим аспектом настоящего раскрытия и его вариантами осуществления в терапевтически эффективном количестве. Как можно понять, указанную молекулярную конструкцию можно вводить в фармацевтическом составе, который содержит фармацевтически приемлемый наполнитель, подходящий для намеченного или желаемого пути введения, в дополнение к молекулярной конструкции по настоящему изобретению.

[69] Различные иллюстративные комбинации первого и второго элементов молекулярной конструкции по настоящему изобретению для лечения некоторых конкретных заболеваний раскрыты ниже для облегчения понимания некоторых вариантов осуществления настоящего раскрытия.

[70] В некоторых вариантах осуществления первый элемент представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), специфичный к цитокину или рецептору цитокина; или растворимый рецептор цитокина, а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к тканевому белку внеклеточного матрикса. В этих случаях первый элемент представляет собой эффекторный элемент для лечения одного или более иммунологических нарушений, а второй элемент представляет собой нацеливающий элемент, который облегчает доставку молекулярной конструкции в пораженный участок.

[71] Неограничивающие примеры цитокина включают фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкин-17 (IL-17), IL-1, IL-6, IL-12/IL-23 и фактор активации В-клеток (BAFF), а неограничивающими примерами рецептора цитокина являются рецепторы, специфичные к IL-6 (т.е. IL-6R) или IL-17 (т.е. IL-17R). Что касается растворимого рецептора цитокина, его примеры включают без ограничения растворимый рецептор цитокина, специфичный к TNF-α или IL-1. Иллюстративные примеры тканевого белка внеклеточного матрикса включают без ограничения α-аггрекан, коллаген I типа, коллаген II типа, коллаген III типа, коллаген V типа, коллаген VII типа, коллаген IX типа и коллаген XI типа.

[72] В соответствии с некоторыми конкретными, но иллюстративными примерами молекулярных конструкций, подходящих для лечения псориаза, первый элемент представляет собой scFv, специфичный к KTNF-α, IL-12/IL-23, IL-17 или IL-17R; а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа.

[73] В некоторых необязательных примерах молекулярные конструкции, подходящие для лечения иммунологических нарушений, таких как системная красная волчанка (SLE), кожная волчанка или синдром Шегрена, содержат scFv, специфичный к BAFF, в качестве первого элемента и scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа, в качестве второго элемента.

[74] Иллюстративные молекулярные конструкции для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилоартрита содержат первый элемент, который представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12/IL-23, IL-17, IL-6R или IL-17R; и второй элемент, который представляет собой scFv, специфичный к коллагену II типа, коллагену IX типа, коллагену XI типа или α-аггрекану.

[75] Молекулярные конструкции также подходят для лечения воспалительных заболеваний кишечника, например, в числе прочих, болезни Крона и неспецифического язвенного колита. В этих случаях в молекулярной конструкции по настоящему изобретению применяется scFv, специфичный к TNF-α, в качестве первого элемента и scFv, специфичный к коллагену III типа или коллагену V типа, в качестве второго элемента.

[76] Другой группой заболеваний, поддающихся лечению с помощью молекулярной конструкции по настоящему изобретению, являются диффузные опухоли, включающие без ограничения острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому и миелому. В этих вариантах осуществления первый элемент может представлять собой нацеливающий элемент, такой как scFv, специфичный к первому антигену клеточной поверхности, тогда как второй элемент может представлять собой цитотоксическое лекарственное средство или эффекторный элемент, такой как scFv, специфичный ко второму антигену клеточной поверхности.

[77] Первый антиген клеточной поверхности, подходящий для применения в качестве нацеливающего элемента для лечения диффузной опухоли, включает без ограничения CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD72a, CD78, CD79a, CD79b, CD86, CD134, CD137, CD138 и CD319. В то же время неограничивающие примеры второго антигена клеточной поверхности, подходящего для применения в качестве эффекторного элемента, включают CD3 и CD16a. В качестве альтернативы, первый и второй антигены клеточной поверхности представляют собой соответственно CD79a и CD79b. Цитотоксическое лекарственное средство, подходящее для лечения диффузной опухоли, включает без ограничения ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин и камптотецин.

[78] Для лечения лимфомы или лейкоза, происходящих из В-лимфоцитов, иллюстративный первый элемент представляет собой scFv, специфичный к CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD37, CD79a или CD79b; а иллюстративный второй элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или scFv, специфичный к CD3 или CD16a.

[79] Для лечения плазмоцитомы или множественной миеломы иллюстративный первый элемент представляет собой scFv, специфичный к CD38, CD78, CD138 или CD319; а иллюстративный второй элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или scFv, специфичный к CD3 или CD16a.

[80] Что касается лимфомы или лейкоза, происходящих из Т-клеток, иллюстративный первый элемент для их лечения представляет собой scFv, специфичный к CD5, CD30 или CD43; а второй элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или scFv, специфичный к CD3 или CD16a.

[81] Для лечения миелогенного лейкоза иллюстративный первый элемент представляет собой scFv, специфичный к CD33 или CD34; а иллюстративный второй элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или scFv, специфичный к CD3 или CD16a.

[82] Еще одной группой заболеваний, которые можно лечить с помощью молекулярной конструкции по настоящему изобретению, являются солидные опухоли, включающие без ограничения формы меланомы, формы карциномы пищевода, формы карциномы желудка, опухоль головного мозга, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак почки, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичника, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичка и плоскоклеточную карциному головы и шеи. Дополнительно, молекулярная конструкция по настоящему изобретению также подходит для лечения запущенных, злокачественных или метастатических солидных опухолей.

[83] Для конструирования молекулярной конструкции для лечения солидных опухолей первый элемент (т.е. нацеливающий элемент) выбирают из пептидного гормона, первого фактора роста и первого scFv, специфичного к опухолеассоциированному антигену; тогда как второй элемент (т.е. эффекторный элемент) представляет собой цитотоксическое лекарственное средство, агонист Toll-подобных рецепторов (TLR), хелатообразователь в комплексе с радиоактивным нуклидом, цитокин или второй scFv, специфичный ко второму фактору роста, антигену клеточной поверхности, гаптену или цитокину.

[84] Например, пептидный гормон представляет собой секретин, холецистокинин (CCK), соматостатин или тиреостимулирующий гормон (TSH). Что касается первого фактора роста, он может представлять собой эпидермальный фактор роста (EGF), мутантный EGF, эпирегулин, гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), основной фактор роста фибробластов (bFGF) или фактор роста гепатоцитов (HGF). Иллюстративные примеры опухолеассоциированного антигена включают рецептор 1 человеческого эпидермального фактора роста (HER1), HER2, HER3, HER4, углеводный антиген 19-9 (СА 19-9), углеводный антиген 125 (СА 125), раково-эмбриональный антиген (СЕА), муцин 1 (MUC 1), ганглиозид GD2, антиген, ассоциированный с меланомой (MAGE), простатический специфический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA), мезотелин, Tn, родственный муцину, сиалированный Tn, глобо-Н, стадиеспецифический эмбриональный антиген 4 (SSEA-4) и молекулу адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ).

[85] Поскольку цитотоксическое лекарственное средство подходит для лечения диффузных опухолей, цитотоксическое лекарственное средство, применяемое в молекулярной конструкции для лечения солидных опухолей, включает без ограничения ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин и камптотецин. Неограничивающие примеры агониста TLR включают липополисахарид (LPS), монофосфорил-липид А, мотолимод, имиквимод, резиквимод, гардиквимод, CpG-олигодезоксинуклеотид (CpG DON), липотейхоевую кислоту, β-глюкан и зимозан. Хелатообразователь выбран из группы, состоящей из 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA), 1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусной кислоты (NOTA), 1,4,7-триазациклононан-1,4-диуксусной кислоты (NODA) и диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA); а радиоактивный нуклид представляет собой¹¹¹In,¹³¹I или¹⁷⁷Lu. Что касается цитокина, он может быть выбран из группы, состоящей из IL-2, IFN-α, IFN-γ и TNF-α. Второй фактор роста, способный специфично распознаваться вторым scFv и связываться с ним, представляет собой EGF, мутантный EGF, VEGF-A, bFGF или HGF. Антиген клеточной поверхности, специфично распознаваемый вторым scFv и связывающийся с ним, выбран из группы, состоящей из CD3, CD16a, CD28, CD134, белка 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA-4, или CD152), белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1, или CD279) и лиганда 1 белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD-L1, или CD274). Цитокин, специфично распознаваемый вторым scFv и связывающийся с ним, выбран из группы, состоящей из IL-2, IFN-α, IFN-γ и TNF-α; в этих случаях второй scFv представляет собой ненейтрализующий scFv.

[86] В некоторых случаях некоторые опухолеассоциированные антигены могут "слущиваться" с поверхности солидной опухоли субъекта и уходить в систему кровообращения субъекта. В этих случаях способ лечения солидной опухоли по настоящему изобретению включает этапы (а) проведения субъекту процедуры диализа крови с применением антитела, специфичного к одному или более опухолеассоциированным антигенам, для удаления опухолеассоциированных антигенов, "слущивающихся" с поверхности опухоли и уходящих в систему кровообращения субъекта; и (b) введения молекулярной конструкции по настоящему изобретению для лечения солидной опухоли.

[87] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия в тех случаях, когда второй элемент представляет собой второй scFv, специфичный к гаптену, способ дополнительно включает этап введения субъекту иммунорегуляторного эффектора, меченного этим гаптеном. В вариантах осуществления гаптен выбран из группы, состоящей из динитрофенола (DNP), тринитрофенола (TNP) и короткого пептида, имеющего аминокислотную последовательность WADWPGPP (SEQ ID NO: 20); а иммунорегуляторный эффектор представляет собой IFN-α, IL-2, TNF-α и IFN-γ, а также антитело IgG, специфичное к PD-1, PD-L1, CTLA-4 или CD3.

[88] Еще одним типичным заболеванием, поддающимся лечению с помощью молекулярной конструкции по настоящему изобретению, является остеопороз. Иллюстративные молекулярные конструкции, подходящие для лечения остеопороза, содержат первый элемент (в данном случае эффекторный элемент), который представляет собой первый scFv, специфичный к лиганду рецептора-активатора ядерного фактора кВ (RANKL); и второй элемент (например, нацеливающий элемент), который представляет собой второй scFv, специфичный к коллагену I типа или остеонектину.

[89] Противовоспалительные молекулы с функциями нацеливания на ткани

[90] В пятом аспекте настоящее раскрытие направлено на молекулярную конструкцию на основе кристаллизующегося фрагмента (Fc), которая имеет по меньшей мере один нацеливающий элемент и по меньшей мере один эффекторный элемент, непосредственно или опосредованно связанные с доменом СН2-СН3 иммуноглобулина. Архитектура молекулярной конструкции на основе Fc по настоящему изобретению обеспечивает возможность реализации многочисленных комбинаций широкого диапазона нацеливающих и эффекторных элементов. Следовательно, молекулярная конструкция на основе Fc по настоящему изобретению может служить в качестве платформы для конструирования поливалентных молекул.

[91] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция на основе Fc содержит пару сегментов СН2-СН3 Fc IgG, первую пару эффекторных элементов и первую пару нацеливающих элементов.

[92] В некоторых вариантах осуществления молекулярные конструкции на основе Fc по настоящему изобретению предназначены для применения в лечении иммунологических заболеваний (в частности, аутоиммунных заболеваний) или остеопороза. В этом случае первая пара эффекторных элементов состоит из двух эффекторных элементов, при этом каждый из двух эффекторных элементов представляет собой фрагмент антитела, специфичный к фактору некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкину-17 (IL-17), рецептору IL-17 (IL-17R), IL-1, IL-6, IL-6R, IL-12/IL-23, фактору активации В-клеток (BAFF) или лиганду рецептора-активатора ядерного фактора каппа-В (RANKL); или растворимый рецептор TNF-α или IL-1. Дополнительно, первая пара нацеливающих элементов состоит из двух нацеливающих элементов, при этом каждый из двух нацеливающих элементов представляет собой фрагмент антитела, специфичный к α-аггрекану, коллагену I типа, коллагену II типа, коллагену III типа, коллагену V типа, коллагену VII типа, коллагену IX типа, коллагену XI типа или остеонектину. В случае, когда первая пара эффекторных элементов связана с N-концами пары сегментов СН2-СН3, первая пара нацеливающих элементов связана с С-концами пары сегментов СН2-СН3, и наоборот. В качестве альтернативы, если как первая пара эффекторных элементов, так и первая пара нацеливающих элементов находятся в форме одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), то первая пара нацеливающих элементов связана с N-концами первой пары эффекторных элементов в тандемной конфигурации или в конфигурации диатела с образованием таким образом пары биспецифических scFv, связанной с N-концами пары сегментов СН2-СН3.

[93] В определенных вариантах осуществления пара сегментов СН2-СН3 получена из тяжелой цепи γ4 человеческого IgG или тяжелой цепи γ1 человеческого IgG.

[94] В некоторых примерах первая пара эффекторных элементов или первая пара нацеливающих элементов имеет конфигурацию Fab (т.е. состоит из домена V_H-CH1 и домена V_L-C_K); этот Fab-фрагмент связан с N-концами первой и второй тяжелых цепей, так что молекулярная конструкция на основе Fc принимает конфигурацию IgG. В этих случаях пара элементов, которая не находится в конфигурации Fab, связана с С-концами пары сегментов СН2-СН3.

[95] В соответствии с другими вариантами осуществления молекулярная конструкция на основе Fc дополнительно содержит вторую пару эффекторных элементов, которая состоит из двух дополнительных эффекторных элементов, оба из которых выбраны из группы, описанной выше применительно к эффекторным элементам. В соответствии с различными вариантами осуществления элементы второй пары эффекторных элементов отличаются от элементов первой пары эффекторных элементов. В этих вариантах осуществления вторая пара эффекторных элементов связана со свободными С-концами сегментов СН2-СН3.

[96] В качестве альтернативы, молекулярная конструкция на основе Fc по настоящему изобретению дополнительно содержит вторую пару нацеливающих элементов, в которой оба из двух нацеливающих элементов выбраны из группы, описанной выше в отношении нацеливающих элементов. В соответствии с различными вариантами осуществления элементы второй пары нацеливающих элементов отличаются от элементов первой пары нацеливающих элементов. В этих вариантах осуществления вторая пара нацеливающих элементов связана со свободными С-концами сегментов СН2-СН3.

[97] В соответствии с различными необязательными вариантами осуществления нацеливающие элементы и эффекторные элементы, описанные выше, можно при желании объединять, чтобы достичь намеченного терапевтического эффекта. Некоторые типичные комбинации эффекторного(эффекторных) элемента(элементов) и нацеливающего(нацеливающих) элемента(элементов) для лечения иммунологических заболеваний представлены в прилагаемой формуле изобретения и обсуждаются ниже в разделе "Подробное описание изобретения".

[98] Пути применения противовоспалительных молекул с функциями нацеливания на ткани

[99] В шестом аспекте настоящее раскрытие направлено на способы лечения различных заболеваний. Как правило, способы включают этап введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества молекулярных конструкций на основе Fc в соответствии с пятым аспектом и любым из соответствующих вариантов осуществления.

[100] В определенных вариантах осуществления способ по настоящему изобретению направлен на лечение иммунологического заболевания; в частности, аутоиммунного заболевания.

[101] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит, псориатический артрит или анкилозирующий спондилоартрит. В этом случае эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к TNF-α, IL-12/IL-23, IL-1, IL-17 или IL-6, а нацеливающий элемент может представлять собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену II типа, коллагену IX типа, коллагену XI типа или α-аггрекану.

[102] В соответствии с различными вариантами осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой псориаз. В этом случае эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к TNF-α, IL-12/IL-23 или IL-17, а нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа.

[103] В соответствии с некоторыми другими вариантами осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой системную красную волчанку, кожную волчанку или синдром Шегрена. В этом случае эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к BAFF, а нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа.

[104] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аутоиммунное заболевание представляет собой воспалительное заболевание кишечника, такое как болезнь Крона или неспецифический язвенный колит. В этом случае эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к TNF-α, а нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену III типа или коллагену V типа.

[105] Другим заболеванием, поддающимся лечению с помощью способа, предложенного в данном документе, является остеопороз. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия эффекторный элемент для лечения остеопороза включает в себя фрагмент антитела, специфичный к RANKL, а нацеливающий элемент включает в себя фрагмент антитела, специфичный к коллагену I типа или остеонектину.

[106] Молекулярные конструкции для лечения опухолей

[107] В седьмом аспекте настоящее раскрытие направлено на молекулярную конструкцию на основе Fc, которая, подобно молекулярной конструкции, описанной выше в пятом аспекте настоящего раскрытия, имеет по меньшей мере один нацеливающий элемент и по меньшей мере один эффекторный элемент, непосредственно или опосредованно связанные с доменом СН2-СН3 иммуноглобулина. Благодаря выбору эффекторного (эффекторных) элемента(элементов) и нацеливающего(нацеливающих) элемента(элементов) молекулярной конструкции на основе Fc по настоящему изобретению молекулярную конструкцию можно применять для лечения различных заболеваний, обусловленных нарушением пролиферации клеток, в том числе диффузных опухолей и солидных опухолей. Настоящее раскрытие также является преимущественным в том, что в некоторых вариантах осуществления в нем используется линкерное звено в соответствии с первым аспектом настоящего раскрытия, что обеспечивает легкий способ контроля количества нагрузки из лекарственных средств (например, цитотоксических лекарственных средств) в молекулярной конструкции на основе Fc по настоящему изобретению. Линкерное звено, несущее несколько молекул лекарственных средств, называется в данном документе "связкой" лекарственных средств. Такие "связки" лекарственных средств можно получать по отдельности перед конъюгированием с молекулами антител, избегая таким образом воздействия на молекулы лекарственных средств жестких химических условий для непосредственного конъюгирования с молекулами антител.

[108] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция на основе Fc содержит пару сегментов СН2-СН3 Fc IgG, первую пару эффекторных элементов и первую пару нацеливающих элементов.

[109] В первой серии молекулярных конструкций на основе Fc в соответствии с данным аспектом каждый эффекторный элемент первой пары эффекторных элементов представляет собой "связку" лекарственных средств, а каждый нацеливающий элемент первой пары нацеливающих элементов представляет собой фрагмент антитела, специфичный к антигену клеточной поверхности. В этих случаях первая пара эффекторных элементов связана с С-концами пары сегментов СН2-СН3, тогда как первая пара нацеливающих элементов связана с N-концами пары сегментов СН2-СН3. В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия "связка" лекарственных средств содержит множество молекул цитотоксических лекарственных средств, таких как ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин и камптотецин; а антиген клеточной поверхности, на который нацеливаются эти молекулярные конструкции на основе Fc, представляет собой CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD78, CD79a, CD79b, CD138 или CD319. В качестве примера, а не ограничения, эти молекулярные конструкции на основе Fc являются применимыми в лечении различных диффузных опухолей.

[110] Во второй серии молекулярных конструкций на основе Fc в соответствии с данным аспектом каждый эффекторный элемент первой пары эффекторных элементов представляет собой "связку" лекарственных средств, а каждый нацеливающий элемент первой пары нацеливающих элементов представляет собой фрагмент антитела, специфичный к опухолеассоциированному антигену. В этих случаях первая пара эффекторных элементов связана с С-концами пары сегментов СН2-СН3, тогда как первая пара нацеливающих элементов связана с N-концами пары сегментов СН2-СН3. В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия "связка" лекарственных средств содержит множество молекул цитотоксических лекарственных средств, агонистов Toll-подобных рецепторов (TLR) или хелатообразователей в комплексе с радиоактивными нуклидами, тогда как опухолеассоциированный антиген, на который нацеливаются эти молекулярные конструкции на основе Fc, представляет собой рецептор 1 человеческого эпидермального фактора роста (HER1), HER2, HER3, HER4, СА19-9, СА125, раково-эмбриональный антиген (СЕА), муцин 1, ассоциированный с клеточной поверхностью (MUC1), антиген, ассоциированный с меланомой (MAGE), простатический специфический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA); Tn, родственный муцину, сиалированный Tn, глобо-Н, стадиеспецифический эмбриональный антиген 4 (SSEA-4), ганглиозид GD2 или адгезивную молекулу эпителиальных клеток (ЕрСАМ). В качестве примера, а не ограничения, эти молекулярные конструкции на основе Fc являются применимыми в лечении различных солидных опухолей, в том числе злокачественных и/или метастатических солидных опухолей.

[111] В третьей серии молекулярных конструкций на основе Fc в соответствии с данным аспектом каждый эффекторный элемент первой пары эффекторных элементов представляет собой "связку" лекарственных средств или фрагмент антитела, специфичный к антигену клеточной поверхности, фактору роста или гаптену; а каждый нацеливающий элемент первой пары нацеливающих элементов представляет собой фактор роста или пептидный гормон. В случае, когда эффекторные элементы представляют собой "связки" лекарственных средств, первая пара эффекторных элементов соответственно связана с С-концами пары сегментов СН2-СН3, тогда как нацеливающие элементы соответственно связаны с N-концами пары сегментов СН2-СН3. В качестве альтернативы, если эффекторные элементы представляют собой фрагменты антител, то эффекторные элементы соответственно связаны с N-концами пары сегментов СН2-СН3, тогда как нацеливающие элементы соответственно связаны с С-концами пары сегментов СН2-СН3, и наоборот.

[112] Благодаря выбору эффекторного(эффекторных) элемента(элементов) и нацеливающего(нацеливающих) элемента(элементов) молекулярные конструкции на основе Fc из этой третьей серии, представленные в данном документе, также являются применимыми для применения в лечении различных солидных опухолей, в том числе злокачественных и/или метастатических солидных опухолей; однако, настоящее раскрытие не ограничивается ими.

[113] В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия цитотоксическое лекарственное средство, подходящее для применения в качестве эффекторного элемента, представляет собой ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин или камптотецин. Иллюстративные примеры агониста TLR включают липополисахарид (LPS), монофосфорил-липид А, мотолимод, имиквимод, резиквимод, гардиквимод, CpG-олигодезоксинуклеотид (CpG DON), липотейхоевую кислоту, β-глюкан и зимозан. Хелатообразователи, подходящие для применения в данном документе, включают без ограничения 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N'',N'''',N''''''-тетрауксусную кислоту (DOTA), 1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусную кислоту (NOTA), 7-п-изотиоцианобензил-1,4,7-триазациклооктан-1,4-диуксусную кислоту (NODA) или диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA). Неограничивающие примеры радиоактивных нуклидов, подлежащих включению в комплекс с вышеупомянутыми хелатообразователями или подобными им, включают⁹⁰Y,¹¹¹In и¹⁷⁷Lu.

[114] Некоторые фрагменты антител, подходящие для применения в качестве эффекторных элементов, являются специфичными к антигенам клеточной поверхности, таким как белок 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1), лиганд 1 белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD-L1), белок 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA-4), CD3, CD16a, CD28 и CD134. Другим примером является фрагмент антитела, специфичный к фактору роста, такому как эпидермальный фактор роста (EGF), мутантный EGF, эпирегулин, гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), VEGF-A, основной фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор роста гепатоцитов (HGF). Фрагменты антител, специфичные к гаптенам, также подходят для применения в данном документе, и иллюстративные примеры гаптенов включают динитрофенол (DNP), тринитрофенол (TNP), дансил, пенициллин, п-аминобензойную кислоту или полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

[115] Что касается нацеливающего(нацеливающих) элемента(элементов), подходящих для применения в этой серии молекулярных конструкций на основе Fc, нацеливающий(нацеливающие) элемент(элементы) могут представлять собой фактор роста, такой как EGF, мутантный EGF, эпирегулин, HB-EGF, VEGF-A, bFGF и HGF. В качестве альтернативы, нацеливающий(нацеливающие) элемент(элементы) могут представлять собой пептидный гормон, такой как ССK, соматостатин и TSH.

[116] Молекулярные конструкции на основе Fc в соответствии с данным аспектом настоящего раскрытия обладают некоторыми общими структурными признаками, которые обобщены ниже.

[117] В определенных вариантах осуществления пара сегментов СН2-СН3 получена из тяжелой цепи γ4 человеческого IgG или тяжелой цепи γ1 человеческого IgG.

[118] В некоторых примерах первая пара эффекторных элементов (например, для третьей серии молекулярных конструкций на основе Fc) или первая пара нацеливающих элементов (например, для первой и второй серий молекулярных конструкций на основе Fc) имеет конфигурацию Fab (т.е. содержит домен V_H-CH1 и домен V_L-C_K); этот Fab-фрагмент связан с N-концами первой и второй тяжелых цепей, так что молекулярная конструкция на основе Fc принимает конфигурацию IgG. В этих случаях пара элементов, которая не находится в конфигурации Fab, может быть связана с С-концами пары сегментов СН2-СН3.

[119] В соответствии с определенными вариантами осуществления молекулярная конструкция на основе Fc по настоящему изобретению дополнительно содержит пептидное удлинение и соединяющую ветвь. В частности, пептидное удлинение имеет последовательность (G_2-4S)_2-8C и связано с С-концом одного из пары сегментов СН2-СН3. В таких случаях соединяющая ветвь связана с С-концом пептидного удлинения посредством реакции тиольной и малеимидной групп, происходящей между ними. Кроме того, перед конъюгированием со "связкой" лекарственных средств свободный конец соединяющей ветви (то есть конец, который не связан с цистеиновым остатком) модифицируют алкиновой, азидной, напряженной алкиновой или тетразиновой группой, так чтобы "связка" лекарственных средств связывалась с ним посредством реакции Дильса-Альдера с обратными электронными требованиями (iEDDA), или химической клик-реакции азид-алкинового циклоприсоединения, облегченного напряжением (SPAAC), или реакции азид-алкинового циклоприсоединения, катализируемого медью (I) (CuAAC), происходящей между ними.

[120] Если эффекторный элемент представляет собой "связку" лекарственных средств, "связка" лекарственных средств может быть представлена в виде линкерного звена в соответствии с первым аспектом настоящего раскрытия. В частности, "связка" лекарственных средств содержит центральную сердцевину, множество первых связывающих ветвей и необязательно вторую связывающую ветвь. Центральная сердцевина может представлять собой химическое соединение, имеющее множество аминогрупп, или полипептид, содержащий множество лизиновых (K) остатков, в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия. Каждая из первых связывающих ветвей имеет один конец, связанный с центральной сердцевиной посредством реакции с аминогруппами сердцевины на основе химического соединения или остатками K полипептидной сердцевины. Первая связывающая ветвь также несет малеимидную группу на своем свободном конце, при этом каждая из молекул (например, молекул цитотоксических лекарственных средств, агонистов TLR или комплексов хелатообразователь/радиоактивный нуклид) связана с центральной сердцевиной путем присоединения с помощью первой связывающей ветви посредством реакции с малеимидной группой.

[121] Если центральная сердцевина представляет собой полипептидную сердцевину, то аминокислотный остаток на N- или С-конце центральной сердцевины представляет собой цистеиновый остаток или имеет азидную группу или алкиновую группу.

[122] В случае с полипептидными сердцевинами с концевым аминокислотным остатком, имеющим азидную группу или алкиновую группу, "связка" лекарственных средств может связываться с соединяющей ветвью посредством реакции CuAAC, происходящей между указанным концевым остатком и С-концом соединяющей ветви.

[123] В случае с полипептидными сердцевинами с концевым остатком, представляющим собой цистеин, или в случае с сердцевинами на основе химического соединения "связка" лекарственных средств дополнительно содержит вторую связывающую ветвь. Вторая связывающая ветвь имеет один конец, связанный с центральной сердцевиной посредством реакции с цистеиновым остатком полипептидной сердцевины или одной аминогруппой сердцевины на основе химического соединения. Вторая связывающая ветвь также несет алкиновую группу, азидную группу, тетразиновую группу или напряженную алкиновую группу на своем свободном конце, так что "связка" лекарственных средств может связываться с С-концом соединяющей ветви посредством реакции CuAAC или реакции iEDDA, происходящей между ними.

[124] В соответствии с некоторыми необязательными вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция на основе Fc может дополнительно содержать вторую пару эффекторных элементов и вторую пару нацеливающих элементов.

[125] Во второй серии молекулярных конструкций на основе Fc вторая пара нацеливающих элементов может быть соответственно связана с первой парой нацеливающих элементов. Например, в определенных вариантах осуществления каждый эффекторный элемент первой пары эффекторных элементов представляет собой "связку" лекарственных средств, содержащую множество молекул цитотоксических лекарственных средств, каждый нацеливающий элемент первой пары нацеливающих элементов представляет собой scFv, специфичный к HER2, и каждый нацеливающий элемент второй пары нацеливающих элементов представляет собой scFv, специфичный к HER1.

[126] В третьей серии молекулярных конструкций на основе Fc вторая пара эффекторных элементов может быть связана в тандемной конфигурации или в конфигурации диатела с N-концами пары элементов, которая связана с N-концами пары сегментов СН2-СН3, с образованием таким образом пары биспецифических scFv, связанной с N-концами пары сегментов СН2-СН3. В качестве альтернативы, молекулярная конструкция третьей серии на основе Fc может дополнительно содержать вторую пару нацеливающих элементов, связанную в тандемной конфигурации или в конфигурации диатела с N-концами пары элементов, которая связана с N-концами пары сегментов СН2-СН3, с образованием таким образом пары биспецифических scFv, связанной с N-концами пары сегментов СН2-СН3.

[127] Пути применения молекулярных конструкций для лечения опухолей

[128] В восьмом аспекте настоящее раскрытие направлено на способы лечения различных заболеваний, обусловленных нарушениями пролиферации клеток. Как правило, способы включают этап введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества молекулярных конструкций на основе Fc в соответствии с седьмым аспектом или любым из соответствующих вариантов осуществления.

[129] В определенных вариантах осуществления способ по настоящему изобретению направлен на лечение диффузных опухолей, таких как лимфома или лейкоз, происходящие из В-лимфоцитов, плазмоцитома, множественная миелома, лимфома или лейкоз, происходящие из Т-клеток, и миелогенный лейкоз. Как обсуждается выше, молекулярные конструкции первой серии на основе Fc согласно седьмому аспекту настоящего раскрытия являются применимыми в лечении диффузной опухоли. Иллюстративные примеры антигена(антигенов) клеточной поверхности, на которые нацеливается молекулярная конструкция на основе Fc по настоящему изобретению при лечении конкретной диффузной опухоли, представлены в прилагаемой формуле изобретения и обсуждаются ниже в разделе "Подробное описание изобретения".

[130] Как обсуждается выше, способ по настоящему изобретению также подходит для лечения солидных опухолей у субъекта. Примеры солидных опухолей включают без ограничения формы меланомы, формы карциномы пищевода, формы карциномы желудка, опухоль головного мозга, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак почки, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичника, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичка и плоскоклеточную карциному головы и шеи. Как обсуждается выше, молекулярные конструкции второй и третьей серии на основе Fc согласно седьмому аспекту настоящего раскрытия являются применимыми в лечении солидной опухоли. Некоторые типичные комбинации эффекторного(эффекторных) элемента(элементов) и нацеливающего(нацеливающих) элемента(элементов) для лечения солидных опухолей представлены в прилагаемой формуле изобретения и обсуждаются ниже в разделе "Подробное описание изобретения".

[131] В соответствии с некоторыми необязательными вариантами осуществления настоящего раскрытия при лечении солидной опухоли способ включает этапы (а) проведения субъекту процедуры диализа крови с применением фрагмента антитела, специфичного к одному или более опухолеассоциированным антигенам, для удаления опухолеассоциированных антигенов, "слущивающихся" с поверхности опухоли в систему кровообращения субъекта; и затем (b) введения молекулярной конструкции на основе Fc по настоящему раскрытию для лечения солидной опухоли.

[132] Если в молекулярной конструкции на основе Fc применяется фрагмент антитела, специфичный к гаптену, в качестве эффекторного элемента, то способ по настоящему изобретению дополнительно включает этап введения субъекту иммунорегуляторного эффектора, меченного этим гаптеном, после введения молекулярной конструкции на основе Fc по настоящему изобретению. Неограничивающие примеры иммунорегуляторного эффектора включают IFN-α, IL-2, TNF-α и IFN-γ, а также антитело IgG, специфичное к PD-1, PD-L1, CTLA-4 и CD3.

[133] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия с поверхности злокачественной опухоли "слущиваются" один или более опухолеассоциированных антигенов в систему кровообращения субъекта, и способ дополнительно включает этап проведения субъекту процедуры диализа крови с применением фрагмента антитела, специфичного к одному или более опухолеассоциированным антигенам, для удаления опухолеассоциированных антигенов, "слущивающихся" с поверхности злокачественной опухоли, перед введением молекулярной конструкции на основе Fc.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[134] Настоящее описание будет более понятным из следующего подробного описания, читаемого с учетом сопровождающих графических материалов, коротко обсуждаемых ниже.

[135] Фигуры 1А-1K представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие линкерные звенья в соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия.

[136] Фигура 2 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее линкерное звено, имеющее сердцевину на основе химического соединения.

[137] Фигуры 3A-3D представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие молекулярные конструкции Т-Е в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия.

[138] Фигура 4 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее библиотеки для конструирования молекулярных конструкций в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия.

[139] Фигура 5А и фигура 5В представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие молекулярные конструкции в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия.

[140] Фигура 6 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее молекулярную конструкцию в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия.

[141] Фигура 7А и фигура 7В представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие молекулярные конструкции в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия.

[142] Фигуры 8A-8F представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие молекулярные конструкции на основе Fc в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия.

[143] Фигуры 9А и 9В представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие молекулярные конструкции на основе Fc в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия.

[144] Фигуры 10А-10С представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие молекулярные конструкции на основе Fc в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия.

[145] Фигура 11 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее молекулярные конструкции на основе Fc в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия.

[146] Фигуры 12А-12С представляют собой схематические изображения, иллюстрирующие молекулярные конструкции на основе Fc в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия.

[147] На фигуре 13 показан профиль элюирования в ходе обращенно-фазовой HPLC для очистки ТСО-функционализированного пептида 2. Пептид 2 представляет собой SEQ ID NO: 18.

[148] На фигуре 14 показан профиль обращенно-фазовой HPLC для очистки ТСО-функционализированного пептида 2, конъюгированного с PEG₁₂-малеимидом.

[149] На фигуре 15 показан результат масс-спектрометрии MALDI-TOF для ТСО-функционализированного пептида 2, конъюгированного с PEG₁₂-малеимидом.

[150] На фигурах 16А и 16В соответственно показан результат масс-спектрометрии MALDI-TOF для тетразин-функционализированного пептида 2 и DBCO-функционализированного пептида 2, конъюгированных с PEG₁₂-малеимидом.

[151] На фигуре 17 показан результат масс-спектрометрии ESI-TOF для тетразин-функционализированного пептида 8, конъюгированного с РЕG₁₂-малеимидом.

[152] На фигуре 18 показан результат масс-спектрометрии ESI-TOF для ТСО-функционализированного пептида 9, конъюгированного с PEG₆-малеимидом.

[153] На фигуре 19 показан результат масс-спектрометрии ESI-TOF для 1,3,5-триаминобензола, конъюгированного с одной NHS-PEG₁₂-алкиновой соединяющей ветвью и двумя NHS-PEG₁₂-малеимидными связывающими ветвями.

[154] На фигуре 20 показан профиль обращенно-фазовой HPLC для очистки ТСО-функционализированного пептида 9 с 5 молекулами DM1-SMCC.

[155] На фигуре 21 показан результат масс-спектрометрии для ТСО-функционализированного пептида 9 с 5 молекулами DM1-SMCC.

[156] На фигуре 22 показано, что LPS при реакции с дансилгидразином характеризовался максимумом испускания при 495 нм в анализе по методу флуоресцентной спектрофотометрии.

[157] На фигуре 23 показан анализ PEG₅-NHS, конъюгированного с имиквимодом, по методу масс-спектрометрии.

[158] На фигуре 24А показан результат масс-спектрометрии ESI-TOF для ТСО-функционализированного пептида 9, конъюгированного с DOTA. На фигуре 24В показан результат масс-спектрометрии для ТСО-функционализированного пептида 9, конъюгированного с DOTA, с хелатированным Y³⁺.

[159] На фигурах 25А и 25В соответственно показан анализ очищенных белков scFv антитела 1F10 к CD79b по методам SDS-PAGE и ELISA. На фигурах 25С и 25D соответственно показан анализ очищенных белков scFv антитела LH7.2 к коллагену VII типа по методам SDS-PAGE и ELISA.

[160] На фигуре 26А показан анализ очищенных scFv трастузумаба и адалимумаба по методу SDS-PAGE. На фигурах 26В и 26С соответственно показаны анализы очищенных scFv трастузумаба и адалимумаба по методу ELISA. На фигурах 26D и 26Е соответственно показаны анализы очищенного scFv цетуксимаба по методам SDS-PAGE и ELISA.

[161] На фигуре 27А показан анализ очищенного scFv адалимумаба по методу SDS-PAGE. На фигуре 27В показан анализ очищенных scFv адалимумаба по методу ELISA.

[162] На фигуре 28А и фигуре 28В соответственно показан анализ scFv, конъюгированного с ТСО, и scFv, конъюгированного с DBCO, специфичных к CD3, по методу ELISA.

[163] Фигура 29А представляет собой профиль элюирования синтезированного линкерного звена, состоящего из свободной тетразиновой функциональной группы и набора из трех scFv, специфичных к человеческому CD79b, в ходе FPLC. На фигуре 29В показан результат анализа по методу SDS-PAGE. На фигуре 29С показан результат масс-спектрометрии MALDI-TOF.

[164] На фигуре 30А и фигуре 30В соответственно показан результат анализа тетразин-функционализированного пептида 2, конъюгированного с тремя scFv, специфичными к HER2/neu, по методам SDS-PAGE и масс-спектрометрии. На фигуре 30С показан результат масс-спектрометрии для ТСО-функционализированного пептида 2, конъюгированного с тремя scFv, специфичными к TNF-α. На фигурах 30D и 30Е соответственно показан анализ ТСО-функционализированного пептида 2, конъюгированного с тремя scFv, специфичными к PD-1, по методам SDS-PAGE и масс-спектрометрии.

[165] На фигуре 31 показан результат анализа тетразин-функционализированного пептида 2, конъюгированного с 3 пептидами CCK, по методу масс-спектрометрии.

[166] На фигуре 32 показан результат анализа ТСО-функционализированного пептида 7, конъюгированного с двумя scFv, специфичными к CD20, по методу масс-спектрометрии.

[167] На фигуре 33 показан результат анализа ТСО-функционализированного пептида 1, конъюгированного с двумя scFv, специфичными к VEGF-A, по методу масс-спектрометрии.

[168] На фигуре 34А показан результат анализа молекулярной конструкции с тремя scFv, специфичными к CD79b, и одним scFv, специфичным к CD3, по методу масс-спектрометрии. На фигуре 34В показан результат анализа молекулярной конструкции с тремя scFv, специфичными к HER2/neu, и одним scFv, специфичным к CD3, по методу масс-спектрометрии.

[169] На фигуре 35 показан анализ реакционных смесей с ТСО-функционализированным пептидом 1 по методу SDS-PAGE после его конъюгирования с scFv антитела к VEGF-A и дополнительно с тетразин-функционализированным PEG весом 20 кДа.

[170] На фигурах 36А и 36В соответственно показаны анализы молекулярной конструкции с нацеливающим линкерным звеном с тремя scFv, специфичными к CD79b, и "связкой" лекарственных средств с пятью молекулами DM1 по методам SDS-PAGE и масс-спектрометрии.

[171] На фигуре 37 показаны анализы молекулярной конструкции с нацеливающим линкерным звеном с тремя scFv, специфичными к CD79b, и "связкой" лекарственных средств с пятью молекулами DM1 по методу ELISA.

[172] На фигуре 38 показаны анализы молекулярной конструкции с нацеливающим линкерным звеном с тремя scFv, специфичными к HER2/neu, и "связкой" лекарственных средств с пятью молекулами DM1 по методу SDS-PAGE.

[173] На фигуре 39 показан анализ молекулярной конструкции с нацеливающим линкерным звеном с тремя пептидами CCK8 и "связкой" лекарственных средств с пятью молекулами DM1 по методу масс-спектрометрии.

[174] На фигуре 40 показан анализ молекулярной конструкции с нацеливающим линкерным звеном с тремя пептидами CCK8 и "связкой" лекарственных средств с пятью DOTA-группами по методу масс-спектрометрии.

[175] На фигуре 41 показан анализ реакционных смесей, содержащих линкерное звено на основе тетразин-функционализированного пептида 2 с тремя scFv, специфичными к CD79b, ТСО-функционализированного пептида 7 с двумя scFv, специфичными к CD20, и "связку" лекарственных средств с пятью DM1, по методу SDS-PAGE.

[176] На фигуре 42 показаны результаты анализа биологической активности LPS до и после модификации дансилгидразином.

[177] На фигуре 43 показаны результаты анализа биологической активности имиквимода при конъюгировании со связывающей ветвью PEG.

[178] На фигуре 44 показан фармакокинетический профиль молекулярной конструкции с 3 scFv, специфичными к VEGF-A, и PEG весом 20 кДа у мышей.

[179] На фигуре 45 показаны результаты анализа цитотоксичности молекулярной конструкции с тремя scFv, специфичными к CD79b, и "связкой" лекарственных средств из пяти DM1.

[180] На фигуре 46 показан анализ (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 по методу SDS-PAGE.

[181] На фигурах 47А и 47В показаны результаты ELISA для анализа связывания (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 с коллагеном II типа и TNF-α.

[182] На фигурах 48А и 48В соответственно показан анализ 2-цепочечной конструкции (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4-(scFv α IL-17) по методам SDS-PAGE и ELISA.

[183] На фигурах 49А и 49В соответственно показан анализ 2-цепочечной конструкции (растворимый рецептор TNF-α)-CH2-CH3 IgG1-scFv α коллаген II типа по методам SDS-PAGE и ELISA.

[184] На фигуре 50 показан анализ 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому TNF-α и scFv, специфичный к коллагену II типа, по методу SDS-PAGE.

[185] На фигурах 51А и 51В соответственно показаны анализы 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому IL-17 и scFv, специфичный к коллагену VII типа, по методам SDS-PAGE и ELISA.

[186] На фигурах 52А и 52В соответственно показан анализ scFv α коллаген VII типа-СН2-СН3 IgG4-scFv α BAFF по методам SDS-PAGE и ELISA.

[187] На фигурах 53А и 53В соответственно показаны анализы 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому BAFF и scFv, специфичный к коллагену VII типа, по методам SDS-PAGE и ELISA.

[188] На фигурах 54А и 54В соответственно показаны анализы 2-цепочечной молекулярной конструкции (scFv α SPARC)-(scFv α RANKL)-Fc hIgG4 по методам SDS-PAGE и ELISA.

[189] На фигурах 55A и 55В соответственно показаны анализы 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому RANKL и scFv, специфичный к человеческому остеонектину, по методам SDS-PAGE и ELISA.

[190] На фигуре 56 показано иммуноокрашивание костного эпифиза мыши с помощью (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 и 2-цепочечной конструкции (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4-(scFv α IL-17).

[191] На фигуре 57 показано иммуноокрашивание костного эпифиза мыши с помощью 2-цепочечной конструкции (растворимый рецептор TNF-α)-CH2-CH3 IgG1-scFv α коллаген II типа.

[192] На фигуре 58 показано биораспределение флуоресцентно меченной конструкции (scFv α SPARC)-(scFv α RANKL)-Fc hIgG4 in vivo у мышей BALB/c.

[193] На фигуре 59A показан анализ 2-цепочечной конструкции EGF-CH2-CH3 с С-концевым удлинением и цистеиновым остатком и 2-цепочечной конструкции EGF-CH2-CH3-scFv антитела к PD1 по методу SDS-PAGE. На фигуре 59В показан анализ 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG1, конъюгированного с линкерным звеном с 2 молекулами LPS, по методу SDS-PAGE.

[194] На фигурах 60А и 60В показаны результаты ELISA для изучения связывания EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1) с различными PD-1 и ERBB1.

[195] На фигуре 61А показан анализ 2-цепочечной молекулярной конструкции EGF-Fc hIgG1-(scFv α CD3) по методу SDS-PAGE. На фигуре 61В показан анализ ELISA для изучения связывания 2-цепочечной конструкции EGF-Fc hIgG1-(scFv α CD3) с ERBB1, ERBB2 и ERBB3.

[196] На фигуре 62А показан анализ EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1 с С-концевым удлинением, EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) по методу SDS-PAGE. На фигурах 62B-62E показаны анализы связывания EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) с PD-1 или CD3, а также ERBB1, ERBB2 и ERBB3, по методу ELISA.

[197] На фигуре 63 показан анализ соматостатин-Fc hIgG1, соматостатин-Fc hIgG1-(scFv α CD3) и соматостатин-Fc hIgG1-(scFv α PD-1) по методу SDS-PAGE.

[198] На фигуре 64 показан анализ EGF-Fc IgG1, EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1), EGF-Fc IgG1-(scFv α CD3), EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1 и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) на клетках A431, экспрессирующих EGFR, путем окрашивания клеток.

[199] На фигуре 65 показан анализ EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) на Т-клетках в сравнении с mAb к PD-1 путем окрашивания (панели А-С), а также анализ EGF-Fc IgG1-(scFv α CD3) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) на Т-клетках в сравнении с mAb к CD3 путем окрашивания (панели D-F).

[200] На фигурах 66А и 66В показан опосредованный Т-клетками цитолиз клеток А431, экспрессирующих EGFR, при инкубировании с EGF-Fc hIgG-scFv α CD3 и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3). Ha фигурах 66С и 66D показана степень цитолиза клеток MDA-MB-231 при инкубировании с EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3).

[201] Ha фигурах 67А-67С показана динамика опосредованного Т-клетками цитолиза клеток А431 при инкубировании с EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3).

[202] Ha фигуре 68 показана степень цитолиза А431 под действием человеческих РВМС при инкубировании с 2-цепочечной конструкцией EGFw2v3-Fc IgG1-(scFv α PD-1).

[203] В соответствии с обычной практикой различные описанные признаки/элементы не вычерчены в масштабе, а вместо этого вычерчены для наилучшей иллюстрации конкретных признаков/элементов, относящихся к настоящему изобретению. Кроме того, одинаковые номера позиций и обозначения на различных графических материалах используются для указания одинаковых элементов/частей там, где это возможно.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[204] Подразумевается, что подробное описание, представленное ниже вместе с прилагаемыми графическими материалами, является описанием примеров настоящего изобретения, и не подразумевается, что оно представляет единственные формы, в которых пример настоящего изобретения может быть сконструирован или использован. В настоящем описании изложены функции примера и последовательность этапов конструирования и эксплуатации примера. Однако, одинаковые или эквивалентные функции и последовательности могут реализовываться в различных примерах.

[205] Для удобства здесь собраны некоторые термины, используемые в описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения. Если в данном документе не определено иное, научные и технические термины, используемые в настоящем раскрытии, будут иметь значения, обычно понимаемые и используемые средним специалистом в данной области.

[206] Если иное не требуется по контексту, будет понятно, что термины в единственном числе будут включать их формы множественного числа, а термины во множественном числе будут включать единственное число. В частности, используемые в данном документе и в формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если в контексте четко не указано иное. Кроме того, используемые в данном документе и в формуле изобретения термины "по меньшей мере один" и "один или более" имеют одинаковое значение и включают один, два, три или более. Более того, подразумевается, что фразы "по меньшей мере один из А, В и С", "по меньшей мере один из А, В или С" и "по меньшей мере один из А, В и/или С", используемые во всем настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения, охватывают А в отдельности, В в отдельности, С в отдельности, А и В вместе, В и С вместе, А и С вместе, а также А, В и С вместе.

[207] Несмотря на то, что числовые диапазоны и параметры, отражающие широкий объем настоящего изобретения, являются приблизительными величинами, числовые значения, изложенные в конкретных примерах, представлены как можно более точно. Любое числовое значение, однако, по своей сути заключает в себе определенные погрешности, неизбежно проистекающие из стандартного отклонения, обнаруживаемого в соответствующих тестовых измерениях. Кроме того, используемый в данном документе термин "приблизительно", как правило, означает в пределах 10%, 5%, 1% или 0,5% от указанного значения или диапазона. В качестве альтернативы, термин "приблизительно" означает в пределах допустимой стандартной ошибки среднего при рассмотрении средним специалистом в данной области. За исключением примеров эксплуатации/рабочих примеров или если в явной форме не указано иное, все числовые диапазоны, количества, значения и процентные доли, как, например, в отношении количества материалов, продолжительности периодов времени, температур, условий эксплуатации, соотношений количеств и т.п., раскрытых в данном документе, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином "приблизительно". Соответственно, если не указано противоположное, числовые параметры, изложенные в настоящем раскрытии и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными величинами, которые при желании можно изменять. По крайней мере, каждый числовой параметр следует интерпретировать по меньшей мере с учетом количества приводимых значащих цифр и путем применения стандартных методик округления. Диапазоны могут быть выражены в данном документе от одной конечной точки до другой конечной точки или между двумя конечными точками. Все диапазоны, раскрытые в данном документе, включают конечные точки, если не указано иное.

[208] Настоящее раскрытие в целом относится к молекулярным конструкциям, при этом каждая молекулярная конструкция содержит нацеливающий элемент (Т) и эффекторный элемент (Е), и эти молекулярные конструкции иногда в данном документе называют "молекулами Т-Е", "фармацевтическими средствами Т-Е" или "лекарственными средствами Т-Е".

[209] Используемый в данном документе термин "нацеливающий элемент" относится к части молекулярной конструкции, которая непосредственно или опосредованно связывается с мишенью, представляющей интерес (например, с рецептором на клеточной поверхности или белком в ткани), облегчая таким образом транспортировку молекулярной конструкции по настоящему изобретению к мишени, представляющей интерес. В некоторых примерах нацеливающий элемент может направлять молекулярную конструкцию в окрестность клетки-мишени. В других случаях нацеливающий элемент специфично связывается с молекулой, присутствующей на поверхности клеток-мишеней, или со второй молекулой, которая специфично связывается с молекулой, присутствующей на клеточной поверхности. В некоторых случаях нацеливающий элемент может интернализироваться вместе с молекулярной конструкцией по настоящему изобретению после его связывания с мишенью, представляющей интерес, а значит, перемещаться в цитозоль клетки-мишени. Нацеливающий элемент может представлять собой антитело или лиганд рецептора клеточной поверхности, или он может представлять собой молекулу, которая связывается с таким антителом или лигандом, опосредованно нацеливая таким образом молекулярную конструкцию по настоящему изобретению на участок-мишень (например, поверхность выбранной клетки). Молекулярная конструкция по настоящему изобретению будет повышать степень или содействовать локализации эффектора (терапевтического средства) в пораженном участке по сравнению с терапевтическим средством без нацеливающей функции. Локализация относится к степени или относительной доле; она не означает абсолютную или полную локализацию эффектора в пораженном участке.

[210] В соответствии с настоящим изобретением термин "эффекторный элемент" относится к части молекулярной конструкции, которая вызывает биологическую активность (например, индуцирует иммунные ответы, оказывает цитотоксические эффекты и т.п.) или другую функциональную активность (например, привлекает другие терапевтические молекулы, меченные гаптенами) после направления молекулярной конструкции к ее участку-мишени. "Эффект" может быть терапевтическим или диагностическим. Эффекторные элементы охватывают те, которые связываются с клетками и/или внеклеточными иммунорегуляторными факторами. Эффекторный элемент включает в себя такие средства, как белки, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы, гликопептиды, компоненты-лекарственные средства (как низкомолекулярные лекарственные средства, так и биологические лекарственные средства), химические соединения, элементы и изотопы, а также их фрагменты.

[211] Хотя термины первый, второй, третий и т.д. могут использоваться в данном документе для описания различных элементов, компонентов, областей и/или частей, эти элементы (а также компоненты, области и/или части) не должны ограничиваться данными терминами. Кроме того, использование таких порядковых числительных не предполагает наличие последовательности или порядка, если это четко не указано в контексте. Данные термины вместо этого используются лишь для проведения различия между одним и другим элементами. Таким образом, первый элемент, обсуждаемый ниже, можно называть вторым элементом без отступления от идей типичных вариантов осуществления.

[212] В данной работе термины "связывать", "соединять" и "конъюгировать" используются взаимозаменяемо для обозначения любого способа присоединения двух компонентов друг к другу с помощью непосредственной связи или с помощью опосредованной связи между двумя компонентами.

[213] Термин "полипептид", используемый в данном документе, относится к полимеру, имеющему по меньшей мере два аминокислотных остатка. Как правило, полипептид содержит аминокислотные остатки в диапазоне длины от 2 до приблизительно 200 остатков; предпочтительно от 2 до 50 остатков. Если в данном документе представлена аминокислотная последовательность, то также предусматриваются варианты данной последовательности, содержащие L-, D- или бета-аминокислоты. Полипептиды также включают полимеры аминокислот, в которых один или более аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический аналог соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также встречающиеся в природе полимеры аминокислот. В дополнение, данный термин применяется в отношении аминокислот, сочлененных друг с другом пептидной связью или другими "модифицированными связями", например в случаях, когда пептидная связь заменена α-сложноэфирной, β-сложноэфирной, тиоамидной, фосфорамидной, карбаматной, гидроксилатной и т.п.

[214] В определенных вариантах осуществления предусматриваются консервативные замещения аминокислот, образующих любую из последовательностей, описанных в данном документе. В различных вариантах осуществления замещены один, два, три, четыре или пять различных остатков. Термин "консервативное замещение" используется для отражения аминокислотных замещений, которые значительно не изменяют активность (например, биологическую или функциональную активность и/или специфичность) молекулы. Как правило, консервативные аминокислотные замещения включают замещение одной аминокислоты другой аминокислотой со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Некоторые консервативные замещения включают "замещения аналогом", при которых стандартная аминокислота заменяется нестандартной (например, редкой, синтетической и т.д.) аминокислотой, минимально отличающейся от исходного остатка. Аналоги аминокислот считаются получаемыми синтетическим методом из стандартных аминокислот без значительного изменения структуры исходной молекулы, являются изомерами или являются метаболитами-предшественниками.

[215] В определенных вариантах осуществления также предусматриваются полипептиды, характеризующиеся по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85% или 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95% или 98% идентичностью последовательности с любой из последовательностей, описанных в данном документе.

[216] "Процентная (%) идентичность аминокислотных последовательностей" по отношению к полипептидным последовательностям, идентифицированным в данном документе, определяется как процентная доля остатков полипептида в последовательности-кандидате, являющихся идентичными аминокислотным остаткам в конкретной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения гэпов для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей и без рассмотрения каких-либо консервативных замещений в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивания в целях определения процентной идентичности последовательностей можно достичь различными способами, которые находятся в пределах компетенции специалиста в данной области, например, с помощью общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.

Для целей, изложенных в данном документе, сравнение последовательностей между двумя полипептидными последовательностями проводили с помощью компьютерной программы Blastp (BLAST для сравнения последовательностей белков), предоставляемой в режиме онлайн Национальным центром биотехнологической информации (NCBI). Процентную идентичность аминокислотных последовательностей для указанной полипептидной последовательности А и указанной полипептидной последовательности В (что можно в качестве альтернативы сформулировать как определенный % идентичности аминокислотной последовательности с указанной полипептидной последовательностью В, которым характеризуется указанная полипептидная последовательность А) рассчитывают по следующей формуле:

где X представляет собой количество аминокислотных остатков, подсчитанных как идентичные совпадения в программе для выравнивания последовательностей BLAST при выравнивании А и В в данной программе, и где Y представляет собой общее количество аминокислотных остатков в А или В в зависимости от того, какая из них короче.

[217] Термин "пегилированная аминокислота", используемый в данном документе, относится к цепи полиэтиленгликоля (PEG) с одной аминогруппой и одной карбоксильной группой. Как правило, пегилированная аминокислота имеет формулу NH₂-(CH₂CH₂O)_n-COOH. В настоящем раскрытии значение n находится в диапазоне от 1 до 20; предпочтительно находится в диапазоне от 2 до 12.

[218] Используемый в данном документе термин "концевой" по отношению к полипептиду относится к аминокислотному остатку на N- или С-конце полипептида. Применительно к полимеру термин "концевой" относится к составному звену полимера (например, полиэтиленгликоля по настоящему раскрытию), расположенному на конце основной цепи полимера. В настоящем описании и формуле изобретения термин "свободный конец" используется для обозначения концевого аминокислотного остатка или составного звена, химически не связанного с какой-либо другой молекулой.

[219] Термин "антиген" или "Ag", используемый в данном документе, определяется как молекула, вызывающая иммунный ответ.Этот иммунный ответ может включать секреторный, гуморальный и/или клеточный антиген-специфический ответ. В настоящем раскрытии термин "антиген" может означать любое из белка, полипептида (включая его мутантные формы или биологически активные фрагменты), полисахарида, гликопротеина, гликолипида, нуклеиновой кислоты или их комбинации.

[220] В настоящем описании и формуле изобретения термин "антитело" используется в наиболее широком смысле и охватывает полностью собранные антитела, фрагменты антител, которые связываются с антигенами, такие как антигенсвязывающий фрагмент (Fab/Fab'), F(ab')₂-фрагмент (имеющий две антигенсвязывающие Fab-части, связанные друг с другом дисульфидными связями), вариабельный фрагмент (Fv), одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), биспецифический одноцепочечный вариабельный фрагмент (bi-scFv), нанотела, одновалентные антитела и диатела. "Фрагменты антител" включают в себя часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающую область или вариабельную область интактного антитела. Как правило, "антитело" относится к белку, состоящему из одного или более полипептидов, кодируемых главным образом генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов. Широко известные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей каппа-, лямбда-, альфа-, гамма-, дельта-, эпсилон- и мю-цепей, а также большое число генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи классифицируются как каппа либо лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, что, в свою очередь, соответственно определяет классы иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD, и IgE. Как известно, типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) образует тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну "легкую" цепь (приблизительно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область из приблизительно 100-110 или более аминокислот, преимущественно отвечающих за распознавание антигена. Термины "вариабельная область легкой цепи(V_L)" и "вариабельная область тяжелой цепи (V_H)" относятся соответственно к этим легким и тяжелым цепям. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия фрагмент антитела можно получить путем модификации природы антитела или путем синтеза de novo с применением методов рекомбинантных ДНК. В определенных вариантах осуществления настоящего раскрытия антитело и/или фрагмент антитела могут быть биспецифическими и могут находиться в различных конфигурациях. Например, биспецифические антитела могут содержать два различных антигенсвязывающих участка (вариабельные области). В различных вариантах осуществления биспецифические антитела можно получить с помощью гибридомной методики или методики рекомбинантных ДНК. В определенных вариантах осуществления биспецифические антитела обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя различными эпитопами.

[221] Термин "специфично связывается", используемый в данном документе, относится к способности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента к связыванию с антигеном с константой диссоциации (Kd), составляющей не более чем приблизительно 1×10^-6M, 1×10^-7М, 1×10^-8М, 1×10^-9М, 1×10^-10М, 1×10^-11M, 1×10^-12М, и/или к связыванию с антигеном с аффинностью, по меньшей мере в два раза превышающей его аффинность к неспецифическому антигену.

[222] Термин "иммунологическое нарушение", используемое в данном документе, относится к нарушению, включающему дефицит гуморального иммунитета, дефицит клеточно-опосредованного иммунитета, комбинированный иммунодефицит, неуточненный иммунодефицит и аутоиммунное заболевание.

[223] Термин "опухоль", используемый в данном документе, относится ко всем типам роста и пролиферации неопластических клеток, как злокачественным, так и доброкачественным, и ко всем предраковым и раковым клеткам и тканям. В настоящем описании и формуле изобретения термин "опухоль" включает солидные опухоли и диффузные опухоли.

[224] Термин "солидная опухоль", используемый в данном документе, означает аномальную массу ткани, которая обычно не содержит кист или жидких областей. Различные типы солидных опухолей называют по типу клеток, которые их образуют. Примеры солидных опухолей включают без ограничения саркомы и карциномы. Как правило, "саркомы" представляют собой формы рака, происходящие из соединительных или опорных тканей, таких как костная или мышечная. "Карциномы" представляют собой формы рака, происходящие из железистых клеток и эпителиальных клеток, которые выстилают ткани организма.

[225] Термин "диффузная опухоль", используемый в данном документе, относится к лейкозной и/или гематологической злокачественной опухоли, образующейся из гемопоэтических (кроветворных) клеток и поражающей кровь, костный мозг или лимфатические узлы. Пример диффузной опухоли включает без ограничения острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому и миелому.

[226] Термин "опухолеассоциированный антиген" (ТАА), используемый в данном документе, относится к любому раковому антигену, известному из уровня техники, и включает антигены, находящиеся на поверхности раковых клеток, а также антигены, которые "слущиваются" с поверхности раковых клеток и становятся растворимыми (т.е. растворимые раковые антигены). Некоторые антигены клеточной поверхности, расположенные на опухолях или нормальных клетках, имеют растворимые эквиваленты. Такие антигены включают без ограничения антигены, находящиеся на фибробластах, ассоциированных с раком (CAF), опухолевых эндотелиальных клетках (ТЕС) и опухолеассоциированных макрофагах (ТАМ).

[227] Термин "лечение", используемый в данном документе, включает предупреждающее (например, профилактическое), радикальное или паллиативное лечение; и "осуществление лечения", как используется в данном документе, также включает предупреждающее (например, профилактическое), радикальное или паллиативное лечение. В частности, термин "осуществление лечения", используемый в данном документе, относится к применению молекулярной конструкции или фармацевтической композиции, содержащей ее, по отношению к субъекту, имеющему медицинское состояние или симптом, ассоциированный с медицинским состоянием, заболевание или нарушение вследствие медицинского состояния или предрасположенность к медицинскому состоянию, или ее введению ему с целью частичного или полного уменьшения интенсивности, ослабления, облегчения, задерживания начала проявления, ингибирования прогрессирования, уменьшения тяжести и/или снижения частоты возникновения одного или более симптомов или характерных особенностей указанного конкретного заболевания, нарушения и/или состояния. Лечение можно проводить субъекту, у которого не проявляются признаки заболевания, нарушения и/или состояния, и/или субъекту, у которого проявляются только ранние признаки заболевания, нарушения и/или состояния, в целях снижения риска развития патологии, ассоциированной с заболеванием, нарушением и/или состоянием.

[228] Термин "эффективное количество", используемый в данном документе, относится к количеству молекулярной конструкции по настоящему изобретению, достаточному для достижения желаемого терапевтического ответа. Эффективное количество средства не требуется для излечения заболевания или состояния, но будет обеспечивать такое лечение заболевания или состояния, при котором начало проявления заболевания или состояния задерживается, приостанавливается или предупреждается, или симптомы заболевания или состояния ослабляются. Эффективное количество можно разделить на одну, две или более доз в форме, подходящей для введения один, два или более раз в течение всего указанного периода времени. Конкретное эффективное или достаточное количество будет изменяться в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, подвергаемое лечению, физическое состояние пациента (например, масса тела, возраст или пол пациента), тип субъекта, подвергаемого лечению, продолжительность лечения, характер сопутствующей терапии (если таковая имеется), а также конкретные используемые составы и структура химических соединений или их производных. Эффективное количество может быть выражено, например, в виде общей массы активного компонента (например, в граммах, миллиграммах или микрограммах) или в виде соотношения массы активного компонента и массы тела, например, в виде миллиграммов на килограмм (мг/кг).

[229] Термины "применение" и "введение" используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения применения молекулярной конструкции или фармацевтической композиции по настоящему изобретению по отношению к субъекту, нуждающемуся в лечении.

[230] Термины "субъект" и "пациент" используются в данном документе взаимозаменяемо, и подразумевается, что они означают животное, в том числе человека, которое поддается лечению с помощью молекулярной конструкции, фармацевтической композиции и/или способа по настоящему изобретению. Подразумевается, что термин "субъект" или "пациент" относится как к мужскому, так и к женскому полу, если конкретно не указан один пол. Соответственно, термин "субъект" или "пациент" включает любое млекопитающее, для которого способ лечения по настоящему раскрытию может иметь благоприятный эффект. Примеры "субъекта" или "пациента" включают без ограничения человека, крысу, мышь, морскую свинку, обезьяну, свинью, козу, корову, лошадь, собаку, кошку, птицу и домашнюю птицу. В типичном варианте осуществления пациентом является человек. Термин "млекопитающее" относится ко всем представителям класса млекопитающих, в том числе к людям, приматам, домашним и сельскохозяйственным животным, таким как кролик, свинья, овца и крупный рогатый скот; а также к зоопарковым животным, животным, используемым в спорте, или животным-компаньонам; и грызунам, таким как мышь и крыса. Термин "млекопитающее, отличное от человека" относится ко всем представителям класса млекопитающих, за исключением человека.

[231] Настоящее раскрытие основано по меньшей мере на конструировании фармацевтических средств Т-Е, которые можно доставлять в клетки-мишени, ткани- или органы-мишени в увеличенных долях по сравнению с кровотоком, лимфоидной системой и другими клетками, тканями или органами. При достижении этого терапевтический эффект фармацевтических средств увеличивается, а масштаб и тяжесть побочных эффектов и токсичности уменьшаются. Также возможно вводить терапевтический эффектор в форме молекулы Т-Е в более низкой дозе, чем в форме без нацеливающего компонента. Таким образом, терапевтический эффектор можно вводить в более низких дозах без утраты действенности, при этом побочные эффекты и токсичность уменьшаются.

[232] Заболевания, в отношении которых лучшее нацеливание лекарственных средств может иметь благоприятный эффект

[233] Лекарственные средства, применяемые против многих заболеваний, можно улучшить для достижения лучшей эффективности и безопасности, если их можно нацелить на пораженные участки, т.е. если их можно локализовать в пораженных участках или разделить между ними более благоприятным образом, чем в нормальных тканях или органах. Далее приведены основные примеры заболеваний, лекарственные средства против которых можно улучшить, если они могут преимущественно распределяться в пораженные участки или клетки.

[234] I. Иммунологическое нарушение

[235] В соответствии с архитектурой молекулярных конструкций по настоящему раскрытию заболевания, состояния и/или нарушения, поддающиеся лечению с помощью способа по настоящему изобретению, представляют собой иммунологическое нарушение; например, аутоиммунное нарушение, которое включает без ограничения псориаз, системную красную волчанку (SLE), кожную волчанку, синдром Шегрена, ревматоидный артрит, псориатический артрит, анкилозирующий спондилоартрит и воспалительное заболевание кишечника.

[236] Большинство аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, синдром Шегрена, псориаз, болезнь Крона, воспалительные заболевания кишечника и другие, поражают соединительные ткани. Независимо от этиологической природы, будь то определяемая окружающей средой, генетическая, эпигенетическая или их комбинации, пораженные ткани повреждаются в ходе длительных воспалительных процессов. В настоящем изобретении логически обосновано, что при внесении противовоспалительных терапевтических средств, таких как антитела к TNF-α, антитела к IL-17, антитела к BAFF, антитела к IL-6, антитела к IL-12/IL-23, в пораженные соединительные ткани компоненты внеклеточного матрикса можно использовать в качестве антигенов-мишеней. Антигены-мишени, которые можно рассматривать, включают различные типы коллагенов, ламининов, эластинов, фибриллинов, фибронектинов и тенасцинов. Соединительные ткани заполняют практически все части тела человека. Однако, в связи со структурными и функциональными требованиями к соединительным тканям в различных местах локализации типы этих компонентов внеклеточного матрикса являются разными, что обеспечивает превосходные возможности выбора специфичности к ткани-мишени.

[237] Преимущества выбора внеклеточных компонентов по сравнению с антигенами клеточной поверхности для нацеливания противовоспалительных терапевтических средств заключаются в возможностях выбора селективности среди различных типов белков матрикса и обильного количества белков внеклеточного матрикса. Более того, поскольку клетки не применяются в качестве антигенных мишеней, потенциальных пагубных эффектов непосредственного связывания противовоспалительных средств с клетками можно избежать.

[238] I-(i). Ревматоидный артрит, псориатический артрит или анкилозирующий спондилоартрит

[239] Некоторые антитела к TNF-α например, инфликсимаб и адалимумаб, и белки слияния на основе рецептора TNF-α и Fc IgG (например, этанерцепт) одобрены для применения или находятся на стадии клинических испытаний с участием людей по оценке применения в лечении ревматоидного артрита, анкилозирующего спондилоартрита и других аутоиммунных заболеваний. Внеклеточная часть рецептора интерлейкина-1 (IL-1) анакинра одобрена для лечения ревматоидного артрита. Антитела к общему для IL-12 и IL-23 белку р40, например, устекинумаб и бриакинумаб, одобрены для применения против псориатического артрита или находятся на стадии клинических испытаний по оценке применения против ревматоидного артрита. Антитело к рецептору IL-6 (тоцилизумаб) одобрено для применения против ревматоидного артрита и системного ювенильного идиопатического артрита, и некоторые антитела к IL-6, например, сарилумаб и олокизумаб, находятся на стадии клинических испытаний по оценке лечения ревматоидного артрита. Антитело, специфичное к IL-17 (секукинумаб), одобрено для применения против псориаза и находится на стадии клинических испытаний по оценке применения против ревматоидного артрита и анкилозирующего спондилоартрита.

[240] Хотя эти терапевтические средства могут уменьшать интенсивность тяжелых симптомов лучше, чем ранее доступные лекарственные препараты, они вызывают ряд серьезных побочных эффектов у некоторых пациентов, подвергаемых лечению. Например, инфликсимаб может вызывать серьезные нарушения со стороны крови, такие как лейкопения и тромбоцитопения, серьезные инфекции, лимфому и другие солидные опухоли, реактивацию вируса гепатита В и туберкулез, а также другие серьезные проблемы. Анакинра вызывает частые инфекции и тяжелые побочные эффекты в отношении желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, а также кроветворных органов. Важно сводить к минимуму серьезные побочные эффекты этих широко применяемых терапевтических средств, при этом сохраняя или даже усиливая их терапевтические эффекты.

[241] Ревматоидный артрит поражает суставы коленей, пальцев рук, пальцев ног и другие суставы, а анкилозирующий спондилоартрит поражает суставы позвоночника и крестцово-подвздошный сустав таза. В пораженных суставах поверхность костей и суставной хрящ, выстилающий поверхности костей, подвергаются атаке воспалительных компонентов иммунной системы в суставах. Суставной хрящ в суставах представляет собой гладкий хрящ, который содержит внеклеточный матрикс. Хрящ является бессосудистым, и примерно 60% от его веса составляет вода, а остальное содержимое состоит из коллагенов и α-аггрекана, протеогликана и других молекул матрикса. Коллаген II типа образует основную часть фибрилл в хряще. Аггрекан является вторым наиболее обильно представленным компонентом хряща. Коллаген XI типа связан с поверхностью фибрилл коллагена II типа, способствуя образованию сетей фибрилл, а коллаген IX типа ассоциирован с коллагеном II типа и коллагеном XI типа. Хрящ имеет большую поверхность, а α-аггрекан имеет перовидную структуру и форму. В дополнение к образующему хрящу, суставы также имеют связки, соединяющие соседние кости, такие как крестообразные связки, и сухожилия, соединяющие мышцы с костями. Связки и сухожилия образованы сетью волокон коллагена I, II и III типов, а также эластина и фибриллинов 1 и 2.

[242] В настоящем изобретении логически обосновано, что антагониста TNF-α, IL-1 и IL-12/IL-23 можно переносить в пораженные суставы путем применения фрагментов антител, таких как scFv, специфичный к коллагену II типа, α-аггрекану, коллагену XI типа или коллагену IX типа, или, в качестве альтернативы, к коллагену I типа, эластину или фибриллину 1, в качестве нацеливающего средства. Предпочтительное антитело к коллагену II типа связывается с нативным коллагеном II типа в суставах и не связывается с N-концевыми и С-концевыми пропептидами, которые отщепляются в ходе сборки фибрилл. Предпочтительное антитело к аггрекану связывается с целыми нативными молекулами α-аггрекана и не связывается с фрагментами, которые отщепляются и высвобождаются в кровоток. Благодаря использованию молекулярной конструкции по настоящему изобретению с scFv антитела к коллагену II типа в качестве нацеливающего средства по сравнению с обычным IgG к TNF-α, IL-1 и IL-12/IL-23 в пораженные участки можно переносить большие доли терапевтических средств по настоящему изобретению и меньшие количества терапевтических средств будут присутствовать в других нецелевых, нормальных тканях, в частности, в лимфоидных органах, и, следовательно, будет наблюдаться меньше побочных эффектов.

[243] I-(ii). Псориаз

[244] У большинства пациентов с псориазом или бляшечным псориазом симптомы воспаления проявляются преимущественно на коже, а не в других тканях и органах. Псориаз вовлекает главным образом кератиноциты в части кожи пораженных им пациентов. Системное введение моноклональных антител к TNF-α, к IL-12/IL-23 и к IL-17 или к рецептору IL-17 (антител к IL-17R) или других противовоспалительных средств, таких как антитело к IL-6, вызывает нежелательные побочные эффекты, обсуждаемые в предыдущем разделе. Серьезные неблагоприятные побочные эффекты всех этих иммуномодулирующих антител были подтверждены документально.

[245] Ряд мембранных или внеклеточных белков, таких как филаггрин, коллаген I типа, которые экспрессируются в тканях кожи на намного более высоких уровнях, чем в большинстве других тканей, вероятно, можно рассматривать в качестве белков-мишеней для перемещаемых в кожу терапевтических средств. Филаггрин присутствует в плотных контактах между клетками и, вероятно, доступен для антител в пораженных участках тканей. Хотя коллаген I типа также присутствует в костном матриксе и многих частях тела, он присутствует в дермальном слое кожи при высоких значениях относительного содержания.

[246] Для подавления воспалительной активности, вызываемой пораженными кератиноцитами, которая приводит к проявлению симптомов псориаза, не является необходимой такая доставка противовоспалительных лекарственных средств на основе антител, чтобы они находились в контакте с кератиноцитами. Кератиноциты находятся в наружном, эпидермальном слое кожи; кровеносные сосуды, потовые железы и коллагеновые волокна находятся в среднем, дермальном слое кожи. Внутренний слой представляет собой гиподерму, где находятся жировые ткани. Три слоя кожи человека имеют совокупную толщину 2-3 мм. Если противовоспалительные антитела доставляют в дермальный слой с помощью scFv, специфичного к коллагену I типа, они могут диффундировать в другие слои. Или же антитела могут захватывать воспалительные цитокины в трех слоях кожи.

[247] Некоторые белки, присутствующие в дермо-эпидермальном соединении, также можно использовать в качестве мишеней для переносимых в кожу терапевтических средств. Они включают коллаген VII типа, коллаген XVII типа и ламинины 5, 6 или 10 типа. Дермо-эпидермальное соединение представляет собой область ткани, которая соединяет эпидермальный и дермальный слои кожи. Базальные клетки в базальном слое эпидермиса соединены с базальной мембраной с помощью якорных филаментов полудесмосом. Клетки сосочкового слоя дермы прикреплены к базальной мембране с помощью якорных фибрилл, которые состоят из коллагена VII типа. Коллаген XVII типа, трансмембранный белок (также называемый ВР180), экспрессируемый на кератиноцитах, является структурным компонентом полудесмосом, многобелковых комплексов в дермо-эпидермальной зоне базальной мембраны, которые опосредуют прикрепление кератиноцитов к подлежащей мембране. Ламинины представляют собой структурные неколлагеновые гликопротеины, присутствующие в базальных мембранах. Среди многих типов ламининов типы 5, 6 и 10 являются специфичными для базальной пластинки, находящейся под многослойным эпителием.

[248] I-(iii). Системная красная волчанка (SLE), кожная волчанка или синдром Шегрена

[249] Системная красная волчанка (SLE) представляет собой аутоиммунное заболевание, вовлекающее несколько аутоантигенов, таких как нуклеиновые кислоты, гистоны и другие ядерные белки. Синдром Шегрена представляет собой аутоиммунное заболевание, при котором иммунная система атакует экзокринные железы, в частности, слюнные и слезные железы, в которых вырабатываются соответственно слюна и слезная жидкость, в результате чего появляются симптомы сухости глаз и сухости во рту, что приводит к инфекциям и различным другим проблемам. Оба этих заболевания встречаются в 9 раз чаще у женщин, чем у мужчин, в особенности у женщин детородного возраста от 15 до 35 лет. SLE представляет собой системное аутоиммунное заболевание соединительной ткани и поражает многие органы и ткани. Как правило, эти ткани и органы, такие как сердце, легкие, мочевой пузырь и почки, которые проявляют эластичность и могут расширяться и сжиматься, содержат сеть коллагеновых волокон. При некоторых типах SLE ярко выражено кожное проявление симптомов воспаления.

[250] За более чем 50 лет было разработано не одно новое терапевтическое средство против SLE, прежде чем был разработан и одобрен белимумаб, человеческое моноклональное антитело, специфичное к BAFF. Однако, терапевтический эффект белимумаба против SLE считается незначительным. Белимумаб вызывает множество побочных эффектов, в том числе увеличение частоты встречаемости серьезных инфекций и смертей в группе лечения по сравнению с группой плацебо. Интересно, что в клиническом испытании в фазе II белимумаб продемонстрировал более успешные результаты в отношении синдрома Шегрена, чем в отношении SLE.

[251] В дополнение к BAFF, исследователи проводят поиск других терапевтических мишеней при SLE. Хотя не один воспалительный цитокин был идентифицирован как несущий главную ответственность за патологический процесс при SLE, во многих исследованиях была задокументирована экспрессия группы генов, называемой "сигнатурой генов, стимулируемых интерферонами 1 типа", известная как последующие события при стимуляции интерферонами 1 типа. Было обнаружено, что патогенез SLE ассоциирован с активацией Toll-подобных рецепторов 7 и 9 (TLR 7 и TLR9), которая индуцирует экспрессию группы генов аналогично происходящему в результате активации с помощью IFN-α.

[252] Некоторые моноклональные антитела, специфичные к IFN-α, в том числе ронтализумаб, сифалимумаб и анифролумаб, изучали в клинических испытаниях по оценке лечения SLE. Поскольку IFN-α вовлечен во многие функции, системное введение антитела к IFN-α без обеспечения локализации в пораженных участках путем нацеливания может приводить к серьезным побочным эффектам.

[253] I-(iv). Воспалительное заболевание кишечника

[254] Антитело к TNF-α (такое как адалимумаб) также было одобрено для лечения болезни Крона и неспецифического язвенного колита (формы воспалительного заболевания кишечника). Однако, как описано в более раннем разделе, введение антитела к TNF-α ассоциировано с рядом серьезных побочных эффектов, включающих тяжелые инфекционные заболевания и В-клеточную лимфому. Таким образом, при лечении пациентов с болезнью Крона или неспецифическим язвенным колитом с помощью антитела к TNF-α будет желательным распределение вводимого антитела к TNF-α в пользу кишечника и толстой кишки. Было обнаружено, что коллаген III типа и V типа довольно обильно представлен в соединительных тканях кишечника и пищеварительного тракта.

[255] II. Опухоль

[256] Большое количество терапевтических средств из нескольких классов было разработано и подвергнуто экспериментам на животных моделях и в клинических испытаниях с участием людей для оценки лечения злокачественных опухолей, в том числе диффузных и солидных опухолей, а также первичных и метастатических опухолей, на различных клинических стадиях. Эти терапевтические средства, некоторые из которых были одобрены государственными регуляторными органами для применения у пациентов, включают (1) большое количество химических соединений, нацеленных на ключевые регуляторные пути или структурные компоненты клеток или повреждающие ДНК или важные аппараты клеток, (2) антитела, специфичные к поверхностным антигенам определенных типов клеток или специфичные к определенным опухолеассоциированным антигенам и способные опосредовать апоптоз, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или комплемент-опосредованный цитолиз (CMC) клеток-мишеней, (3) антитела, специфичные к определенным опухолеассоциированным антигенам, конъюгированные с сильнодействующими цитотоксическими лекарственными средствами, (4) иммунорегуляторные цитокины, такие как интерферон-α (IFN-α), интерлейкин-2 (IL-2) или интерферон-γ (IFN-γ), которые могут активировать борьбу иммунной системы против озлокачествленных клеток, (5) антитела, нацеливающиеся на определенные маркеры клеточной поверхности В- и Т-лимфоцитов, например, антитело к CD20 ритуксимаб, (6) антитела, нацеливающиеся на рецепторы факторов роста, например, антитело к HER2/neu трастузумаб и антитело к EGFR цетуксимаб, (7) антитела, нацеливающиеся на фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), для ингибирования ангиогенеза, например, бевацизумаб, и (8) антитела, связывающиеся с иммунными контрольными точками, такими как PD1 (белок 1 запрограммированной гибели клеток, CD279), например, ниволумаб, PD-L1 (лиганд 1 белка запрограммированной гибели клеток, CD274), например, MPDL3280A, CTLA-4 (белок 4 цитотоксических Т-лимфоцитов, CD152), например, ипилимумаб, которые ингибируют иммунные реакции, осуществляемые по принципу отрицательной обратной связи, и обеспечивают непрерывную активацию текущих иммунных ответов.

[257] Применимость терапевтических средств для лечения рака, а также против многих других заболеваний ограничена или ослаблена ввиду их токсичности, поскольку данные средства также в некоторой степени воздействуют на некоторые нормальные клетки. Таким образом, многие терапевтические средства имеют узкие терапевтические окна, и поэтому в целях контроля их токсических эффектов их вводят многим из пациентов, подвергаемых лечению, в субоптимальных дозах, которые в том, что касается терапевтической эффективности, являются недостаточными для достижения удовлетворительных терапевтических эффектов.

[258] Подход с использованием конъюгатов антитело-лекарственное средство, к которому проявляют активный интерес, требует, чтобы антитела, нацеливающиеся на опухоль, вместе с переносимыми цитотоксическими лекарственными средствами интернализировались клетками-мишенями, экспрессирующими опухолеассоциированные антигены, которые распознаются нацеливающимися антителами. Это требование может потенциально ограничивать действенность существующего подхода с использованием конъюгатов антитело-лекарственное средство, поскольку клетки в опухоли экспрессируют опухолеассоциированный антиген при различных плотностях. Те клетки, которые экспрессируют на относительно низких уровнях, могут не уничтожаться существующими конъюгатами антитело-лекарственное средство в ходе лечения и будут расти при прекращении приема терапевтических средств.

[259] II-(i). Диффузная опухоль

[260] II-(i)-A. Нацеливание на раковые клетки, происходящие из лейкоцитов

[261] Рак, происходящий из подвергнутых злокачественной трансформации клеток лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки, составляет значительную долю среди всех случаев рака. Эти опухоли, как правило, являются диффузными, а не солидными. Таким образом, нацеливание на опухоли, происходящие из лейкоцитов, будет включать нацеливание на отдельные опухолевые клетки. Таким образом, идентификация экспрессии антигенов клеточной поверхности опухолевых клеток является ключевым фактором нацеливания на опухоли, происходящие из лейкоцитов.

[262] Опухоли, происходящие из белых кровяных телец (лейкоцитов), как правило, подразделяются на три категории: (1) лейкоз, обнаруживаемый в крови и костном мозге, (2) лимфома, обнаруживаемая в лимфатической системе, и (3) миелома во многих частях костного мозга, а также в крови.

[263] Лейкоз подразделяется на четыре широкие категории: (1) острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), (2) хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), (3) острый миелогенный лейкоз (AML) и (4) хронический миелогенный лейкоз (CML). Однако, по мере разработки усовершенствованных способов диагностики и анализа описываются новые типы лейкоза, такие как В-клеточный CLL, Т-клеточный CLL, В-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз и другие.

[264] Лимфомы подразделяются на две категории: (1) лимфомы Ходжкина и (2) неходжкинские лимфомы. Среди пациентов, имеющих лимфомы, приблизительно 12% имеют лимфомы Ходжкина, а остальные имеют неходжкинские лимфомы. Среди неходжкинских лимфом большинство происходит из В-клеток, и существует много подтипов В-клеточных неходжкинских лимфом. Остальные неходжкинские лимфомы представляют собой Т-клеточные лимфомы.

[265] Миелома происходит из антителообразующих плазмоцитов и также называется плазмоцитомой. Миеломные клетки обнаруживаются в костном мозге и могут переходить в кровоток и демонстрировать устойчивый рост во многих частях кости, и, следовательно, миелому также называют множественной миеломой.

[266] Хотя лейкоз, лимфомы и миелома происходят из миелоидных, лимфоидных клеток и плазмоцитов, диагностика типов опухолей часто является очень сложной и включает исследования тканей и клеток с анализами гистологических, иммуногистологических, морфологических и клеточных маркеров в биопсийных образцах опухолей. Поскольку плюрипотентные стволовые клетки, клетки миелоидной линии дифференцировки, дифференцирующиеся в гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы и базофилы), моноциты и макрофаги, а также тромбоциты, и клетки лимфоидной линии дифференцировки, дифференцирующиеся в В-клетки и Т-клетки, проходят много этапов дифференцировки и созревания, злокачественная трансформация может происходить на любой из стадий дифференцировки. Более того, при раковой трансформации могут усиливаться и приобретаться определенные признаки и ослабляться или утрачиваться определенные признаки.

[267] Поверхностные маркеры или дифференцировочные антигены, в особенности те, которым был присвоен номер CD (кластера дифференцировки), стали весьма применимыми и часто необходимыми для идентификации различных лейкоцитов и иммуноцитов в исследованиях врожденного и приобретенного иммунитета. Часто для идентификации типа клетки требуется набор маркеров.

[268] Для основанных на применении антител терапевтических подходов к нацеливанию на раковую опухоль, происходящую из лейкоцитов, идентификация поверхностных маркеров опухоли-мишени является весьма применимой и действенной. Однако, среди пациентов, у которых было диагностировано наличие одного и того же типа опухоли, поверхностные маркеры могут варьироваться по плотности в большом диапазоне.

[269] II-(i)-B. Поверхностные маркеры лимфоцитарных лейкоза и лимфомы, происходящих из В-клеток

[270] Как ALL, так и CLL не являются солидными опухолями. ALL происходит из лимфобластов, предшественников В-клеток, предшественников Т-клеток или В-клеток. ALL состоит из следующих иммунофенотипических подтипов: (1) острого лимфобластного лейкоза из предшественников В-клеток, характеризующегося экспрессией маркеров клеточной поверхности, ассоциированных с предшественниками В-клеток, и острого лимфобластного лейкоза из предшественников Т-клеток, характеризующегося экспрессией маркеров предшественников Т-клеток, (2) лимфомы Беркитта, происходящей из В-клеток зародышевого центра и характеризующейся экспрессией маркеров клеточной поверхности, ассоциированных с В-клетками, и (3) острого бифенотипического лейкоза, характеризующегося экспрессией маркеров как лимфоидных, так и миелоидных клеток.

[271] CLL также называют В-клеточным CLL (B-CLL), поскольку CLL происходит чаще всего из В-клеток. Таким образом, основным различием в клеточном происхождении между ALL и CLL является то, что ALL происходит из лимфобластов, которые являются общими предшественниками В-клеток и Т-клеток, a CLL происходит из В-клеток. Все клетки CLL пациента происходят из одной исходной моноклональной В-клетки с конкретным набором V_H и V_L. Клетки CLL экспрессируют CD19 и CD20, а также характерные для них CD5 и CD23.

[272] Лимфомы Ходжкина характеризуются наличием клеток Рид-Штернберга, которые представляют собой гигантские многоядерные клетки, происходящие из В-клеток. Существует по меньшей мере четыре подтипа лимфом Ходжкина, выделяемых на основе морфологических характеристик клеток Рид-Штернберга и состава реактивного клеточного инфильтрата в биопсийном образце лимфатического узла: (1) узловая склерозирующая лимфома Ходжкина, (2) смешанноклеточная, (3) богатая лимфоцитами или с лимфоидным преобладанием и (4) с лимфоидным истощением. Надежно установлено, что лимфома Ходжкина происходит из зрелых В-клеток. Клетки лимфомы Ходжкина в зависимости от их иммунофенотипа экспрессируют подмножества CD15, CD20, CD30, CD79a и CD138. Неходжкинские лимфомы в большинстве случаев происходят из В-клеток. Существует по меньшей мере 14 подтипов В-клеточных неходжкинских лимфом.

[273] В-лимфоциты являются источником антиген-специфичных антител и являются критически важным компонентом системы приобретенного иммунитета для защиты от инфекционных патогенов. Однако, В-клетки также могут быть патогенными и вызывать некоторые типы заболеваний. В-клеточные нарушения подразделяют на нежелательную выработку иммуноглобулинов (аутоиммунные и аллергические заболевания) и неконтролируемую пролиферацию (лимфомы, лейкоз). Было подтверждено, что В-клетки являются эффективными мишенями для лечения многочисленных аутоиммунных нарушений и рака из клеток В-клеточной линии дифференцировки. Было разработано много подходов, касающихся истощения популяции В-клеток для лечения В-клеточных злокачественных опухолей и опосредованных антителами заболеваний, которые имеют частичный успех или находятся на стадиях активных экспериментов. Они включают применение терапевтических антител, нацеливающихся на поверхностные антигены человеческих В-клеток, такие как CD19, CD20, CD22, CD37, CD79a/CD79b и изотип-специфичный рецептор Ig. Некоторые из таких антител могут вызывать лизис В-клеток. Некоторые другие антитела будут вызывать лизис В-клеток в случаях, когда антитела конъюгированы с цитотоксическими лекарственными средствами.

[274] Множественная миелома, также называемая плазмоклеточной миеломой, является второй наиболее распространенной гематологической злокачественной опухолью (после неходжкинской лимфомы), составляющей 1% от всех случаев рака и 2% от всех смертей от рака. Множественная миелома вырабатывает большие количества миеломных белков, захватывает костный мозг и проявляется в виде ряда симптомов, включающих боль в костях, анемию, почечную недостаточность, инфекцию и неврологические проблемы. Множественная миелома образуется в результате злокачественной трансформации плазмоцитов, дифференцирующихся из В-лимфоцитов. Клетки множественной миеломы, однако, не экспрессируют наиболее распространенные маркеры В-клеток, такие как CD19, CD20 и CD22.

[275] Ряд терапевтически средств и лекарственных средств был подвергнут экспериментам, и несколько из них были одобрены для лечения множественной миеломы. Они включают кортикостероиды, химиотерапевтические средства, ингибиторы протеасом и иммунорегуляторные химические соединения.

[276] II-(i)-C. Уникальные антигены В-клеток Igα, Igβ и migis-δ в качестве мишеней для антител

[277] Igα (CD79a)/Igβ (CD79b) представляет собой набор антигенов, экспрессируемых совместно с В-клеточным рецепторным (BCR) комплексом на поверхности клеток В-клеточной линии дифференцировки. Igα/Igβ представляет собой гетеродимерный трансмембранный белок, состоящий из двух различных цепей Igα и Igβ, стабилизированных путем образования дисульфидных связей. Igα/Igβ образует комплекс с BCR и генерирует сигнал после распознавания антигена BCR-комплексом. В ходе развития и созревания В-клеток Igα/Igβ экспрессируется на стадии пре-В-клеток и является более ранним, чем CD20, в профиле экспрессии в В-клеточной линии дифференцировки. Igα/Igβ считается привлекательной мишенью для терапии путем истощения популяции В-клеток при лечении неходжкинских лимфом, поскольку Igα/Igβ экспрессируется на В-клетках и в большинстве неходжкинских лимфом.

[278] mIgD и mIgM коэкспрессируются на поверхности зрелых В-клеток и функционируют в качестве части BCR. mIgD содержит уникальный пептидный сегмент migis-δ размером 27 аминокислот, который представляет собой внеклеточные части заякоренного в мембране сегмента mIgD и расположен между доменом СН3 и трансмембранным сегментом. Было предположено, что пептид migis-δ представляет собой антигенный участок для нацеливания на В-клетки, экспрессирующие mIgD. Участок присутствует в mIgD, экспрессируемом В-клетками, но не в секретируемом IgD.

[279] II-(i)-D. Т-клеточные опухоли

[280] Субпопуляции Т-лимфоцитов посредством своих поверхностных молекул и секретируемых факторов опосредуют сложную систему форм иммунорегуляторной активности в отношении эффекторных функций гуморального и клеточного иммунитета, включающих выработку антител разнообразных классов, секрецию различных цитокинов и образование цитотоксических Т-клеток и других цитолитических клеток. Многие аутоиммунные заболевания вызываются аномальными формами активности Т-клеток в отношении собственных компонентов или клеток. Например, при сахарном диабете I типа β-клетки, вырабатывающие инсулин, в островках Лангерганса поджелудочной железы подвергаются атаке аутореактивных Т-клеток и уничтожаются ими. Тяжелейшие аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка (SLE), рассеянный склероз и воспалительные заболевания кишечника, вызываются главным образом Т-клетками.

Более того, реакция отторжения трансплантированных органов или тканей опосредована главным образом Т-клетками.

[281] Существует также несколько форм Т-клеточных злокачественных опухолей. Таким образом, модулирование форм активности Т-клеток или удаление Т-клеток является активной областью исследований по изысканию новых лекарственных средств. Разнообразные антитела к поверхностным антигенам Т-клеток, в том числе CD3, CD4, CD8, CD25 и CD28, и их модифицированные формы исследовали в животных моделях или клинических испытаниях с участием людей для оценки лечения различных заболеваний человека, упомянутых выше. Некоторые антитела с конъюгированными с ними цитотоксическими лекарственными средствами или без них могут вызывать лизис субпопуляций Т-клеток-мишеней. Некоторые антитела могут вызывать анергию или бездействующее, неактивное состояние Т-клеток без фактического лизиса клеток.

[282] Т-лимфоциты играют основную роль в регуляции форм активности различных иммуноцитов и различных других типов клеток в системе приобретенного и естественного иммунитета. В ходе разработки терапевтических средств, нацеливающихся на лимфоциты, было успешно разработано меньшее количество кандидатов для нацеливания на Т-клетки, чем для нацеливания на В-клетки. Однако, возрастает количество терапевтических антител, разрабатываемых для нацеливания на поверхностные антигены субпопуляций Т-клеток. Антитела, нацеливающиеся на поверхностные антигены Т-клеток, можно потенциально использовать для лечения злокачественных опухолей, происходящих из Т-клеток. Антитела также можно применять для модулирования форм активности Т-клеток для их ингибирования либо для их усиления.

[283] II-(i)-E. Миелогенный лейкоз

[284] AML происходит из миелоидных стволовых клеток или миелобластов, предшественников зрелых гранулоцитов и моноцитов. Многие подтипы AML вызываются мутагенами, которые вызывают хромосомные транслокации или утрату определенных сегментов генов. Клетки AML, происходящие из клеток на различных стадиях дифференцировки, экспрессируют некоторые подмножества поверхностных маркеров CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD36, CD41, CD61, CD64, CD65 и CD11c. Клетки AML, образующиеся на стадии ранних миелоидных предшественников, экспрессируют CD34, который представляет собой поверхностный маркер плюрипотентных стволовых клеток, и CD33, который представляет собой маркер незрелых миелоидных клеток. Клетки AML, образующиеся на многих стадиях дифференцировки клеток миелоидного ряда, экспрессируют CD15, маркер зрелых миелоидных клеток. CML представляет собой нарушение со стороны клональных стволовых клеток костного мозга, обусловленное злокачественной трансформацией стволовых клеток или миелоидных стволовых клеток или транслокацией филадельфийской хромосомы.

[285] II-(ii). Солидная опухоль

[286] II-(ii)-A. Солидная опухоль и опухолеассоциированные антигены

[287] Клетки многих типов опухолей экспрессируют определенные антигены на клеточной поверхности на повышенных уровнях по сравнению с нормальными клетками. Эти антигены называют опухолеассоциированными антигенами. Например, образцы сыворотки крови от пациентов с опухолями поджелудочной железы и многими типами рака желудочно-кишечного тракта, включающими колоректальный рак, рак пищевода и гепатоцеллюлярную карциному, содержат антиген СА19-9 (углеводный антиген 19-9, сиалированный антиген А Льюиса). Клетки этих опухолей экспрессируют СА19-9 во внеклеточном матриксе и на клеточной поверхности. Аналогично, образцы сыворотки крови от пациентов с раком яичника, раком эндометрия, раком фаллопиевой трубы и некоторыми другими типами рака характеризуются повышенным уровнем СА-125 (углеводного антигена 125, муцина 16), и клетки этих опухолей экспрессируют СА125. Сверхэкспрессия ассоциированного с клеточной поверхностью гликопротеина муцина 1 (MUC1) часто ассоциирована с раком толстой кишки, молочной железы, яичника, легкого и поджелудочной железы.

[288] Ганглиозид GD2 экспрессируется на высоком уровне в опухолях, происходящих из нейроэктодермы, и саркомах, включая нейробластому, ретинобластому, меланому, мелкоклеточный рак легкого, опухоли головного мозга, остеосаркому, рабдомиосаркому, саркому Юинга у детей и подростков, а также липосаркому, фибросаркому, лейомиосаркому и другие саркомы мягких тканей у взрослых.

[289] Хотя мезотелин экспрессируется на нормальных мезотелиальных клетках, он экспрессируется во многих раковых опухолях человека, мезотелиоме, опухолях поджелудочной железы, яичника, легкого и желудка, холангиокарциноме и трижды негативной раковой опухоли молочной железы.

[290] Tn-антиген является структурным элементом гликопротеинов, в котором N-ацетилгалактозамин (GalNAc) связан с серином или треонином гликозидной связью, т.е. в виде О-гликана. При добавлении отдельных остатков моносахаридов формируются дисахаридные антигены: антиген Томсена-Фриденрайха (TF-антиген или Т-антиген) образуется путем замещения галактозой (Gal(b1-3)GalNAc); сиалированный Tn-антиген (STn-антиген) образуется путем замещения сиаловой кислотой (Neu5Ac(a2-6)GalNAc). TN и сиалированный Tn обычно не находятся на поверхности здоровых клеток, но могут находиться на раковых клетках.

[291] Опухолеассоциированные антигены, которые широко исследовали в качестве маркеров опухолей или изучали в качестве мишеней для иммунотерапевтических средств, включают (1) рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR) - рецептор 1 человеческого эпидермального фактора роста (EGFR или HER1), HER2, HER3, HER4 или их мутантные формы; (2) гликопротеины - СА19-9 (несущий сиалированный антиген А Льюиса), СА125 (несущий муцин 16 или MUC 16), муцин 1, ассоциированный с клеточной поверхностью (MUC1), или рэково-эмбриональный антиген, антиген, ассоциированный с меланомой (MAGE), простатический специфический мембранный антиген (PSMA), антиген стволовых клеток предстательной железы (PSCA) или мезотелин; (3) Tn, родственный муцину, или сиалированный Tn; (4) относящиеся к антигенам групп крови Льюиса антиген Y Льюиса, сиалированный антиген Y Льюиса, сиалированный антиген А Льюиса или антиген X Льюиса; (5) гликосфинголипиды - глобо-Н или стадиеспецифический эмбриональный антиген 4 (SSEA-4); или (6) ганглиозиды - GD2, GD3, GM2, фукозилированный GM1 или Neu5GcGM3.

[292] II-(ii)-B. Факторы роста, пептидные гормоны и цитокины в качестве средств, нацеливающихся на клетки со сверхэкспрессией рецепторов

[293] Ряд факторов роста, пептидных гормонов и регуляторных цитокинов регулируют важные физиологические процессы в организме человека. Эти вещества опосредуют свои функции посредством взаимодействия со своими рецепторами на различных типах клеток. Наиболее значимыми являются эндокринные или экзокринные клетки в органах или отделах органов, несущие функционально специализированные рецепторы, реагирующие на факторы роста, гормоны или цитокины. Например, экзокринные клетки в поджелудочной железе несут рецепторы, реагирующие на секретин, гастрин и холецистокинин (CCK) из двенадцатиперстной кишки и желудка в ходе приема пищи и процесса пищеварения.

[294] Если с клетками, несущими рецепторы, происходит злокачественная трансформация, опухолевые клетки сохраняют экспрессию рецепторов. В действительности во многих случаях аномально высокая экспрессия рецепторов имеет место вследствие определенных мутаций в клетках, которые необязательно происходят в самих рецепторах. Пораженные клетки, таким образом, подвергаются злокачественной трансформации. Сверхэкспрессия рецепторов в опухолях, например, рецепторов соматостатина, которые экспрессируются на высоком уровне в большинстве нейроэндокринных опухолей, и нацеливание на эти рецепторы для терапевтических и диагностических целей (например, для радиологической визуализации) является активной областью исследований. Нейроэндокринные опухоли, как правило, являются редкими, но включают длинный перечень опухолей различного клеточного происхождения, в том числе нейроэндокринные опухоли желудочно-кишечного тракта или поджелудочной железы, опухоли щитовидной железы, карциному из клеток Меркеля, адреномедуллярные опухоли и многие другие.

[295] Многочисленными являются примеры в данном направлении исследований.

Сверхэкспрессия семейства рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR) при раке молочной железы, раке легкого, раке толстой кишки и многих других типах карцином подтверждена документально. Например, моноклональное антитело трастузумаб, специфичное к рецептору HER2/neu, широко применяется для лечения НЕР2-положительного рака молочной железы. Цетуксимаб, специфичный к EGFR, применяется в лечении метастатического рака толстой кишки, метастатического немелкоклеточного рака легкого и рака головы и шеи. Низкомолекулярные ингибиторы, такие как гефитиниб и эрлотиниб, которые нарушают функционирование тирозинкиназного домена EGFR, также были разработаны для лечения некоторых типов рака.

[296] Рак поджелудочной железы представляет собой одну из наиболее агрессивных форм рака. Среди различных типов рака поджелудочной железы аденокарцинома поджелудочной железы (протоковая или инвазивная), происходящая из экзокринных клеток, составляет 85%, хотя эти протоковые эпителиальные клетки составляют лишь 10% от всех клеток поджелудочной железы. Экзокринные клетки экспрессируют рецепторы пептидных гормонов, гастрина, секретина или холецистокинина, секретируемые клетками в желудке и двенадцатиперстной кишке, и реагируют на эти гормоны и секретируют бикарбонат-ионы и пищеварительные ферменты. Сверхэкспрессируемые рецепторы CCK и гастрина при раке поджелудочной железы и многих других типах также изучали в качестве мишени для радиологической визуализации. Другие гормоны и рецепторы, которые находятся на стадии активного исследования, представляют собой соматостатин и гастрин-высвобождающий пептид. В таких подходах с радиологической визуализацией к CCK или гастрину или их пептидным аналогам присоединяют хелатообразующие группы для радиоактивных нуклидов. В рамках процедуры визуализации визуализирующие средства связываются с первичными или метастатическими опухолями, содержащими клетки, экспрессирующие рецепторы. Пептидные гормоны или их аналоги, несущие радионуклиды лютеций-177, иттрий-90 или индий-111, также подвергали экспериментам по лечению опухолей.

[297] II-(ii)-C. Иммунные контрольные точки в качестве мишеней

[298] CTLA-4 представляет собой белковый рецептор, который деактивирует иммунную систему. CTLA-4 находится на поверхности Т-клеток и действует в качестве "выключателя" при связывании с CD80 (В7-1) или CD86 (В7-2) на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Такое связывание предотвращает связывание этих рецепторов с CD28, который активирует иммунный ответ.Ипилимумаб, человеческое антитело IgG1, специфичное к CTLA-4, был одобрен для лечения меланомы и находится на стадии клинических исследований по оценке лечения некоторых других типов рака. Лечение с помощью ипилимумаба было связано с тяжелыми и потенциально смертельными иммунологическими побочными эффектами, обусловленными активацией и пролиферацией Т-клеток.

[299] PD-1 экспрессируется на поверхности активированных Т-клеток. Если PD-1 блокируется его лигандом PD-L1, то Т-клетка становится неактивной. Таким способом в организме осуществляется регуляция иммунной системы, направленная на избегание чрезмерных реакций при иммунном ответе. Многие раковые клетки производят PD-L1 и таким образом "обезоруживают" Т-клетки и подавляют их атаку на раковые клетки. Два человеческих антитела к PD-1 пембролизумаб и ниволумаб были одобрены для лечения неоперабельной или метастатической меланомы, которая больше не отвечает на другие лекарственные средства, и плоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого. Антитело к PD-L1 MPDL3280A в настоящее время находится в фазе II или III клинических испытаний по оценке применения против трижды негативного рака молочной железы, метастатического немелкоклеточного рака легкого, карциномы мочевого пузыря и почечно-клеточной карциномы. Большое количество антител к PD-1 и к PD-L1 находится на стадии исследования или клинических испытаний ранних фаз.

[300] Многие исследователи изучают другие мишени, такие как ОХ40, CD137 и CD27, на активированных Т-клетках и их соответствующие лиганды OX40L, CD137L и CD137 на антигенпрезентирующих клетках или опухолевых клетках в отношении растормаживайия активации Т-клеток. Эти пути считаются более мягкими по силе активации Т-клеток, чем пути CTLA-4 и PD-1.

[301] Хотя антитела, специфичные к PD-1 или PD-L1, выглядят весьма перспективно в отношении лечения некоторых типов рака, существующие клинические разработки дают основание предположить, что для этих антител будет требоваться комбинация с химиотерапевтическими средствами, другими антителами или средствами целенаправленной терапии. Кроме того, антитела также вызывают ряд тяжелых побочных эффектов. Авторы настоящего изобретения логически обосновывают то, что если антитела, специфичные к иммунным контрольным точкам, переносить в участок-мишень расположения опухоли, то можно достичь лучшей терапевтической эффективности и будет наблюдаться меньше побочных эффектов.

[302] II-(ii)-D. Фактор роста эндотелия сосудов в качестве мишени

[303] Фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF-A) является существенно важным для ангиогенеза (образования кровеносных сосудов) по мере роста опухоли. Кровоток необходим для снабжения кислородом и питательными веществами, удаления отходов метаболизма и многих других функций. Антитела, специфичные к VEGF-A, такие как бевацизумаб, специфичный к VEGF-A, являются эффективными в качестве средств монотерапии или в комбинации с химиотерапией при лечении некоторых форм рака. Однако, бевацизумаб ассоциирован с рядом побочных эффектов, включающих гипертензию и повышенный риск кровотечений, перфорацию кишечника и некротизирующий фасциит.

[304] II-(ii)-E. Иммунорегуляторные цитокины в качестве противораковых терапевтических средств

[305] Иммунорегуляторные цитокины, упоминаемые в настоящем изобретении, как известно, являются стимулирующими и являются основными движущими факторами активации иммунных ответов. Эти цитокины включают интерлейкин-2 (IL-2), интерферон-α (IFN-α), интерферон-γ (IFN-γ) и TNF-α. Среди них IFN-α, который является сильным активатором Т-клеток, был одобрен для применения при волосатоклеточном лейкозе, саркоме Капоши, ассоциированной со СПИДом, фолликулярной лимфоме, хроническом миелоидном лейкозе и меланоме. В клинических исследованиях, однако, до сих пор не были установлены основные виды терапевтической полезности этих иммунорегуляторных цитокинов при лечении опухолей, главным образом потому, что терапевтические дозы этих цитокинов при системном введении ограничены побочными эффектами цитокинов. Как правило, цитокины действуют главным образом в микроокружении лимфоидной системы.

[306] III. Остеопорозное заболевание

[307] Антитело деносумаб, специфичное к RANKL (CD254), лиганду RANK (RANK, рецептора-активатора ядерного фактора кВ), одобрено для лечения остеопороза. Разработка деносумаба представляет собой главное усовершенствование медицинской помощи при остеопорозе. Однако, введение деносумаба вызывает частые побочные эффекты, такие как инфекции мочевыводящих и дыхательных путей, формы катаракты, запор, сыпь и боль в суставах. Следовательно, желательно, чтобы терапевтическое средство переносилось преимущественно в кость.

[308] RANKL представляет собой мембранный белок, принадлежащий к семейству лигандов факторов некроза опухоли. RANKL выявляют на высоких уровнях в легких, вилочковой железе и лимфатических узлах. Его также выявляют на низких уровнях в костном мозге, желудке, периферической крови, селезенке, плаценте, лейкоцитах, сердце, щитовидной железе и скелетных мышцах. Поскольку антитело IgG к RANKL, такое как деносумаб, может служить в качестве терапевтического средства при остеопорозе, молекулярные конструкции по настоящему изобретению будут представлять собой лучшие терапевтические средства, чем антитело IgG к RANKL.

[309] Другой мишенью для антител при лечении остеопороза является склеростин, кодируемый геном SOST. Данный гликопротеин вырабатывается и секретируется остеоцитами и осуществляет отрицательную регуляцию костеобразования, обеспечиваемого остеобластами. Мутация с потерей функции или дефектом гена SOST вызывает прогрессирующее утолщение костей. Мутация с дефектом гена SOST приводит к повышению костеобразования. Антитела к склеростину вызывают повышение костеобразования, минеральной плотности костей и укрепление костей. Клинические испытания двух гуманизированных моноклональных антител к склеростину блосозумаба и ромосозумаба в фазах I и II указывали на то, что лечение с помощью антител ассоциировано с повышением минеральной плотности костей и костеобразования и снижением костной резорбции.

[310] С учетом вышеприведенного обсуждения в настоящем раскрытии представлены два типа молекулярных платформ для конструирования молекул Т-Е по настоящему изобретению. В основе одного лежит конфигурация "линкерного звена" (см. часть I - часть IV ниже), а в основе другого лежит конфигурация "Fc" (см. часть V - часть VIII ниже). Подробное обсуждение, касающееся структуры указанных двух конфигураций, а также пути практического применения каждой из молекулярных конструкций представлены ниже.

[311] ЧАСТЬ I. Многоветвевые линкеры на основе пептидной сердцевины

[312] Первый аспект настоящего раскрытия относится к линкерному звену, которое содержит (1) центральную сердцевину, содержащую 2-15 лизиновых (K) остатков, и (2) 2-15 связывающих ветвей, соответственно связанных с остатками K центральной сердцевины. Центральная сердцевина по настоящему изобретению характеризуется тем, что она имеет азидную группу, алкиновую группу, тетразиновую группу или напряженную алкиновую группу или связана с ней на своем N- или С-конце.

[313] При получении линкерного звена по настоящему изобретению цепь PEG, имеющая N-гидроксисукцинимидильную (NHS) группу на одном конце и малеимидную группу на другом конце, связывается с остатком K центральной сердцевины путем образования амидной связи между NHS-группой цепи PEG и аминогруппой остатка K. В настоящем раскрытии цепь PEG, связанную с остатком K, называют связывающей ветвью, которая имеет малеимидную группу на своем свободном конце.

[314] В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина представляет собой полипептид, имеющий длину 8-120 аминокислотных остатков и содержащий 2-15 лизиновых (K) остатков, в котором каждый остаток K отделен от следующего остатка К вставочной последовательностью.

[315] В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия вставочная последовательность содержит глициновые (G) и сериновые (S) остатки; вставочная последовательность предпочтительно состоит из 2-15 остатков, выбранных из G, S и их комбинации. Например, вставочная последовательность может представлять собой

или

[316] Вставочная последовательность, расположенная между двумя лизиновыми остатками, может представлять собой варианты из глициновых и сериновых остатков, имеющие в некоторой степени произвольные последовательности и/или значения длины. Можно применять более длинные вставочные последовательности для полипептида с меньшим количеством лизиновых остатков и более короткие вставочные последовательности для полипептида с большим количеством лизиновых остатков. Во вставочные последовательности наряду с глицином и серином можно внедрять гидрофильные аминокислотные остатки, такие как аспарагиновая кислота и гистидин. В качестве альтернатив для вставочных последовательностей, образованных из глициновых и сериновых остатков, вставочные последовательности также можно взять из гибких растворимых петель широко распространенных человеческих сывороточных белков, таких как альбумин и иммуноглобулины.
[317] В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина содержит 2-15 звеньев с последовательностью G_1-5SK. В качестве альтернативы, полипептид содержит последовательность (GSK)_2-15; то есть полипептид содержит по меньшей мере два последовательных звена с последовательностью GSK. Например, центральная сердцевина по настоящему изобретению может содержать следующую аминокислотную последовательность:
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK (SEQ ID NO: 17),
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK (SEQ ID NO: 18) или
Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK (SEQ ID NO: 19),
в которой Ac представляет собой ацетильную группу.
[318] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина представляет собой полипептид, который содержит последовательность (Х_аа-K)_n, в которой Х_аа представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую 2-12 повторяющихся этиленгликолевых (EG) звеньев, а n представляет собой целое число от 2 до 15.
[319] Как описано выше, центральная сердцевина по настоящему изобретению характеризуется тем, что она имеет азидную группу, алкиновую группу, тетразиновую группу или напряженную алкиновую группу или связана с ней на своем N- или С-конце. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина по настоящему изобретению содержит на своем N- или С-конце аминокислотный остаток, имеющий азидную группу или алкиновую группу. Аминокислотный остаток, имеющий азидную группу, может представлять собой L-азидогомоаланин (AHA), 4-азидо-L-фенилаланин, 4-азидо-D-фенилаланин, 3-азидо-L-аланин, 3-азидо-D-аланин, 4-азидо-L-гомоаланин, 4-азидо-D-гомоаланин, 5-азидо-L-орнитин, 5-азидо-D-орнитин, 6-азидо-L-лизин или 6-азидо-D-лизин. Например, центральная сердцевина по настоящему изобретению может иметь последовательность
Ac-(GSK)_2-7-(G_2-4S)_1-8-A^AH,
Ac-A^AH-(SG_2-4)_1-8-(GSK)_2-7,
Ac-A^AH-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-C,
Ac-C-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-A^AH,
Ас-K-(Хаа_2-12-K)_2-4-Хаа_2-12-А^АН,
Ac-A^AH-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_2-4,
Ас-А^АН-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-C или
Ас-С-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-А^АН,
в которой Хаа представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую определенное количество повторяющихся EG-звеньев, Ас представляет собой ацетильную группу, а А^АН представляет собой остаток AHA.
[320] Типичная аминокислота, имеющая алкиновую группу, включает без ограничения L-гомопропаргилглицин (L-HPG), D-гомопропаргилглицин (D-HPG) или бета-гомопропаргилглицин (β-HPG). В этом случае центральная сердцевина по настоящему изобретению может иметь последовательность
Ac-(GSK)_2-7-(G_2-4S)_1-8-G^HP,
Ac-G^HP-(SG_2-4)_1-8-(GSK)_2-7,
Ac-G^HP-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-C,
Ac-C-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-G^HP,
Ac-K-(Xaa_2-12-K)_2-4-Xaa_2-12-G^HP,
Ac-G^HP-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_2-4,
Ac-G^HP-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_1-3-Xaa_2-12-C или
Ac-C-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_1-3-Xaa_2-12-G^HP,
в которой Хаа представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую определенное количество повторяющихся EG-звеньев, Ас представляет собой ацетильную группу, a G^HP представляет собой остаток HPG.
[321] Следует отметить, что многие аминокислоты, содержащие азидную или алкиновую группу в своих боковых цепях, и пегилированные аминокислоты доступны коммерчески в защищенных t-boc (трет-бутилоксикарбонилом) или Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонилом) формах, легко применимых в твердофазном синтезе пептидов.
[322] В соответствии с некоторыми рабочими примерами настоящего раскрытия центральная сердцевина может содержать последовательность
Ac-G^HPGGSGGSGGSKGSGSK (SEQ ID NO: 21),
Ac-G^HPGGSGGSGGSKGSGSKGSK (SEQ ID NO: 22),
Ac-A^AHGGSGGSGGSKGSGSKGSK (SEQ ID NO: 23),
Ac-G^HPGGSGGSGGSKGSGSKGSGSC (SEQ ID NO: 24),
Ас-С-Хаа₂-K-Хаа₂-K-Хаа₂-K (SEQ ID NO: 25) или
Ac-C-Xaa₆-K-Xaa₆-K-Xaa₆-K-Xaa₆-K-Xaa₆-K (SEQ ID NO: 26),
в которой Xaa представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую определенное количество повторяющихся EG-звеньев, Ас представляет собой ацетильную группу, А^АН представляет собой остаток AHA, a G^HP представляет собой остаток HPG.
[323] В качестве альтернативы, центральная сердцевина по настоящему изобретению связана с соединяющей ветвью, которая имеет функциональную группу (например, азидную группу, алкиновую группу, тетразиновую группу или напряженную алкиновую группу) на своем свободном конце (то есть на конце, не связанном с центральной сердцевиной). В этих случаях центральная сердцевина по настоящему изобретению содержит цистеиновый остаток на своем N- или С-конце. Для получения линкерного звена, связанного с соединяющей ветвью, цепь PEG, имеющая малеимидную группу на одном конце и функциональную группу на другом конце, связывается с цистеиновым остатком центральной сердцевины посредством реакции тиольной и малеимидной групп, происходящей между малеимидной группой цепи PEG и тиольной группой цистеинового остатка. В настоящем раскрытии цепь PEG, связанную с цистеиновым остатком центральной сердцевины, называют соединяющей ветвью, которая имеет функциональную группу на своем свободном конце.
[324] Соединяющая ветвь предпочтительно имеет тетразиновую группу или напряженную алкиновую группу на своем свободном конце. Эти соединяющие ветви имеют 2-12 EG-звеньев. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия тетразиновая группа представляет собой 1,2,3,4-тетразиновую, 1,2,3,5-тетразиновую, 1,2,4,5-тетразиновую группы или их производные. Пример напряженной алкиновой группы включает без ограничения транс-циклооктеновую (ТСО), дибензоциклооктиновую (DBCO), дифторциклооктиновую (DIFO), бициклонониновую (BCN) и дибензоциклооктиновую (DICO) группы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия тетразиновая группа представляет собой 6-метилтетразин.
[325] Пример центральной сердцевины по настоящему изобретению, связанной с соединяющей ветвью, включает без ограничения
Ac-(GSK)_2-7-(G_2-4S)_1-8-С-Хаа_2-12-тетразин,
Ас-(GSK)_2-7-(С_2-4S)_1-8-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,
Ас-K-(Хаа_2-12-K)_2-4-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-тетразин,
Ас-K-(Хаа_2-12-K)_2-4-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,
тетразин-Xaa_2-12-C(Ac)-(SG_2-4)_1-8-(GSK)_2-7,
напряженный алкин-Xaa_2-12-C(Ac)-(SG_2-4)_1-8-(GSK)_2-7,
тетразин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_2-4 и
напряженный алкин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_2-4.
[326] В качестве альтернативы, центральная сердцевина имеет азидную или алкиновую группу на одном конце и соединяющую ветвь с тетразиновой или напряженной алкиновой группой на другом конце. Примерами являются следующие:
Ac-A^AH-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-C-Xaa_2-12-тетразин,
Ас-А^АН-(SG_2-4)_0-7-(CSK)_2-6-(С_2-4S)_1-8-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,
тетразин-Xaa_2-12-C(Ac)-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-A^AH,
напряженный алкин-Хаа_2-12-С(Ас)-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-А^АН,
Ас-А^АН-Хаа_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-тетразин,
Ас-А^АН-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,
тетразин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-А^АН,
напряженный алкин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3Хаа_2-12A^AH,
Ac-G^HP-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-C-Xaa_2-12-тетразин,
Ас-G^HP-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,
тетразин-Xaa_2-12-C(Ac)-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-G^HP,
напряженный алкин-Хаа_2-12-С(АС)-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-G^HP,
Ac-G^HP-Xaa_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-тетразин,
Ac-G^HP-Xaa_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,
тетразин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-G^HP и
напряженный алкин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-G^HP.
[327] Полипептид также можно синтезировать с помощью рекомбинантной технологии путем экспрессии сконструированных сегментов генов в клетках-хозяевах бактерий или млекопитающих. Если сердцевина имеет большое количество лизиновых остатков и существенную длину, то предпочтительно получать полипептид в виде рекомбинантных белков. При использовании твердофазного синтеза по мере увеличения длины полипептида возрастает количество ошибок, а степень чистоты и/или выход продукта снижаются. Для получения полипептида в клетках-хозяевах бактерий или млекопитающих вставочная последовательность в диапазоне от нескольких аминокислотных остатков до 10-20 остатков может располагаться между двумя остатками К. Кроме того, поскольку AHA и HPG не являются природными аминокислотами, кодируемыми генетическими кодами, N-концевой или С-концевой остаток в этих рекомбинантных полипептидах представляет собой цистеин. После экспрессии и очистки рекомбинантных белков концевой цистеиновый остаток затем подвергают реакции с короткими бифункциональными сшивающими средствами, которые имеют малеимидную группу на одном конце, реагирующую с SH-группой цистеинового остатка, и алкиновую, азидную, тетразиновую или напряженную алкиновую группу на другом конце.
[328] Синтез полипептида с применением пегилированных аминокислот включает меньшее количество этапов, чем в случае применения обычных аминокислот, таких как глициновые и сериновые остатки. В дополнение, можно использовать пегилированные аминокислоты с различной длиной (т.е. количеством повторяющихся этиленгликолевых звеньев), что обеспечивает гибкость для целей растворимости и некоторое расстояние между соседними аминогруппами лизиновых остатков. Центральные сердцевины также могут быть сконструированы таким образом, чтобы они содержали, кроме пегилированных аминокислот, искусственные аминокислоты, такие как D-формы аминокислот, гомоаминокислоты, N-метилированные аминокислоты и т.д. Для конструирования центральной сердцевины предпочтительно применяют пегилированные аминокислоты с различной длиной цепи полиэтиленгликоля (PEG), поскольку PEG-компоненты, содержащиеся в молекулах аминокислот, обеспечивают конформационную гибкость и надлежащее расстояние между конъюгирующими группами, повышают растворимость в воде и, как правило, являются слабоиммуногенными. Синтез центральной сердцевины, содержащей пегилированные аминокислоты, аналогичен процедурам синтеза обычных полипептидов.
[329] Центральная сердцевина по настоящему изобретению для целей стабильности необязательно имеет на своем N-конце ацетильную группу, блокирующую аминогруппу.
[330] Как может быть понятно, количество связывающих ветвей, связанных с центральной сердцевиной, определяется главным образом количеством лизиновых остатков, содержащихся в центральной сердцевине. Поскольку в центральной сердцевине по настоящему изобретению содержится по меньшей мере два лизиновых остатка, линкерное звено по настоящему изобретению может содержать множество связывающих ветвей.
[331] Обратимся теперь к фигуре 1А. Согласно иллюстрации, линкерное звено 10А содержит центральную сердцевину 11а, содержащую один остаток HPG (G^HP) и четыре лизиновых (K) остатка, соответственно разделенных вставочными последовательностями (обозначенными многоточием во всех графических материалах). Вставочные последовательности между остатком HPG и остатком K или между любыми двумя остатками K могут иметь одинаковые или разные аминокислотные последовательности. В этом примере четыре связывающие ветви 20a-20d связаны с лизиновыми остатками путем образования амидной связи между NHS-группой и аминогруппой лизинового остатка соответственно. Как может быть понятно, определенные признаки, обсуждаемые в данном документе в отношении линкерного звена 10А или любых других последующих линкерных звеньев, являются общими для других линкерных звеньев, раскрытых в данном документе, и, следовательно, некоторые или все из этих признаков также являются применимыми в следующих примерах, если это не противоречит контексту конкретного варианта осуществления. Однако, в целях краткости эти общие признаки могут не повторяться явным образом ниже.
[332] На фигуре 1 В представлено линкерное звено 10В в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего раскрытия. Центральная сердцевина 11b содержит один цистеиновый (С) остаток и шесть лизиновых (K) остатков, соответственно разделенных вставочными последовательностями. В этом примере линкерное звено 10 В содержит шесть связывающих ветвей 20a-20f, соответственно связанных с лизиновыми остатками. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия связывающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев.
[333] В отличие от линкерного звена 10А на фигуре 1А, линкерное звено 1В дополнительно содержит соединяющую ветвь 60. Как обсуждается выше, цепь PEG, имеющая малеимидную группу на одном конце и функциональную группу на другом конце, применяется для образования соединяющей ветви 60. Таким образом, соединяющая ветвь 60 связана с цистеиновым остатком центральной сердцевины 11b посредством реакции тиольной и малеимидной групп. В этом примере функциональная группа на свободном конце соединяющей ветви 60 представляет собой тетразиновую группу 72. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия соединяющая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-12 повторяющихся EG-звеньев.
[334] Если требуется высвобождение эффекторных элементов в участке-мишени, в связывающую ветвь можно вставить расщепляемую связь. Такая связь расщепляется путем кислотного/щелочного гидролиза, восстановления/окисления или под действием ферментов. Одним вариантом осуществления класса расщепляемых цепей PEG, которые можно применять для образования соединяющей ветви, является NHS-PEG_2-20-S-S-малеимид, где S-S представляет собой дисульфидную связь, которую можно подвергнуть медленному восстановлению, a NHS-группу применяют для конъюгирования с аминогруппой центральной сердцевины, связывая таким образом цепь PEG с центральной сердцевиной. Малеимидная группа на свободном конце связывающей ветви может быть замещена азидной, алкиновой, тетразиновой или напряженной алкиновой группой.
[335] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия связывающая ветвь, связанная с остатком K центральной сердцевины, имеет малеимидную группу на своем свободном конце. Таким образом, функциональный элемент (такой как нацеливающий элемент или эффекторный элемент), имеющий тиольную группу, может реагировать с малеимидной группой связывающей ветви посредством реакции тиольной и малеимидной групп, так чтобы функциональный элемент связывался со связывающей ветвью. В целях иллюстрации функциональные элементы, связанные со связывающими ветвями, называют первыми элементами. Как можно понять, количество первых элементов, которые несет линкерное звено по настоящему изобретению, зависит от количества остатков К в центральной сердцевине (и, таким образом, от количества связывающих ветвей). Соответственно, средний специалист в данной области при необходимости может регулировать количество первых элементов линкерного звена, например, для достижения желаемого нацеливания или терапевтического эффекта.
[336] Пример линкерного звена 10С, имеющего первые элементы, проиллюстрирован на фигуре 1С. За исключением признаков, обсуждаемых в данном документе ниже, фигура 1С довольно сходна с фигурой 1В. Во-первых, в центральной сердцевине 11d имеется пять остатков K, и, соответственно, с ними связаны соответственно пять связывающих ветвей 20а-20е. Во-вторых, линкерное звено 10С имеет пять первых элементов 30а-30е, связанных с каждой из связывающих ветвей 20а-20е. Как обсуждается ниже, необязательная тетразиновая группа 72 обеспечивает возможность конъюгирования с дополнительным функциональным элементом, другой молекулярной конструкцией (см. часть III или часть VII ниже).
[337] В целях усиления намеченного или желаемого эффекта (например, терапевтического эффекта) линкерное звено по настоящему изобретению может дополнительно содержать второй элемент в дополнение к первому элементу. Например, второй элемент может представлять собой нацеливающий элемент либо эффекторный элемент В необязательных вариантах осуществления настоящего раскрытия первый элемент представляет собой эффекторный элемент, а второй элемент может представлять собой другой эффекторный элемент, который действует аддитивно или синергично с первым элементом или независимо от него. Опять же необязательно, первый и второй элементы проявляют разные свойства; например, первый элемент представляет собой нацеливающий элемент, а второй элемент представляет собой эффекторный элемент, и наоборот. В качестве альтернативы, первый элемент представляет собой эффекторный элемент, а второй элемент представляет собой элемент, способный к улучшению фармакокинетического свойства линкерного звена, такого как растворимость, коэффициент очищения, период полувыведения и биодоступность.
[338] В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия первый элемент представляет собой нацеливающий элемент, который делает линкерное звено по настоящему изобретению специфично нацеленным на очаг поражения, второй элемент представляет собой эффекторный элемент, вызывающий терапевтический эффект после доставки линкерного звена по настоящему изобретению в очаг поражения. Например, при лечении диффузной опухоли линкерное звено по настоящему изобретению может содержать множество нацеливающих элементов в качестве первых элементов и один эффекторный элемент в качестве второго элемента. В этом случае нацеливающий элемент специфично нацеливается на антиген клеточной поверхности, экспрессируемый в диффузной опухоли (например, CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD37, CD79a или CD79b); а эффекторный элемент (например, фрагмент антитела, специфичный к CD3 или CD16a) привлекает Т-клетки или NK-клетки для уничтожения опухолевых клеток.
[339] В соответствии с альтернативным вариантом осуществления настоящего раскрытия первый элемент представляет собой эффекторный элемент, а второй элемент представляет собой нацеливающий элемент. Например, при лечении аутоиммунного заболевания линкерное звено по настоящему изобретению может содержать один нацеливающий элемент, который специфично нацеливается на тканевой белок внеклеточного матрикса (например, α-аггрекан, коллаген I типа, коллаген II типа, коллаген III типа, коллаген V типа, коллаген VII типа, коллаген IX типа и коллаген XI типа), и множество эффекторных элементов, вызывающих терапевтический эффект в очаге поражения.
[340] В структурном плане второй элемент связан с азидной, алкиновой, тетразиновой или напряженной алкиновой группой на N- или С-конце центральной сердцевины. В частности, второй элемент может быть необязательно конъюгирован с короткой цепью PEG (предпочтительно имеющей 2-12 повторяющихся EG-звеньев) и далее связан с N- или С-концевым аминокислотным остатком, имеющим азидную группу или алкиновую группу (например, остатком AHA или остатком HPG). В качестве альтернативы, второй элемент может быть необязательно конъюгирован с короткой цепью PEG и далее связан с соединяющей ветвью от центральной сердцевины.
[341] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина содержит аминокислоту, имеющую азидную группу (например, остаток AHA), на своем N- или С-конце; и, соответственно, второй элемент, имеющий алкиновую группу, связан с N- или С-концом центральной сердцевины посредством реакции CuAAC. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина содержит аминокислоту, имеющую алкиновую группу (например, остаток HPG), на своем N- или С-конце; а второй элемент, имеющий азидную группу, способен, таким образом, связываться с N- или С-концом центральной сердцевины посредством реакции
"азид-алкинового циклоприсоединения, катализируемого медью (I) (CuAAC)" (или, для краткости, "клик"-реакции), поясняемой на примере на схеме 1.
<<Схема 1. Реакция CuAAC>>

[342] В результате реакции CuAAC получают 1,5-дизамещенный 1,2,3-триазол. Реакция между алкином и азидом является весьма селективной, и в природных биомолекулах отсутствуют алкиновые и азидные группы. Более того, реакция является быстрой и нечувствительной к рН. Было выдвинуто предположение, что вместо применения меди(I), как, например, бромида меди или йодида меди, для катализа клик-реакции лучше применять смесь меди(II) и восстановителя, такого как аскорбат натрия, для получения меди(I) в реакционной смеси in situ. В качестве альтернативы, второй элемент может быть связан с N- или С-концом центральной сердцевины по настоящему изобретению посредством реакции без использования меди, в которой в качестве катализатора для катализа азид-алкинового циклоприсоединения применяется пентаметилциклопентадиенильный комплекс хлорида рутения.
[343] На фигуре 1D представлен пример линкерного звена по настоящему изобретению 10D, несущего множество первых элементов и один второй элемент. В этом примере центральная сердцевина 11с содержит один остаток HPG (G^HP) и пять лизиновых (K) остатков. Пять связывающих ветвей 20а-20е соответственно связаны с пятью остатками K центральной сердцевины 11с; а пять первых элементов 30а-30е соответственно связаны с указанными пятью связывающими ветвями 20а-20е посредством реакции тиольной и малеимидной групп. В дополнение к первым элементам, линкерное звено 10D дополнительно содержит один второй элемент 50, связанный с одним концом короткой цепи PEG 62. Другой конец короткой цепи PEG 62 до конъюгирования с центральной сердцевиной 11с имеет азидную группу. Таким образом, азидная группа может реагировать с остатком HPG, имеющим алкиновую группу, посредством реакции CuAAC, так чтобы второй элемент 50 связывался с центральной сердцевиной 11с. Жирная точка 40, показанная на фигуре 1D, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции CuAAC, происходящей между остатком HPG и азидной группой.
[344] В качестве альтернативы, второй элемент связан с центральной сердцевиной посредством соединяющей ветви. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия соединяющая ветвь имеет тетразиновую группу, которая может эффективно связываться со вторым элементом, имеющим ТСО-группу, посредством реакции Дильса-Альдера с обратными электронными требованиями (iEDDA) (см. схему 2). В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия соединяющая ветвь имеет ТСО-группу, которая способна связываться со вторым элементом, имеющим тетразиновую группу, посредством реакции iEDDA. В реакции iEDDA используются напряженные циклооктены, которые характеризуются значительно сниженной энергией активации в противоположность терминальным алкинам, и поэтому устраняется необходимость в экзогенном катализаторе.
[345] Обратимся теперь к фигуре 1Е, на которой центральная сердцевина 11d линкерного звена 10Е содержит концевой цистеиновый (С) остаток и пять лизиновых (K) остатков. Как показано на фигуре 1Е, пять связывающих ветвей 20а-20е соответственно связаны с пятью остатками K центральной сердцевины 11d, и далее пять первых элементов 30а-30е соответственно связаны с пятью связывающими ветвями 20а-20е посредством реакций тиольной и малеимидной групп. Цистеиновый остаток связан с соединяющей ветвью 60, которая до конъюгирования со вторым элементом содержит тетразиновую группу или ТСО-группу на своем свободном конце. В этом примере второй элемент 50, связанный с короткой цепью PEG 62, имеющей соответствующую ТСО-группу или тетразиновую группу, может быть связан с соединяющей ветвью 60 посредством реакции iEDDA. Эллипс 70, показанный на фигуре 1Е, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции iEDDA, происходящей между соединяющей ветвью 60 и короткой цепью PEG 62.
<<Схема 2. Реакция iEDDA>>

[346] В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия соединяющая ветвь до конъюгирования со вторым элементом имеет азидную группу. В связи с этим соединяющая ветвь может быть связана со вторым элементом, имеющим напряженную алкиновую группу (например, DBCO-, DIFO-, BCN- или DICO-группу) на свободном конце короткой цепи PEG, посредством реакции SPAAC (см. схему 3), и наоборот.
[347] Обратимся теперь к фигуре 1F, на которой линкерное звено 10F имеет сходную структуру с линкерным звеном 10Е на фигуре 1Е, за исключением того, что соединяющая ветвь 60 содержит азидную или напряженную алкиновую группу (например, DBCO-, DIFO-, BCN- или DICO-группу) вместо тетразиновой или ТСО-группы. Соответственно, второй элемент 50, связанный с короткой цепью PEG 62, может иметь соответствующую напряженную алкиновую (например, DBCO, DIFO, BCN или DICO) или азидную группу, так что он может связываться с соединяющей ветвью 60 посредством реакции SPAAC. Ромб 90, показанный на фигуре 1F, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC, происходящей между соединяющей ветвью 60 и короткой цепью PEG 62.
<<Схема 3. Реакция SPAAC>>

[348] Схема 4 представляет собой типичную иллюстрацию способа получения линкерного звена по настоящему изобретению. На этапе 1 получают центральную сердцевину, содержащую аминокислотную последовательность (GSK)₃ и L-азидогомоаланиновый (AHA) остаток на своем С-конце. На этапе 2 три связывающие ветви соответственно связываются с лизиновыми (K) остатками центральной сердцевины посредством образования амидной связи между NHS-группой и аминогруппой; связывающая ветвь, связанная с центральной сердцевиной, имеет малеимидную (Mal) группу на своем свободном конце. На этапе 3 три scFv антитела к антигену A (scFv α А) в качестве первого элемента соответственно связываются со связывающими ветвями посредством реакции тиольной и малеимидной групп. В то же время на этапе 4 один scFv антитела к антигену В (scFv α В) в качестве второго элемента связывается с короткой цепью PEG, имеющей 4 повторяющихся EG-звена и DBCO-группу на свободном конце. Наконец, на этапе 5 второй элемент связывается с остатком AHA центральной сердцевины посредством реакции SPAAC.
<<Схема 4. Получение линкерного звена, связанного с двумя различными scFv посредством связывающей ветви и С-концевого аминокислотного остатка>>

[349] На схеме 5 проиллюстрирован другой пример способа получения линкерного звена по настоящему изобретению. На этапе 1 получают центральную сердцевину, содержащую аминокислотную последовательность (K-Хаа)₃ и цистеиновый остаток на своем С-конце. На этапе 2 цепь PEG (в качестве соединяющей ветви), имеющая малеимидную (Mal) группу на одном конце и тетразиновую группу на другом конце, связывается с цистеиновым остатком посредством реакции тиольной и малеимидной групп. Далее на этапе 3 три связывающие ветви соответственно связываются с лизиновыми (K) остатками центральной сердцевины. Далее три scFv антитела к антигену А (scFv α А) в качестве первых элементов соответственно связываются со связывающими ветвями посредством реакции тиольной и малеимидной групп, как описано на этапе 4. В то же время на этапе 5 один scFv антитела к антигену В (scFv α В) в качестве второго элемента связывается с короткой цепью PEG, имеющей 3 повторяющихся EG-звена и ТСО-группу на свободном конце. Наконец, на этапе 6 второй элемент связывается с соединяющей ветвью посредством реакции iEDDA.
<<Схема 5. Получение линкерного звена, связанного с двумя различными scFv посредством связывающей ветви и соединяющей ветви>>

[350] Пегилирование представляет собой процесс, при котором цепь PEG прикрепляется к молекуле (например, лекарственному средству или белку) или связывается с ней. Известно, что пегилирование придает некоторые значительные фармакологические преимущества по сравнению с немодифицированной формой, такие как улучшенная растворимость, повышенная стабильность, увеличенная продолжительность циркуляции в крови и сниженная интенсивность протеолитического распада. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия второй элемент представляет собой цепь PEG, имеющую молекулярный вес, составляющий приблизительно 20000-50000 дальтонов.
[351] На фигуре 1G представлен альтернативный пример линкерного звена по настоящему изобретению (линкерное звено 10G), в котором пять первых элементов 30 соответственно связаны с лизиновыми остатками посредством связывающих ветвей 20, а остаток HPG (G^HP) центральной сердцевины 11е связан с цепью PEG 80 посредством реакции CuAAC. Жирная точка 40, показанная на фигуре 1G, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции CuAAC, происходящей между остатком AHA и цепью PEG 80.
[352] На фигуре 1Н представлен другой пример настоящего раскрытия, в котором N-конец центральной сердцевины 11d представляет собой цистеиновый остаток, связанный с соединяющей ветвью 60. Цепь PEG 80 может эффективно связываться с соединяющей ветвью 60 посредством реакции iEDDA. Эллипс 70 линкерного звена 10Н представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции iEDDA, происходящей между соединяющей ветвью 60 и цепью PEG 80.
[353] На фигуре 1I представлен альтернативный пример линкерного звена по настоящему изобретению, в котором линкерное звено 10I имеет сходную структуру с линкерным звеном 10Н на фигуре 1Н, за исключением того, что цепь PEG 80 связана с соединяющей ветвью 60 посредством реакции SPAAC. Ромб 90, показанный на фигуре 11, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC, происходящей между соединяющей ветвью 60 и цепью PEG 80.
[354] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия линкерное звено по настоящему изобретению в дополнение к первому и второму элементам дополнительно содержит третий элемент. В этом случае один из N- и С-конца центральной сердцевины представляет собой аминокислоту, имеющую азидную группу или алкиновую группу, а другой из N- и С-конца центральной сердцевины представляет собой цистеиновый остаток. Лизиновые остатки центральной сердцевины соответственно связаны со связывающими ветвями, каждая из которых имеет малеимидную группу на своем свободном конце; тогда как цистеиновый остаток центральной сердцевины связан с соединяющей ветвью, которая имеет тетразиновую группу или напряженную алкиновую группу на своем свободном конце. Как описано выше, первый элемент, таким образом, связан со связывающей ветвью посредством реакции тиольной и малеимидной групп, а второй элемент связан с соединяющей ветвью посредством реакции iEDDA. Кроме того, третий элемент связан с концевой аминокислотой, имеющей азидную группу или алкиновую группу, посредством реакции CuAAC или реакции SPAAC.
[355] Первый, второй и третий элементы, необязательно, являются разными. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия линкерное звено может иметь два различных вида нацеливающих элементов и один вид эффекторного элемента, два различных вида эффекторных элементов и один вид нацеливающего элемента или один вид нацеливающего элемента, один вид эффекторного элемента и один элемент, способный к улучшению фармакокинетического свойства линкерного звена, такого как растворимость, коэффициент очищения, период полувыведения и биодоступность.
[356] Обратимся теперь к линкерному звену 10J на фигуре 1J, в котором центральная сердцевина 11f имеет остаток HPG (G^HP) на своем N-конце и цистеиновый остаток на своем С-конце. Связывающие ветви 20 и соединяющая ветвь 60 связаны соответственно с лизиновыми (K) остатками и цистеиновым (С) остатком центральной сердцевины 11f. Кроме того, пять первых элементов 30 соответственно связаны с пятью связывающими ветвями 20, второй элемент (т.е. цепь PEG) 80 связан с соединяющей ветвью 60, а третий элемент 50 связан с остатком HPG посредством короткой цепи PEG 62. Жирная точка 40 указывает на химическую связь, образующуюся в результате реакции CuAAC, происходящей между остатком HPG и короткой цепью PEG 62; а эллипс 70 представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции IEDDA, происходящей между соединяющей ветвью 60 и цепью PEG 80.
[357] На фигуре 1K представлен другой вариант осуществления настоящего раскрытия, в котором линкерное звено 10K имеет сходную структуру с линкерным звеном 10J на фигуре 1J, за исключением того, что короткая цепь PEG 62 связана с остатком HPG посредством реакции SPAAC вместо реакции iEDDA. Ромб 90 на фигуре 1K представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC, происходящей между короткой цепью PEG 62 и остатком HPG.
[358] В предпочтительных вариантах осуществления настоящего раскрытия связывающие ветви имеют малеимидную группу на свободном конце для конъюгирования с первыми элементами, имеющими сульфгидрильную группу, посредством реакции тиольной и малеимидной групп. Кроме того, на конце пептидной сердцевины существует один цистеиновый остаток или аминокислотный остаток с азидной или алкиновой группой для прикрепления соединяющей ветви для связывания со вторым элементом.
[359] Для специалистов в данной области понятно, что можно осуществлять изменения. На свободном конце связывающих ветвей можно применять конъюгирующую группу, отличную от малеимидной, такую как азидная, алкиновая, тетразиновая или напряженная алкиновая, для связывания с первыми элементами с помощью реакции CuAAC, iEDDA или SPAAC. Кроме того, не является необходимым наличие цистеинового остатка (или аминокислотного остатка с азидной или алкиновой группой) на N- или С-конце пептидной сердцевины. Более того, в состав пептидной сердцевины можно включить два или более таких остатка для прикрепления нескольких соединяющих ветвей для связывания с множеством вторых элементов.
[360] ЧАСТЬ II. Пути применения многоветвевых линкеров на основе пептидной сердцевины
[361] По сравнению с ранее известными терапевтическими конструкциями линкерное звено по настоящему изобретению, обсуждаемое в части I, является преимущественным по двум пунктам.
(1) Количество функциональных элементов можно регулировать в соответствии с потребностями и/или путями применения. Линкерное звено по настоящему изобретению может содержать два элемента (т.е. первый и второй элементы) или три элемента (т.е. первый, второй и третий элементы) в соответствии с требованиями пути применения (например, заболеванием, подвергаемым лечению, путем введения линкерного звена по настоящему изобретению и авидностью и/или аффинностью связывания антитела, переносимого линкерным звеном по настоящему изобретению). Например, в случаях прямой доставки линкерного звена по настоящему изобретению в ткань/орган (например, при обработке глаза), один элемент, выступающий в качестве эффекторного элемента, может быть достаточным, что, таким образом, будет устранять необходимость во втором элементе, выступающем в качестве нацеливающего элемента. Однако, в случаях периферической доставки линкерного звена по настоящему изобретению (например, при пероральном, энтеральном, назальном, местном, чресслизистом введении, внутримышечной, внутривенной или внутрибрюшинной инъекции) может быть необходимым, чтобы линкерное звено по настоящему изобретению одновременно содержало нацеливающий элемент, специфично нацеливающий линкерное звено по настоящему изобретению на очаг поражения; и эффекторный элемент, проявляющий терапевтический эффект в очаге поражения. В целях повышения эффективности нацеливания или лечения или повышения стабильности линкерного звена по настоящему изобретению в линкерное звено по настоящему изобретению можно дополнительно включить третий элемент (например, второй нацеливающий элемент, второй эффекторный элемент или цепь PEG).
(2) Первый элемент представлен в форме "связки". Как описано в части I настоящего раскрытия, количество первых элементов может изменяться в зависимости от количества лизиновых остатков, содержащихся в центральной сердцевине. Если количество лизиновых остатков в центральной сердцевине находится в диапазоне от 2 до 15, то в каждом линкерном звене может содержаться по меньшей мере два первых элемента. Таким образом, вместо предоставления всего одной молекулы (например, цитотоксического лекарственного средства и антитела), что может выполняться в рамках традиционных терапевтических конструкции или способа, линкерное звено по настоящему изобретению способно предоставлять большее количество функциональных элементов (в качестве нацеливающих элементов либо в качестве эффекторных элементов) одновременно, что, таким образом, существенно улучшает терапевтический эффект.
[362] В определенных путях терапевтического применения желательным является наличие одной копии нацеливающего или эффекторного элемента. Например, при применении scFv для нацеливания на белок внеклеточного матрикса для доставки "связки" scFv для нейтрализации провоспалительного цитокина желательной является одна копия scFv, специфичного к внеклеточному белку, так чтобы можно было избежать нежелательных эффектов, обусловленных чрезмерно прочным связыванием. В другом примере при применении scFv, специфичного к CD3 или CD16a, для привлечения Т-клеток или NK-клеток для уничтожения опухолевых клеток-мишеней, связанных со "связкой" scFv, специфичных к опухолеассоциированному антигену на опухолевых клетках, желательной является одна копия scFv, специфичного к CD3 или CD16a, так чтобы можно было избежать нежелательных эффектов, обусловленных перекрестным связыванием CD3 или CD16a. В еще одном примере желательным является наличие только одной копии длинноцепочечного PEG для усиления фармакокинетических свойств. Две или более длинных цепей PEG могут обуславливать образование сплетений и влиять на свойства связывания нацеливающих или эффекторных элементов.
[363] На основании вышеперечисленных преимуществ второй аспект настоящего раскрытия относится к применению линкерного звена по настоящему изобретению. В частности, в настоящем раскрытии представлен способ лечения различных заболеваний (включающих иммунологическое нарушение, диффузную опухоль, солидную опухоль, остеопорозное заболевание и возрастную макулярную дегенерацию), при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества линкерного звена по настоящему изобретению.
[364] Первой группой заболеваний, поддающихся лечению с помощью линкерного звена по настоящему изобретению, являются иммунологические нарушения. Иллюстративные линкерные звенья, подходящие для лечения иммунологических нарушений, содержат первый элемент, который представляет собой фрагмент антитела, специфичный к провоспалительному цитокину или рецептору цитокина; или растворимый рецептор, специфичный к цитокину; и второй элемент, который представляет собой фрагмент антитела, специфичный к тканеспецифическому белку внеклеточного матрикса.
[365] В соответствии с одним вариантом осуществления линкерное звено по настоящему изобретению, подходящее для лечения псориаза, содержит в качестве первого элемента scFv, специфичный к TNF-α, IL-12/IL-23, IL-17 или рецептору IL-17; и в качестве второго элемента scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа.
[366] В соответствии с другим вариантом осуществления линкерное звено по настоящему изобретению, подходящее для лечения системной красной волчанки (SLE), кожной волчанки или синдрома Шегрена, содержит scFv, специфичный к BAFF, в качестве первого элемента и scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа, в качестве второго элемента.
[367] Некоторые кожные заболевания, такие как атопический дерматит, обыкновенная пузырчатка и некоторые типы крапивницы, которые характеризуются выраженным проявлением воспаления на коже, не лечат с помощью антител, специфично нацеливающихся на TNF-α, IL-12/IL-23, IL-17 или BAFF, поскольку для этих антител не была обнаружена достаточная эффективность. Разумно ожидать, что если эти противовоспалительные антитела распределяются благоприятным для кожи образом, то они могут быть способны лечить эти кожные заболевания.
[368] В соответствии с еще одним вариантом осуществления линкерное звено по настоящему изобретению применяют для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилоартрита. В варианте осуществления первый элемент представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12/IL-23, IL-17, IL-6R или IL-17R; а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену II типа, коллагену IX типа, коллагену XI типа или α-аггрекану.
[369] В соответствии с другим дополнительным вариантом осуществления линкерное звено по настоящему изобретению, подходящее для лечения воспалительного заболевания кишечника (например, болезни Крона и неспецифического язвенного колита), содержит scFv, специфичный к TNF-α, в качестве первого элемента и scFv, специфичный к коллагену III типа или коллагену V типа, в качестве второго элемента.
[370] При лечении диффузной опухоли (например, острого лимфоцитарного лейкоза (ALL), хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), острого миелогенного лейкоза (AML), хронического миелогенного лейкоза (CML), лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы и миеломы) первый элемент линкерного звена по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела, специфичный к антигену клеточной поверхности, ассоциированному с диффузной опухолью и/или сверхэкспрессируемому в ней; а второй элемент линкерного звена по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела, специфичный к антигену клеточной поверхности CD3 или CD16a. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия антиген клеточной поверхности, ассоциированный с диффузной опухолью и/или сверхэкспрессируемый в ней, представляет собой CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD27, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD72a, CD78, CD79a, CD79b, CD86, CD134, CD137, CD138 или CD319.
[371] Для лечения лимфомы или лейкоза, происходящих из В-лимфоцитов, первый элемент представляет собой scFv, специфичный к CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD37, CD79a или CD79b; а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к CD3 или CD16a.
[372] При лечении плазмоцитомы или множественной миеломы первый элемент представляет собой scFv, специфичный к CD38, CD78, CD138 или CD319; а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к CD3 или CD16a.
[373] Для лечения лимфомы или лейкоза, происходящих из Т-клеток, первый элемент представляет собой scFv, специфичный к CD5, CD30 или CD43; а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к CD3 или CD16a.
[374] Что касается лечения миелогенного лейкоза, первый элемент представляет собой scFv, специфичный к CD33 или CD34; а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к CD3 или CD16a.
[375] Другой группой заболеваний, поддающихся лечению с помощью линкерного звена по настоящему изобретению, являются солидные опухоли, которые могут представлять собой формы меланомы, формы карциномы пищевода, формы карциномы желудка, опухоль головного мозга, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак почки, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичника, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичка или плоскоклеточную карциному головы и шеи. В соответствии с вариантом осуществления настоящего раскрытия первый элемент линкерного звена по настоящему изобретению представляет собой пептидный гормон, фактор роста или scFv, специфичный к опухолеассоциированному антигену; а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к антигену клеточной поверхности CD3 или CD16a.
[376] В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия пептидный гормон представляет собой секретин, холецистокинин (CCK), соматостатин или тиреостимулирующий гормон (TSH).
[377] В вариантах осуществления настоящего раскрытия фактор роста выбран из группы, состоящей из эпидермального фактора роста (EGF), мутантного EGF, эпирегулина, гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (HB-EGF), фактора роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), основного фактора роста фибробластов (bFGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF).
[378] В соответствии с одним вариантом осуществления опухолеассоциированный антиген выбран из группы, состоящей из рецептора человеческого эпидермального фактора роста (HER1), HER2, HER3, HER4, углеводного антигена 19-9 (СА 19-9), углеводного антигена 125 (СА 125), раково-эмбрионального антигена (СЕА), муцина 1 (MUC 1), ганглиозида GD2, антигена, ассоциированного с меланомой (MAGE), простатического специфического мембранного антигена (PSMA), антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA), мезотелина, Tn, родственного муцину, сиалированного Tn, глобо-Н, стадиеспецифического эмбрионального антигена 4 (SSEA-4) и молекулы адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ).
[379] В некоторых случаях некоторые опухолеассоциированные антигены могут "слущиваться" с поверхности солидной опухоли субъекта и уходить в систему кровообращения субъекта. В этих случаях способ лечения солидной опухоли по настоящему изобретению включает этапы (а) проведения субъекту процедуры диализа крови с применением антитела, специфичного к одному или более опухолеассоциированным антигенам, для удаления опухолеассоциированных антигенов, "слущивающихся" с поверхности опухоли и уходящих в систему кровообращения субъекта; и (b) введения линкерного звена по настоящему изобретению для лечения солидной опухоли.
[380] Для целей лечения остеопорозного заболевания первый элемент по настоящему раскрытию представляет собой scFv, специфичный к лиганду рецептора-активатора ядерного фактора κВ (RANKL); а второй элемент по настоящему раскрытию представляет собой второй scFv, специфичный к коллагену I типа или остеонектину.
[381] В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия линкерное звено по настоящему изобретению является применимым в лечении возрастной макулярной дегенерации (AMD), при этом первый элемент линкерного звена по настоящему изобретению представляет собой scFv, специфичный к VEGF-A; а второй элемент по настоящему раскрытию представляет собой длинную цепь PEG, имеющую молекулярный вес, составляющий приблизительно 20000-50000 дальтонов.
[382] ЧАСТЬ III. Молекулярные конструкции с нацеливающими и эффекторными компонентами
[383] Другой аспект настоящего раскрытия относится к молекулярной конструкции, содержащей по меньшей мере два линкерных звена. В дополнение к многоветвевым линкерным звеньям на основе пептидной сердцевины, обсуждаемым выше в части I настоящего раскрытия, в молекулярной конструкции также можно применять линкерное звено с сердцевиной на основе химического соединения (см. ниже) в качестве одного или обоих из ее линкерных звеньев. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия по меньшей мере одно из линкерных звеньев молекулярной конструкции по настоящему изобретению содержит полипептидную сердцевину. Предпочтительно, по меньшей мере два линкерных звена молекулярной конструкции по настоящему изобретению содержат полипептидные сердцевины. Более предпочтительно, все линкерные звенья молекулярной конструкции по настоящему изобретению соответственно содержат полипептидные сердцевины.
[384] III-(i). Линкерные звенья с сердцевиной на основе химического соединения
[385] В дополнение к линкерному звену, описанному в части I настоящего раскрытия, в данном документе также раскрыто другое линкерное звено, в котором в качестве центральной сердцевины вместо полипептида используется химическое соединение. В частности, химическое соединение представляет собой бензол-1,3,5-триамин, 2-(аминометил)-2-метилпропан-1,3-диамин, трис(2-аминоэтил)амин, бензол-1,2,4,5-тетраамин, 3,3',5,5'-тетраамин-1,1'-бифенил, тетракис(2-аминоэтил)метан, тетракис(этиламин)гидразин, N,N,N',N'-тетракис(аминоэтил)этилендиамин, бензол-1,2,3,4,5,6-гексаамин, 1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-гексакис(метиламин)бензол-1,3,5-триамин, 1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N-октакис(метиламин)бензол-1,2,4,5-триамин, бензол-1,2,3,4,5,6-гексаамин или N,N-бис[(1-амино-3,3-диаминоэтил)пентил]метандиамин. Каждое из этих химических соединений имеет 3 или более аминогрупп в идентичной или симметричной конфигурации. Таким образом, если одна из аминогрупп химического соединения конъюгирована с соединяющей ветвью, то все молекулы химического соединения имеют одинаковую конфигурацию.
[386] Каждое химическое соединение, перечисленное выше, содержит множество аминогрупп, и поэтому с химическим соединением можно связать множество цепей PEG, имеющих NHS-группы, посредством образования аминной связи между аминогруппой и NHS-группой, что аналогично механизму связывания, описанному в части I настоящего раскрытия; связываемую таким образом цепь PEG обозначают как связывающую ветвь, которая имеет малеимидную группу на своем свободном конце. В то же время по меньшей мере одна из аминогрупп сердцевины на основе химического соединения связывается с другой цепью PEG, которая имеет NHS-группу на одном конце и функциональную группу (например, азидную, алкиновую, тетразиновую или напряженную алкиновую группу) на другом конце; связываемую таким образом цепь PEG обозначают как соединяющую ветвь, которая имеет функциональную группу на своем свободном конце.
[387] Соответственно, со связывающей ветвью и/или соединяющей ветвью можно соответственно связать два различных элемента посредством реакции тиольной и малеимидной групп (связывание между элементом и связывающей ветвью) и реакции CuAAC, реакции SPAAC или реакции iEDDA (связывание между элементом и соединяющей ветвью).
[388] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия связывающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев; а соединяющая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-12 повторяющихся EG-звеньев. В одном варианте осуществления как связывающая, так и соединяющая ветви имеют 12 повторяющихся EG-звеньев, при этом один конец соединяющей ветви представляет собой NHS-группу, а другой конец соединяющей ветви представляет собой алкиновую группу.
<<Схема 6. Связывание связывающей и соединяющей ветвей, имеющих соответственно малеимидную группу и азидную группу, с центральной сердцевиной>>

[389] На схемах 6 и 7 соответственно показано связывание между центральной сердцевиной и связывающей ветвью и соединяющей ветвью, при этом NHS представляет сложный NHS-эфир, Mal представляет малеимидную группу, азид представляет азидную группу, а алкин представляет алкиновую группу.
<<Схема 7. Связывание связывающей и соединяющей ветвей, имеющих соответственно малеимидную группу и алкиновую группу, с центральной сердцевиной>>

[390] Требование наличия нескольких NH₂-групп, существующих в симметричной и идентичной ориентации в химическом соединении, служащем в качестве центральной сердцевины, выдвигается по следующей причине: если одна NH₂-группа применяется для присоединения бифункциональной связывающей ветви с группой N-гидроксисукцинимидного (NHS) сложного эфира и алкиновой, азидной, тетразиновой или напряженной алкиновой группой, то продукт, а именно сердцевина с соединяющей ветвью, имеющей алкиновую, азидную, тетразиновую или напряженную алкиновую группу, является однородным и может быть очищен. Такой продукт можно затем применять для получения многоветвевых линкерных звеньев, в которых все остальные NH₂-группы присоединены к связывающим ветвям с малеимидными или другими соединяющими группами на других концах. Если химическое соединение имеет несколько NH₂-групп в несимметричных ориентациях, то продукт с одной бифункциональной связывающей ветвью/соединяющей ветвью не является однородным.
[391] Некоторые из этих симметричных химических соединений можно дополнительно модифицировать с получением центральных сердцевин с большим количеством связывающих ветвей/соединяющих ветвей. Например, тетракис(2-аминоэтил)метан, который можно синтезировать из широко распространенных химических соединений или получить коммерческим путем, можно применять в качестве сердцевины для конструирования линкерных звеньев с четырьмя связывающими ветвями/соединяющими ветвями. Тетракис(2-аминоэтил)метан может реагировать с бис(сульфосукцинимидил)субератом с получением продукта конденсации двух молекул тетракис(2-аминоэтил)метана, который можно применять в качестве сердцевины для конструирования линкерных звеньев, имеющих шесть связывающих ветвей/соединяющих ветвей. Линкерные звенья, соответственно имеющие 3 связывающие ветви/соединяющие ветви, 4 связывающие ветви/соединяющие ветви и 6 связывающих ветвей/соединяющих ветвей, могут удовлетворять большинство потребностей в конструировании нацеливающих/эффекторных молекул с конфигурацией сочлененных линкеров.
[392] Как будет понятно, количество связывающих ветвей и/или соединяющих ветвей и элементов, связанных с ними, может изменяться в зависимости от количества аминогрупп, содержащихся в центральной сердцевине. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления количество связывающих ветвей/соединяющих ветвей и соответствующих связывающихся элементов, связанных с ними, находится в диапазоне, составляющем приблизительно 1-7.
[393] Обратимся теперь к фигуре 2, на которой показан бензол-1,2,4,5-тетраамин, имеющий 4 аминогруппы. Три аминогруппы соответственно связаны со связывающими ветвями 20, а одна аминогруппа связана с соединяющей ветвью 60, которая имеет азидную группу на своем свободном конце. С тремя связывающими ветвями 20 далее соответственно связаны три первых элемента 30 посредством реакции тиольной и малеимидной групп, и с соединяющей ветвью 60 связан один второй элемент 50 посредством реакции CuAAC. Жирная точка 40, показанная на фигуре 2, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции CuAAC, происходящей между соединяющей ветвью 60 и вторым элементом 50.
[394] III-(ii). Молекулярная конструкция с конфигурацией сочлененных линкеров
[395] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция содержит два линкерных звена, и линкерные звенья соединены друг с другом посредством реакции CuAAC (с применением меди или пентаметилциклопентадиенильного комплекса хлорида рутения в качестве катализатора), реакции SPAAC либо реакции iEDDA. В вариантах осуществления одно линкерное звено связано со множеством первых элементов, выступающих в качестве нацеливающих элементов, а другое линкерное звено связано со множеством вторых элементов, выступающих в качестве эффекторных элементов.
[396] В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция содержит три линкерных звена, при этом первое и второе линкерные звенья соединены друг с другом посредством реакции iEDDA, и далее третье линкерное звено соединено с первым или вторым линкерными звеньями посредством реакции CuAAC. В качестве альтернативы, первое и второе линкерные звенья соединены друг с другом посредством реакции iEDDA, и третье линкерное звено соединено с первым или вторым линкерными звеньями посредством реакции SPAAC. В вариантах осуществления первое, второе и третье линкерные звенья соответственно несут множество первых, вторых и третьих элементов, при этом первый, второй и третий элементы являются разными. В соответствии с одним вариантом осуществления два из трех элементов (т.е. первого, второго и третьего элементов) представляют собой нацеливающие элементы, а один из трех элементов представляет собой эффекторный элемент. В соответствии с другим вариантом осуществления два из трех элементов представляют собой эффекторные элементы, а один из трех элементов представляет собой нацеливающий элемент. В соответствии с еще одним вариантом осуществления один из трех элементов представляет собой нацеливающий элемент, другой из трех элементов представляет собой эффекторный элемент, а оставшийся из трех элементов представляет собой элемент, способный к улучшению фармакокинетического свойства молекулярной конструкции, такого как растворимость, коэффициент очищения, период полувыведения и биодоступность.
[397] Сперва обратимся к фигурам 3A-3D, на которых соответственно показано связывание между двумя линкерными звеньями. На фигуре 3А показана молекулярная конструкция, содержащая два линкерных звена (100А, 200А), соединяющихся друг с другом посредством реакции iEDDA. Первое линкерное звено 100А содержит первую центральную сердцевину 110а, связывающую ветвь 120 (в качестве первой связывающей ветви) и соединяющую ветвь 130а (в качестве первой соединяющей ветви), при этом связывающая и соединяющая ветви соответственно связаны с первой центральной сердцевиной 110а на одном из концов. Аналогично, второе линкерное звено 200А содержит вторую центральную сердцевину 210а, связывающую ветвь 220 (в качестве второй связывающей ветви) и соединяющую ветвь 230а (в качестве второй соединяющей ветви), при этом связывающая и соединяющая ветви соответственно связаны со второй центральной сердцевиной 210а на одном из концов. Одна из соединяющих ветвей 130а и 230а имеет тетразиновую группу на своем свободном конце, а другая из соединяющих ветвей 130а и 230а имеет ТСО-группу. В частности, если соединяющая ветвь 130а имеет тетразиновую группу 152 на своем свободном конце (т.е. на конце, не присоединенном к первой центральной сердцевине 110а), то соединяющая ветвь 230а будет иметь ТСО-группу 154 на своем свободном конце (т.е. на конце, не присоединенном ко второй центральной сердцевине 210а), и наоборот. Соответственно, два линкерных звена (100А, 200А) соединяются друг с другом посредством реакции iEDDA, происходящей между соответствующими свободными концами соединяющих ветвей 130а и 230а. Эллипс 156, показанный на фигуре 3А, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции iEDDA, происходящей между соединяющими ветвями 130а и 230а.
[398] В показанном варианте осуществления каждая из связывающих ветвей 120 и 220 имеет малеимидную группу на своем свободном конце. Соответственно, первый нацеливающий элемент 140 и первый эффекторный элемент 240, каждый из которых имеет тиольную группу, связаны соответственно со связывающими ветвями 120 и 220 посредством реакции тиольной и малеимидной групп.
[399] В соответствии с одним вариантом осуществления как первая, так и вторая центральные сердцевины 110а и 210а, показанные на фигуре 3А, представляют собой полипептидные сердцевины. В соответствии с другим вариантом осуществления как первая, так и вторая центральные сердцевины 110а и 210а, показанные на фигуре 3А, представляют собой сердцевины на основе химического соединения. В соответствии с еще одним вариантом осуществления одна из первой и второй центральных сердцевин 110а и 210а, показанных на фигуре 3А, представляет собой полипептидную сердцевину, а другая из первой и второй центральных сердцевин 110а и 210а, показанных на фигуре 3А, представляет собой сердцевину на основе химического соединения.
[400] На фигуре 3В представлен альтернативный вариант осуществления настоящего раскрытия, в котором как первая, так и вторая центральные сердцевины 110b и 210b представляют собой полипептидные сердцевины и связаны соответственно с первым нацеливающим элементом 140 и первым эффекторным элементом 240 посредством связывающих ветвей 120 и 220. Уникальным признаком данного варианта осуществления является то, что одна из центральных сердцевин 110b и 210b содержит аминокислотный остаток, имеющий азидную группу (например, остаток AHA), на своем N- или С-конце, а другая из центральных сердцевин 110b и 210b содержит аминокислотный остаток, имеющий алкиновую группу (например, остаток HPG), на своем N- или С-конце, и такая конфигурация обеспечивает возможность непосредственного связывания центральных сердцевин 110а и 210а друг с другом, то есть без присоединения с помощью каких-либо соединяющих ветвей, как показано на фигуре 3А. В частности, если центральная сердцевина 110b содержит аминокислотный остаток, имеющий азидную группу 162, на своем N- или С-конце, то центральная сердцевина 210b будет содержать аминокислотный остаток, имеющий алкиновую группу 164, на своем N- или С-конце, и наоборот. Соответственно, линкерные звенья 100В и 200В могут непосредственно соединяться друг с другом посредством реакции CuAAC, происходящей между N- или С-концевыми аминокислотными остатками центральных сердцевин 110b и 210b. Жирная точка 166, показанная на фигуре 3В, представляет химическую связь, образующуюся между N- или С-концевыми аминокислотными остатками.
[401] Фигура 3С представляет собой другой вариант осуществления настоящего раскрытия. Линкерные звенья 100С и 200С имеют сходные структуры с линкерными звеньями 100А и 200А, за исключением того, что соединяющие ветви 130b и 230b соответственно имеют азидную группу 162 и DBCO-группу 172 вместо азидной группы 152 и алкиновой группы 154, показанных в линкерных звеньях 100А и 200А на фигуре 3А. В частности, центральная сердцевина 110а связана с соединяющей ветвью 130b (в качестве первой соединяющей ветви), имеющей азидную группу 162 на своем свободном конце; а центральная сердцевина 210а связана с соединяющей ветвью 230b (в качестве второй соединяющей ветви), имеющей DBCO-группу 172 на своем свободном конце. Линкерные звенья 100С и 200С далее соединяются друг с другом посредством реакции SPAAC, происходящей между соединяющими ветвями 130b и 230b; с образованием при этом химической связи 182, показанной в виде ромба.
[402] В одном варианте осуществления как первая, так и вторая центральные сердцевины 110а и 210а, показанные на фигуре 3С, представляют собой полипептидные сердцевины. В другом варианте осуществления как первая, так и вторая центральные сердцевины 110а и 210а, показанные на фигуре 3С, представляют собой сердцевины на основе химического соединения. В еще одном варианте осуществления одна из первой и второй центральных сердцевин 110а и 210а, показанных на фигуре 3С, представляет собой полипептидную сердцевину, а другая из первой и второй центральных сердцевин 110а и 210а, показанных на фигуре 3С, представляет собой сердцевину на основе химического соединения.
[403] Как будет понятно, два линкерных звена могут соединяться друг с другом посредством реакции CuAAC, происходящей между центральной сердцевиной и соединяющей ветвью. Обратимся теперь к фигуре 3D, на которой центральная сердцевина 110b содержит N- или С-концевой аминокислотный остаток, имеющий азидную группу 162 (например, остаток AHA), а центральная сердцевина 210а связана с соединяющей ветвью 230b, имеющей ТСО-группу 172 на своем свободном конце. Соответственно, линкерные звенья 100В и 200С могут соединяться друг с другом посредством реакции SPAAC, происходящей между центральной сердцевиной 110b и соединяющей ветвью 230b; с образованием при этом химической связи 182.
[404] В соответствии с одним вариантом осуществления линкерные звенья 100В и 200С, показанные на фигуре 3D, соответственно содержат полипептидные сердцевины. В соответствии с другим вариантом осуществления центральная сердцевина 100В, показанная на фигуре 3D, представляет собой полипептидную сердцевину, а центральная сердцевина 200С, показанная на фигуре 3D, представляет собой сердцевину на основе химического соединения.
[405] В качестве альтернативы, линкерное звено, которое содержит N- или С-концевой аминокислотный остаток, имеющий алкиновую группу (например, остаток HPG), и линкерное звено, содержащее соединяющую ветвь с азидной группой на своем свободном конце, могут соединяться друг с другом посредством азид-алкинового циклоприсоединения, происходящего между центральной сердцевиной и соединяющей ветвью.
[406] По сравнению с другими терапевтическими конструкциями молекулярная конструкция по настоящему изобретению является преимущественной по меньшей мере по трем следующим аспектам:
(1) линкерные звенья, содержащие определенные количество и/или тип нацеливающих/эффекторных элементов, можно получать независимо, а затем переходить к их соединению друг с другом посредством реакции CuAAC, реакции iEDDA или реакции SPAAC;
(2) количество и вид нацеливающих и/или эффекторных элементов можно изменять в соответствии с требованиями пути применения (например, заболеванием, подвергаемым лечению, и авидностью и/или аффинностью связывания нацеливающего и/или эффекторного элемента). Комбинацию нацеливающих и эффекторных элементов можно регулировать в соответствии с конкретными потребностями и/или путями применения. Каждый из нацеливающих и эффекторных элементов по настоящему изобретению можно изменять в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, подвергаемое лечению, физическое состояние пациента и/или тип заболевания, подвергаемого лечению. Практикующий клиницист может объединить наиболее подходящий нацеливающий элемент и наиболее подходящий эффекторный элемент, чтобы достичь наилучшего терапевтического эффекта. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия нацеливающий элемент может представлять собой фактор роста, пептидный гормон, цитокин или фрагмент антитела; а эффекторный элемент может представлять собой иммуномодулятор, хелатообразователь в комплексе с радиоактивным нуклидом, цитотоксическое лекарственное средство, цитокин, растворимый рецептор или фрагмент антитела; и
(3) по сравнению с другими реакциями присоединения реакция CuAAC, реакция iEDDA или реакция SPAAC является более эффективной в отношении соединения любых двух линкерных звеньев.
[407] Обратимся теперь к фигуре 4, на которой проиллюстрированы шесть библиотек, получаемых независимо. В этом варианте осуществления библиотеки 1-6 соответственно содержат множество линкерных звеньев 300А, 300В, 300С, 400А, 400В и 400С, связанных с функциональными элементами. Все линкерные звенья 300А, 300В и 300С сходны по структуре; при этом каждое из линкерных звеньев 300А, 300В и 300С содержит одну центральную сердцевину 310, одну соединяющую ветвь 330, связанную с ней и имеющую тетразиновую группу 350 на своем свободном конце, и определенное количество связывающих ветвей 320. Например, линкерное звено 300А содержит четыре связывающие ветви 320, и, соответственно, с четырьмя связывающими ветвями 320 могут быть соответственно связаны четыре нацеливающих элемента 340а. Аналогично, два нацеливающих элемента 340b и пять нацеливающих элементов 340с могут быть соответственно связаны с линкерными звеньями 300В и 300С. Нацеливающие элементы 340а, 340b и 340с могут быть одинаковыми или разными. Что касается линкерных звеньев 400А, 400В и 400С, каждое из этих линкерных звеньев содержит одну центральную сердцевину 410, одну соединяющую ветвь 430, связанную с ней и имеющую напряженную алкиновую группу 450 на своем свободном конце, и определенное количество связывающих ветвей 420. Как показано, три эффекторных элемента 440а, пять эффекторных элементов 440b и восемь эффекторных элементов 440с могут быть соответственно связаны с линкерными звеньями 400А, 400В и 400С. Эффекторные элементы 440а, 440b и 440с могут быть одинаковыми или разными. Библиотеки 1-6 можно получать независимо. Специалист в данной области может выбрать первое линкерное звено из библиотек 1, 2 и 3 и второе линкерное звено из библиотек 4, 5 и 6, затем перейти к соединению первого и второго линкерных звеньев посредством реакции iEDDA, происходящей между тетразиновой группой 350 и напряженной алкиновой группой 450, чтобы получить молекулярную конструкцию с определенным количеством нацеливающих и эффекторных элементов.
[408] На основании идеи библиотек можно получать молекулярные конструкции по настоящему изобретению с различными конфигурациями в зависимости от выбранных библиотек. На фигуре 5А представлен пример молекулярной конструкции по настоящему изобретению, в которой каждая из первой и второй центральных сердцевин (310, 410) связана с тремя связывающими ветвями (320, 420) и одной соединяющей ветвью (330, 430). Три первых нацеливающих элемента 340 соответственно связаны со связывающими ветвями 320; и три первых эффекторных элемента 440 соответственно связаны со связывающими ветвями 420. Два линкерных звена соединяются друг с другом посредством реакции iEDDA, происходящей между двумя соединяющими ветвями 330 и 430, с образованием при этом химической связи 356. В этой конфигурации в одной молекулярной конструкции может переноситься равное количество нескольких нацеливающих и/или эффекторных элементов.
[409] На фигуре 5В представлен другой пример молекулярной конструкции по настоящему изобретению, в которой первая и вторая центральные сердцевины соответственно содержат разные количества аминогрупп (например, лизиновых остатков), и, соответственно, молекулярная конструкция содержит неравное количество нацеливающих и эффекторных элементов. В показанном примере первая центральная сердцевина 310 связана с одной соединяющей ветвью 330 и двумя связывающими ветвями 320. Вторая центральная сердцевина 410 связана с одной соединяющей ветвью 430 и пятью связывающими ветвями 420. Соответственно, два нацеливающих элемента 340 соответственно связаны со связывающими ветвями 320; и пять эффекторных элементов 440 соответственно связаны со связывающими ветвями 420. Эллипс 356 на фигуре 5В представляет связь между двумя соединяющими ветвями 330 и 430.
[410] В необязательных вариантах осуществления молекулярная конструкция по настоящему изобретению может дополнительно содержать относительно длинную цепь PEG, присоединенную к первой либо второй центральной сердцевине, так чтобы молекулярная конструкция по настоящему изобретению могла распадаться вдали от ретикулоэндотелиальной системы и достигала более длительного периода полувыведения после введения субъекту. В случае, когда белок модифицируют цепью PEG, чтобы улучшить его фармакокинетические свойства и/или снизить иммуногенность, предпочтительным является PEG до 20000-50000 дальтонов. Соответственно, в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для присоединения нацеливающих и эффекторных элементов применяются связывающие ветви относительно более короткой длины, а цепь PEG весом 20000-50000 дальтонов присоединяют к любому из линкерных звеньев с целью увеличения периода полувыведения in vivo молекулярной конструкции по настоящему изобретению.
[411] В некоторых вариантах осуществления для конструирования молекулярной конструкции по настоящему изобретению применяют несколько scFv-фрагментов в качестве нацеливающих и/или эффекторных элементов. Фармацевтические средства с конфигурацией нацеливающий элемент/эффекторный элемент на основе молекулярных конструкций, содержащих scFv-фрагменты, должны иметь более длительные периоды полувыведения in vivo, чем отдельные фрагменты антител. Для некоторых клинических путей применения, таких как применение антитела к TNF-α и антитела к IL-12/IL-23 в лечении ревматоидного артрита, антитела к RANKL в лечении остеопороза и антитела к VEGF-A в лечении глазного заболевания возрастной макулярной дегенерации, желательными являются значительно увеличенные периоды полувыведения фармацевтических средств, чтобы устранить необходимость в частом введении лекарственных средств. В молекулярных конструкциях, применяемых в этих путях применения, цепи PEG весом 20000-50000 дальтонов можно применять в качестве связывающих ветвей для связывания с scFv-фрагментами, которые служат в качестве нацеливающих или эффекторных элементов. PEG с такими значениями длины применяли для модификации большого количества терапевтических белков для увеличения их периодов полувыведения.
[412] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия линкерное звено может содержать две связывающие ветви, соответственно связанные с различными функциональными элементами. Обратимся теперь к фигуре 6, на которой молекулярная конструкция содержит два линкерных звена 100А и 200D. Первый и второй функциональные элементы 140 и 240 (один служит в качестве нацеливающего элемента, а другой служит в качестве эффекторного элемента) связаны соответственно с первой центральной сердцевиной 110а и второй центральной сердцевиной 210с посредством связывающих ветвей 120 и 220; и две центральные сердцевины 110а и 210с соединены друг с другом посредством реакции iEDDA, происходящей между соединяющими ветвями 130а и 230а, при этом эллипс 156 представляет химическую связь, образующуюся между ними. В дополнение к функциональному элементу 240, вторая центральная сердцевина 210с дополнительно связана с цепью PEG 260. В частности, вторая центральная сердцевина 210с содержит остаток AHA, который можно подвергнуть реакции и связать с цепью PEG 260, имеющей напряженную алкиновую группу, посредством реакции SPAAC, при этом ромб 182 представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC. В зависимости от намеченного и желаемого применения третий элемент может представлять собой второй нацеливающий элемент, второй эффекторный элемент или элемент, способный к улучшению фармацевтического свойства молекулярной конструкции. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия цепь PEG 260 имеет молекулярный вес, составляющий приблизительно 20000-50000 дальтонов.
[413] На основании данной идеи линкерное звено может содержать множество связывающих ветвей, которые могут быть связаны со множеством функциональных элементов. Например, линкерное звено может содержать 5-12 связывающих ветвей, которые могут быть связаны с 5-12 функциональными элементами. Это является особенно применимым в случаях, когда функциональные элементы представляют собой малые молекулы, такие как цитотоксические лекарственные средства или агонисты Toll-подобных рецепторов. Линкерное звено, несущее несколько молекул цитотоксических лекарственных средств, называется в данном документе "связкой" лекарственных средств.
[414] Кроме того, полипептидные сердцевины можно использовать для получения молекулярной конструкции, содержащей три линкерных звена. Соответственно, другой аспект настоящего раскрытия направлен на молекулярную конструкцию, содержащую три линкерных звена. Среди трех линкерных звеньев два из них могут быть присоединены друг к другу посредством реакции iEDDA, а третье линкерное звено присоединяется к любому из двух линкерных звеньев посредством реакции SPAAC или реакции CuAAC. Логическое обоснование получения конструкций с несколькими линкерными звеньями (например, тремя линкерными звеньями) заключается в том, что в их состав можно включить два различных набора нацеливающих элементов или два различных набора эффекторных элементов.
[415] Обратимся теперь к фигуре 7А, на которой молекулярная конструкция содержит три линкерных звена (500, 600, 700А). Линкерные звенья 500, 600, 700А соответственно содержат центральную сердцевину (510, 610, 710) и связывающую ветвь (520, 620, 720) с функциональным элементом (540, 640, 740), связанным с ней. Линкерное звено 600 характеризуется тем, что оно содержит цистеиновый остаток на одном из его N- или С-конца, связанный с соединяющей ветвью 630; и аминокислотный остаток, имеющий азидную или алкиновую группу, на другом из его N- или С-конца. Перед конъюгированием одна из соединяющих ветвей 530 и 630 имеет тетразиновую группу на своем свободном конце, а другая из соединяющих ветвей 530 и 630 имеет напряженную алкиновую группу на своем свободном конце. Соответственно, линкерные звенья 500 и 600 могут соединяться друг с другом посредством реакции iEDDA, происходящей между соединяющими ветвями 530 и 630, согласно способу связывания, описанному на фигуре 3А. Что касается связывания с линкерным звеном 700А, если N- или С-концевой аминокислотный остаток центральной сердцевины 610 имеет азидную группу (например, остаток AHA), то центральная сердцевина 710 содержит аминокислоту, имеющую алкиновую группу (например, остаток HPG), на своем N- или С-конце; или если N- или С-концевой аминокислотный остаток центральной сердцевины 610 имеет алкиновую группу (например, остаток HPG), то центральная сердцевина 710 содержит аминокислоту, имеющую азидную группу (например, остаток AHA), на своем N- или С-конце. Таким образом, согласно способу связывания, описанному на фигуре 3В, линкерные звенья 600 и 700А могут непосредственно соединяться друг с другом посредством реакции CuAAC, происходящей между N- или С-концевыми аминокислотными остатками центральных сердцевин 610 и 710, без наличия соединяющих ветвей. Эллипс 560 и жирная точка 670 на фигуре 7А соответственно представляют химические связи, образующиеся в результате реакции iEDDA и реакции CuAAC.
[416] В качестве альтернативы, два из трех линкерных звеньев могут быть присоединены друг к другу посредством реакции iEDDA, а третье линкерное звено присоединяется к любому из двух линкерных звеньев посредством реакции SPAAC. Обратимся теперь к фигуре 7В, на которой линкерные звенья 500 и 600 соединены друг с другом посредством реакции iEDDA, описанной на фигуре 7А, тогда как линкерное звено 700В связано слинкерным звеном 600 посредством реакции SPAAC, происходящей между центральной сердцевиной 610 и соединяющей ветвью 730. Ромб 672 на фигуре 7В представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC.
[417] Как будет понятно, количество функциональных элементов 540, 640 и 740, соответственно связанных с линкерными звеньями 500, 600 и 700А или 700В, может быть разным в зависимости от намеченного применения. Согласно идее библиотек, показанной на фигуре 4, линкерные звенья, соответственно несущие различные количества и/или типы функциональных элементов, можно получать по отдельности в виде различных библиотек, и специалист в данной области может выбрать и объединить желаемые линкерные звенья из библиотек в соответствии с различными путями применения.
[418] В целом, соединяющую ветвь молекулярной конструкции по настоящему изобретению, описанную в вышеприведенных аспектах и/или вариантах осуществления настоящего раскрытия, которая имеет азидную, алкиновую, тетразиновую или напряженную алкиновую группу на конце, конструируют как цепь PEG, имеющую 2-12 повторов EG-звеньев. Связывающую ветвь конструируют как цепь PEG, имеющую 2-20 повторов EG-звеньев.
[419] Использование полипептида в качестве центральной сердцевины обеспечивает универсальность молекулярной конструкции по настоящему изобретению, при которой несколько копий или типов нацеливающих/эффекторных элементов могут присутствовать в одной конструкции и, соответственно, достигается повышение специфичности доставки лекарственных средств и действенности в намеченных участках-мишенях. Используемая молекулярная конструкция, содержащая несколько линкерных звеньев, может принимать большое количество конфигураций. Несколькими примерами являются: первое линкерное звено, несущее три scFv в качестве нацеливающих элементов, и второе линкерное звено, несущее 5 цитотоксических лекарственных средств; первое линкерное звено, несущее три scFv в качестве нацеливающих элементов, и второе линкерное звено, несущее три scFv в качестве эффекторных элементов; первое линкерное звено, несущее два scFv из первого набора нацеливающих элементов, второе линкерное звено, несущее два scFv из второго набора нацеливающих элементов, и третье линкерное звено, несущее 5 цитотоксических лекарственных средств; первое линкерное звено, несущее 2 bi-scFv в качестве нацеливающих элементов, и второе линкерное звено, несущее два scFv в качестве эффекторных элементов; или первое линкерное звено, несущее три scFv в качестве нацеливающих элементов, второе линкерное звено, несущее два scFv в качестве эффекторных элементов, со связывающей ветвью с прикрепленным длинноцепочечным PEG весом 20000-50000 дальтонов в целях увеличения фармакокинетических свойств.
[420] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения бифункциональный PEG, выступающий в качестве связывающей ветви, применяют для связывания антигенсвязывающих фрагментов антител, которые служат в качестве нацеливающих или эффекторных элементов, с аминогруппами, расположенными в полипептидной сердцевине. Каждый PEG может иметь NHS-группу на одном конце и малеимидную группу на другом конце. NHS-группа может соединяться с аминогруппой в полипептидной сердцевине, а малеимидная группа может соединяться с сульфгидрильной группой цистеинового остатка scFv, bi-scFv или Fab-фрагмента антитела. scFv и bi-scFv конструируют таким образом, чтобы они имели полипептидный линкер с концевым цистеиновым остатком на С-конце. Fab можно получить из целого IgG путем расщепления пепсином, и свободные сульфгидрильные группы получают из межцепочечной дисульфидной связи посредством реакции мягкого восстановления.
[421] На схемах 8-12 представлены некоторые рабочие примеры, соответственно показывающие соединение и получение определенных линкерных звеньев.
<<Схема 8. Соединение линкерных звеньев посредством С-концевых аминокислотных остатков>>

[422] Схема 8 представляет собой схематическое изображение, на котором показано получение молекулярной конструкции по настоящему изобретению в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия, в которой NHS представляет сложный NHS-эфир, Mal представляет малеимидную группу, A^AH представляет L-азидогомоаланиновый (AHA) остаток, G^HP представляет гомопропаргилглициновый (HPG) остаток, Ас представляет ацетильную группу, a scFv представляет одноцепочечный вариабельный фрагмент. На этапе 1 соответственно получают первую центральную сердцевину, содержащую аминокислотную последовательность (GSK)₃ и L-азидогомоаланиновый (AHA) остаток на своем С-конце; и вторую центральную сердцевину, содержащую аминокислотную последовательность (GSK)₅ и гомопропаргилглициновый (HPG) остаток на своем С-конце. В целях стабилизации полипептида N-концы первой и второй центральных сердцевин соответственно модифицируют ацетильной группой. На этапе 2 связывающие ветви соответственно связываются с лизиновыми остатками в первой и второй центральных сердцевинах посредством образования амидной связи между ними; связывающая ветвь, связанная с центральной сердцевиной, имеет малеимидную группу на свободном конце. На этапе 3 первый нацеливающий элемент (т.е. антитело), имеющий тиольную группу (например, цистеиновый остаток), связывается со связывающей ветвью, связанной с первой центральной сердцевиной, посредством реакции тиольной и малеимидной групп; аналогично, эффекторный элемент (т.е. лекарственное средство), имеющий тиольную группу, связывается со связывающей ветвью, связанной со второй центральной сердцевиной, посредством реакции тиольной и малеимидной групп. На этапе 4 два линкерных звена соединяются посредством реакции CuAAC, происходящей между остатками AHA и HPG.
<<Схема 9. Способ соединения эффекторного элемента с полипептидной сердцевиной посредством связывания со связывающими ветвями>>

[423] Нацеливающий/эффекторный элемент необязательно может связываться с центральной сердцевиной альтернативным способом. Схема 9 представляет собой схему, иллюстрирующую соединение эффекторного элемента с полипептидной сердцевиной, при котором сперва связывающая ветвь связывается с центральной сердцевиной, а затем эффекторный элемент (т.е. лекарственное средство) связывается со связывающей ветвью посредством реакции тиольной и малеимидной групп. В альтернативном способе на схеме 10 эффекторный элемент (т.е. лекарственное средство) соединяется со связывающей ветвью с получением конъюгата связывающая ветвь-эффектор (т.е. PEG-лекарственное средство); далее конъюгат связывающая ветвь-эффектор связывается с центральной сердцевиной посредством образования амидной связи между лизиновыми остатками и группами сложного NHS-эфира.
<<Схема 10. Альтернативный способ соединения эффекторного элемента с полипептидной сердцевиной путем сперва конъюгирования с цепью PEG, a затем связывания с аминогруппами лизиновых остатков>>

[424] В качестве альтернативы, связывающие ветви в конфигурации сочлененных линкеров также можно применять для связывания с биспецифическими scFv, которые выступают в качестве нацеливающих элементов или эффекторных элементов. Эти конфигурации будут увеличивать специфичность нацеливания и/или действенность эффекторных механизмов.
[425] На схеме 11 представлен пример получения молекулярной конструкции по настоящему изобретению, которая содержит два линкерных звена; оба линкерных звена содержат аминокислотную последовательность (K-Хаа₄)₃ и цистеиновый (С) остаток на своем С-конце. На этапе 1 две соединяющие ветви соответственно связываются с остатками С линкерных звеньев, при этом одна из соединяющих ветвей имеет малеимидную (Mal) группу на одном конце и тетразиновую группу на другом конце, а другая соединяющая ветвь имеет Mal-группу на одном конце и ТСО-группу на другом конце. На этапе 2 связывающие ветви соответственно связываются с лизиновыми (K) остатками посредством образования амидной связи между связывающей ветвью и остатком K. Далее на этапе 3 три scFv антитела к антигену А (scFv α А) и три scFv антитела к антигену В (scFv α В) соответственно связываются со связывающими ветвями линкерных звеньев посредством реакции тиольной и малеимидной групп. Наконец, на этапе 4 два линкерных звена соединяются друг с другом посредством реакции iEDDA, происходящей между тетразиновой группой и ТСО-группой.
<<Схема 11. Получение молекулярной конструкции посредством реакции iEDDA, происходящей между соединяющими ветвями>>

[426] На схеме 12 представлен пример получения молекулярной конструкции, содержащей три линкерных звена, в котором два линкерных звена, соответственно связанных с scFv α А и scFv α В, соединяются друг с другом посредством реакции iEDDA, описанной на схеме 11, а третье линкерное звено соединяется со вторым линкерным звеном посредством реакции CuAAC. В этом примере третье линкерное звено представляет собой "связку" лекарственных средств. Эту схему реакций, однако, можно применять к третьему линкерному звену с другими элементами, такими как scFv. В примере настоящего изобретения центральное линкерное звено (то есть второе линкерное звено) содержит остаток HPG (G^HP) на своем N-конце, и, соответственно, "связка" лекарственных средств, конъюгированная с остатком AHA (A^AH), может связываться со вторым линкерным звеном посредством реакции CuAAC, происходящей между остатками HPG и AHA. В качестве альтернативы, центральное линкерное звено может содержать остаток AHA на своем N- или С-конце и может связываться с третьим линкерным звеном, несущим соединяющую ветвь с DBCO или другой напряженной алкиновой группой, посредством реакции SPAAC. Образованная таким образом молекулярная конструкция на схеме 12 имеет три функциональных элемента: scFv α A, scFv α В и молекулу лекарственного средства. Молекулярные конструкции с тремя линкерными звеньями могут нести три набора scFv, из них два набора в качестве нацеливающих элементов и один набор в качестве эффекторных элементов или один набор в качестве нацеливающих элементов и два набора в качестве эффекторных элементов.
<<Схема 12. Получение молекулярной конструкции, имеющей три линкерных звена с тремя функциональными элементами>>

[427] Если все нацеливающие и эффекторные элементы представляют собой scFv и применяются связывающие ветви весом 600 дальтонов (12 EG-звеньев), то молекулярная конструкция в общей сложности с шестью scFv имеет молекулярный вес, составляющий приблизительно 170000 дальтонов. Молекулярная конструкция с семью scFv имеет молекулярный вес, составляющий приблизительно 200000 дальтонов, а молекулярная конструкция с восемью scFv имеет молекулярный вес, составляющий приблизительно 230000 дальтонов. Большинство молекулярных конструкций по настоящему изобретению имеют значения молекулярного веса, составляющие менее 200000 дальтонов, и несколько молекулярных конструкций имеют значения молекулярного веса, составляющие 200000-250000 дальтонов.
[428] Если в одной молекулярной конструкции необходимо перенести четыре различных набора scFv, то предпочтительным является наличие одного линкерного звена, несущего сочлененный одноцепочечный биспецифический scFv (bi-scFv), такой как scFv1-scFv2 (например, специфичный к HER2 и HER3), и двух других линкерных звеньев, каждое из которых несет один scFv (т.е. соответственно scFv3 и scFv4). Существует два способа конструирования биспецифического scFv1-scFv2. В "тандемной" конфигурации расположение представлено как V_L1-V_H1-V_L2-V_H2 или V_H1-V_L1-V_H2-V_L2; в конфигурации "диатела" расположение представлено как V_L2-V_L1-V_H1-V_H2 или V_H2-V_H1-V_L1-V_L2. Надлежащие полипептидные линкеры с повторами GGGGS (SEQ ID NO: 6) или других последовательностей расположены между доменами иммуноглобулинов.
[429] Как показывает практика, пептидный или PEG-линкер, который содержит малеимидную и азидную группы, может полимеризоваться при длительном хранении вследствие спонтанной реакции присоединения между малеимидной и азидной группами. Таким образом, предпочтительно, чтобы каждое линкерное звено получали заново и независимо и подвергали процессу присоединения к нацеливающим или эффекторным элементам в линкерных звеньях и незамедлительно проводили соединение линкерных звеньев посредством клик-реакции. Альтернативный предпочтительный вариант осуществления заключается в том, что как нацеливающие элементы, так и эффекторные элементы конъюгируют с линкерными звеньями с алкиновыми группами, и алкиновую группу в одном из линкерных звеньев далее превращают в азидную группу с помощью короткого гомобифункционального линкера с азидными группами на обоих концах. Линкерные звенья, одно с алкиновой группой, а другое с азидной группой, далее соединяют посредством клик-реакции.
[430] Предпочтительные связывающие ветви для настоящего изобретения представляют собой PEG. Длина связывающих ветвей важна по нескольким соображениям. Они должны быть достаточно длинными, чтобы обеспечивать гибкость связанных scFv или других типов функциональных элементов для достижения антигенных участков-мишеней на поверхности клеток-мишеней без стерических ограничений; но недостаточно длинными, чтобы обуславливать образование внутримолекулярных и межмолекулярных сплетений связывающих ветвей и связанных с ними scFv-фрагментов или функциональных элементов или излишне увеличивать размер целой молекулярной конструкции, препятствуя проникновению в ткани. Связывающие ветви, которые являются слишком длинными, также могут быть неспособны обеспечивать сближение молекул антигенов с образованием компактных кластеров, если такие кластеры необходимы для инициирования процесса передачи сигнала для осуществления апоптоза или других клеточных эффектов. Оптимальную длину связывающих ветвей для различных типов комбинаций антигенов-мишеней и связывающихся с ними средств может определить любой специалист в соответствующей области техники без проведения излишних экспериментов. Как показывает практика, в случае с CD20 в качестве антигена-мишени и Fab антитела к CD20 (ритуксимаба) в 4-ветвевом PEG-линкере ветвь PEG весом приблизительно 1000-1200 дальтонов (приблизительно 25-30 этиленгликолевых звеньев) является эффективной для вызывания апоптоза. Таким образом, PEG-линкеры весом 100-1000 дальтонов подходят для целей настоящего изобретения. Связывающая ветвь NHS-(PEG)₁₂-малеимид (примерно 500 дальтонов) является предпочтительной в ряде молекулярных конструкций по настоящему изобретению. Полностью растянутый (PEG)₁₂ имеет длину 40-50

.
[431] Применимые связывающие ветви и соединяющие ветви не ограничены цепями PEG. Можно применять пептиды, содержащие глицин, серин и другие гидрофильные аминокислотные остатки, а также полисахариды и другие биосовместимые линейные полимеры, модифицированные таким образом, что они содержат NHS- и малеимидные группы.
[432] Для определенных путей терапевтического применения желательно, чтобы эффекторные элементы в молекулярных конструкциях по настоящему раскрытию высвобождались из связывающих ветвей, так чтобы они могли поступать в клетки в участке-мишени, в том числе в клетки, связанные с нацеливающими элементами, или окружающие клетки, вызывая фармакологические эффекты. В этих случаях в связывающую ветвь встраивают расщепляемую связь. Были разработаны расщепляемые связи, восприимчивые к расщеплению путем гидролиза, воздействия кислот, восстановления и под действием ферментов. Например, в конструировании терапевтических конструкций применяли пептидные сегменты, восприимчивые к действию матриксных металлопротеиназ, присутствующих в воспаленных тканях. Один вариант осуществления настоящего изобретения заключается в применении PEG-линкеров со связью S-S рядом с малеимидной группой (NHS-PEG_2-12-S-S-малеимид), где S-S представляет собой дисульфидную связь, которую можно подвергнуть медленному восстановлению.
[433] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия нацеливающий элемент, описанный в вышеупомянутых вариантах осуществления, выбран из группы, состоящей из фактора роста, пептидного гормона, цитокина и антитела; а эффекторный элемент представляет собой иммуномодулятор, хелатообразователь в комплексе с радиоактивным нуклидом, цитотоксическое лекарственное средство, цитокин, растворимый рецептор или антитело.
[434] В вариантах осуществления антитело находится в форме антигенсвязывающего фрагмента (Fab), вариабельного фрагмента (Fv), одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), однодоменного антитела (sdAb) или биспецифического одноцепочечного вариабельного фрагмента (bi-scFv). В соответствии с одним вариантом осуществления bi-scFv представляет собой биспецифический тандемный scFv или биспецифический scFv в форме диатела.
[435] Для сохранения диффундирующей способности молекулярных конструкций предпочтительным является размер молекулы, составляющий менее 250000 дальтонов. Таким образом, scFv-фрагменты являются предпочтительными для большинства вариантов осуществления. На уровне ДНК гены конструируют так, чтобы V_L и V_H были связаны в виде единого полипептида в любом порядке (V_L-V_H или V_H-V_L) пептидным линкером из 10-25 аминокислотных остатков, преобладающими остатками в котором являются глицин и серин. На С-конце встраивают короткий фрагмент с глициновым и сериновым и концевым цистеиновым остатками. Рекомбинантные scFv и bi-scFv можно получать в бактериях, таких как Е.coli и Pseudomonas putida, в дрожжах, таких как Pichia pastoris, или в клетках млекопитающих, таких как линии клеток СНО и HEK293.
[436] В лаборатории авторов настоящего изобретения было получено большое количество антител IgG, Fab, scFv и различных фрагментов антител, белков на основе Fc и других рекомбинантных антител в линиях клеток HEK293 и СНО для проведения экспериментов в системах in vitro и в животных моделях. В лаборатории также были разработаны линии клеток для получения антител для клинических испытаний с участием людей. Для удобства можно использовать систему транзиентной экспрессии HEK293 для получения до 1 г IgG или фрагментов антител с применением нескольких колб на 1-2 литра в научно-исследовательской лаборатории. scFv-фрагменты, подлежащие применению в молекулярных конструкциях по настоящему изобретению, как правило, не имеют углеводной модификации, и углеводная модификация не требуется для активности связывания scFv с их антигенными мишенями. Более того, в scFv-фрагменте присутствует только одна дисульфидная связь и один концевой цистеин. Поэтому для получения scFv были разработаны маломасштабные бактериальные системы экспрессии в качестве производственной альтернативы. В случае с Е.coli использовали системы экспрессии для извлечения scFv из внутриклеточных телец-включений, из периплазмы и в секретируемой форме. scFv в большинстве случаев можно очищать с помощью аффинной колонки с белком L, который взаимодействует с V_H большинства легких κ-цепей, или, в других случаях, с помощью ионообменных колонок.
[437] В основе примеров настоящего изобретения лежит платформа из сочлененных линкеров, в которой в качестве нацеливающих и/или эффекторных элементов используются главным образом scFv и Fab. Однако, также можно подвергать скринингу конкретные связывающие молекулы из больших библиотек связывающих молекул на основе sdAb или других фрагментов антител. Библиотеки связывающих молекул, в основе которых не лежат домены иммуноглобулинов, но которые напоминают антитела тем, что они характеризуются аффинностью специфичного связывания с выбранными молекулами-мишенями, включают (1) аптамеры, которые представляют собой олигонуклеотиды или короткие пептиды, выбранные для связывания с молекулами-мишенями, (2) финомеры, которые представляют собой небольшие связывающие белки, полученные из домена SH3 человеческого Fyn, (3) аффимеры, которые представляют собой связывающие белки, полученные из семейства цистатинов - ингибиторов цистеиновых протеиназ, и (4) дарпины (искусственные белки с анкириновыми повторами), которые представляют собой белки, полученные методами генной инженерии, со структурами, полученными из природных белков-анкиринов, и состоят из 3, 4 или 5 повторяющихся мотивов этих белков. Эти миметики антител имеют значения молекулярного веса, составляющие приблизительно 10000-20000 дальтонов.
[438] Цитокины, факторы роста, пептидные гормоны или их природные фрагменты или синтетические аналоги также можно применять в качестве нацеливающих или эффекторных элементов. Низкомолекулярные лекарственные средства, такие как цитотоксические лекарственные средства (такие как ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин и камптотецин) и иммуностимулирующие лекарственные средства (например, мотолимод, имиквимод, резиквимод и гардиквимод), также могут связываться в качестве эффекторных элементов и переноситься в пораженные клетки- или ткани-мишени. CpG-олигонуклеотиды, липополисахариды, полученные из определенных грамотрицательных бактерий, и глюканы (такие как зимозан и β-D-глюкан), полученные из грибов, в частности, видов Aspergillus и Agaricus, обладают сильными формами иммуностимулирующей активности и также могут использоваться в качестве эффекторных элементов. Большинство из этих иммуностимулирующих веществ связываются с Toll-подобными рецепторами на различных иммуноцитах и, следовательно, активируют иммунную систему.
[439] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия по меньшей мере один из нацеливающего элемента и эффекторного элемента молекулярной конструкции по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела, специфичный к антигену клеточной поверхности. В частности, если нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к антигену клеточной поверхности, то конструкция по настоящему изобретению способна к специфичному нацеливанию на клетку/ткань/орган, на/в которых экспрессируется антиген клеточной поверхности. Что касается антитела, специфичного к антигену клеточной поверхности, которое используется в качестве эффекторного элемента конструкции по настоящему изобретению, оно может активировать либо ингибировать путь передачи сигнала посредством связывания с антигеном клеточной поверхности и, соответственно, регулировать рост/выживание/функционирование клетки/ткани/органа, на/в которых экспрессируется антиген клеточной поверхности. В соответствии с вариантами осуществления антиген клеточной поверхности может быть выбран из группы, состоящей из лиганда рецептора-активатора ядерного фактора κВ (RANKL), CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16a, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD27, CD28, CD30, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD43, CD52, CD56, CD61, CD64, CD65, CD74, CD78, CD79a, CD79b, CD80, CD86, CD134, CD137, CD138, CD319, белка 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA-4 или CD152), белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1, или CD279) и лиганда 1 белка 1 запрограммированной гибели клеток (PD-L1, или CD274). В соответствии с одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD19, CD20, CD38 или CD138; а эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD3 или CD16a, является применимой в лечении диффузных опухолей. В соответствии с другим рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к PD1, является применимой в лечении солидных опухолей. В соответствии с еще одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD79a; a эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD79b, является применимой в лечении диффузных опухолей. В соответствии с еще одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению является применимой в лечении диффузных опухолей, и нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD79b; а эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к CD79a.
[440] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия нацеливающий элемент молекулярной конструкции по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела, специфичный к опухолеассоциированному антигену, выбранному из группы, состоящей из рецептора 1 человеческого эпидермального фактора роста (HER1), рецептора 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2), рецептора 3 человеческого эпидермального фактора роста (HER3), рецептора человеческого эпидермального фактора роста (HER4), углеводного антигена 19-9 (СА 19-9), углеводного антигена 125 (СА 125), муцина 1 (MUC 1), ганглиозида GD2, ганглиозида GD3, ганглиозида GM2, фукозилированного GM1, Neu5GcGM3, антигена, ассоциированного с меланомой (MAGE), простатического специфического мембранного антигена (PSMA), антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA), мезотелина, Tn, родственного муцину, сиалированного Tn, антигена Y Льюиса, сиалированного антигена Y Льюиса, антигена А Льюиса, антигена Х Льюиса, гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (HB-EGF), глобо-Н, стадиеспецифического эмбрионального антигена 4 (SSEA-4) и рецептора трансферрина. В соответствии с одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к HER1 или HER2, является применимой в лечении опухоли/рака молочной железы. В соответствии с другим рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к PSMA, является применимой в лечении опухоли/рака предстательной железы.
[441] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия нацеливающий элемент молекулярной конструкции по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела, специфичный к тканеспецифическому белку внеклеточного матрикса, который представляет собой остеонектин, α-аггрекан, коллаген I типа, коллаген II типа, коллаген III типа, коллаген V типа, коллаген VII типа, коллаген IX типа или коллаген XI типа. В соответствии с одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену IX типа, является применимой в лечении ревматоидного артрита. В соответствии с другим рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену VII типа, является применимой в лечении псориаза. В соответствии с еще одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к α-аггрекану, является применимой в лечении анкилозирующего спондилоартрита.
[442] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия по меньшей мере один из нацеливающего элемента и эффекторного элемента по настоящему раскрытию представляет собой цитокин. В других вариантах осуществления настоящего раскрытия по меньшей мере один из нацеливающего элемента и эффекторного элемента по настоящему раскрытию представляет собой фрагмент антитела, специфичный к цитокину. В вариантах осуществления цитокин представляет собой фактор активации В-клеток (BAFF), интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-6, IL-12/IL-23, IL-17, интерферон-α (IFN-α), IFN-β, интерферон-γ (IFN-γ), фактор некроза опухоли-α (TNF-α) или трансформирующий фактор роста-β (TGF-β). В частности, если нацеливающий элемент представляет собой цитокин (например, TGF-β), то молекулярная конструкция по настоящему изобретению способна к специфичному нацеливанию на клетку/ткань/орган, на/в которых экспрессируется рецептор (например, на опухолевую клетку, на которой экспрессируется рецептор TGF-β). В том случае, если цитокин служит в качестве эффекторного элемента молекулярной конструкции по настоящему изобретению, он может активировать цитокин-ассоциированный путь передачи сигнала посредством связывания с рецептором цитокина и, соответственно, производить терапевтический эффект (например, IFN-α в качестве эффекторного элемента связывается с рецептором IFN-α и вызывает провоспалительный или противоопухолевый эффект). Что касается эффекторного элемента, который представляет собой фрагмент антитела, специфичный к цитокину, он может захватывать и нейтрализовать цитокин и, таким образом, ингибировать цитокин-ассоциированный путь передачи сигнала (например, антитело нейтрализует IL-6 и ингибирует IL-6-ассоциированное воспаление). В соответствии с одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к TNF-α или IL-17, является применимой в лечении аутоиммунных заболеваний. В соответствии с другим рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой эффекторный элемент представляет собой IFN-γ или IL-2, является применимой в лечении солидных опухолей. В соответствии с еще одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой эффекторный элемент представляет собой фрагмент ненейтрализующего антитела, специфичный к IFN-α или IL-2, является применимой в лечении солидных опухолей. В соответствии с другим дополнительным рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к BAFF, является применимой в лечении аутоиммунных заболеваний.
[443] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия растворимый рецептор является специфичным к TNF-α или IL-1. В вариантах осуществления растворимый рецептор применяют для захвата и нейтрализации цитокина без запуска ассоциированного с ним пути передачи сигнала.
[444] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия нацеливающий элемент молекулярной конструкции по настоящему изобретению представляет собой фактор роста. В других вариантах осуществления настоящего раскрытия по меньшей мере один из нацеливающего элемента и эффекторного элемента по настоящему раскрытию представляет собой фрагмент антитела, специфичный к фактору роста. В вариантах осуществления фактор роста выбран из группы, состоящей из эпидермального фактора роста (EGF), мутантного EGF, эпирегулина, гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (HB-EGF), фактора роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), основного фактора роста фибробластов (bFGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF). Согласно идее, аналогичной описанной выше, если нацеливающий элемент представляет собой фактор роста (например, EGF), то молекулярная конструкция по настоящему изобретению способна к специфичному нацеливанию на клетку/ткань/орган, на/в которых экспрессируется рецептор (например, на опухолевую клетку, на которой экспрессируется рецептор EGF). В случае, когда эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к фактору роста (например, к VEGF-A), он может захватывать и нейтрализовать данный фактор роста, ингибируя ассоциированный с ним путь передачи сигнала (например, VEGF-A-индуцированный ангиогенез). В соответствии с одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к VEGF-A, является применимой в лечении солидных опухолей.
[445] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия нацеливающий элемент молекулярной конструкции по настоящему изобретению представляет собой пептидный гормон. В других вариантах осуществления настоящего раскрытия по меньшей мере один из нацеливающего элемента и эффекторного элемента молекулярной конструкции по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела, специфичный к пептидному гормону. В вариантах осуществления пептидный гормон выбран из группы, состоящей из секретина, холецистокинина (CCK), гастрина, гастрин-высвобождающего полипептида, глюкагоноподобного полипептида 1 (GLP-1), нейромедина, адренокортикотропного гормона (АСТН), тиреостимулирующего гормона (TSH), гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH) и соматостатина. В соответствии с одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой нацеливающий элемент представляет собой CCK или соматостатин, является применимой в лечении солидных опухолей.
[446] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия эффекторный элемент молекулярной конструкции по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела, специфичный к гаптену, который выбран из группы, состоящей из динитрофенола (DNP), тринитрофенола (TNP), дансила, пенициллина, п-аминобензойной кислоты и короткого пептида, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20. В частности, если эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к гаптену, то его можно применять вместе с иммунорегуляторным эффектором, меченным этим гаптеном.
[447] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия эффекторный элемент молекулярной конструкции по настоящему изобретению является иммуномодулятором. В соответствии с вариантами осуществления иммуномодулятор представляет собой агонист Toll-подобных рецепторов. В вариантах осуществления агонист Toll-подобных рецепторов выбран из группы, состоящей из липотейхоевой кислоты, глюкана, мотолимода, имиквимода, резиквимода, гардиквимода, CpG-олигодезоксинуклеотида (CpG DON), липополисахарида (LPS), монофосфорил-липида А и зимозана. В соответствии с одним рабочим примером молекулярная конструкция по настоящему изобретению, в которой эффекторный элемент представляет собой LPS или имиквимод, является применимой в лечении солидных опухолей.
[448] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия эффекторный элемент молекулярной конструкции по настоящему изобретению представляет собой цитотоксическое лекарственное средство, выбранное из группы, состоящей из ауристатина, майтанзина, доксорубицина, калихеамицина и камптотецина.
[449] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия радиоактивный нуклид представляет собой¹¹¹In,¹³¹I или¹⁷⁷Lu. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия хелатообразователь выбран из группы, состоящей из 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA), 1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусной кислоты (МОТА), 1,4,7-триазациклононан-1,4-диуксусной кислоты (NODA) и диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA). В одном рабочем примере радиоактивный нуклид представляет собой⁹⁰Y или¹¹¹In, а хелатообразователь представляет собой DOTA. В другом рабочем примере радиоактивный нуклид представляет собой¹¹¹In, а хелатообразователь представляет собой МОТА. В еще одном рабочем примере радиоактивный нуклид представляет собой¹¹¹In, a хелатообразователь представляет собой NODA. В другом дополнительном рабочем примере радиоактивный нуклид представляет собой⁹⁰Y,¹¹¹In или¹⁷⁷Lu, a хелатообразователь представляет собой DTPA.
[450] Во многих молекулярных конструкциях по настоящему изобретению предпочтительные нацеливающие или эффекторные элементы представляют собой Fab, Fv, одноцепочечный Fv (scFv), однодоменное антитело (sdAb) или другие антигенсвязывающие фрагменты антител. В scFv между V_L и V_H или между V_H и V_L расположен полипептидный линкер с последовательностью (GGGGS)_2-5. Также можно применять другие последовательности, характеризующиеся гибкой природой и не имеющие жесткой вторичной структуры, такие как связывающие последовательности между доменами СН1 и СН2 и доменами СН2 и СН3 в некоторых изотипах человеческих иммуноглобулинов. Полипептидный линкер (GGGGS)_1-3 и концевой цистеиновый остаток размещены на С-конце scFv или другого фрагмента антитела или фактора роста, гормона или цитокина. Сульфгидрильная группа служит для конъюгирования с малеимидной группой на конце связывающих ветвей, выступающих из линкерного звена.
[451] В подходе с использованием конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), к которому проявляли очень активный интерес в последние годы, делается акцент на логически обоснованном внесении нагрузки из цитотоксических лекарственных средств к клеткам-мишеням. Однако, в типичном подходе с использованием ADC, в котором применяются восстановленные сульфгидрильные группы межцепочечных дисульфидных связей, в частности, в шарнирной области молекул антител, соотношения лекарственное средство/антитело (DAR) обычно варьируются и характеризуются распределением 1-8 среди молекул антител, конъюгированных с лекарственным средством. Также известно, что для типичного ADC среднее DAR выше 4 или 5 может обуславливать нестабильность и, следовательно, проблемы, связанные с агрегацией или осаждением молекул антител. В типичной конструкции ADC нацеливающая часть ограничена двумя антигенсвязывающими Fab- или Fv-фрагментами. В настоящем изобретении нацеливающий элемент может объединять в себе факторы роста, цитокины, гормоны в дополнение к различным фрагментам антител, а эффекторный элемент может объединять в себе широкий спектр эффекторных элементов, включающих низкомолекулярные лекарственные средства, такие как цитотоксические лекарственные средства, агонисты Toll-подобных рецепторов, хелатообразователи для радиоактивных нуклидов и белки, такие как scFv, взаимодействующие с различными иммунными факторами, клетками и/или цитокинами. В молекулярной конструкции по настоящему изобретению специфичность нацеливания повышают путем регулирования количества конкретных нацеливающих элементов и/или включения двух различных наборов нацеливающих элементов.
[452] Линкерное звено, содержащее нагрузку из цитотоксических лекарственных средств, можно получать в отдельности и затем конъюгировать с различными антителами IgG для получения конъюгатов антитело-лекарственное средство. В одной группе предпочтительных вариантов осуществления линкерное звено, содержащее любое из следующего. 3 или более цитотоксических лекарственных средств, 2 или более агонистов Toll-подобных рецепторов (например, молекул LPS), 2 или более хелатообразователей для радиоактивных нуклидов (которые также называют "связками" цитотоксических лекарственных средств, молекул LPS или хелатообразователей), можно конъюгировать с любым из двух С-концов доменов СН3 молекул IgG, специфичных к определенным антигенам-мишеням. Эти "связки" цитотоксических лекарственных средств, молекул LPS и хелатообразователей можно поставлять в исследовательские и промышленные лаборатории, производящие конъюгаты антитело-лекарственное средство, для лабораторных тестов, клинических испытаний или коммерческого распространения.
[453] В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия существует достаточная гибкость в отношении количества нацеливающих элементов и эффекторных элементов, которые можно вставить, обеспечивающая более высокую специфичность нацеливания и эффекторную активность. Линкерные звенья для нацеливающего элемента и для эффекторного элемента можно получать по отдельности перед сочленением. При получении ADC "связки" цитотоксических лекарственных средств, молекул LPS, хелатообразователей для радиоактивных нуклидов или других малых молекул можно получать по отдельности без воздействия на антитела жестких химических условий. Применяя данный подход, соотношения лекарственного средства и антитела (DAR) можно контролировать лучше, чем в случае, если лекарственные средства конъюгированы непосредственно с молекулами антител. Использование платформы из сочлененных линкеров может объединять в себе получение различных нацеливающих/эффекторных фармацевтических молекул. Другое преимущество заключается в том, что Fc IgG не содержится в молекулярных конструкциях, и потенциальные Fc-опосредованные эффекты, такие как комплемент-опосредованная активация, можно свести к минимуму, если такие эффекты не являются желаемыми.
[454] ЧАСТЬ IV. Пути применения молекулярных конструкций с нацеливающими и эффекторными компонентами
[455] Многие из этих иммунотерапевтических антител для лечения опухолей и противовоспалительных антител для лечения аутоиммунных заболеваний воздействуют на иммунную систему. Хотя предполагаемый фармакологический эффект заключается в активации иммунной системы или подавлении форм иммунной активности в участках-мишенях расположения опухолей или пораженных участках-мишенях, эффект от вводимых антител вызывает системные эффекты усиления или подавления иммунного ответа, что приводит к широкому диапазону побочных эффектов. Таким образом, основным принципом настоящего изобретения является перенос терапевтических эффекторов в пораженные участки (например, в опухоль, воспаленный участок и т.п.) при сведении к минимуму общего системного эффекта усиления иммунного ответа или подавления иммунного ответа.
[456] Молекулярная конструкция по настоящему изобретению, обсуждаемая в части III выше, имеет как нацеливающие, так и эффекторные элементы; следовательно, молекулы лекарственных средств, переносимые эффекторным элементом, направляются в намеченный участок-мишень с помощью нацеливающего элемента. Соответственно, целенаправленного лечения любого заболевания, состояния и/или нарушения можно достичь путем надлежащего выбора нацеливающих и эффекторных элементов. Соответственно, другой аспект настоящего изобретения направлен на пути применения молекулярных конструкций по настоящему изобретению (в том числе молекулярных конструкций с конфигурацией сочлененных линкеров и на основе Fc) в лечении различных заболеваний, состояний и/или нарушений. Подходящие заболевания, состояния и/или нарушения, которые можно лечить с помощью способов по настоящему изобретению, включают аутоиммунные заболевания (ревматоидный артрит, псориаз, SLE, синдром Шегрена и болезнь Крона), остеопороз, диффузные опухоли (различные типы лимфом и лейкоз), солидные опухоли, а также сухую и влажную формы возрастной макулярной дегенерации. В частности, каждый из этих способов включает введение субъекту или пациенту терапевтически эффективного количества молекулярной конструкции в соответствии с любым из вышеупомянутых аспектов/вариантов осуществления.
[457] Нацеливающие элементы, вовлеченные в конструирование нацеливающих/эффекторных фармацевтических средств для лечения вышеупомянутых заболеваний, включают scFv, специфичный к (1) коллагену I типа, коллагену II типа, коллагену III типа, коллагену V типа, коллагену VII типа, коллагену IX типа, коллагену XI типа, α-аггрекану, остеонектину и некоторым другим компонентам внеклеточного матрикса в суставах, коже или костях, (2) CD19, CD20, CD22, CD30, CD52, CD79a, CD79b, CD38, CD56, CD74, CD78, CD138, CD319, CDS, CD4, CD7, CD8, CD13, CD14, CD15, CD33, CD34, CD36, CD37, CD41, CD61, CD64, CD65, CD11c и другим поверхностным антигенам клеток лимфоидной и миелоидной линий дифференцировки и плазмоцитов, (3) EGFR, HER2/neu, HER3, TN, глобо-Н, GD-2, СА125, СА19-9 и СЕА, сверхэкспрессирующимся в солидных опухолях. Нацеливающие элементы также могут представлять собой антитела к гормонам, факторам роста или цитокинам, при этом рецепторы гормонов, факторов роста или цитокинов экспрессируются на опухолевых клетках или других пораженных клетках. Следует отметить, что многие аутоиммунные заболевания представляют собой заболевания соединительных тканей, и, следовательно, различные типы коллагена могут служить в качестве антигенов-мишеней для перемещения нацеливающих/эффекторных фармацевтических средств в соединительные ткани-мишени.
[458] Выбор эффекторных элементов для фармацевтических средств Т-Е по настоящему изобретению охватывает широкий диапазон молекул, включающий (1) scFv, специфичный к воспалительным цитокинам (таким как TNF-α, IL-12/IL-23, IL-17, IL-1, IL-6, BAFF), (2) scFv, специфичный к RANKL, (3) scFv, взаимодействующие с CD3 и CD16a, экспрессируемыми на Т-клетках и NK-клетках, (4) scFv, специфичный к PD-1, PD-L1, CTLA-4 и другим иммунным контрольным точкам, (5) цитокины, усиливающие иммунный ответ (IFN-α, IFN-γ, IL-2, TNF-α), (6) цитотоксические молекулы, (7) агонисты TLR (LPS, мотолимод, имиквимод, резиквимод, гардиквимод, CpG-олигонуклеотиды, β-глюкан, зимозан) и (9) хелатообразующие средства в комплексе с радиоактивными нуклидами.
[459] В настоящем изобретении логически обосновано, что требование к силе связывания нацеливающего элемента с молекулами-мишенями не являются постоянно одинаковыми. Для нацеливания на опухолеассоциированный антиген на поверхности опухолевых клеток-мишеней, например, с помощью scFv, специфичного к CD19, CD38, HER2/neu, EGFR, CA125, как правило, желательно, чтобы авидность связывания нацеливающего элемента с опухолеассоциированным антигеном-мишенью была высокой. Таким образом, специфичное связывание с клетками-мишенями будет усиливаться по сравнению с клетками, не экспрессирующими антигены. Более того, в случаях, когда аффинность и авидность связывания является высокой, нацеливающее/эффекторное фармацевтическое средство по-прежнему может связываться с теми клетками-мишенями, которые экспрессируют антигены-мишени при относительно низких плотностях. Вследствие этого нагрузки из эффекторных элементов, как, например, нагрузка из цитотоксических лекарственных средств, или эффекторные элементы, усиливающие иммунный ответ, имеют повышенную вероятность проявления своих эффекторных функций.
[460] Для перемещения противовоспалительных средств, таких как антитело к TNF-α, антитело к IL-17, антитело к IL-12/IL-23 и антитело к BAFF, в пораженные суставы, кожу или кишечник не обязательно, чтобы нацеливающий элемент, например, scFv, специфичный к коллагену II типа, коллагену IX типа, коллагену VII типа, коллагену I типа или остеонектину, связывался с антигенами-мишенями во внеклеточном матриксе в пораженных участках слишком прочно. Если связывание является слишком сильным, то возможно, что оно будет вызывать проявление нежелательных иммунных функций или влиять на целостность внеклеточного матрикса. Предполагается, что обильно представленный внеклеточный белок может секвестрировать терапевтические молекулы с нацеливающими компонентами; даже если авидность связывания нацеливающих компонентов с их молекулами-мишенями является невысокой. Равновесное состояние между ассоциацией и диссоциацией при связывании нацеливающего элемента фармацевтического средства Т-Е будет обуславливать повышение локальной концентрации фармацевтического средства Т-Е.
[461] В настоящем изобретении логически обосновано, что для нацеливания с помощью scFv, специфичного к коллагену II типа, коллагену I типа, коллагену VII типа, коллагену IX типа или остеонектину, авидность не является слишком высокой. В предпочтительных вариантах осуществления, если нацеливающееся антитело IgG характеризуется константой аффинности связывания с антигеном-мишенью Kd < 1×10^-9, в состав фармацевтического средства включают только один scFv, а для двух scFv, подлежащих использованию в фармацевтическом средстве, аффинность связывания нацеливающегося антитела IgG с антигеном-мишенью должна быть более низкой: 1×10^-8 > Kd > 1×10^-9. Для достижения увеличения специфичности нацеливания антитела к TNF-α на суставы, антитела к IL-17 или антитела к BAFF на кожу можно использовать два нацеливающих элемента, каждый из которых имеет разный связываемый антиген. Это будет усиливать связывание с целевой тканью-мишенью по сравнению с нормальными тканями или клетками, в которых экспрессируется один из двух антигенов-мишеней.
[462] IV-(i). Иммунологическое нарушение
[463] Молекулярные конструкции, применяемые для лечения аутоиммунных заболеваний, конструируют на основании логического обоснования того, что если антитела, специфичные к провоспалительным цитокинам, переносятся в пораженные ткани, находящиеся под влиянием этих провоспалительных цитокинов, то терапевтическая эффективность будет повышаться, а побочные эффекты уменьшаться. Цитокины, в отличие от гормонов, как правило, не циркулируют в кровяном русле и не воздействуют на отдаленные клетки-мишени. Клетки лимфатических узлов мигрируют через эфферентные лимфатические сосуды и поступают в систему лимфатической циркуляции. Продукты лимфоцитов не выходят из лимфатических узлов, передвигаясь вверх против потока крови, входящего в узлы. В действительности вводимые антитела могут поступать в лимфатические узлы через кровоток. Однако, большинство молекул цитокинов не выходит из лимфатических узлов через кровоток. Цитокины, секретируемые в регионарных лимфатических узлах, воздействуют на клетки в микроокружении лимфатических узлов. Таким образом, если антитела, нацеливающиеся на провоспалительные цитокины, в некотором смысле направить по каналам к пораженным воспаленным тканям, то меньше антител попадет в лимфатические узлы, и, следовательно, побочные эффекты уменьшатся, и больше антител попадет в пораженную ткань, и терапевтическая эффективность может повышаться.
[464] Применяя антитело к TNF-α, например, при применении таких молекулярных конструкций или фармацевтических средств, содержащих их, с применением молекулярной конструкции с scFv, специфичным к коллагену II типа, в качестве нацеливающего элемента и scFv, специфичным к TNF-α, в качестве эффекторного элемента, вводят количество молекулярной конструкции по настоящему изобретению, несущее избыточное количество эффекторного элемента (т.е. scFv, специфичного к TNF-α, в количестве, превышающем общее количество TNF-α в кровотоке). Хотя небольшое количество терапевтического средства нейтрализуется TNF-α в крови, остальное количество будет благоприятным образом локализоваться в тканях (в том числе в суставах), в которых обильно представлен коллаген II типа. Подобно многим цитокинам (также называемым интерлейкинами или лимфокинами), TNF-α оказывает воздействие главным образом в микроокружении иммунной системы. Он характеризуется очень коротким периодом полувыведения, составляющим приблизительно 1 час, и в кровотоке находится его незначительное количество. Вводимое антитело к TNF-α по настоящему изобретению главным образом не будет присутствовать в лимфоидной системе и нейтрализовать TNF-α в лимфоидной системе. Таким образом, побочные эффекты антитела к TNF-α, заключающиеся в вызывании серьезных инфекций, должны уменьшаться.
[465] В одном варианте осуществления способ по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к α-аггрекану, коллагену I типа, коллагену II типа, коллагену III типа, коллагену V типа, коллагену VII типа, коллагену IX типа или коллагену XI типа; а первый эффекторный элемент представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, IL-17, IL-1, IL-6, IL-12/IL-23, BAFF, рецептору IL-6 (IL-6R) или рецептору IL-17 (IL-17R); или растворимый рецептор TNF-α или IL-1, является применимым в лечении аутоиммунных заболеваний.
[466] IV-(i)-A. Псориаз
[467] Предпочтительной задачей настоящего изобретения является конструирование молекулярных конструкций с scFv, специфичными к коллагену I типа и коллагену VII типа, в качестве нацеливающих элементов и scFv, специфичными к TNF-α, IL-12/IL-23 или IL-17, в качестве эффекторных элементов. В одном варианте осуществления настоящего раскрытия различные молекулы Т-Е на основе конфигурации "сочлененных линкеров" содержат scFv, специфичные к коллагену I типа и/или коллагену VII типа, в качестве нацеливающих элементов и scFv, специфичные к IL-17, в качестве эффекторных элементов.
[468] В одном предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа; а первый эффекторный элемент представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, IL-12/IL-23, IL-17 или IL-17R, используют для лечения псориаза.
[469] IV-(i)-B. SLE, кожная волчанка или синдром Шегрена
[470] В настоящем изобретении scFv антител, специфичных к BAFF или IFN-α, подлежат переносу в кожу с помощью нацеливающих элементов, представляющих собой scFv, специфичные к коллагену I типа и коллагену VII типа. В одном варианте осуществления настоящего раскрытия различные молекулы Т-Е на основе конфигурации "сочлененных линкеров" содержат scFv, специфичные к коллагену I типа и/или коллагену VII типа, в качестве нацеливающих элементов и scFv, специфичные к BAFF, в качестве эффекторных элементов.
[471] В другом предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа; а первый эффекторный элемент представляет собой scFv, специфичный к BAFF, подходит для лечения SLE, кожной волчанки или синдрома Шегрена.
[472] IV-(i)-C. Ревматоидный артрит, псориатический артрит или анкилозирующий спондилоартрит
[473] В еще одном предпочтительном варианте осуществления заболевание, подвергаемое лечению с помощью способа по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену II типа, коллагену IX типа, коллагену XI типа или α-аггрекану; а первый эффекторный элемент представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, IL-1, IL-6, IL-12/IL-23, IL-17, IL-6R или IL-17R, представляет собой ревматоидный артрит, псориатический артрит или анкилозирующий спондилоартрит.
[474] IV-(i)-D. Воспалительное заболевание кишечника
[475] Было обнаружено, что коллаген I, III и V типов обильно представлен в кишечнике и толстой кишке. Логически обосновано, что поскольку коллаген I типа широко распространен в различных тканях, предпочтительно применять scFv, специфичные к коллагену III типа или коллагену V типа, в качестве нацеливающих элементов для переноса scFv, специфичного к TNF-α, в кишечник и толстую кишку пациентов с болезнью Крона или неспецифическим язвенным колитом. В одном варианте осуществления настоящего раскрытия различные молекулы Т-Е на основе конфигурации "сочлененных линкеров" содержат scFv, специфичные к коллагену III типа и/или коллагену V типа, в качестве нацеливающих элементов и scFv, специфичные к TNF-α, в качестве эффекторных элементов.
[476] В другом дополнительном предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену III типа или коллагену V типа; а первый эффекторный элемент представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, можно применять для лечения воспалительного заболевания кишечника. В соответствии с вариантом осуществления воспалительное заболевание кишечника представляет собой болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.
[477] IV-(ii). Опухоль
[478] В настоящем изобретении логически обосновано, что предпочтительный подход к нацеливанию лекарственных средств имеет два круга вопросов. Один заключается в увеличении авидности и специфичности нацеливающих средств, так чтобы с клетками-мишенями, экспрессирующими антиген при относительно низких плотностях, по-прежнему связывались нацеливающие средства. Во-вторых, терапевтические средства вносят в пораженную опухолевую ткань без необходимости в том, чтобы терапевтические средства интернализировались клетками, которые экспрессируют конкретный опухолеассоциированный антиген. Примерами таких терапевтических средств являются scFv, которые привлекают Т-клетки и NK-клетки для опосредования цитолитических эффектов в отношении клеток-мишеней. Другой группой примеров таких терапевтических средств являются агонисты Toll-подобных рецепторов, такие как молекулы LPS, и scFv, специфичные к иммунным контрольным точкам, такие как scFv, специфичные к PD-1, PD-L1 и CTLA-4, которые вызывают иммунный ответ в локальных участках. Еще одной группой примеров являются "связки" хелатообразующих средств в комплексе с радиоактивными нуклидами. При использовании многих из этих терапевтических средств цитолитические эффекты в отношении пораженных клеток и клеток-"свидетелей" можно вызвать в участках тканей независимо от уровней опухолеассоциированного антигена, экспрессируемого опухолевыми клетками.
[479] Настоящее изобретение, таким образом, охватывает ряд средств для увеличения степени относительной локализации терапевтических средств в целевом участке. Такая логически обоснованная специфичная доставка терапевтических средств в пораженные участки не ограничивается терапевтическими средствами, нацеливающимися на раковые опухоли, но также предполагает применение терапевтических средств, нацеливающихся на ткани, пораженные другими заболеваниями. Абсолютная точность мишень-специфичной доставки не является необходимой. Другими словами, не обязательно, чтобы все вводимые молекулы лекарственных средств доставлялись в намеченный пораженный участок. Поскольку уровень доставки в пораженный участок-мишень повышается по сравнению с теми же лекарственными средствами без нацеливающего элемента, терапевтические эффекты лекарственного средства должны увеличиваться, а побочные эффекты уменьшаться.
[480] IV-(ii)-A. Диффузная опухоль
[481] Предпочтительной задачей вариантов осуществления фармацевтических средств Т-Е по настоящему изобретению является использование "связок" цитотоксических лекарственных средств в конфигурации сочлененных линкеров. Сильнодействующие цитотоксические лекарственные средства включают ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин, камптотецин и другие. Предпочтительным вариантом осуществления являются 5-10 цитотоксических молекул, переносимых в линкерном звене. Для сравнения, типичные конъюгаты антитело IgG-лекарственное средство, в настоящее время одобренные или находящиеся на стадии клинической разработки, переносят два Fab-фрагмента для нацеливания и в среднем 3 или 4 молекулы цитотоксического лекарственного средства для выполнения лизиса клеток-мишеней. Молекулярная конструкция по настоящему изобретению содержит 3-5 scFv, специфичных к антигену-мишени, в качестве нацеливающих элементов и 5-10 цитотоксических молекул в качестве эффекторных элементов. Как специфичность нацеливания, так и фармакологические эффекты можно значительно усилить по сравнению с подходом с использованием типичных конъюгатов антитело-лекарственное средство. Более того, два набора scFv, взаимодействующих с двумя различными антигенами на клетках-мишенях, можно использовать в качестве нацеливающих элементов, повышая специфичность нацеливания и поглощение или интернализацию связанных конъюгатов антитело-лекарственное средство клетками-мишенями. В молекулярных конструкциях по настоящему изобретению цитотоксические молекулы конъюгированы с помощью связывающих ветвей PEG или пептидных связывающих ветвей для увеличения растворимости. Линкерное звено с нагрузкой из цитотоксических лекарственных средств получают в отдельности перед соединением с линкерным звеном, конъюгированным с нацеливающими элементами. В таком подходе растворимость линкерного звена и целых молекулярных конструкций не должна представлять проблему.
[482] Молекулярные конструкции, описанные в данном разделе, обладают большей авидностью связывания при связывании с поверхностным антигеном клеток-мишеней, но также и большей нагрузкой из токсических лекарственных средств, чем типичные конъюгаты антитело-лекарственное средство, которые были одобрены для клинических путей применения или находятся на стадии клинических испытаний. Включение нагрузки из "связок" цитотоксических лекарственных средств значительно усиливает действенность молекулярных конструкций и, таким образом, может увеличивать специфичность нацеливающих терапевтических средств. Предполагается, что эти терапевтические средства можно вводить в более низкой дозе, и для них можно достичь повышения терапевтической эффективности и снижения токсичности при лечении диффузных и солидных опухолей. Данный подход подходит не только для различных типов лимфомы и лейкоза, происходящих из В-клеток, Т-клеток и других лейкоцитов, но также является применимым для опухолей, которые несут молекулы клеточной поверхности для нацеливания антител, таких как опухоли, несущие антиген, принадлежащий к семейству рецепторов человеческого эпидермального фактора роста (EGFR), которые часто сверхэкспрессируются во многих опухолях.
[483] scFv-фрагменты антител к CD3 также могут быть конъюгированы с линкерными звеньями в качестве эффекторных элементов в тех молекулах Т-Е, которые сконструированы для нацеливания на опухолевые клетки. Включение в состав scFv, специфичного к CD3, способствует привлечению Т-клеток и прикреплению цитотоксических Т-клеток к опухолевым клеткам-мишеням. Связывание с scFv антитела к CD3 индуцирует активацию Т-клеток, что приводит к лизису контактирующих или соединенных мостиками с ними клеток-мишеней. Существуют многочисленные примеры, где биспецифические антитела, в которых антитела к CD3 объединены с фрагментами антител, специфичными к таким антигенам, как CD20, CD30 и EGFR, могут эффективно лизировать клетки-мишени, экспрессирующие эти антигены.
[484] В вышеприведенном описании определен ряд эффекторных механизмов, которые можно использовать в молекулярных конструкциях, в которые включены функции нацеливания. Эти эффекторные механизмы включают использование нагрузок из цитотоксических лекарственных средств и scFv, специфичного к CD3 или CD16a. Ассортимент эффекторов для опухолей, происходящих из В-клеток, опухолей, происходящих из Т-клеток, и некоторых других типов лейкоза, некоторые из которых имеют диффузную форму, отличается от такового для солидных опухолей. Например, в состав молекулярной конструкции для нацеливания на солидные опухоли могут быть включены средства, усиливающие иммунный ответ, такие как LPS, в качестве эффекторных элементов. Сильнодействующие IgG и антитела к CD28, усиливающие иммунный ответ, можно применять и привлекать в локальные участки расположения опухоли для стимуляции форм иммунной активности. Эти сильнодействующие средства для усиления иммунного ответа не являются применимыми в качестве терапевтических эффекторов для лечения различных типов лейкоза и диффузных опухолей.
[485] Для достижения эффекта апоптоза связывающее средство должно быть способно к перекрестному связыванию и кластеризации молекул-мишеней клеточной поверхности, таких как В-клеточные рецепторы или CD20, эффективным образом. Авторы настоящего изобретения логически обосновывают, что перекрестное связывание поверхностных молекул должно приводить к образованию "центрально-фокусированного" кластера перекрестно-связанных молекул, а не большого количества небольших скоплений на поверхности клетки-мишени. Авторы настоящего изобретения дополнительно логически обосновывают, что на достижение связывающим средством его апоптотического эффекта будет влиять ряд факторов. Многовалентность связывающего средства может усиливать его способность к перекрестному связыванию. Однако, если количество связывающих ветвей является слишком большим, то оно будет приводить к увеличению размера связывающего средства и влиять на его способность к проникновению в ткани. Связывающее средство должно эффективно связываться с поверхностью целевой клетки на плоской поверхности клетки. Поэтому связывающие ветви, такие как PEG-scFv, обладают определенной степенью гибкости и могут достигать антигенных участков-мишеней без стерических ограничений. В то же время если связывающие ветви являются слишком длинными, то эффекты перекрестного связывания и кластеризации могут не быть оптимальными или связывающие ветви достигают молекул клеточной поверхности на соседней клетке. Авторы настоящего изобретения также логически обосновывают то, что если в многоветвевом линкерном звене имеется достаточное количество связывающих ветвей, то Fab- или scFv-фрагменты могут обеспечивать большую гибкость, чем целый IgG или F(ab')₂.
[486] В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения используются вышеприведенные логические обоснования. Хотя методы авторов настоящего изобретения являются применимыми в отношении антител, специфичных к различным антигенам на различных типах клеток, в примерах авторов настоящего изобретения используются антитела, специфичные к В-клеткам и к антигенам на этих клетках, а именно CD20, CD79a/CD79b (также известному как Igα/β) и антигенным эпитопам, специфичным для изотипа иммуноглобулина, называемым migis-α и migis-β, которые представлены наружными сегментами заякоренных в мембране пептидов, выступающих с С-концов цепей α и δ мембраносвязанных иммуноглобулинов.
[487] CD20 представляет собой трансмембранный белок, представленный в качестве терапевтической мишени для лечения В-клеточных злокачественных опухолей. CD20 экспрессируется более чем на 95% В-лимфоцитов на всем пути их дифференцировки и созревания от стадии пре-В-клеток до окончательно дифференцированных плазмоцитов, но отсутствует на гемопоэтических стволовых клетках. Полагают, что CD20 на клеточной поверхности существует преимущественно в виде тетрамера. До сих пор наиболее широко применяемым лекарственным средством на основе антитела, нацеливающимся на В-клетки, является ритуксимаб, который представляет собой химерное моноклональное антитело IgG1, направленное против CD20. Накапливающиеся данные указывают на то, что ритуксимаб эффективен только для приблизительно 50% пациентов с В-клеточной лимфомой. Антитела к CD20, одобренные для клинических путей применения или находящиеся на стадии клинических испытаний с участием людей, включают химерное моноклональное антитело "С2В8" (ритуксимаб), моноклональное антитело 1F5 и химерное антитело 2Н7.
[488] Антитела, специфичные к другим поверхностным антигенам В-клеток, таким как CD19 и CD22, как правило, не вызывают литических эффектов в отношении опухолевых клеток, происходящих из В-клеток. Авторы настоящего изобретения логически обосновывают, что для увеличения специфичности и авидности связывания и для осуществления в результате клеточного лизиса клеток-мишеней будет эффективным использование scFv, специфичного к поверхностному антигену В-клеток, такому как CD19, в комбинации с scFv, специфичным к CD20. В таком пути применения scFv, специфичный к CD20, может рассматриваться как нацеливающий элемент и эффекторный элемент. В соответствии с таким логическим обоснованием большое количество CD-маркеров на В-клетках, вероятно, можно объединить с CD20, поскольку CD20 присутствует на некотором уровне в намеченных В-клеточных опухолях-мишенях. В одном варианте осуществления настоящего раскрытия различные молекулы Т-Е на основе конфигурации "сочлененных линкеров" содержат scFv, специфичные к CD20 и CD19, в качестве нацеливающих элементов и scFv, специфичные к CD3 или CD16a, а также "связки" цитотоксических лекарственных средств, в качестве эффекторных элементов.
[489] Хотя среди форм множественной миеломы существуют значительные неоднородности относительно экспрессии поверхностных антигенов, систематическое профилирование по поверхностным маркерам у отдельных пациентов может обеспечить стратегию нацеливания. В последние годы на стадии разработки находится ряд конъюгатов антитело-лекарственное средство или биспецифических антител, нацеливающихся на некоторые CD-маркеры, такие как CD38, CD138, CD78 и CD319, и другие поверхностные антигены. Авторы настоящего изобретения логически обосновывают то, что если авидность нацеливающихся антител и эффекторных механизмов можно повысить, то лечение может быть намного более специфичным и эффективным. Предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения при лечении множественной миеломы являются молекулярные конструкции, в которых используются 3 или более scFv одного или двух антител, специфичных к CD38, CD78, CD138 или CD319, в качестве нацеливающих элементов и нагрузка из лекарственных средств с 5-10 молекулами цитотоксических лекарственных средств в качестве эффекторных элементов. Также можно использовать другие эффекторные элементы, такие как scFv, специфичный к CD3 или CD16a. В одном варианте осуществления настоящего раскрытия различные молекулы Т-Е на основе конфигурации "сочлененных линкеров" содержат scFv, специфичные к CD38 и CD138, в качестве нацеливающих элементов и scFv, специфичные к CD3 или CD16a, а также "связки" цитотоксических лекарственных средств, в качестве эффекторных элементов.
[490] Для того, чтобы белок-мишень на клеточной поверхности мог подвергаться эффективному перекрестному связыванию с образованием крупного кластера, данный белок должен иметь два или более антигенных участка для связывания со связывающим средством (без помощи дополнительного перекрестно-связывающего средства). Например, поскольку каждый комплекс Igα/Igβ-BCR имеет только одну копию Igα и одну копию Igβ, связывающее средство даже с несколькими копиями Fab или scFv, специфичного к Igα или Igβ, не может индуцировать продуктивное перекрестное связывание Igα/Igβ-BCR с образованием кластера. Другими словами, 4-ветвевой линкер с 4 Fab (или scFv), специфичными к Igα, в лучшем случае обеспечит образование многих небольших структурных единиц из 4 BCR, но не сможет обеспечить образование более крупных перекрестие-связанных комплексов. Поэтому для перекрестного связывания Igα/Igβ-BCR 4-6-ветвевой линкер должен иметь 2-три scFv, специфичных к Igα, конъюгированных с одним линкерным звеном, и 2-три scFv, специфичных к Igβ, конъюгированных с другим линкерным звеном. В качестве альтернативы, 4-ветвевой линкер с scFv, специфичным к Igα, и 4-ветвевой линкер с scFv, специфичным к Igβ, вводят пациенту в комбинации.
[491] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия конструируют молекулы Т-Е, которые напоминают молекулы, конструируемые для лечения опухолей, происходящих из В-клеток. В этих конструкциях scFv, специфичные к CD-маркерам Т-клеток, используют в качестве нацеливающих элементов, а эффекторные элементы являются такими же, как используемые при нацеливании на В-клеточные опухоли. Настоящее изобретение также относится к разработке молекулярных конструкций на основе фрагментов антител к CD3 для вызывания частичной анергии или дисфункции Т-клеток без индуцирования активации Т-клеток и "цитокиновой бури". Такие конструкции можно затем применять для лечения опосредованных Т-клетками аутоиммунных заболеваний, в том числе сахарного диабета I типа, SLE, рассеянного склероза, воспалительных заболеваний кишечника и т.д. Как будет обсуждаться в более поздних разделах, в молекулярных конструкциях с различными scFv, специфичными к опухолеассоциированным антигенам, в качестве нацеливающих элементов также можно применять scFv, специфичный к CD3, в качестве эффекторного элемента для привлечения Т-клеток для устранения опухолевых клеток-мишеней.
[492] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия конструируют молекулы Т-Е, которые напоминают молекулы, конструируемые для лечения опухолей, происходящих из В-клеток. В этих конструкциях scFv, специфичные к CD-маркерам клеток миелоидной линии дифференцировки, используют в качестве нацеливающих элементов, а эффекторные элементы являются такими же, как используемые при нацеливании на В-клеточные опухоли.
[493] В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия заболевание, поддающееся лечению с помощью способа по настоящему изобретению, представляет собой опухоль, в том числе диффузную опухоль или солидную опухоль. В этих вариантах осуществления диффузная опухоль может представлять собой острый лимфоцитарный лейкоз (ALL), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), острый миелогенный лейкоз (AML), хронический миелогенный лейкоз (CML), лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому или миелому.
[494] В одном варианте осуществления настоящего раскрытия способ по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD34, CD36, CD37, CD38, CD41, CD43, CD56, CD61, CD64, CD65, CD74, CD78, CD79a, CD79b, CD80, CD138 или CD319; а первый эффекторный элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или scFv, специфичный к CD3 или CD16a, является применимым в лечении диффузной опухоли. В другом варианте осуществления настоящего раскрытия один из первого нацеливающего элемента и первого эффекторного элемента представляет собой scFv, специфичный к CD79a; а другой из первого нацеливающего элемента и первого эффекторного элемента представляет собой scFv, специфичный к CD79b. Цитотоксическое лекарственное средство необязательно выбрано из группы, состоящей из ауристатина, майтанзина, доксорубицина, калихеамицина и камптотецина.
[495] В одном предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD37, CD79a или CD79b; а первый эффекторный элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или scFv, специфичный к CD3 или CD16a, используют для лечения лимфомы или лейкоза, происходящих из В-лимфоцитов.
[496] В другом предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению, при котором один из первого нацеливающего элемента и первого эффекторного элемента представляет собой scFv, специфичный к CD79a; а другой из первого нацеливающего элемента и первого эффекторного элемента представляет собой scFv, специфичный к CD79b, используют в лечении лимфомы или лейкоза, происходящих из В-лимфоцитов.
[497] В еще одном предпочтительном варианте осуществления заболевание, подвергаемое лечению с помощью способа по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к CD38, CD78, CD138 или CD319; а первый эффекторный элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или scFv, специфичный к CD3 или CD16a, представляет собой плазмоцитому или множественную миелому.
[498] В другом дополнительном предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к CD5, CD30 или CD43; а первый эффекторный элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или scFv, специфичный к CD3 или CD16a, обладает эффектом в отношении лимфомы или лейкоза, происходящих из Т-клеток.
[499] В одном предпочтительном варианте осуществления способ по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к CD33 или CD34; а первый эффекторный элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство или scFv, специфичный к CD3 или CD16a, применяют для лечения миелогенного лейкоза.
[500] IV-(ii)-B. Солидная опухоль
[501] Настоящее изобретение относится к многоветвевым линкерам, конъюгированным с фрагментами антител, специфичными к опухолеассоциированным антигенам, перечисленным выше. Многие антитела, специфичные к опухолеассоциированным антигенам, такие как антитело к HER2/neu (трастузумаб), антитело к СА19-9 (полученное из клона 1116-NS-19-9), антитело к СА125 (полученное из клона ОС125), антитело к GD2 (моноклональное антитело ch14.18) и антитело к глобо-Н (клон VK9), легкодоступны для применения. Настоящее изобретение относится к использованию scFv или bi-scFv антител, специфичных к этим опухолеассоциированным антигенам, вместе с многоветвевым и линкерами для переноса терапевтических средств в участки расположения опухоли.
[502] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекулы Т-Е в конфигурациях "сочлененных линкеров" конструируют в виде конъюгатов нескольких копий лиганда, фактора роста, цитокина или гормона и одной или более копий терапевтического средства, переносимых в участок расположения опухоли, где пораженные клетки экспрессируют рецепторы, с которыми связывается лиганд. При таком подходе к доставке лекарственных средств будет повышаться специфичность и, следовательно, будут обеспечиваться более сильные терапевтические эффекты и более слабые побочные эффекты, чем при простом применении терапевтических средств.
[503] Лиганды, подходящие для такого подхода, включают эпидермальный фактор роста (EGF) и его мутантные формы, эпирегулин, гепарин-связывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), формы основного фактора роста фибробластов (FGF), формы фактора роста гепатоцитов (HGF), гастрин, CCK, секретин, гастрин-высвобождающий пептид, глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1), нейромедин, тиреостимулирующий гормон (TSH, или тиреотропин), адренокортикотропный гормон (АСТН), гонадотропин-высвобождающий гормон (GnRH) и соматостатин.
[504] Существует по меньшей мере четыре типа VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C и VEGF-D). Среди них VEGF-A участвует в ангиогенезе эндотелиальных клеток кровеносных сосудов. VEGF-A может связываться с рецепторами как 1, так и 2 VEGF (VEGFR1 и VEGFR2). Было обнаружено, что в случаях, когда Ser2-Asp3 на N-конце EGF подвергнут мутации по типу замены на Trp2-Val3 или Trp2-Arg3, мутантный EGF может связываться не только с HER1, но также и с HER2 и HER3 (Stortelers С. et al., Biochemistry 41: 8732-8741, 2002). Таким образом, при нацеливании с помощью EGF(W2V3), EGF(W2R3) или VEGF-A можно достичь более широкого диапазона опухолевых клеток-мишеней, чем с помощью антител, специфичных к рецепторам EGF или VEGF-A.
[505] Размеры большинства этих пептидов или белков являются относительно небольшими: EGF - 53 аминокислоты, соматостатин -14 и 28 аминокислот, секретин - 27 аминокислот, гастрин - 14-34 аминокислоты, CCK - 8-58 аминокислот, гастрин-высвобождающий пептид - 27 аминокислот, GLP-1 - 37 аминокислот, рецептор-связывающая β-цепь тиреостимулирующего гормона - 118 аминокислот, нейромедин - 10 аминокислот, АСТН - 39 аминокислот и GnRH - 10 аминокислот. VEGF-A представляет собой димер из двух пептидов длиной 120-188 аминокислот. В радиологических визуализационных исследованиях было показано, что усеченные сегменты гормонов, или факторов, или искусственно сконструированных пептидов сохраняют сравнимое или даже более сильное связывание со своими соответствующими рецепторами. Например, был сконструирован октапептид для визуализации опухолей, экспрессирующих рецепторы соматостатина.
[506] Некоторые продукты бактерий, вирусов и других микроорганизмов могут вызывать сильный иммунный ответ. Например, суперантигены, такие как стафилококковые энтеротоксины, могут активировать значительную часть Т-клеток путем одновременного связывания с антигеном МНС класса II и Т-клеточным рецептором. Большое разнообразие продуктов жизнедеятельности микроорганизмов может связываться с Toll-подобными рецепторами (TLR) и активировать широкий диапазон форм иммунной активности.
[507] Три агониста TLR были одобрены FDA для лечения определенных раковых и инфекционных заболеваний. Бацилла Кальмета-Герена, которая активирует TLR2 и TLR4, длительное время применялась в качестве вакцины против туберкулеза. В настоящее время она одобрена для применения в иммунотерапии карциномы мочевого пузыря in situ. Имиквимод, низкомолекулярный имидазохинолин, изначально разработанный в качестве противовирусного средства местного действия, который также связывается с TLR7, одобрен для применения против актинического кератоза и поверхностной базальноклеточной карциномы. Монофосфорил-липид А, производное липополисахарида (LPS) из Salmonella minnesota, которое связывается с TLR2 и TLR4, одобрен в качестве адъюванта для вакцины против вируса папилломы, который вызывает большинство случаев карциномы шейки матки.
[508] Другие агонисты TLR, которых исследовали в качестве потенциальных терапевтических иммуностимулирующих веществ, включают (1) глюканы, в том числе β-D-глюканы, получаемые из клеточной стенки определенных грибов, в частности, видов Aspergillus и Agaricus, и зимозан, получаемый из клеточной стенки определенных грибов, таких как дрожжи Saccharomyces cerevisiae, которые связываются с TLR2 и другими рецепторами иммуноцитов, (2) мотолимод, малую молекулу, которая связывается с TLR8, (3) имиквимод, пояснение о котором приведено выше, и (4) CpG-олигодезоксинуклеотиды (CpG DON), короткие однонитевые синтетические молекулы ДНК, содержащие нуклеотид С, после которого расположен нуклеотид G, которые связываются с TLR9. Эти средства, связывающиеся с TLR, как правило, активируют дендритные клетки, макрофаги, естественные клетки-киллеры, нейтрофилы и другие иммунные клетки системы естественного иммунитета и вызывают выработку большого количества воспалительных цитокинов, которые усиливают приобретенный иммунитет. Системы естественного и приобретенного иммунитета действуют синергично при удалении патологических элементов.
[509] LPS, получаемый из грамотрицательных бактерий, также называемый эндотоксином или экзогенным пирогеном, является очень сильным стимулятором иммунной системы. LPS связывается с рецепторным комплексом CD14/TLR4/MD2 на моноцитах, дендритных клетках и макрофагах, вызывает сильные ответы системы врожденного иммунитета и индуцирует выработку воспалительных цитокинов. У людей LPS при 1 мкг/кг может индуцировать шок и является мощным иммуностимулирующим средством. Системное введение немодифицированного LPS потенциально может быть очень рискованным.
[510] В настоящем изобретении логически обосновано то, что если LPS можно связать с носителем и перенести в участок расположения опухоли, то он может вызывать мощный локальный иммунный ответ in situ, обуславливать высвобождение воспалительных цитокинов, увеличивать проницаемость сосудов и привлекать различные эффекторные клетки в данный участок. Это может способствовать лизису опухолевых клеток в воспаленной ткани. Поскольку клетки в опухоли экспрессируют опухолеассоциированные антигены при различной плотности, в настоящем подходе формы иммунной активности вызываются по отношению ко всем клеткам в участке расположения опухоли независимо от плотностей опухолеассоциированных антигенов на клетках.
[511] В настоящем изобретении логически обосновано, что мощная воспалительная активность LPS будет в значительной степени ограничена участком-мишенью расположения опухоли. Соответственно, предпочтительным вариантом осуществления являются три scFv, специфичных к опухолеассоциированному антигену, конъюгированных с одним линкерным звеном, в качестве нацеливающих элементов и 2-3 молекулы LPS или монофосфорил-липида А, конъюгированные с другим линкерным звеном, в качестве эффекторных элементов. Дополнительно, два набора scFv, специфичных к двум опухолеассоциированным антигенам, можно по отдельности конъюгировать с двумя линкерными звеньями, которые затем сочленяют с образованием нацеливающего элемента.
[512] Продемонстрировано, что LPS можно конъюгировать с белком посредством линкера. Метод включает активацию LPS тетрафторборатом 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) и соединение с первичной аминогруппой белка. Эксперимент также демонстрирует, что LPS при конъюгировании с белком сохраняет 70% своей эндотоксической активности. Конъюгирование LPS с линкерным звеном по настоящему изобретению можно осуществлять, следуя аналогичной процедуре. Активацию гидроксильных групп в углеводном элементе LPS можно осуществлять путем обработки с помощью CDAP в мягких условиях в водном растворе. После этого LPS, активированный с помощью CDAP, подвергают реакции со сшивающим средством NH₂-SH, а затем с малеимидными группами связывающих ветвей линкерного звена.
[513] В настоящем изобретении логически обосновано то, что если терапевтические средства можно более специфично локализовать в пораженных участках, то можно получить более широкие терапевтические окна, и можно достичь большего количества терапевтических эффектов, и будет вызываться меньшее количество побочных эффектов. В настоящем изобретении молекулы Т-Е конструируют для переноса scFv, специфичных к иммунным контрольным точкам, таким как белок 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами, или CTLA-4 (CD152), белок 1 запрограммированной гибели клеток, или PD-1 (CD279), и лиганд 1 белка 1 запрограммированной гибели клеток, или PD-L1 (CD274 или В7-Н1), в качестве эффекторных элементов для освобождения иммунологических механизмов для разрушения раковых клеток.
[514] В настоящем изобретении логически обосновано то, что если эти цитокины привлекаются в участки расположения опухоли, то они могут вызывать сильные формы локальной иммунной активности или воспалительной активности, что затем приводит к устранению опухолей. Поэтому в настоящем изобретении используются многоветвевые линкеры для конъюгирования с scFv или bi-scFv, специфичными к иммунорегуляторным цитокинам, а не иммунорегуляторные цитокины сами по себе. Логически обоснованным является применение scFv для привлечения иммунорегуляторных цитокинов, уже присутствующих в организме и циркулирующих в крови, и для сосредоточения их в участке расположения опухоли. scFv, специфичные к цитокинам, применяемые в этих молекулярных конструкциях, не нейтрализуют формы активности цитокинов. scFv также обладают не очень высокой аффинностью связывания с цитокинами. Для этих отдельных scFv-фрагментов приемлемой является Kd в диапазоне 1-5×10^-8. В этом предпочтительном варианте осуществления каждый из scFv может потенциально привлекать несколько молекул иммунорегуляторного цитокина, приводя к увеличению терапевтических эффектов.
[515] В некоторых опухолях сверхэкспрессируются два опухолеассоциированных маркера, например, СА19-9 и рецепторы CCK/гастрина в некоторых опухолях желудочно-кишечного тракта и нейроэндокринных опухолях или глобо-Н и HER2/neu в некоторых опухолях молочной железы. В настоящем изобретении логически обосновано, что при использовании двух направляющих механизмов, в каждом из которых переносится разное эффекторное средство, например, одного с нагрузкой из цитотоксических лекарственных средств и другого с LPS, совокупные терапевтические эффекты будут сильнее, а побочные эффекты будут меньшими. В рамках предпочтительного метода терапии сперва применяют молекулярный конъюгат с LPS, антителом к PD-1, антителом к PD-L1, антителом к CTLA-4, антителом к TNF-α, антителом к IFN-γ или антителом к IFN-α, так чтобы индуцировать воспаление или иммунную активацию "in situ", что позволяет увеличить проницаемость сосудов. Если локальные воспаление или иммунная активация не могут привести к полноценным цитолитическим эффектам в отношении опухоли или пораженных клеток, то последующее введение молекулярной конструкции, несущей нагрузку из цитотоксических лекарственных средств, может обеспечивать усиление цитолитических эффектов в отношении клеток, несущих опухолеассоциированный антиген-мишень.
[516] Терапевтические эффекторы, которые можно переносить в участок-мишень расположения солидной опухоли с помощью нацеливающих компонентов, включают следующее: (1) цитотоксические лекарственные средства, которые уничтожают связанные клетки; (2) антитела к CD16a или антитела к CD3, которые индуцируют ADCC или формы цитотоксической активности; (3) LPS или другие агонисты TLR, антитела к IL-2, антитела к TNF-α, антитела к IFN-γ или антитела к IFN-α, которые активируют формы иммунной активности; (4) антитела к PD1, антитела к PD-L1, антитела к CTLA-4 или другие ингибиторы иммунных контрольных точек, которые освобождают иммунные контрольные точки и подавляют формы ингибирующей активности, осуществляемой по принципу обратной связи. Терапевтической целью этих средств является вызывание лизиса опухолевых клеток, несущих рецепторы для лиганда.
[517] В качестве примеров, в состав различных молекул Т-Е в конфигурации сочлененных линкеров включены scFv, специфичный к HER2/neu, в отдельности или в комбинации с scFv, специфичным к HER1, в качестве нацеливающих элементов и цитотоксическое лекарственное средство, LPS или scFv, специфичный к CD3, CD16a, PD1 или VEGF-A, в качестве эффекторных элементов. В состав различных молекул Т-Е в конфигурации сочлененных линкеров включены scFv, специфичный к GD2, в отдельности или в комбинации с scFv, специфичным к глобо-Н, в качестве нацеливающих элементов и цитотоксическое лекарственное средство, LPS или scFv, специфичный к CD3, CD16a, PD1 или VEGF-A, в качестве эффекторных элементов. В состав различных молекул Т-Е в конфигурации сочлененных линкеров включены холецистокинин (CCK) в отдельности или в комбинации с соматостатином в качестве нацеливающих элементов и цитотоксическое лекарственное средство, LPS или scFv, специфичный к CD3, CD16a, PD1 или VEGF-A, в качестве эффекторных элементов. В состав некоторых молекул Т-Е в конфигурации сочлененных линкеров включены scFv, специфичные к простатическому специфическому мембранному антигену (PSMA), в качестве нацеливающих элементов и scFv, специфичные к IL-2, TNF-α, IFN-α или IFN-γ, но не нейтрализующие их, в качестве эффекторных элементов.
[518] В предыдущем разделе было исследовано использование факторов роста, пептидных гормонов или цитокинов в качестве нацеливающих элементов в молекулярных конструкциях на основе многоветвевых линкерных звеньев и были описаны предпочтительные варианты осуществления. Этим пептидам или белкам, отличным от иммуноглобулинов, также можно придать конфигурацию IgG-подобных молекулярных конструкций или 2-цепочечных белков слияния на основе Fc IgG. В частности, в их состав могут быть включены факторы роста, такие как EGF или его мутантная форма, эпирегулин, HB-EGF, VEGF-A, FGF, HGF, гастрин, CCK, секретин, гастрин-высвобождающий пептид, GLP-1, нейромедин, β-цепь TSH, ACTH, GnRH или соматостатин в качестве нацеливающих элементов. Опухоли, происходящие из клеток, экспрессирующих рецепторы этих факторов роста или гормонов, часто экспрессируют эти рецепторы. В одном варианте осуществления настоящего раскрытия в молекулярные конструкции в конфигурациях белка слияния на основе Fc IgG включен EGF в качестве нацеливающего элемента. Эффекторные элементы включают в себя линкерные звенья, содержащие цитотоксические молекулы или молекулы LPS, конъюгированные с С-концевыми пептидными линкерами. Эффекторы также могут представлять собой scFv, специфичные к CD3, CD16a, PD-1 или VEGF-A. Иммунорегуляторные цитокины, такие как IFN-α, TNF-α, IL-2 и IFN-γ, могут быть включены в состав в качестве эффекторных элементов. scFv или иммунорегуляторный цитокин может экспрессироваться в качестве части рекомбинантной пептидной цепи.
[519] Настоящее изобретение также относится к предпочтительному варианту осуществления молекул Т-Е, в состав которых включены scFv, специфичные к опухолеассоциированным антигенам, в качестве нацеливающих элементов и scFv, специфичные к гаптенам, в качестве эффекторных элементов. Такие гаптены включают динитрофенол (DNP), тринитрофенол (TNP), дансильную группу, пенициллин, п-аминобензойную кислоту или короткие пептиды, получаемые из белков клеток человека, вирусов или бактерий, для которых уже имеются антитела. Например, пептид WADWPGPP из 8 аминокислотных остатков, который расположен в домене СεmX мембраносвязанного IgE на человеческих В-лимфоцитах, имеет уникальную для всей базы данных белков последовательность и не является физически доступным для антител на поверхности В-клеток. Если молекулу Т-Е с данной архитектурой вводят пациенту с опухолью, в которой экспрессируется опухолеассоциированный антиген, нацеливание на который является задачей лекарственного средства, то молекула Т-Е связывается с опухолевыми клетками и служит в участке расположения опухоли в качестве основы для привлечения вводимых после нее иммунорегуляторных антител, цитокинов или других белков, меченных гаптеном.
[520] Гаптен, которым мечена терапевтическая молекула, может быть встроен посредством пептидного линкера, такого как GGGGS или (GGGGS)₂, на С-конце антител, таких как антитела IgG, специфичные к PD-1, PD-L1, CTLA-4, VEGF-A, CD3, CD28, или иммунорегуляторных цитокинов, таких как IL-2, TNF-α, IFN-α или IFN-γ. Пептидный линкер и пептидный гаптен могут экспрессироваться в качестве части интегрального рекомбинантного белка. Линкерное звено на основе нагрузки из "связок" цитотоксических лекарственных средств также может быть мечено гаптеном с помощью связывающей ветви и привлекаться в участок расположения опухоли. При данной стратегии лечения будет увеличиваться относительное распределение терапевтических средств в пользу участка расположения опухоли и достигаться усиление терапевтических эффектов и снижение токсичности и побочных эффектов.
[521] IgG, специфичные к CD3 или CD28, являются крайне мощными активаторами Т-клеток. Системное применение этих антител может вызывать существенные "цитокиновые бури". Однако, если антитела к CD3 или антитела к CD28, активирующие Т-клетки, можно вводить в значительно сниженных количествах и сосредотачивать их в опухолевых тканях, то индуцируемые ими эффекты могут быть весьма эффективными в индуцировании форм локальной иммунной активности и воспаления и привлечении различных иммуноцитов для противодействия опухолевым клеткам. Таким образом, предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является мечение этих антител гаптеном. Меченое антитело к CD3 или CD28 затем вводят в очень незначительных количествах.
[522] Некоторые опухолеассоциированные антигены, такие как СА19-9, СА125 и раково-эмбриональный антиген (СЕА), "слущиваются" с поверхности опухолевых клеток и присутствуют в кровотоке. Выявление и измерение уровней этих антигенов в образцах сыворотки крови стали обычными анализами для предварительного выявления опухолей у людей, подвергаемых исследованию физического здоровья. Данные анализы также применяли для отслеживания эффективности терапии и статуса опухоли после лечения. Хотя другие типы опухолеассоциированных антигенов в сыворотке крови в обычной практике не анализируют, также известно, что они присутствуют в кровотоке в различных количествах.
[523] Ключевыми факторами в достижении терапевтических целей для конъюгированных с лекарственными средствами фармацевтических средств, нацеливающихся на опухоль, являются то, что терапевтические средства специфично вносят в участки-мишени расположения опухоли, и то, что минимальные количества токсичных терапевтических средств захватываются другими молекулами и тканями. Настоящее изобретение также относится к очищению от циркулирующих в крови опухолеассоциированных антигенов, таких как СА19-9, СА125 или СЕА, в случаях, когда такие опухолеассоциированные антигены представляют собой антигенные мишени для нацеливающих элементов фармацевтических средств Т-Е по настоящему изобретению. Очищение крови от опухолеассоциированного антигена можно осуществлять путем пропускания плазмы крови пациента через колонки для аффинной хроматографии, в которые упакованы смолы, конъюгированные с антителами, специфичными к намеченным опухолеассоциированным антигенам, в ходе процедуры диализа крови перед применением фармацевтических средств по настоящему изобретению, специфичных к опухолеассоциированным антигенам-мишеням.
[524] Существует несколько возможных механизмов, вызывающих лизис клетки-мишени при связывании антитела с антигеном клеточной поверхности на клетке-мишени. Эти механизмы включают апоптоз, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и комплемент-опосредованный цитолиз (CMC). Относительная важность этих трех механизмов может зависеть от антигенов-мишеней и антител, связывающихся с антигенами. В случае нацеливания на Igα или Igβ с помощью антител для вызывания лизиса В-клеток антитела IgG, специфичные к Igα или Igβ, не вызывают эффективный лизис, что позволяет предположить, что антитела неспособны обуславливать все три механизма лизиса. Антитела не осуществляют перекрестное связывание Igα или Igβ, вызывающее эффективный апоптоз, что поясняется выше в более раннем разделе. Они также, по-видимому, неспособны опосредовать эффективную ADCC и CMC. Поэтому группа исследователей разрабатывает антитело к Igβ, конъюгированное с токсином, для вызывания эффективного апоптоза. Также вполне вероятно, что антитела, специфичные к опухолеассоциированным антигенам пептидогликановой или муциновой природы, не могут индуцировать интернализацию антител и переносимых ими цитотоксических лекарственных средств.
[525] Настоящее изобретение также относится к новому методу лечения, заключающемуся в последовательном введении PEG-модифицированного связывающего средства и антитела к PEG, конъюгированного с лекарственным средством. PEG-модифицированные связывающие средства включают белковые терапевтические средства, конъюгированные с PEG для улучшения фармакокинетических свойств, и терапевтические средства на основе многоветвевых линкеров, в которых используются связывающие ветви PEG, по настоящему изобретению. В случаях, когда PEG-модифицированные связывающие средства не обуславливают эффективные механизмы цитолиза клеток-мишеней вследствие низкой плотности поверхностного антигена-мишени, недостаточного перекрестного связывания, неспособности индуцировать апоптоз или по другим причинам, цитолитический эффект усиливают или индуцируют посредством применения антитела IgG или F(ab')₂ к PEG, конъюгированного с лекарственным средством. С каждой нитью PEG может связываться несколько молекул антител IgG или F(ab')₂ к PEG, и каждой молекулой антитела IgG или F(ab')₂ к PEG может переноситься несколько молекул цитотоксического лекарственного средства. Применение бивалентного антитела IgG или F(ab')₂ к PEG может обуславливать перекрестное связывание комплексов поверхностного антигена-мишени и связывающего средства, связанного с PEG. Связывание с бивалентным антителом IgG или F(ab')₂ к PEG может вызывать агрегацию крупных комплексов (поверхностный антиген-мишень со связывающим средством, связанным с PEG, и с бивалентным антителом IgG или F(ab')₂ к PEG, конъюгированным с лекарственным средством) и приводить к интернализации таких комплексов клетками-мишенями. Интернализированное лекарственное средство будет затем вызывать цитолиз клеток-мишеней. Стратегия лечения должна быть эффективной в комбинации с применением молекулярных конструкций для нацеливания на опухолеассоциированные антигены.
[526] Такая стратегия обеспечивает повышенные связывание и специфичность связывающих средств, нацеливающихся на опухоль, усиление путем связывания с антителом к PEG, и, следовательно, большую и более специфичную нагрузку из лекарственных средств. Антитело IgG к PEG, конъюгированное с лекарственным средством, можно получить путем конструирования IgG посредством вставки линкера (GGGGS)₂ и цистеинового остатка на С-концах тяжелых γ-цепей и конъюгирования с помощью двух сульфгидрильных групп с двумя линкерными звеньями с нагрузками из цитотоксических лекарственных средств, каждая из которых содержит 3-5 молекул цитотоксического лекарственного средства.
[527] Настоящее изобретение также относится к новому методу лечения, заключающемуся в последовательном введении связанных с PEG антигенсвязывающих фрагментов антител, специфичных к опухолеассоциированному антигену, такому как СЕА, глобо-Н или SSEA4, и антитела к PEG, конъюгированного с LPS. Применение антитела IgG или F(ab')₂ к PEG, конъюгированного с LPS, вызывает сильный иммунный ответ в участке-мишени расположения опухоли. Например, пациенту с раком, характеризующимся экспрессией глобо-Н или SSEA4, сперва вводят 4-ветвевой PEG-линкер, конъюгированный с 4 scFv-фрагментами, а через определенный промежуток времени антитело IgG или F(ab')₂ к PEG, конъюгированные с LPS.
[528] В определенных вариантах осуществления настоящего раскрытия способ по настоящему изобретению является применимым для лечения солидной опухоли.
[529] В варианте осуществления первый нацеливающий элемент представляет собой пептидный гормон, фактор роста или фрагмент антитела, специфичный к опухолеассоциированному антигену; а первый эффекторный элемент представляет собой цитотоксическое лекарственное средство, агонист Toll-подобных рецепторов, хелатообразователь в комплексе с радиоактивным нуклидом, цитокин или фрагмент антитела, специфичный к фактору роста, антигену клеточной поверхности, гаптену или цитокину.
[530] В соответствии с некоторыми необязательными вариантами осуществления настоящего раскрытия в тех случаях, когда эффекторный элемент представляет собой антитело, специфичное к гаптену, способ дополнительно включает этап введения субъекту иммунорегуляторного эффектора, меченного этим гаптеном, перед введением молекулярной конструкции по настоящему изобретению.
[531] В соответствии с одним примером солидная опухоль, поддающаяся лечению с помощью способа по настоящему изобретению, может представлять собой формы меланомы, формы карциномы пищевода, формы карциномы желудка, опухоль головного мозга, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак почки, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичника, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичка или плоскоклеточную карциному головы и шеи.
[532] В соответствии с другим примером опухолеассоциированный антиген выбран из группы, состоящей из рецептора 1 человеческого эпидермального фактора роста (HER1), рецептора 2 человеческого эпидермального фактора роста (HER2), рецептора 3 человеческого эпидермального фактора роста (HER3), рецептора 4 человеческого эпидермального фактора роста (HER4), углеводного антигена 19-9 (СА 19-9), углеводного антигена 125 (СА 125), муцина 1 (MUC 1), ганглиозида GD2, ганглиозида GD3, ганглиозида GM2, фукозилированного GM1, Neu5GcGM3, антигена, ассоциированного с меланомой (MAGE), простатического специфического мембранного антигена (PSMA), антигена стволовых клеток предстательной железы (PSCA), мезотелина, Tn, родственного муцину, сиалированного Tn, антигена Y Льюиса, сиалированного антигена Y Льюиса, антигена А Льюиса, антигена Х Льюиса, гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (HB-EGF), глобо-Н и стадиеспецифического эмбрионального антигена 4 (SSEA-4).
[533] В соответствии с еще одним примером пептидный гормон выбран из группы, состоящей из секретина, гастрина, холецистокинина (CCK), гастрин-высвобождающего полипептида, глюкагоноподобного полипептида 1 (GLP-1), нейромедина, тиреостимулирующего гормона (TSH), адренокортикотропного гормона (АСТН), гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH) и соматостатина.
[534] В соответствии с еще одним примером фактор роста выбран из группы, состоящей из эпидермального фактора роста (EGF), мутантного EGF, эпирегулина, гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (HB-EGF), фактора роста эндотелия сосудов A (VEGF-A), основного фактора роста фибробластов (bFGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF). В одном рабочем примере первый нацеливающий элемент представляет собой EGF, мутантный EGF, HB-EGF, VEGF-A, bFGF или HGF. В другом рабочем примере первый эффекторный элемент представляет собой scFv, специфичный к EGF, мутантному EGF, VEGF-A, bFGF или HGF.
[535] В одном примере антиген клеточной поверхности представляет собой PD-1, PD-L1, CTLA-4, CD3, CD16a, CD28 или CD134.
[536] В другом примере гаптен представляет собой динитрофенол (DNP), тринитрофенол (TNP), дансил, пенициллин, п-аминобензойную кислоту или короткий пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
[537] В еще одном примере цитокин представляет собой IL-2, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, TGF-β или TNF-α. В соответствии с одним вариантом осуществления первый эффекторный элемент представляет собой ненейтрализующий scFv, специфичный к цитокину, выбранному из группы, состоящей из IL-2, IFN-α, IFN-γ и TNF-α.
[538] Как будет понятно, цитотоксические лекарственные средства, проявляющие цитотоксический эффект в отношении опухолевой клетки, могут представлять собой антиэстрогены (например, тамоксифен, ралоксифен и мегестрол), агонисты LHRH (например, гозерелин и леупролид), антиандрогены (например, флутамид и бикалутамид), средства фотодинамической терапии (например, вертепорфин, фталоцианин, фотосенсибилизатор Рс4 и деметоксигипокреллин А), азотистые иприты (например, циклофосфамид, ифосфамид, трофосфамид, хлорамбуцил, эстрамустин и мелфалан), нитрозомочевины (например, кармустин и ломустин), алкилсульфонаты (например, бусульфан и треосульфан), триазены (например, дакарбазин, темозоломид), платиносодержащие химические соединения (например, цисплатин, карбоплатин, оксалиплатин), алкалоиды барвинка (например, винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин), таксоиды (например, паклитаксел, доцетаксел и таксол), эпиподофиллины (например, этопозид, фосфат этопозида, тенипозид, топотекан, 9-аминокамптотецин, камптоиринотекан, иринотекан, криснатол, митомицин С), антиметаболиты, ингибиторы DHFR (например, метотрексат, дихлорметотрексат, триметрексат, эдатрексат), ингибиторы IMP-дегидрогеназы (например, микофеноловую кислоту, тиазофурин, рибавирин и EICAR), ингибиторы рибонуклеотидредуктазы (например, гидроксимочевину и дефероксамин), аналоги урацила (например, 5-фторурацил (5-FU), флоксуридин, доксифлуридин, ралтитрексед, тегафур/урацил, капецитабин), аналоги цитозина (например, цитарабин (Ara-C), цитозин-арабинозид и флударабин), аналоги пуринов (например, меркаптопурин и тиогуанин), аналоги витамина D3 (например, ЕВ 1089, СВ 1093 и KH 1060), ингибиторы изопренилирования (например, ловастатин), нейротоксины, воздействующие на дофаминергические нейроны (например, ион 1-метил-4-фенилпиридиния), ингибиторы клеточного цикла (например, стауроспорин), актиномицины (например, актиномицин D, дактиномицин), блеомицины (например, блеомицин А2, блеомицин В2, пепломицин), антрациклины (например, даунорубицин, доксорубицин, идарубицин, эпирубицин, пирарубицин, зорубицин, митоксантрон), ингибиторы MDR (например, верапамил), ингибиторы Са²⁺-АТФазы (например, тапсигаргин), иматиниб, талидомид, леналидомид, ингибиторы тирозинкиназ (например, акситиниб, бозутиниб, цедираниб, дазатиниб, эрлотиниб, гефитиниб, иматиниб, лапатиниб, лестауртиниб, нератиниб, нилотиниб, семаксаниб, сунитиниб, тоцераниб, вандетаниб, ваталаниб, ритуксимаб, нилотиниб, сорафениб), эверолимус, темсиролимус, ингибиторы протеасом (например, бортезомиб), ингибиторы mTOR (например, рапамицин, темсиролимус, эверолимус и ридафоролимус), облимерсен, гемцитабин, карминомицин, лейковорин, пеметрексед, циклофосфамид, дакарбазин, прокарбазин, преднизолон, дексаметазон, кампатецин, пликамицин, аспарагиназу, аминоптерин, метоптерин, порфиромицин, мелфалан, лейрозидин, лейрозин, хлорамбуцил, трабектедин, прокарбазин, дискодермолид, карминомицин, аминоптерин или гексаметилмеламин. В соответствии с одним конкретным вариантом осуществления настоящего раскрытия цитотоксическое лекарственное средство представляет собой ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин или камптотецин.
[539] В соответствии с вариантом осуществления агонист Toll-подобных рецепторов представляет собой липотейхоевую кислоту, глюкан, мотолимод, имиквимод, резиквимод, гардиквимод, CpG-олигодезоксинуклеотид (CpG DON), липополисахарид (LPS), монофосфорил-липид А или зимозан.
[540] IV-(iii). Остеопорозное заболевание
[541] В сети внеклеточного матрикса костей основным тканеспецифическим белком является остеонектин, также называемый секретируемым кислым белком, обогащенным цистеином (SPARC). Коллаген I типа является преобладающим белком в костном матриксе, хотя он также присутствует в соединительной ткани, подстилающей кожу.
[542] При лечении остеопороза задачей настоящего изобретения является конструирование молекул Т-Е с scFv, специфичными к остеонектину и/или коллагену I типа, в качестве нацеливающих элементов и scFv, специфичными к RANKL или склеростину, в качестве эффекторных элементов. Авторы настоящего изобретения логически обосновывают то, что если антитела к RANKL или антитела к склеростину можно преимущественно локализовать в кости, то дозу можно уменьшить, а терапевтическую эффективность увеличить. В одном варианте осуществления настоящего раскрытия различные молекулы Т-Е на основе конфигурации "сочлененных линкеров" содержат scFv, специфичные к остеонектину (SPARC) и коллагену I типа, в качестве нацеливающих элементов и scFv, специфичные к RANKL, в качестве эффекторных элементов.
[543] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия способ по настоящему изобретению, при котором первый нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или остеонектину; а первый эффекторный элемент представляет собой scFv, специфичный к лиганду рецептора-активатора ядерного фактора κВ (RANKL), является применимым в лечении остеопорозного заболевания.
[544] ЧАСТЬ V. Противовоспалительные молекулы с функциями нацеливания на ткани
[545] Иммуноглобулиновое антитело в широком смысле конфигурации на основе Fc может служить в качестве основы для нацеливающего или эффекторного элемента, и его соответствующий эффекторный или нацеливающий элемент может быть включен в его состав на С-конце его двух тяжелых γ-цепей в форме доменов scFv. В типичной конфигурации "на основе Fc" двухцепочечный Fc IgG применяют в качестве основы для молекулярной платформы. Каждая из полипептидных цепей слита с одним или двумя нацеливающими и одним или двумя эффекторными элементами, так что на каждой цепи находится в общей сложности от двух до трех элементов. Молекула Т-Е с конфигурацией на основе Fc будет иметь в общей сложности от четырех до шести элементов (например, scFv, факторов роста или цитокинов). Fc-часть молекулярных конструкций необязательно также заключает в себе Fc-опосредованные эффекторные функции, ADCC и/или комплемент-опосредованную активацию. Хотя в некоторых других путях применения такие Fc-опосредованные эффекторные функции не рассматриваются.
[546] При конструировании молекулярных конструкций на основе Fc нацеливающие элементы располагают на N- или С-конце. Если эффекторные элементы функционируют посредством связывания с компонентом клеточной поверхности, таким как CD3, CD16a, PD-1, PD-L1 или CTLA-4, то они также должны размещаться на данном конце. Если эффекторные элементы функционируют путем связывания с растворимыми факторами, такими как VEGF, TNF-α, IL-17 или BAFF, и их нейтрализации, то они могут располагаться между концевым нацеливающим или эффекторным элементом и СН2-СН3.
[547] В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия как эффекторный элемент, так и нацеливающий элемент, переносимые сегментом СН2-СН3 (или цепью СН2-СН3), состоят по большей части из аминокислотных остатков, и для целей обсуждения эти молекулярные конструкции называют противовоспалительными молекулами с функциями нацеливания на ткани или противовоспалительными молекулярными конструкциями на основе Fc. Например, эффекторный элемент может представлять собой фрагмент антитела или растворимый рецептор, а нацеливающий элемент также представляет собой фрагмент антитела. Некоторые иллюстративные структуры этих молекулярных конструкций на основе Fc обсуждаются в данном разделе.
[548] Как видно из фигуры 8А, она представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее молекулярную конструкцию 800А на основе Fc в соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия. Как проиллюстрировано, молекулярная конструкция 800А на основе Fc содержит две идентичные цепи СН2-СН3 810, первую пару эффекторных элементов Е1, связанных с N-концами цепей СН2-СН3 810, и первую пару нацеливающих элементов Т1, связанных с С-концами цепей СН2-СН3 810. В этой иллюстративной конфигурации как нацеливающий элемент Т1, так и эффекторный элемент Е1 представляют собой фрагменты антител.
[549] В некоторых вариантах осуществления цепи СН2-СН3 взяты из γ1 или γ4 человеческих иммуноглобулинов. Как правило, выбирают γ1, если желаемыми являются Fc-опосредованные функции, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-опосредованная активность (воспалительная активация или лизис клеток-мишеней). В случае, когда Fc-опосредованные функции не рассматриваются, для конструирования молекулярных конструкций на основе Fc по настоящему изобретению выбирают γ4.
[550] Молекулярная конструкция 800В на основе Fc, проиллюстрированная на фигуре 8 В, довольно сходна по структуре с молекулярной конструкцией 800А на основе Fc на фигуре 8А, за исключением того, что два эффекторных элемента Е1 соответственно связаны с С-концами цепей СН2-СН3 810, а два нацеливающих элемента Т1 соответственно связаны с N-концами цепей СН2-СН3 810.
[551] В соответствии с определенными вариантами осуществления как эффекторные элементы, так и нацеливающие элементы связаны с N-концами цепей СН2-СН3. Например, если как эффекторный элемент, так и нацеливающий элемент находятся в форме одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), то эффекторный элемент и нацеливающий элемент могут быть связаны в тандемной конфигурации или в конфигурации диатела с образованием таким образом биспецифического scFv, связанного с N-концом цепи СН2-СН3.
[552] Молекулярная конструкция 800С на основе Fc (фигура 8С) содержит Fc-часть, и, соответственно, с N-концом каждой цепи СН2-СН3 810 связан биспецифический scFv T1-E1.
[553] Как обсуждается выше, в соответствии с определенными вариантами осуществления в противовоспалительных молекулярных конструкциях на основе Fc также может применяться растворимый рецептор (например, растворимый рецептор TNF-α или IL-1) в качестве эффекторного элемента. В этих случаях молекулярная конструкция 800D на основе Fc (фигура 8D) может иметь два эффекторных элемента Е1, соответственно связанных с N-концами цепей СН2-СН3 810, и два нацеливающих элемента Т1, соответственно связанных с С-концами цепей СН2-СН3 810. Также возможно, чтобы эффекторные элементы и нацеливающие элементы были размещены соответственно на С- и N-концах цепей СН2-СН3; см., например, молекулярную конструкцию 800Е на основе Fc на фигуре 8Е.
[554] В некоторых примерах первая пара эффекторных элементов или первая пара нацеливающих элементов имеет конфигурацию Fab (т.е. состоит из домена V_H-CH1 и домена V_L-C_K); этот Fab-фрагмент связан с N-концами цепей СН2-СН3, так что молекулярная конструкция на основе Fc принимает конфигурацию IgG. В этих случаях пара элементов, которая не находится в конфигурации Fab, может быть связана с С-концами пары сегментов СН2-СН3.
[555] Например, в молекулярной конструкции 800F на основе Fc на фигуре 8F каждый из двух нацеливающих элементов Т1 содержит домен V_H-CH1 820 и домен V_L-C_K 825 с образованием таким образом конфигурации Fab 830, связанной с N-концами цепей СН2-СН3 810, так что молекулярная конструкция 800F на основе Fc принимает конфигурацию IgG. В этом случае пара эффекторных элементов Е1 связана с С-концами пары цепей СН2-СН3 810.
[556] Как описано выше, молекулярная конструкция на основе Fc по настоящему изобретению может переносить в общей сложности не более шести элементов. Дополнительные элементы могут представлять собой вторую пару эффекторных элементов или вторую пару нацеливающих элементов.
[557] В соответствии с другим вариантом осуществления молекулярная конструкция 900А на основе Fc (фигура 9А) содержит вторую пару нацеливающих элементов Т2. В этих случаях нацеливающие элементы Т1 и Т2 связаны в тандемной конфигурации или в конфигурации диатела с образованием биспецифического scFv, связанного с N-концом цепи СН2-СН3 910, а эффекторный элемент Е1 связан с С-концом цепи СН2-СН3 910.
[558] В соответствии с вариантами осуществления, поясняемыми на примере на фигуре 9В, молекулярная конструкция 900В на основе Fc содержит вторую пару эффекторных элементов Е2. В этих случаях эффекторные элементы Е1 и Е2 связаны в тандемной конфигурации или в конфигурации диатела с образованием биспецифического scFv, связанного с N-концом цепи СН2-СН3 910, а нацеливающий элемент Т1 связан с С-концом цепи СН2-СН3 910.
[559] Теперь, когда основные типы структурной организации противовоспалительных молекулярных конструкций на основе Fc были обсуждены выше, определенные комбинации конкретного(конкретных) эффекторного(эффекторных) элемента(элементов) и нацеливающего(нацеливающих) элемента(элементов) представлены ниже для целей иллюстрации.
[560] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эффекторный элемент представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену II типа, или коллагену IX типа, или α-аггрекану. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления каждый из двух эффекторных элементов представляет собой scFv, специфичный к IL-17, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа. Опять же в качестве альтернативы, каждый из двух эффекторных элементов представляет собой scFv, специфичный к BAFF, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа. В некоторых вариантах осуществления каждый из двух эффекторных элементов представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену III типа или коллагену V типа. В некоторых других вариантах осуществления два эффекторных элемента находятся в форме Fab, специфичного к RANKL, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или остеонектину. Например, такая молекулярная конструкция может иметь любую из конфигураций, показанных на фигурах 8А-8С и 8F.
[561] В некоторых вариантах осуществления первая пара эффекторных элементов содержит scFv, специфичный к TNF-α, или scFv, специфичный к IL-17, а первая пара нацеливающих элементов содержит scFv, специфичный к коллагену II типа, или scFv, специфичный к коллагену IX типа. В некоторых альтернативных вариантах осуществления первая пара эффекторных элементов содержит scFv, специфичный к TNF-α, или scFv, специфичный к IL-17, а первая пара нацеливающих элементов содержит scFv, специфичный к коллагену I типа, или scFv, специфичный к коллагену VII типа. В качестве альтернативы, каждый из двух эффекторных элементов представляет собой scFv, специфичный к BAFF, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа. Опять же в качестве альтернативы, каждый из двух эффекторных элементов представляет собой scFv, специфичный к RANKL, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или остеонектину. Эти молекулярные конструкции могут иметь любую из конфигураций, показанных на фигурах 8В, 8D и 8F.
[562] В определенных вариантах осуществления два эффекторных элемента находятся в форме Fab антитела, специфичного к TNF-α, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену II типа или коллагену IX типа. В некоторых вариантах осуществления два эффекторных элемента находятся в форме Fab антитела, специфичного к IL-17, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа. В качестве альтернативы, два эффекторных элемента находятся в форме Fab антитела, специфичного к BAFF, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа. Опять же в качестве альтернативы, два эффекторных элемента находятся в форме Fab антитела, специфичного к TNF-α, а нацеливающий элемент представляет собой scFv, специфичный к коллагену III типа или коллагену V типа.
[563] Сущностью настоящего изобретения являются логическое обоснование и идея использования конкретной комбинации или составления пар нацеливающих и эффекторных элементов. Использование конфигурации слияния с Fc в молекулярных конструкциях является предпочтительным вариантом осуществления. Для специалистов в данной области возможным является связывание пар нацеливающих и эффекторных элементов по настоящему изобретению с использованием других молекулярных платформ, таких как пептиды, белки (например, альбумин), полисахариды, полиэтиленгликоль и другие типы полимеров, которые служат в качестве структурной основы для прикрепления нескольких молекулярных элементов.
[564] ЧАСТЬ VI. Пути применения противовоспалительных молекул с функциями нацеливания на ткани
[565] Другой аспект настоящего раскрытия направлен на применение противовоспалительных молекулярных конструкций на основе Fc, обсуждаемых выше в части V.
[566] Как можно понять, описание из части IV-(i), относящееся к логическим обоснованиям, лежащим в основе выбора подходящих нацеливающих и эффекторных элементов, также является применимым в данном разделе. Например, противовоспалительные молекулярные конструкции на основе Fc, применяемые для лечения различных иммунологических нарушений, содержат фрагменты антител (например, scFv, Fab и т.п.), специфичные к коллагену II типа, коллагену XI типа или α-аггрекану, применяемые в качестве нацеливающих элементов, и фрагменты антител (например, scFv, Fab и т.п.), специфичные к TNF-α или IL-17, в качестве эффекторных элементов.
[567] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия способ лечения по настоящему изобретению включает введение подходящей противовоспалительной молекулярной конструкции на основе Fc субъекту, нуждающемуся в таком лечении. Конкретные примеры противовоспалительных молекулярных конструкций на основе Fc для лечения различных иммунологических нарушений, в частности, аутоиммунных заболеваний, обсуждаются ниже.
[568] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления способ по настоящему изобретению применяют для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилоартрита. В этих случаях каждый эффекторный элемент противовоспалительной молекулярной конструкции на основе Fc представляет собой фрагмент антитела, специфичный к TNF-α, IL-12/IL-23, IL-1, IL-17 или IL-6, а каждый нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену II типа, коллагену IX типа, коллагену XI типа или α-аггрекану. Например, каждый эффекторный элемент первой пары эффекторных элементов представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, а каждый нацеливающий элемент первой пары нацеливающих элементов представляет собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену II типа. В других вариантах осуществления эффекторный элемент представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, а нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену IX типа. В качестве альтернативы, эффекторный элемент представляет собой scFv, специфичный к TNF-α, а нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к α-аггрекану. В соответствии с различными вариантами осуществления вышеупомянутые противовоспалительные молекулярные конструкции на основе Fc могут иметь конфигурацию 800А, 800В или 800С, обсуждаемую выше.
[569] Другая противовоспалительная молекулярная конструкция на основе Fc для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита или анкилозирующего спондилоартрита содержит два эффекторных элемента, которые находятся в форме Fab антитела, специфичного к TNF-α. В этих случаях оба нацеливающих элемента первой пары нацеливающих элементов представляют собой scFv, специфичные к коллагену II типа, или scFv, специфичные к коллагену IX типа. Конфигурации этих молекулярных конструкций на основе Fc проиллюстрированы, например, на фигуре 8F.
[570] Способы по настоящему изобретению также являются применимыми в лечении псориаза. Например, противовоспалительная молекулярная конструкция на основе Fc может содержать фрагменты антител, специфичные к TNF-α, IL-12/IL-23 или IL-17, в качестве эффекторных элементов и фрагменты антител, специфичные к коллагену I типа или коллагену VII типа, в качестве нацеливающих элементов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эффекторные элементы представляют собой scFv, специфичные к IL-17, а нацеливающие элементы представляют собой scFv, специфичные к коллагену I типа. В качестве альтернативы, эффекторные элементы представляют собой scFv, специфичные к IL-17, а нацеливающие элементы представляют собой scFv, специфичные к коллагену VII типа. Эти противовоспалительные молекулярные конструкции на основе Fc имеют конфигурацию 800А, 800В или 800С, обсуждаемую выше.
[571] Другая противовоспалительная молекулярная конструкция на основе Fc для лечения псориаза содержит два эффекторных элемента, которые находятся в форме Fab антитела, специфичного к IL-17. В этих случаях оба нацеливающих элемента первой пары нацеливающих элементов представляют собой scFv, специфичные к коллагену I типа, или scFv, специфичные к коллагену VII типа. Конфигурации этих молекулярных конструкций на основе Fc проиллюстрированы, например, на фигуре 8F.
[572] Другой группой заболеваний, поддающихся лечению с помощью способа по настоящему изобретению с применением противовоспалительных молекулярных конструкций на основе Fc, являются системная красная волчанка, кожная волчанка или синдром Шегрена. В этих вариантах осуществления каждый эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к BAFF, а каждый нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену I типа или коллагену VII типа. Эти противовоспалительные молекулярные конструкции на основе Fc могут иметь конфигурацию, проиллюстрированную на фигурах 8А-8С. Как можно понять, пара эффекторных элементов также может иметь форму Fab антитела, специфичного к BAFF, и пара нацеливающих элементов может представлять собой scFv, специфичные к коллагену I типа или коллагену VII типа, что имеет конфигурацию молекулярной конструкции 800F, проиллюстрированной на фигуре 8F.
[573] В других вариантах осуществления способ по настоящему изобретению применяют для лечения воспалительного заболевания кишечника, такого как болезнь Крона или неспецифический язвенный колит. В этих случаях каждый эффекторный элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к TNF-α, а каждый нацеливающий элемент представляет собой фрагмент антитела, специфичный к коллагену III типа или коллагену V типа. Конфигурации этих молекулярных конструкций на основе Fc проиллюстрированы, например, на фигурах 8А-8С. Разумеется, пара эффекторных элементов также может иметь форму Fab антитела, специфичного к TNF-α, а пара нацеливающих элементов может представлять собой scFv, специфичные к коллагену III типа или коллагену V типа, что, таким образом, дает конфигурацию, проиллюстрированную на фигуре 8F.
[574] Противовоспалительные молекулярные конструкции на основе Fc по настоящему изобретению также являются применимыми в лечении остеопороза. Например, эффекторные элементы представляют собой фрагменты антител, специфичные к RANKL, а нацеливающие элементы представляют собой фрагменты антител, специфичные к коллагену I типа или остеонектину. Как можно понять, фрагменты антител, специфичные к RANKL, могут представлять собой scFv, так что молекулярная конструкция на основе Fc имеет конфигурацию, проиллюстрированную на фигурах 8А-8С, или они могут иметь форму Fab, так что молекулярная конструкция на основе Fc имеет конфигурацию, проиллюстрированную на фигуре 8F.
[575] Следует отметить, что вышеуказанные примеры приведены в целях иллюстрации, и методы лечения с применением противовоспалительных молекулярных конструкций на основе Fc с другими комбинациями Т-Е находятся в пределах объема настоящего раскрытия.
[576] ЧАСТЬ VII. Молекулярные конструкции для лечения опухолей
[577] Другой аспект настоящего раскрытия направлен на молекулярную конструкцию на основе Fc, которая, подобно молекулярной конструкции, описанной в части V выше, имеет по меньшей мере пару нацеливающих элементов и по меньшей мере пару эффекторных элементов, непосредственно или опосредованно связанных с доменом СН2-СН3 иммуноглобулина. Благодаря выбору элементов Т-Е молекулярной конструкции на основе Fc по настоящему изобретению молекулярную конструкцию можно применять для лечения различных заболеваний, обусловленных нарушением пролиферации клеток, в том числе диффузных опухолей и солидных опухолей. Настоящее раскрытие также является преимущественным в том, что в некоторых вариантах осуществления в нем используется линкерное звено в соответствии с первым аспектом настоящего раскрытия, что обеспечивает легкий способ контроля количества нагрузки из цитотоксических лекарственных средств в молекулярных конструкциях на основе Fc по настоящему изобретению, соответственно обсуждаемых ниже.
[578] VII-(i). Молекулярные конструкции с антителами в качестве нацеливающих элементов и "связками" лекарственных средств в качестве эффекторных элементов
[579] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия каждый эффекторный элемент первой пары эффекторных элементов представляет собой "связку" лекарственных средств, а каждый нацеливающий элемент первой пары нацеливающих элементов представляет собой фрагмент антитела, специфичный к антигену клеточной поверхности или опухолеассоциированному антигену. В этих случаях молекулярные конструкции на основе Fc для лечения опухолей могут иметь конфигурацию молекулярной конструкции 1000А, изображенной на фигуре 10А, или молекулярной конструкции 1000В, изображенной на фигуре 10В. Как проиллюстрировано на фигуре 10А, эффекторные элементы Е1 (например, "связки" лекарственных средств) связаны с С-концами пары сегментов СН2-CH3 1010, тогда как нацеливающие элементы Т1 (в этом случае scFv) связаны с N-концами пары сегментов СН2-CH3 1010. В соответствии с альтернативными вариантами осуществления молекулярная конструкция 1000В (см. фигуру 10В) имеет пару нацеливающих элементов Т1, которая имеет форму Fab 1030. В частности, конфигурация Fab 1030 содержит домен V_H-CH1 1020 и домен V_L-C_K 1025 и связана с N-концами пары сегментов СН2-CH3 1010, так что молекулярная конструкция 1000А на основе Fc принимает конфигурацию IgG. В этом случае пара эффекторных элементов Е1 связана с С-концами пары цепей СН2-CH3 1010.
[580] В некоторых вариантах осуществления цепи СН2-CH3 взяты из γ1 или γ4 человеческих иммуноглобулинов. Как правило, выбирают γ1. если желаемыми являются Fc-опосредованные функции, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-опосредованная активность (воспалительная активация или лизис клеток-мишеней). В случае, когда Fc-опосредованные функции не рассматриваются, для конструирования молекулярных конструкций на основе Fc по настоящему изобретению выбирают γ4. Как можно понять, вышеупомянутая структура Fc-области также является применимой в других молекулярных конструкциях на основе Fc, обсуждаемых в части VII.
[581] "Связка" лекарственных средств может быть представлена в виде линкерного звена, обсуждаемого в части I настоящего раскрытия (см., например, фигуры 1А-1С). Коротко говоря, "связка" лекарственных средств содержит центральную сердцевину, множество связывающих ветвей и необязательно соединяющую ветвь. Центральная сердцевина может представлять собой химическое соединение, имеющее множество аминогрупп, или полипептид, содержащий множество лизиновых (K) остатков, в соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия. Каждая из связывающих ветвей имеет один конец, связанный с центральной сердцевиной посредством реакции с аминогруппами сердцевины на основе химического соединения или содержащими аминогруппу боковыми цепями остатков K полипептидной сердцевины. Связывающая ветвь также несет малеимидную группу на своем свободном конце, при этом каждая из молекул (например, в данном случае молекул цитотоксических лекарственных средств и/или агонистов TLR или комплексов хелатообразователь/радиоактивный нуклид, описанных ниже) связана с центральной сердцевиной путем присоединения с помощью связывающей ветви посредством реакции с малеимидной группой. В соответствии с необязательными вариантами осуществления настоящего раскрытия каждый из эффекторных элементов Е1 представляет собой "связку" лекарственных средств с 3-5 цитотоксическими молекулами.
[582] В случае, когда центральная сердцевина представляет собой полипептидную сердцевину, аминокислотный остаток на N- или С-конце центральной сердцевины представляет собой цистеиновый остаток или имеет азидную группу или алкиновую группу. В соответствии с определенными вариантами осуществления в случае с полипептидными сердцевинами с концевым аминокислотным остатком, имеющим азидную группу, "связка" лекарственных средств связывается с соединяющей ветвью посредством реакции SPAAC или реакции CuAAC, происходящей между указанным концевым остатком и С-концом соединяющей ветви. В качестве альтернативы, если полипептидные сердцевины имеют концевой аминокислотный остаток с алкиновой группой, то "связка" лекарственных средств связывается с соединяющей ветвью посредством реакции CuAAC, происходящей между указанным концевым остатком и С-концом соединяющей ветви. Опять же в качестве альтернативы, в случае с полипептидными сердцевинами с концевым остатком, представляющим собой цистеин, или в случае с сердцевинами на основе химического соединения "связка" лекарственных средств дополнительно содержит вторую связывающую ветвь. В частности, вторая связывающая ветвь имеет один конец, связанный с центральной сердцевиной посредством реакции с цистеиновым остатком полипептидной сердцевины или одной аминогруппой сердцевины на основе химического соединения. Вторая связывающая ветвь также несет алкиновую группу, азидную группу, тетразиновую группу или напряженную алкиновую группу на своем свободном конце, так что вторая связывающая ветвь "связки" лекарственных средств связывается с С-концом соединяющей ветви посредством реакции iEDDA (для соединяющих ветвей с тетразиновой или циклооктеновой группой), реакции SPAAC (для соединяющих ветвей с азидной или циклооктиновой группой) или реакции CuAAC (для соединяющих ветвей с алкиновой или азидной группой), происходящей между ними.
[583] В соответствии с определенными вариантами осуществления молекулярная конструкция на основе Fc по настоящему изобретению для лечения опухолей дополнительно содержит пару пептидных удлинений 1050 (см. фигуры 10А и 10В), соответственно имеющих последовательность (G_2-4S)_2-8С. Как проиллюстрировано, пара пептидных удлинений 1050 связана с С-концами пары сегментов СН2-CH3 1010. Цистеиновый остаток на С-конце пептидного удлинения связан с соединяющей ветвью 1055 посредством реакции тиольной и малеимидной групп, происходящей между ними. Кроме того, перед конъюгированием с эффекторным элементом Е1 (в этом случае "связкой" лекарственных средств) свободный конец соединяющей ветви (то есть конец, который не связан с цистеиновым остатком) модифицируют алкиновой, азидной, напряженной алкиновой или тетразиновой группой, так чтобы "связка" лекарственных средств связывалась с ним посредством реакции iEDDA, реакции SPAAC или CuAAC, происходящей между ними.
[584] Например, на фигуре 10А вторая связывающая ветвь 1040 от эффекторного элемента Е1 (в этом случае "связки" лекарственных средств) связана с сегментом СН2-CH3 1010 посредством реакции iEDDA. Эллипс 1045, показанный на фигуре 10А, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции iEDDA, происходящей между соединяющей ветвью 1055 и второй связывающей ветвью 1040 эффекторного элемента Е1. Как можно понять, реакция iEDDA происходит между тетразиновой группой и циклооктеновой группой, такой как транс-циклооктеновая (ТСО) группа.
[585] В качестве альтернативы, на фигуре 10В эффекторный элемент Е1 связан с сегментом СН2-CH3 1010 посредством реакции SPAAC. Ромб 1045, показанный на фигуре 10В, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC, происходящей между соединяющей ветвью 1055 и второй связывающей ветвью 1040 эффекторного элемента Е1. В частности, реакция SPAAC происходит между азидной группой и напряженной алкиновой группой (например, циклооктиновой группой, в том числе дибензоциклооктиновой (DBCO), дифторциклооктиновой (DIFO), бициклонониновой (BCN) и дибензоциклооктиновой (DICO) группой).
[586] В соответствии с некоторыми необязательными вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция на основе Fc для лечения опухолей может дополнительно содержать вторую пару нацеливающих элементов. Например, молекулярная конструкция 1000С на фигуре 10С содержит первую пару нацеливающих элементов Т1 и вторую пару нацеливающих элементов Т2, а также эффекторные элементы Е1. В частности, вторая пара нацеливающих элементов Т2 связана в тандемной конфигурации или в конфигурации диатела с N-концами пары нацеливающих элементов Т1, которая связана с N-концами пары сегментов СН2-CH3 1010, с образованием таким образом пары биспецифических scFv, связанной с N-концами пары сегментов СН2-CH3 1010. Кроме того, пара эффекторных элементов Е1 связана с сегментом СН2-CH3 1010 посредством реакции iEDDA путем образования химической связи 1045 между соединяющей ветвью 1055 и второй связывающей ветвью 1040 эффекторного элемента Е1. Однако, настоящее раскрытие не ограничивается этим; напротив, в других вариантах осуществления эффекторные элементы Е1 связаны с сегментом СН2-CH3 1010 посредством реакции SPAAC или реакции CuAAC.
[587] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция на основе Fc, которая имеет конфигурацию, проиллюстрированную на любой из фигур 10А-10С, является применимой в лечении диффузных опухолей. Например, "связка" лекарственных средств в такой молекулярной конструкции на основе Fc содержит множество молекул цитотоксических лекарственных средств, таких как ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин и камптотецин. Кроме того, нацеливающие элементы в такой молекулярной конструкции на основе Fc могут представлять собой фрагменты антител (например, scFv, Fab и т.п.), специфичные к антигену клеточной поверхности, выбранному из группы, состоящей из CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD34, CD37, CD38, CD43, CD78, CD79a, CD79b, CD138 и CD319.
[588] В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция на основе Fc, которая имеет конфигурацию, проиллюстрированную на любой из фигур 10А-10С, является применимой в лечении солидных опухолей, в том числе злокачественных и/или метастатических солидных опухолей. В некоторых случаях "связки" лекарственных средств для применения в качестве эффекторных элементов содержат несколько молекул цитотоксических лекарственных средств, например, ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин и камптотецин. В качестве альтернативы, "связка" лекарственных средств содержит несколько молекул агонистов TLR, таких как LPS, монофосфорил-липид А, мотолимод, имиквимод, резиквимод, гардиквимод, CpG DON, липотейхоевая кислота, β-глюкан и зимозан. Опять же в качестве альтернативы, "связка" лекарственных средств содержит несколько молекул хелатообразователей (например, DOTA, NOTA, NODA и DTPA) в комплексе с радиоактивным нуклидом (например,⁹⁰Y,¹¹¹In и¹⁷⁷Lu). В то же время нацеливающие элементы в такой молекулярной конструкции на основе Fc могут представлять собой фрагменты антител (например, scFv, Fab и т.п.), специфичные к HER1, HER2, HER3, HER4, СА19-9, СА125, СЕА, MUC1, MAGE, PSMA, PSCA, Tn, родственному муцину, сиалированному Tn, глобо-Н, SSEA-4, ганглиозиду GD2 или ЕрСАМ.
[589] В случаях, когда молекулярные конструкции на основе Fc имеют вторую пару нацеливающих элементов, эффекторный элемент первой пары эффекторных элементов представляет собой "связку" лекарственных средств, содержащую несколько молекул цитотоксических лекарственных средств, а первая и вторая пары нацеливающих элементов соответственно представляют собой scFv, специфичные к HER2, и scFv, специфичные к HER1.
[590] VII-(ii). Молекулярные конструкции с факторами роста/пептидными гормонами в качестве нацеливающих элементов и "связками" лекарственных средств в качестве эффекторных элементов
[591] В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия каждый эффекторный элемент первой пары эффекторных элементов представляет собой "связку" лекарственных средств, а каждый нацеливающий элемент первой пары нацеливающих элементов представляет собой фактор роста или пептидный гормон. В этих случаях молекулярные конструкции на основе Fc, подходящие для лечения солидных опухолей (в том числе злокачественных и/или метастатических), могут иметь конфигурацию молекулярной конструкции 1100, изображенной на фигуре 11. Как проиллюстрировано на фигуре 11, эффекторные элементы Е1 связаны с С-концами пары сегментов СН2-CH3 1110, тогда как нацеливающие элементы Т1 связаны с N-концами пары сегментов СН2-CH3 1110.
[592] Подобно молекулярной конструкции 1000А или 1000В на основе Fc, молекулярная конструкция 1100 по настоящему изобретению дополнительно содержит пару пептидных удлинений 1150, соответственно имеющих последовательность (G_2-4S)_2-8C, которые связаны с С-концами пары сегментов СН2-CH3 1110. Аналогично, для облегчения конъюгирования со "связкой" лекарственных средств цистеиновый остаток связывают с соединяющей ветвью 1155, а "связку" лекарственных средств связывают с соединяющей ветвью 1155 посредством реакции iEDDA, реакции SPAAC или реакции CuAAC, происходящей между ними (см. вышеприведенное обсуждение относительно фигуры 10А). Например, на фигуре 11 вторая связывающая ветвь 1140 от эффекторного элемента Е1 связана с соединяющей ветвью 1155 посредством реакции iEDDA, при этом эллипс 1145 представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции iEDDA, происходящей между соединяющей ветвью 1155 и эффекторным элементом Е1. Однако, настоящее раскрытие не ограничивается этим; напротив, в других вариантах осуществления эффекторные элементы Е1 связаны с сегментом СН2-CH3 1110 посредством реакции SPAAC или реакции CuAAC.
[593] Как можно понять, приведенные выше в части VII-(i) обсуждения относительно Fc-области и "связки" лекарственных средств в молекулярных конструкциях на основе Fc также являются применимыми в данном случае, и, следовательно, подробное описание, относящееся к ним, в данном документе для краткости опускают.
[594] Поскольку молекулярная конструкция по настоящему изобретению (например, молекулярная конструкция 1100) является применимой в лечении солидных опухолей, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления "связка" лекарственных средств для применения в качестве эффекторных элементов содержит несколько молекул цитотоксических лекарственных средств, например, ауристатин, майтанзин, доксорубицин, калихеамицин и камптотецин. В качестве альтернативы, "связка" лекарственных средств содержит несколько молекул агонистов TLR, таких как LPS, монофосфорил-липид А, мотолимод, имиквимод, резиквимод, гардиквимод, CpG DON, липотейхоевая кислота, β-глюкан и зимозан. Опять же в качестве альтернативы, "связка" лекарственных средств содержит несколько молекул хелатообразователей (например, DOTA, NOTA, NODA и DTPA) в комплексе с радиоактивным нуклидом (например,⁹⁰Y,¹¹¹In и¹⁷⁷Lu).
[595] В то же время нацеливающие элементы, подходящие для применения в комбинации с вышеупомянутыми "связками" лекарственных средств, представляют собой факторы роста, включающие без ограничения EGF, мутантный EGF, эпирегулин, HB-EGF, VEGF-A, bFGF и HGF. Другие нацеливающие элементы, комбинируемые с вышеупомянутыми "связками" лекарственных средств, представляют собой пептидные гормоны; иллюстративные примеры которых включают CCK, соматостатин и TSH.
[596] VII-(iii). Молекулярные конструкции с факторами роста/пептидными гормонами в качестве нацеливающих элементов и антителами в качестве эффекторных элементов
[597] В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция на основе Fc содержит фрагменты антител в качестве эффекторных элементов и факторы роста или пептидные гормоны в качестве нацеливающих элементов. Такие молекулярные конструкции являются применимыми в лечении солидных опухолей (в том числе злокачественных и/или метастатических).
[598] На фигуре 12А проиллюстрирована молекулярная конструкция 1200А на основе Fc, в которой пара эффекторных элементов Е1 (в этом случае scFv) связана с N-концами пары сегментов СН2-CH3 1210, тогда как пара нацеливающих элементов Т1 связана с С-концами пары сегментов СН2-CH3 1210. Что касается молекулярной конструкции 1200В на основе Fc на фигуре 12В, эффекторные элементы Е1 и нацеливающие элементы Т1 связаны соответственно с С- и N-концами пары сегментов СН2-CH3 1210.
[599] Как можно понять, фрагмент антитела также может иметь форму Fab в соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия. Например, молекулярная конструкция 1200С на основе Fc на фигуре 12С содержит пару эффекторных элементов Е1 в форме Fab 1230. В частности, конфигурация Fab 1230 содержит домен V_H-CH1 1220 и домен V_L-C_K 1225; Fab 1230 связан с N-концами пары сегментов СН2-CH3 1210, так что молекулярная конструкция 1200С на основе Fc принимает конфигурацию IgG. В этом случае пара нацеливающих элементов Т1 связана с С-концами пары цепей СН2-CH3 1210.
[600] В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия фрагменты антител, подходящие для применения в качестве эффекторных элементов, являются специфичными к антигенам клеточной поверхности, таким как PD-1, PD-L1, CTLA-4, CD3, CD16a, CD28 и CD134. Другой пример эффекторного элемента представляет собой фрагмент антитела, специфичный к фактору роста, такому как EGF, мутантный EGF, эпирегулин, HB-EGF, VEGF-A, bFGF и HGF. Фрагменты антител, специфичные к гаптенам, также подходят для применения в качестве эффекторных элементов, и иллюстративные примеры гаптенов включают DNP, TNP, дансил, пенициллин, n-аминобензойную кислоту и полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
[601] Что касается нацеливающего элемента, подходящего для применения в этой серии молекулярных конструкций на основе Fc, нацеливающий элемент может представлять собой фактор роста, такой как EGF, мутантный EGF, эпирегулин, HB-EGF, VEGF-A, bFGF и HGF. В качестве альтернативы, нацеливающий элемент может представлять собой пептидный гормон, такой как CCK, соматостатин и TSH.
[602] Сущностью настоящего изобретения являются логическое обоснование и идея использования конкретной комбинации или составления пар нацеливающих и эффекторных элементов. Использование конфигурации слияния с Fc в молекулярных конструкциях является предпочтительным вариантом осуществления. Для специалистов в данной области возможным является связывание пар нацеливающих и эффекторных элементов по настоящему изобретению с использованием других молекулярных платформ, таких как пептиды, белки (например, альбумин), полисахариды, полиэтиленгликоль и другие типы полимеров, которые служат в качестве структурной основы для прикрепления нескольких молекулярных элементов.
[603] ЧАСТЬ VIII. Пути применения молекулярных конструкций для лечения опухолей
[604] Благодаря выбору эффекторного(эффекторных) элемента(элементов) и нацеливающего(нацеливающих) элемента(элементов) молекулярные конструкции на основе Fc из части VII, упомянутые выше, также являются применимыми в лечении различных опухолей, в том числе диффузных опухолей и солидных опухолей. В связи с этим настоящее раскрытие также охватывает способ лечения опухолей путем применения молекулярной конструкции на основе Fc из части VII. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия способ включает введение молекулярной конструкции на основе Fc по настоящему изобретению или фармацевтического средства, содержащего ее, в эффективном количестве субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
[605] Для молекулярных конструкций, нацеливающихся на опухолевые клетки, как, например, нацеливающихся на EGFR, HER2/neu или CD20, фармакологической целью является лизис клеток-мишеней, экспрессирующих эти антигены. Как правило, желательно, чтобы молекулярная конструкция обладала Fc-опосредованными функциями, такими как ADCC или комплемент-опосредованный цитолиз. Однако, если молекулярная конструкция может быть сочленена с эффекторными элементами, вызывающими проявление сильных функций иммунного повреждения, как, например, в случае с scFv, специфичным к CD3 или CD16a, или иммунорегуляторных функций, как, например, в случае с scFv, специфичным к PD-1, PD-L1, CTLA-4, Fc-опосредованные функции могут не быть принципиально важными. Молекулы IgG также могут быть связаны на концах двух тяжелых цепей со "связками" цитотоксических молекул, молекул LPS или хелатообразующих групп в комплексе с радиоактивными нуклидами.
[606] Fc-область (спаренные домены СН2-CH3) человеческого IgG1 опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и комплемент-опосредованный цитолиз (CMC). В настоящем изобретении логически обосновано, что эти Fc-опосредованные функции можно сохранять при увеличении авидности связывания как составляющей связывающей способности антитела. Известно, что некоторые доли клеток в опухоли, которые экспрессируют антигены-мишени при низких плотностях, являются устойчивыми к нацеливающимся терапевтическим антителам. Например, клетки, экспрессирующие HER2/neu в опухоли молочной железы или CD20 в В-клеточной лимфоме на низких уровнях, не уничтожаются соответственно трастузумабом или ритуксимабом. Молекулярные конъюгаты по настоящему изобретению с намного более высокой авидностью связывания могут достаточно сильно связываться с этими клетками и опосредовать цитолитический механизм в их отношении.
[607] Различные Fc-рецепторы для различных подклассов IgG находятся на эффекторных клетках различных популяций, которые вместе с подклассами IgG опосредуют различные группы иммунных механизмов. FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) и FcγRIIIb (CD16b) находятся на макрофагах, нейтрофилах и эозинофилах и опосредуют фагоцитоз частиц и микроорганизмов, покрытых IgG. FcγRIIIa (CD16a) находится главным образом на NK-клетках и макрофагах в некоторых тканях и опосредует ADCC. При связывании с IgG1 и кластеризации FcγRIIIa на NK-клетках NK-клетки секретируют цитотоксические гранулы и факторы, вызывающие гибель, которые лизируют клетки, связанные с IgG. Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является конъюгирование scFv антител, специфичных к FcγRIIIa, с многоветвевыми линкерами, конъюгированными с scFv, взаимодействующими с различными антигенными мишенями (например, CD20, EGFR) и опухолеассоциированными антигенами, экспрессирующимися на различных клетках-мишенях. В недавно опубликованной статье показано, что биспецифическое антитело с одним Fab, специфичным к HER2/neu, и одним Fab, специфичным к FcγRIIIa, превосходит антитело к HER2/neu трастузумаб в отношении лизиса опухолевых клеток, экспрессирующих антиген HER2 при низкой плотности. Молекулярная конструкция по настоящему изобретению имеет более высокую авидность в отношении HER2/neu, а также должна обладать более высокой литической активностью в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих HER2/neu на очень низком уровне.
[608] Для лечения диффузных опухолей, таких как лимфома или лейкоз, происходящие из В-лимфоцитов, плазмоцитома, множественная миелома, лимфома или лейкоз, происходящие из Т-клеток, и миелогенный лейкоз, в молекулярной конструкции на основе Fc по настоящему изобретению применяются "связки" лекарственных средств, содержащие несколько молекул цитотоксических лекарственных средств, в качестве эффекторных элементов и фрагменты антител, специфичные к подходящему антигену клеточной поверхности, в качестве нацеливающих элементов.
[609] В соответствии с определенными вариантами осуществления способ по настоящему изобретению применяют для лечения лимфомы или лейкоза, происходящих из В-лимфоцитов. В этих случаях антигены клеточной поверхности, на которые нацеливается молекулярная конструкция на основе Fc по настоящему изобретению, представляют собой антигены клеточной поверхности на человеческих В-лимфоцитах, такие как CD5, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD37, CD43, CD79a и CD79b.
[610] В других вариантах осуществления диффузная опухоль, поддающаяся лечению с помощью способа по настоящему изобретению, представляет собой плазмоцитому или множественную миелому, а антигены клеточной поверхности, на которые нацеливаются в этих случаях, в том числе CD38, CD78, CD138 и CD319, находятся на человеческих плазмоцитах.
[611] В качестве альтернативы, способ по настоящему изобретению включает лечение лимфомы или лейкоза, происходящих из Т-клеток, с помощью молекулярных конструкций, которые нацеливаются на антигены клеточной поверхности на человеческих Т-клетках, такие как CD5, CD30 и CD43.
[612] Антигены клеточной поверхности, на которые нацеливается применяемая молекулярная конструкция при лечении миелогенного лейкоза в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, такие как CD33 и CD34, находятся на человеческих лейкоцитах миелоидной линии дифференцировки.
[613] В соответствии с определенными вариантами осуществления в молекулярной конструкции на основе Fc по настоящему изобретению для лечения солидных опухолей, таких как формы меланомы, формы карциномы пищевода, формы карциномы желудка, опухоль головного мозга, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак почки, гепатоцеллюлярная карцинома, рак яичника, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичка и плоскоклеточная карцинома головы и шеи, применяются "связки" лекарственных средств в качестве эффекторных элементов и фрагменты антител, специфичные к подходящему опухолеассоциированному антигену, в качестве нацеливающих элементов. В частности, молекулярные конструкции, обсуждаемые выше в вышеприведенной части VII-(ii), являются предпочтительными в этих вариантах осуществления.
[614] В соответствии с некоторыми необязательными вариантами осуществления способ лечения солидных опухолей дополнительно включает этап проведения субъекту процедуры диализа крови с применением фрагмента антитела, специфичного к одному или более опухолеассоциированным антигенам, для удаления опухолеассоциированных антигенов, "слущивающихся" с поверхности опухоли в систему кровообращения субъекта, перед введением молекулярной конструкции.
[615] В качестве альтернативы, способ лечения солидных опухолей включает применение молекулярной конструкции на основе Fc со "связками" лекарственных средств или фрагментами антител, специфичными к антигенам клеточной поверхности, факторам роста или гаптенам, в качестве эффекторных элементов и факторами роста или пептидными гормонами в качестве нацеливающих элементов. Иллюстративные примеры такой молекулярной конструкции включают обсуждаемые выше в части VII-(iii). Солидная опухоль, поддающаяся лечению с помощью этих молекулярных конструкций, представляет собой формы меланомы, формы карциномы пищевода, формы карциномы желудка, опухоль головного мозга, мелкоклеточный рак легкого, немел ко клеточный рак легкого, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, рак почки, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичника, рак предстательной железы, рак щитовидной железы, рак яичка или плоскоклеточную карциному головы и шеи.
[616] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления в молекулярной конструкции применяются "связки" лекарственных средств из молекул цитотоксических лекарственных средств в качестве эффекторных элементов и EGF или его мутантные формы в качестве нацеливающих элементов.
[617] В соответствии с другими вариантами осуществления в молекулярной конструкции применяются scFv, специфичные к CD3, CD16a, PD-1 или VEGF, в качестве эффекторных элементов и EGF или его мутантные формы в качестве нацеливающих элементов.
[618] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления эффекторные элементы представляют собой фрагменты антител, специфичные к гаптену. В этих случаях способ дополнительно включает этап введения субъекту иммунорегуляторного эффектора, меченного этим гаптеном, после введения молекулярной конструкции. Например, иммунорегуляторный эффектор может представлять собой IFN-α, IL-2, TNF-α и IFN-γ, а также антитело IgG, специфичное к PD-1, PD-L1, CTLA-4 или CD3.
[619] В некоторых вариантах осуществления пара сегментов СН2-CH3 получена из тяжелой цепи γ¹ человеческого IgG, и в молекулярной конструкции применяются "связки" лекарственных средств из молекул цитотоксических лекарственных средств или молекул LPS в качестве эффекторных элементов и EGF или его мутантные формы, эпирегулин, HB-EGF, VEGF-A, FGF, HGF, CCK, соматостатин или TSH в качестве нацеливающих элементов.
[620] В некоторых вариантах осуществления пара сегментов СН2-CH3 получена из тяжелой цепи γ1 человеческого IgG, и в молекулярной конструкции применяются scFv, специфичные к человеческому CD3, CD16a, PD-1, PD-L1 или VEGF-A, в качестве эффекторных элементов и EGF или его мутантные формы, эпирегулин, HB-EGF, VEGF-A, FGF, HGF, CCK, соматостатин или TSH в качестве нацеливающих элементов.
[621] ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ
[622] Пример 1. Синтез пептида 1 (SEQ ID NO: 17), пептида 2 (SEQ ID NO: 18) и пептида 3 (SEQ ID NO: 19) в качестве пептидных сердцевин и конъюгирование SH-группы цистеинового остатка с малеимид-PEG₃-транс-циклооктеном (ТСО) в качестве конъюгирующей ветви
[623] Пептиды 1-3 синтезировали с помощью способа твердофазного синтеза пептидов и очищали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) с применением системы для HPLC Shimadzu Nexera-i LC-2040C 3D до 95% чистоты. В обращенно-фазовой HPLC применяли колонку Kromasil 100-5C18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты, линейным градиентом от 10% до 45% ацетонитрила в течение 15 минут при скорости потока 1,0 мл/мин, и температурой колонки 25°С.
[624] Очищенный пептид растворяли в 100 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA, в конечной концентрации 2 мМ. Растворенный пептид восстанавливали с помощью 1 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) при 25°С в течение 2 часов. Для конъюгирования SH-группы цистеинового остатка с малеимид-PEG₃-ТСО (Conju-Probe Inc., Сан-Диего, США) с получением функциональной связывающей ТСО-группы пептид и малеимид-PEG₃-ТСО смешивали в соотношении 1/10 и инкубировали при рН 7,0 и 25°С в течение 24 часов. Пептиды, конъюгированные с ТСО, очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC на колонке Supelco C18 (250 мм × 10 мм; 5 мкм) с применением подвижной фазы в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты, линейного градиента от 0% до 100% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин, и температуры колонки 25°С. На фигуре 13 показан профиль элюирования в ходе обращенно-фазовой HPLC для очистки ТСО-функционализированного пептида 2; при этом пик ТСО-функционализированного пептида 2 указан стрелкой.
[625] Идентификацию трех синтезированных ТСО-функционализированных пептидов (проиллюстрированных ниже) проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. Анализы по методу масс-спектрометрии осуществляли в центральной лаборатории масс-спектрометрии Института молекулярной биологии (IMB) Академии Синика, Тайбэй, Тайвань. Измерения осуществляли на масс-спектрометре Bruker Autoflex III для MALDI-TOF/TOF (Bruker Daltonics, Бремен, Германия).
[626] ТСО-функционализированный пептид 1 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел молекулярный вес (m.w.), составляющий 1807,0 дальтона.

[627] ТСО-функционализированный пептид 2 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 2078,9 дальтона.

[628] ТСО-функционализированный пептид 3 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 3380,8 дальтона.

[629] Пример 2. Синтез пептидов 1 и 2 в качестве пептидных сердцевин и конъюгирование SH-группы цистеинового остатка с малеимид-PEG₄-тетразином в качестве конъюгирующей ветви
[630] Пептиды 1 и 2 получали согласно примеру 1 и затем растворяли в 100 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA, в конечной концентрации 2 мМ. Растворенный пептид восстанавливали с помощью 1 мМ ТСЕР при 25°С в течение 2 часов. Для конъюгирования SH-группы цистеинового остатка с малеимид-PEG₄-тетразином (Conju-Probe Inc.) с получением функциональной связывающей тетразиновой группы пептид и малеимид-PEG₄-тетразин смешивали в соотношении 1/5 и инкубировали при рН 7,0 и 4°С в течение 24 часов. Пептиды, конъюгированные с тетразином, очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC на колонке Supelco C18 (250 мм × 10 мм; 5 мкм) с применением подвижной фазы в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты, линейного градиента от 0% до 100% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин, и температуры колонки 25°С. Идентификацию указанных двух синтезированных тетразин-функционализированных пептидов проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF, изложенной в предыдущем примере.
[631] Тетразин-функционализированный пептид 1 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 1912,7 дальтона.

[632] Тетразин-функционализированный пептид 2 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 2185,2 дальтона.

[633] Пример 3. Синтез пептидов 1 и 2 в качестве пептидных сердцевин и конъюгирование SH-группы цистеинового остатка с малеимид-PEG₅-DBCO в качестве конъюгирующей ветви
[634] Пептиды 1 и 2 получали согласно более раннему примеру. Пептид растворяли в 100 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA, в конечной концентрации 2 мМ. Растворенный пептид восстанавливали с помощью 1 мМ ТСЕР при 25°С в течение 2 часов.
[635] Для конъюгирования SH-группы цистеинового остатка с дибензилциклооктином (DBCO) с получением функциональной связывающей DBCO-группы пептид и малеимид-PEG₅-DBCO (Conju-Probe Inc.) смешивали в соотношении 1/5 и инкубировали при рН 7,0 и комнатной температуре в течение 24 часов. Пептиды, конъюгированные с DBCO, очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC на колонке Supelco C18 (250 мм × 10 мм; 5 мкм) с применением подвижной фазы в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты, линейного градиента от 0% до 100% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин, и температуры колонки 25°С. Идентификацию двух синтезированных DBCO-функционализированных пептидов проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.
[636] DBCO-функционализированный пептид 1 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 1941,8 дальтона.

[637] DBCO-функционализированный пептид 2 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 2213,9 дальтона.

[638] Пример 4. Синтез пептида 4 (SEQ ID NO: 21), пептида 5 (SEQ ID NO: 22) и пептида 6 (SEQ ID NO: 23) в качестве пептидных сердцевин
[639] Пептиды 4-6 синтезировали с помощью способа твердофазного синтеза пептидов и затем очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC до 95% чистоты. Неприродные аминокислоты гомопропаргилглицин (G^HP) и азидогомоаланин (A^AH) содержали соответственно алкиновую и азидную группу. В обращенно-фазовой HPLC применяли колонку Supelco C18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с подвижной фазой в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты, линейным градиентом от 2% до 90% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин, и температурой колонки 25°С.
[640] Идентификацию указанных трех синтезированных пептидов проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. Пептид 4 по настоящему изобретению (Ac-G^HPGGSGGSGGSKGSGSK; SEQ ID NO: 21) имел молекулярный вес, составляющий 1317,0 дальтона; пептид 5 по настоящему изобретению (Ac-G^HPGGSGGSGGSKGSGSKGSK; SEQ ID NO: 22) имел m.w, составляющий 1589,9 дальтона; а пептид 6 по настоящему изобретению (Ac-A^AHGGSGGSGGSKGSGSKGSK; SEQ ID NO: 23) имел m.w., составляющий 1634,66 дальтона.
[641] Пример 5. Синтез пептида 7 (SEQ ID NO: 24) в качестве пептидной сердцевины и конъюгирование SH-группы цистеинового остатка с малеимид-PEG₃-ТСО или малеимид-PEG₄-тетразином в качестве конъюгирующей ветви
[642] Синтезировали пептид 7 (Ac-G^HPGGSGGSGGSKGSGSKGSGSC; SEQ ID NO: 24), и осуществляли конъюгирование со сшивающими средствами согласно описанному в вышеприведенных примерах. Синтезированные ТСО-функционализированный пептид 7 и тетразин-функционализированный пептид 7 изучали с помощью MALDI-TOF.
[643] ТСО-функционализированный пептид 7 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 1736,78 дальтона.

[644] Тетразин-функционализированный пептид 7 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 1820,62 дальтона.

[645] Пример 6. Синтез пептида 8 (SEQ ID NO: 25) в качестве пептидной сердцевины и конъюгирование SH-группы цистеинового остатка с малеимид-PEG₃-ТСО, малеимид-PEG₄-тетразином или малеимид-PEG₅-DBCO в качестве конъюгирующей ветви
[646] Пептид 8 (Ас-С-Хаа-K-Хаа-K-Хаа-K; где Хаа представлял собой пегилированную аминокислоту с 2 EG-звеньями; SEQ ID NO: 25) синтезировали с помощью способа твердофазного синтеза пептидов и затем очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC до 95% чистоты. Обращенно-фазовую HPLC проводили с применением колонки Kromasil 100-5C18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с подвижной фазой в виде воды и 0,1% TFA, линейным градиентом от 10% до 40% ацетонитрила в течение 12 минут при скорости потока 1,0 мл/мин, и температурой колонки 25°С.
[647] Идентификацию синтезированного пептида 8 проводили с помощью масс-спектрометрии ESI-MS. Эксперименты выполняли на масс-спектрометре LTQ Orbitrap XL ETD (Thermo Fisher Scientific, Сан-Хосе, Калифорния) с высокой разрешающей способностью и высокой точностью измерения масс, оснащенном стандартным источником ионов для ESI. Анализы по методу масс-спектрометрии ESI-TOF осуществляли в центральной лаборатории масс-спектрометрии GRC Научно-исследовательского центра геномики Академии Синика, Тайбэй, Тайвань. Образец синтезированного пептида продемонстрировал наличие сильного молекулярного иона при 981,9, соответствующем [М-Н]^-, что указывало на то, что фактический молекулярный вес пегилированного пептида составлял 983,0 дальтона.
[648] Конъюгирование со сшивающими средствами осуществляли согласно описанному в вышеприведенных примерах, и для изучения продуктов (проиллюстрированных ниже, в которых Хаа₂ означает пегилированную аминокислоту с двумя EG-звеньями) применяли масс-спектрометрию ESI-MS.
[649] ТСО-функционализированный пептид 8 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 1478,87 дальтона.

[650] Тетразин-функционализированный пептид 8 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 1584,92 дальтона.

[651] DBCO-функционализированный пептид 8 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 1613,8 дальтона.

[652] Пример 7. Синтез пептида 9 (SEQ ID NO: 26) в качестве пептидной сердцевины и конъюгирование SH-группы цистеинового остатка с малеимид-PEG₃-ТСО в качестве конъюгирующей ветви
[653] Пептид 9 (Ас-С-Хаа-K-Хаа-K-Хаа-K-Хаа-K-Хаа-K; где Хаа представлял собой пегилированную аминокислоту с 6 EG-звеньями; SEQ ID NO: 26) получали согласно изложенному в более раннем примере. Идентификацию синтезированного пептида 9 проводили с помощью масс-спектрометрии ESI-MS. Образец синтезированного пептида продемонстрировал наличие сильного молекулярного иона при 828,0, соответствующем [М+3Н]³⁺, что указывало на то, что фактический молекулярный вес пегилированного пептида составлял 2480,7 дальтона.
[654] Конъюгирование со сшивающим средством осуществляли согласно изложенному в вышеприведенных примерах, а затем изучали с помощью масс-спектрометрии ESI-MS. ТСО-функционализированный пептид 9 по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 2975 дальтонов.

[655] Пример 8. Синтез линкерного звена путем конъюгирования NHS-PEG₁₂-малеимида с NH₂-группами ТСО-функционализированных пептидов 1 и 2
[656] К пептидной сердцевине на основе ТСО-функционализированного пептида 1 прикрепляли две PEG₁₂-малеимидные связывающие ветви; а к пептидной сердцевине на основе ТСО-функционализированного пептида 2 прикрепляли три PEG₁₂-малеимидные связывающие ветви. Сшивающее средство NHS-PEG₁₂-малеимид (сукцинимидиловый сложный эфир [(N-малеимидопропионамидо)додекаэтиленгликоля]) приобретали у Thermo Fisher Scientific Inc. (Уолтем, США). Процедуру конъюгирования осуществляли согласно инструкции производителя; пептид с лизиновыми остатками растворяли в буфере для конъюгирования, представляющем собой фосфатно-солевой буферный раствор (PBS, рН 7,5), при 100 мМ. К растворенному пептиду добавляли сшивающее средство NHS-PEG₁₂-малеимид в конечной концентрации 1 мМ (в 20-кратном молярном избытке по отношению к 0,1 мМ раствору пептида). Реакционные смеси инкубировали в течение 18 часов при комнатной температуре. ТСО-функционализированные пептид 1 и пептид 2, конъюгированные с PEG₁₂-малеимидом, очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC на колонке Supelco C18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с применением подвижной фазы в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты, линейного градиента от 0% до 100% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин, и температуры колонки 25°С. На фигуре 14 показан профиль обращенно-фазовой HPLC для очистки ТСО-функционализированного пептида 2, конъюгированного с PEG₁₂-малеимидом; при этом пик указан стрелкой.
[657] Идентификацию ТСО-функционализированных пептида 1 и пептида 2, конъюгированных с PEG₁₂-малеимидом, проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.
[658] ТСО-функционализированный пептид 1, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, представлял собой линкерное звено на основе пептидной сердцевины, несущее одну соединяющую ветвь с ТСО-группой и две связывающие ветви PEG с малеимидными группами. Результат масс-спектрометрии MALDI-TOF указывал на то, что молекулярная конструкция по настоящему изобретению имела m.w., составляющий 3330,7 дальтона.

[659] ТСО-функционализированный пептид 2, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, представлял собой линкерное звено на основе пептидной сердцевины, несущее одну соединяющую ветвь с ТСО-группой и три связывающие ветви PEG с малеимидными группами. На фигуре 15 показан результат масс-спектрометрии MALDI-TOF, указывающий на то, что молекулярная конструкция по настоящему изобретению имела m.w., составляющий 4332 дальтона; (ESI-TOF) масса/заряд (z=4): [М+4Н]⁺; расчетное значение для C₁₈₅H₃₁₃N₃₁O₈₃S₁ 1083,7829; найденное значение 1083,7833, что соответствует [M+Na]⁺.

[660] Пример 9. Синтез линкерного звена путем конъюгирования NHS-PEG₁₂-малеимида с NH₂-группами тетразин-функционализированного пептида 2 и DBCO-функционализированного пептида 1
[661] К тетразин-функционализированному пептиду 2 прикрепляли три PEG₁₂-малеимидные связывающие ветви, а к DBCO-функционализированному пептиду 1 прикрепляли две связывающие ветви. Конъюгирование NHS-PEG₁₂-малеимида с NH₂-группами лизиновых остатков пептидных сердцевин осуществляли согласно описанному в более ранних примерах, и продукты идентифицировали с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.
[662] Как проиллюстрировано ниже, тетразин-функционализированный пептид 2, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, по настоящему изобретению нес одну соединяющую ветвь с тетразиновой группой и три связывающие ветви PEG с малеимидными группами. На фигуре 16А показан результат масс-спектрометрии MALDI-TOF, указывающий на то, что конструкция имела m.w., составляющий 4461 дальтон.

[663] Как проиллюстрировано ниже, DBCO-функционализированный пептид 1, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, по настоящему изобретению нес одну связывающую ветвь с DBCO-группой и две связывающие ветви PEG с малеимидными группами. На фигуре 16В показан результат масс-спектрометрии MALDI-TOF, указывающий на то, что конструкция имела m.w., составляющий 3445 дальтонов.

[664] Пример 10. Синтез линкерного звена путем конъюгирования NHS-PEG₁₂-малеимида с NH₂-группами пептидов 4-6
[665] К пептиду 4 прикрепляли две PEG₁₂-малеимидные связывающие ветви; а к пептиду 5 и пептиду 6 прикрепляли три PEG₁₂-малеимидные связывающие ветви. Конъюгирование NHS-PEG₁₂-малеимида с NH₂-группами лизиновых остатков пептидных сердцевин осуществляли согласно более раннему примеру, и продукты идентифицировали с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.
[666] Пептид 4, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 2817,3 дальтона; он представлял собой линкерное звено на основе пептидной сердцевины, несущее одну алкиновую группу и две связывающие ветви PEG с малеимидными группами.

[667] Пептид 5, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, по настоящему изобретению (проиллюстрированный ниже) имел m.w., составляющий 3839,2 дальтона; он представлял собой линкерное звено на основе пептидной сердцевины, несущее одну алкиновую группу и три связывающие ветви PEG с малеимидными группами.

[668] Пептид 6, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом (проиллюстрированный ниже), имел m.w., составляющий 3811,5 дальтона; он представлял собой линкерное звено на основе пептидной сердцевины, несущее одну азидную группу и три связывающие ветви PEG с малеимидными группами.

[669] Пример 11. Синтез линкерного звена путем конъюгирования NHS-PEG₁₂-малеимида с NH₂-группами ТСО-функционализированного пептида 7 и тетразин-функционализированного пептида 7
[670] Две PEG₁₂-малеимидные связывающие ветви прикрепляли к пептидной сердцевине на основе пептида 7 из предыдущих примеров. Конъюгирование NHS-PEG₁₂-малеимида с NH₂-группами лизиновых остатков пептидной сердцевины осуществляли согласно описанному выше, и идентификацию проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.
[671] ТСО-функционализированный пептид 7, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 3237,63 дальтона; он представлял собой линкерное звено на основе пептидной сердцевины, несущее одну алкиновую группу, одну соединяющую ветвь с TCO-группой и две связывающие ветви PEG с малеимидными группами.

[672] Тетразин-функционализированный пептид 7, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, по настоящему изобретению, проиллюстрированный ниже, имел m.w., составляющий 3342,98 дальтона; он представлял собой линкерное звено на основе пептидной сердцевины, несущее одну алкиновую группу, одну соединяющую ветвь с тетразиновой группой и две связывающие ветви PEG с малеимидными группами.

[673] Пример 12. Синтез линкерного звена путем конъюгирования NHS-PEG₁₂-малеимида с NH₂-группами ТСО-функционализированного пептида 8 и тетразин-функционализированного пептида 8
[674] Три PEG₁₂-малеимидные связывающие ветви прикрепляли к пептидным сердцевинам на основе ТСО-функционализированного пептида 8 и тетразин-функционализированного пептида 8. Конъюгирование NHS-PEG₁₂-малеимида с NH₂-группами лизиновых остатков пептидной сердцевины осуществляли согласно примеру 8, и идентификацию проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.
[675] ТСО-функционализированный пептид 8 (проиллюстрированный ниже), конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, по настоящему изобретению имел m.w., составляющий 3774,9 дальтона; он представлял собой линкерное звено на основе пегилированной аминокислоты и лизина; он нес одну соединяющую ветвь с ТСО-группой и три связывающие ветви PEG с малеимидными группами.

[676] Тетразин-функционализированный пептид 8 (проиллюстрированный ниже), конъюгированный с РЕС₁₂-малеимидом, по настоящему изобретению имел m.w., составляющий 3856,94 дальтона (фигура 17; (ESI-TOF) масса/заряд (z=4):[М+4Н]⁺; расчетное значение для C₁₇₁H₂₈₇N₂₃O₇₁S₁H₃Na 964,7363; найденное значение 964,7324); он представлял собой линкерное звено на основе пегилированной аминокислоты и лизина; он нес одну соединяющую ветвь с тетразиновой группой и три связывающие ветви PEG с малеимидными группами.

[677] Пример 13. Синтез линкерного звена путем конъюгирования NHS-PEG₆-малеимида с NH₂-группами ТСО-функционализированного пептида 9
[678] Пять PEG₆-малеимидных связывающих ветвей прикрепляли к пептидным сердцевинам на основе ТСО-функционализированного пептида 9. Конъюгирование NHS-PEG₆-малеимида с NH₂-группами лизиновых остатков пептидной сердцевины осуществляли согласно примеру 8, идентификацию проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.
[679] ТСО-функционализированный пептид 9 (проиллюстрированный ниже), конъюгированный с PEG₆-малеимидом, имел m.w., составляющий 5543,78 дальтона (фигура 18; (ESI-TOF) масса/заряд (z=6):[М+6Н]⁺; расчетное значение для C₂₄₄H₄₂₁N₂₉O₁₀₁S₁Na 924,297; найденное значение 924,299); он представлял собой линкерное звено на основе пегилированной аминокислоты и лизина; он нес одну соединяющую ветвь с ТСО-группой и пять связывающих ветвей PEG с малеимидными группами.

[680] Пример 14. Синтез линкерного звена с 1,3,5-триаминобензолом, конъюгированным с 1 NHS-PEG₁₂-алкиновой связывающей ветвью и 2 NHS-PEG₁₂-малеимидными связывающими ветвями
[681] 1,3,5-триаминобензол приобретали у ВОС Sciences, Creative Dynamics Inc., Нью-Йорк, США, а NHS-PEG₁₂-алкиновую связывающую ветвь и NHS-PEG₁₂-малеимид у Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США. При конъюгировании со связывающими ветвями использовали двухэтапную процедуру, показанную на схеме 13. На этапе (i) 1,3,5-триаминобензол растворяли в буфере для конъюгирования (фосфатно-солевом буферном растворе PBS, рН 7,2) при 1 мМ, и к раствору 1,3,5-триаминобензола добавляли сшивающее средство NHS-PEG₁₂-алкин в конечной концентрации 1 мМ (молярное соотношение 1:1). После этого к 1 мл раствора 1,3,5-триаминобензола добавляли 4 мкл 250 мМ исходного раствора NHS-PEG₁₂-алкина. Реакционные смеси инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. На этапе (ii) к инкубируемому раствору из этапа (i) добавляли сшивающее средство NHS-PEG₁₂-малеимид в конечной концентрации 10 мМ (молярное соотношение 1:30). Далее к 125 мкл инкубируемого раствора добавляли 30 мкл 250 мМ исходного раствора NHS-PEG₁₂-малеимида; затем добавляли 845 мкл буфера для конъюгирования с получением 1 мл конечного раствора. Реакционные смеси инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре.
«Схема 13. Двухэтапный синтез 1,3,5-триаминобензола, конъюгированного с одной NHS-PEG₁₂-алкиновой связывающей ветвью и двумя NHS-PEG₁₂-малеимидными связывающими ветвями»

[682] Продукт 1,3,5-триаминобензол, конъюгированный с одной NHS-PEG₁₂-алкиновой соединяющей ветвью и двумя NHS-PEG₁₂-малеимидными связывающими ветвями, очищали путем пропускания реакционной смеси через колонку для обращенно-фазовой HPLC и сбора фракций, содержащих линкерное звено. Продукт анализировали с помощью масс-спектроскопии ESI (фигура 19). Данные показали (ESI-TOF): масса/заряд: [М+Н]⁺ - расчетное значение для C₁₀₄H₁₈₀N₇O₄₆ 2263, 1955; найденное значение 2263, 1920. В MS-спектре также были видны три изотопных пика при 2264, 1934, 2265, 1938 и 2266, 1927, что соответствовало [М+Н+1]⁺, [М+Н+2]⁺ и [М+Н+3]⁺.
[683] Пример 15. Конъюгирование пяти молекул DM1-SMCC с ТСО-функционализированным пептидом 9
[684] DM1-SMCC, который представлял собой N₂'-деацетил-N₂'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтанзин (DM1), модифицированный линкером сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилатом (SMCC), приобретали у ALB Technology Inc., Гонконг, Китай. ТСО-функционализированный пептид 9 со свободными аминогруппами растворяли в 100 мМ натрий-фосфатного буфера при рН 7,5. К раствору ТСО-функционализированного пептида 9 добавляли DM1-SMCC в конечной концентрации 1 мМ (в 25-кратном молярном избытке по отношению к 0,04 мМ раствору ТСО-функционализированного пептида 9) путем добавления 4 мкл 250 мМ раствора DM1-SMCC на миллилитр раствора NH₂-содержащего ТСО-функционализированного пептида 9. Реакционные смеси инкубировали в течение 24 часов при комнатной температуре. Продукт реакции отделяли с помощью HPLC и затем лиофилизировали. ТСО-функционализированный пептид 9 с пятью молекулами DM1-SMCC очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC на колонке Supelco C18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с применением подвижной фазы в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты, линейного градиента от 30% до 100% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин, и температуры колонки 25°С.
[685] На фигуре 20 показан профиль обращенно-фазовой HPLC для очистки ТСО-функционализированного пептида 9 с пятью молекулами DM1-SMCC (также называемыми "связкой" лекарственных средств); при этом пик указан стрелкой. Масс-спектроскопический анализ синтезированной таким образом "связки" лекарственных средств, представленный на фигуре 21, указывал на то, что молекулярная конструкция имела m.w., составляющий 7803 дальтона.
[686] "Связка" лекарственных средств по настоящему изобретению, проиллюстрированная ниже, состояла из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из пяти молекул DM1 в качестве эффекторных элементов.

[687] Пример 16. Конъюгирование молекул LPS с ТСО-функционализированным пептидом 1
[688] LPS из Salmonella enterica серовара Minnesota (№ по каталогу L2137, Sigma) очищали посредством хроматографии на колонке Tricorn с Superdex 200 10/300 (HR, GE Healthcare) в системе

Explorer для FPLC. Применяли 50 мМ HEPES, pH 7,5, в качестве элюирующего буфера. Образец вводили и элюировали в изократическом режиме при 0,5 мл/мин, и собирали в виде фракций по 1 мл. Фракции, содержащие LPS, затем подвергали диализу против воды Milli-Q с применением мембраны с MWCO 3500 при 4°С в течение ночи. Подвергнутый диализу LPS лиофилизировали для последующего конъюгирования.
[689] Перед конъюгированием очищенный LPS активировали следующим образом. 2 мг/мл водного раствора LPS в количестве 1 мл перемешивали вихревым способом в течение 3 мин. и обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин. при 25°С. Затем добавляли 1 мл 4,5 мМ дезоксихолата натрия (NaDC); добавляли 100 мкл 2,5 мМ раствора EDTA. Смесь перемешивали в течение 30 минут при 37°С, обрабатывали ультразвуком в течение 15 минут и перемешивали в течение еще 30 минут при 37°С. Добавляли 40 мкл 100 мг/мл тетрафторбората 1-циано-4-диметиламинопиридиния (CDAP) в ацетонитриле. Через 30 секунд добавляли 40 мкл 0,2 М водного триэтиламина (TEA). Смесь выдерживали при 25°С в течение дополнительных 150 секунд при перемешивании для обеспечения активации LPS под действием CDAP.
[690] LPS, полученный из Salmonella enterica серовара Minnesota, подвергали реакции с дансилгидразином для введения гидразиновой группы для последующего соединения с аминогруппой в линкерном звене. Коротко говоря, 1 мл 2,0 мг/мл дансилгидразина в 0,1 М натрий-боратном буфере, pH 9,3, добавляли к LPS, активированному CDAP. Смесь оставляли для реакции в течение ночи в темноте при 25°С при перемешивании. Реакцию гасили путем добавления 100 мкл этаноламина. Непрореагировавший дансилгидразин удаляли путем диализа против воды Milli-Q с применением диализной мембраны с MWCO 3500 в течение 24 часов при 4°С в темноте. Характеристики образца определяли с помощью флуоресцентной спектроскопии путем измерения спектров испускания с возбуждением при 325 нм. На фигуре 22 показано, что LPS при реакции с дансилгидразином характеризовался максимумом испускания при 495 нм в анализе по методу флуоресцентной спектрофотометрии.
[691] Идентификацию очищенного LPS и активированного дансилом LPS проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. Очищенный LPS имел m.w., составляющий 3143 дальтона; активированный дансилом LPS имел m.w., составляющий 3651 дальтон, что указывало на то, что один LPS конъюгирован с двумя молекулами дансилгидразина; одна молекула дансилгидразина имела m.w., составляющий 265 дальтонов.
[692] Осуществляли конъюгирование молекул LPS с NH₂-группами лизиновых остатков ТСО-функционализированного пептида 1. Коротко говоря, 0,67 моль активированного дансилом LPS смешивали с 0,067 моль ТСО-функционализированного пептида 1 в 0,1 М натрий-бикарбонатном буфере, рН 9,5, при комнатной температуре в течение ночи.
[693] "Связка" лекарственных средств по настоящему изобретению, проиллюстрированная ниже, состояла из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из двух молекул LPS в качестве эффекторных элементов.

[694] Пример 17. Конъюгирование молекулы имиквимода с ТСО-функционализированным пептидом 9, конъюгированным с NHS-PEG₆-малеимидом
[695] NH₂-группу молекулы имиквимода подвергали реакции с гомобифункциональным сшивающим средством NHS-PEG₅-NHS (Conju-Probe Inc.) в молярном соотношении 1:3,5. Масс-спектрометрический анализ показал, что PEG₅-NHS, конъюгированный с имиквимодом, имел m.w., составляющий 658,36 дальтона (фигура 23).
[696] Продукт имиквимод-PEG₅-NHS очищали с помощью HPLC для удаления избыточных непрореагировавших сшивающих средств. ТСО-функционализированный пептид 9 и имиквимод-PEG₅-NHS затем смешивали в 100 мМ натрий-фосфатном буфере при рН 7,5 при 25°С в течение 18 часов. Масс-спектрометрический анализ показал, что "связка" лекарственных средств с имиквимодом имела m.w., составляющий 5135 дальтонов.
[697] "Связка" лекарственных средств по настоящему изобретению, проиллюстрированная ниже, состояла из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из пяти молекул имиквимода в качестве эффекторных элементов.

[698] Пример 18. Конъюгирование DOTA-NHS с ТСО-функционализированным пептидом 9
[699] DOTA-NHS (N-гидроксисукцинимидный сложный эфир 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты) приобретали у Macrocyclics, Inc., Даллас, США. При конъюгировании DOTA-NHS с ТСО-функционализированным пептидом 9 использовали двухэтапную процедуру, проиллюстрированную на схеме 14. На первом этапе ТСО-функционализированный пептид 9 растворяли в буфере для конъюгирования (фосфатно-солевой буферный раствор PBS с 5 мМ EDTA, рН 7,0) при 1 мМ. Реакционные смеси инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. На втором этапе к инкубируемому раствору добавляли сложный эфир DOTA-NHS в конечной концентрации 100 мМ (в молярном соотношении 1:100 или в соотношении эквивалентов 1:20). Поскольку сложный эфир DOTA-NHS был кислым ввиду того, что содержал TFA, рН раствора доводили до 8,0 в целях активации реакции присоединения сложного NHS-эфира и NH₂. Реакционные смеси инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.
«Схема 14. Двухэтапная процедура конъюгирования DOTA-NHS с ТСО-функционализированным пептидом 9»

[700] В соответствии с данными на фигуре 24А молекулярная конструкция по настоящему изобретению имела m.w., составляющий 4907,685; (ESI-TOF) масса/заряд (z=5): [М+3Н]⁺; расчетное значение для C₂₁₄H₃₈N₃₉O₈₆S₁ 982,5358; найденное значение 982,5370.
[701] Пример 19. Хелатирование атомов иттрия линкерным звеном на основе ТСО-функционализированного пептида 9, конъюгированным с DOTA
[702] На схеме 15 показано хелатирование пяти ионов Y³⁺ ТСО-функционализированным пептидом 9, конъюгированным с DOTA. В данном случае к реакционным смесям добавляли раствор Y(NO₃)₃ в молярном соотношении 1:100, инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Свободные DOTA-NHS и ионы Y³⁺удаляли из реакционных смесей путем применения колонки NAP-10 c Sephadex G-25.
«Схема 15. Хелатирование атома иттрия ТСО-функционализированным пептидом 9, конъюгированным с DOTA»

[703] ТСО-функционализированный пептид 9, конъюгированный с DOTA, со связанными ионами Y³⁺ анализировали с помощью масс-спектроскопии MALDI-TOF. Масс-спектрометрический анализ показал, что образец ТСО-функционализированного пептида 9, конъюгированного с DOTA, со связанными ионами Y³⁺ имел m.w., составляющий 5355 дальтонов (фигура 24В).
[704] Ниже проиллюстрирована "связка" лекарственных средств по настоящему изобретению, состоящая из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из пяти DOTA-групп, соответственно хелатирующих ионы Y³⁺, в качестве эффекторных элементов.

[705] Пример 20. Выделение последовательностей V_H и V_L из гибридомных линий клеток, вырабатывающих моноклональные антитела, специфичные соответственно к CD79a, CD79b и человеческому коллагену VII типа, для получения scFv
[706] Мышиную В-клеточную гибридому 24С10, вырабатывающую антитело к CD79a, и гибридому 1F10, вырабатывающую антитело к CD79b, создавали в лаборатории авторов настоящего изобретения с использованием стандартного гибридомного метода. Мышиная гибридомная линия LH7.2, специфичная к человеческому коллагену VII типа, была получена в дар от профессора Irene M. Leigh, Университет Данди, Великобритания. Поли(А)+ РНК подвергали обратной транскрипции с помощью системы SuperScript III для ОТ-ПЦР (Invitrogen, Карлсбад, США), и синтезировали первую нить кДНК. Для определения последовательности вариабельной области 24С10, 1F10 и LH7.2 кДНК, кодирующую V_H и V_L, амплифицировали с помощью ПЦР с применением набора ДНК-праймеров, представленных в наборах праймеров для Ig (Novagen, Мэдисон, США), в соответствии с инструкциями производителя. Определяли последовательности V_H и V_L для всех клонов.
[707] Последовательности кДНК, кодирующие V_H и V_L мышиного моноклонального антитела клона 24С10 к человеческому CD79a, указаны соответственно под SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28; последовательности кДНК, кодирующие V_H и V_L мышиного моноклонального антитела клона 1F10 к человеческому CD79b, указаны соответственно под SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30; последовательности кДНК, кодирующие V_H и V_L мышиного моноклонального антитела клона LH7.2 к человеческому коллагену VII типа, указаны соответственно под SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32.
[708] Пример 21. Получение scFv, специфичного к CD79b или человеческому коллагену VII типа
[709] Для получения scFv антитела 1F10 к CD79b (SEQ ID NO: 33) и scFv антитела LH7.2 к человеческому коллагену VII типа (SEQ ID NO: 34) синтезировали последовательности ДНК, кодирующие V_L-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-V_H-(GGGGS)₂-C. Гибкий линкер GGGGSGGGGS и цистеиновый остаток вставляли в С-конец scFv, так чтобы модифицированный scFv мог после этого связываться с малеимидной группой связывающих ветвей в различных линкерных звеньях по настоящему изобретению.
[710] Последовательность, кодирующую scFv, помещали в кассету экспрессии pG1K. Клетки Expi293F высевали при плотности 2,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл в среду для экспрессии Expi293F и выдерживали в течение 18-24 часов перед трансфекцией, чтобы убедиться в том, что клетки на момент трансфекции активно делились. В день трансфекции 7,5×10⁸ клеток в 255 мл среды в 2-литровой смесительной колбе Эрленмейера трансфицировали с помощью реагента для трансфекции ExpiFectamine™ 293. Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С в течение 16-18 часов после трансфекции в орбитальном шейкере (125 об./мин.), и к клеткам в смесительную колбу добавляли усилитель трансфекции 1 и усилитель трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293, и их инкубировали в течение еще 6 дней. Образцы надосадочной жидкости культуры собирали, и белки scFv в среде очищали с помощью аффинной хроматографии на белке L. На фигурах 25А и 25В соответственно показан анализ очищенных белков scFv антитела 1F10 к CD79b по методам SDS-PAGE и ELISA. На фигурах 25С и 25D соответственно показан анализ очищенных белков scFv антитела LH7.2 к коллагену VII типа по методам SDS-PAGE и ELISA.
[711] Пример 22. Получение scFv трастузумаба, ритуксимаба, цетуксимаба, ниволумаба, ипилимумаба, ранибизумаба, адалимумаба и мутантного теплизумаба с помощью системы сверхэкспрессии на основе HEK293
[712] scFv, получаемые из этих антител, конструировали таким образом, чтобы они содержали гибкий линкер GGGGSGGGGS и концевой цистеиновый остаток на С-конце. Цистеиновый остаток обеспечивает сульфгидрильную группу для конъюгирования с малеимидной группой, присутствующей на свободных концах связывающих ветвей в различных линкерных звеньях. Для получения scFv трастузумаба, ритуксимаба, цетуксимаба, ниволумаба, ипилимумаба, ранибизумаба, адалимумаба и мутантного теплизумаба авторы настоящего изобретения применяли последовательности ДНК, кодирующие V_H и V_L этих гуманизированных антител, без дополнительной оптимизации кодонов. Синтезировали последовательности ДНК, кодирующие V_L-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-V_H-(GGGGS)₂-C. Молекула антитела теплизумаба содержит цистеиновый остаток в CDR3 V_H, препятствующий конъюгированию между SH-группой и малеимидной группой, поясняемому выше. Поэтому авторы настоящего изобретения получили мутантный теплизумаб с замещением цистеинового остатка сериновым остатком. Аминокислотные последовательности scFv трастузумаба, ритуксимаба, цетуксимаба, ниволумаба, ипилимумаба, ранибизумаба, адалимумаба и мутантного теплизумаба, полученные для экспериментов по настоящему изобретению, приведены соответственно под SEQ ID NO: 35-42.
[713] Для получения белков scFv с помощью систем экспрессии в клетках млекопитающих авторы настоящего изобретения применяли систему сверхэкспрессии на основе линии клеток Expi293F™ для получения 10-500 мг scFv для проведения экспериментов. Значения выхода были достаточными для получения различных конструкций, содержащих конкретный scFv, для тестов in vitro и животных моделей на грызунах. В системе использовался набор для трансфекции ExpiFectamine™ 293 (Life Technologies, Карлсбад, США), состоящий из линии клеток Expi293F™, реагента ExpiFectamine™ 293 на основе катионных липидов и усилителей трансфекции 1 и 2 ExpiFectamine™ 293, а также среды (Gibco, Нью-Йорк, США).
[714] Последовательность, кодирующую scFv, помещали в кассету экспрессии pG1K. Клетки Expi293F высевали при плотности 2,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл в среду для экспрессии Expi293F и выдерживали в течение 18-24 часов перед трансфекцией, чтобы убедиться в том, что клетки на момент трансфекции активно делились. В день трансфекции 7,5×10⁸ клеток в 255 мл среды в 2-литровой смесительной колбе Эрленмейера трансфицировали с помощью реагента для трансфекции ExpiFectamine™ 293. Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С в течение 16-18 часов после трансфекции в орбитальном шейкере (125 об./мин.), и к клеткам в смесительную колбу добавляли усилитель трансфекции 1 и усилитель трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293, и их инкубировали в течение еще 5-6 дней. Образцы надосадочной жидкости культуры собирали, и белки scFv в среде очищали с помощью аффинной хроматографии на белке L. Как показывает практика, в случае с белками scFv адалимумаба и трастузумаба из 1 литра культуры можно получить более 300 мг очищенного scFv. На фигуре 26А показан анализ очищенных scFv трастузумаба (дорожка 1) и адалимумаба (дорожка 2) по методу SDS-PAGE (в 10% геле), а на фигурах 26В и 26С соответственно показаны анализы очищенных scFv трастузумаба и адалимумаба по методу ELISA. На фигурах 26D и 26Е соответственно показаны анализы очищенного scFv цетуксимаба по методам SDS-PAGE и ELISA, в которых scFv трастузумаба (scFv антитела к HER2) применяли в качестве отрицательного контроля.
[715] Пример 23. Получение scFv адалимумаба с помощью системы экспрессии в дрожжах Pichia
[716] Намеченные конструкции scFv были такими же, как в предыдущем примере, а применяемые сигнальные пептиды были другими.
[717] Последовательность ДНК, кодирующую scFv адалимумаба, синтезировали и субклонировали с помощью праймеров (прямого

и обратного

, содержащих сайты рестрикции для Xhol и Notl, в вектор экспрессии pPICZα, в котором сигнальный пептид Kex2 обеспечивал внеклеточную секрецию scFv адалимумаба. Экспрессионную плазмиду затем вводили путем трансформации в Pichia pastoris посредством электропорации. Для скрининга в целях выявления клонов с высоким выходом продукта осуществляли ELISA для измерения уровней экспрессии scFv адалимумаба. Из 480 трансформантов отбирали пять для дополнительного индуцирования синтеза белка и изучения с помощью SDS-PAGE. Для последующей крупномасштабной ферментации отбирали клон scFv_1-A2.
[718] Клон scFv_1-A2 с высоким выходом продукта инокулировали в 100 мл сложной буферизированной среды с глицерином (BMGY, содержащей 1% дрожжевой экстракт, 2% пептон, 100 мМ K₃PO₄, 1,34% YNB, 0,4 мг/л биотина и 1% глицерин, рН 6,0) и культивировали при 30°С, 200 об./мин. в течение 24 часов. На следующий день культуру переводили на условия ферментации с выдерживанием при 30°С, 30% растворенного кислорода и рН 6,0. После ферментации в течение 24 часов добавляли источник азота (YE, пептон) и метанол (0,5%, об./об.) для индуцирования экспрессии белка. Надосадочную жидкость культуры собирали для очистки белка.
[719] Масс-спектрометрический анализ показал, что scFv имел m.w., составляющий 27296,28 дальтона. На фигуре 27А показан анализ очищенного scFv адалимумаба по методу SDS-PAGE, а на фигуре 27В показан анализ очищенных scFv адалимумаба по методу ELISA. Размер scFv соответствовал ожидаемому, и scFv адалимумаба, получаемый в дрожжах, связывался с человеческим TNF-α так же хорошо, как и scFv адалимумаба, получаемый в Expi-293F.
[720] Пример 24. Получение аналога CCK
[721] Пептидный аналог

конструировали таким образом, чтобы он состоял из сегмента CCK, содержащего 8 аминокислот, с тремя необычными аминокислотными остатками и следующим за ним N-концевым удлинением из шести аминокислотных остатков (CGGGGS) с цистеиновым остатком на конце. Тирозиновый остаток (Y) был сульфатирован по его ОН-группе в ароматическом кольце, а L(N) представлял собой норлейциновый остаток. Цистеиновый остаток обеспечивал SH-группу для конъюгирования с PEG-малеимидными связывающими ветвями линкерного звена в соответствии с настоящим раскрытием. Пептид синтезировали на заказ в Kelowna Inc., Тайбэй, Тайвань.
[722] Пример 25. Получение ТСО- и DBCO-scFv, специфичных к CD3
[723] Последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 42, синтезировали и экспрессировали в соответствии с вышеприведенными примерами. Последовательности V_L и V_H scFv, специфичного к CD3, представляли собой последовательности V_L и V_H мутантного теплизумаба. Для конъюгирования с Mal-PEG₃-TCO и Mal-PEG₅-DBCO (Conju-Probe, Inc.) цистеиновый остаток на С-конце очищенного scFv мутантного теплизумаба восстанавливали путем инкубирования с 5 мМ DTT при комнатной температуре в течение 4 часов при осторожном встряхивании. Буфер, в котором находились восстановленные scFv антитела к CD3, заменяли на натрий-фосфатный буфер (100 мМ фосфат натрия, рН 7,0, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA) путем применения колонки NAP-10 с Sephadex G-25. После реакции восстановления и замены буфера проводили конъюгирование в течение ночи при комнатной температуре в реакционном молярном соотношении 1:1 ([Mal-PEG₃-TCO или Mal-PEG₅-DBCO:[scFv]]. Избыток сшивающего средства удаляли с помощью колонки для обессоливания, и анализировали scFv-продукты, конъюгированные с ТСО и конъюгированные с DBCO.
[724] Результаты анализа по методу масс-спектроскопии MALDI-TOF указывали на то, что образец scFv, конъюгированного с ТСО, специфичного к CD3, имел m.w., составляющий 28053 дальтона; а образец scFv, конъюгированного с DBCO, специфичного к CD3, имел m.w., составляющий 28178 дальтонов. Чистоту scFv, конъюгированных с ТСО, специфичных к CD3, определяли посредством окрашивания Кумасси 12% геля для SDS-PAGE (данные не показаны). На фигуре 28А и фигуре 28В соответственно показан анализ scFv, конъюгированного с ТСО, и scFv, конъюгированного с DBCO, специфичных к CD3, по методу ELISA, в котором scFv антитела к PD1 и scFv антитела к CD3 применяли соответственно в качестве отрицательного контроля и положительного контроля. В соответствии с результатами ELISA как scFv, конъюгированный с ТСО, так и scFv, конъюгированный с DBCO, специфичные к CD3, связывались с белком слияния CD3-FC.
[725] Пример 26. Конъюгирование трех scFv, специфичных к CD79b, с тремя PEG₁₂-малеимидными связывающими ветвями, размещенными на основе из тетразин-функционализированного пептида 2
[726] Задачей данного примера является демонстрация того, что три scFv можно конъюгировать с тремя PEG₁₂-малеимидными связывающими ветвями, размещенными на основе из тетразин-функционализированного пептида 2. Перед конъюгированием с тетразин-функционализированным пептидом 2, имеющим три PEG₁₂-малеимидные связывающие ветви, scFv 1F10 инкубировали с DTT в молярном соотношении 2:1 ([DTT]:[scFv]) при 25°С в течение 4 часов при осторожном встряхивании для сохранения его С-концевого цистеина в восстановленной форме. После этого буфер, в котором находились восстановленные scFv 1F10, заменяли на буфер для реакции присоединения между малеимидной группой и SH-группой (100 мМ фосфат натрия, рН 7,0, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA) путем применения колонки NAP-10 с Sephadex G-25 (GE Healthcare). После восстановления и замены буфера проводили конъюгирование с тетразин-функционализированным пептидом 2, имеющим три PEG₁₂-малеимидных связывающих ветви, в течение ночи при 4°С в молярном соотношении 1:4 ([линкер]:[белок]).
[727] Пример 27. Очистка нацеливающего линкерного звена, содержащего три scFv, специфичных к CD79b, связанных с тремя PEG₁₂-малеимидными связывающими ветвями, размещенными на основе из тетразин-функционализированного пептида 2
[728] Реакционную смесь из предыдущего примера вносили в колонку для эксклюзионной хроматографии с S75. Тетразин-функционализированный пептид 2, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом и конъюгированный с тремя scFv, специфичными к CD79b, отделяли от свободного scFv, свободного тетразин-функционализированного пептида 2, конъюгированного с PEG₁₂-малеимидом, и тетразин-функционализированного пептида 2, конъюгированного с PEG₁₂-малеимидом и конъюгированного с 1 и двумя scFv, специфичными к CD79b, с помощью колонки для эксклюзионной хроматографии с S75. Фигура 29А представляет собой профиль элюирования синтезированного нацеливающего линкерного звена, состоящего из линкерного звена со свободной тетразиновой функциональной группой и набора из трех scFv, специфичных к человеческому CD79b, в качестве нацеливающих элементов, в ходе FPLC. Продукт (т.е. тетразин-функционализированный пептид 2, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, имеющий свободную тетразиновую функциональную группу и конъюгированный с набором из трех scFv, специфичных к CD79b) был очищен в виде элюируемых фракций и показан на дорожках 5-7 в анализе в 10% геле для SDS-PAGE, показанном на фигуре 29В.
[729] Пример 28. Анализ нацеливающего линкерного звена, содержащего три scFv, специфичных к CD79b, связанных с тремя PEG₁₂-малеимидными связывающими ветвями, размещенными на основе из тетразин-функционализированного пептида 2, с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF
[730] Состав образца нацеливающего линкерного звена из трех scFv, специфичных к CD79b, связанных с тремя PEG₁₂-малеимидными связывающими ветвями, размещенными на основе из тетразин-функционализированного пептида 2, подтверждали путем применения масс-спектрометрии MALDI-TOF. Экспериментальное медианное значение молекулярного веса согласовывалось с теоретическим медианным значением молекулярного веса трех scFv 1F10, конъюгированных с тетразин-функционализированным пептидом 2 с тремя PEG₁₂-малеимидными связывающими ветвями. В соответствии с масс-спектрометрическим профилем на фигуре 29С нацеливающее линкерное звено по настоящему изобретению имело медианный молекулярный вес, составляющий 85996 дальтонов. Ниже проиллюстрировано нацеливающее линкерное звено по настоящему изобретению, состоящее из линкерного звена со свободной тетразиновой функциональной группой и набора из трех scFv, специфичных к человеческому CD79b, в качестве нацеливающих элементов.

[731] Пример 29. Получение нацеливающего линкерного звена на основе тетразин-функционализированного пептида 2 с тремя scFv, специфичными к HER2/neu
[732] Конъюгирование scFv с линкерным звеном, полученным в более раннем примере, а также очистка и анализ продукта были такими же, как описано в предыдущих примерах. На фигуре 30А показан анализ синтезированного продукта по методу SDS-PAGE, указывающий на то, что полученное вещество было относительно чистым. Однако, молекулы со значительным содержанием PEG-компонента, как правило, мигрируют в геле для SDS-PAGE медленнее, чем белки с таким же молекулярным весом. На фигуре 30В показан масс-спектрометрический анализ, указывающий на то, что очищенное линкерное звено имело m.w., составляющий 86120 дальтонов. Ниже проиллюстрировано нацеливающее линкерное звено по настоящему изобретению, состоящее из линкерного звена с одной свободной тетразиновой функциональной группой и набора из трех scFv, специфичных к человеческому HER2/neu, в качестве нацеливающих элементов.

[733] Пример 30. Получение эффекторных линкерных звеньев на основе ТСО-функционализированного пептида 2 с тремя scFv, специфичными к TNF-α или PD-1
[734] Конъюгирование scFv с полученным линкерным звеном, а также очистка и анализ продукта были такими же, как в предыдущих примерах.
[735] На фигуре 30С показан масс-спектрометрический анализ эффекторного линкерного звена по настоящему изобретению, состоящего из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из трех scFv, специфичных к человеческому TNF-α, в качестве эффекторных элементов (проиллюстрированного ниже). Как указано на фигуре 30С, это эффекторное линкерное звено имело молекулярный вес, составляющий 86134 дальтона.

[736] На фигуре 30D и фигуре 30Е соответственно показаны анализы другого эффекторного линкерного звена, имеющего одну свободную функциональную ТСО-группу и набор из трех scFv, специфичных к человеческому PD-1, в качестве эффекторных элементов (проиллюстрированного ниже), по методам SDS-PAGE и масс-спектрометрии. Как указано на фигуре 30Е, это эффекторное линкерное звено имело молекулярный вес, составляющий 88431 дальтон.

[737] Пример 31. Получение нацеливающего линкерного звена на основе тетразин-функционализированного пептида 2 с тремя молекулами пептида CCK
[738] Пептид CCK получали в более раннем примере. Конъюгирование пептида с 3-ветвевым линкером осуществляли согласно описанному в предыдущих примерах. Масс-спектрометрический анализ показал, что линкерное звено с тремя пептидами CCK имело m.w., составляющий 8801 дальтон (фигура 31). В частности, это нацеливающее линкерное звено состояло из линкерного звена со свободной тетразиновой функциональной группой и набора из трех пептидов CCK в качестве нацеливающих элементов.

[739] Пример 32. Получение нацеливающего линкерного звена на основе ТСО-функционализированного пептида 7 с двумя scFv, специфичными к CD20
[740] В этом примере получали линкерное звено с двумя функциональными группами для конъюгирования с различными линкерными звеньями. Данное нацеливающее линкерное звено служило в качестве центрального линкерного звена в молекулярной конструкции с тремя линкерными звеньями, которая содержала два нацеливающих линкерных звена и одно эффекторное линкерное звено. В архитектуре авторов настоящего изобретения два нацеливающих линкерных звена были сочленены посредством реакции iEDDA между тетразиновой группой и ТСО-группой, а центральное линкерное звено и эффекторное линкерное звено были сочленены посредством реакции CuAAC между алкиновой и азидной группами.
[741] Конъюгирование scFv с линкерным звеном, полученным в более раннем примере, а также очистка и анализ продукта были такими же, как описано в предыдущих примерах. Полученное в результате нацеливающее линкерное звено (проиллюстрированное ниже) состояло из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой, свободной алкиновой группой и набора из двух scFv, специфичных к человеческому CD20, в качестве нацеливающих элементов. Масс-спектрометрический анализ, представленный на фигуре 32, указывал на то, что такое нацеливающее линкерное звено имело m.w., составляющий 56949 дальтонов (указано стрелкой).

[742] Пример 33. Конъюгирование двух scFv, специфичных к VEGF-A, с линкерным звеном с одной свободной ТСО-группой и двумя связывающими ветвями PEG с малеимидными группами
[743] Конъюгирование scFv с линкерным звеном, полученным в более раннем примере, а также очистка и анализ продукта были такими же, как описано в предыдущих примерах.
[744] Ниже проиллюстрировано полученное в результате линкерное звено, которое представляет собой эффекторное линкерное звено, состоящее из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из двух scFv, специфичных к человеческому VEGF-A, в качестве эффекторных элементов. Масс-спектрометрический анализ указывал на то, что это линкерное звено имело m.w., составляющий 59187 дальтонов (фигура 33).

[745] Пример 34. Получение молекулярной конструкции с тремя scFv, специфичными к CD79b, в качестве нацеливающих элементов и одним scFv, специфичным к CD3, в качестве эффекторного элемента
[746] В этом примере нацеливающее линкерное звено из предыдущих примеров и TCO-scFv, специфичный к CD3, соединяли посредством реакции iEDDA между тетразиновой группой и ТСО-группой. В частности, нацеливающее линкерное звено имело три scFv, специфичных к CD79b, и одну свободную тетразиновую группу.
[747] Процедуру лигирования тетразиновой группы и ТСО-группы осуществляли в соответствии с инструкциями производителя (Jena Bioscience GmbH, Йена, Германия). Коротко говоря, к раствору, содержащему эффекторное звено, добавляли 113 мкл нацеливающего линкерного звена (12,4 мг/мл) в молярном соотношении 1:2 ([тетразин]:[ТСО]). Реакционную смесь инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре. Продукт подвергали масс-спектрометрическому анализу, и результат указывал на молекулярный вес, составляющий 114025 дальтонов (фигура 34А).
[748] Продукт в виде молекулярной конструкции из одного линкерного звена с тремя scFv, специфичными к CD79b, в качестве нацеливающих элементов и одним scFv, специфичным к CD3, в качестве эффекторного элемента проиллюстрирован ниже.

[749] Пример 35. Получение молекулярной конструкции с тремя scFv, специфичными к HER2/neu, в качестве нацеливающих элементов и одним scFv, специфичным к CD3, в качестве эффекторного элемента
[750] Нацеливающее линкерное звено, полученное в более раннем примере, и TCO-scFv, специфичный к CD3, соединяли посредством реакции iEDDA между тетразиновой группой и ТСО-группой.
[751] Процедуру лигирования тетразиновой группы и ТСО-группы осуществляли согласно описанному в предыдущем примере. Продукт, проиллюстрированный ниже, представлял собой молекулярную конструкцию из одного линкерного звена с тремя scFv, специфичными к HER2/neu, в качестве нацеливающих элементов и одним scFv, специфичным к CD3, в качестве эффекторного элемента. Масс-спектрометрический анализ, показанный на фигуре 34В, указывал на то, что данная молекулярная конструкция имела молекулярный вес, составляющий 112046 дальтонов.

[752] Пример 36. Получение молекулярной конструкции с эффекторным линкерным звеном с двумя scFv, специфичными к VEGF-A, и длинноцепочечным PEG
[753] Длинноцепочечный PEG (линейный, 20 кДа) с тетразиновой группой на одном конце приобретали у Click Chemistry Tools (Скотсдейл, Пенсильвания, США). Соединение эффекторного линкерного звена и длинноцепочечного тетразин-функционализированного PEG осуществляли посредством реакции iEDDA с применением протокола, аналогичного описанному в вышеприведенном примере. На фигуре 35 показан анализ реакционных смесей с ТСО-функционализированным пептидом 1 по методу SDS-PAGE после его конъюгирования с scFv антитела к VEGF-A (дорожка 2) и дополнительно с тетразин-функционализированным PEG весом 20 кДа (дорожка 2). Стрелки №1 и №2 соответственно указывают на ТСО-функционализированный пептид 1, конъюгированный с одним и двумя scFv антитела к VEGF-A; стрелки №3 и №4 соответственно указывают на ТСО-функционализированный пептид 1, конъюгированный с одним и двумя scFv антитела к VEGF-A, а также с одной цепью тетразин-функционализированного PEG весом 20 кДа.
[754] Ниже проиллюстрирована молекулярная конструкция по настоящему изобретению с двумя scFv антитела к VEGF-A и одной цепью PEG весом 20 кДа.

[755] Пример 37. Получение молекулярной конструкции из сочлененных линкеров, состоящей из нацеливающего линкерного звена с тремя scFv, специфичными к CD79b, и эффекторного линкерного звена с пятью молекулами DM1
[756] В этом примере конструировали молекулярную конструкцию из сочлененных линкеров с тремя scFv, специфичными к CD79b, и "связкой" лекарственных средств PEG-(SMCC-DM1)₅. Молекулярную конструкцию получали посредством реакции iEDDA между ТСО-группой и тетразиновой группой, описанной в предыдущих примерах. Продукт, проиллюстрированный ниже, представлял собой молекулярную конструкцию из сочлененных линкеров с тремя scFv, специфичными к CD79b, и одной "связкой" лекарственных средств, имеющей пять молекул DM1. На фигуре 36А, фигуре 36В и фигуре 37 соответственно показаны анализы молекулярной конструкции из сочлененных линкеров по настоящему изобретению по методам SDS-PAGE, масс-спектрометрии (указывающей на молекулярный вес, составляющий 91144 дальтона), и ELISA. Стрелка №1 указывает на линкерное звено с тремя scFv антитела к CD79b; стрелка №2 указывает на молекулярную конструкцию из сочлененных линкеров с тремя scFv антитела к CD79b и "связкой" лекарственных средств с пятью молекулами DM1. Результаты ELISA показали, что линкерное звено с тремя scFv антитела к CD79b и молекулярная конструкция из сочлененных линкеров с тремя scFv антитела к CD79b и "связкой" лекарственных средств из пяти молекул DM1 специфично связывались с белком слияния CD79b-Fc.

[757] Пример 38. Получение молекулярной конструкции из сочлененных линкеров, состоящей из нацеливающего линкерного звена с тремя scFv, специфичными к HER2/neu, и эффекторного линкерного звена с пятью молекулами DM1
[758] В этом примере представлена молекулярная конструкция из сочлененных линкеров (проиллюстрированная ниже) с тремя scFv, специфичными к HER2/neu, и "связкой" лекарственных средств, имеющей пять молекул DM1. На фигуре 38 показан анализ данного продукта по методу SDS-PAGE. Профиль SDS-PAGE линкерного звена с тремя scFv антитела к HER2/neu (без "связки" лекарственных средств) размещен с левой стороны для сравнения. Конъюгирование со "связкой" лекарственных средств из пяти молекул DM1 сделало молекулярную конструкцию большей.

[759] Пример 39. Получение молекулярной конструкции из сочлененных линкеров, состоящей из нацеливающего линкерного звена с тремя молекулами аналога CCK8 и эффекторного линкерного звена с пятью молекулами DM1
[760] В этом примере нацеливающее линкерное звено с тремя молекулами пептидного аналога CCK и одной свободной тетразиновой группой и эффекторное линкерное звено ("связку" лекарственных средств) с пятью молекулами DM1 и одной свободной ТСО-группой соединяли посредством реакции iEDDA, изложенной в предыдущем примере. Ниже проиллюстрированы полученные в результате молекулярные конструкции из сочлененных линкеров, имеющие три пептида CCK8 и одну "связку" лекарственных средств, имеющую пять молекул DM1. На фигуре 39 показан масс-спектрометрический анализ молекулярной конструкции, указывающий на то, что m.w. составляет 16381 дальтон.

[761] Пример 40. Получение молекулярной конструкции из сочлененных линкеров, состоящей из нацеливающего линкерного звена с тремя молекулами аналога CCK8 и эффекторного линкерного звена с пятью хелатообразующими DOTA-группами
[762] В этом примере нацеливающее линкерное звено с тремя молекулами пептидного аналога CCK и одной свободной тетразиновой группой и эффекторное линкерное звено ("связку" лекарственных средств) с пятью DOTA-группами и хелатированным Y⁺³ и одной свободной ТСО-группой соединяли посредством реакции iEDDA, изложенной в предыдущем примере. Ниже проиллюстрирована полученная в результате молекулярная конструкция из сочлененных линкеров, имеющая три пептида CCK8 и одну "связку" лекарственных средств, имеющую пять DOTA-групп и хелатированный Y⁺³. На фигуре 40 показан масс-спектрометрический анализ молекулярной конструкции, указывающий на то, что m.w. составляет 12654 дальтона.

[763] Пример 41. Получение молекулярной конструкции из сочлененных линкеров, состоящей из нацеливающего линкерного звена с тремя scFv, специфичными к HER2/neu, и эффекторного линкерного звена с тремя scFv, специфичными к CTLA-4
[764] В этом примере нацеливающее линкерное звено с тремя scFv, специфичными к HER2/neu, и одной свободной тетразиновой группой и эффекторное линкерное звено с тремя scFv, специфичными к CTLA-4, и одной свободной ТСО-группой соединяли посредством реакции iEDDA, осуществляемой в предыдущих примерах. Полученная в результате молекулярная конструкция из сочлененных линкеров, проиллюстрированная ниже, имела три scFv, специфичных к HER2/neu, и три scFv, специфичных к CTLA-4. В анализе реакционной смеси по методу SDS-PAGE наблюдали полосу, соответствующую размеру приблизительно 230 кДа.

[765] Пример 42. Получение молекулярной конструкции из сочлененных линкеров, состоящей из нацеливающего линкерного звена 1 с тремя scFv, специфичными к CD79b, нацеливающего линкерного звена 2 с двумя scFv, специфичными к CD20, и эффекторного линкерного звена с пятью молекулами DM1
[766] В этом примере нацеливающее линкерное звено (нацеливающее линкерное звено 2) с двумя scFv, специфичными к CD20, из предыдущего примера применяли в качестве центрального линкерного звена, которое было связано с первым нацеливающим звеном (нацеливающим линкерном звеном 1) посредством реакции iEDDA между тетразиновой группой первого нацеливающего линкерного звена и ТСО-группой центрального линкерного звена. Кроме того, центральное линкерное звено и эффекторное линкерное звено были соединены посредством реакции CuAAC между алкиновой группой центрального линкерного звена и азидной группой эффекторного линкерного звена. На фигуре 41 показан анализ реагирующих веществ и реакционной смеси в различных реакционных точках. Интенсивная полоса на дорожке 1 соответствует очищенному scFv антитела к CD20; стрелка 1 на дорожке 2 указывает на линкерное звено с двумя scFv антитела к CD20, одной ТСО-группой и одной алкиновой группой (нацеливающее линкерное звено 2); стрелка №2 на дорожке 3 указывает на линкерное звено с тремя scFv антитела к CD79b и одной тетразиновой группой (нацеливающее линкерное звено 1); стрелка №3 указывает на сочлененные линкеры, содержащие нацеливающие линкерные звенья 1 и 2.
[767] Молекулярная конструкция из сочлененных линкеров по настоящему изобретению, проиллюстрированная ниже, содержала три scFv, специфичных к CD79b (из первого нацеливающего линкерного звена), два scFv, специфичных к CD20 (из центрального, или второго, нацеливающего линкерного звена), и пять молекул DM1 (из эффекторного линкерного звена).

[768] Пример 43. Анализ биологической активности LPS при конъюгировании с пептидной сердцевиной с помощью связывающей ветви
[769] Для тестирования биологической активности LPS в линкерном звене, конъюгированном с LPS, осуществляли клеточный анализ стимуляции TLR 4 с применением набора для выявления HEK-Blue™ (InvivoGen, Сан-Диего, США) в соответствии с инструкцией производителя. Клетки HEK-blue™-hTLR4 экспрессируют два человеческих гена, ген TLR4 и ген корецептора MD-2/CD14, и содержат репортерный ген секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP) для отслеживания активации ядерного фактора (NF)-κB. При взаимодействии с агонистом TLR4 TLR4 передает сигнал к запуску активации NF-κВ и к экспрессии секретируемой щелочной фосфатазы, которую можно выявить путем применения среды для выявления (HEK-Blue™ Detection, среды, применяемой для количественного определения секретируемой щелочной фосфатазы; InvivoGen) и измерить с помощью спектрофотометра.
[770] Коротко говоря, клетки HEK-hTLR4 культивировали при плотности 2,5×10⁴ клеток в 96-луночных планшетах и выдерживали в полной DMEM с селективным антибиотиком нормоцином. Клетки стимулировали различными концентрациями (2-кратными разведениями из 100 мкг/мл) неочищенного LPS, очищенного LPS, LPS, модифицированного дансилгидразином, и LPS, конъюгированного с пептидной сердцевиной, в течение 18 часов. Активацию TLR4 анализировали путем измерения уровня SEAP в культуральной среде с помощью спектрофотометра при 620 нм.
[771] На фигуре 42 показаны результаты анализа биологической активности LPS до и после модификации. Фракцию LPS, подходящую для модификации дансилгидразином, очищали, и она обладала сходной биологической активностью с неочищенным LPS. LPS, модифицированный дансилгидразином, и LPS, конъюгированный с пептидной сердцевиной, имели сравнимые значения частичной активности.
[772] Пример 44. Анализ биологической активности имиквимода при конъюгировании с пептидной сердцевиной с помощью связывающей ветви
[773] Для тестирования биологической активности PEG₅-NHS, конъюгированного с имиквимодом, осуществляли клеточный анализ стимуляции TLR 7 с применением набора для выявления HEK-Blue™ (InvivoGen, Сан-Диего, США) в соответствии с инструкцией производителя. Клетки HEK-blue™-hTLR7 экспрессируют два человеческих гена, ген рецептора TLR7 и репортерный ген секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP). При взаимодействии с агонистом TLR7 TLR7 передает сигнал к запуску активации NF-κВ и к экспрессии секретируемой щелочной фосфатазы, которую можно выявить путем применения среды для выявления (HEK-Blue™ Detection, среды, применяемой для количественного определения секретируемой щелочной фосфатазы; InvivoGen) и измерить с помощью спектрофотометра.
[774] Коротко говоря, клетки HEK-hTLR7 культивировали при плотности 4×10⁴ клеток в 96-луночных планшетах и выдерживали в полной DMEM с селективным антибиотиком нормоцином. Клетки стимулировали различными концентрациями (2-кратными разведениями из 20 мкг/мл) имиквимода и PEG₅-NHS, конъюгированного с имиквимодом, в течение 18 часов. Активацию TLR7 анализировали путем измерения уровня SEAP в культуральной среде с помощью спектрофотометра при 620 нм.
[775] На фигуре 43 показаны результаты анализа биологической активности имиквимода при конъюгировании со связывающей ветвью, указывающие на то, что молекула имиквимода, конъюгированная со связывающей ветвью, обладала сходной биологической активностью с немодифицированным имиквимодом.
[776] Пример 45. Фармакокинетические свойства молекулярной конструкции с двумя scFv антитела к VEGF-A и одной цепью PEG весом 20 кДа у мышей Balb/c
[777] В этом исследовании применяли самок мышей Balb/c mice в возрасте 10 недель. scFv, содержащийся в молекулярных конструкциях, был получен из ранибизумаба, как получали в более раннем примере. Коротко говоря, 100 мкг scFv антитела к VEGF-A и линкерного звена с двумя scFv антитела к VEGF-A и одной цепью PEG весом 20 кДа в 100 мл PBS соответственно инъецировали мышам в хвостовую вену. Образцы крови собирали посредством кровопускания из орбитального синуса через 2, 4, 24, 48 и 72 часа после инъекции. Крови давали свернуться, и собирали сыворотку крови. Концентрацию и активность антитела к VEGF-A анализировали с помощью ELISA с применением 96-луночного планшета, покрытого рекомбинантным белком huVEGF-A в концентрации 2 мкг/мл при 50 мкл на лунку. В лунки добавляли аликвоты сыворотки крови объемом 100 мкл, разведенные в PBS, содержащем 1% BSA и 1% обезжиренное молоко, и инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Затем добавляли 100 мкл белка L, конъюгированного с HRP, разведенного в PBS в соотношении 1:2000, и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Далее для проявления цвета добавляли 50 мкл ТМВ-субстрата. Реакцию останавливали с помощью 50 мкл 1 М HCl. С помощью планшет-ридера измеряли поглощение при 450 нм.
[778] Результаты, обобщенные на фигуре 44, показывают, что в сыворотке крови сохранялись значительные концентрации молекулярной конструкции с 3 scFv, специфичными к VEGF-A, и цепью PEG весом 20 кДа даже через 72 часа после введения.
[779] Пример 46. Значения цитотоксической активности молекулярной конструкции из сочлененных линкеров с 3 scFv антитела к CD79b и пятью молекулами DM1 в отношении клеток Ramos
[780] Клетки Ramos (2×10⁴/лунка) высевали в лунки 96-луночных планшетов в среду RPMI1640, содержащую 10% фетальную бычью сыворотку крови. Через 2 часа клетки обрабатывали различными концентрациями (2-кратными разведениями из 20 нМ) scFv антитела к CD79, линкерного звена с тремя scFv антитела к CD79b (без "связки" лекарственных средств), линкерного звена с пятью молекулами DM1 ("связкой" лекарственных средств) и молекулярной конструкции с тремя scFv антитела к CD79b и пятью молекулами DM1. После инкубирования в течение 6 часов культуральную среду удаляли путем центрифугирования при 300 g в течение 5 минут и заменяли свежей средой, и клетки дополнительно инкубировали в течение еще 24 часов. Затем определяли жизнеспособность клеток с помощью набора реагентов alamarBlue для определения жизнеспособности клеток (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя.
[781] На фигуре 45 показаны результаты определения жизнеспособности клеток Ramos в четырех группах обработки. Молекулярная конструкция с тремя scFv, специфичными к CD79b, и "связкой" лекарственных средств из пяти молекул DM1 вызывала цитолиз примерно 50% клеток Ramos.
[782] Пример 47. Конструирование сегментов генов, кодирующих 2-цепочечный белок слияния на основе Fc IgG4, содержащий scFv, специфичный к человеческому коллагену II типа, и scFv, специфичный к TNF-α
[783] Мышиную В-клеточную гибридому II-II6B3, вырабатывающую антитело к коллагену II типа, приобретали у Банка гибридом для исследований развития в Университете Айовы. Поли(А)+ РНК подвергали обратной транскрипции с помощью системы SuperScript III для ОТ-ПЦР (Invitrogen, Уолтем, США), и синтезировали первую нить кДНК. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности V_H и V_L II-II6B3 не были опубликованы. Для определения последовательностей вариабельных областей II-II6B3 кДНК, кодирующую V_H и V_L, амплифицировали с помощью ПЦР с применением набора ДНК-праймеров, представленных в наборах праймеров для Ig (Novagen, Мэдисон, США), в соответствии с инструкциями производителя. Аминокислотные последовательности V_H и V_L моноклонального антитела II6B3, специфичного к коллагену II типа (CII, или COL2), описаны под SEQ ID NO: 46 и 47. Последовательности V_L и V_H scFv, специфичного к TNF-α, представляли собой последовательности V_L и V_H адалимумаба.
[784] Ниже проиллюстрирована 2-цепочечная молекулярная конструкция в конфигурации белка слияния на основе Fc IgG4. Конфигурацию рекомбинантной цепи scFv1-scFv2-CH2-CH3 (на основе человеческой γ4) создавали путем слияния двух scFv, один из которых являлся специфичным к человеческому коллагену II типа, а другой являлся специфичным к человеческому TNF-α, с N-концом домена СН2 Fc IgG4 с помощью гибкой шарнирной области. Первый scFv (специфичный к коллагену II типа) имел ориентацию V_L-линкер-V_H, а второй scFv (специфичный к TNF-α) находился в ориентации V_H-линкер-V_L. V_L и V_H в каждом из двух scFv были присоединены друг к другу гидрофильным линкером GSTSGSGKPGSGEGSTKG. Два scFv присоединяли друг к другу гибким линкером (GGGGS)₃. Последовательность рекомбинантной цепи в молекулярной конструкции в конфигурации белка слияния на основе Fc IgG4, проиллюстрированной ниже, описана под SEQ ID NO: 48.
[785] Ниже проиллюстрирована конфигурация 2-цепочечной молекулярной конструкции (scFv α коллаген II типа)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 по настоящему изобретению.

[786] Пример 48. Экспрессия и очистка рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4
[787] В этом примере последовательность, кодирующую ген, помещали в кассету экспрессии pcDNA3. Клетки Expi293F высевали при плотности 2,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл в среду для экспрессии Expi293F и выдерживали в течение 18-24 часов перед трансфекцией, чтобы убедиться в том, что клетки на момент трансфекции активно делились. В день трансфекции 7,5×10⁸ клеток в 255 мл среды в 2-литровой смесительной колбе Эрленмейера трансфицировали с помощью реагента для трансфекции ExpiFectamine™ 293. Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С в течение 16-18 часов после трансфекции в орбитальном шейкере (125 об./мин.), и к клеткам в смесительную колбу добавляли усилитель трансфекции 1 и усилитель трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293, и их инкубировали в течение еще 7 дней. Надосадочную жидкость культуры собирали, и рекомбинантные 2-цепочечные белки слияния (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 в среде очищали с помощью хроматографии на белке А. После замены буфера на PBS концентрацию белков (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 определяли и анализировали с помощью SDS-PAGE; см. фигуру 46; II-II6B3 (дорожка 1) и (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 (дорожка 2) анализировали в 10% геле для SDS-PAGE. Молекулярная конструкция в конфигурации слияния с Fc была выявлена как основная полоса, соответствующая приблизительно 80 кДа, что согласовывалось с ожидаемым размером.
[788] Пример 49. Анализ связывания рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 по методу ELISA
[789] Для изучения способности рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 к связыванию с коллагеном II типа осуществляли анализ по методу ELISA с применением адалимумаба и исходного мышиного моноклонального антитела II-II6B3 для сравнения. Планшеты для ELISA покрывали 5 мкг/мл человеческого коллагена II типа (человеческого COL2), мышиного коллагена II типа (мышиного COL2) и куриного коллагена II типа (куриного COL2). 1D11 представлял собой человеческое антитело IgG1 к клещевому аллергену в качестве изотипического контроля. Рекомбинантный 2-цепочечный белок слияния (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4, очищенное антитело к коллагену II типа (II-II6B3) и адалимумаб выявляли соответственно с помощью козьего антитела к Fc человеческого IgG4, козьего антитела к Fc мышиного IgG и козьего антитела к Fc человеческого IgG1, конъюгированных с HRP. Результаты ELISA обобщены на фигуре 47А.
[790] Для изучения способности 2-цепочечного белка слияния (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 к связыванию с человеческим TNF-α осуществляли анализ по методу ELISA вместе с адалимумабом и исходным мышиным моноклональным антителом II-II6B3. Планшеты для ELISA покрывали 1 мкг/мл человеческого TNF-α и 1 мкг/мл человеческого сывороточного альбумина в качестве контроля. Рекомбинантный 2-цепочечный белок слияния (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4, очищенное антитело к коллагену II типа (II-II6B3) и адалимумаб выявляли соответственно с помощью козьего антитела к Fc человеческого IgG4, козьего антитела к Fc мышиного IgG и козьего антитела к Fc человеческого IgG1, конъюгированных с HRP. Результаты, обобщенные на фигуре 47В, показали, что рекомбинантный 2-цепочечный белок слияния (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 проявлял значительную активность связывания в отношении человеческого TNF-α; HSA (человеческий сывороточный альбумин) применяли в качестве контроля.
[791] Пример 50. Получение 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG4, содержащего scFv, специфичный к человеческому коллагену II типа, scFv, специфичный к TNF-α, и scFv, специфичный к человеческому IL-17
[792] Конфигурацию рекомбинантной цепи scFv1-scFv2-CH2-CH3-scFv3 (на основе человеческой γ4) создавали путем слияния трех scFv, при этом первый из них, специфичный к человеческому коллагену II типа, и второй из них, специфичный к TNF-α, сливали с N-концом домена СН2 Fc IgG4 с помощью гибкой шарнирной области, а третий из них, специфичный к IL-17, сливали с С-концом домена CH3.
[793] V_H и V_L scFv, специфичного к коллагену II типа, были получены из моноклонального антитела II-II6B3; V_H и V_L scFv, специфичного к TNF-α, были получены из моноклонального антитела адалимумаба; V_H и V_L scFv, специфичного к IL-17, были получены из секукинумаба. Первый scFv (специфичный к коллагену II типа) имел ориентацию V_L-линкер-V_H, второй scFv (специфичный к TNF-α) находился в ориентации V_H-линкер-V_L, а третий scFv (специфичный к IL-17) находился в ориентации V_L-линкер-V_H. V_L и V_H в каждом из трех scFv были присоединены друг к другу гидрофильным линкером GSTSGSGKPGSGEGSTKG. Первый и второй scFv сливали посредством гибкого линкера (GGGGS)₃.
[794] Последовательность рекомбинантной цепи в молекулярной конструкции в конфигурации белка слияния на основе Fc IgG4, проиллюстрированной ниже, показана под SEQ ID NO: 49. Экспрессию сконструированных генов в клетках Expi293F и очистку экспрессируемого белка слияния осуществляли в соответствии с предыдущими примерами. Определение характеристик новой конструкции осуществляли с помощью SDS-PAGE и ELISA. Антитело секукинумаб (косентикс) приобретали у больницы Чан Гун (Тайбэй, Тайвань); человеческий IL-17 получали от PeproTech (Нью-Джерси, США). На фигуре 48А показаны результаты SDS-PAGE, указывающие на то, что рекомбинантная цепь новой конструкции имела размер, составляющий приблизительно 110 кДа, что согласовывалось с ожидаемым размером. На фигуре 48В показаны результаты ELISA, указывающие на то, что рекомбинантный белок слияния на основе Fc по настоящему изобретению обладал активностью связывания с человеческим коллагеном II типа, человеческим TNF-α и человеческим IL-17.
[795] Ниже проиллюстрирована конфигурация 2-цепочечной молекулярной конструкции (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4-(scFv α IL-17) no настоящему изобретению.

[796] Пример 51. Получение 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG1, содержащего растворимый рецептор TNF-α и scFv, специфичный к коллагену II типа
[797] Конфигурацию рекомбинантной цепи (рецептор TNF-α)-CH2-CH3-(scFv α коллаген II типа) (на основе человеческой γ1) создавали путем слияния человеческого рецептора TNF-α, Fc IgG1 и scFv, специфичного к коллагену II типа. Последовательности рецептора TNF-α и Fc IgG1 представляли собой последовательности этанерцепта. Этанерцепт и scFv сливали посредством гибкого линкера (GGGGS)₃. Последовательность рекомбинантной цепи в молекулярной конструкции в конфигурации белка слияния на основе Fc IgG4 показана под SEQ ID NO: 50.
[798] Экспрессию сконструированных генов в клетках Expi293F и очистку экспрессируемого белка слияния осуществляли в соответствии с предыдущими примерами. Определение характеристик новой конструкции осуществляли с помощью SDS-PAGE и ELISA. Этанерцепт(энбрел)приобретали у больницы Чан Гун (Тайбэй, Тайвань). На фигуре 49А показаны результаты SDS-PAGE, указывающие на то, что рекомбинантная цепь в новой молекулярной конструкции имела размер, составляющий приблизительно 100 кДа, что согласовывалось с ожидаемым размером (молекула этанерцепта имела молекулярный вес, составляющий 150 кДа, а одна ее цепь имела размер, составляющий приблизительно 75 кДа; scFv имел размер, составляющий приблизительно 27 кДа). На фигуре 49В показаны результаты ELISA, указывающие на то, что молекулярная конструкция по настоящему изобретению связывалась с человеческим TNF-α, человеческим коллагеном II типа и мышиным коллагеном II типа.
[799] Ниже проиллюстрирована конфигурация 2-цепочечной молекулярной конструкции (растворимый рецептор TNF-α)-CH2-CH3 IgG1-(scFv α коллаген II типа) по настоящему изобретению.

[800] Пример 52. Получение 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому TNF-α и scFv, специфичный к коллагену II типа
[801] Конфигурацию рекомбинантной цепи IgG-scFv (на основе человеческой γ1) создавали путем слияния интактного антитела, специфичного к человеческому TNF-α, и scFv, специфичного к коллагену II типа (проиллюстрировано ниже). Последовательности интактного антитела представляли собой последовательности адалимумаба. Адалимумаб и scFv сливали посредством гибкого линкера (GGGGS)₃.
[802] Конструкцию из рекомбинантных генов тяжелой и легкой цепей создавали путем внедрения двух генов в кассету экспрессии pG1K с сайтом множественного клонирования. Для получения 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому TNF-α и scFv, специфичный к коллагену II типа, осуществляли введение векторов экспрессии в клетки Expi293F путем трансфекции в соответствии с предыдущими примерами. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому TNF-α и scFv, специфичный к коллагену II типа, указана под SEQ ID NO: 51, а аминокислотная последовательность легкой цепи 2-цепочечного белка слияния указана под SEQ ID NO: 52.
[803] На фигуре 50 показан результат SDS-PAGE, указывающий на то, что рекомбинантная тяжелая цепь в молекулярной конструкции по настоящему изобретению в конфигурации удлиненного IgG имела размер, составляющий приблизительно 75 кДа, что согласовывалось с ожидаемым размером.
[804] Ниже проиллюстрирована конфигурация антитела к человеческому TNF-α по настоящему изобретению в конфигурации удлиненного IgG с scFv, специфичным к человеческому коллагену II типа, на С-конце.

[805] Пример 53. Получение 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому IL-17 и scFv, специфичный к коллагену VII типа
[806] Конфигурацию рекомбинантной цепи IgG-scFv (на основе человеческой γ1) создавали путем слияния интактного антитела, специфичного к человеческому IL-17, и scFv, специфичного к коллагену VII типа. Последовательности интактного антитела представляли собой последовательности секукинумаба. Секукинумаб и scFv сливали посредством гибкого линкера (GGGGS)₃.
[807] Конструкцию из рекомбинантных генов тяжелой и легкой цепей создавали путем внедрения двух генов в кассету экспрессии pG1K с сайтом множественного клонирования. Для получения 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому IL-17 и scFv, специфичный к коллагену VII типа, осуществляли введение векторов экспрессии в клетки Expi293F путем трансфекции в соответствии с предыдущим примером. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому IL-17 и scFv, специфичный к коллагену VII типа, указана под SEQ ID NO: 53, а аминокислотная последовательность легкой цепи 2-цепочечного белка слияния указана под SEQ ID NO: 54.
[808] На фигуре 51А показаны результаты SDS-PAGE, указывающие на то, что рекомбинантная тяжелая цепь новой молекулярной конструкции имела размер, составляющий 75 кДа, что согласовывалось с ожидаемым размером. На фигуре 51В показаны результаты ELISA, указывающие на то, что молекулярная конструкция по настоящему изобретению связывалась с человеческим IL-17 и человеческим коллагеном VII типа. Относительно слабое связывание с коллагеном VII типа было обусловлено низкой концентрацией антигена, применяемого для покрытия планшетов для ELISA.
[809] Ниже проиллюстрировано антитело к человеческому IL-17 по настоящему изобретению в конфигурации удлиненного IgG с scFv, специфичным к человеческому коллагену VII типа, на С-конце.

[810] Пример 54. Получение 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG4, содержащего scFv, специфичный к человеческому коллагену VII типа, и scFv, специфичный к BAFF
[811] кДНК из мышиной В-клеточной гибридомы LH7.2, вырабатывающей mAb-антитело к коллагену VII типа, была получена в дар от доктора Purdie, Отделение Академической Дерматологии и лаборатория изучения опухолей кожи Cancer Research UK в Лондонском университете королевы Марии. Последовательности V_H и V_L моноклонального антитела LH7.2 (SEQ ID NO: 29 и 30) были определены в более раннем примере. Последовательности V_L и V_H scFv, специфичного к BAFF, представляли собой последовательности V_L и V_H белимумаба.
[812] Конфигурацию рекомбинантной цепи scFv1-CH2-CH3-scFv2 (на основе человеческой γ4) (SEQ ID NO: 55) создавали путем слияния двух scFv, разделенных Fc IgG4, один из которых являлся специфичным к коллагену VII типа, а другой являлся специфичным к BAFF, с С-концом домена CH3 Fc IgG4 с помощью гибкого линкера (GGGGS)₃ (проиллюстрировано ниже). Первый scFv (специфичный к коллагену VII типа) имел ориентацию V_L-линкер-V_H, а второй scFv (специфичный к BAFF) находился в ориентации V_H-линкер-V_L. V_L и V_H в каждом из двух scFv были присоединены друг к другу гидрофильным линкером GSTSGSGKPGSGEGSTKG.
[813] Экспрессию сконструированных генов в клетках Expi293F и очистку экспрессируемого белка слияния осуществляли в соответствии с более ранним примером. Определение характеристик новой конструкции осуществляли с помощью SDS-PAGE и ELISA. Антитело белимумаб (бенлиста) приобретали у больницы Чан Гун (Тайбэй); человеческий BAFF получали от GenScript (Нью-Джерси, США). На фигуре 52А показаны результаты SDS-PAGE, указывающие на то, что рекомбинантная цепь в новой молекулярной конструкции имела размер, составляющий приблизительно 80-90 кДа, что согласовывалось с ожидаемым размером или несколько превышало его. На фигуре 52В показаны результаты ELISA, указывающие на то, что новая конструкция специфично связывалась с человеческим BAFF и человеческим коллагеном VII типа.
[814] Ниже проиллюстрирована 2-цепочечная молекулярная конструкция (scFv α коллаген VII типа)-СН2-CH3 IgG4-(scFv α BAFF) по настоящему изобретению в конфигурации слияния с Fc.

[815] Пример 55. Получение 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому BAFF и scFv, специфичный к коллагену VII типа
[816] Конфигурацию рекомбинантной цепи IgG-scFv (на основе человеческой γ1) создавали путем слияния интактного антитела, специфичного к человеческому BAFF, и scFv, специфичного к коллагену VII типа. Последовательности интактного антитела представляли собой последовательности белимумаба. Белимумаб и scFv сливали посредством гибкого линкера (GGGGS)₃.
[817] Конструкцию из рекомбинантных генов тяжелой и легкой цепей создавали путем внедрения двух генов в кассету экспрессии pG1K с сайтом множественного клонирования. Для получения 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому BAFF и scFv, специфичный к коллагену VII типа, осуществляли введение векторов экспрессии в клетки Expi293F путем трансфекции в соответствии с предыдущими примерами.
[818] Аминокислотная последовательность тяжелой цепи 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому BAFF и scFv, специфичный к коллагену VII типа, указана под SEQ ID NO: 56, а аминокислотная последовательность легкой цепи 2-цепочечного белка слияния указана под SEQ ID NO: 57. На фигуре 53А показаны результаты SDS-PAGE, указывающие на то, что рекомбинантная тяжелая цепь новой молекулярной конструкции имела размер, составляющий приблизительно 80 кДа, что согласовывалось с ожидаемым размером. На фигуре 53В показаны результаты ELISA, указывающие на то, что новая конструкция в конфигурации удлиненного IgG специфично связывалась с человеческим BAFF и человеческим коллагеном VII типа.
[819] Ниже проиллюстрирована конфигурация антитела к человеческому BAFF по настоящему изобретению в конфигурации удлиненного IgG с scFv, специфичным к человеческому коллагену VII типа, на С-конце.

[820] Пример 56. Получение 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG4, содержащего scFv, специфичный к человеческому остеонектину, и scFv, специфичный к RANKL
[821] Мышиную В-клеточную гибридому AON-1, вырабатывающую антитело к остеонектину (SPARC), приобретали у Банка гибридом для исследований развития в Университете Айовы. Поли(А)+РНК подвергали обратной транскрипции с помощью системы SuperScript III для ОТ-ПЦР (Invitrogen), и синтезировали первую нить кДНК. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности V_H и V_L AON-1 не были опубликованы. Для определения последовательностей вариабельных областей AON-1 кДНК, кодирующую V_H и V_L, амплифицировали с помощью ПЦР с применением набора ДНК-праймеров, представленных в наборах праймеров для Ig (Novagen), в соответствии с инструкциями производителя. Последовательности V_H и V_L моноклонального антитела AON-1, специфичного к остеонектину, показаны под SEQ ID NO: 58 и 59. Последовательности V_L и V_H scFv, специфичного к RANKL, представляли собой последовательности V_L и V_H деносумаба.
[822] Конфигурацию рекомбинантной цепи scFv1-scFv2-CH2-CH3 (на основе γ4 человека) (SEQ ID NO: 60) создавали путем слияния двух scFv, один из которых являлся специфичным к человеческому остеонектину, а другой являлся специфичным к RANKL, с N-концом домена СН2 Fc IgG4 с помощью гибкой шарнирной области (проиллюстрировано ниже). Первый scFv (специфичный к остеонектину) имел ориентацию V_L-линкер-V_H, а второй scFv (специфичный к RANKL) находился в ориентации V_H-линкер-V_L. V_L и V_H в каждом из двух scFv были присоединены друг к другу гидрофильным линкером GSTSGSGKPGSGEGSTKG. Два scFv сливали посредством гибкого линкера (GGGGS)₃.
[823] Экспрессию сконструированных генов в клетках Expi293F и очистку экспрессируемого белка слияния осуществляли в соответствии с более ранним примером. Определение характеристик связывания белка слияния с человеческим остеонектином и RANKL с помощью ELISA осуществляли в соответствии с предыдущим примером. Определение характеристик новой конструкции осуществляли с помощью SDS-PAGE и ELISA. Антитело деносумаб (пролиа) приобретали у больницы Чан Гун; человеческий RANKL и человеческий остеонектин (SPARC) получали от GenScript. На фигуре 54А показаны результаты SDS-PAGE, указывающие на то, что рекомбинантная цепь в новой молекулярной конструкции имела размер, составляющий приблизительно 80 кДа. На фигуре 54В показаны результаты ELISA, указывающие на то, что новая конструкция в конфигурации слияния с Fc специфично связывалась с человеческим SPARC и человеческим RANKL.
[824] Ниже проиллюстрирована конфигурация 2-цепочечной молекулярной конструкции (scFv α SPARC)-(scFv α RANKL)-Fc hIgG4 по настоящему изобретению.

[825] Пример 57. Получение 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому RANKL и scFv, специфичный к человеческому остеонектину
[826] Конфигурацию рекомбинантной цепи IgG-scFv (на основе человеческой γ1) создавали путем слияния интактного антитела, специфичного к человеческому RANKL, и scFv, специфичного к человеческому остеонектину. Последовательности интактного антитела представляли собой последовательности деносумаба. Деносумаб и scFv сливали посредством гибкого линкера (GGGGS)₃.
[827] Конструкцию из рекомбинантных генов тяжелой и легкой цепей создавали путем внедрения двух генов в кассету экспрессии pG1K с сайтом множественного клонирования. Для получения 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому RANKL и scFv, специфичный к человеческому остеонектину осуществляли введение векторов экспрессии в клетки Expi293F путем трансфекции в соответствии с предыдущими примерами.
[828] Аминокислотная последовательность тяжелой цепи 2-цепочечного белка слияния, содержащего интактное антитело к человеческому RANKL и scFv, специфичный к человеческому остеонектину, указана под SEQ ID NO: 61, а аминокислотная последовательность легкой цепи 2-цепочечного белка слияния указана под SEQ ID NO: 62. На фигуре 55А показаны результаты SDS-PAGE, указывающие на то, что рекомбинантная тяжелая цепь в молекулярной конструкции в конфигурации удлиненного IgG имела размер, составляющий приблизительно 80 кДа. На фигуре 55В показаны результаты ELISA, указывающие на то, что новая конструкция в конфигурации слияния с Fc специфично связывалась с человеческим SPARC и человеческим RANKL
[829] Ниже проиллюстрирована конфигурация антитела к человеческому RANKL по настоящему изобретению в конфигурации удлиненного IgG с scFv, специфичным к человеческому остеонектину на С-конце.

[830] Пример 58. Иммуногистохимический анализ 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG4, содержащего scFv, специфичный к человеческому коллагену II типа, и scFv, специфичный к TNF-α, при связывании с суставным хрящом
[831] Иммуногистологический анализ осуществляли в центральной гистологической лаборатории Научно-исследовательского центра геномики Академии Синикадля изучения того, обладает ли 2-цепочечная молекулярная конструкция (scFv α коллаген II типа)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 (конфигурация проиллюстрирована в более раннем примере) аффинностью связывания с хрящом. Образцы костей и хрящей мышей получали от мышей FVB/N, умерщвленных путем применения СО₂. Бедренные кости, соединенные с феморальными концами большеберцовой кости и надколенника, собирали и фиксировали в 10% забуференном нейтральном формальдегиде при комнатной температуре в течение 48 часов. Образцы затем декальцинировали в 10% EDTA, рН 7,4, в течение 7 дней с ежедневным обновлением раствора. После декальцинации образцы подвергали постфиксации в 10% забуференном нейтральном формальдегиде при комнатной температуре в течение 24 часов и хранили в 70% этаноле при 4°С до дегидратации с помощью гистопроцессора ASP6025 (Leica) и заливки в парафин.
[832] Окрашивание сафранином О осуществляли в соответствии с протоколом, описанным у Schmitz и соавт., 2010. Для иммуноокрашивания срезы толщиной 3 мкм депарафинировали и регидратировали с помощью Leica AutoStainer XL с последующими процедурами окрашивания, описанными в наборе на основе биотина для тирамидной амплификации сигнала (PerkinElmer). Коротко говоря, в срезах проводили гашение эндогенной пероксидазной активности с помощью 3% H₂O₂ в течение 15 минут с последующим демаскированием антигена с помощью 1 мг/мл гиалуронидазы (Sigma Aldrich) при 37°С в течение 20 минут и 20 мкг/мл протеиназы K (TOOLS) при комнатной температуре в течение 10 минут. Далее срезы блокировали в TNB-буфере из набора для TSA. Для окрашивания мышиным антителом II-II6B3 перед блокированием в TNB добавляли дополнительный реагент для блокирования мышиного IgG (Vector Laboratories). Оба первичных антитела II-II6B3 и (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4 применяли при 50 мкг/мл. Козье антитело к Fc мышиного IgG и козье антитело к Fc человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch) применяли при 1,6 мкг/мл для включения в их состав HRP, которая реагировала с добавляемым после этого комплексом биотин-тирамид. Биотиновые метки затем зондировали конъюгатом стрептавидин-HRP и подвергали хромогенной визуализации с помощью диаминобензидинового субстрата (BioGenex). Срезы подвергали контрастному окрашиванию с помощью гематоксилина и заключали с помощью устройства для заключения препаратов под покровное стекло Leica CV5030.
[833] На фигуре 56, панели А-С, показано иммуноокрашивание костного эпифиза мыши моноклональными антителами II-II6B3 (фигура 56, панель А), адалимумабом (фигура 56, панель В) и (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4, т.е. конфигурацией, проиллюстрированной в более раннем примере (фигура 56, панель С), с последующим применением меченных HRP вторичных козьих антител к мышиным иммуноглобулинам или козьих антител к человеческим иммуноглобулинам и тирамидной амплификацией. Коллаген II типа был выявлен в эпифизарном суставном хряще (АС) и в пластинке роста (GP) на панели А фигуры 56 и панели С фигуры 56. Результаты показали, что моноклональное антитело II-II6B3 к коллагену II типа давало заметное окрашивание АС- и GP-частей (фигура 56, панель А), а адалимумаб не характеризовался значительным окрашиванием (фигура 56, панель В). Конструкция по настоящему изобретению также давала положительное окрашивание (фигура 56, панель С). Цвет положительного окрашивания, изначально выявляемый как коричневый, превращался в черный/серый. Масштабная метка представляет 250 мкм.
[834] Пример 59. Иммуногистохимический анализ 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG1, содержащего scFv, специфичный к коллагену II типа, scFv, специфичный к TNF-α, а также scFv, специфичный к IL-17, при связывании с суставным хрящом
[835] Получение тонких срезов тканей, окрашивание 2-цепочечной молекулярной конструкцией (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4-(scFv α IL-17) (конфигурация которой проиллюстрирована в более раннем примере) и контролями осуществляли в соответствии с предыдущими примерами.
[836] На фигуре 56, панели D-E, показано иммуноокрашивание коллагена II типа в костном эпифизе мыши. Срезы феморального конца надколенника мыши толщиной 3 мкм окрашивали моноклональными антителами, мышиным антителом к IL-17a (приобретенным у PeproTech, Нью-Джерси, США) (фигура 56, панель D) и 2-цепочечной конструкцией (scFv α CII)-(scFv α TNF-α)-Fc hIgG4-(scFv α IL-17) по настоящему изобретению (фигура 56, панель Е), с последующим применением меченных HRP вторичных козьих антител к мышиным иммуноглобулинам или козьих антител к человеческим иммуноглобулинам и тирамидной амплификацией. Результаты показали, что монокпональное антитело к IL-17 не характеризовалось значительным окрашиванием, а конструкция по настоящему изобретению характеризовалась умеренным положительным окрашиванием.
[837] Пример 60. Иммуногистохимический анализ 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG1, содержащего растворимый рецептор TNF-α и scFv, специфичный к коллагену II типа, при связывании с суставным хрящом
[838] Получение тонких срезов тканей, окрашивание 2-цепочечной молекулярной конструкцией (растворимый рецептор TNF-α)-CH2-CH3 IgG1-scFv α коллаген II типа (конфигурация которой проиллюстрирована в более раннем примере) и контролями осуществляли в соответствии с предыдущим примером.
[839] Процедура окрашивания была такой же, как в предыдущих примерах. Образцы срезов тканей костного эпифиза мышей были из той же партии. Результаты показали, что положительный контроль II-II6B3 давал сильное окрашивание (фигура 57, панель А), этанерцепт не характеризовался значительным окрашиванием (фигура 57, панель В), а конструкция по настоящему изобретению давала положительное окрашивание АС- и GP-компонентов, содержащих коллаген II типа (фигура 57, панель С).
[840] Пример 61. Биораспределение рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG4, содержащего scFv, специфичный к человеческому остеонектину (SPARC), и scFv, специфичный к RANKL, с применением системы визуализации in vivo
[841] Для конъюгирования деносумаба и (scFv α SPARC)-(scFv α RANKL)-Fc hIgG4 (Пример 56) применяли набор для мечения антител DyLight 680 (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Мышам BALB/c в возрасте 8-10 недель внутривенно инъецировали PBS или 40 мкг меченых антител. В различные моменты времени мышей анестезировали изофлураном в O₂ и помещали в систему визуализации in vivo IVIS Spectrum (PerkinElmer) в положении лежа на спине. Флуоресцентные изображения захватывали при длинах волн возбуждения/испускания = 675/720 с помощью программного обеспечения Living Image версии 3.2.
[842] Для исследования нацеливающего эффекта (scFv α SPARC)-(scFv α RANKL)-Fc hIgG4 сравнивали распределение антител в тканях мышей посредством наблюдения флуоресцентных сигналов с абдоминальной стороны. Флуоресцентные изображения мышей BALB/c получали и анализировали через 30 минут, 3 часа и 28 часов после введения антител, конъюгированных с DyLight 680. Через 30 минут после инъекции проникновение антитела к SPARC, (scFv α SPARC)-(scFv α RANKL)-Fc hIgG4 и BoneTag в конечности было большим, чем наблюдаемое для деносумаба. В дополнение к накоплению в мочевом пузыре, распределение деносумаба, антитела к SPARC и (scFv α SPARC)-(scFv α RANKL)-Fc hIgG4 было более широким через 3 часа, а для BoneTag оно было ограничено головой и конечностями. Костные структуры с оставшимся антителом к SPARC были четко различимы через 28 часов после введения антитела.
[843] На фигуре 58 показано биораспределение флуоресцентно меченных антител in vivo. Мышам BALB/c внутривенно инъецировали PBS (1), деносумаб (2), mAb к SPARC (3), (scFv α SPARC)-(scFv α RANKL)-Fc hIgG4 (4) и BoneTag (5). Изображения захватывали в указанные моменты времени с помощью устройства для визуализации IVIS Spectrum и анализировали с помощью программного обеспечения Living Image. Для проведения различий между аутофлуоресценцией тканей и сигналами от DyLight 680 осуществляли спектральное разделение. Результаты показали, что по сравнению с деносумабом конструкция по настоящему изобретению распределялась более сходно с моноклональным антителом к SPARC через 30 минут после обработки. В более далекие моменты времени на распределение влияли значения периода полувыведения реагентов. Как антитело к SPARC, так и деносумаб представляли собой антитела и имели сходные периоды полувыведения из сыворотки крови.
[844] Пример 62. Получение 2-цепочечной молекулярной конструкции в конфигурации белка слияния на основе Fc IgG1, содержащей EGF в качестве нацеливающего элемента и "связки" цитотоксических молекул в качестве эффекторных элементов
[845] В конфигурации, проиллюстрированной ниже, показано, что 2-цепочечный белок слияния на основе Fc IgG1 был получен путем создания конфигурации рекомбинантной цепи EGF-CH2-CH3 (на основе человеческой γ1). С-конец EGF, содержащего 53 аминокислоты, был связан с М-концом СН2 посредством линкера ASGGGGSGGGGS. С-конец CH3 был удлинен с помощью GGGDC. Цистеиновый остаток на С-конце служил для соединения с линкерным звеном, несущим нагрузку из "связки" цитотоксических средств. Последовательность рекомбинантной пептидной цепи показана под SEQ ID NO: 63. Очистку рекомбинантных белков осуществляли при 4°С с помощью хроматографии на белке А, и чистоту белков анализировали посредством окрашивания Кумасси 12% геля для SDS-PAGE. На фигуре 59А показан анализ 2-цепочечного EGF-CH2-CH3 с С-концевым удлинением и цистеиновым остатком и 2-цепочечного EGF-CH2-CH3-scFv антитела к PD1 по методу SDS-PAGE, указывающий на то, что EGF-CH2-CH3 с С-концевым удлинением имел размер, составляющий приблизительно 38 кДа, a EGF-CH2-CH3-(scFv антитела к PD1) имел размер, составляющий приблизительно 60-65 кДа, что согласовывалось с ожидаемыми размерами.
[846] Ниже проиллюстрирована конфигурация 2-цепочечного EGF-Fc hIgG1 no настоящему изобретению с С-концевым удлинением и цистеиновым остатком.

[847] Пример 63. Соединение 2-цепочечного белка слияния EGF-CH2-CH3 с двумя "связками" лекарственных средств из молекул LPS посредством реакции SPACC
[848] Осуществляли конъюгирование тетразин-PEG₄-Mal с С-концевым цистеиновым остатком 2-цепочечного EGF-CH2-CH3. Аликвоту линкерного звена, конъюгированного с LPS, объемом 0,6 моль смешивали с 0,06 моль 2-цепочечного белка слияния EGF-Fc IgG1 в 0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,0, при комнатной температуре в течение ночи в молярном соотношении 10:1 ([линкер]:[белок]). SH-группу концевого цистеина конъюгировали с малеимид-PEG₄-тетразином. Осуществляли анализ по методу масс-спектрометрии MALDI-TOF для идентификации образования 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG1, конъюгированного с тетразином, посредством реакции между SH-группой и малеимидной группой. Масс-спектрометрический анализ показал, что 2-цепочечный белок слияния на основе Fc IgG1, конъюгированный с тетразином, имел m.w., составляющий 68852.
[849] Дополнительно осуществляли конъюгирование "связки" лекарственных средств (линкерного звена), имеющей свободную ТСО-группу и 2 молекулы LPS, со свободной тетразиновой группой 2-цепочечного EGF-CH2-CH3. К раствору, содержащему 2-цепочечный EGF-CH2-CH3, конъюгированный с тетразином, добавляли 1 мг/мл "связки" лекарственных средств в количестве 100 мкл в молярном соотношении 2:1 ([тетразин]:[ТСО]). Реакционные смеси инкубировали в течение 16 часов при комнатной температуре.
[850] На фигуре 59В показан анализ 2-цепочечного белка слияния на основе Fc IgG1, конъюгированного с линкерным звеном с двумя молекулами LPS, по методу SDS-PAGE. Полоса на дорожке 1 соответствует EGF-CH2-CH3 с С-концевым линкером и цистеиновым остатком, а стрелка на дорожке 2 указывает на EGF-CH2-CH3, конъюгированный со "связкой" лекарственных средств с двумя молекулами LPS.
[851] Ниже проиллюстрирован 2-цепочечный белок слияния на основе Fc IgG1, конъюгированный с линкерным звеном с LPS.

[852] Пример 64. Получение 2-цепочечных молекулярных конструкций в конфигурации слияния с Fc IgG1, содержащих EGF в качестве нацеливающего элемента и scFv, специфичный к PD1, в качестве эффекторного элемента
[853] В конфигурации, проиллюстрированной ниже, показана 2-цепочечная молекулярная конструкция в конфигурации белка слияния с Fc IgG1, содержащая EGF в качестве нацеливающего элемента и scFv, специфичный к PD-1, в качестве эффекторного элемента. 2-цепочечный белок слияния на основе Fc IgG1, 2-цепочечный EGF-Fc hIgG1-(scFv α PD1) (SEQ ID NO: 64), получали путем создания конфигурации рекомбинантной цепи EGF-CH2-CH3-(scFv α PD1) (на основе человеческой γ1). СН2-CH3 представлял собой часть человеческой γ1, а scFv был специфичным к человеческому PD1. V_L и V_H scFv, специфичного к PD1, представляли собой V_L и V_H ниволумаба. С-конец CH3 присоединяли к scFv антитела к PD1 с помощью гибкого линкера (GGGGS)₃. Очистку рекомбинантных белков осуществляли при 4°С с помощью хроматографии на белке А.

[854] Для изучения способности рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1) к связыванию с ERBB1 осуществляли анализ рекомбинантных 2-цепочечных белка слияния EGF-Fc IgG1 и белка слияния EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1) по методу ELISA. Планшеты для ELISA покрывали 1 мкг/мл, 2 мкг/мл и 4 мкг/мл рекомбинантного белка ERBB1. Цетуксимаб представлял собой человеческое антитело IgG1 к человеческому EGFR, и scFv цетуксимаба применяли в качестве положительного контроля. Результаты ELISA, обобщенные на фигуре 60А, показали, что как белок слияния EGF-Fc IgG1, так и белок слияния EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1) связывались с эктодоменом ERBB1 и обладали способностью к связыванию, сравнимой с scFv цетуксимаба. Каждый столбец представляет среднее значение OD450 для образцов в двух повторностях.
[855] Для изучения способности рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1) к связыванию с PD-1 планшеты для ELISA покрывали 1 мкг/мл человеческого рекомбинантного белка PD-1. Герцептин представлял собой человеческое антитело IgG1 к ERBB2, и scFv герцептина применяли в качестве отрицательного контроля. Каждый столбец представляет среднее значение OD450 для образцов в двух повторностях. Результаты ELISA на фигуре 60В показали положительное связывание белка слияния EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1) с человеческим белком PD-1.
[856] Пример 65. Получение 2-цепочечных молекулярных конструкций в конфигурации слияния с Fc IgG1, содержащих EGF в качестве нацеливающего элемента и scFv, специфичный к CD3, в качестве эффекторного элемента
[857] В этом примере 2-цепочечный белок слияния на основе Fc IgG получали путем создания конфигурации рекомбинантной цепи EGF-CH2-CH3-(scFv α CD3) (SEQ ID NO: 65). СН2-CH3 представлял собой часть человеческой γ1, а scFv был специфичным к человеческому CD3. V_L и V_H scFv, специфичного к CD3, представляли собой V_L и V_H теплизумаба. С-конец CH3 присоединяли к scFv антитела к CD3 с помощью гибкого линкера (GGGGS)₃. На фигуре 61А показан анализ 2-цепочечной молекулярной конструкции EGF-Fc hIgG1-(scFv α CD3) (проиллюстрированной ниже) по методу SDS-PAGE.
[858] Для изучения способности рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния EGF-Fc hIgG1-(scFv α CD3) к связыванию с ERBB1, ERBB2 и ERBB3 осуществляли анализ по методу ELISA. Планшеты для ELISA покрывали 1 мкг/мл, 2 мкг/мл и 4 мкг/мл рекомбинантного белка ERBB1, ERBB2 или ERBB3. Результаты ELISA, обобщенные на фигуре 61В, показали, что белок слияния EGF-Fc IgG1 и белок слияния EGF-Fc IgG1-(scFv α CD3) связывались с эктодоменом ERBB1 и обладали способностью к связыванию, сравнимой с scFv цетуксимаба. Каждый столбец представляет среднее значение OD450 для образцов в двух повторностях.
[859] Ниже проиллюстрирована конфигурация 2-цепочечной конструкции EGF-Fc hIgG1-(scFv α CD3) по настоящему изобретению.

[860] Пример 66. Получение 2-цепочечных конструкций EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1, EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CDS), содержащих мутантный EGF EGF(S2W/D3V) в качестве нацеливающего элемента
[861] Было показано, что замена всего лишь двух аминокислот в линейной N-концевой области EGF (Ser-2 на Trp и Asp-3 на Val) была достаточной для того, чтобы обеспечить связывание EGF с гетеродимером ERBB2/ERBB3 и гомодимером ERBB3. EGF(S2W/D3V) представлял собой EGF с заменой двух аминокислот (Ser-2 на Trp и Asp-3 на Val) в N-концевой области. Получали 2-цепочечные белки слияния EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1, EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3), содержащие мутантный EGF EGF(S2W/D3V), и исследовали их связывание с гомодимером ERBB1, гетеродимером ERBB2/ERBB3 и гомодимером ERBB3.
[862] Последовательность рекомбинантной 2-цепочечной конструкции EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1 показана под SEQ ID NO: 66. С-конец CH3 EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) (SEQ ID NO: 67) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) (SEQ ID NO: 68) присоединяли соответственно к scFv антитела к PD-1 и антитела к CD3 с помощью гибкого линкера (GGGGS)₃. На фигуре 62А показан анализ EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1 с С-концевым удлинением (дорожки 1 и 3), EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) (дорожка 2) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) (дорожка 4) по методу SDS-PAGE. Размеры продуктов согласовывались с ожидаемыми размерами. На фигурах 62В и 62С показаны результаты анализов EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) по методу ELISA, a на фигурах 62D и 62Е показаны результаты анализов EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) по методу ELISA в отношении связывания с рекомбинантным PD-1 или рекомбинантным белком слияния CD3-Fc и их связывания с ERBB1, ERBB2 и ERBB3. Результаты показали, что EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) мог связываться с рекомбинантным PD-1, ERBB1 и ERBB3 и что EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) мог связываться с рекомбинантным CD3, ERBB1 и ERBB3.
[863] Ниже проиллюстрирована конфигурация 2-цепочечной конструкции EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1-(scFv α PD-1) по настоящему изобретению.

[864] Ниже проиллюстрирована конфигурация 2-цепочечной конструкции EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1-(scFv α CD3) по настоящему изобретению.

[865] Пример 67. Получение 2-цепочечной молекулярной конструкции в конфигурации белка слияния на основе Fc IgG1, содержащей соматостатин в качестве нацеливающего элемента
[866] 2-цепочечный белок слияния на основе Fc IgG1 был получен путем создания конфигурации рекомбинантной цепи соматостатин-СН2-CH3 (на основе человеческой γ1). С-конец соматостатина, содержащего 14 аминокислот, был связан с N-концом СН2 посредством линкера ASGGGGSGGGGS. С-конец CH3 был удлинен с помощью GGGDC. Цистеиновый остаток на С-конце служил для соединения со "связкой" лекарственных средств. Последовательность рекомбинантной пептидной цепи, содержащей соматостатин и Fc IgG, показана под SEQ ID NO: 69. Также получали две молекулярные конструкции с scFv α PD-1 и scFv α CD3. На фигуре 63 показан SDS-PAGE (в 10% геле) соматостатин-Fc hIgG1 (дорожка 1), соматостатин-Fc hIgG1-(scFv α CDS) (дорожка 2) и соматостатин-Fc hIgG1-(scFv α PD-1) (дорожка 3). Результаты показали, что размеры трех конструкций согласовывались с ожидаемыми размерами.
[867] Ввиду очень небольшого размера соматостатина анализ по методу SDS-PAGE не подходил для определения включения соматостатина в состав белка слияния на основе Fc. Для идентификации соматостатина в молекулярных конструкциях осуществляли тандемный масс-спектрометрический анализ 2-цепочечной конструкции соматостатин-Fc DIgG1-(scFv α PD-1) и 2-цепочечной конструкции соматостатин-Fc hIgG1-(scFv α CD3), расщепленных трипсином. Все масс-спектрометрические эксперименты выполняли с применением масс-спектрометра Bruker Autoflex III для MALDI-TOF/TOF (Бремен, Германия), оснащенного лазером SmartBeam с частотой 200 Гц, в режиме определения положительных ионов с задержкой извлечения в рефлектронном режиме. Сбор данных выполняли в ручном режиме с помощью FlexControl 3.4, а обработку данных осуществляли с помощью FlexAnalysis 3.4 (оба от Bruker Daltonik).
[868] Для идентификации пептида путем поиска по молекулярной массе белкового фрагмента в базе данных белков с помощью поисковой машины Mascot значение соотношения масса/заряд для белкового фрагмента в MS/MS-спектре, соответствующее 741,37 дальтона, сопоставляли с аминокислотной последовательностью фрагмента соматостатина (NFFWK). Значения соотношения масса/заряд для двух белковых фрагментов в MS/MS-спектре, соответствующие 835,45 и 1286,69 дальтона, сопоставляли с аминокислотной последовательностью двух пептидных фрагментов DTLMISR и EPQVYTLPPSR в Fc-области человеческого IgG.
[869] Ниже проиллюстрирована конфигурация 2-цепочечной конструкции соматостатин-Fc hIgG1-(scFv α PD-1) по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 70).

[870] Ниже проиллюстрирована конфигурация 2-цепочечной конструкции соматостатин-Fc hIgG1-(scFv α CD3) по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 71).

[871] Пример 68. Анализ путем окрашивания для изучения связывания 2-цепочечного белка слияния EGF-Fc IgG1, 2-цепочечного белка слияния EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1), 2-цепочечного белка слияния EGF-Fc IgG1-(scFv α CD3), 2-цепочечного белка слияния EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) и 2-цепочечного белка слияния EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) с линией опухолевых клеток, экспрессирующей EGFR
[872] Пять молекулярных конструкций анализировали в отношении их способности к связыванию с EGFR на опухолевых клетках линии А431. А431 представляла собой линию клеток эпидермоидной карциномы человека, экспрессирующую EGFR на высоких уровнях. Анализ осуществляли путем инкубирования 1×10⁵ клеток А431, экспрессирующих EGFR, с 10 мкг/мл каждой конструкции в PBS с 1% BSA на льду в течение 30 мин., применяя scFv-FITC цетуксимаба в качестве положительного контроля. Клетки промывали и инкубировали с козьим антителом к Fc человеческого IgG, конъюгированным с FITC (Caltag, Бакингем, Великобритания), разведенным 1:200 в PBS/BSA, при 4°С в течение 20 минут в темноте. а20, мышиное моноклональное антитело, специфичное к заякоренному в мембране сегменту мембраносвязанного человеческого IgE, и OKT3, мышиное моноклональное антитело, специфичное к человеческому CD3, применяли в качестве отрицательных контролей. Окрашивание клеток анализировали с помощью FACS (FACSCanto II; BD Biosciences) с применением козьего антитела к мышиному IgG или козьего антитела к Fc человеческого IgG, конъюгированного с FITC.
[873] На фигуре 64 показаны результаты анализа EGF-Fc IgG1, EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1), EGF-Fc IgG1-(scFv α CD3), EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1 и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) на клетках А431, экспрессирующих EGFR, путем окрашивания клеток. Все эти пять конструкций характеризовались положительным связыванием с клетками А431 на значительном уровне.
[874] Пример 69. Анализ путем окрашивания, показывающий связывание 2-цепочечного белка слияния EGF-Fc IgG1, 2-цепочечного белка слияния EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1), 2-цепочечного белка слияния EGF-Fc IgG1-(scFv α CD3), 2-цепочечного белка слияния EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) и 2-цепочечного белка слияния EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) с человеческими Т-лимфоцитами
[875] Способность различных конструкций EGF-Fc IgG-scFv к связыванию с человеческими Т-лимфоцитами, экспрессирующими CD3 и PD-1, исследовали с применением фракционированных Т-лимфоцитов периферической крови человека. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из лейкоцитарных пленок здоровых доноров (Taiwan Blood Services Foundation) путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) и подвергали криоконсервации в 90% FBS/10% DMSO. Человеческие Т-клетки получали из РВМС путем истощения популяций клеток, отличных от Т-клеток (отрицательной селекции), с применением набора для выделения общей популяции человеческих Т-клеток (Miltenyi Biotech, Оберн, Калифорния, США). 10 мкг/мл EGF-Fc IgG1 и EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1), EGF-Fc IgG1-(scFv α CD3), EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) инкубировали с 1×10⁵ Т-клеток в PBS с 1% BSA на льду в течение 20 минут. Антитело к PD-1 и ОКТ3 применяли в качестве положительных контролей, а EGF-Fc IgG1 и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1 в качестве отрицательных контролей. Клетки промывали и инкубировали с козьим антителом к Fc человеческого IgG (Caltag) или кроличьим антителом к Fc мышиного IgG (AbD Serotec), конъюгированным с FITC, разведенным 1:200 в PBS/BSA, при 4°С в течение 20 минут в темноте. Образцы анализировали с помощью анализа по методу FACS (FACSCanto II; BD Biosciences). На панелях А-С фигуры 65 показано, что EGF-Fc IgG1-(scFv α PD1) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD1), как и антитело к PD-1, связывались с Т-клетками. На панелях D-F фигуры 65 показано, что EGF-Fc IgG1-(scFv α CD3) и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3), как и антитело OKT3, также связывались с Т-клетками.
[876] Пример 70. Анализ опосредованной Т-клетками цитотоксичности 2-цепочечной конструкции EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) в отношении линий опухолевых клеток MDA-MB-231 и А431
[877] В качестве источника Т-клеток применяли Т-клетки периферической крови человека. Т-клетки получали в соответствии с предыдущим примером. Т-клетки культивировали в присутствии 10 мкг/мл человеческого рекомбинантного IL-2 (PeproTech, Роки-Хилл, США). MAb AN02 к DNP применяли в качестве изотипически сходного контроля.
[878] Аликвоты по 5000 клеток-мишеней А431 в 100 мкл полной среды RPMI покрывали рекомбинантными EGF-Fc hIgG-Cys, EGF-Fc hIgG-scFv α CD3, EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) или изотипически сходными контролями на 30 минут при 37°С в атмосфере 5% CO₂ и затем объединяли с человеческими Т-клетками при различных соотношениях Е:Т, составляющих 20, 10 или 5. Через 24 часа инкубирования анализировали цитотоксичность с помощью люминесцентного способа с применением набора aCella-Tox (Cell Technology, Маунтин-Вью, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Планшет прочитывали с помощью люминометра (мультидетекторного считывающего устройства для микропланшетов, DS Pharma, Осака, Япония).
[879] Опосредованный Т-клетками цитолиз опухолевых клеток, экспрессирующих EGFR, под действием EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1-scFv α CD3 исследовали с применением опухолевых клеток MDA-MB-231 и опухолевых клеток А431. MDA-MB-231 изначально были получены из первичной инвазивной протоковой карциномы с метастатическим плевральным выпотом и широко применялись в исследованиях моделей опухолей. Для этих эффектов цитотоксичности был важен источник Т-клеток. Для изучения цитотоксичности, опосредованной Т-клетками, были выбраны выделенные человеческие Т-лимфоциты от доноров №56 и №59. Клетки MDA-MB-231 инкубировали с 10 мкг/мл EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1 или EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1-scFv α CD3 при 37°С в течение 1 часа, а затем смешивали с человеческими Т-лимфоцитами при различных соотношениях Е:Т, составляющих 20, 10 или 5, и инкубировали в течение 24 часов. MAb цетуксимаб применяли в качестве контроля. Цитолиз анализировали путем применения набора aCella-Tox. Данные, показанные здесь, указывали на то, что EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1, несущий scFv α CD3, привлекал эффекторные клетки для проявления цитолитической активности более эффективно.
[880] На фигурах 66А и 66В показана степень цитолиза клеток А431, экспрессирующих EGFR, при инкубировании с EGF-Fc hIgG1-Cys, EGF-Fc hIgG1-scFv α CD3 и EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3); на фигурах 66С и 66D показана степень цитолиза MDA-MB-231 под действием человеческих Т-лимфоцитов от доноров №56 (фигура 66С) и №59 (фигура 66D) при инкубировании с EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3). Этот результат указывал на то, что EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1-scFv α CD3 опосредовал лизис клеток MDA-MB-231, экспрессирующих EGFR, посредством ADCC in vitro.
[881] Для исследования временной зависимости цитолиза клеток А431 под действием человеческих Т-лимфоцитов при инкубировании с EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3) клетки А431 инкубировали с 10 мкг/мл EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1, EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1-(scFv α CD3) или mAb к HER1 (контроля) при 37°С в течение 1 часа, а затем смешивали с человеческими Т-лимфоцитами, выделенными из человеческих РВМС, при различных соотношениях Е:Т, составляющих 20, 10 или 5, и инкубировали в течение 2 (фигура 67А), 9 (фигура 67В) или 24 (фигура 67С) часов. Результаты, обобщенные на фигурах 67А-67С, указывали на то, что степень цитолиза, вызванногочеловеческими Т-лимфоцитами при инкубировании с EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α CD3), была зависимой от времени.
[882] Пример 71. Анализ опосредованной Т-клетками цитотоксичности 2-цепочечного белка слияния EGF(S2W/D3V)-Fc IgG1-(scFv α PD-1) в отношении опухолевых клеток А431
[883] EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1 и EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1-scFv α PD-1 опосредовали лизис клеток А431, экспрессирующих EGFR, посредством ADCC in vitro. Анализ осуществляли согласно описанному в предыдущем примере. Клетки А431 инкубировали с 10 мкг/мл EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1, EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG1-scFv α PD-1 или mAb к HER1 (контроля) при 37°С в течение 1 часа, а затем смешивали с человеческими Т-лимфоцитами, выделенными из человеческих РВМС, при различных соотношениях Е:Т, составляющих 20, 10 или 5, и инкубировали в течение 24 часов. ADCC анализировали путем применения набора aCella-TOX (Cell Technology Inc.)
[884] На фигуре 68 показана степень цитолиза А431 под действием человеческих РВМС при инкубировании с 2-цепочечной конструкцией EGFw2v3-Fc IgG1-(scFv α PD-1).
[885] Пример 72. Модель опухоли in vivo с рекомбинантными 2-цепочечными белками слияния EGFw2v3-Fc IgG1-(scFv α PD-1) и EGFw2v3-Fc IgG1-(scFv α CD3)
[886] Мышей NOD-SCID NOD.CB17-Prkdcscid/lcrCrlBltw в возрасте трех-четырех недель получали от BioLasco, Тайбэй, Тайвань. Мышам внутрибрюшинно инъецировали 1×10⁶ клеток А431 на мышь за 2 недели до обработки рекомбинантными белками EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG-Cys. EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG-scFv α PD-1, EGF(S2W/D3V)-Fc hIgG-scFv α CD3 или изотипически сходным контролем. Мышей распределяли по группам по пять мышей на группу, и им внутрибрюшинно вводили соответствующий белок при 5 мг/кг в 50 мл PBS 3 раза в неделю. При первой обработке белком каждой мыши также давали 2×10⁷ человеческих РВМС-клеток внутрибрюшинно. РВМС очищали из лейкоцитарных пленок образцов крови здоровых доноров (Taiwan Blood Services Foundation) путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) и подвергали криоконсервации в 90% FBS/10% DMSO. Перед применением РВМС размораживали и культивировали при 2×10⁶ клеток/мл в течение ночи в среде IMDM (Invitrogen), дополненной 10% термоинактивированной FBS, 4 мМ L-глутамином, 25 мМ HEPES, 50 мг/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (в полной среде IMDM). Рост опухоли регистрировали каждые 3-4 дня с помощью штангенциркуля. Мышей умерщвляли в день 35, и s.c. опухоли удаляли, взвешивали и изучали.
[887] Будет понятно, что вышеизложенное описание вариантов осуществления приведено только в качестве примера, и что средние специалисты в данной области могут произвести различные модификации. В вышеизложенном описании, примерах и данных представлено полное описание структуры и применения типичных вариантов осуществления настоящего изобретения. Хотя различные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны выше с определенной степенью конкретности или со ссылкой на один или более отдельных вариантов осуществления, средние специалисты в данной области могут произвести многочисленные изменения раскрытых вариантов осуществления без отступления от сущности или объема настоящего изобретения.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к линкерному звену, и может быть использовано в качестве сшивающего средства для объединения различных антител или иных биологически активных агентов в конъюгаты и построения молекулярных конструкций с конкретной комбинацией нацеливающих и эффекторных элементов с применением химического синтеза, либо рекомбинантной технологии. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 72 пр.

Формула

1. Линкерное звено, содержащее центральную сердцевину, множество связывающих ветвей и необязательно соединяющую ветвь, где
центральная сердцевина содержит (1) первый полипептид, содержащий множество лизиновых (K) остатков, где каждый остаток K отделен от следующего за ним остатка K вставочной последовательностью, содержащей глициновые (G) и сериновые (S) остатки и имеющей длину от 2 до 15 аминокислотных остатков, и количество остатков K находится в диапазоне от 2 до 15; или (2) второй полипептид, содержащий последовательность (Х_аа-K)_n, где каждый Х_аа представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую 2-12 повторяющихся этиленгликолевых (EG) звеньев, а n представляет собой целое число от 2 до 15;
множество связывающих ветвей соответственно связано с остатками К центральной сердцевины, где количество связывающих ветвей находится в диапазоне от 2 до 15, где каждая из связывающих ветвей представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев, и имеет малеимидную группу на своем свободном конце; и
аминокислотный остаток на N- или С-конце центральной сердцевины имеет азидную или алкиновую группу; или аминокислотный остаток на N- или С-конце центральной сердцевины представляет собой цистеиновый остаток, и тиольная группа цистеинового остатка связана с соединяющей ветвью посредством реакции тиольной и малеимидной групп, где соединяющая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-12 повторяющихся EG-звеньев и имеет азидную, алкиновую, тетразиновую или напряженную алкиновую группу на своем свободном конце.
2. Линкерное звено по п. 1, где вставочная последовательность имеет последовательность GS, GGS, GSG или SEQ ID NO: 1-16.
3. Линкерное звено по п. 1 или 2, где аминокислотный остаток, имеющий азидную группу, представляет собой L-азидогомоаланин (AHA), 4-азидо-L-фенилаланин, 4-азидо-D-фенилаланин, 3-азидо-L-аланин, 3-азидо-D-аланин, 4-азидо-L-гомоаланин, 4-азидо-D-гомоаланин, 5-азидо-L-орнитин, 5-азидо-D-орнитин, 6-азидо-L-лизин или 6-азидо-D-лизин; аминокислотный остаток, имеющий алкиновую группу, представляет собой L-гомопропаргилглицин (L-HPG), D-гомопропаргилглицин (D-HPG) или бета-гомопропаргилглицин (β-HPG), напряженная алкиновая группа представляет собой транс-циклооктеновую (ТСО), дибензоциклооктиновую (DBCO), дифторциклооктиновую (DIFO), бициклонониновую (BCN) или дибензоциклооктиновую (DICO) группу; или тетразиновая группа представляет собой 1,2,3,4-тетразиновую, 1,2,3,5-тетразиновую или 1,2,4,5-тетразиновую группы или их производные.

Документы, цитированные в отчёте о поиске

Регуляторы ммр-9 и их применение

Патенты аналоги

Регуляторы ммр-9 и их применение

Авторы

ЧАНГ Тсе-Вен (CN)

ЧУ Хсинг-Мао (CN)

ЧЕН Джоу-Хан (CN)

ЛИН Чун-Йу (CN)

ЛИН Чиен-Джен (CN)

CHANG TSE-WEN

CHU HSING-MAO

CHEN JOU-HAN

LIN CHUN-YU

LIN CHIEN-JEN

CHANG, Tse-Wen

CHU, Hsing-Mao

CHEN, Jou-Han

LIN, Chun-Yu

LIN, Chien-Jen

Патентообладатели

ACADEMIA SINICA

ACADEMIA SINICA

Заявители

ACADEMIA SINICA

ACADEMIA SINICA

СПК: A61K31/397 A61K31/4545 A61K31/4709 A61K31/4745 A61K31/537 A61K31/739 A61K2039/505 A61K47/58 A61K47/60 A61K47/61 A61K47/64 A61K47/6801 A61K47/6803 A61K47/6843 A61K47/6845 A61K47/6849 A61K47/6851 A61K47/6883 A61K51/065 A61K51/088 A61P1/04 A61P17/06 A61P19/02 A61P19/10 A61P27/02 A61P29/00 A61P35/00 A61P35/02 A61P37/00 A61P37/02 A61P37/06 C07K16/18 C07K16/22 C07K16/241 C07K16/244 C07K16/2803 C07K16/2809 C07K16/2818 C07K16/2863 C07K16/2875 C07K16/2887 C07K16/32 C07K16/468 C07K2317/21 C07K2317/24 C07K2317/31 C07K2317/524 C07K2317/526 C07K2317/55 C07K2317/622 C07K2317/64 C07K2317/71 C07K2317/73 C07K2317/732 C07K2317/76 C07K2317/94 C07K2319/30 C07K2319/32 C07K2319/33 C07K14/655 C07K14/705 C07K14/70578 C07K14/7151 C07K14/485

Публикация: 2019-08-01

Дата подачи заявки: 2016-01-18

0

0

0

0

Невозможно загрузить содержимое всплывающей подсказки.

РОССТИП

Поиск по товарам

Добавить свой товар

Сообщества

Товары

Участники

Патенты

Запросов

Поставщикам

О сервисе

Блогерам

Помощь

Представьтесь

Имя

Фамилия

Пароль

Адрес электронной почты

Подтвердить адрес электронной почты