Трансгенный объект сои mon 87708 и способы его применения - RU2624025C2

Чертежи

Показать все 11 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США № 61/243227, зарегистрированной 17 сентября 2009 года, включенной в настоящий документ в качестве ссылки в полном объеме.

ВКЛЮЧЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Список последовательностей, содержащийся в файле "55544-0001_seqlisting.txt", составляющем 19,5 килобайт (размер, определяемый Microsoft Windows®) и созданном 13 августа 2010 года, зарегистрирован посредством этого в электронном виде и включен в настоящий документ в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к трансгенному объекту Glycine max MON 87708. Объект проявляет устойчивость к гербициду дикамба. Изобретение также относится к растениям, частям растений, семенам растений, растительным клеткам, сельскохозяйственной продукции и способам, относящимся к объекту MON 87708, и относится к нуклеотидным молекулам, являющимся уникальными для объекта и созданным применительно к встраиванию трансгенной ДНК в геном растения Glycine max.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соя (Glycine max) является важной сельскохозяйственной культурой во многих регионах мира, и для получения сои с желаемыми свойствами к данной сельскохозяйственной культуре применяют способы биотехнологии. Одним таким желаемым свойством является устойчивость к гербицидам. Экспрессия в растении трансгена устойчивости к гербицидам может придавать растению желаемое свойство устойчивости к гербицидам, но на экспрессию трансгена могут влиять положение на хромосоме и геномный результат встраивания трансгена. Например, в растениях часто наблюдают разнообразие уровня и профиля экспрессии трансгена среди отдельных объектов, отличающихся по участку встраивания трансгена в хромосому, но в остальном идентичных. Также могут существовать нежелательные и/или желательные фенотипические или агрономические различия между объектами. Поэтому часто необходимыми являются получение и анализ большого числа отдельных растительных трансформированных объектов для селекции объекта, обладающего желаемым свойством и оптимальными фенотипическими и сельскохозяйственными характеристиками, необходимыми для того, чтобы делать его подходящим для коммерческих целей. Такая селекция часто требует наличия теплиц и полевых испытаний со многими объектами в течение многих лет во многих местах и в различных условиях, таким образом, можно собирать значительное количество агрономических, фенотипических и молекулярных данных. Затем с целью селекции коммерчески подходящего объекта команды ученых и агрономов должны анализировать полученные данные и наблюдения. Выбрав такой объект, затем можно применять его для интрогрессии желаемого свойства в другое генетическое окружение с применением способов селекции растений и, таким образом, получать ряд различных сортов сельскохозяйственных культур, обладающих желаемым свойством и соответствующим образом приспособленных к конкретным местным условиям выращивания.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к трансгенным растениям сои, обозначаемым как объект MON 87708, проявляющим коммерчески приемлемую устойчивость к применению гербицида дикамба, показательный образец семян которых хранится в American Type Culture Collection (ATCC) как образец № PTA-9670. Изобретение также относится к новым молекулам ДНК, относящимся к объекту сои MON 87708, и способам применения данных молекул. Изобретение также относится к семенам, потомству, частям растений, клеткам и товарам объекта сои MON 87708. Изобретение также относится к способам применения объекта сои MON 87708 и способам получения устойчивой к дикамбе сои.

Изобретение относится к рекомбинантным молекулам ДНК, относящимся к объекту сои MON 87708. Данные рекомбинантные молекулы ДНК могут содержать нуклеотидные молекулы, обладающие нуклеотидной последовательностью, представляющей собой область геномной ДНК, фланкирующую инсерцию трансгена, и/или область инсерции трансгена, и/или непрерывную последовательность любой из данных областей, такой как область соединения между инсерцией трансгена и фланкирующей геномной ДНК объекта сои MON 87708. Изобретение также относится к молекулам ДНК, применимым в качестве праймеров и зондов, характерных для объекта сои MON 87708, и ампликонам, характерным для наличия объекта сои MON 87708. Также описывают растения сои, растительные клетки, части растений, товары, потомство и семена, содержащие данные молекулы.

Изобретение относится к способам, композициям и наборам, применимым для определения наличия и/или отсутствия ДНК, полученной из объекта сои MON 87708, и, таким образом, наличия и/или отсутствия объекта. Изобретение относится к способу определения MON 87708 посредством приведения содержащего ДНК образца в контакт с набором праймеров, с помощью которого при применении в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с геномной ДНК из объекта сои MON 87708 получают амплифицированную ДНК, характерную для объекта сои MON 87708, проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты, таким образом, получения амплифицированной ДНК и определения наличия и/или отсутствия амплифицированной ДНК. Изобретение также относится к способу определения MON 87708 посредством приведения содержащего ДНК образца в контакт зондом, который при применении в реакции гибридизации с ДНК из объекта сои MON 87708 гибридизуется с молекулой ДНК, специфичной для объекта сои MON 87708, проведения реакции гибридизации и определения гибридизации зонда с молекулой ДНК. Также предоставляют наборы, включающие способы и композиции по изобретению, применимые для определения наличия ДНК, полученной из объекта сои MON 87708.

Изобретение относится к растению сои, семенам, растительной клетке, растению-потомку, части растения или товару, полученному из растения, растительной клетки или семян объекта сои MON 87708. Изобретение также относится к растению сои, семенам, растительной клетке, растению-потомку, части растения или товару, содержащим рекомбинантную молекулу ДНК, обладающую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-8 и комплементарных им цепей и их фрагментам. Изобретение также относится к растению сои, семенам, растительной клетке, растению-потомку, части растения или товару, полученным из растения или семян объекта сои MON 87708 и содержащим рекомбинантную молекулу ДНК, из которой в способе амплификации ДНК получают амплифицированную молекулу ДНК, содержащую SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8.

Изобретение относится к способу контроля сорняков в поле посредством посева объекта сои MON 87708 и затем нанесения эффективной дозы гербицида дикамба, способного контролировать сорняки без повреждения растений объекта сои MON 87708. Изобретение также относится к способу контроля сорняков в поле посредством нанесения эффективной дозы гербицида дикамба для контроля сорняков в поле и затем посева объекта сои MON 87708 в поле. Изобретение также относится к способу получения семян сои, по существу не содержащих семена вредоносных видов сорняков, посредством посева семян устойчивого к дикамбе сорта сои MON 87708 в поле, нанесения на поле повсходовой эффективной дозы гербицида дикамба, достаточной для уничтожения вредоносных видов сорняков, и сбора семян с поля.

Изобретение относится к способам получения растения сои и/или семян, устойчивых к нанесению гербицида дикамба, посредством полового скрещивания растения объекта сои MON 87708, содержащего SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, со вторым растением сои, таким образом, получая семена, выращивая семена для получения растений-потомков, обрабатывая растения-потомки дикамбой и выбирая устойчивое к дикамбе растение-потомка. Способы также могут включать самоопыление выбранного растения-потомка для получения множества растений-потомков второго поколения и селекции из них устойчивого к дикамбе растения. Способы также могут включать половое скрещивание выбранного растения-потомка с другим растением сои для получения семян, выращивание семян для получения второго поколения растений-потомков, обработку второго поколения растений-потомков дикамбой и селекцию устойчивого к дикамбе растения-потомка второго поколения. Изобретение относится к способам получения растения сои и/или семян, устойчивых к нанесению гербицида дикамба, посредством самоопыления устойчивого к дикамбе растения объекта сои MON 87708, содержащего SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, таким образом, получая семена, выращивая семена для получения растений-потомков, обрабатывая растения-потомки дикамбой; и селекции растения-потомка, устойчивого к дикамбе.

Изобретение относится к способам определения зиготности растения или семян объекта сои MON 87708, включающим приведение образца ДНК сои в контакт с набором праймеров, содержащим SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, и набором зондов, содержащим SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16; затем осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты с образцом, набором праймеров и набором зондов; затем определение в данной реакции амплификации нуклеиновой кислоты первого флуоресцентного сигнала, характерного для объекта MON 87708, и второго флуоресцентного сигнала, отличающегося от первого флуоресцентного сигнала и характерного для геномной ДНК природной сои, соответствующей положению инсерции трансгена объекта MON 87708; и анализ наличия и/или отсутствия первого флуоресцентного сигнала и второго флуоресцентного сигнала в реакции амплификации нуклеиновой кислоты, где наличие обоих флуоресцентных сигналов свидетельствует о том, что образец является гетерозиготным по объекту MON 87708, и наличие только первого флуоресцентного сигнала свидетельствует о том, что образец является гомозиготным по объекту MON 87708.

Изобретение также относится к растению сои, семенам, растительной клетке или части растения, содержащим область гаплотипа сои в группе сцепления 9 в приблизительном положении 143.5, содержащую ген устойчивости к дикамбе и далее определяемую по "скользящему окну" гаплотипа 19743 и 19767, и способам их применения. Указанные выше и другие аспекты изобретения станут более очевидными из последующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлена организация трансгенной инсерции в геноме объекта сои MON 87708; [A] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 1, представляющей собой шестьдесят нуклеотидов соединения между геномной ДНК сои и 5'-областью инсерции ДНК трансгена; [Α'] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 7, представляющей собой сто нуклеотидов соединения между геномной ДНК сои и 5'-областью инсерции ДНК трансгена; [B] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 2, представляющей собой шестьдесят нуклеотидов соединения между геномной ДНК сои и 3'-областью инсерции ДНК трансгена; [Β'] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 8, представляющей собой сто нуклеотидов соединения между геномной ДНК сои и 3'-областью инсерции ДНК трансгена; [C] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 3, являющейся последовательностью генома сои, фланкирующей условно выделенный/обозначенный 5'-конец встроенной в геном объекта MON 87708 экспрессирующей кассеты; [D] соответствует относительному положению SEQ ID NO: 4, являющейся последовательностью генома сои, фланкирующей условно выделенный/обозначенный 3'-конец встроенной в геном объекта MON 87708 экспрессирующей кассеты; [E] представляет различные элементы, содержащие SEQ ID NO: 5, и является последовательностью встроенной в геном объекта MON 87708 экспрессирующей кассеты; и [F] представляет непрерывную последовательность (предоставляемую как SEQ ID NO: 6), содержащую, как представлено на фигуре слева направо, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 4, в которые включают SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, т.к. данные последовательности присутствуют в геноме объекта MON 87708.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 является последовательностью шестидесяти нуклеотидов, представляющей собой 5'-соединение между геномной ДНК сои и встроенной трансгенной экспрессирующей кассетой. SEQ ID NO: 1 помещают в SEQ ID NO: 6 в нуклеотидное положение 1097-1156.

SEQ ID NO: 2 является последовательностью шестидесяти нуклеотидов, представляющей собой 3'-соединение между геномной ДНК сои и встроенной трансгенной экспрессирующей кассетой. SEQ ID NO: 2 помещают в SEQ ID NO: 6 в нуклеотидное положение 4100-4159.

SEQ ID NO: 3 является 5'-последовательностью, фланкирующей встроенную ДНК объекта сои MON 87708 до области инсерции трансгенной ДНК и включая ее.

SEQ ID NO: 4 является 3'-последовательностью, фланкирующей встроенную ДНК объекта сои MON 87708 до области инсерции трансгенной ДНК и включая ее.

SEQ ID NO: 5 является последовательностью встроенной трансгенной экспрессирующей кассеты.

SEQ ID NO: 6 является нуклеотидной последовательностью, представляющей собой контиг 5'-последовательности, фланкирующей встроенную ДНК объекта сои MON 87708 (SEQ ID NO: 3), последовательность встроенной ДНК (SEQ ID NO: 5), и 3' последовательности, фланкирующей встроенную ДНК объекта сои MON 87708 (SEQ ID NO: 4), и включает SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 7 является последовательностью ста нуклеотидов, представляющей собой 5'-соединение между геномной ДНК сои и встроенной трансгенной экспрессирующей кассетой.

SEQ ID NO: 8 является последовательностью ста нуклеотидов, представляющей собой 3'-соединение между геномной ДНК сои и встроенной трансгенной экспрессирующей кассетой.

SEQ ID NO: 9 является последовательностью праймера, обозначаемого как праймер SQ13570 и применяемого для идентификации объекта сои MON 87708. Он комплементарен встроенной экспрессирующей кассете в области, близкой к 3'-краю инсерции трансгена. ПЦР-ампликон, получаемый при анализе TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) с применением сочетания праймеров SQ13570 и SQ13571 (SEQ ID NO: 10), является положительным результатом наличия объекта MON 87708.

SEQ ID NO: 10 является последовательностью праймера, обозначаемого как праймер SQ13571 и применяемого для идентификации объекта сои MON 87708. Он комплементарен 3'-области, фланкирующей встроенную экспрессирующую кассету и близкой к краю инсерции ДНК трансгена. ПЦР-ампликон, получаемый при анализе TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) с применением сочетания праймеров SQ13570 (SEQ ID NO: 9) и SQ13571, является положительным результатом наличия объекта MON 87708.

SEQ ID NO: 11 является последовательностью зонда, обозначаемого как зонд PB4655 и применяемого для идентификации объекта сои MON 87708. Он комплементарен области, охватывающей 3'-соединение встроенной экспрессирующей кассеты и геномной ДНК. Данный зонд является 6-FAM™-меченым синтетическим олигонуклеотидом. Испускание флуоресцентного сигнала в реакции амплификации с применением праймеров SQ13570 и SQ13571 (SEQ ID NO: 9-10) в сочетании с 6-FAM™-меченым зондом PB4655 является характерным для объекта MON 87708 в анализе TAQMAN®.

SEQ ID NO: 12 является последовательностью праймера, обозначаемого как праймер SQ20632 и применяемого для идентификации зиготности объекта MON 87708.

SEQ ID NO: 13 является последовательностью праймера, обозначаемого как праймер SQ20636 и применяемого для идентификации зиготности сои дикого типа и объекта MON 87708.

SEQ ID NO: 14 является последовательностью праймера, обозначаемого как праймер SQ20637 и применяемого для идентификации зиготности сои дикого типа.

SEQ ID NO: 15 является последовательностью зонда, обозначаемого как зонд PB10130 и применяемого для анализа зиготности объекта MON 87708.

SEQ ID NO: 16 является последовательностью зонда, обозначаемого как зонд PB10131 и применяемого для анализа зиготности сои дикого типа.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Для лучшего определения изобретения и руководства специалистам в данной области в практическом осуществлении изобретения предоставляют следующие определения и способы. Если не указано иначе, термины следует понимать в соответствии с общепринятым применением специалистами в соответствующей области техники.

Изобретение относится к трансгенному объекту сои MON 87708, проявляющему коммерчески приемлемую устойчивость к применению гербицида дикамба. Объект содержит одиночную инсерцию трансгенной ДНК в хромосому/геном идиоплазмы сои. "Объект" получают: (i) трансформацией растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, включающей интересующий трансген, (ii) восстановлением популяции растений, получаемых от инсерции трансгена в геном растения, и (iii) селекцией конкретного растения, отличающегося инсерцией трансгена в конкретном положении в геном растения. Термин "объект" относится к исходному трансформанту, включающему трансген, встроенный в конкретном положении в геном растения. Термин "объект" также относится к потомству трансформанта, включающему трансген, встроенный в конкретном положении в геном растения. Такое потомство можно получать половым ауткроссингом между трансформантом или его потомством и другим растением. Таким другим растением может являться трансгенное растение, содержащее тот же или другой трансген, и/или нетрансгенное растение, такое как один из различных сортов. Даже после повторного обратного скрещивания с реккурентным родителем, встроенная ДНК и фланкирующая ДНК из трансформированного родителя присутствуют в потомстве от скрещивания в том же геномном положении.

Как применяют в настоящем документе, термин "соя" обозначает Glycine max и включает все сорта растений, которые можно скрещивать с соей, включая дикие сорта сои, а также растения, принадлежащие к Glycine, позволяющие осуществлять скрещивание между видами.

Термин "объект" также относится к молекуле ДНК из исходного трансформанта, содержащей встроенную ДНК и фланкирующую геномную ДНК сои, непосредственно прилегающую к каждой стороне встроенной ДНК. Данную молекулу ДНК получают встраиванием трансгенной ДНК в геном растения сои, т.е. трансформацией. Таким образом, данная молекула ДНК содержит нуклеотидную последовательность, специфичную для объекта и уникальную для генома растения сои, в который встраивают трансгенную ДНК, поскольку данная нуклеотидная последовательность содержит последовательность и конкретной области геномной ДНК сои, и трансгенной ДНК инсерции. Таким образом, расположение встроенной ДНК в объекте сои MON 87708 в отношении окружающей ДНК генома растения сои является специфичным и уникальным для объекта сои MON 87708. Данная молекула ДНК также является составной частью хромосомы объекта сои MON 87708 и в связи с этим является стационарной в растении и может передаваться потомству растения.

Объект MON 87708 содержит трансген, придающий устойчивость к применению гербицида дикамба к растению сои. "Дикамба" относится к 3,6-дихлор-2-метоксибензойной кислоте. Дикамба является синтетическим ауксиновым гербицидом, применимым для контроля широколистных сорняков. Растения сои трансформировали монооксигеназой дикамбы (DMO), ферментом, клонированным из Stenotrophomonas maltophilia, как правило, обнаруживаемого в грунтовой ризосфере. Монооксигеназа дикамбы является ферментом, катализирующим деактивацию дикамбы посредством реакции O-деметилирования негербицидного соединения 3,5-дихлорсалициловой кислоты. В некоторых регионах мира семена вредоносных видов сорняков могут контаминировать собранные семена сои, которые могут влиять на здоровье и питание животных, которых кормят контаминированными товарами сои. Данные растения можно удалять с поля сои обработкой гербицидом дикамба. Члены данной группы вредоносных сорняков включают Cardaria spp., Heliotropium spp., Centaurea spp., Senecio spp., Crotalaria spp., Solanum spp., Xanthium spp., Amsinckia spp., Cassia spp., Sesbania spp., Datura spp., Ricinus spp., Argemone spp., Corchorus spp., Impomoea spp. и Echium spp.

Как применяют в настоящем документе, термин "рекомбинантный" относится к форме ДНК, и/или белку, и/или организму, не обнаруживаемых в природе в норме и в связи с этим получаемых вмешательством человека. Таким вмешательством человек может получать рекомбинантную молекулу ДНК и/или рекомбинантное растение. Как применяют в настоящем документе, "рекомбинантная молекула ДНК" является молекулой ДНК, содержащей сочетание молекул ДНК, не существующих в природе совместно, и является результатом вмешательства человека, например, молекулой ДНК, состоящей из сочетания, по меньшей мере, двух гетерологичных друг другу молекул ДНК, и/или молекулой ДНК, искусственно синтезированной и содержащей полинуклеотидную последовательность, отличающуюся от полинуклеотидной последовательности, существующей в природе в норме, и/или молекулой ДНК, содержащей трансген, искусственно встроенный в геномную ДНК клетки-хозяина и соответствующую фланкирующую ДНК генома клетки-хозяина. Примером рекомбинантной молекулы ДНК является описываемая в настоящем документе молекула ДНК, полученная при инсерции трансгена в геномную ДНК сои, которая в конечном итоге может приводить к экспрессии молекулы рекомбинантной РНК и/или белка в таком организме. Как применяют в настоящем документе, "рекомбинантное растение" является растением, не существующим в природе в норме, являющимся результатом вмешательства человека и содержащим трансген и/или гетерологичную молекулу ДНК, встроенную в его геном. В результате таких геномных изменений, рекомбинантное растение заметно отличается от родственного растения дикого типа. Примером рекомбинантного растения является растение сои, описываемое в настоящем документе как объект MON 87708.

Как применяют в настоящем документе, термин "трансген" относится к нуклеотидной молекуле, искусственно встроенной в геном клетки-хозяина. Такой трансген может являться гетерологичным клетке-хозяину. Термин "трансгенное растение" относится к содержащему такой трансген растению.

Как применяют в настоящем документе, термин "гетерологичный" относится к первой молекуле, не обнаруживаемой в природе в норме в сочетании со второй молекулой. Например, молекулу можно получать из первых видов и встраивать в геном вторых видов. Таким образом, молекула будет гетерологичной хозяину и искусственно встроенной в геном клетки-хозяина.

Как применяют в настоящем документе, термин "химерный" относится к отдельной молекуле ДНК, получаемой слиянием первой молекулы ДНК со второй молекулой ДНК, где ни первую, ни вторую молекулу ДНК не обнаруживают в норме в такой конфигурации, т.е. слитой с другой. Таким образом, химерная молекула ДНК является новой молекулой ДНК, в ином случае не обнаруживаемой в норме в природе.

Изобретение относится к молекулам ДНК и их соответствующим нуклеотидным последовательностям. Как применяют в настоящем документе, термин "ДНК", "молекула ДНК", "нуклеотидная молекула" относится к молекуле ДНК геномного или синтетического происхождения, т.е. полимеру дезоксирибонуклеиновых оснований или полинуклеотидной молекуле, читаемой с 5'-конца (в обратном направлении) к 3'-концу (в прямом направлении). Как применяют в настоящем документе, термин "последовательность ДНК", "нуклеотидная последовательность" или "полинуклеотидная последовательность" относится к нуклеотидной последовательности молекулы ДНК. Применяемая в настоящем документе номенклатура предусмотрена Разделом 37 Кодекса федеральных нормативных актов США § 1.822 и изложена в таблицах в WIPO Standard ST.25 (1998), Приложение 2, Таблицы 1 и 3. Как правило, нуклеотидные последовательности по изобретению, предоставляемые как SEQ ID NO: 1-8, и их фрагменты, описывают со ссылкой только на одну цепь из двух комплементарных нуклеотидных цепей. Косвенно, комплементарные последовательности (т.е. последовательности комплементарной цепи), также обозначаемые в данной области как обратные комплементарные последовательности, находятся в объеме изобретения и определенно предназначены для включения в объем заявленного объекта изобретения.

Нуклеотидную последовательность, соответствующую полной нуклеотидной последовательности встроенной трансгенной ДНК и значительным сегментам геномной ДНК сои, фланкирующей конец встроенной трансгенной ДНК, предоставляют в настоящем документе как SEQ ID NO: 6. Ее часть является встроенной трансгенной ДНК, предоставляемой как SEQ ID NO: 5. Нуклеотидную последовательность геномной ДНК сои, физически связанную фосфодиэфирной связью с 5'-концом встроенной трансгенной ДНК и, таким образом, фланкирующую его, представляют, как указано в SEQ ID NO: 3. Нуклеотидную последовательность геномной ДНК сои, физически связанную фосфодиэфирной связью с 3'-концом встроенной трансгенной ДНК и, таким образом, фланкирующую его, представляют, как указано в SEQ ID NO: 4.

Объект сои MON 87708 дополнительно содержит две области, одну, охватывающую 5'-положение, и одну, охватывающую 3'-положение, где трансгенную ДНК встраивают в геномную ДНК, обозначаемые в настоящем документе как 5'- и 3'-соединение, соответственно. "Последовательность соединения" или "область соединения" относится к последовательности ДНК и/или соответствующей молекуле ДНК, охватывающей встроенную трансгенную ДНК и прилегающую фланкирующую геномную ДНК. Последовательности соединения условно можно представлять двумя последовательностями 60 нуклеотидов, предоставляемыми как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, каждая представляющая собой 30 нуклеотидов фланкирующей геномной ДНК, прилегающей к 30 нуклеотидам встроенной ДНК и непрерывной с ними. Альтернативно, последовательности соединения условно можно представлять двумя последовательностями 100 нуклеотидов, предоставляемыми как SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, каждая представляющая собой 50 нуклеотидов фланкирующей геномной ДНК, прилегающей к 50 нуклеотидам встроенной ДНК и непрерывной с ними. Эти нуклеотиды соединены фосфодиэфирной связью и присутствуют в объекте сои MON 87708 как часть генома. В сое идентификация одной или нескольких SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 в образце, полученном из растения сои, семян или части растения, свидетельствует о том, что ДНК получали из объекта сои MON 87708, и она является характерной для наличия в образце ДНК из объекта сои MON 87708. Таким образом, изобретение относится к молекуле ДНК, содержащей, по меньшей мере, нуклеотидную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8. Любой сегмент ДНК, полученный из трансгенного объекта сои MON 87708, достаточный для того, чтобы содержать SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, находится в объеме изобретения. Кроме того, любой полинуклеотид, содержащий последовательность, комплементарную любым последовательностям, описываемым в данном параграфе, находится в объеме изобретения. На фиг.1 представлено физическое расположение SEQ ID NO: 1-5 и 7-8 относительно SEQ ID NO: 6, расположенной от 5' к 3'.

Изобретение относится к примерам молекул ДНК, которые можно применять в качестве праймеров или зондов для определения в образце наличия ДНК, полученной из растения сои объекта MON 87708. Такие праймеры или зонды являются специфичными для целевой последовательности нуклеиновой кислоты и в связи с этим применимы для идентификации последовательности нуклеиновой кислоты объекта сои MON 87708 способами по изобретению, описываемыми в настоящем документе.

Как правило, "праймер" является высокоочищенным выделенным полинуклеотидом, сконструированным для применения в конкретных способах отжига или гибридизации, включающих термическую амплификацию. Можно применять пару праймеров с матрицей ДНК, такой как образец геномной ДНК сои, в термической амплификации, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР), для получения ампликона, где ампликон, получаемый в такой реакции, будет обладать последовательностью ДНК, соответствующей последовательности матрицы ДНК, находящейся между двумя участками гибридизации праймеров на матрице. Как применяют в настоящем документе, "ампликон" является частью или фрагментом ДНК, синтезированным с применением способов амплификации. Ампликон по изобретению содержит, по меньшей мере, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8. Как правило, праймер конструируют для гибридизации с комплементарной целевой цепью ДНК для образования гибрида между праймером и целевой цепью ДНК, и наличие праймера является точкой распознавания полимеразой для начала элонгации праймера (т.е. полимеризации дополнительных нуклеотидов в удлиняющейся нуклеотидной молекуле) с применением целевой цепи ДНК в качестве матрицы. Как применяют в настоящем изобретении, пары праймеров предназначены для обозначения двух праймеров, связывающих противоположные цепи двухцепочечного нуклеотидного сегмента в целях последовательной амплификации полинуклеотидного сегмента между положениями, целевыми для связывания отдельных членов пары праймеров, как правило, в термической реакции амплификации или других общепринятых способах амплификации нуклеиновых кислот. Примеры молекул ДНК, применимых в качестве праймеров, предоставляют как SEQ ID NO: 9-10. Пара праймеров, предоставляемая как SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, применима в качестве первой молекулы ДНК и второй молекулы ДНК, отличающейся от первой молекулы ДНК, и каждая обладает достаточной длиной непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6 для функционирования в качестве ДНК-праймеров, с помощью которых при совместном применении в термической реакции амплификации с матрицей ДНК, получаемой из объекта сои MON 87708, получают ампликон, содержащий SEQ ID NO: 2.

"Зонд" является выделенной нуклеиновой кислотой, комплементарной цепи целевой нуклеиновой кислоты. Зонды по изобретению включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также полиамиды и другие материалы зондов, специфически связывающиеся с целевой последовательностью ДНК, и определение такого связывания может являться применимым в диагностике, различении, определении или подтверждении наличия такой целевой последовательности ДНК в конкретном образце. Зонд можно прикреплять к общепринятой детектируемой метке или репортерной молекуле, например, радиоактивному изотопу, лиганду, хемилюминесцентному средству или ферменту. Пример молекулы ДНК, применимой в качестве зонда, предоставляют как SEQ ID NO: 11.

Зонды и праймеры по изобретению могут обладать полной идентичностью последовательностей с целевой последовательностью, хотя общепринятыми способами можно конструировать праймеры и зонды, отличающиеся от целевой последовательности, сохраняющие способность гибридизоваться преимущественно с целевыми последовательностями. Для того чтобы молекула нуклеиновой кислоты служила в качестве праймера или зонда, ей только необходимо являться достаточно комплементарной в последовательности, чтобы являться способной образовывать стабильную двухцепочечную структуру в конкретных применяемых концентрациях растворителя и соли. Для идентификации в образце наличия трансгенной ДНК из объекта сои MON 87708 можно применять любой общепринятый способ гибридизации или амплификации нуклеиновой кислоты. Как правило, зонды и праймеры составляют, по меньшей мере, приблизительно 11 нуклеотидов, по меньшей мере, приблизительно 18 нуклеотидов, по меньшей мере, приблизительно 24 нуклеотида, или, по меньшей мере, приблизительно 30 нуклеотидов или больше. Такие зонды и праймеры специфически гибридизуют с последовательностью ДНК в строгих условиях гибридизации. Общепринятые строгие условия описывают в Sambrook et al., 1989 и в Haymes et al.: Nucleic acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Как применяют в настоящем документе, две молекулы нуклеиновой кислоты способны специфически гибридизоваться друг к другу, если две молекулы способны образовывать антипараллельную двухцепочечную структуру нуклеиновой кислоты. Молекула нуклеиновой кислоты "комплементарна" другой молекуле нуклеиновой кислоты, если они проявляют полную комплементарность. Как применяют в настоящем документе, молекулы проявляют "полную комплементарность", когда каждый нуклеотид одной из молекул комплементарен нуклеотиду другой. Две молекулы "минимально комплементарны", если они могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, позволяющей им оставаться отожженными друг с другом, по меньшей мере, при общепринятых условиях "пониженной строгости". Аналогично, молекулы являются "комплементарными", если они могут гибридизоваться друг с другом с достаточной стабильностью, позволяющей им оставаться отожженными друг с другом, по меньшей мере, при общепринятых условиях "повышенной строгости". Таким образом, отклонения от полной комплементарности являются допустимыми при условии, что такие отклонения не устраняют полностью способность молекул образовывать двухцепочечную структуру.

Как применяют в настоящем документе, термин "выделенный" относится к молекуле, по меньшей мере, частично отделенной от других молекул, в норме с ней ассоциированных в своем естественном или природном состоянии. В одном из вариантов осуществления термин "выделенный" относится к молекуле ДНК, по меньшей мере, частично отделенной от нуклеиновых кислот, в норме фланкирующих молекулу ДНК в своем естественном или природном состоянии. Таким образом, молекулы ДНК, слитые с регуляторными или кодирующими последовательностями, с которыми они в норме не ассоциированы, например, в результате рекомбинантных способов, в настоящем документе считают выделенными. Такие молекулы считают выделенными даже при встраивании в хромосому клетки-хозяина или присутствии в растворе нуклеиновой кислоты с другими молекулами ДНК.

Для выделения и манипуляций с молекулой ДНК или ее фрагментом, описываемым в настоящем изобретении, можно применять любое количество способов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, технологию ПЦР (полимеразная цепная реакция) можно применять для амплификации конкретной исходной молекулы ДНК и/или для получения вариантов исходной молекулы. Молекулы ДНК или их фрагменты также можно получать другими способами, такими как прямой синтез фрагмента химическими средствами, который общепринято проводят с применением автоматического синтезатора олигонуклеотидов.

Таким образом, молекулы ДНК и соответствующие нуклеотидные последовательности, представленные в настоящем документе являются применимыми, в частности, для идентификации объекта сои MON 87708, селекции сортов растений или гибридов, содержащих объект сои MON 87708, определения наличия в образце ДНК, полученной из трансгенного объекта сои MON 87708, и контроля образцов на наличие и/или отсутствие объекта сои MON 87708 или частей растений, полученных из растений объекта сои MON 87708.

Изобретение относится к растениям сои, потомству, семенам, растительным клеткам, частям растений (таким как пыльца, семязачаток, стручок, ткань цветка, ткань корня, ткань стебля и ткань листа) и товарам. Данные растения, потомство, семена, растительные клетки, части растений и товары содержат определяемое количество полинуклеотида по изобретению, т.е. такого как полинуклеотид, обладающий, по меньшей мере, одной из последовательностей, представленных как SEQ ID NO: 1-8. Растения, потомство, семена, растительные клетки и части растений по изобретению также могут содержать один или несколько дополнительных трансгенов. Такой трансген может являться любой нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок или молекулу РНК, придающей желаемое свойство, включая, в качестве неограничивающих примеров, повышенную устойчивость к насекомым, повышенную эффективность использования воды, повышенную урожайность, повышенную засухоустойчивость, повышенное качество семян, улучшенное питательное качество и/или повышенную устойчивость к гербицидам, где желаемое свойство измеряют в отношении растения сои без такого дополнительного трансгена.

Изобретение относится к растениям сои, потомству, семенам, растительным клеткам и части растения, такой как пыльца, семязачаток, стручок, ткань цветка, корня или стебля и листья, полученным из трансгенного растения объекта сои MON 87708. Показательный образец семян объекта сои MON 87708 депонирован в соответствие с Budapest Treaty в целях предоставления изобретения. Хранилищем, выбранным для получения депозита, является American Type Culture Collection (ATCC) по адресу 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA, Zip Code 20110. В хранилище ATCC семенам объекта MON 87708 присваивали № доступа PTA-9670.

Изобретение относится к микроорганизму, содержащему молекулу ДНК, обладающую SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, присутствующей в его геноме. Примером такого микроорганизма является трансгенная растительная клетка. Микроорганизмы, такие как растительная клетка по изобретению, применимы во многих промышленных областях применения, включая, в качестве неограничивающих примеров: (i) применение в качестве исследовательского инструмента для научного исследования или промышленного исследования; (ii) применение в культуре для получения эндогенного или рекомбинантного углевода, липида, нуклеиновой кислоты или белковых продуктов или низкомолекулярных соединений, которые можно применять для последующих научных исследований или в качестве промышленной продукции; и (iii) применение с современными способами культивирования тканей растений для получения трансгенных растений или культур тканей растений, которые затем можно применять для сельскохозяйственных исследований или производства. В производстве и применении микроорганизмов, таких как трансгенные растительные клетки, применяют современные микробиологические способы и вмешательство человека для получения созданного человеком уникального микроорганизма. В данном способе рекомбинантную ДНК встраивают в геном растительной клетки для получения трансгенной растительной клетки, отдельной и уникальной по отношению к природным растительным клеткам. Затем данную трансгенную растительную клетку можно культивировать подобно бактериям и дрожжевым клеткам с применением современных микробиологических способов, и она может существовать в недифференцированном одноклеточном состоянии. Новая генетическая композиция и генотип растительной клетки являются техническим эффектом, полученным посредством встраивания гетерологичной ДНК в геном клетки. Другим аспектом изобретения является способ применения микроорганизма по изобретению. Способы применения микроорганизмов по изобретению, таких как трансгенные растительные клетки, включают (i) способы получения трансгенных клеток встраиванием рекомбинантной ДНК в геном клетки и затем применения данной клетки для получения дополнительных клеток, обладающих той же гетерологичной ДНК; (ii) способы культивирования клеток, содержащих рекомбинантную ДНК с применением современных микробиологических способов; (iii) способы получения и очистки эндогенного или рекомбинантного углевода, липида, нуклеиновой кислоты или белковых продуктов из культивируемых клеток; и (iv) способы применения современных способов культивирования тканей растений с трансгенными растительными клетками для получения трансгенных растений или культур тканей трансгенных растений.

Растения по изобретению могут передавать потомству объект ДНК, включая трансген. Как применяют в настоящем документе, "потомство" включает любое растение, семена, растительную клетку и/или регенеративную часть растения, содержащую объект ДНК, полученный от родительского растения, и/или полинуклеотид, обладающий, по меньшей мере, одной из последовательностей, предоставленных как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Растения, потомство и семена могут являться гомозиготными или гетерозиготными по трансгену. Потомство можно выращивать из семян, полученных из растения объекта сои MON 87708, и/или из семян, полученных из растения, опыленного пыльцой от растения объекта сои MON 87708.

Растения-потомки могут являться самоопыляемыми (термин, также известный как "самоопыление") для получения чистой селекционной линии растений, т.е. растений, гомозиготных по трансгену. Самоопылением соответствующего потомства можно получать растения, гомозиготные по обоим добавляемым экзогенным генам.

Альтернативно, растения-потомки можно подвергать ауткроссингу, например, скрещивать с другим неродственным растением, для получения сортовых или гибридных семян или растений. Другое неродственное растение может являться трансгенным или нетрансгенным. Таким образом, сортовые или гибридные семена или растение по изобретению можно получать скрещиванием первого родителя без специфической и уникальной ДНК объекта сои MON 87708 со вторым родителем, содержащим объект сои MON 87708, приводящим к гибриду, содержащему специфическую и уникальную ДНК объекта сои MON 87708. Каждый родитель может являться гибридом или инбредным/сортовым при условии, что скрещивание или разведение приводит к растению или семенам по изобретению, т.е. семенам, обладающим, по меньшей мере, одним аллелем, содержащим специфическую и уникальную ДНК объекта сои MON 87708 и/или SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Таким образом, два различных трансгенных растения можно скрещивать для получения гибридного потомка, содержащего два независимо расщепляющихся добавленных экзогенных гена. Например, устойчивую к дикамбе сою MON 87708 можно скрещивать с другим трансгенным растением сои для получения растения, обладающего характеристиками обоих трансгенных родителей. Одним примером этого будет скрещивание устойчивой к дикамбе сои MON 87708 с растением, обладающим одним или несколькими дополнительными свойствами, такими как устойчивость к гербицидам (например, объект сои 40-3-2 или объект сои MON 89788 (публикация патентной заявки США № 20060282915)), устойчивость к насекомым (например, объект сои MON87701 (публикация патентной заявки США № 20090130071)) и/или другими желаемыми свойствами (например, повышенной масляной композицией, такой как объект сои MON87769 (патентная публикация PCT WO2009102873)), приводящее к растению-потомку или семенам, устойчивым к дикамбе и обладающим одним или несколькими дополнительными свойствами. Гербициды, для которых демонстрировали устойчивость трансгенных растений и можно применять способ по изобретению, включают в качестве неограничивающих примеров: глифосат, глуфосинат, сульфонилкарбамиды, имидазолиноны, бромоксинил, далапон, циклогександион, ингибиторы протопорфириногеноксидазы и изоксафлютоловые гербициды. Нуклеотидные молекулы, кодирующие белки, вовлеченные в устойчивость к гербицидам, известны в данной области и включают, в качестве неограничивающих примеров, нуклеотидную молекулу, кодирующую: глифосат-устойчивую 5-энолпирувилшикимат-3-фосфатсинтетазу (EPSPS) (см., например, патенты США №№ 5627061; 5633435; 6040497; 5094945; 5804425; 6248876; 7183110; RE39247); глифосатоксидоредуктазу (GOX) (см., например, патент США № 5776760); глифосат-n-ацетилтрансферазу (GAT); устойчивую к гербицидам ацетолактатсинтазу (ALS, также известную как синтаза ацетогидроксикислот (AHAS)) для устойчивости к сульфонилкарбамидам, имидазолинонам, триазолопиримидинам, пиримидилоксибензоатам, сульфониламинокарбонилтриазолинонам и/или гетероарильным простым эфирам; устойчивую к гербицидам ацетил-коэнзим-A-карбоксилазу (ACCase) или R-2,4-дихлорфеноксипропионатдиоксигеназу (rdpA) для устойчивости к арилоксифеноксипропионату (AOPP) (такому как галоксифоп, квизалофоп, дихлорофоп и дихлофоп); детоксикационный белок, такой как 2,4-D-диоксигеназа (tfdA), R-2,4-дихлорфеноксипропионатдиоксигеназа (rdpA), арилоксиалканоатдиоксигеназа (AAD) и/или S-2,4-дихлорпропдиоксигеназа (sdpA) для устойчивости к синтетическим ауксиновым гербицидам; бромоксинилнитрилазу (Bxn) для устойчивости к бромоксинилу (см., например, патент США № 4810648); фитоендесатуразу (crtl) для устойчивости к норфлуразону; устойчивость к биалофосу (bar) или белок фосфинотрицинацетилтрансферазы (PAT) (см., например, патент США № 5646024 и 5276268) для устойчивости к глуфосинату и биалофосу; и белок устойчивости к гербициду трикетону (мезотриону, темботриону, топромезону, изоксазолу), такой как устойчивая 4-гидроксифенилпируватдиоксигеназа (HPPD), детоксикационный цитохром P450 или обход пути HPPD, такой как HPP оксидаза Artbrobacter globiformis (HPPO) и 4-HPA-1-гидроксилаза (HPAH) и NADH-оксидоредуктаза (HPAC) Pseudomonas acidovorans.

Также предполагают обратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением в качестве вегетативного размножения. Описание других способов скрещивания, общеупотребительных для различных свойств и сельскохозяйственных культур, можно найти в одной из нескольких ссылок, например, Fehr в Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).

Изобретение относится к части растения, полученной из объекта сои MON 87708. Как применяют в настоящем документе, "часть растения" относится к любой части растения, состоящей из материала, полученного из растения объекта сои MON 87708. Части растений включают, в качестве неограничивающих примеров, пыльцу, семязачаток, стручок, ткань цветка, корня или стебля, волокна и листья. Части растений могут являться жизнеспособными, нежизнеспособными, регенеративными и/или нерегенеративными.

Изобретение относится к товару, полученному из объекта сои MON 87708. Как применяют в настоящем документе, "товар" относится к любой композиции или препарату, состоящему из материала, полученного из растения, семян, растительной клетки или части растения объекта сои MON 87708. Товары можно продавать потребителям, и они могут являться жизнеспособными или нежизнеспособными. Нежизнеспособные товары включают, в качестве неограничивающих примеров, нежизнеспособные семена и зерна; обработанные семена, части семян и части растений; обезвоженную ткань растения, замороженную ткань растения и обработанную ткань растения; семена и части растений, обработанных для применения в качестве корма для животных для кормления наземных и/или водных животных, масла, муки грубого помола, муки, хлопьев, отрубей, волокон, молока, сыра, бумаги, сливок, вина и любой другой пищи для потребления человеком; и биомассы и топливных продуктов. Жизнеспособные товары включают, в качестве неограничивающих примеров, семена и растительные клетки. Таким образом, объект сои MON 87708 можно применять для производства любого товара, как правило, получаемого из сои. Любой такой товар, полученный из объекта сои MON 87708, может содержать, по меньшей мере, определяемое количество специфической и уникальной ДНК, соответствующей объекту сои MON 87708 и конкретно может содержать определяемое количество полинуклеотида, содержащего, по меньшей мере, 15 непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Можно применять любой стандартный способ определения нуклеотидных молекул, включая описываемые в настоящем документе способы определения. Товар находится в объеме изобретения, в товаре находится любое определяемое количество SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

Таким образом, растения, потомство, семена, растительные клетки, части растений (такие как пыльца, семязачаток, стручок, ткань цветка, корня или стебля и листья) и товары по изобретению, в частности, применимы для выращивания растений в целях получения семян и/или частей растений объекта сои MON 87708 в сельскохозяйственных целях, получения потомства объекта сои MON 87708 для скрещивания растений и исследовательских целей, применения вместе с микробиологическими способами для промышленного и исследовательского применения и продажи потребителям.

Изобретение относится к способам контроля сорняков и способам получения растений с применением гербицида дикамба и объекта сои MON 87708. Предоставляют способ контроля сорняков в поле, и он состоит из посева сортовых или гибридных растений объекта сои MON 87708 в поле и нанесения на поле гербицидно эффективной дозы дикамбы в целях контроля сорняков в поле без повреждения растений MON 87708. Такое нанесение гербицида дикамба может являться довсходовым, т.е. в любое время после посева семян MON 87708 и до всхода растений MON 87708, или повсходовым, т.е. в любое время после всхода растений MON 87708. Также предоставляют другой способ контроля сорняков в поле, и он состоит из нанесения эффективной дозы гербицида дикамба для контроля сорняков в поле и затем посева объекта сои MON 87708 в поле. Такое нанесение гербицида дикамба будет являться предпосевным, т.е. до посева семян MON 87708, и его можно осуществлять в любое время перед посевом, включая, в качестве неограничивающих примеров, от приблизительно 14 дней перед посевом до приблизительно 1 дня перед посевом. Изобретение также относится к способу получения семян сои, по существу не содержащих семена вредоносных видов сорняков, посредством посева в поле семян устойчивого к дикамбе сорта сои MON 87708, нанесения на поле повсходовой эффективной доза гербицида дикамба, достаточной для гибели вредоносных видов сорняков, и сбора семян с поля. Гербицидно эффективная доза дикамбы для применения в поле должна находится в диапазоне от приблизительно 0,005 фунтов на акр приблизительно до 8 фунтов дикамбы на акр в течение посевного периода. Можно применять многократные нанесения дикамбы в течение посевного периода, например, два нанесения (например, предпосевное нанесение и повсходовое нанесение или довсходовое нанесение и повсходовое нанесение) или три нанесения (например, предпосевное нанесение, довсходовое нанесение и повсходовое нанесение).

Предоставляют способы получения устойчивого к гербицидам растения сои, содержащего последовательности ДНК, специфичные и уникальные для трансгенного объекта MON 87708 по изобретению. Применяемые в данных способах трансгенные растения могут являться гомозиготными или гетерозиготными по трансгену. Получаемые данными способами растения-потомки могут являться сортовыми или гибридными растениями; их можно выращивать из семян, получаемых из растения объекта сои MON 87708 и/или из семян, получаемых из растения, опыленного пыльцой из растения объекта сои MON 87708; и они могут являться гомозиготными или гетерозиготными по трансгену. Затем растения-потомки можно подвергать самоопылению для получения чистой селекционной линии растений, т.е. гомозиготных по трансгену растений, или, альтернативно, можно подвергать ауткроссингу, например, скрещивать с другим неродственным растением, для получения сортовых или гибридных семян или растения.

Устойчивое к нанесению гербицида дикамба растение сои можно получать половым скрещиванием растения объекта MON 87708, содержащего нуклеотидную молекулу, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, с другим растением сои и, таким образом, получением семян, которые затем выращивают в растения-потомки. Затем данные растения-потомки можно обрабатывать гербицидом дикамба для селекции растений-потомков, устойчивых к гербициду дикамба. Альтернативно, данные растения-потомки можно анализировать с применением аналитических способов для выбора растений-потомков, содержащих ДНК объекта MON 87708. Другое применяемое в скрещивании растение может являться или не являться устойчивым к гербициду дикамба и может являться или не являться трансгенным. Полученное растение-потомок и/или семена могут являться сортовыми или гибридными семенами. В осуществлении данного способа этап полового скрещивания одного растения с другим растением, т.е. перекрестное опыление, можно выполнять или облегчать вмешательством человека, например: собирая пыльцу одного растения и приводя данную пыльцу в контакт с пестиком или рыльцем второго растения руками человека; удаляя, разрушая или покрывая тычинки или пыльники растения руками и/или действиями человека (например, посредством удаления соцветий-метелок или нанесения химического гаметоцида) таким образом, что предотвращают природное самоопыление, и для осуществления оплодотворения будет происходить перекрестное опыление; посредством помещения человеком опыляющих насекомых, способных к "направленному опылению" (например, помещая пчелиный улей во фруктовые сады или поля или изолируя растения с опыляющими насекомыми); посредством открытия или удаления человеком частей цветка, делающими возможным помещение или контакт чужеродной пыльцы на пестике или рыльце (например, у сои, в природе обладающей цветками, препятствующими или предотвращающими перекрестное опыление, делающими их природными облигатными самоопылителями без вмешательства человека); избирательным помещением растений (например, умышленным посевом растений в области, доступной для опыления); и/или посредством нанесения химических веществ для ускорения цветения или для обеспечения восприимчивости (рыльца для пыльцы).

Растение сои, устойчивое к нанесению гербицида дикамба, можно получать самоопылением растения объекта MON 87708, содержащего нуклеотидную молекулу, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, и, таким образом, получать семена, выращиваемые затем в растения-потомков. Затем данные растения-потомки можно обрабатывать гербицидом дикамба для селекции устойчивых к гербициду дикамба растений-потомков. Альтернативно, данные растения-потомки можно анализировать с применением аналитических способов для селекции растений-потомков, содержащих ДНК объекта MON 87708. В осуществлении данного способа этап полового скрещивания одного растения с самим собой, т.е. самоопыление или самооплодотворение, можно выполнять или облегчать вмешательством человека, например: собирая пыльцу растения и приводя данную пыльцу в контакт с пестиком или рыльцем того же растения руками человека, и затем, необязательно, предотвращая дальнейшее опыление растения; удаляя, разрушая или покрывая тычинки или пыльники других близкорасположенных растений руками и/или действиями человека (например, посредством удаления соцветий-метелок или нанесения химического гаметоцида) таким образом, что предотвращают природное перекрестное опыление, для осуществления оплодотворения будет происходить самоопыление; посредством помещения человеком опыляющих насекомых, способных к "направленному опылению" (например, отдельно изолируя растение с опыляющими насекомыми); посредством манипуляций человека с цветком или его частями, делающими возможным самоопыление; избирательным помещением растений (например, умышленным посевом растений вне области, доступной для опыления); и/или посредством нанесения химических веществ для ускорения цветения или для обеспечения восприимчивости (рыльца для пыльцы).

Потомство растений сои и семена, включенные в данные способы и получаемые с применением данных способов, будут отличаться от других растений сои, например, потому что потомство растений сои и семена: являются рекомбинантными и в связи с этим полученными вмешательством человека; являются устойчивыми к гербициду дикамба; содержат, по меньшей мере, один аллель, состоящий из ДНК трансгена по изобретению; и/или содержат определяемое количество полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Семена можно выбирать из отдельного растения-потомка, и при условии, что семена содержат SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, они будут находиться в объеме изобретения.

При осуществлении изобретения для получения гибридного потомка, содержащего два независимо расщепляющихся гетерологичных гена, можно скрещивать два различных трансгенных растения. Гомозиготные по обоим генам растения можно получать самоопылением соответствующего потомства. Также включают обратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением в качестве вегетативного размножения. Описание других способов, общеупотребительных для различных свойств и сельскохозяйственных культур, можно найти в одной из нескольких ссылок, например, Fehr в Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).

Растения и семена, применяемые в описываемых в настоящем документе способах, также могут содержать один или несколько дополнительных трансгенов. Такой трансген может являться любой нуклеотидной последовательностью, кодирующей молекулу белка или РНК, придающей желаемое свойство, включая, в качестве неограничивающих примеров, повышенную устойчивость к насекомым, повышенную эффективность использования воды, повышенную урожайность, повышенную засухоустойчивость, повышенное качество семян, улучшенное питательное качество и/или повышенную устойчивость к гербицидам, где желаемое свойство измеряют в отношении растения сои без такого дополнительного трансгена.

Таким образом, способы по изобретению применимы, в частности, для контроля сорняков в поле одновременно с выращиванием растений в целях получения семян и/или части растений объекта сои MON 87708 для сельскохозяйственных или исследовательских целей, селекции потомства объекта сои MON 87708 для скрещивания растений или исследовательских целей и получения растений-потомков и семян объекта сои MON 87708.

Растения, потомство, семена, растительные клетки, части растений (такие как пыльца, семязачаток, стручок, ткань цветка, корня или стебля и листья) и товары по изобретению можно оценивать по композиции ДНК, экспрессии генов и/или экспрессии белков. Такую оценку можно проводить с применением любого стандартного способа, такого как ПЦР, нозерн-блоттинг, саузерн-блоттинг, вестерн-блоттинг, иммунопреципитация и ELISA, или с применением способов определения и/или наборов для определения, предоставляемых в настоящем документе.

Предоставляют способы определения в образце наличия ДНК, полученной из клетки, ткани, семян сои или растения объекта сои MON 87708. Один способ состоит из (i) выделения образца ДНК, по меньшей мере, из одной клетки, ткани, семени или растения сои, (ii) приведения образца ДНК в контакт с парой праймеров, с помощью которой можно получать ампликон из ДНК объекта MON 87708 в подходящих для амплификации ДНК условиях, (iii) осуществления реакции амплификации ДНК, и затем (iv) определения молекулы ампликона и/или подтверждения того, что нуклеотидная последовательность ампликона содержит специфичную для объекта MON 87708 нуклеотидную последовательность, такую как одна, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-8. Ампликон должен являться специфичным для объекта MON 87708, таким как ампликон, содержащий SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Определение специфичной для объекта MON 87708 нуклеотидной последовательности в ампликоне является определяющим и/или характерным для наличия в образце специфичной ДНК объекта сои MON 87708. Пример пары праймеров, с помощью которой можно получать ампликон из ДНК объекта MON 87708 в подходящих для амплификации ДНК условиях, предоставляют как SEQ ID NO: 10-11. Специалист в данной области легко может конструировать другие пары праймеров, и они будут содержать, по меньшей мере, один фрагмент SEQ ID NO: 6. Другой способ определения в образце наличия ДНК, полученной из клетки, ткани, семян сои или растения объекта сои MON 87708, состоит из (i) выделения образца ДНК, по меньшей мере, из одной клетки, ткани, семени или растения сои, (ii) приведения образца ДНК в контакт со специфичным для ДНК объекта MON 87708 ДНК-зондом, (iii) допускания гибридизации зонда и образца ДНК в строгих условиях гибридизации и затем (iv) определения гибридизации между зондом и целевым образцом ДНК. Пример последовательности ДНК-зонда, специфичной для ДНК объекта MON 87708, предоставляют как SEQ ID NO: 11. Специалист в данной области легко может конструировать другие зонды, и они могут содержать, по меньшей мере, один фрагмент SEQ ID NO: 6. Определение гибридизации зонда с образцом ДНК является характерным для наличия в образце специфичной ДНК объекта сои MON 87708. Альтернативно, отсутствие гибридизации характерно для отсутствия в образце специфичной ДНК объекта сои MON 87708.

Предоставляют наборы для определения ДНК, применимые для идентификации в образце ДНК объекта сои MON 87708, и их также можно применять по способам скрещивания растений сои, содержащих соответствующую ДНК объекта. Такие наборы содержат ДНК-праймеры и/или зонды, содержащие фрагменты SEQ ID NO: 1-8. Один пример такого набора содержит, по меньшей мере, одну молекулу ДНК с достаточной длиной непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO: 6 в качестве ДНК-зонда, применимого для определения в образце наличия и/или отсутствия ДНК, полученной из трансгенного объекта сои MON 87708. Полученная из трансгенного объекта сои MON 87708 ДНК будет содержать SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8. Предоставляют молекулу ДНК, достаточную для применения в качестве ДНК-зонда, т.е. применимую для определения, детектирования или диагностирования в образце наличия и/или отсутствия ДНК объекта сои MON 87708, предоставленную как SEQ ID NO: 11. Специалист в данной области легко может конструировать другие зонды, и они должны содержать, по меньшей мере, 15 непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO: 6 и являться достаточно уникальными для ДНК объекта сои MON 87708 для идентификации полученной из объекта ДНК. Другой тип набора содержит пару праймеров, применимых для получения ампликона, применимого для определения в образце наличия и/или отсутствия ДНК, полученной из трансгенного объекта сои MON 87708. В таком наборе применяют способ, включающий приведение образца целевой ДНК в контакт с парой праймеров, как описано в настоящем документе, затем осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты, достаточной для получения ампликона, содержащего SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, и затем определение наличия и/или отсутствия ампликона. Такой способ также может включать секвенирование ампликона или его фрагмента, которое будет являться определяющим, т.е. характерным, для наличия специфичной ДНК объекта сои MON 87708 в образце целевой ДНК. Специалист в данной области легко может конструировать другие пары праймеров, и они должны содержать, по меньшей мере, 15 непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO: 6 и являться достаточно уникальными для ДНК объекта сои MON 87708 для идентификации полученной из объекта ДНК.

Амплификацию нуклеиновой кислоты можно осуществлять любым из различных известных в данной области способов амплификации нуклеиновой кислоты, включая способы термической амплификации. В данной области известно множество способов для определения, количественного анализа и/или секвенирования получаемого данными способами ампликона. Одним примером способа, применимого в практическом осуществлении настоящего изобретения, является TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

Наборы и способы определения по изобретению применимы, в частности, для идентификации объекта сои MON 87708, селекции сортов и гибридов растений, содержащих объект сои MON 87708, определение в образце наличия ДНК, полученной из трансгенного объекта сои MON 87708, и контроля образцов на наличие и/или отсутствие объекта сои MON 87708 или части растений, полученных из объекта сои MON 87708.

Последовательность инсерции гетерологичной ДНК, последовательности соединения или фланкирующие последовательности из объекта сои MON 87708 (образцы семян которых хранятся в ATCC как PTA-9670) можно проверять (и при необходимости корректировать) амплификацией таких последовательностей из объекта с применением праймеров, полученных из предоставляемых в настоящем документе последовательностей, с последующим стандартным секвенированием ДНК ампликона или клонированной ДНК.

Как применяют в настоящем документе, термин "содержащий" означает "включая в качестве неограничивающих примеров".

Следующие примеры включают для демонстрации примеров конкретных предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что описываемые в следующих ниже примерах способы представляют подходы, хорошо работающие по данным авторов изобретения в практическом осуществлении изобретения, и, таким образом, можно предполагать введение в практику примеров предпочтительных способов. Однако, в свете настоящего описания, специалисты в данной области должны понимать, что в описываемых конкретных вариантах осуществления можно осуществлять множество изменений и по-прежнему получать подобный или схожий результат без отступления от сущности и объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Трансформация сои A3525 и селекция объекта MON 87708

Растение сои MON 87708 получали трансформацией сои с помощью агробактерий. Клетки сои трансформировали, и восстанавливали в интактных растениях сои и выбирали из популяции растений отдельные растения, демонстрирующие целостность экспрессирующей кассеты растения и устойчивость к дикамбе. Из данной выборки выбирали растение объекта сои MON 87708 и охарактеризовывали.

Трансгенное устойчивое к дикамбе растение сои MON 87708 получали посредством трансформации меристемы сои с помощью агробактерий с применением трансформирующего вектора PV-GMHT4355. В патенте США № 6384301 (включенном в настоящий документ в качестве ссылки) описывали способ, позволяющий получать трансформированные растения без применения каллюса. В кратком изложении, меристему извлекали из зародышей пророщенных семян сои A3525 (Asgrow, St Louis, MO). После совместного культивирования с несущими вектор Agrobacterium меристему помещали на селективную среду, содержащую глифосат (Monsanto, St Louis, MO), динатриевую соль карбенициллина, натриевую соль цефотаксима и смесь динатриевой соли тикарциллина/клавуланата калия, для ингибирования роста нетрансформированных растительных клеток и избытка Agrobacterium. Затем меристему помещали на среду, способствующую появлению ростков и развитию корня. Выбирали имеющие корни растения с нормальными фенотипическими характеристиками и переносили их на грунт для выращивания и дальнейшей оценки.

Полученные посредством описываемой выше трансформации растения R0 переносили для выращивания на грунт и затем подвергали самоопылению для получения семян R1. В течение последующего самоопыления растений R0 для получения поколения R1 расщепляли несвязанные инсерции Т-ДНК I (экспрессирующая кассета dmo) и Т-ДНК II (экспрессирующая кассета cp4 epsps). Нелетальную дозу глифосата наносили на растения R1. Растения с наименьшими повреждениями выбирали для дальнейших анализов, в то время как не демонстрирующие повреждений растения, т.е. содержащие Т-ДНК II (экспрессирующую кассету cp4 epsps) исключали из дальнейшего анализа. Затем идентифицировали растения R0, содержащие только единственную инсерцию Т-ДНК I (т.е. генетическую кассету dmo). Экспрессирующая кассета Т-ДНК I, содержащая промотор вируса хлоротичной полосатости арахиса (PCISV) с дуплицированной энхансерной областью (P-PCISV.FLt-enh); функционально связанная с лидерной последовательностью ДНК, полученной из РНК-транскрипта вируса гравировки табака (L-TEV); функционально связанная с молекулой ДНК, кодирующей N-концевой транзитный пептид хлоропласта из малой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (SSU) Pisum sativum (TS-RbcS-3C); функционально связанная с частью зрелого белка из малой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (SSU) Pisum sativum (CR-RbcS-3C); функционально связанная с молекулой ДНК, кодирующей монооксигеназу дикамбы (DMO) Stenotrophomonas maltophilia (исходным названием источника гена DMO являлось Pseudomonas maltophilia. Затем данный организм-источник переклассифицировали сначала как Xanthomonas maltophilia и затем как Stenotrophomonas maltophilia); функционально связанная с 3'-UTR молекулы ДНК, полученной из гена малой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы Pisum sativum (T-Ps.RbcS2-E9). Растения выбирали посредством сочетания аналитических способов, включая TaqMan, анализ ПЦР и распыление гербицидов. Объект MON 87708 выбирали из приблизительно 2400 отдельных трансгенных объектов на основе их лучших фенотипических характеристик, сравнительного анализа молекулярного профиля и ассоциации их желаемых гаплотипов. Затем объект MON 87708 скрещивали с объектом MON 89788 (устойчивым к глифосату). Потомство от данного скрещивания обрабатывали дикамбой (Clarity®, BASF, Research Triangle Park, NC), глифосатом (Roundup WeatherMAX®, Monsanto Co., St Louis, MO) или сочетанием дикамбы и глифосата. Обработки осуществляли перед посевом, после посева на стадии вегетативного роста с 3 листьями (V3) и после посева репродуктивной стадии 1 (R1). Обработанные растения оценивали по проценту ингибирования роста на 14 день после обработки (DAT) для обработки гербицидами до посева, 3 DAT для повсходовой обработки на стадии VE и 3 DAT для повсходовой обработки на стадии R1. Гербицид (гербициды) наносили в различных количествах на акр, как показано в таблице 1. Измерения процента ингибирования представляют собой среднее значение из нескольких повторений.

Трансген устойчивости к дикамбе картировали в объекте сои MON 87708 по группе сцепления 9 приблизительно в положении 143.5. Ассоциированное "скользящее окно" гаплотипа 19743 и 19767 не оказывало эффекта на урожай, созревание, высоту или полегание. Информация об ассоциации гаплотипов представлена в таблице 2, где GM_A92205 указывает на объект MON 87708.

ДНК, встроенную в геном растения сои MON 87708, и фланкирующую последовательность охарактеризовывали посредством подробных молекулярных анализов. Данные анализы включают: последовательность инсерции, количество инсерций (количество участков встраивания в геноме сои), количество копий (количество копий ДНК трансгена в одном локусе), целостность встроенной генетической кассеты, фланкирующие последовательности и ассоциация инсерции с областями гаплотипов генома сои.

Применяли молекулярные ДНК-зонды, включающие интактную кодирующую область и ее соответствующие регуляторные элементы, промоторы, интроны и последовательности полиаденилирования экспрессирующих кассет растений. Анализ показал, что MON 87708 содержит единственную инсерцию ДНК трансгена с одной копией экспрессирующей кассеты. Осуществляли обратную ПЦР и анализы последовательности ДНК для определения 5'- и 3'-соединения инсерций с геномом растений, подтверждения организации элементов внутри инсерции (фиг.1) и определения полной последовательности ДНК инсерции в растении сои MON 87708 (предоставляемой в настоящем документе как SEQ ID NO: 5). Растение сои, содержащее в своем геноме связанные генетические элементы трансгена, показанные на фиг.1, и устойчивое к дикамбе, является одним из аспектов изобретения.

Последовательности, фланкирующие инсерцию ДНК трансгена в MON 87708, определяли с применением обратной ПЦР, как описано в Ochman et al., 1990 (PCR Protocols: A guide to Methods и Applications, Academic Press, Inc.), и/или способов "прогулки по геному". Геномную ДНК растений выделяли из A3525 и трансгенных линий сои из ткани, выращенной в стандартных условиях теплицы. Приблизительно 1 грамм ткани молодого листа объединяли с жидким азотом и перемалывали в тонкодисперсный порошок с применением ступки и пестика. ДНК выделяли с применением набора для выделения геномной ДНК Nucleon™ PhytoPure™ (RPN8511, Amersham, Piscataway, NJ) по протоколу производителя. После конечного этапа осаждения ДНК ресуспендировали в 0,5 мл TE (10 мМ Tris-HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА). Специалист в данной области может модифицировать данный способ для выделения ДНК из любой ткани сои, включая, в качестве неограничивающих примеров, семена. Аликвоту ДНК расщепляли рестрикционными эндонуклеазами, выбранными в зависимости от рестрикционного анализа ДНК трансгена. После самолигирования рестрикционных фрагментов осуществляли ПЦР с применением праймеров, сконструированных из последовательности ДНК трансгена, с помощью которых амплифицируют последовательности, распространяющиеся за 5'- и 3'-концы ДНК трансгена. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в агарозном геле и очищали с применением набора для выделения из геля QIAGEN (Qiagen, Valencia, CA). Затем продукты ДНК секвенировали непосредственно с применением стандартных способов секвенирования ДНК. 5'-Фланкирующую последовательность, распространяющуюся на правый край последовательности ДНК экспрессирующей кассеты трансгена, предоставляют как SEQ ID NO: 3 ([C], см. фиг.1). 3'-фланкирующую последовательность, распространяющуюся на левый край последовательности ДНК экспрессирующей кассеты трансгена, предоставляют как SEQ ID NO: 4 ([D], см. фиг.1). Часть ДНК экспрессирующей кассеты, полностью встроенную в геномную ДНК A3525, представляют как SEQ ID NO: 5 ([E], см. фиг.1).

Последовательности выделенных молекул ДНК сравнивали с последовательностью ДНК трансгена для идентификации фланкирующей последовательности и совместно выделяемого фрагмента ДНК трансгена. Подтверждение наличия экспрессирующей кассеты осуществляли посредством ПЦР с праймерами, сконструированными в зависимости от данных об установленной фланкирующей последовательности и известной последовательности ДНК трансгена. Последовательность дикого типа, соответствующая той же области, в которую встраивают ДНК трансгена в трансформированной линии, выделяли с применением праймеров, сконструированных из фланкирующих последовательностей в MON 87708. Реакции ПЦР осуществляли с применением системы амплификации Elongase® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Фланкирующие последовательности ДНК в MON 87708 и последовательность A3525 дикого типа анализировали относительно многочисленных баз данных нуклеотидов и белков. Данную информацию применяли для исследования взаимоотношений трансгена и генома растения и проверки целостности сайта встраивания. Фланкирующую последовательность и последовательности дикого типа применяли для конструирования праймеров для анализов по конечной точке TAQMAN®, применяемых для идентификации объектов. Анализы зиготности осуществляли с применением данной информации.

Пример 3: Специфичные для объекта анализы по конечной точке TAQMAN®

В данном примере описывают специфичный для объекта способ термической амплификации по конечной точке TAQMAN®, разработанный для идентификации объекта MON 87708 в образце. Примеры условий, применимых для специфичного для объекта MON 87708 способа анализа по конечной точке TAQMAN®, являются следующими: Этап 1: Воду с сопротивлением 18 мегаОм добавляли до конечного объема 10 мкл. Этап 2: 5,0 мкл 2× Universal Master Mix (dNTP, фермент, буфер) добавляли до конечной концентрации 1×. Этап 3: 0,5 мкл смеси праймера объекта-1 (SQ13570) и праймера объекта-2 (SQ13571) (ресуспендированную в воде с сопротивлением 18 мегаОм до концентрации 20 мкМ для каждого праймера) добавляли до конечной концентрации 1,0 мкМ (например, в микроцентрифужной пробирке, следующее необходимо добавить для получения 500 мкл при конечной концентрации 20 мкМ: 100 мкл праймера SQ13570 (SEQ ID NO: 9) в концентрации 100 мкМ; 100 мкл праймера SQ13571 (SEQ ID NO: 10) в концентрации 100 мкМ; 300 мкл воды с сопротивлением 18 мегаОм). Этап 4: 0,2 мкл 6-FAM™-MGB-зонда объекта PB4655 (ресуспендированного в воде с сопротивлением 18 мегаОм до концентрации 10 мкΜ (SEQ ID NO: 11)) добавляли до конечной концентрации 0,2 мкМ. Этап 5: 0,5 мкл смеси праймера внутреннего контроля-1 и праймера внутреннего контроля-2 (ресуспендированной в воде с сопротивлением 18 мегаОм до концентрации 20 мкМ для каждого праймера) добавляли до конечной концентрации 1,0 мкМ. Этап 6: 0,2 мкл VIC™-зонда внутреннего контроля добавляли до конечной концентрации 0,2 мкМ (ресуспендированного в воде с сопротивлением 18 мегаОм до концентрации 10 мкМ). Этап 7: добавляли 3,0 мкл выделенной ДНК (матрицы) для каждого образца с каждым из следующих, включающих 1. Анализируемые образцы листьев; 2. Отрицательный контроль (нетрансгенная ДНК); 3. Отрицательный контроль вода (без матрицы); 4. Положительный контроль ДНК MON 87708. Этап 8: Настройки термоциклера являлись следующими: один цикл при 50°C в течение 2 минут; один цикл при 95°C в течение 10 минут; десять циклов при 95°C в течение 15 секунд, затем 64°C в течение 1 минуты с -1°C/цикл; тридцать циклов при 95°C в течение 15 секунд, затем 1 минута при 54°C; конечный цикл при 10°C.

Применяемыми в анализе по конечной точке ДНК-праймерами являются праймеры SQ13570 (SEQ ID NO: 9), SQ13571 (SEQ ID NO: 10) и 6-FAM™-меченый зонд PB4655 (SEQ ID NO: 11). 6-FAM™ является флуоресцентным красителем, производимым Applied Biosystems (Foster City, CA), присоединяемым к ДНК-зонду. Для TAQMAN® MGB™-зондов 5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы Taq расщепляет зонд с 5'-конца между флуорофором и гасителем. При гибридизации с целевой цепью ДНК гаситель и флуорофор разделяются в достаточной для получения флуоресцентного сигнала степени, таким образом, испуская флуоресценцию. С помощью SQ13570 (SEQ ID NO: 9) и SQ13571 (SEQ ID NO: 10) при применении в данных способах реакции с PB4655 (SEQ ID NO: 11) получают ДНК-ампликон, характерный для ДНК объекта MON 87708. Контроли для данного анализа должны включать положительный контроль из сои, содержащей ДНК объекта MON 87708, отрицательный контроль из нетрансгенной сои и отрицательный контроль, не содержащий матрицы ДНК. Дополнительно, контроль для реакции ПЦР включает праймеры внутреннего контроля и зонд внутреннего контроля, специфичные для единственной копии гена в геноме сои. Специалист в данной области знает, как конструировать праймеры, специфичные к единственной копии гена в геноме сои. Данные анализы оптимизируют для применения с ПЦР-системой 9700 GeneAmp® Applied Biosystems (запущенной на максимальной скорости) или термоциклером MJ Research DNA Engine PTC-225. Другие способы и устройства, известные специалистам в данной области, с помощью которых можно получать ампликоны, идентифицирующие ДНК объекта MON 87708, известны специалистам в данной области.

Растениям R0, демонстрирующим наличие экспрессирующей кассеты, позволяли развиваться в полностью зрелые растения. Для анализа саузерн-блоттингом применяли зонды, сконструированные на основе последовательностей кассеты трансгена устойчивости к дикамбе, для определения сцепления. Также растения R0 оценивали по количеству копий экспрессирующей кассеты с применением сочетания саузерн-блоттинга и TAQMAN® по конечной точке.

Анализ зиготности применим для определения, если содержащее объект растение является гомозиготным по объекту ДНК; т.е. содержащим экзогенную ДНК в том же положении на каждой хромосоме из пары хромосом; или гетерозиготным по объекту ДНК, т.е. содержащим экзогенную ДНК только на одной хромосоме из пары хромосом; или не содержит объект ДНК, т.е. является диким типом. Способ термической амплификации по конечной точке TAQMAN® также применяли для разработки анализов зиготности для объекта MON 87708. В данном примере описывают специфичный для объекта способ термической амплификации по конечной точке TAQMAN®, разработанный для определения зиготности объекта MON 87708 в образце. Для данного анализа применяют анализ с тремя праймерами, где праймер SQ20632 (SEQ ID NO: 12) гибридизуется и специфически удлиняется от 3'-соединения встроенной экзогенной ДНК и геномной ДНК, праймер SQ20636 (SEQ ID NO: 13) гибридизуется и специфически удлиняется от ДНК, фланкирующей 3'-сторону встроенной экзогенной ДНК, и праймер SQ20637 (SEQ ID NO: 14) гибридизуется и специфически удлиняется от геномной ДНК, в которую встраивают встроенную экзогенную ДНК. Три праймера являются характерными для объекта. В данном примере праймер SQ20636 (SEQ ID NO: 13), и праймер SQ20632 (SEQ ID NO: 12) и 6-FAM™-меченый олигонуклеотидный зонд PB10130 (SEQ ID NO: 15) являются характерными, если присутствует копия встроенной экзогенной ДНК. В данном примере SQ20636 (SEQ ID NO: 13), и праймер SQ20637 (SEQ ID NO: 14) и VIC™-меченый олигонуклеотидный зонд PB10131 (SEQ ID NO: 16) являются характерными, если нет копии встроенной экзогенной ДНК в геномной ДНК, т.е. дикий тип. При смешивании трех праймеров и двух зондов вместе в реакции ПЦР с ДНК, выделенной из гомозиготного по объекту MON 87708 растения, получают флуоресцентный сигнал только от 6-FAM™-меченого олигонуклеотидного зонда PB10130 (SEQ ID NO: 15), свидетельствующий о наличии гомозиготного по объекту MON 87708 растения и характерный для него. При смешивании трех праймеров и двух зондов вместе в реакции ПЦР с ДНК, выделенной из гетерозиготного по объекту MON 87708 растения, получают флуоресцентный сигнал от 6-FAM™-меченого олигонуклеотидного зонда PB10130 (SEQ ID NO: 15) и VIC™-меченого олигонуклеотидного зонда PB10131 (SEQ ID NO: 16), свидетельствующий о наличии гетерозиготного по объекту MON 87708 растения и характерный для него. При смешивании трех праймеров и двух зондов вместе в реакции ПЦР с ДНК, выделенной из несодержащего объект MON 87708 растения (т.е. дикого типа), получают флуоресцентный сигнал только от VIC™-меченого олигонуклеотидного зонда PB10131 (SEQ ID NO: 16), свидетельствующий о наличии не содержащего объект MON 87708 растения, т.е. дикого типа, и характерный для него. Примеры применимых для данного способа условий являются следующими. Этап 1: Воду с сопротивлением 18 мегаОм добавляли до конечного объема 10 мкл. Этап 2: 5,0 мкл 2× Universal Master Mix (Applied Biosystems, кат. № 4304437; dNTP, фермент, буфер) добавляли до конечной концентрации 1×. Этап 3: 0,5 мкл праймеров для определения зиготности SQ20632, SQ20636, SQ20637 (ресуспендированных в воде с сопротивлением 18 мегаОм до концентрации 20 мкМ для каждого праймера) добавляли до конечной концентрации 1,0 мкМ. Этап 4: 0,2 мкл 6-FAM™-зонда PB10130 (SEQ ID NO: 15) (ресуспендированного в воде с сопротивлением 18 мегаОм до концентрации 10 мкМ) добавляли до конечной концентрации 0,2 мкМ. Этап 5: 0,2 мкл VIC™-зонда PB10131 (SEQ ID NO: 16) (ресуспендированного в воде с сопротивлением 18 мегаОм до концентрации 10 мкΜ) добавляли до конечной концентрации 0,2 мкМ. Этап 6: добавляли 3,0 мкл выделенной ДНК (матрицы) для каждого образца с каждым из следующих, включающих 1. Анализируемые образцы листьев (4-80 нг геномной ДНК, разбавленной водой); 2. Отрицательный контроль (ДНК нетрансгенной сои; 4 нг, разбавленные водой); 3. Отрицательный контроль вода (без матрицы; раствор, в котором ресуспендируют ДНК); 4. Положительный контроль геномная ДНК MON 87708 из известного гетерозиготного объекта (4 нг, разбавленные водой); 5. Положительный контроль геномная ДНК MON 87708 из известного гомозиготного объекта (4 нг, разбавленные водой). Этап 7: Осторожно перемешать. Этап 8: Настойки термоциклера при применении ПЦР-системы 9700 GeneAmp® Applied Biosystems (запущенной на максимальной скорости) или термоциклера MJ Research DNA Engine PTC-225 являлись следующими: один цикл при 50°C в течение 2 минут; один цикл при 95°C в течение 10 минут; десять циклов (95°C в течение 15 секунд, затем 64°C в течение 1 минуты (-1°C/цикл)); тридцать циклов (95°C в течение 15 секунд, затем 54°C в течение 1 минут); необязательные дополнительные 10-20 циклов (95°C в течение 15 секунд, затем 64°C в течение 1 минуты (-1°C/цикл) могут обеспечивать более четкое разделение популяции в течение анализа по конечной точке TaqMan®; один цикл хранения при 10°C.

Пример 4: Идентификация объекта MON 87708 в любой селекционной работе с MON 87708

В следующем примере описывают, как можно идентифицировать объект MON 87708 в потомстве от любой селекционной работы с применением объектов сои MON 87708.

Пары праймеров для ДНК объекта применяют для получения ампликона, характерного для объекта сои MON 87708. Характерный для MON 87708 ампликон содержит, по меньшей мере, одну последовательность соединения, предоставленную как SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 7, или SEQ ID NO: 8. Пары праймеров для объекта, с помощью которых получают характерный для MON 87708 ампликон, включают пары праймеров в зависимости от фланкирующих последовательностей и встроенной экспрессирующей кассеты. Для получения характерного ампликона, в котором обнаруживают SEQ ID NO: 1, необходимо конструировать молекулу прямого праймера в зависимости от SEQ ID NO: 3 от основания 1 до 1126 и молекулу обратного праймера в зависимости от последовательности ДНК встроенной экспрессирующей кассеты (SEQ ID NO: 5 от положения 1 до 3003), в которых молекулы праймеров обладают достаточной длиной непрерывных нуклеотидов для специфической гибридизации с SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5. Для получения характерного ампликона, в котором обнаруживают SEQ ID NO: 2, необходимо конструировать молекулу прямого праймера в зависимости от последовательности ДНК встроенной экспрессирующей кассеты (SEQ ID NO: 5 от положения 1 до 3003) и молекулу обратного праймера в зависимости от 3'-фланкирующей последовательности (SEQ ID NO: 4 от основания 131 до 1947), в которых молекулы праймеров обладают достаточной длиной непрерывных нуклеотидов для специфической гибридизации с SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5. Для практических целей необходимо конструировать праймеры, с помощью которых получают ампликоны ограниченных диапазонов длин, например, от 100 до 1000 оснований. Меньшие (с более короткой длиной полинуклеотида) по размеру ампликоны, в основном, более надежно получают в реакциях ПЦР, делая возможным более короткое время циклов, и их легко можно разделять и визуализировать в агарозных гелях или приспосабливать для применения в подобных TAQMAN® анализах по конечной точке. Можно получать меньшие ампликоны и определять их известными в данной области способами определения ДНК-ампликонов. Кроме того, получаемые с применением пары праймеров ампликоны можно клонировать в векторы, накапливать, выделять и секвенировать или их можно непосредственно секвенировать хорошо известными способами в данной области. Любая пара праймеров, полученная из сочетания SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5 или сочетания SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, применимых в способе амплификации ДНК для получения ампликона, характерного для MON 87708 или его потомства, является одним из аспектов изобретения. Любая отдельная выделенная молекула полинуклеотидного ДНК-праймера, содержащая, по меньшей мере, 11 непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO: 3 или комплементарной ей последовательности, применимая в способе амплификации ДНК для получения ампликона, характерного для MON 87708 или его потомства, является одним из аспектов изобретения. Любая отдельная выделенная молекула полинуклеотидного ДНК-праймера, содержащая, по меньшей мере, 11 непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO: 4 или комплементарной ей последовательности, применимая в способе амплификации ДНК для получения ампликона, характерного для MON 87708 или его потомства, является одним из аспектов изобретения. Любая отдельная выделенная молекула полинуклеотидного ДНК-праймера, содержащая, по меньшей мере, 11 непрерывных нуклеотидов SEQ ID NO: 5 или комплементарной ей последовательности, применимая в способе амплификации ДНК для получения ампликона, характерного для MON 87708 или его потомства, является одним из аспектов изобретения.

Пример условий амплификации для данного анализа представлен в примере 3. Однако в данную область включают любую модификацию данных способов или применение ДНК-праймеров, гомологичных или комплементарных SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, или последовательности ДНК генетических элементов, содержащихся в инсерции трансгена (SEQ ID NO: 5) MON 87708, с помощью которых получают характерный для MON 87708 ампликон. Характерный ампликон содержит молекулу ДНК, гомологичную или комплементарную, по меньшей мере, одной ДНК соединения трансгена/геномной ДНК (SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8), или значительной ее части.

Анализ образца ткани растения объект MON 87708 должен включать положительный контроль в виде ткани из объекта MON 87708, отрицательный контроль из растения сои, не являющегося объектом MON 87708 (в качестве неограничивающих примеров, A3525), и отрицательный контроль, не содержащий геномную ДНК сои. Пара праймеров, с помощью которых амплифицируют эндогенную молекулу ДНК сои, будет служить внутренним контролем условий амплификации ДНК. Специалисты в области способов амплификации ДНК могут выбирать последовательности дополнительных праймеров из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, и условия, выбранные для получения ампликона представленными в примере 3 способами, могут отличаться, но приводят к образованию характерного для ДНК объекта MON 87708 ампликона. Применение данных последовательностей ДНК праймеров с модификациями способов примера 3 находится в объеме изобретения. Ампликон, получаемый с помощью, по меньшей мере, одной последовательности ДНК праймера, полученной из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, характерный для MON 87708, является одним из аспектов изобретения.

Наборы для определения ДНК содержат, по меньшей мере, один ДНК-праймер с достаточной длиной непрерывных нуклеотидов, полученный из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, с помощью которого при применении в способе амплификации ДНК получают ампликон, характерный для MON 87708 или его потомства, являются одним из аспектов изобретения. Растение сои MON 87708, часть растения, растительная клетка, семена или товар, с помощью которого получают характерный для MON 87708 ампликон при тестировании в способе амплификации ДНК, являются одним из аспектов изобретения. Анализ ампликона MON 87708 можно осуществлять с применением ПЦР-системы 9700 GeneAmp® Applied Biosystems (запущенной с максимальной скоростью) или термоциклера MJ Research DNA Engine PTC-225 или любой другой системы амплификации, которую можно применять для получения характерного для MON 87708 ампликона, как показано в примере 3.

Депозит семян образца объекта сои MON 87708, описываемого выше и перечисленного в формуле изобретения, осуществляют с учетом Budapest Treaty в American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110. Номером доступа в ATCC для данного депозита является PTA-9670. Депозит будут хранить в хранилище в течение 30 лет или 5 лет после последнего запроса, или в течение срока действия патента, независимо от того, что будет длиннее, и будут заменять по мере необходимости в течение данного периода.

После иллюстрирования и описания принципов изобретения специалистам в данной области будет очевидно, что изобретение можно модифицировать в структуре и подробностях без отклонения от таких принципов. Авторы изобретения заявляют все модификации, находящиеся в сущности и объеме формулы изобретения.

Реферат

Изобретение относится к области биохимии, в частности к рекомбинантной молекуле ДНК, указывающей на присутствие трансгенного события, где репрезентативный образец семени, содержащий указанное трансгенное событие, депонирован как АТСС РТА-9670. Также раскрыт способ определения присутствия молекулы ДНК из вышеуказанного трансгенного события в образце, который осуществляется путем использования ДНК-зонда или пары молекул ДНК, а также набор для детекции вышеуказанного трансгенного события. Изобретение также относится к рекомбинантному растению сои, устойчивому к дикамбе, его части, клетке и семени. Также раскрыт способ борьбы с сорняками в поле, включающем посев растения, включающего трансгенное событие, где репрезентативный образец семени, содержащий указанное трансгенное событие, депонирован как АТСС РТА-9670, а также способ определения зиготности растения сои, содержащего вышеуказанное событие. Изобретение позволяет эффективно получать растение сои, устойчивое к дикамбе. 13 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 4 пр.

Формула