Патенты

Пролекарства фосфорамидатных алкилаторов - RU2414475C2

Код документа: RU2414475C2

Чертежи

Показать все 7 чертежа(ей)

Описание

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США № 60/695755, поданной 29 июня 2005 г., которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим пролекарства фосфорамидатных алкилаторов, и способам применения указанных композиций для лечения рака и других гиперпролиферативных заболеваний. Настоящее изобретение в широком контексте относится к областям химии, биологии, молекулярной биологии, фармакологии и медицины.

Уровень техники

Алкилирующие агенты (“алкилаторы” или “иприты”), используемые в химиотерапии рака, включают обширную группу химических веществ, способных алкилировать биологически жизненно важные макромолекулы, такие как ДНК, в физиологических условиях (см. публикацию Hardman et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 2001, 1389-1399, McGraw-Hill, New York, USA). Считается, что алкилирование ДНК является важным механизмом противоопухолевой активности алкилаторов. Химиотерапевтические алкилаторы действуют в качестве сильных электрофилов, например, путем образования промежуточных продуктов, стабилизированных соседним гетероатомом, таких как азиридин или катион азиридиния.

Фосфорамидатные алкилаторы, используемые при лечении рака, такие как циклофосфамид или ифосфамид, представляют собой важный подкласс химиотерапевтических алкилаторов. Циклофосфамид и ифосфамид активируются в печени, и высвободившийся активный алкилатор алкилирует нуклеофильные части, такие как ДНК, в опухолевых клетках, действуя в качестве химиотерапевтического средства. В случае высвобождения активных алкилаторов вне опухоли могут быть алкилированы ДНК и другие нуклеофильные части, в частности фосфатные, амино-, сульфгидрильные, гидроксильные, карбоксильные и имидазогруппы биомолекул здоровых нераковых клеток. Такое алкилирование здоровых клеток может оказывать нежелательное токсическое действие в организме субъектов (см. приведенную выше публикацию Hardman et al.).

Существует потребность в новых фосфорамидатных алкилаторах, которые могут быть использованы для лечения рака и других гиперпролиферативных заболеваний и предпочтительно являются менее токсичными для нормальных клеток. Настоящее изобретение позволяет удовлетворить указанные потребности и относится к новым пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов и способам применения указанных соединений в терапии, как описано в нижеследующем разделе.

Сущность изобретения

Одним объектом настоящего изобретения являются соединения, которые представляют собой пролекарства фосфорамидатных алкилаторов, активируемые в условиях гипоксии, и способы синтеза указанных соединений. Пролекарства фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению могут иметь формулу Alk-T, в которой Alk означает фосфорамидатный алкилатор, Т означает L-Z3, где L является линкером и Z3 является биовосстановительной группой.

Одним объектом настоящего изобретения являются пролекарства фосфорамидатных алкилаторов формулы (I):

в которой:

Y1 означает О, S, NR6 или NSO2R6, где каждый R6 независимо означает С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, арил или гетероарил;

Y2 означает O, S, NR6, NCOR6 или NSO2R6;

каждый элемент из R1-R5 независимо означает водород, гидроксил, амино, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил, гетероарил, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил или гетероароил; либо два любых элемента из R1-R5 вместе образуют С3-С10 гетероцикл или каждый элемент из R1-R5 независимо означает триггер Т, где Т означает L-Z3;

L выбирают из

-[C(Z1)2-Y3]v-[C(=O)-O]q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-[C(Z1)2]z-[C(Z1)=C(Z1)]g-Z3 и

-[C(Z1)2-Y3]v-(S(=O)2)q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-[C(Z1)2]z-[C(Z1)=C(Z1)]g-Z3, где каждый символ z, v, q, u и g независимо означает 0 или 1;

Y3 означает S, O или NR7, где каждый R7 независимо означает водород, гидроксил, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил, гетероарил, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил или гетероароил;

Y4 означает О, S или -NR7-C(=O)-O-;

каждый Z1 независимо означает водород, галоген, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, арил, гетероарил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил или гетероароил;

Z2 означает С1-С6 алкилен, С1-С6 гетероалкилен,

где каждый Х1 независимо означает N или CR8, где R8 независимо означает водород, галоген, нитро, циано, СО2Н, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С1-С6 циклоалкил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил, CON(R7)2, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил или гетероароил;

Х2 означает NR7, S или О; и

Z3 выбирают из группы, включающей:

при условии, что в соединении формулы (I):

(i) по крайней мере два элемента из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил;

(ii) по крайней мере один элемент из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-С1-С6 алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, и по крайней мере один элемент из NR2R3 и NR4R5 означает

(iii) NR2R3 и NR4R5 вместе означают

их отдельные изомеры, рацемические или нерацемические смеси изомеров, биоизостеры, фармакофоры, фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты или пролекарства.

В одном варианте осуществления изобретения Z3 означает биовосстановительную группу, которая может акцептировать один или несколько электронов в результате окислительно-восстановительной реакции.

Родственный вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, которые имеют значение IC50 или GI50 в клетках, находящихся в условиях гипоксии, от 50 мкМ до 0,01 нМ. Родственный вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, которые являются в миллион раз, 10000 раз и 1000 раз менее токсичными в соответствующих негипоксических клетках. В родственном варианте осуществления изобретения клеточно-опосредованную цитотоксичность измеряют при помощи анализа антипролиферативной активности, используя относительное значение IC50 соединения в гипоксических и негипоксических клетках. В родственном варианте осуществления изобретения клеточно-опосредованную цитотоксичность измеряют при помощи анализов клоногенного выживания, используя относительные значения С10, С50 или С90 соединений в гипоксических и негипоксических клетках.

Другой родственный вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, которые имеют значения IC50 в клетках, находящихся в условиях гипоксии, от 50 мкМ до 0,01 нМ. Другой родственный вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, которые являются в 5000 раз менее токсичными в соответствующих негипоксических клетках при измерении с использованием относительных значений IC50 в гипоксических и негипоксических клетках. Другой родственный вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, которые имеют значение IC50 в клетках, находящихся в условиях гипоксии, от 50 мкМ до 0,01 нМ и являются в 1000 раз менее токсичными в соответствующих негипоксических клетках при измерении с использованием относительных значений IC50 в гипоксических и негипоксических клетках.

В родственном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению характеризуется гипоксической цитотоксичностью от 0,1 нМ до 50 мкМ и отношением гипоксической цитотоксичности, HCR, равным 10-100000, которое измеряют в виде соотношения цитотоксичности в негипоксических и гипоксических клетках, более подробно описанного ниже. В родственном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидного алкилатора по настоящему изобретению имеет значение гипоксической цитотоксичности от 0,1 нМ до 50 мкМ и HCR от 25 до 100000. В другом родственном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению имеет значение гипоксической цитотоксичности от 0,1 нМ до 5 мкМ и HCR от 50 до 10000.

Одним объектом настоящего изобретения являются новые фосфорамидатные алкилаторы, предназначенные для лечения рака и других гиперпролиферативных заболеваний.

Одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая пролекарства фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель.

Одним объектом настоящего изобретения является способ лечения рака и других гиперпролиферативных заболеваний, который включает введение терапевтически эффективного количества пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению или известного пролекарства фосфорамидатного алкилатора субъекту, нуждающемуся в таком лечении. В одном варианте осуществления изобретения подвергаемый лечению рак является раком, устойчивым к терапии первой линии, второй линии или третьей линии, либо представляет собой рецидив рака. В другом варианте осуществления изобретения подвергаемый лечению рак является метастазирующим раком. В другом варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению или известное пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят в комбинации по крайней мере с одним другим противораковым средством.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показано действие соединения 25 (50 мг/кг) на рост опухоли в модели ксенотрансплантата Н460 у мышей.

На фиг.2 показано действие соединения 25 (100 мг/кг) на рост опухоли в модели ксенотрансплантата Н460 у мышей.

На фиг.3 показано действие соединение 25 (150 мг/кг), вводимого в комбинации с CDDP, на рост опухоли в модели ксенотрансплантата Н460 у мышей.

На фиг.4 показано действие соединения 25, вводимого в комбинации с CDDP, на рост опухоли в модели ксенотрансплантата Н460 у мышей.

На фиг.5-7 показано действие соединения 25 в комбинации с гемцитабином на рост опухоли в модели ксенотрансплантата Н460 у мышей.

Подробное описание изобретения

Подробное описание разных объектов и вариантов осуществления настоящего изобретения представлено следующим образом: в разделе I даны определения терминов; в разделе II описаны соединения по настоящему изобретению и способы их получения; в разделе III описаны способы лечения, терапии, введения и приготовления препаратов с применением соединений по настоящему изобретению, используемых отдельно или в комбинации; и в разделе IV приведены примеры способов синтеза и биологических анализов соединений по настоящему изобретению. Подробное описание представлено в виде разделов только для удобства читателя, и описание, приведенное в любом разделе, применимо к любому объекту настоящего изобретения.

I. Определения терминов

Приведенные ниже определения терминов облегчают читателю понимание настоящего изобретения. За исключением особо оговоренных случаев все термины, используемые в данной области, обозначения и другие научные или медицинские термины или терминологии, приведенные в настоящем описании изобретения, имеют значения, известные специалистам в области химии и медицины. В некоторых случаях термины, имеющие общеизвестные значения, приведены в настоящем описании изобретения для большей ясности и/или справки, поэтому такие определения не следует рассматривать как существенное отличие от определения термина, обычно используемого в данной области.

В используемом здесь значении “один” означает “по крайней мере один” или “один или несколько”.

“Алкил” означает насыщенный одновалентный углеводородный радикал с линейной цепью или насыщенный одновалентный углеводородный радикал с разветвленной цепью, содержащий указанное в префиксе число атомов углерода. В значении, использованном в настоящем описании изобретения, префиксы (С1-Сqq), С1-qq или С1-Сqq, где qq означает целое число, равное 2-20, имеют одинаковые значения. Например, (С1-С8)алкил, С1-8 алкил или С1-С8 алкил включает метил, этил, н-пропил, 2-пропил, н-бутил, 2-бутил, трет-бутил, пентил и тому подобные. В каждом использованном здесь определении (например, алкил, алкенил, алкокси, араалкилокси) при отсутствии префикса с указанием числа атомов углерода в алкильной части основной цепи радикал или его часть содержит шесть или менее атомов углерода в основной цепи. (С1-С6)алкил может быть далее необязательно замещен заместителями, включающими, например, дейтерий (“D”), гидроксил, амино, моно- или ди(С1-С6)алкиламино, галоген, простой С2-С6 алкениловый эфир, циано, нитро, этенил, этинил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкилтио, -СООН, -СОNH2, моно- или ди(С1-С6) алкилкарбоксамидо, -SO2NH2, -OSO2-(C1-C6)алкил, моно- или ди(С1-С6) алкилсульфонамидо, арил, гетероарил, алкилсульфонилокси, гетероалкилсульфонилокси, арилсульфонилокси или гетероарилсульфонилокси.

“Алкенил” означает одновалентный углеводородный радикал с линейной цепью или одновалентный углеводородный радикал с разветвленной цепью, содержащий указанное в префиксе число атомов углерода и имеющий по крайней мере одну двойную связь, но не более трех двойных связей. Например, (С2-С6)алкенил включает этенил, пропенил, 1,3-бутадиенил и тому подобные. Алкенил может быть далее необязательно замещен заместителями, включающими, например, дейтерий (“D”), гидроксил, амино, моно- или ди(С1-С6)алкиламино, галоген, простой С2-С6 алкениловый эфир, циано, нитро, этенил, этинил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкилтио, -СООН, -CONH2, моно- или ди(С1-С6)алкилкарбоксамидо, -SO2NH2, -OSO2-(C1-C6)алкил, моно- или ди(С1-С6)алкилсульфонамидо, арил, гетероарил, алкил или гетероалкилсульфонилокси и арил или гетероарилсульфонилокси.

“Алкилатор” означает химически активную часть, способную образовывать ковалентную алкильную связь с макромолекулами в результате электрофильной реакции с нуклеофилом в макромолекуле. “Фосфорамидатный алкилатор” означает алкилатор, для которого имеется электрофил азиридина или азиридиния или образуется в результате внутримолекулярной циклизации.

“Алкилен” означает насыщенный двухвалентный углеводородный радикал с линейной цепью, содержащий от одного до двенадцати атомов углерода, или насыщенный двухвалентный углеводородный радикал с разветвленной цепью, содержащий от одного до двенадцати атомов углерода, который необязательно замещен заместителями, включающими, например, дейтерий (“D”), гидроксил, амино, моно- или ди-(С1-С6)алкиламино, галоген, простой С2-С6 алкениловый эфир, циано, нитро, этенил, этинил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкилтио, -СООН, -CONH2, моно- или ди(С1-С6)алкилкарбоксамидо, -SO2NH2, -OSO2-(C1-C6)алкил, моно- или ди(С1-С6)алкилсульфонамидо, арил, гетероарил, алкил или гетероалкилсульфонилокси и арил или гетероарилсульфонилокси. Например, алкилен включает метилен, этилен, пропилен, 2-метилпропилен, пентилен, гексилен и тому подобные.

“Гетероалкилен” имеет по существу значение, приведенное выше для алкилена, за исключением того, что в алкиленовом бирадикале может присутствовать один или несколько гетероатомов (то есть атом кислорода, серы, азота и/или фосфора). Например, гетероалкилен включает -СН2ОСН2О-, -СН2СН2ОСН2СН2-, -СН2СН2N(СН3)СН2СН2-, -СН2СН2SСН2СН2- и тому подобные.

“Арил” означает одновалентный моноциклический или бициклический ароматический углеводородный радикал, содержащий 6-10 атомов в кольце, который независимо замещен одним-восемью заместителями, предпочтительно одним, двумя, тремя, четырьмя или пятью заместителями, выбираемыми из группы, включающей дейтерий (“D”), алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, галоген, нитро, циано, гидроксил, алкокси, амино, ациламино, моноалкиламино, диалкиламино, галогеналкил, галогеналкокси, гетероалкил, COR (где R означает водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, фенил или фенилалкил), -(CR'R”)n-COOR (где n означает целое число от 0 до 5, R' и R” независимо означают водород или алкил и R означает водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, фенил или фенилалкил) или -(CR'R”)n-CONRxRy (где n означает целое число от 0 до 5, R' и R” независимо означают водород или алкил и Rx и Ry независимо выбирают из группы, включающей водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, фенил или фенилалкил). В одном варианте осуществления изобретения Rх и Rу вместе означают циклоалкил или гетероциклил. В частности, термин “арил” означает, не ограничиваясь ими, фенил, бифенил, 1-нафтил, 2-нафтил и их замещенные формы.

“Циклоалкил” означает одновалентный циклический углеводородный радикал, содержащий три-семь атомов углерода в кольце. Циклоалкильная группа может иметь одну или несколько двойных связей и может быть также необязательно и независимо замещена одним, двумя, тремя или четырьмя заместителями, выбираемыми из группы, включающей алкил, необязательно замещенный фенил или -С(О)Rz (где Rz означает водород, алкил, галогеналкил, амино, моноалкиламино, диалкиламино, гидроксил, алкокси или необязательно замещенный фенил). В частности, термин “циклоалкил” означает, например, циклопропил, циклогексил, циклогексенил, фенилциклогексил, 4-карбоксициклогексил, 2-карбоксамидоциклогексенил, 2-диметиламинокарбонилциклогексил и тому подобные.

“Гетероалкил” означает алкильный радикал, имеющий указанное здесь значение, с одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбираемыми из циано, -ORw, -NRxRy и -S(O)pRz (где р означает целое число от 0 до 2), с учетом того, что гетероалкильный радикал присоединен атомом углерода гетероалкильного радикала. Rw означает водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, арил, аралкил, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, карбоксамидо или моно- или диалкилкарбамоил. Rх означает водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, арил или араалкил, Rу означает водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, арил, араалкил, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, карбоксамидо, моно- или диалкилкарбамоил или алкилсульфонил. Rz означает водород, (при условии, что n равно 0), алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, арил, араалкил, амино, моноалкиламино, диалкиламино или гидроксиалкил. Типичные примеры включают, например, 2-гидроксиэтил, 2,3-дигидроксипропил, 2-метоксиэтил, бензилоксиметил, 2-цианоэтил и 2-метилсульфонилэтил. В каждой из вышеуказанных групп Rw, Rx, Ry и Rz могут быть далее замещены амино, галогеном, фтором, алкиламино, диалкиламино, ОН или алкокси. Кроме того, префикс, указывающий число атомов углерода (например, С1-С10), означает общее число атомов углерода в гетероалкильной группе за исключением циано, -ОRw, -NRxRy или -S(O)pRz.

В одном варианте осуществления изобретения Rх и Ry вместе означают циклоалкил или гетероциклил.

“Гетероарил” означает одновалентный моноциклический, бициклический или трициклический радикал с 5-12 атомами в кольце, имеющий по крайней мере одно ароматическое кольцо, содержащее один, два или три гетероатома в кольце, выбираемых из N, O или S, при этом остальные атомы в кольце являются С, с учетом того, что гетероарильный радикал присоединен в ароматическом кольце. Гетероарильное кольцо необязательно и независимо замещено одним-восемью заместителями, предпочтительно одним, двумя, тремя или четырьмя заместителями, выбираемыми из группы, включающей алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, галоген, нитро, циано, гидроксил, алкокси, амино, ациламино, моноалкиламино, диалкиламино, галогеналкил, галогеналкокси, гетероалкил, -COR (где R означает водород, алкил, фенил или фенилалкил), -(CR'R”)n-COOR (где n означает целое число от 0 до 5, R' и R” независимо означают водород или алкил и R означает водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, фенил или фенилалкил) или -(CR'R”)n-CONRхRy (где n означает целое число от 0 до 5, R' и R” независимо означают водород или алкил, Rх и Ry независимо означают водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, фенил или фенилалкил). В одном варианте осуществления изобретения Rх и Ry вместе означают циклоалкил или гетероциклил. В частности, термин “гетероарил” означает, не ограничиваясь ими, пиридил, фуранил, тиенил, тиазолил, изотиазолил, триазолил, имидазолил, изоксазолил, пирролил, пиразолил, пиридазинил, пиримидинил, бензофуранил, тетрагидробензофуранил, изобензофуранил, бензотиазолил, бензоизотиазолил, бензотриазолил, индолил, изоиндолил, бензоксазолил, хинолил, тетрагидрохинолинил, изохинолил, бензимидазолил, бензизоксазолил или бензотиенил, индазолил, пирролопиримидинил, индолизинил, пиразолопиридинил, триазолопиридинил, пиразолопиримидинил, триазолопиримидинил, пирролотриазинил, пиразолотриазинил, триазолотриазинил, пиразолотетразинило, гексаазаинденил, гептаазаинденил и их производные. За исключением особо оговоренных случаев гетероатомы в кольце могут иметь любое расположение, допускаемое характеристиками связывания образующих кольцо атомов.

“Гетероциклил” или “циклогетероалкил” означает насыщенный или ненасыщенный неароматический циклический радикал с 3-8 атомами в кольце, в котором один-четыре атома в кольце являются гетероатомами, выбираемыми из О, NR (где R означает водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, фенил или фенилалкил), Р(=О)ORw или S(O)р (где р означает целое число от 0 до 2), и остальные атомы в кольце являются С, при этом один или два атома С могут быть необязательно замещены карбонильной группой. Гетероциклильное кольцо может быть необязательно и независимо замещено одним, двумя, тремя или четырьмя заместителями, выбираемыми из группы, включающей алкил, арил, арилалкил, гетероарил, гетероарилалкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, галоген, нитро, циано, гидроксил, алкокси, амино, моноалкиламино, диалкиламино, галогеналкил, галогеналококси, -COR (где R означает водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, фенил или фенилалкил), -(CR'R”)n-COOR (n означает целое число от 0 до 5, R' и R” независимо означают водород или алкил и R означает водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, фенил или фенилалкил) или -(CR'R”)n-CONRxRy (где n означает целое число от 0 до 5, R' и R” независимо означают водород или алкил, Rх и Ry независимо означают водород, алкил, циклоалкил, циклоалкилалкил, фенил или фенилалкил). В частности, термин “гетероциклил” означает, не ограничиваясь ими, пиридил, тетрагидропиранил, N-метилпиперидин-3-ил, N-метилпирролидин-3-ил, 2-пирролидон-1-ил, фурил, хинолил, тиенил, бензотиенил, пирролидинил, пиперидинил, морфолинил, пирролидинил, тетрагидрофуранил, тетрагидротиофуранил, 1,1-диоксо-гексагидро-1Δ6-тиопиран-4-ил, тетрагидроимидазо[4,5-c]пиридинил, имидазолинил, пиперазинил и пиперидин-2-онил и их производные. Префикс, указывающий число атомов углерода (например, С3-С10), означает общее число атомов углерода в циклогетероалкильной или гетероциклильной группе за исключением числа гетероатомов.

“С1-С6 ацил” означает -СО-(С1-С6 алкил), где термин ”алкил” имеет указанные выше значения.

“С1-С6 гетероацил” означает -СО-(С1-С6 гетероалкил), где термин “гетероалкил” имеет указанные выше значения.

“Ароил” означает -СО-арил, где термин “арил” имеет указанные выше значения.

“Гетероароил” означает -СО-гетероарил, где термин ”гетероарил” имеет указанные выше значения.

“Rsul сульфонилокси” означает Rsul-S(=O)2-O-, включающий алкилсульфонилокси, гетероалкилсульфонилокси, циклоалкилсульфонилокси, гетероциклилсульфонилокси, арилсульфонилокси и гетероарилсульфонилокси, где Rsul означает соответственно алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил, при этом алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил имеют указанные выше значения. Примеры алкилсульфонилокси включают Ме-S(=O)2-O-, Et-S(=O)2-O-, CF3-S(=O)2-O- и тому подобные, и примеры арилсульфонилокси включают

и тому подобные. Алкилсульфонилокси, гетероалкилсульфонилокси, циклоалкилсульфонилокси, гетероциклилсульфонилокси, арилсульфонилокси и гетероарилосульфонилоксигруппы могут быть удаляемыми группами в фосфорамидатных алкилаторах и могут быть заменены в клетке нуклеиновыми кислотами, такими как ДНК или РНК, и имидазолами, карбоксилатами или тиолами белков, что вызывает алкилирование и гибель клетки. Скорость взаимодействия разных Rsulсульфонилоксигрупп с нуклеиновыми кислотами, белками или водой может быть модулирована в зависимости от способа оттягивания электрона и пространственного объема части Rsul, благодаря чему могут быть получены фосфорамидатные алкилаторы и их пролекарства, которые являются более токсичными для опухолей вообще и гипоксических зон опухоли, в частности, по сравнению со здоровыми клетками.

Термин “заместители” наряду с заместителями, указанными в определении каждой из приведенных выше групп, означает заместители, выбираемые из дейтерия, галогена, -OR', -NR'R”, -SR', -SiR'R”R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R”, -OC(O)NR'R”, -NR”C(O)R', -NR'-C(O)NR”R''', -NR”C(O)2R', -NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NR2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R”, -NR'S(O)2R”, -CN и -NO2, -R', -N3, перфтор(С1-С4)алкокси и перфтор(С1-С4)алкила, число которых составляет от нуля до общего числа открытых валентностей в радикале и где R', R” и R''' независимо выбирают из группы, включающей водород, С1-8 алкил, С3-6 циклоалкил, С2-8 алкенил, С2-8 алкинил, незамещенный арил и гетероарил, (незамещенный арил)-С1-4 алкил и незамещенный арилокси-С1-4 алкил, арил, замещенный 1-3 атомами галогенов, незамещенный С1-8 алкил, С1-8 алкокси, С1-8 тиоалкокси или незамещенные арил-С1-4 алкильные группы. Когда R' и R” присоединены к одному атому азота, они могут быть объединены с данным атомом азота с образованием 3-, 4-, 5-, 6- или 7-членного кольца. Например, -NR'R” означает 1-пирролидинил и 4-морфолинил. Другие приемлемые заместители включают вышеуказанные арильные заместители, присоединенные к атому в кольце при помощи алкиленовой связи 1-4 атомов углерода. Два заместителя у смежных атомов арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены заместителем формулы -Т2-С(О)-(СН2)q-U3, где Т2 и U3 независимо означают -NH-, -O-, -CH2- или простую связь и q означает целое число от 0 до 2. Альтернативно два заместителя у смежных атомов арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены заместителем формулы -А-(СН2)r-В-, где А и В независимо означают -CH2-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR'- или простую связь и r означает целое число от 1 до 3. Одна из простых связей нового кольца, образованного таким образом, может быть необязательно заменена двойной связью. Альтернативно два заместителя у смежных атомов арильного или гетероарильного кольца могут быть необязательно заменены заместителем формулы -(СН2)s-Х5-(СН2)t-, где s и t независимо означают целые числа от 0 до 3 и Х5 означает -О-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- или -S(O)2NR'-. Заместитель R' в -NR'- и -S(O)2NR'- выбирают из водорода или незамещенного С1-6 алкила.

Некоторые соединения по настоящему изобретению содержат асимметричные атомы углерода (оптические центры) или двойные связи; в объем настоящего изобретения входят рацематы, диастереомеры, геометрические изомеры, региоизомеры и отдельные изомеры (например, отдельные энантиомеры). Соединения по настоящему изобретению могут также содержать не соответствующее природному числу изотопов атомов у одного или нескольких атомов, образующих такие соединения. Например, соединения могут быть мечены радиоактивными изотопами, такими как, например, тритий (3Н), иод-125 (125I) или углерод-14 (14С). В объем настоящего изобретения входят все изотопные варианты соединений по настоящему изобретению, независимо от того, являются ли они радиоактивными или нет.

Термин “фармацевтически приемлемые соли” означает соли активных соединений, которые получают при взаимодействии с относительно нетоксичными кислотами или основаниями в зависимости от конкретных заместителей, обнаруженных в соединениях, рассмотренных в настоящем описании изобретения. Когда соединения по настоящему изобретению содержат относительно кислотные функциональные группы, основно-аддитивные соли могут быть получены при контактировании нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством требуемого основания, используемого в чистом виде или в приемлемом инертном растворителе. Примеры солей, полученных из фармацевтически приемлемых неорганических оснований, включают соли алюминия, аммония, кальция, меди, трехвалентного железа, двухвалентного железа, лития, магния, трехвалентного марганца, двухвалентного марганца, калия, натрия, цинка и тому подобных. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических оснований, включают соли первичного, вторичного или третичного аминов, в том числе замещенных аминов, циклических аминов, природных аминов и тому подобных, таких как аргинин, бетаин, кофеин, холин, N,N'-дибензилэтилендиамин, диэтиламин, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этаноламин, этилендиамин, N-этилморфолин, N-этилпиперидин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, изопропиламин, лизин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиперадин, полиаминовые смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтиламин, триметиламин, трипропиламин, трометамин и тому подобные. Когда соединения по настоящему изобретению содержат относительно основные функциональные группы, кислотно-аддитивные соли могут быть получены в результате контактирования нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством требуемой кислоты, используемой в чистом виде или в приемлемом инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей включают соли, полученные из неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромистоводородная, азотная, угольная, моногидроугольная, фосфорная, моногидрофосфорная, дигидрофосфорная, серная, моногидросерная, гидроиодноватая или фосфористая кислоты и тому подобные, а также соли, полученные из относительно нетоксичных органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, изомасляная, малоновая, бензойная, янтарная, субериновая, фумаровая, миндальная, фталевая, бензолсульфоновая, п-толуолсульфоновая, лимонная, винная, метансульфоновая и подобные кислоты. В объем настоящего изобретения входят также соли аминокислот, такие как аргинат и тому подобные, и соли органических кислот, таких как глюкуроновая или галактуроновая кислоты и тому подобные (см., например, публикацию Berge, S.M., et al. “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Некоторые специальные соединения по настоящему изобретению содержат как основные, так и кислотные функциональные группы, которые позволяют превращать указанные соединения в основно- или кислотно-аддитивные соли.

Нейтральные формы соединений могут быть восстановлены в результате контактирования соли с основанием или кислотой и выделения исходного соединения известным методом. Исходная форма соединения отличается от разных солевых форм некоторыми физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях, а в остальных отношениях соли эквивалентны исходной форме соединения, соответствующей целям настоящего изобретения.

Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в несольватированных формах, а также в сольватированных формах, включая гидратированные формы. Как правило, сольватированные формы эквиваленты несольватированным формам и входят в объем настоящего изобретения. Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в нескольких кристаллических или аморфных формах. Все физические формы обычно соответствуют целям настоящего изобретения и входят в объем настоящего изобретения.

В используемом здесь значении термин “аналог глюкозы” означает моно-, ди- и трисахариды. Аналог глюкозы включает сахариды, представляющие собой глюкозамин, N-ацетилглюкозамин, фруктозу, маннозу и производные маннозы, глюкозу и производные глюкозы, которые включают, не ограничиваясь ими, 2-дезоксиглюкозу (2-DG), N-ацетил-2-амино-2-дезоксиглюкозу, 3-амино-3-дезоксиглюкозу, 2-амино-2-дезоксиглюкозу, галактозу и производные галактозы, которые включают, не ограничиваясь ими, D-2-дезокси-D-галактозу, D-4-амино-4-дезоксигалактозу и D-2-амино-2-дезоксигалактозу. Таким образом, аналог глюкозы может отличаться от глюкозы или производного, такого как DG и глюклозамин, тем, что является его эпимером. Кроме того, аналог глюкозы может быть фторированным производным любых вышеуказанных соединений. Атом кислорода в кольце любого из вышеуказанных соединений может быть замещен изостером, выбираемым из группы, включающей S, сульфон и тому подобные. Например, аналог глюкозы может быть 5-тио-D-глюкозой или ее производным.

Волнистая линия

означает место присоединения одной группы или части молекулы к другой группе. Например, формулы

показывают, что тиогруппа находится в месте присоединения к другой группе или части молекулы.

Термины СО, С(О), С(=О), -СО- имеют взаимозаменяемые значения в настоящем описании изобретения. Термины СО2 и СОО имеют взаимозаменяемые значения. Термины SO2, S(O)2 имеют взаимозаменяемые значения. Термины SO и S(=O) имеют взаимозаменяемые значения. Термины РО и Р(=О) также имеют взаимозаменяемые значения.

В используемом здесь значении термин “биоизостер” химической части, такой как молекула, группа или атом, означает другую химическую часть, имеющую такой же размер и пространственное расположение одной или нескольких электронных пар. Биоизостеры и биоизостерия являются хорошо известными средствами прогнозирования биологической активности соединений на основании предположения о том, что соединения, имеющие одинаковый размер, форму и плотность электронов, могут обладать аналогичной биологической активностью. Известные замены биоизостеров включают, например, взаимозаменяемость -F, -OH, -NH2, -Cl и -СН3; взаимозаменяемость -Br и -i-C3H7; взаимозаменяемость -I и -t-C4H9; взаимозаменяемость -О-, -S-, -NH-, -CH2 и -Se-; взаимозаменяемость -N=, =CH= и -Р= (в циклических и нециклических частях); взаимозаменяемость фенильных и пиридильных групп; взаимозаменяемость -С=С- и -S- (например, бензол и тиофен); взаимозаменяемость ароматического азота (Rar-N(Rar)-Rar) и ненасыщенного углерода (Rar-С(=Rar)-Rar); и взаимозаменяемость -СО-, -SO- и -SO2-. Приведенные примеры не ограничивают диапазон биоизостерных эквивалентов, и специалист в данной области может определить другие замены биоизостеров, известные в данной области (см., например, публикации Patani et al., 1996, Chem. Rev. 96:3147-76 и Burger, 1991, A. Prog. Drug Res. 37:287-371).

Обоснованный количественный прогноз связывающей способности или функции известной молекулы может быть сделан на основании пространственного расположения небольшого числа атомов или функциональных групп в молекуле. В используемом здесь значении такое расположение именуется “фармакофором”, и информация о фармакофоре или фармакофорах в молекуле может быть использована для идентификации других молекул, содержащих такие же или подобные фармакофоры. Специалистам в области медицинской химии хорошо известны такие методы, а также то, каким образом информация о структуре, представленная в данной заявке на патент, позволяет идентифицировать фармакофор пролекарств фосфорамидатных алкилаторов и фосфорамидатных алкилаторов. Примером программ, используемых для поиска фармакофоров, является программа трехмерного поиска фармакофоров компании Chemical Computing Group (см. ).

Термин “необязательный” или “необязательно” означает, что далее описываемое явление или событие может, но необязательно должно произойти, и что данное описание включает случаи, когда указанное явление или событие происходит, и случаи, когда оно не происходит. Например, выражение “гетероциклическая группа, необязательно моно- или дизамещенная алкильной группой” означает, что алкил может, но необязательно должен присутствовать, и описание включает ситуации, когда гетероциклическая группа моно- или дизамещена алкильной группой, и ситуации, когда гетероциклическая группа не замещена алкильной группой.

Комбинация заместителей или переменных допустима только тогда, когда такая комбинация позволяет получить устойчивое или химически приемлемое соединение. Устойчивым или химически приемлемым соединением является такое соединение, химическая структура которого не подвергается существенному изменению при температуре 4°С или ниже, при отсутствии влаги или в других химически активных условиях в течение по крайней мере одной недели.

В используемом здесь значении термин “пролекарство” означает соединение, которое после введения метаболизируется или каким-либо другим образом превращается в активную или более активную форму в отношении по крайней мере одного биологического свойства по сравнению с пролекарством. Для получения пролекарства фармацевтически активное соединение (или его приемлемый предшественник) химически модифицируют таким образом, чтобы модифицированная форма была менее активной или неактивной, но могла быть эффективно возвращена в исходное состояние в определенных биологических условиях в результате осуществления метаболических или других биологических процессов. Пролекарство по сравнению с лекарством может иметь измененные характеристики метаболической устойчивости или переноса, меньше побочных эффектов, меньшую токсичность или лучший аромат (см., например, публикацию Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392). Пролекарства могут быть также получены при использовании соединений, которые не являются лекарствами, но в результате активации в определенных биологических условиях образуют фармацевтически активное соединение. В используемом здесь значении пролекарство фосфорамидатного алкилатора является пролекарством, которое в результате активации высвобождает активный фосфорамидатный алкилатор.

В используемом здесь значении термин “цитотоксический агент” означает агент или соединение, которое оказывает токсическое воздействие на клетки. В используемом здесь значении термин “цитостатический агент” означает агент, который ингибирует или подавляет рост и размножение клеток.

В используемом здесь значении термин “гипоксические клетки” означает клетки, находящиеся в условиях гипоксии in vivo, например, в гипоксической зоне опухоли или in vitro. В используемом здесь значении термин “негипоксические клетки” означает клетки, находящиеся в условиях отсутствия гипоксии in vivo или in vitro. В используемом здесь значении термин “гипоксическая цитотоксичность” соединения или агента означает его цитотоксичность в отношении гипоксических клеток. В используемом здесь значении термин “негипоксическая цитотоксичность” соединения или агента означает его цитотоксичность в отношении негипоксических клеток.

В используемом здесь значении термин “биовосстановительная группа” означает группу, акцептирующую электроны при выполнении окислительно-восстановительной реакции. Биовосстановительная группа является группой, которая: (1) может быть восстановлена, то есть группой, которая может акцептировать электроны, водород и/или ион гидрида; (2) может быть восстановлена in vivo и/или in vitro; (3) может быть восстановлена in vivo и/или in vitro в условиях гипоксии; (4) может быть восстановлена in vivo и/или in vitro при помощи DT-диафоразы, тиолов либо фотохимическими или электрохимическими способами; или (5) может быть удалена и/или расщеплена в результате биологического процесса, такого как ферментативный гидролиз, метаболизм и т.д.

Например, как более подробно описано ниже, одна биовосстановительная группа является нитроимидазолом, который может быть замещен разными группами. Другие примеры биовосстановительных групп включают, не ограничиваясь ими, группы на основе нитробензолов с недостатком электронов, амидов нитробензойной кислоты с недостатком электронов, нитроазолов, нитроимидазолов, нитротиофенов, нитротиазолов, нитрооксазолов, нитрофуранов и нитропирролов, причем все указанные классы частей могут быть необязательно замещены таким образом, что окислительно-восстановительный потенциал биовосстановительной группы находится в диапазоне, в котором указанная группа может подвергаться восстановлению в условиях гипоксии опухоли под воздействием DT-диафоразы и/или тиола. Специалисту в данной области должно быть понятно в свете настоящего описания изобретения, каким образом необходимо заместить указанные и другие биовосстановительные группы для получения биовосстановительной группы, обладающей окислительно-восстановительным потенциалом, находящимся в указанном диапазоне.

Как правило, специалист в данной области может “отрегулировать” окислительно-восстановительный потенциал биовосстановительной группы, изменяя группу таким образом, чтобы она содержала электроноакцепторные группы, электронодонорные группы или некоторую комбинацию таких групп. Например, нитротиофен, нитрофуран и нитротиазол могут быть замещены одной или несколькими электронодонорными группами, которые включают, не ограничиваясь ими, метильные, метоксильные или аминогруппы, для достижения желаемого окислительно-восстановительного потенциала. В другом примере нитропиррол может быть замещен электроноакцепторной группой, которая включает, не ограничиваясь ими, циано, карбоксамидные, -CF3 и сульфонамидные группы, для достижения желаемого окислительно-восстановительного потенциала. Для указанной цели могут быть использованы сильные электроноакцепторные группы, такие как циано, сульфон, сульфонамид, карбоксамид или -CF3, и более слабые электроноакцепторные группы, такие как -СН2-галоген, где в качестве галогена может быть использован -F, -Cl или -Br.

В используемом здесь значении термин “антибластомное средство”, “противоопухолевое средство” или “противораковое средство” означает любое средство, применяемое при лечении рака. Такие средства могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими соединениями и могут облегчать, уменьшать, ослаблять, предотвращать или сохранять в состоянии ремиссии клинические симптомы или диагностические показатели, ассоциированные с новообразованием, опухолью или раком. Антибластомные средства включают, не ограничиваясь ими, средства, препятствующие развитию кровеносных сосудов, алкилирующие агенты или алкилаторы, антиметаболиты, некоторые природные продукты, координационные комплексы платины, антрацендионы, замещенные мочевины, производные метилгидразина, адренокортикальные супрессоры, некоторые гормоны и антагонисты, противораковые полисахариды, химиозащитные средства и некоторые травяные или другие растительные экстракты.

В используемом здесь значении термин “рак” означает одно из более 100 заболеваний, вызываемых неконтролируемым ростом и распространением аномальных клеток, которые могут принимать форму солидных опухолей, лимфом и несолидных раковых заболеваний, таких как лейкоз.

В используемом здесь значении термин “злокачественная опухоль” означает раковые клетки или раковые опухоли, способные метастазировать с утратой контроля за ростом и расположением.

В используемом здесь значении термин “новообразование” (неоплазия) или “опухоль” означает аномальный рост новых клеток или тканей, которые могут быть доброкачественными или злокачественными.

В используемом здесь значении термин “лечение” заболевания или субъекта означает принятие мер для получения благоприятных или желаемых результатов, включая клинические результаты. В соответствии с целями настоящего изобретения благоприятные или желаемые клинические результаты включают, не ограничиваясь ими, облегчение или ослабление одного или нескольких симптомов рака или других гиперпролиферативных заболеваний, уменьшение тяжести заболевания, задержку или замедление развития заболевания, ослабление, временное облегчение или стабилизацию заболевания и другие благоприятные результаты, описанные ниже.

В используемом здесь значении термин “ослабление” симптома или симптомов (и грамматические эквиваленты данной фразы) означает уменьшение тяжести или частоты возникновения симптомов или устранение симптомов.

В используемом здесь значении термин “введение” лекарственного средства субъекту (и грамматические эквиваленты данной фразы) означает прямое введение, включающее прием лекарственного средства без контроля врача, и непрямое введение, включающее акт прописывания лекарственного средства. Например, в используемом здесь значении лечащий врач, который инструктирует субъекта о самостоятельном приеме лекарственного средства и выписывает лекарственное средство, вводит субъекту лекарственное средство.

В используемом здесь значении “терапевтически эффективное количество” лекарственного средства означает такое количество лекарственного средства, которое при введении субъекту, страдающему раком, оказывает предполагаемое терапевтическое действие, например уменьшает, ослабляет, временно облегчает или устраняет одно или несколько проявлений рака у данного субъекта. Полное терапевтическое действие необязательно происходит при введении одной дозы и может проявляться только после введения серии доз. Таким образом, терапевтически эффективное количество может быть введено в виде одного или нескольких введений.

В используемом здесь значении “профилактически эффективное количество” лекарственного средства означает такое количество лекарственного средства, которое при введении субъекту оказывает предполагаемое профилактическое действие, например предотвращает или задерживает возникновение (или повторное возникновение) заболевания или симптомов либо уменьшает вероятность возникновения (или повторного возникновения) заболевания или симптомов. Полное профилактическое действие необязательно происходит при введении одной дозы и может возникать только после введения серии доз. Таким образом, профилактически эффективное количество может быть введено в виде одного или нескольких введений.

В используемом здесь значении терапия “второй линии” означает терапию, проводимую при лечении рака, который не реагирует на первую схему химиотерапии или химиотерапию “первой линии”. Терапия “третьей линии” означает терапию, проводимую при лечении рака, когда первичное лечение, терапия первой линии, и последующее лечение, терапия второй линии, не оказывают требуемого действия или прекращают действовать.

В используемом здесь значении “LogP” означает меру липофильности вещества, определяемую на основании распределения вещества между октанолом и водой.

IIa. Соединения

Большинство методов лекарственной терапии рака, включающих лечение фосфорамидатными алкилаторами, основано на ядах, именуемых цитотоксическими агентами, которые направленно воздействуют на делящиеся клетки, например реплицирующуюся ДНК, микроканальцы, разные факторы роста и рецепторы факторов роста. Указанные лекарственные средства являются эффективными, так как раковые клетки обычно делятся быстрее, чем нормальные клетки. Однако такие лекарственные средства почти неизбежно убивают не все раковые клетки у субъекта. Одна причина заключается в том, что раковые клетки могут мутировать и вырабатывать лекарственную устойчивость. Другой причиной является то, что не все раковые клетки делятся быстрее, чем нормальные клетки, и медленно делящиеся раковые клетки могут быть нечувствительны или в большей степени нечувствительны к воздействию таких цитотоксических агентов, что и нормальные клетки.

Некоторые раковые клетки, находящиеся в плохо васкуляризованной солидной опухоли, не способны генерировать энергию, необходимую для быстрого деления клеток, и делятся медленно. Опухоль по мере роста требует притока крови и, следовательно, развития новой сосудистой сети. Новая сосудистая сеть, поддерживающая рост опухоли, часто бывает беспорядочной, оставляя значительные области опухоли без сосудов, причем даже васкуляризованные области подвержены периодическому блокированию. Указанные плохо васкуляризованные и блокированные области опухоли становятся гипоксическими - они характеризуются более низкой концентрацией кислорода или более низким парциальным давлением кислорода, чем соответствующая нормальная ткань, и клетки в указанных областях делятся медленнее. Таким образом, средняя концентрация кислорода только в десяти процентах солидных опухолей находится в нормальном диапазоне от 40 до 60 мм Hg, и пятьдесят процентов солидных опухолей имеют среднюю концентрацию кислорода менее 10 мм Hg.

Гипоксические области опухоли являются значительным источником метастазов и раковых клеток, устойчивых к терапии (см., например, публикации De Jaeger et al., Br. J. Cancer. 2001, 84(9): 1280-5, и Rofstad et al., Br. J. Cancer. 1999, 80(11):1697-707). Неудивительно, что низкие уровни кислорода в опухоли ассоциированы с плохой реакцией на лечение, повышенным метастазированием и плохим выживанием. Механизмы активации и действия циклофосфамида и ифосфамида показывают, что данные средства не могут направленно воздействовать на плохо уничтожаемую гипоксическую зону опухоли.

Циклофосфамид и ифосфамид являются пролекарствами и могут быть активированы окислением в печени через промежуточные продукты с образованием активных фосфорамидатных алкилаторов, соответственно алкилаторов 1 (иприт циклофосфамида) и 2 (иприт ифосфамида) (см. ниже). Гемиацетали с нейтральным зарядом 1 и 2 характеризуются длительным периодом полураспада и могут проникать в клетку и из клетки. В отличие от этого анионные алкилаторы 1 и 2 в гораздо меньшей степени проникают через клеточную мембрану и при образовании вне клетки неэффективно убивают клетку путем алкилирования клеточной ДНК.

Фосфорамидатные алкилаторы, попав в опухоль, обычно убивают клетки в быстрорастущей, хорошо васкуляризованной, негипоксической внешней зоне опухоли. Однако указанные фосфорамидатные алкилаторы плохо проникают в менее васкуляризованные, медленно растущие, все более гипоксические внутренние зоны опухоли и неэффективно убивают опухолевые клетки в таких зонах. Прежде чем указанные активные алкилаторы достигнут опухоль, они могут взаимодействовать со здоровыми клетками, оказывая токсическое действие и/или вызывая гибель клеток.

Хотя гипоксическая опухоль плохо поддается лечению, в гипоксической зоне опухоли могут образовываться восстановленные производные разных химических групп (см. публикацию Workman et al., 1993, Cancer and Metast. Rev. 12:73-82), поэтому можно создать пролекарства цитотоксинов, воздействующие на такие биовосстановительные среды (заявки на патент США согласно РСТ №№ US04/009667 и US05/08161; РСТ/US2005/041959 и PCT/US2005/042095, Matteucci et al.). Такое пролекарство, восстанавливаемое в условиях гипоксии (или активируемое гипоксией), может быть создано в результате использования биовосстановительной группы (Z3) вместе с алкилатором. Биовосстановительная группа является частью триггера, ковалентно связанного или присоединенного к фосфорамидатному алкилатору.

Соединения по настоящему изобретению можно охарактеризовать как пролекарства фосфорамидатных алкилаторов. Как правило, пролекарства фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению имеют следующую структуру:

Alk-Триггер

в которой Alk означает фосфорамидатный алкилатор и триггер Т имеет структуру L-Z3, где линкер L связан с биовосстановительной группой Z3. В одном варианте осуществления изобретения триггер Т является триггером, активируемым в условиях гипоксии.

Производные фосфорамидатных алкилаторов представлены в публикациях Borch et al., J. Med. Chem. 2000, 43: 2258-65; 2001, 44: 69-73; 2001, 44: 74-7; Hernick et al., J. Med. Chem. 2002, 45: 3540-8; Hernick et al., J. Med. Chem. 2003, 46: 148-54; патентах США №№ 4908356, 5306727, 5403932, 5190929, 5472956 и 6656926; публикации заявки на патент США № US 2003/0008850 и публикации Papot et al., Curr. Med. Chem., 2002, 2, 155-85, выделенные соединения которых рассмотрены в настоящем описании изобретения и не являются объектом настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления изобретения пролекарства фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению имеют одну или несколько нижеследующих характеристик: (i) более высокая гипоксическая токсичность или меньшее значение IC50 или IC90 в гипоксической ткани, (ii) более низкая негипоксическая цитотоксичность и (iii) менее выраженный токсический профиль побочных эффектов или некоторая комбинация указанных признаков. В некоторых вариантах осуществления изобретения пролекарства фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению отличаются от известных производных фосфорамидатных алкилаторов (i) типом высвобождаемого фосфорамидатного алкилатора, (ii) типом линкера (L) и/или биовосстановительной группы Z3, (iii) наличием нескольких биовосстановительных групп или некоторой комбинацией указанных признаков, (iv) повышенной избирательной цитотоксичностью в условиях гипоксии, определяемой по более высоким значениям HCR, (v) более высокой растворимостью в воде, (vi) повышенной устойчивостью к разрушению микросомами печени и/или (vii) получением эффективных пролекарств фосфорамидатных алкилаторов, которые не являются хиральными и не подвергаются специфичному для энантиомеров метаболизму in vivo.

Пониманию того, почему пролекарства по настоящему изобретению характеризуются значительным преимуществом по сравнению с известными противораковыми производными фосфорамидатных алкилаторов, может способствовать ознакомление с биологией опухолей, особенно в условиях гипоксии, фармакокинетикой и фармакодинамикой пролекарств, представленных в настоящем описании изобретения.

Для эффективного лечения опухоли пролекарство, активируемое в условиях гипоксии, должно быть гораздо менее токсичным для здоровых негипоксических клеток по сравнению с гипоксическими опухолевыми клетками. В некоторых вариантах осуществления изобретения пролекарства, активируемые в условиях гипоксии, по настоящему изобретению являются менее активными и менее токсичными для негипоксических клеток по сравнению с гипоксическими клетками. Когда такое пролекарство по настоящему изобретению обнаруживает гипоксическую, восстанавливающую среду в ткани солидной опухоли, восстановление биовосстановительной группы вызывает диссоциацию фосфорамидатного алкилатора или активного цитотоксина. Фосфорамидатный алкилатор высвобождается в зоне опухоли и может легче проникать в гипоксическую область солидной опухоли. Указанные фосфорамидатные алкилаторы могут убивать клетки в труднодоступной гипоксической области солидной опухоли, минимально сокращая гибель нераковых здоровых клеток и токсические побочные эффекты для субъекта. Таким образом, настоящее изобретение относится к пролекарствам, активируемым в условиях гипоксии, которые являются гораздо менее токсичными для здоровых негипоксических клеток по сравнению с гипоксическими опухолевыми клетками.

В некоторых вариантах осуществления изобретения пролекарства фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению включают нитросодержащие ароматические или индолхиноновые части в качестве биовосстановительных групп в триггере Т. В гипоксической опухоли нитрогруппа восстанавливается в гидроксиламино- или аминогруппу, и перемещение электронной пары из амино- или гидроксиламиногруппы через конъюгированную систему π-электронов триггера Т высвобождает фосфорамидатный алкилатор. В другом варианте осуществления изобретения индолхинон восстанавливается в гипоксической опухоли в индолгидрохинон, и перемещение электронной пары из гидрохинона через триггер Т высвобождает фосфорамидатный алкилатор. Высвободившийся фосфорамидатный алкилатор убивает клетки в гипоксической опухоли и/или рядом с ней.

Восстановление биовосстановительной группы Z3 в триггере опосредует ряд ферментов. Например, ферменты цитохром Р450-редуктазы могут восстанавливать нитро или хиноновую часть в биовосстановительной группе на первой стадии соответственно в NO2(-) или анион семихинонового радикала. Гипоксическая зона опухоли может характеризоваться более высокой концентрацией фермента редуктазы по сравнению с негипоксической тканью. В условиях отсутствия гипоксии, а также в хорошо васкуляризованной здоровой ткани в присутствии кислорода образованный NO2(-) или анион семихинонового радикала может взаимодействовать с кислородом, возвращая биовосстановительную группу в исходное состояние, в результате чего не происходит образования или высвобождения фосфорамидатного алкилатора. Арильная или гетероарильная часть, ковалентно связанная с NO2(-) или анионом семихинонового радикала, модулирует чувствительность аниона радикала к кислороду.

Чувствительность биовосстановительной группы к кислороду частично изменяется в зависимости от восстановительного потенциала биовосстановительной группы. Так, например, одна биовосстановительная группа может восстанавливаться в гипоксической зоне опухоли, содержащей 1% кислорода, другая группа может восстанавливаться в зоне, содержащей 0,1% кислорода, и третья группа может восстанавливаться в зоне, содержащей 0,01% кислорода.

Биовосстановительная группа теряет некоторую часть или всю свою гипоксическую специфичность в условиях легкого восстановления, при котором фермент цитохром Р450-редуктаза или другие восстановители (восстановительный агент) в здоровой негипоксической ткани могут восстанавливать ее в присутствии кислорода. Если NO2(-) или анион семихинонового радикала в биовосстановительной группе не взаимодействует или медленно взаимодействует с кислородом, анион радикала может сам высвобождать фосфорамидатный алкилатор или может подвергаться дальнейшему восстановлению с последующим высвобождением фосфорамидатного алкилатора, оказывая токсическое воздействие на здоровые негипоксические клетки и ткани. Новые пролекарства фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению являются более токсичными для гипоксических раковых клеток и тканей по сравнению со здоровыми негипоксическими клетками и тканями.

Легкое или тяжелое восстановления биовосстановительной группы Z3 можно измерить на основании восстановительного потенциала биовосстановительной группы с учетом влияния линкера (L) и фосфорамидатного алкилатора (Alk-H). Например, присоединение биовосстановительной группы к электроноакцепторному линкеру или электроноакцепторному фосфорамидатному алкилатору может облегчить восстановление биовосстановительной группы по сравнения с тем, когда указанная группа ковалентно связана с богатым электронами линкером или богатым электронами фосфорамидатным алкилатором.

Триггер Т может быть окислен, гидролизован или тиолизирован и может высвобождать фосфорамидатный алкилатор, не будучи чувствительным к условиям гипоксии. Телцита™, пролекарство фосфорамидатного алкилатора, применяемое в медицине, может высвобождать активный токсин при отсутствии гипоксии под воздействием глутатионтрансферазы (см., например, фосфорамидатный алкилатор 1f, описанный в разделе “Способы лечения”). Химическая природа линкера и/или фосфорамидатного алкилатора может влиять на устойчивость пролекарства к окислению, гидролизу или тиолизу в отношении высвобождения фосфорамидатного алкилатора. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора, активируемое в условиях гипоксии, не высвобождает фосфорамидатный алкилатор в неспецифичных для гипоксии условиях окисления, гидролиза или тиолиза.

В соответствии с настоящим изобретением правильно выбранный триггер в пролекарстве фосфорамидатного алкилатора может быть использован для “регулирования” фармакокинетического свойства данного пролекарства без изменения цитотоксических свойств. Например, широкий диапазон распределения противоракового средства гарантирует быструю абсорбцию пролекарства тканями. В одном варианте осуществления настоящего изобретения диапазон распределения пролекарства фосфорамидатного алкилатора может быть изменен в результате применения триггера Т, содержащего аминогруппу, способную образовывать катион аммония в физиологических условиях. В одном варианте осуществления изобретения триггер Т, содержащий группу четвертичного аммония, позволяет получить пролекарство по настоящему изобретению с широким диапазоном распространения при отсутствии возможного захвата эндосомами. В другом варианте осуществления изобретения триггер Т, содержащий карбоксильную функциональную группу, может существовать в форме карбоксилатного аниона. Наличие СО2(-) во внеклеточном пространстве снаружи нормальной здоровой ткани не позволяет пролекарству легко проникать через нормальную клеточную мембрану. При более низком значении рН во внеклеточном пространстве опухоли СО2(-) может превращаться в незаряженную форму “CO2H”, делая возможным проникновение пролекарства через клеточную мембрану опухоли.

Фосфорамидатный алкилатор, содержащий гидроксильную, амино-, меркапто- и/или карбоксильную группу, может быть превращен в пролекарство путем ковалентного связывания триггера Т с одной или несколькими указанными функциональными группами. В процессе превращения из фосфорамидатного алкилатора в пролекарство гидроксильная группа в фосфорамидатном алкилаторе может быть превращена, например, в простой эфир или ацеталь; аминогруппа может быть превращена в алкиламиногруппу, карбамат или амид; карбоксильная группа может быть превращена в сложный эфир; и меркаптогруппа может быть превращена в простой тиоэфир или тиоацил, как более подробно описано ниже в разделах “Способ синтеза” и “Экспериментальный раздел”. Подобные превращения позволяют получить пролекарство, которое является менее полярным или более липофильным по сравнению с соответствующим фосфорамидатным алкилатором. Неполярные пролекарства фосфорамидатных алкилаторов плохо растворяются в водных фармацевтических носителях или разбавителях. В триггере Т могут быть использованы усиливающие растворимость группы, такие как СО2Н, амино, алкиламино, диалиламино и гидроксил, для изменения растворимости пролекарства и преодоления проблем, возникающих при приготовлении водных препаратов пролекарств фосфорамидатных алкилаторов.

Фосфорамидатные алкилаторы по настоящему изобретению могут содержать одну или несколько N-(2-галогеналкильных групп) или N-(2-галогенэтильных групп) и/или одну или несколько азиридиновых частей

ковалентно связанных с частью Р=О, как показано ниже. При высвобождении анионной части фосфорамидатного алкилатора образуется азиридин или азиридиний, который может алкилировать ДНК (см. раздел “Примеры”, пример 36). Кинетика образования азиридиния может меняться в зависимости от электроноакцепторного характера заместителей R2 и R3. Например, как показано в приведенной ниже последовательности реакций, скорость алкилирования может возрастать при изменении части NR2R3 из NH2 в
(см. публикацию Engle et al., J. Med. Chem., 1987, 25:1347-57). Заместители у атомов азота могут изменять геометрию фосфорамидатного алкилатора, делокализацию отдельной электронной пары у данного атома азота в части Р=О, доступность отдельных электронных пар у атома азота для образования азиридиния или последующего азиридина, растворимость в воде пролекарства фосфорамидатного алкилатора и фосфорамидатного алкилатора.

В основе настоящего изобретения частично лежит открытие того, что пролекарства фосфорамидатных алкилаторов, содержащие 2-нитроимидазольную биовосстановительную группу, характеризуются неожиданно высокой гипоксической цитотоксичностью, низкой негипоксической токсичностью, высоким значением HCR и лучшей растворимостью. Например, при выполнении анализа антипролиферативной цитотоксичности при значении IC50, равном 0,05 мкМ, в клетках, находящихся в условиях гипоксии, было установлено, что соединения 24 и 25 являются соответственно в 400-1000 раз более токсичными в гипоксических клетках, чем в негипоксических клетках. (См. раздел “Примеры”). Пролекарства фосфорамидатных алкилаторов, содержащие иприт ифосфамида или аналоги иприта ифосфамида и имеющие формулы:

Z3-CH2-O-P(=O)(NHCH2CH2X4)2, Z3-CH2-O-P(=O)(NHCH(R9)CH2X4)2 и

Z3-CH(Z2)-O-P(=O)(NHCH(R9)CH2X4)2,

где Z2 означает метил; R9 означает водород, метил или изопропил; Z3 означает 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-ил, 2-нитротиофен-5-ил или 2-нитрофуран-5-ил; и каждый Х4 означает Cl или Br, неожиданно оказались более токсичными в гипоксических клетках по сравнению с негипоксическими клетками и/или характеризовались неожиданно высокими значениями НCR при выполнении анализов антипролиферативной клеточной цитотоксичности по сравнению со значениями HCR известных производных фосфорамидатных алкилаторов, содержащих 2-нитротиофен-5-ил, 2-нитрофуран-5-ил или 5-нитроимидазолил в качестве биовосстановительных групп (Z3) и иприт N,N'-(тетракис-2-хлорэтил)фосфорамидата или иприт циклофосфамида; или индолхинонильную группу в качестве Z3 и иприт ифосфамида (см., например, соединения Р4, Р14-17, Р19 и Р21-22 в приведенной выше публикации Borch et al., J. Med. Chem. и в патенте США № 6656926).

Одним объектом настоящего изобретения являются пролекарства фосфорамидатных алкилаторов формулы (I):

в которой:

Y1 означает О, S, NR6 или NSO2R6, где каждый R6 независимо означает С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, арил или гетероарил;

Y2 означает O, S, NR6, NCOR6 или NSO2R6;

каждый элемент из R1-R5 независимо означает водород, гидроксил, амино, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил, гетероарил, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил или гетероароил; либо два любых элемента из R1-R5 вместе образуют С3-С10 гетероцикл или каждый элемент из R1-R5 независимо означает триггер Т, который имеет формулу L-Z3;

L выбирают из

-[C(Z1)2-Y3]v-[C(=O)-O]q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-[C(Z1)2]z-[C(Z1)=C(Z1)]g- и

-[C(Z1)2-Y3]v-(S(=O)2)q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-[C(Z1)2]z-[C(Z1)=C(Z1)]g-,

где каждый символ z, v, q, u и g независимо означает 0 или 1;

Y3 означает S, O или NR7, где каждый R7 независимо означает водород, гидроксил, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил, гетероарил, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил или гетероароил;

Y4 означает О, S или -NR7-C(=O)-O-;

каждый Z1 независимо означает водород, галоген, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, арил, гетероарил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил или гетероароил;

Z2 означает С1-С6 алкилен, С1-С6 гетероалкилен,

где каждый Х1 независимо означает N или CR8, где R8 независимо означает водород, галоген, ОН, ОР(=О)(ОН)2, нитро, циано, СО2Н, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С1-С6 циклоалкил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил, CON(R7)2, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил или гетероароил;

Х2 означает NR7, S или О; и

Z3 означает биовосстановительную группу, выбираемую из группы, включающей:

при условии, что в соединении формулы (I):

(i) по крайней мере два элемента из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил;

(ii) по крайней мере один элемент из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, и по крайней мере один элемент из NR2R3 и NR4R5 означает

или

(iii) каждый элемент из NR2R3 и NR4R5 означает

и

их отдельные изомеры, рацемические или нерацемические смеси изомеров, биоизостеры, фармакофоры, фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты или пролекарства.

В одном варианте осуществления изобретения z равно 1.

В одном варианте осуществления изобретения элементы R2-R5 имеют разные значения.

В одном варианте осуществления изобретения любой один элемент из R2-R5 означает

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, активируемым в условиях гипоксии, каждый из которых содержит два фосфорамидатных алкилатора. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению содержит 1-N-алкил-2-нитроимидазол-5-ил или 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-ил в качестве биовосстановительной группы или Z3. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению содержит 2-нитрофуран в качестве биовосстановительной группы или Z3.

В одном варианте осуществления изобретения из объема настоящего изобретения исключены соединения:

где Rа означает Н, Br (P14), NМe2 (P15), CN (P16) или CONH2 (P17),

где R означает Н, Ме или аллил;

3-(5-метокси-1-метил-4,7-индолхинонил)метилбис[N-метил-N-(2-бромэтил)]фосфордиамидат (Р27),

3-(5-метокси-1-метил-4,7-индолхинонил)метил-N,N-бис(2-бромэтил)фосфордиамидат (Р28),

2-(5-метокси-1-метил-4,7-индолхинонил)метилбис[N-метил-N-(2-бромэтил)]фосфордиамидат (Р29),

2-(5-метокси-1-метил-4,7-индолхинонил)метил-N,N-бис(2-хлорэтил)фосфордиамидат (Р30),

2-(5-метокси-1-метил-4,7-индолхинонил)метил-N,N-бис(2-бромэтил)фосфордиамидат (Р31),

3-(5-метокси-1-метил-4,7-индолхинонил)метил-N,N-бис(2-бромэтил)фосфордиамидат (Р32),

2-(5-метокси-1-метил-4,7-индолхинонил)метилбис[N-метил-N-(2-бромэтил)]фосфордиамидат (Р33),

2-(5-метокси-1-метил-4,7-индолхинонил)метил-N,N-бис(2-хлорэтил)фосфордиамидат (Р34) и

2-(5-метокси-1-метил-4,7-индолхинонил)метил-N,N-бис(2-бромэтил)фосфордиамидат (Р35).

Родственный вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (I) при условии, что

(i) по крайней мере один элемент из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилалкил, и

по крайней мере один элемент из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил; или

(ii) по крайней мере один элемент из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-С1-С6 алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил; и по крайней мере один элемент из NR2R3 и NR4R5 означает

(iii) каждый элемент NR2R3 и NR4R5 означает

Другой родственный вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (I) при условии, что из формулы (I) исключены R2 и R3, вместе образующие морфолиновое кольцо, или R4 и R5, вместе образующие морфолиновое кольцо.

В одном варианте осуществления изобретения из объема настоящего изобретения исключено соединение следующей формулы:

где Z1 означает водород или С1-С6 алкил.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям, в которых триггер Т означает

В дополнительном варианте осуществления изобретения Z3 означает

В одном варианте осуществления изобретения каждый элемент -С(Z1)2- означает: -СН2-, -СНМе-, -CH(CN)-, -CH(CO2H)-, -CH(CONH2)-, -CH(CF3)-, -CH(CHF2)-, -C(Me)2-, -C(Et)2-, -CH(CH2NMe2)-, -CH(CH2NMe2)-, -C(CH2NMe2)2- или -С(СН2СО2Н)2-.

В одном варианте осуществления изобретения элемент -С(Z1)2-Y3- означает: -СН2-О-, -CH2-S-, -CH2NMe-, -CH2-NH-, -CH(Me)-O-, -CH(Me)-S-, -CH(Me)-NMe-, -CH(Me)-NH-, -CМe2-NMe-, -CМe2-NMe- или -СМe2-NMe-.

В одном варианте осуществления изобретения -Z2-Y4- вместе означают

В одном варианте осуществления изобретения -[C(Z1)=C(Z1)]- означает: -CH=CH-, -C(CN)=CH-, -CH=C(CN)-, -C(Ar)=CH-, -CH=CАr-, -C(COAr)=CH-, -CH=C(COAr)-, -C(COR12)=CH- или -СH=C(COR12)-, где Ar означает арил, необязательно замещенный одним-пятью заместителями, выбираемыми из группы, включающей ОН, ОМе, CF3, O-CHF2, OCF3, NO2, CN, галоген, галогенметил, дигалогенметил, тригалогенметил, гидроксиметил, СО2Н, CONH2, CONMe2 и CОNHMe, и R12 независимо означает водород, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил или гетероциклил.

В другом варианте осуществления изобретения триггер означает:

В другом варианте осуществления изобретения триггер означает:

где каждый Z1 независимо означает Н или С1-С6 алкил.

В другом варианте осуществления изобретения триггер означает:

где каждый Z1 означает водород или С1-С6 алкил и R8 означает Н, ОН или -ОР(=О)(ОН)2.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям формул (II) и (III):

где каждый элемент из R2-R5 независимо выбирают из группы, включающей водород, гидроксил, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил и гетероарил; или два любых элемента из R2-R5 вместе образуют С3-С10 гетероцикл; каждый Y1 независимо означает S или О; и каждый триггер Т имеет значения, указанные в формуле (I);

при условии, что в соединениях формул (II) или (III):

(i) по крайней мере два элемента из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил; или

(ii) по крайней мере один элемент из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-С1-С6 алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил; и по крайней мере один элемент из NR2R3 и NR4R5 означает

или

(iii) каждый элемент NR2R3 и NR4R5 означает

и

их отдельным изомерам, рацемическим или нерацемическим смесям изомеров, биоизостерам, фармакофорам, фармацевтически приемлемым солям, сольватам, гидратам или пролекарствам.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (II), в котором триггер Т означает -CH2-Z3, -CH(Z1)-Z3 или -C(Z1)2-Z3, где Z1 означает С1-алкил и Z3 означает:

при условии, что в соединении формулы (II):

(i) один элемент из R2 и R3 означает Н и один элемент из R4 и R5 означает Н;

(ii) один элемент из R2 и R3 означает С1-алкил и один элемент из R4 и R5 означает С1-алкил; или

(iii) по крайней мере один элемент из R2-R5 означает гидроксил, амино, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил, гетероарил, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил или гетероароил.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (II), в котором Z3 означает биовосстановительную группу, выбираемую из:

при условии, что в соединении формулы (II):

(i) по крайней мере один элемент из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, и

по крайней мере один элемент из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил; или

(ii) по крайней мере один элемент из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-С1-С6 алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил; и по крайней мере один элемент из NR2R3 и NR4R5 означает

или

(iii) каждый элемент NR2R3 и NR4R5 означает

.

Одним объектом настоящего изобретения являются пролекарства фосфорамидатных алкилаторов формулы (I):

в которой:

R1 означает -[C(Z1)2-Y3]v-[C(=O)-O]q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-Z3 или -[С(Z1)2-Y3]v-(S(=O)2)q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-Z3, где v, q и u независимо означают 0 или 1; и Z3 означает глюкозу или ее аналог, при условии, что из объема настоящего изобретения исключены конъюгаты глюкозы с фосфорамидатными алкилаторами, описанные в ссылке Wiessler et al., патент США № 5622936;

каждый элемент из R2-R5 независимо означает водород, гидроксил, амино, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил и гетероарил, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил или гетероароил; или два любых элемента из R1-R5 вместе образуют С3-С10 гетероцикл;

при условии, что в соединении формулы (I):

(i) по крайней мере два элемента из R2-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил;

(ii) по крайней мере один элемент из R2-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-С1-С6 алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил; и по крайней мере один элемент из NR2R3 и NR4R5 означает

или

(iii) каждый элемент NR2R3 и NR4R5 означает

и

их отдельные изомеры, рацемические или нерацемические смеси изомеров, биоизостеры, фармакофоры, фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты или пролекарства.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям:

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям:

где Х4 и Z3 имеют указанные выше значения.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям:

В одном варианте осуществления изобретения R6 означает -(N-CH2CH2X4)2.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям:

где R2-R5 имеют значения, указанные в формуле (II).

На приведенной ниже схеме показан пример восстановления пролекарства фосфорамидатного алкилатора в условиях гипоксии с образованием соответствующего фосфорамидатного алкилатора.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям:

где R2-R5 имеют значения, указанные в формуле (II).

На приведенной ниже схеме показан пример восстановления пролекарства фосфорамидатного алкилатора в условиях гипоксии с образованием соответствующего фосфорамидатного алкилатора.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям формул (IV)-(VII):

где каждый R9 независимо означает водород, дейтерий, арил, гетероарил, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил, гетероароил, С1-С6 алкоксикарбонил, С1-С6 алкиламинокарбонил, ди-С1-С6 алкиламинокарбонил или С1-С6 алкокси; либо две группы R9 вместе образуют гетероцикл;

каждый R10 означает водород, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, ароил или гетероароил; либо две группы R10 вместе образуют гетероцикл;

R11 независимо означает водород, дейтерий, арил, гетероарил, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, С1-С6 ацил, С1-С6 гетероацил, ароил, гетероароил, С1-С6 алкоксикарбонил, С1-С6 алкиламинокарбонил, ди-С1-С6 алкиламинокарбонил или С1-С6 алкокси; либо две группы R9 вместе образуют гетероцикл, при условии, что, когда R11 означает С1-С6 алкил или С1-С6 гетероалкил, тогда R11 не является

или две группы R11 вместе образуют гетероцикл;

Х4 означает Cl, Br, алкилсульфонилокси, гетероалкилсульфонилокси, арилсульфонилокси или гетероалкилсульфонилокси; и

триггер Т означает [C(Z1)2-Y3]v-(C(=O)-O)q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-[C(Z1)2]z-[C(Z1)=C(Z1)]g-Z3.

В родственном варианте осуществления изобретения в соединениях формул (IV)-(VII) каждый R9 независимо означает водород, дейтерий, С1-С3 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С6 циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил. В другом варианте осуществления изобретения каждый R9 независимо означает водород, дейтерий или С1-С6 алкил. В другом родственном варианте осуществления изобретения каждый R9 независимо означает метил, этил, пропил, изопропил, изобутил, третичный бутил или циклопропил.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (IV), в котором один из элементов R10 означает -(СН2)е-интеркалятор, где интеркалятор является ароматической или гетероароматической частью, способной производить вставку между парой оснований нуклеиновой кислоты.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению:

где Х4 и R10 имеют значения, указанные в формуле (IV).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению:

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (VIII):

где каждый R9 независимо означает водород, метил, этил, пропил, изопропил или циклопропил; и N(R10)2 выбирают из NH2, NHMe, NMe2, NЕt2,

NHOMe и NHOH.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (IX):

где каждый R9 независимо означает водород, метил, этил, пропил, изопропил или циклопропил.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (Х):

где каждый R9 независимо означает водород, метил, этил, пропил, изопропил или циклопропил; и каждый R11 независимо означает водород, метил, этил, пропил, изопропил, бензил, замещенный метил, циклопропил, метокси и гидроксил; либо два элемента R11 вместе образуют гетероцикл.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям формул (Х-А), (Х-В) и (Х-С):

где Х2 и Х4 имеют значения, указанные в формуле (I), R10 и R11 имеют значения, указанные в формулах (IV), (VI) и (VII).

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям формул (XI)-(XV):

где каждый R11 независимо означает водород, метил или замещенный метил, бензил, изопропил, пропил, циклопропил, метокси и гидроксил; Х1, Х2 и Z3 имеют указанные выше значения; и Х4 означает Cl, Br, алкилсульфонилокси, гетероалкилсульфонилокси, циклоалкилсульфонилокси, гетероциклоалкилсульфонилокси, арилсульфонилокси или гетероарилсульфонилокси. Один вариант осуществления изобретения относится к соединениям формул (XII), (XIV) и (XV), в которых, когда Х4 означает Cl или Br, тогда R11 не является изопропилом. В одном варианте осуществления изобретения из соединений формулы (Х) исключено соединение, в котором Z3 означает

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (XII), (XIV) или (XV), в которой каждый R11 означает водород. Примеры соединений формулы XII, XIV или XV включают соединения 5, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 19, 23, 24, 25, 26, 32, 34 и 36. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов формул XII, XIV или XV, где R11 не является пропилом или изопропилом. В другом варианте осуществления изобретения из объема настоящего изобретения исключено соединение:

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора, в котором R11 означает С3-С8 циклоалкил. В другом варианте осуществления изобретения циклоалкил является циклопропилом. Как правило, циклопропильная группа может быть более устойчивой, чем алкильная группа, к белкам окислительного метаболизма в клетке, например в печени, соединения по настоящему изобретению представляют собой пролекарства фосфорамидатных алкилаторов с улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с известными пролекарствами фосфорамидатных алкилаторов.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям формулы (XVI):

где K означает С1-С6 алкилен или С1-С6 гетероалкилен. В одном варианте осуществления изобретения K означает (С(R12)2)е, CH2CH2(X6-CH2CH2)f или СН2(Х6-СН2)f, где е равно 1-10, f равно 0-3 и Х6 означает О, S или NR12, где каждый R12 имеет указанные выше значения.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям формул (XVII)-(XVIII)

где е равно 0-4, Х4 означает Cl или Br, алкилсульфонилокси, гетероалкилсульфонилокси, арилсульфонилокси или гетероарилсульфонилокси; Х6 означает О, S или NR12, где R12 имеет указанные выше значения.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (XIX):

где е равно 0-4 и Х4 означает Cl, Br, алкилсульфонилокси, гетероалкилсульфонилокси, арилсульфонилокси или гетероарилсульфонилокси. Родственный вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (XIX), в которой е=1. См. раздел “Примеры” для ознакомления с примерами соединений формул, рассмотренных в настоящем описании изобретения.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (ХХ):

ХХ

где Rg означает глюкозу или аналог глюкозы; е равно 0-4 и Х4 означает Cl, Br, алкилсульфонилокси, гетероалкилсульфонилокси, арилсульфонилокси или гетероарилсульфонилокси. В используемом здесь значении аналог глюкозы означает моно-, ди- и трисахариды. Родственный вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы ХХ, в которой е=1.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям:

где Х4 означает Cl, Br или алкилсульфонилокси.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям:

где R9 и Х4 имеют значения, указанные в формуле VI.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (XXI):

где Y1 означает S или О и триггер Т имеет значения, указанные в формуле (I).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к конъюгату оксима и фосфорамидатного алкилатора:

В одном варианте осуществления изобретения такой конъюгат оксима и фосфорамидатного алкилатора может быть гидролизован ферментами с образованием:

Другим объектом настоящего изобретения являются соединения формулы (ХXII):

где:

R1-R5, Y1 и Y2 имеют значения, указанные в формуле (I);

каждый элемент из R1-R5 и R1*-R5* независимо выбирают из группы, включающей водород, гидроксил, С1-С6 алкил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил, гетероарил; либо R2 и R2* вместе образуют гетероцикл или каждый элемент из R1-R5 и R1*-R5* независимо означает триггер Т, выбираемый из группы, включающей

-[C(Z1)2-Y3]v-[C(=O)-O]q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-[C(Z1)2]z-[C(Z1)=C(Z1)]g-Z3 и

-[C(Z1)2-Y3]v-(S(=O)2)q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-[C(Z1)2]z-[C(Z1)=C(Z1)]g-Z3-;

при условии, что в соединении формулы (XXII):

(i) по крайней мере два элемента из R1-R5 и R1*-R5* означают 2-галогеналкил, 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил или 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил;

(ii) по крайней мере один элемент из R1-R5 и R1*-R5* означает 2-галогеналкил, 2-С1-С6 алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил или 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил и по крайней мере один элемент NR2R3 и NR2*R3* означает

или

(iii) каждый элемент NR2R3 и NR2*R3* означает

и

их отдельные изомеры, рацемические или нерацемические смеси изомеров, биоизостеры, фармакофоры, фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты или пролекарства.

каждый Z независимо означает С, S или Р;

каждый символ t независимо означает 1 или 2;

каждый символ r независимо означает О или 1;

К выбирают из группы, включающей С1-С6 алкилен, С1-С6 гетероалкилен, арилен или гетероарилен, (С(R9)2)n и (Y5-(C(R9)2)m-Y4-(C(R9)2)m-Y6)n, где n равно 1-8;

каждый символ m независимо означает 1-4;

каждый R9 независимо означает С1-С6 алкил или гетероалкил либо вместе с ковалентно связанным одним атомом углерода или смежными атомами углерода означает циклоалкил или гетероциклил; и

каждый Y4, Y5 и Y6 независимо означает О, S, NR7 или связь при условии, что один элемент из Y4, Y5 и Y6 должен быть О, S или NR7.

Другим объектом настоящего изобретения являются соединения формулы (XXIII):

где:

R1-R5, Y1 и Y2 имеют значения, указанные в формуле (I);

каждый элемент из R1-R5 и R1*-R5* независимо выбирают из группы, включающей водород, гидроксил, С1-С6 алкил, С1-С6 алкокси, С1-С6 алкиламино, С1-С6 диалкиламино, арил, гетероарил; либо R2 и R2* вместе образуют гетероцикл или каждый элемент из R1*-R5* независимо означает триггер Т, выбираемый из группы, включающей

-[C(Z1)2-Y3]v-[C(=O)-O]q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-[C(Z1)2]z-[C(Z1)=C(Z1)]g-Z3 и

-[C(Z1)2-Y3]v-(S(=O)2)q-[C(Z1)2-Z2-Y4]u-[C(Z1)2]z-[C(Z1)=C(Z1)]g-Z3-;

при условии, что в соединении формулы (XXIII):

(i) по крайней мере два элемента из R2-R5 и R2*-R5* означают 2-галогеналкил, 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил или 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил;

(ii) по крайней мере один элемент из R2-R5 и R2*-R5* означает 2-галогеналкил, 2-С1-С6 алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил или 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил и один элемент из NR2R3 и NR2*R3* означает

или

(iii) NR2R3 и NR2*R3* вместе означают

или NR4R5 и NR4*R5* вместе означают
и

их отдельные изомеры, рацемические или нерацемические смеси изомеров, биоизостеры, фармакофоры, фармацевтически приемлемые соли, сольваты, гидраты или пролекарства.

L2 означает

где Х имеет указанные выше значения.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (XXIV):

где R2, R3, R4, R2*, R3*, R4*, Z, K и триггер имеют значения, указанные в формуле (XXII).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединениям формулы (XXIV), имеющим структуру формулы (ХXV) или (XXVI):

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы (XXVI):

где Х1, Х2, Х4 и е имеют значения, указанные в формуле (XXV).

Другим объектом настоящего изобретения является соединение формулы (XXVII):

где R2-R5, r, k, Y1 и триггер Т имеют значения, указанные в формуле (XXIV).

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы:

где Т означает L-Z3;

L1 означает СН2, СНМе, С(Ме)2, СН2ОСН2 (СН2)3, СН2S(CH2)2, CH2S(CH2)3,

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к элементу Z3, выбираемому из группы, включающей:

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к части молекулы, имеющей формулу:

которую выбирают из группы, включающей:

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к элементу Т, выбираемому из группы, включающей:

где каждый Z1, R7 и R8 имеют указанные выше значения. В данном варианте осуществления изобретения Z1 означает водород, метил или этил; R7 означает метил, трифторэтил, этил, пропил и циклогексил; и R8 означает ОН или ОР(=О)(ОН)2. Данный вариант осуществления изобретения относится к соединению

где каждый R9 означает водород или С1-С6 алкил и каждый Х4 означает галоген или RsulS(=O)2O-. В другом варианте осуществления изобретения R9 означает водород, метил, этил, изопропил или изобутил; и Х4 означает хлор, бром или метансульфонилокси.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению формулы:

где Т имеет указанные выше значения или более конкретно Т означает L-Z3, где L означает СН2, СНМе, СМе2,

и Z3 означает

Одним объектом настоящего изобретения являются дейтерированные фосфорамидатные алкилаторы и пролекарства дейтерированных фосфорамидатных алкилаторов формулы

где Х4 означает галоген или RsulS(=O)2O. В другом варианте осуществления изобретения Х4 означает Cl или Br. Такие дейтерированные фосфорамидатные алкилаторы и их пролекарства в такой же степени цитотоксичны в отношении гипоксической ткани опухоли, что и их недейтерированные или гидрированные аналоги, такие как соединения 25, 36 и тому подобные. Однако присутствие таких дейтерированных аналогов in vivo, например, в плазме крови можно определить с большей степенью достоверности по сравнению с соответствующими фосфорамидатными алкилаторами и/или пролекарствами фосфорамидатных алкилаторов при помощи методов ядерного магнитного резонанса, и такие дейтерированные аналоги могут быть использованы при определении фармакокинетических или фармакодинамических свойств фосфорамидатных алкилаторов и/или пролекарств фосфорамидатных алкилаторов. Информация о фармакокинетических и/или фармакодинамических свойствах фосфорамидатных алкилаторов и/или пролекарств фосфорамидатных алкилаторов может быть использована при определении дозы, частоты введения и подобных параметров, связанных с введением лекарственного средства. Синтез октадейтерированного соединения 25 и октадейтерированного изофосфамидного алкилатора описан в разделе “Примеры”.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к отдельным и выборочным группам соединений, описанных в разделе “Примеры”. Примеры соединений по настоящему изобретению включают:

В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора содержит

в качестве Z3 и обладает специфической токсичностью в отношении гипоксической опухоли, являясь при этом гораздо менее токсичным для здоровой негипоксической ткани.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к новому пролекарству фосфорамидатного алкилатора, которое в результате биовосстановления высвобождает соответствующий новый или известный фосфорамидатный алкилатор

где Х4 имеет значения, указанные в формуле (I), R9, R10 и R11 имеют значения, указанные в формулах (IV)-(VII), и его ионизированным формам. В родственном варианте осуществления изобретения Х4 означает Cl, Br, метансульфонилокси, бензолсульфонилокси или паратолуолсульфонилокси.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к новому пролекарству фосфорамидатного алкилатора, которое в результате биовосстановления высвобождает соответствующие новые или известные фосфорамидатные алкилаторы

и его ионизированным формам;

где N(R10)2 выбирают из группы, включающей NH2, NHMe, NMe2, NEt2,

NHOMe и NHOH; каждый R11 независимо означает водород, Ме, этил, циклопропил, изопропил, пропил, бензил, замещенный метил, циклопропил, метокси и гидроксил; или два элемента R11 вместе образуют гетероцикл.

При лечении рака противораковое средство циклофосфамид метаболизируется в 1d (R10 означает водород) и ифосфамид метаболизируется в 1е (каждый R11 означает водород). Глюфосфамид, который проходит клинические испытания на возможность применения для лечения рака, высвобождает алкилатор формулы 1е (каждый R11 означает водород, см. Wiessler et al., патент США № 5622936; заявку на патент РСТ № US05/03370, озаглавленную “Anti Cancer Therapies”, заявку на патент США № 60/638995, озаглавленную “Glufosfamide Combination Therapy” и декларацию поверенного № 021305-005900US, поданную 11 мая 2005 г. под заголовком “Glufosfamide Combination Therapy”). Лекарственное средство телцита (Telcyta™), которое проходит клинические испытания на возможность применения для лечения рака, высвобождает 1f (Rosen et al., Clin. Cancer Res. 2004, 10(11):3689-98).

Известные пролекарства фосфорамидатных алкилаторов, такие как ифосфамид и циклофосфамид, метаболизируются с образованием цитотоксических побочных продуктов, таких как акролеин и хлорацетальдегид, которые вызывают нежелательные побочные эффекты у субъекта, такие как геморраргический цистит, кома или смерть. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора, которое в результате метаболизма образует менее токсичные побочные продукты по сравнению с побочными продуктами, образующимися в результате метаболизма ифосфамида и/или циклофосфамида. В одном варианте осуществления изобретения пролекарства фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению не продуцируют акролеин в результате метаболизма in vivo. Примеры токсических побочных продуктов, образующихся в результате метаболизма пролекарств по настоящему изобретению, включают хлор, бром, алкилсульфонилокси, гетероалкилсульфонилокси, арилсульфонилокси или гетероарилсульфонилоксиацетальдегид (для ознакомления с образованием хлорацетальдегида из ифосфамида в результате метаболизма см. приведенную выше публикацию Hardman et al., page 1396). Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора, которое в результате окислительного метаболизма образует 5-95% хлорацетальдегида или вышеуказанного эквивалента от количества, продуцируемого в результате метаболизма ифосфамида.

Производное фосфорамидатного алкилатора, образующееся в результате восстановления Z3, может отличаться от защищенного фосфорамидатного алкилатора и пролекарства фосфорамидатного алкилатора и именуется модифицированным пролекарством фосфорамидатного алкилатора. Например, из пролекарства фосфорамидатного алкилатора может быть получено модифицированное пролекарство фосфорамидатного алкилатора Alk-Триггермод в результате восстановления биовосстановительной группы (Z3). Когда в результате восстановления биовосстановительной группы образуется модифицированное пролекарство фосфорамидатного алкилатора, линкер (L), связанный с фосфорамидатным алкилатором, может разрушаться с образованием фосфорамидатного алкилатора или какого-либо другого модифицированного пролекарства фосфорамидатного алкилатора.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к соединению, которое демонстрирует эффект присутствия при активации в гипоксической ткани благодаря введению линкера (L) в соответствии с приведенным выше описанием. В одном варианте осуществления изобретения эффект присутствия позволяет модифицированному фосфорамидатному алкилатору по настоящему изобретению диффундировать или проникать в зоны опухоли, которые не являются достаточно гипоксическими для активации пролекарств по настоящему изобретению и расположены рядом с гипоксической зоной опухоли, которая может активировать указанные пролекарства.

В результате восстановления биовосстановительная группа (Z3) в триггере Т превращается в Z3-mod с образованием модифицированного пролекарства фосфорамидатного алкилатора, такого как конъюгат фосфорамидатного алкилатора-ТМ или Alk-TМ. В одном варианте осуществления изобретения ТМ выбирают из:

где Z3-mod является биовосстановленным или каким-либо другим образом восстановленным или модифицированным элементом Z3.

В другом варианте осуществления изобретения ТМ выбирают из:

[X(Z1)2-Y3]-(C(=O)-O)-[C(Z1)2-Z2-Y4]H, [C(Z1)2-Y3]-[C(Z1)2-Z2-Y4]-H и [C(Z1)2-Y3]-H.

В одном варианте осуществления изобретения триггер Т включает следующие линкеры (L), имеющие формулы:

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к триггеру Т, который в результате биовосстановления превращается в триггермод или ТМ, при этом фосфорамидатный алкилатор отделяется от ТМ в течение менее 0,1 секунды. В другом варианте осуществления изобретения фосфорамидатный алкилатор отделяется от ТМ в течение 0,01-0,10 секунды. В другом варианте осуществления изобретения фосфорамидатный алкилатор отделяется от ТМ в течение 0,1-1,0 секунды. В другом варианте осуществления изобретения активный фосфорамидатный алкилатор отделяется от ТМ в течение 1,0-10,0 секунд. В другом варианте осуществления изобретения фосфорамидатный алкилатор отделяется от ТМ в течение 10,0-100,0 секунд.

В родственном варианте осуществления изобретения в результате активации или восстановления пролекарства фосфорамидатного алкилатора образуется пролекарство с модифицированным триггером Т (ТМ), которое затем высвобождает 20-500 мкМ фосфорамидатного алкилатора в месте активации или восстановления; или 20-100 мкМ в месте активации или восстановления. Эффект присутствия пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению можно измерить при помощи анализа клеточных сфероидов и многослойного клеточного анализа (пример таких анализов приведен в публикациях Kyle et al., Cancer Res. 2004, 64(17):6304-9 и West et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 1987, 20(2):109-14), которые более подробно описаны в примерах 35 и 37. Опухолевые клетки могут быть выращены в культуре в виде многоклеточных сфероидов для создания модели in vitro опухолевой микросреды в солидных опухолях, содержащих гипоксическую область и находящуюся в покое популяцию клеток, зависящую от внешних воздействий, вызываемых недостатком питательных веществ и повышенным образованием продуктов выделения. Указанные сфероиды обладают уникальным свойством создания градиентов кислорода и питательных веществ по мере того, как совокупность клеток продолжает делиться и разрастаться. Когда жизнеспособный край сфероида достигает размера, равного примерно 150 мкм, возникает гипоксическая область, в которой клетки переходят в состояние покоя и в конце концов погибают. В результате гибели клеток образуется некротическое ядро. Сфероид можно разделить на четыре отдельных компартмента для моделирования эффективности пролекарства, активируемого в условиях гипоксии; 1) наружная аэробная и активно делящаяся область; 2) область промежуточной гипоксии; 3) область гипоксии, в которой отсутствует циклическое развитие клеток; 4) некротическое ядро, содержащее мертвые клетки и клеточный дебрис. Реакция лекарственного средства будет зависеть от ряда факторов: способности соединения проникать в самые глубокие области сфероида. Активации нитроредуктазами пролекарства, активируемого в условиях гипоксии (НАР); реактивности активированного лекарственного средства в клетке, в которой оно было активировано; и способности активированного средства покидать место, где оно было активировано, и убивать находящиеся рядом клетки (эффект присутствия). Поэтому оценка эффективности соединения может быть произведена на разных уровнях. Действие отдельно используемого соединения можно сравнить в клетках монослойной культуры и интактных сфероидов. НАР можно использовать в качестве монотерапии. Гипоксическую фракцию сфероида можно модулировать, изменяя концентрацию О2 в уравновешивающем газе и, таким образом, изменять соотношение аэробных и гипоксических компартментов. НАР можно объединить с другими химиотерапевтическими средствами, которые направленно воздействуют только на наружные аэробные клетки или способны направленно воздействовать на весь сфероид. Предполагаемое уничтожение клеток можно прогнозировать, имея представление о гипоксической фракции и ожидаемом уничтожении клеток каждой монотерапией.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора, которое в результате активации, такой как биовосстановление, высвобождает фосфорамидатный алкилатор с периодом полураспада менее 0,1 секунды, от 0,01 до 0,10 секунды, от 0,1 до 1,0 секунды, от 1,0 до 10,0 секунд и от 10,0 до 100,0 секунд.

Противораковые средства могут связываться с тканью, окружающей сосудистую сеть, и/или могут иметь высокую молекулярную массу, препятствующую диффузии, и могут не достигать в терапевтически эффективных концентрациях гипоксических зон опухоли, которые могут находиться на расстоянии 150-200 мкМ от сосудистой сети. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, которые способны достигать гипоксические раковые клетки, удаленные от сосудистой сети. Некоторые методы определения эффекта присутствия более подробно описаны в примерах 35 и 37. Фосфорамидатный алкилатор, используемый в пролекарстве, активируемом в условиях гипоксии, имеет важное значение для эффективного уничтожения опухолевых клеток. Например, на гипоксическую избирательность и гипоксическую цитотоксичность пролекарства фосфорамидатного алкилатора, активируемого в условиях гипоксии, влияют цитотоксичность фосфорамидатного алкилатора и его скорость алкилирования клеток, а также способность пролекарства и фосфорамидатного алкилатора проникать через клеточную мембрану.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, которые являются более безопасными, чем соответствующие фосфорамидатные алкилаторы, образованные in vivo (по крайней мере от десяти до одного миллиона раз). В одном варианте осуществления изобретения повышенная безопасность является следствием модификации места присоединения триггера Т (активация пролекарства фосфорамидатного алкилатора вызывает высвобождение алкилатора/цитотоксического агента). В любом случае пролекарства фосфорамидатных алкилаторов превращаются в соответствующий алкилатор в гипоксических тканях путем активации или восстановления биовосстановительной группы (Z3), в результате происходят удаление данной группы и одновременное или последующее высвобождение или образование фосфорамидатного алкилатора.

В одном варианте осуществления изобретения триггер Т ковалентно связан с фосфорамидатным алкилатором таким образом, что он маскирует или уменьшает цитотоксическую активность фосфорамидатного алкилатора. Маскирующее действие может изменяться и может зависеть от цитотоксической активности фосфорамидатного алкилатора. Цитотоксическая активность пролекарства фосфорамидатного алкилатора обычно по крайней мере в 10 раз меньше, чем у соответствующего фосфорамидатного алкилатора, и может быть примерно в миллион раз меньше. В одном варианте осуществления изобретения цитотоксическая активность пролекарства фосфорамидатного алкилатора примерно в 100-10000 меньше цитотоксической активности соответствующего фосфорамидатного алкилатора. В качестве примера можно привести фосфорамидатный алкилатор со значениями IC50, IC90 или LC50, равными 1 нМ, при этом у соответствующего пролекарства фосфорамидатного алкилатора значения IC50, IC90 или LC50 могут быть равны 1 мкМ или больше.

Один вариант осуществления изобретения относится к соединениям, представляющим собой пролекарство фосфорамидатного алкилатора, содержащее любой фосфорамидатный алкилатор, который в результате связывания с триггером Т образует пролекарство фосфорамидатного алкилатора, являющееся по крайней мере примерно в 10-1000000 раз и обычно примерно в 100-10000 раз менее активным в качестве цитотоксического агента, чем соответствующий фосфорамидатный алкилатор или модифицированный фосфорамидатный алкилатор, высвобождаемый из указанных соединений в условиях гипоксии.

Чтобы определить, является ли пролекарство фосфорамидатного алкилатора избирательно активным в условиях аноксии или гипоксии, клетки подвергают воздействию лекарственного средства в присутствии воздуха (отсутствие гипоксии), без кислорода (аноксия) или в присутствии очень низкого содержания кислорода (гипоксия). Специалисту в данной области должно быть известно, что цитотоксичность пролекарства фосфорамидатного алкилатора, измеренную при помощи анализа антипролиферативной активности, выражают в виде IC50; и цитотоксичность пролекарства фосфорамидатного алкилатора, измеренную в эксперименте по клоногенному выживанию, выражают в виде IC10 или LC10, IC90 или LC90, IC99 или LC99. Отношение цитотоксичности, измеренной, например, в виде IC50, IC90, LC50, LC90 или LC99 в условиях отсутствия гипоксии и в условиях гипоксии, именуется отношением гипоксической цитотоксичности (HCR) и может служить мерой избирательной цитотоксичности пролекарств по настоящему изобретению в условиях гипоксии. Чем выше значение HCR пролекарства фосфорамидатного алкилатора, тем больше избирательная цитотоксичность в отношении гипоксической клетки и выше способность пролекарства уничтожать гипоксическую опухоль по сравнению со здоровыми негипоксическими клетками. Значение HCR, определенное на основании IC99 или LC99, больше значения, определенного на основании IC90 или LC90.

В родственном варианте осуществления изобретения гипоксическая цитотоксичность пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению находится в пределах от 0,1 нМ до 50 мкМ и значение HCR равно 10-100000. В родственном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению характеризуется гипоксической цитотоксичностью от 0,1 нМ до 50 мкМ и значением HCR, равным 25-100000 (см. раздел “Примеры”). В другом родственном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению имеет значение гипоксической цитотоксичности от 0,1 нМ до 5 мкМ и значение HCR, равное 50-10000, как, например, соединения, описанные в примерах 29, 30 и 31.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора, у которого гипоксическая токсичность в 5-1000000 раз больше соответствующей негипоксической токсичности. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора, у которого гипоксическая токсичность в 10-10000 больше соответствующей негипоксической токсичности. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора, у которого гипоксическая токсичность в 25-5000 раз больше соответствующей негипоксической токсичности.

Опухоли характеризуются градиентом концентрации кислорода, который может изменяться от 10% в тканях, прилегающих к сосудистой сети, до 0,5% в тканях, удаленных от сосудистой сети примерно на 150 мкМ, или меньше в тканях, расположенных еще дальше от сосудистой сети или около некротического ядра. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, способным образовывать фосфорамидатные алкилаторы, которые являются в 5-100000, 10-1000 и 25-5000 раз более токсичными, чем соответствующее пролекарство при разных концентрациях кислорода. В одном варианте осуществления настоящего изобретения пролекарства фосфорамидатных алкилаторов образуют фосфорамидатные алкилаторы, которые являются в 5-100000, 10-1000 и 25-5000 раз более токсичными, чем соответствующее пролекарство при концентрациях кислорода около 0,5-0,6%.

Значение logP пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению может быть мерой липофильности или гидрофильности пролекарства. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора со значением logP менее 0. Такие пролекарства фосфорамидатных алкилаторов могут быть гидрофильными, как, например, пролекарство формулы XV, в которой каждый R11 означает Н, и могут быть использованы для получения водных препаратов для внутривенных или внутрибрюшинных инъекций. Другим примером таких пролекарств являются соединения 24, 25 и 36.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора со значением logP выше 0. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора со значением logP от 0 до 4, такому как соединения формул XIV, XX и XV, где каждый R11 означает метил или циклопропил, которое при введении субъекту может проходить через клеточную мембрану и проникать внутрь раковых клеток. В качестве другого примера можно привести пролекарство со значением logP, равным 5, 6, 7 или 16 (измерение значения logP пролекарств фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению описано в разделе “Примеры”).

IIb. Способ синтеза

В основе настоящего изобретения частично лежит открытие того, что соединение 36, которое не может быть выделено в результате взаимодействия

1-N-метил-2-нитроимидазол-5-метанола и н-бутиллития в приемлемом растворителе, может быть легко синтезировано при помощи реакции Мицунобу, при выполнении которой 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-метанол активируют, добавляя трифенилфосфин и диизопропилазодикарбоксилат, и подвергают взаимодействию с

с образованием соединения 36.

Таким образом, одним объектом настоящего изобретения является способ синтеза фосфорамидатного соединения, который включает осуществление взаимодействия фосфорамидной или фосфордиамидной кислоты со спиртом с образованием фосфорамидата. Другим объектом настоящего изобретения являются способы синтеза новых соединений пролекарств фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению и ранее известных соединений. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза пролекарства фосфорамидатного алкилатора, который включает осуществление взаимодействия нового или известного фосфорамидатного алкилатора, триггера-ОН, трехзамещенного фосфина и диалкилазодикарбоксилата с образованием нового или известного пролекарства фосфорамидатного алкилатора. В одном варианте осуществления указанного способа на первой стадии триггер-ОН подвергают взаимодействию с трехзамещенным фосфином и диалкилазодикарбоксилатом с образованием промежуточного продукта и на второй стадии к промежуточному продукту, полученному на первой стадии, добавляют фосфорамидатный алкилатор с образованием требуемого продукта. Такая реакция Мицунобу особенно пригодна для синтеза новых или известных пролекарств фосфорамидатных алкилаторов или их производных, Alk-триггер, в которых триггер является L-Z3, где Z3 означает:

Alk означает

где R9 имеет указанные выше значения.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза пролекарства фосфорамидатного алкилатора, который включает осуществление взаимодействия новых или известных фосфорамидатных алкилаторов:

с триггером-ОН, трехзамещенным фосфином и диалкилазодикарбоксилатом с образованием соответственно

где Х4, R5, R7 и R8 имеют значения, указанные в формуле (I).

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза соединения формулы:

который включает осуществление взаимодействия (а) нового или известного фосфорамидатного алкилатора формулы:

где R2-R5 имеют значения, указанные в формуле (I), при условии, что:

(i) по крайней мере два элемента из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 2-алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил;

(ii) по крайней мере один элемент из R1-R5 выбирают из группы, включающей 2-галогеналкил, 1-С1-С6 алкилсульфонилоксиалкил, 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил, 2-арилсульфонилоксиалкил и 2-гетероалкилсульфонилоксиалкил; и по крайней мере один элемент из NR2R3 и NR4R5 означает

или

(iii) NR2R3 и NR4R5 вместе означают;

(b) триггера-ОН, где триггер имеет значения, указанные в формуле (I), трехзамещенного фосфина и (с) диалкилазодикарбоксилата с образованием соединения формулы:

В одном варианте осуществления изобретения соединение формулы

выбирают из группы, включающей:

В другом варианте осуществления изобретения группу формулы

выбирают из группы, включающей:

В другом варианте осуществления изобретения при осуществлении вышеуказанной реакции используют растворитель, такой как ТГФ, диоксан, С1-С6 алкилацетат, хлороформ, дихлорметан, ацетонитрил и тому подобный. В другом варианте осуществления изобретения каждый заместитель в трехзамещенном фосфине независимо выбирают из группы, включающей С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил и С1-С6 алкокси. В другом варианте осуществления изобретения триггер Т означает:

где Х1, Х2, Z1 и Z2 имеют значения, указанные в формуле (I).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза пролекарства фосфорамидатного алкилатора, который включает:

(i) осуществление взаимодействия в растворителе, выбираемом из группы, включающей ТГФ, диоксан, дихлорметан, хлороформ, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат или ацетонитрил, соединения формулы:

где каждый R11 независимо означает водород, циклопропил, метил, этил, бензил или метокси; каждый R9 независимо означает водород, метил, этил, пропил или циклопропил; и Х4 означает галоген, метилсульфонилокси, фенилсульфонилокси, 4-метилфенилсульфонилокси и 4-галогенфенилсульфонилокси;

(ii) трехзамещенного фосфина, выбираемого из группы, включающей трифенилфосфин, трибутилфосфин и трибутилфосфит; и

(iii) диэтил- или диизопропилазодикарбоксилата

с образованием продукта формулы:

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза соединения формулы:

который включает стадии:

(i) осуществление взаимодействия в апротонном растворителе триггера-ОН, где триггер имеет значения, указанные в формуле (I), трехзамещенного фосфина и диалкилазодикарбоксилата с образованием промежуточного продукта (i);

(ii) осуществление взаимодействия промежуточного продукта (i), полученного на стадии (i), с соединением формулы

где каждый R9, R11 и Х4 имеет значения, указанные в формуле (I), с образованием соединения формулы:

В другом варианте осуществления изобретения трехзамещенный фосфин является Р(R12)3, где каждый R12 означает Н, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, арил или гетероарил. В другом варианте осуществления изобретения трехзамещенный фосфин является трехзамещенным фосфином на полимерном носителе. В другом варианте осуществления изобретения трехзамещенный фосфин является трифенилфосфином, трибутилфосфином, трипропилфосфином, триэтилфосфином или триметилфосфином. В другом варианте осуществления изобретения трехзамещенный фосфин является трифенилфосфином на полимерном носителе. Трехзамещенные фосфины на полимерных носителях можно приобрести коммерческим путем, например, в компании Varian Inc., Palo Alto, California. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза соединений, в которых каждый R11 означает водород. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза соединений

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения соединения, в котором триггер выбирают из группы, включающей:

и Z3 означает

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза пролекарства фосфорамидатного алкилатора, который включает стадии:

(а) нагревание с обратным холодильником POCl3 с солью N-2-галогенэтил-N-(R13)аммония, где R13 означает водород, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, с образованием промежуточного продукта дихлорфосфорамидата;

(b) осуществление взаимодействия промежуточного продукта дихлорфосфорамидата, полученного на стадии (а), с солью N-2-галогенэтил-N-(R13)аммония, где R13 означает водород, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, и основанием в растворителе с образованием промежуточного продукта монохлорфосфорамидата; и

(с) осуществление взаимодействия промежуточного продукта монохлорфосфорамидата, полученного на стадии (b) с триггером-ОН и основанием в растворителе с образованием пролекарства фосфорамидатного алкилатора.

В одном варианте осуществления изобретения промежуточный продукт дихлорфосфорамидата, полученный на стадии (а), сначала отделяют от остальной реакционной смеси и затем подвергают взаимодействию на стадии (b). В другом варианте осуществления изобретения в процессе разделения сначала удаляют избыток POCl3 в вакууме и затем отгоняют дихлорфосфорамидат при пониженном давлении.

В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора, полученное на стадии (с), отделяют от остальной реакционной смеси при помощи флэш-хроматографии на колонке с силикагелем. В одном варианте осуществления изобретения основание, используемое на стадии (b), является третичным амином. Приемлемые третичные амины, используемые на стадии (b), включают триалкиламины, такие как триэтиламин или диизопропилэтиламин. В одном варианте осуществления изобретения растворитель, используемый на стадии (b), является тетрагидрофураном (ТГФ) или диоксаном.

В одном варианте осуществления изобретения промежуточный продукт монохлорфосфорамидата, полученный на стадии (b), отделяют от остальной реакционной смеси при помощи флэш-хроматографии на колонке с силикагелем и затем подвергают взаимодействию на стадии (с). В одном варианте осуществления изобретения основание, используемое на стадии (с), является гексаалкилдисилазидом лития, натрия или калия; гидридом натрия или калия либо диизопропиламидом лития. В одном варианте осуществления изобретения растворитель, используемый на стадии (с), является диметоксиэтаном, диглимом, простым диэтиловым эфиром или ТГФ.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза пролекарства фосфорамидатного алкилатора, который включает стадии:

(а) осуществление взаимодействия в растворителе около 1 эквивалента POCl3, триггера-ОН и основания с образованием промежуточного продукта дихлорфосфата; и

(b) осуществление взаимодействия промежуточного продукта дихлорфосфата, полученного на стадии (а), с солью N-2-галогенэтил-N-(R13)аммония, где R13 означает водород, С1-С6 алкил, С1-С6 гетероалкил, С3-С8 циклоалкил, гетероциклил, арил, гетероарил, и основанием в растворителе с образованием пролекарства фосфорамидатного алкилатора.

В одном варианте осуществления изобретения стадии (а) и (b) выполняют при температуре ниже 0°С. В другом варианте осуществления изобретения стадию (b) выполняют при температуре, которая на 20-100°С выше температуры на стадии (а).

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза пролекарств гетероциклических фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению в соответствии с приведенной ниже схемой реакций:

где Х4 = Br или Cl; е=1-3.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу синтеза пролекарства фосфорамидатного алкилатора, который включает стадии:

(а) осуществление взаимодействия PCl3 с солью N,N-ди(2-галогенэтил)аммония и основанием в растворителе с образованием производного монохлорфосфамида;

(b) осуществление взаимодействия производного монохлорфосфамида с триггером-ОН с образованием промежуточного продукта; и

(с) окисление промежуточного продукта, полученного на стадии (b), с образованием пролекарства фосфорамидатного алкилатора.

В одном варианте осуществления изобретения основание, используемое на стадии (b), является триэтиламином. В другом варианте осуществления изобретения растворитель, используемый на стадии (с), является диметоксиэтаном, диглимом или С1-С6 алкилацетатом. В другом варианте осуществления изобретения триггер-ОН, используемый на стадии (с), является

Могут быть синтезированы разные 1-N-алкил-2-аминоимидазол-5-карбоксилаты, как показано на приведенной ниже схеме реакций:

1-N-Алкил-2-аминоимидазол-5-карбоксилаты могут быть восстановлены с образованием разных производных 1-N-алкил-2-амино-5-гидроксиметилимидазола, используемых в настоящем изобретении в качестве биовосстановительной группы Z3.

Способы синтеза далее более подробно описаны в приведенном ниже разделе “Примеры”.

Способы синтеза биовосстановительных групп и пролекарств фосфорамидатных алкилаторов, а также способы по настоящему изобретению, могут быть разработаны на основании описания, приведенного в публикации заявки на патент РСТ № WO 04/009667, Matteucci et al., и заявки на патент США, озаглавленной “Hypoxia Activated anti-Cancer Agents”; deGroot et al., 2001, Current Med. Chem. 8: 1093-1122; в патентах США №№ 5750782, 5780585, 5872129 и 6251933, Denny et al.; публикациях заявок на патент РСТ №№ WO 04/85421 и WO 04/85361, Davis et al.; публикациях заявок на патент США №№ 2004/254103 и 2005/043244, Lin et al., и в публикации Borch et al. (см. выше).

Примеры способов синтеза пролекарств фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению более подробно описаны в приведенном ниже разделе “Примеры”.

IIIа. Способы лечения

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака у субъекта, нуждающегося в таком лечении, который включает введение указанному субъекту пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению или известного пролекарства фосфорамидатного алкилатора. Известные фосфорамидатные алкилаторы описаны в приведенной выше публикации Borch et al. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора, используемое при лечении рака способами по настоящему изобретению, имеет формулу, выбираемую из (I)-(XXVII). В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора, используемое при лечении рака способами по настоящему изобретению, выбирают из соединений, рассмотренных в разделе “Примеры”.

Лечение рака алкилирующими агентами может вызвать устойчивость раковых клеток к таким алкилирующим агентам. Алкилирующие агенты могут эффективнее убивать раковые клетки в области с быстро делящимися клетками или с более высоким содержанием кислорода по сравнению с раковыми клетками в гипоксической области рака, в которой клетки растут медленнее. Указанные последними клетки выживают при лечении алкилаторами и могут продуцировать клетки, устойчивые к таким алкилаторам. Теоретически обосновано, что устойчивость рака к алкилаторам опосредована повышенной активностью гуанин-О6-алкилтрансферазы, глутатиона, глутатионтрансфераз, пути эксцизионной репарации нуклеотидов и/или белков репарации ошибочного спаривания и пониженной проникающей способностью активно переносимых лекарственных средств, таких как мехлорэтамин и мелфалан (см., например, приведенную выше публикацию Hardman et al., pages 1393 and 1433).

Пролекарства по настоящему изобретению позволяют эффективно лечить разные типы рака, устойчивые к других методам лечения. Медленно делящиеся раковые клетки в гипоксической зоне рака, которые являются источником устойчивых раковых клеток и штаммов, уничтожаются пролекарствами по настоящему изобретению. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака, устойчивого к лечению одним или несколькими алкилаторами, который включает введение соединений по настоящему изобретению, используемых отдельно или в сочетании с другим противораковым средством. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению вводят в комбинации с лекарственным средством, которое по существу не обладает нефротоксичностью. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят вместе с карбоплатином.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, которые не обладают перекрестной устойчивостью с известными алкилаторами. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, которые не обладают перекрестной устойчивостью с такими алкилаторами как циклофосфамид, ифосфамид, глюфосфамид, мехлорэтамин, мелфалан, хлорамбуцил, дакарбазин, темозоломид, кармустин, стрептозоцин, бендамустин, бусульфан, тиотепа, цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака, который включает введение в качестве терапии первой линии соединений по настоящему изобретению отдельно или в комбинации с другими противораковыми средствами. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения метастазирующего рака, который включает введение в качестве терапии первой линии соединений по настоящему изобретению отдельно или в комбинации с другими противораковыми средствами. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака, который включает введение в качестве терапии второй линии соединений по настоящему изобретению отдельно или в комбинации с другими противораковыми средствами. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака, который включает введение в качестве терапии третьей линии соединений по настоящему изобретению отдельно или в комбинации с другими противораковыми средствами. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака, который включает введение после предшествующего хирургического лечения и/или лучевой терапии соединений по настоящему изобретению отдельно или в комбинации с другими противораковыми средствами. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рецидива рака, возникшего после предшествующей химиотерапии, хирургического лечения, лучевой терапии или любой комбинации указанных методов, который включает введение соединений по настоящему изобретению отдельно или в комбинации с другими противораковыми средствами.

При осуществлении способов лечения рака по настоящему изобретению субъекту вводят эффективное количество пролекарств фосфорамидатных алкилаторов. Как правило, субъектом может быть любой человек или млекопитающее, отличное от человека. Предпочтительным субъектом является человек. Другие конкретные субъекты включают, не ограничиваясь ими, приматов кроме человека, собак, кошек, сельскохозяйственных животных и лошадей. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят отдельно. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят в комбинации с одним или несколькими дополнительными противораковыми средствами. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят в сочетании с терапевтическим лечением рака, которое включает, не ограничиваясь ими, хирургическое лечение и лучевую терапию. Пролекарство фосфорамидатного алкилатора обычно вводят в фармацевтической композиции. Разные фармацевтические композиции, которые могут быть использованы, описаны в приведенном ниже разделе “Препараты”.

Пролекарство фосфорамидатного алкилатора и содержащие его фармацевтические композиции могут быть использованы для лечения любого типа рака у субъекта, в частности у человека. Разные типы рака, которые могут быть подвергнуты лечению, включают, не ограничиваясь ими, лейкоз, рак молочной железы, рак кожи, рак кости, рак печени, рак головного мозга, рак гортани, желчного пузыря, поджелудочной железы, прямой кишки, паращитовидной железы, щитовидной железы, надпочечников, нервной ткани, головы и шеи, желудка, бронхов, почек, базально-клеточный рак, плоскоклеточный рак язвенного и папиллярного типа, метастазирующий рак кожи, остеосаркому, саркому Юинга, ретикулоклеточную саркому, миелому, гигантоклеточную опухоль, мелкоклеточную опухоль легкого, желчные конкременты, инсулому, первичную опухоль головного мозга, острую и хроническую лимфоцитому и гранулоцитому, волосковоклеточную опухоль, аденому, гиперплазию, медуллярный рак, феохромоцитому, неврому слизистой оболочки, ганглионеврому кишечника, гиперпластическую опухоль роговичного нерва, опухоль Марфана, опухоль Вильмса, семиному, лейомиосаркому, дисплазию шейки матки и карциному in situ, нейробластому, ретинобластому, саркому мягких тканей, злокачественный карциноид, местное поражение кожи, грибовидный микоз, рабдомиосаркому, саркому Капоши, остеогенную и другие саркомы, злокачественную гиперкальциемию, рак почки, полицитермию, аденокарциному, мультиформную глиому, лейкоз, лимфомы, злокачественные меланомы и эпидермоидный рак.

Пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению может быть особенно пригодно для лечения рака, содержащего значительные участки гипоксической ткани. Такие типы рака включают, не ограничиваясь ими, рак легкого, в частности немелкоклеточный рак легкого, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак головы и шеи, рак яичника, рак поджелудочной железы и рак предстательной железы. Примеры разных типов рака, которые могут быть подвергнуты лечению пролекарствами фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению, приведены в нижеследующих публикациях, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки: Tidmarsh et al., заявка на патент РСТ № РСТ/US2005/047314, поданная 22 декабря 2005 г., и заявка на патент РСТ, озаглавленная “Glufosfamide combination therapy”, декларация поверенного № 021305-005900PC и заявки на патенты США №№ 60/760599 и 60/719787, публикация патента РСТ № WO 2005/076888. Несколько указанных типов рака рассмотрены ниже в иллюстративных целях. Специалистам в данной области должно быть понятно, что химиотерапия рака часто включает одновременное или последовательное введение разных противораковых средств, и, как указано ниже, пролекарство фосфорамидатного алкилатора может быть использовано в комбинированной терапии в соответствии со способами, рассмотренными в настоящем описании изобретения. Поэтому при описании иллюстративных типов рака, содержащих гипоксические области, которые подлежат лечению пролекарством фосфорамидатного алкилатора, приведены также примеры комбинированной терапии.

В США раком легкого страдают более 100000 мужчин и 50000 женщин, большинство из которых умирает в течение 1 года после установления диагноза, что делает данное заболевание основной причиной смерти от рака. Применяемые в настоящее время схемы лечения рака легкого включают химиотерапию в сочетании с лучевой терапией или хирургическим лечением или без указанных методов лечения. Пролекарство фосфорамидатного алкилатора может быть использовано в качестве единственного средства или в комбинации с существующими методами комбинированной терапии. Для лечения мелкоклеточного рака легкого были предложены разные схемы комбинированной химиотерапии, которые включают совместное применение циклофосфамида, доксорубицина и винкристина (CAV); этопозида и цисплатина (VP-16); циклофосфамида, доксорубицина и VP-16 (CAVP-16). В научной литературе были представлены данные о достаточно скромных результатах выживания при применении комбинированной химиотерапии (этопозид плюс цисплатин) для лечения немелкоклеточного рака легкого.

Аналогичным образом несколько разных цитотоксических средств вызывали по крайней мере временную регрессию рака яичника. Наиболее активными лекарственными средствами при лечении рака яичника являются алкилирующие агенты, включающие циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, тиотепа, цисплатин и карбоплатин. Применяемая в настоящее время комбинированная терапия для лечения рака яичника включает использование цисплатина или карбоплатина в комбинации с циклофосфамидом с интервалами в 3-4 недели на протяжении шести-восьми циклов. Соединения и способы их применения, рассмотренные в настоящем описании изобретения, включают пролекарства и способы лечения рака яичника, при осуществлении которых пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению используют в качестве отдельного средства или в комбинированной терапии с целью замены какого-либо лекарственного средства или дополнительно к применяемым в настоящее время лекарственным средствам.

Рак предстательной железы является наиболее распространенным злокачественным заболеванием мужчин в США и второй причиной смерти от рака среди мужчин в возрасте старше 55 лет, причем известно, что указанный рак состоит главным образом из гипоксической ткани. В научной литературе описано несколько химиотерапевтических методов, применяемых на последней стадии заболевания при возникновении рецидива после гормональной терапии. Лекарственные средства, применяемые для лечения рака предстательной железы, включают такие алкилаторы, как фосфат эстрамустина, преднимустин и цисплатин. Для лечения рака предстательной железы применяется также комбинированная химиотерапия, которая включает лечение фосфатом эстрамустина, преднимустином и цисплатином, а также 5-фторурацилом, мелфаланом и гидроксимочевиной. Настоящее изобретение относится к способам лечения рака предстательной железы, при осуществлении которых пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению используют в таких комбинациях для замены одного лекарственного средства или дополнительно к используемым в настоящее время лекарственным средствам.

Рак толстой кишки является второй наиболее распространенной причиной смерти от рака в США и также характеризуется наличием гипоксических областей. Несмотря на то, что химиотерапия запущенного рака прямой и ободочной кишки позволяет получить лишь незначительный благоприятный результат, наиболее эффективным лечением данного заболевания является применение 5-фторурацила. 5-Фторурацил может быть использован отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами, но лишь в 15-20% случаев наблюдается уменьшение измеряемой опухолевой массы на 50% или больше. Применение 5-FU в комбинации с соединениями и способами по настоящему изобретению может оказать значительный благоприятный терапевтический эффект и удовлетворить потребность в более эффективных методах лечения рака ободочной кишки, отсутствующих в настоящее время.

В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора может быть использовано в разных известных методах лечения рака, которые включают, не ограничиваясь ими, “антителонаправленную терапию пролекарствами ферментов” (ADEPT), “вирусонаправленную терапию пролекарствами ферментов” (VDEPT), “генонаправленную терапию пролекарствами ферментов” (GDEPT) и “бактериальнонаправленную терапию пролекарствами на основе ферментов” (BDEPT). Общее применение пролекарства фосфорамидатного алкилатора не ограничено вышеуказанными методами лечения.

Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения нераковых гиперпролиферативных заболеваний, характеризующихся гиперпролиферацией клеток (например, аномально быстрым ростом и величиной пролиферации клеток). В одном варианте осуществления изобретения гиперпролиферативное заболевание, подлежащее лечению способом по настоящему изобретению, выбирают из группы, включающей аллергический ринит и грануломатоз (болезнь Хурга-Страуса), асбестоз, астму, атрофический гастрит, доброкачественную гиперплазию предстательной железы, буллезный пемфигоид, заболевание брюшной полости, хронический бронхит и хроническое обструктивное заболевание дыхательных путей, хронический синусит, болезнь Крона, демиелинизирующую невропатию, дерматомиозит, экзему, в том числе атопический дерматит, заболевания евстахиевой трубы, гигантоклеточный артериит, отторжение трансплантата, аллергический пневмонит, аллергический васкулит (пурпура Шенлейна-Геноха), вызывающий раздражение дерматит, воспалительную гемолитическую анемию, воспалительную нейтропению, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Кавасаки, рассеянный склероз, миокардит, миозит, полипы в носу, заболевания носослезного канала, неопластический васкулит, панкреатит, обыкновенную пузырчатку, первичный гломерулонефрит, псориаз, периодонтит, поликистоз почек, нодозный полиартериит, ангиопатию, первичный склерозирующий холангит, ревматоидный артрит, сывороточную болезнь, спайки, подлежащие хирургическому лечению, стеноз или рестеноз, склерит, склеродермию, стриктуру желчных протоков, стриктуры (двенадцатиперстной кишки, тонкой кишки и ободочной кишки), силикоз и другие формы пневмокониоза, диабет типа I, неспецифический язвенный колит, язвенный проктит, васкулит, обусловленный заболеваниями соединительной ткани, васкулит, обусловленный врожденной недостаточностью комплементзависимой системы, васкулит центральной нервной системы и грануломатоз Вегенера.

В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение по настоящему изобретению вводят для лечения гиперпролиферативного заболевания, выбираемого из группы, включающей псориаз, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, рестеноз и доброкачественную гиперплазию предстательной железы. В одном варианте осуществления изобретения подлежащим лечению гиперпролиферативным заболеванием является псориаз, заболевание, характеризующееся гиперпролиферацией кератиноцитов, которые нарастают на коже с образованием приподнятых чешуйчатых поражений. В другом варианте осуществления изобретения подлежащим лечению гиперпролиферативным заболеванием является рассеянный склероз, заболевание, характеризующееся прогрессирующей демиелинизацией головного мозга. В другом варианте осуществления изобретения подлежащим лечению гиперпролиферативным заболеванием является ревматоидный артрит, многосистемное хроническое, рецидивирующее воспалительное заболевание, которое может вызывать разрушение и анкилоз пораженных суставов. В другом варианте осуществления изобретения соединения по настоящему изобретению используют для профилактики гиперпролиферативного заболевания, возникающего у субъекта вследствие пролиферации клеток на имплантированном протезе, для чего на указанный протез наносят покрытия из композиции, содержащей соединение по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления изобретения подлежащим лечению гиперпролиферативным заболеванием является доброкачественная гиперплазия предстательной железы, заболевание, характеризующееся аномальным ростом эпителиальных клеток предстательной железы, которые блокируют мочеиспускание.

IIIb. Препараты, способы введения, дозы

Пролекарство фосфорамидатного алкилатора обычно получают в виде фармацевтических композиций, предназначенных для введения субъекту. В данном разделе описаны способы введения, препараты и дозы, которые могут применяться при лечении рака с использованием пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению.

Пролекарство фосфорамидатного алкилатора, предназначенное для лечения рака, можно вводить любым способом, обеспечивающим доставку пролекарства к месту действия, в гипоксическую область опухоли. Многие противораковые средства вводят при помощи внутривенной инъекции, и пролекарство фосфорамидатного алкилатора может быть получено в виде препаратов, предназначенных для такого введения, которые включают не только готовые для инъецирования препараты, но и лиофилизованные или концентрированные препараты, которые необходимо соответственно вновь растворить или развести перед инъецированием. Помимо указанных препаратов пролекарство фосфорамидатного алкилатора может быть получено в виде препарата для перорального введения, интрадуоденального введения, парентерального введения (включая внутривенные, подкожные, внутримышечные, внутрисосудистые инъекции или вливания), местного применения и ректального введения. Специалистам в данной области должно быть известно, что пролекарство фосфорамидатного алкилатора может быть активировано бактериями в кишечнике. Если такая активация является нежелательной, лечащий врач может использовать способ введения препарата, обеспечивающий абсорбцию пролекарства фосфорамидатного алкилатора до его попадания в толстую или ободочную кишку. Фактический способ введения и используемый препарат пролекарства фосфорамидатного алкилатора наряду с другими факторами будет зависеть от типа подлежащего лечению рака, выбранного пролекарства фосфорамидатного алкилатора, тяжести заболевания раком, возраста, массы тела и состояния здоровья субъекта.

Количество вводимого пролекарства фосфорамидатного алкилатора и, следовательно, количество пролекарства фосфорамидатного алкилатора, содержащегося в вводимой дозе, и продукта, включающего указанную дозу, будет зависеть от состояния здоровья подлежащего лечению субъекта, тяжести заболевания раком, локализации рака, способа введения, распределения пролекарства (например, молекулярная масса, растворимость, гипоксическая и негипоксическая цитотоксичность), цитотоксического агента, высвобождаемого пролекарством фосфорамидатного алкилатора, и решения лечащего врача, назначающего данное лекарственное средство.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака у субъекта, при осуществлении которого эффективная доза обычно находится в пределах от около 0,001 до около 0,1 г/кг массы тела или от около 0,1 до около 35 мг/кг/сутки в виде однократной дозы или разделенных доз. Для человека с массой тела 70 кг указанная доза будет равна примерно 0,05-7 г/сутки, примерно 0,2-2,5 г/сутки. В некоторых случаях может быть достаточна доза менее нижнего предела вышеуказанного диапазона, в то время как в других случаях могут быть использованы более высокие дозы без возникновения вредных побочных эффектов; более высокие дозы могут быть также разделены на несколько меньших доз, предназначенных для введения на протяжении суток путем вливания в течение одного часа или непрерывного вливания при помощи периферически введенных центральных катетеров (линия PICC), переносного мешка и насоса для внутривенного вливания.

В одном варианте осуществления изобретения эффективная доза соединения по настоящему изобретению, предназначенного для лечения рака и других гиперпролиферативных заболеваний, находится в пределах от около 0,1 до около 35 мг/кг/сутки, от около 0,5 до около 20 мг/кг/сутки, от около 0,5 до около 15 мг/кг/сутки, от около 0,5 до около 10 мг/кг/сутки, от около 0,5 до около 8 мг/кг/ сутки и от около 1 до около 5 мг/кг/сутки в виде однократной дозы или разделенных доз. В одном варианте осуществления изобретения эффективная доза соединения по настоящему изобретению, предназначенного для лечения рака и других гиперпролиферативных заболеваний, находится в пределах от около 2 до около 8 мг/кг/сутки, от около 2 около 4 мг/кг/сутки и около 2 мг/кг/сутки в виде однократной дозы или разделенных доз. В одном варианте осуществления изобретения эффективная доза соединения по настоящему изобретению, предназначенного для лечения рака и других гиперпролиферативных заболеваний, находится в пределах от около 0,25 до около 2,5 мг/кг/сутки, от около 0,25 до около 1 мг/кг/сутки и от около 0,25 до около 0,5 мг/кг/сутки в виде однократной дозы или разделенных доз. В одном варианте осуществления изобретения указанную дозу вводят внутривенно ежедневно в виде монотерапии (только соединение по настоящему изобретению) или в сочетании (комбинации) со стандартными методами лечения. В одном варианте осуществления изобретения эффективную дозу для лечения рака и других гиперпролиферативных заболеваний, которая находится в вышеуказанных пределах, вводят один раз в неделю.

В одном варианте осуществления изобретения периодически (менее часто) вводят более высокую дозу; дозу в пределах от около 3 до около 20 мг/кг, от около 6 до около 10 мг/кг или 8 мг/кг вводят один раз в три дня в течение двух недель. В другом варианте осуществления изобретения дозу в пределах от около 5 до около 30 мг/кг, от около 10 до около 15 мг/кг или 12,5 мг/кг пролекарства фосфорамидатного алкилатора вводят один раз в неделю в течение четырех недель. В одном варианте осуществления изобретения дозу в пределах от около 0,5 до около 8 мг/кг/cутки вводят в течение 5 дней в виде двухнедельных циклов.

В другом варианте осуществления изобретения, относящемся к лечению людей, максимальная суточная доза пролекарства фосфорамидатного алкилатора не превышает 500 мг/кг массы тела субъекта, поэтому пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят в виде суточной дозы в пределах от около 1 мг пролекарства фосфорамидатного алкилатора/кг массы тела субъекта до около 500 мг пролекарства фосфорамидатного алкилатора/кг массы тела субъекта. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят в виде суточной дозы в пределах от около 5 мг/кг до около 500 мг/кг массы тела подлежащего лечению субъекта. В другом варианте осуществления изобретения терапевтически эффективная доза является суточной дозой пролекарства фосфорамидатного алкилатора и находится в пределах от около 10 мг/кг до около 250 мг/кг массы тела подлежащего лечению субъекта. В другом варианте осуществления изобретения терапевтически эффективная доза пролекарства фосфорамидатного алкилатора находится в пределах от около 25 мг/кг до около 150 мг/кг массы тела подлежащего лечению субъекта. В другом варианте осуществления изобретения терапевтически эффективная доза пролекарства фосфорамидатного алкилатора находится в пределах от около 25 мг/кг до около 50 мг/кг массы тела подлежащего лечению субъекта. В другом варианте осуществления изобретения терапевтически эффективная доза пролекарства фосфорамидатного алкилатора находится в пределах от около 1,25 мг/кг до около 12,5 мг/кг массы тела подлежащего лечению субъекта.

Критерии введения могут быть также определены в результате выполнения исследований с участием людей и других млекопитающих. Терапевтически эффективная доза, определенная для животного, может быть переведена в соответствующую эквивалентную дозу для человека (HED) в соответствии с приведенной ниже таблицей.

ЖивотноеПереводной коэффициент для определения эквивалентной дозы для человека (HED)аМышь12,3Хомячок7,4Крыса6,2Хорек5,3Морская свинка4,6Карликовая свинья1,4Миниатюрная свинья1,1Кролик3,1Собака1,8Обезьяныb3,1Игрунка6,2Беличья обезьяна5,3Павиан1,8а Для перевода дозы для животного в мг/кг в HED (массу тела человека принимают равной 60 кг) дозу для животного делят на переводной коэффициент для HED. Для видов, не указанных в таблице, или для масс тела, выходящих за пределы стандартных диапазонов, эквивалентную дозу для человека (HED) можно вычислить по формуле: HED = доза для животного в мг/кг × (масса тела животного в кг: масса тела человека в кг)0,33.
b Например, циномолгус, резус или короткохвостый сцинк.

Для достижения терапевтической эффективности терапевтически эффективную суточную дозу пролекарства фосфорамидатного алкилатора обычно вводят субъекту несколько раз. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят ежедневно в течение определенного периода времени. Ежедневное введение обычно продолжают в течение по крайней мере 3 последовательных дней. В родственных вариантах осуществления изобретения введение продолжают в течение по крайней мере 5 последовательных дней, по крайней мере 7 последовательных дней или по крайней мере 10 последовательных дней. В зависимости от дозы, препарата и способа введения, выбранных лечащим врачом и с учетом удобства субъекта, всю суточную дозу можно вводить один раз в день или суточную дозу можно вводить в виде нескольких меньших доз в течение дня (включая вливание при помощи насоса или внутривенное введение). Например, доза может быть разделена на две меньшие дозы, которые вводят два раза в день, или разделена на три меньшие дозы, которые вводят три раза в день. Специалисту в области лечения рака должно быть очевидно, что термин “ежедневное” введение в использованном здесь значении не ограничен одним введением в день и может включать несколько введений.

Могут быть также использованы схемы введения, отличные от последовательного ежедневного введения. Особенно удобным является введение через день (qod) и введение через два дня на третий, в некоторых случаях может быть приемлемым введение один раз в неделю, но в любом случае пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят повторно в течение определенного периода времени. Например, независимо от того, является ли введение ежедневным (включая, как было указано, разделенную суточную дозу), производится через день или еще реже, пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят по крайней мере 2 дня в неделю в течение по крайней мере двух, трех, четырех, пяти или шести последовательных недель или альтернативно в течение по крайней мере двух, трех, четырех, пяти или шести недель на протяжении шести месяцев или альтернативно в течение по крайней мере двух, трех, четырех, пяти или шести недель на протяжении двенадцати месяцев. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят по крайней мере 3 дня в неделю в течение по крайней мере двух, трех, четырех, пяти или шести последовательных недель или альтернативно в течение по крайней мере двух, трех, четырех, пяти или шести недель на протяжении шести месяцев или альтернативно в течение по крайней мере двух, трех, четырех, пяти или шести недель на протяжении двенадцати месяцев. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят в течение по крайней мере 10 дней в месяц, необязательно по крайней мере 20 дней в месяц на протяжении по крайней мере одного месяца или по крайней мере двух, трех, четырех, пяти или шести последовательных месяцев или альтернативно по крайней мере одного, двух, трех, четырех, пяти или шести месяцев на протяжении 6 месяцев.

В одном варианте осуществления изобретения терапевтически эффективную дозу продолжают вводить в течение нескольких дней, обычно в течение по крайней мере трех последовательных дней и часто в течение по крайней мере пяти-десяти последовательных дней, в течение одной недели, нескольких недель или большего периода времени. Таким образом, пролекарство фосфорамидатного алкилатора можно вводить субъекту в соответствии со способами по настоящему изобретению в течение нескольких недель, одной недели, одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, шести месяцев, одного года или более продолжительного периода времени.

В соответствии со схемами введения других противораковых средств пролекарство фосфорамидатного алкилатора можно вводить в виде нескольких “циклов” введения. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора можно вводить один раз в день в течение по крайней мере трех-десяти или по крайней мере пяти-десяти последовательных дней, и такое лечение в течение трех-десяти или пяти-десяти дней можно повторять один, два, три или большее число раз, при этом период с отсутствием лечения (пролекарством фосфорамидатного алкилатора) может иногда составлять от одной до нескольких недель. Аналогичным образом в некоторых вариантах осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят через день в виде двух-десяти введений, чаще трех-десяти введений или пяти-десяти введений, и такие два, три или пять-десять введений через день можно повторять один, два, три или большее число раз с отсутствием лечения (пролекарством фосфорамидатного алкилатора) в течение периода времени от одной до нескольких недель между введениями. Из настоящего описания изобретения квалифицированному лечащему врачу должны быть очевидны другие схемы введения, состоящие из нескольких циклов.

В соответствии с одним объектом настоящего изобретения выражение “введение терапевтически эффективной дозы и схема введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора” означает (i) введение пролекарства фосфорамидатного алкилатора в указанных пределах (например, от 1 мг до 1 г пролекарства фосфорамидатного алкилатора на 1 кг массы тела субъекта, обычно 25-150 мг пролекарства фосфорамидатного алкилатора на 1 кг массы тела субъекта) в течение указанного минимального числа дней на протяжении указанного периода времени с достижением терапевтического эффекта при лечении у субъекта рака. Иллюстративные схемы введения терапевтически эффективной дозы пролекарства фосфорамидатного алкилатора включают схемы, рассмотренные в настоящем описании изобретения, в частности, введение пролекарства фосфорамидатного алкилатора в течение 3 последовательных дней, 5 последовательных дней, 7 последовательных дней, 10 последовательных дней, по крайней мере 3 дней в неделю, по крайней мере 3 дней в неделю в течение одного месяца, по крайней мере 10 дней в месяц и по крайней мере 20 дней в месяц.

Для оптимизации схемы лечения пролекарством фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению можно выбрать дозу и частоту введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора с учетом достижения максимально удаленного участка под кривой концентрации в плазме (AUC) на протяжении всего курса лечения. Теоретически оптимальная схема введения должна обеспечивать максимальное воздействие пролекарства фосфорамидатного алкилатора на опухолевые клетки при измерении методом AUC при сведении к минимуму максимальной концентрации в плазме (Сmax) для любого одного введения. Более высокое значение Сmax определяет токсичность, в то время как AUC определяет эффективность. Как известно в данной области для других противораковых лекарственных средств, лечение пролекарством фосфорамидатного алкилатора может быть временно прекращено при обнаружении токсичности или для удобства субъекта и затем возобновлено, что не выходит за пределы объема настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления изобретения фармакокинетика пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению, используемого для лечения рака, может определять дозу, способ введения и тип рака, подлежащего лечению пролекарством фосфорамидатного алкилатора. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению может характеризоваться периодом полураспада in vivo от 1 до 300 минут. В одном варианте осуществления изобретения соединения по настоящему изобретению могут характеризоваться периодом полураспада in vivo от 3 до 10 минут. В одном варианте осуществления изобретения соединения по настоящему изобретению могут характеризоваться периодом полураспада in vivo от 10 до 30 минут. Короткий период полураспада пролекарства фосфорамидатного алкилатора может потребовать более продолжительное время вливания по сравнению с пролекарством фосфорамидатного алкилатора с более длительным периодом полураспада. Короткий период полураспада пролекарства фосфорамидатного алкилатора может увеличивать максимально допустимую дозу (MTD) такого пролекарства.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, до 20% которых остается без изменения при инкубации с микросомным белком печени мыши в течение 30 минут. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, 20-80% которых остается без изменения при инкубации с микросомным белком печени мыши в течение 30 минут. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, 80% которых остается без изменения при инкубации с микросомным белком печени мыши в течение 30 минут. В другом варианте осуществления изобретения примеры пролекарств фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению, более 80% которых остается без изменения при инкубации с микросомным белком мыши в течение 30 минут, включают соединения 1, 25 и 36. Чем выше устойчивость к MLM пролекарства по настоящему изобретению, тем меньше будут терапевтически эффективная доза и нежелательные для субъекта побочные эффекты.

В родственном варианте осуществления изобретения биовосстановительная группа пролекарств фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению после восстановления/активации в гипоксической зоне опухоли образует конъюгат фосфорамидатного алкилатора-ТМ. Конъюгат фосфорамидатного алкилатора-ТМ может диффундировать и достигать других частей опухоли или других опухолей в случае метастазирующего заболевания. Были измерены разные фармакокинетические параметры, такие как объем распределения в устойчивом состоянии (Vss), клиренс (CL), площадь под кривой (AUC), устойчивость к микросомам печени мыши (устойчивость MLM), устойчивость в плазме и Сmax пролекарств фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению, которые приведены в разделе “Примеры” (см. также приведенную выше публикацию Hardman et al.).

При повторном курсе лечения доза может быть отрегулирована в зависимости от переносимости субъекта по результатам предыдущего лечения. В любом случае при обнаружении во время повторного курса лечения токсичности, выраженной тяжелыми симптомами, введение препарата может быть временно прекращено. Введение препарата может быть возобновлено, когда в органе, характеризующемся наибольшей токсичностью, будут отсутствовать значительные концентрации пролекарства фосфорамидатного алкилатора или произойдет выделение фосфорамидатного алкилатора из указанного органа (что можно измерить или косвенно определить по отсутствию симптомов). Поэтому промежуток между введениями препарата может исчисляться не только определенным числом дней, но и индивидуально на основании симптомов и клиренса пролекарства фосфорамидатного алкилатора из здорового органа или введения фосфорамидатных алкилаторов.

Препарат пролекарства фосфорамидатного алкилатора может быть получен, например, в форме, пригодной для перорального введения, такой как таблетка, капсула, пилюля, препарат с пролонгированным действием, раствор и суспензия; для парентеральной инъекции в виде стерильного раствора, суспензии или эмульсии; для местного применения в виде мази или крема и для ректального введения в виде суппозитория. Препарат пролекарства фосфорамидатного алкилатора может представлять собой унифицированные лекарственные формы, пригодные для однократного введения точных доз, которые обычно содержат приемлемый фармацевтический носитель или наполнитель.

Приемлемые фармацевтические носители включают инертные разбавители или наполнители, воду и разные органические растворители. Фармацевтические композиции, при желании, могут содержать дополнительные ингредиенты, такие как ароматизаторы, связывающие вещества, наполнители и тому подобные. Так, для перорального введения могут быть использованы таблетки, содержащие разные наполнители, такие как лимонная кислота, вместе с разными дезинтеграторами, такими как крахмал, альгиновая кислота и определенные комплексные силикаты, и связывающими веществами, такими как сахароза, желатин и аравийская камедь. Кроме того, для получения таблетированных форм препаратов пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению могут быть дополнительно использованы смазывающие вещества, такие как стеарат магния, лаурилсульфат натрия и тальк. Твердые композиции подобного типа могут быть использованы в мягких и твердых заполняемых желатиновых капсулах. Предпочтительные вещества включают лактозу или молочный сахар и высокомолекулярные полиэтиленгликоли. При получении водных суспензий или эликсиров для перорального введения пролекарство может быть объединено с разными подсластителями или ароматизаторами, красителями или пигментами и при желании с эмульгирующими или суспендирующими агентами в сочетании с разбавителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин или их комбинации.

Типичные формы для парентерального введения включают растворы или суспензии пролекарства фосфорамидатного алкилатора в стерильных водных растворах, таких как, например, водный раствор полиэтиленгликолей, пропиленгликоля или декстрозы. Такие лекарственные формы при желании могут содержать приемлемый буфер.

Способы получения разных фармацевтических композиций, содержащих определенное количество активного лекарственного средства, хорошо известны или должны быть очевидны специалистам в данной области из настоящего описания изобретения (см., например, публикацию Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th Edition (1984)).

Способы лечения рака с использованием пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению позволяют эффективно убивать особенно плохо поддающиеся уничтожению раковые клетки, растущие в гипоксической области опухоли. После высвобождения в гипоксической области фосфорамидатный алкилатор может диффундировать из гипоксических клеток и уничтожать раковые клетки в смежных областях, содержащих постоянно увеличивающиеся популяции быстро делящихся клеток. Гипоксическая область действует в качестве предприятия по производству лекарственного средства, образуя внутри опухоли алкилатор, убивающий смежные негипоксические раковые клетки, что вызывает увеличение концентрации фосфорамидатного алкилатора в опухоли по сравнению с нормальными тканями. Использование пролекарства для образования фосфорамидатного алкилатора внутри опухоли позволяет уменьшить побочные токсические эффекты, возникающие в результате токсического воздействия на нормальные клетки. После разрушения раковой клетки в негипоксической области опухоли клетки в гипоксической области могут стать негипоксическими и начать делиться. На данном этапе такие клетки могут быть уничтожены фосфорамидатными алкилаторами, образованными из пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению или известных пролекарств либо другими противораковыми средствами или цитоксинами, вводимыми в комбинации с пролекарством фосфорамидатного алкилатора в соответствии с описанием, приведенным в нижеследующем разделе.

IIIc. Комбинированная терапия

В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора можно вводить в комбинации с другими противораковыми средствами. Не ограничиваясь каким-либо определенным механизмом или действием, можно отметить, что такое совместное введение может в некоторых случаях характеризоваться одним или несколькими преимуществами по сравнению с известными методами лечения рака, так, например, совместное введение пролекарства фосфорамидатного алкилатора и противоракового средства оказывает синергическое действие на гибель раковой клетки. Совместное введение дает лучший терапевтический результат, чем введение одного противоракового средства, например, при таком введении достигается более эффективное облегчение или ослабление одного или нескольких симптомов рака, уменьшение тяжести заболевания, задержка или замедление развития болезни, ослабление, временное облегчение или стабилизация заболевания, частичная или полная ремиссия, продление жизни или другие благоприятные терапевтические результаты.

Совместное введение пролекарства фосфорамидатного алкилатора повышает чувствительность раковых клеток к противораковому средству, позволяя вводить субъекту более низкие дозы противоракового средства или использовать противораковое средство для лечения клеток, которые в противном случае являются устойчивыми к воздействию данного противоракового средства или к лечению. В то время как известные противораковые средства обычно направленно воздействуют на быстро делящиеся клетки в негипоксической области, пролекарства фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению направленно воздействуют на гипоксические клетки в областях опухолей, которые недостаточно эффективно уничтожаются отдельно используемым противораковым средством.

В используемом здесь значении термин “совместное введение” пролекарства фосфорамидатного алкилатора с другим противораковым средством (определяемым также как “лекарственное средство”) означает введение пролекарства фосфорамидатного алкилатора и средства в виде части одного курса терапии. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят до введения лекарственного средства (то есть начало другой противораковой терапии) и лечение пролекарством фосфорамидатного алкилатора продолжают в течение всего курса введения лекарственного средства (то есть курс другой терапии). В другом варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят после начала или завершения другой противораковой терапии. В других вариантах осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят одновременно с началом другой противораковой терапии (см., например, методы комбинированной терапии, описанные в разделе “Примеры”).

В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят до введения лекарственного средства и лечение пролекарством фосфорамидатного алкилатора продолжают после прекращения введения лекарственного средства. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят до введения лекарственного средства и лечение пролекарством фосфорамидатного алкилатора продолжают на протяжении части курса введения лекарственного средства. В случае некоторых лекарственных средств, таких как определенные ингибиторы топоизомеразы, введение пролекарства фосфорамидатного алкилатора может быть начато и закончено до введения второго лекарственного средства.

В присутствии кислорода анион радикала, образованный в результате восстановления Z3, взаимодействует с кислородом, образуя супероксид и Z3. Супероксид является цитотоксином, и образование супероксида в негипоксических тканях может вызывать нежелательные побочные эффекты. Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к пролекарству фосфорамидатного алкилатора, вводимому в комбинации с химиозащитным средством. Химиозащитные средства защищают здоровую ткань от токсических эффектов противораковых средств. В одном варианте осуществления изобретения химиозащитным средством является тиол или дисульфид. В одном варианте осуществления изобретения химиозащитное средство может восстанавливать супероксид. В другом варианте осуществления изобретения химиозащитное средство может взаимодействовать с “рецептором Михаэла”, образующимся из пролекарства фосфорамидатного алкилатора и предотвращать взаимодействие “рецептора Михаэла” с белками и нуклеиновой кислотой (см. ниже).

Лечение противораковыми средствами в настоящее время обычно включает несколько курсов или “циклов” введения противораковых средств. В связи с введением пролекарства фосфорамидатного алкилатора каждый цикл введения (а также полная серия циклов) может рассматриваться как введение второго лекарственного средства. Пролекарство фосфорамидатного алкилатора можно вводить в течение любого или всех циклов лечения другим лекарственным средством; как правило, пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят ежедневно в течение по крайней мере двух или более дней во время каждого цикла. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят вместе с противораковым средством в соответствии со схемой, повторяющейся в каждом курсе.

Один вариант осуществления изобретения относится к способу лечения рака с использованием пролекарства фосфорамидатного алкилатора, которое вводят в сочетании с эффективным количеством одного или нескольких химиотерапевтических средств, эффективной дозой лучевой терапии, соответствующим хирургическим лечением или с любой комбинацией таких дополнительных методов лечения.

При использовании пролекарства фосфорамидатного алкилатора в комбинации с одним или несколькими дополнительными методами лечения оба вида лечения можно проводить одновременно или раздельно. Например, если пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят вместе с дополнительным химиотерапевтическим средством, оба средства могут быть введены одновременно или последовательно с некоторым промежутком времени между введениями. Специалисту в данной области должны быть известны методы одновременного и последовательного введения лекарственных средств и возможные промежутки времени между введением (см., например, методы комбинированной терапии, описанные в разделе “Примеры”).

Лекарственные средства можно вводить в одном или разных препаратах одинаковыми или разными способами.

Химиотерапевтические средства, которые могут быть использованы в комбинации с пролекарством фосфорамидатного алкилатора, по настоящему изобретению включают, не ограничиваясь ими, бусульфан, импросульфан, пипосульфан, бензодепа, карбоквон, 2-дезокси-D-глюкозу, лонидамин и его аналоги (обозначаемые app), глюфосфамид, гемцитибин, эрлотиниб, метуредепа, уредепа, альтретамин, иматиниб, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид, триметилоломеламин, хлорамбуцил, хлорнафазин, эстрамустин, ифосфамид, гефитиниб, мехлорэтамин, гидрохлорид оксида мехлорэтамина, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилиприт, кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, нимустин, ранимустин, дакарбазин, манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман, аклациномицины, актиномицин F(1), антрамицин, азасерин, блеомицин, кактиномицин, карубицин, карзинофилин, хромомицин, дактиномицин, даунорубицин, дауномицин, 6-диазо-5-оксо-1-норлейцин, микофенольную кислоту, ногаламицин, оливомицин, пепломицин, пликамицин, порфиромицин, пуромицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин, деноптерин, птероптерин, триметрексат, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-фторурацил, тегафур, L-аспарагиназу, пулмозим, ацеглатон, гликозид альдофосфамида, аминолевулиновую кислоту, амсакрин, бестрабуцил, бизантрен, карбоплатин, дефофамид, демекольцин, диазиквон, элфорнитин, ацетат эллиптиния, этоглуцид, флутамид, нитрат галлия, гидроксимочевину, альфа-интерферон, бета-интерферон, гамма-интерферон, интерлейкин-2, лентинан, митогуазон, митоксантрон, мопидамол, нитракрин, пентостатин, фенамет, пирарубицин, подофиллиновую кислоту, 2-этилгидразид, прокарбазин, разоксан, сизофиран, спирогерманий, паклитаксель, тамоксифен, эрлотониб, тенипозид, тенуазоновую кисолоту, тразиквон, 2,2',2”-трихлортриэтиламиин, уретан, винбластин, циклофосфамид и винкристин. Другие химиотерапевтические средства, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают производные платины, которыми являются, не ограничиваясь ими, цисплатина, карбоплатин и оксоплатин.

В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с ингибиторами развития кровеносных сосудов, которые включают, не ограничиваясь ими, авастин и подобные лекарственные средства. В соответствии с одним вариантом способов комбинированного лечения субъекта сначала подвергают лечению ингибитором развития кровеносных сосудов и затем пролекарством фосфорамидатного алкилатора. В соответствии с одним вариантом способов комбинированного лечения субъекта сначала подвергают лечению ингибитором развития кровеносных сосудов и затем пролекарством фосфорамидатного алкилатора вместе с другим химиотерапевтическим средством, которое включает, не ограничиваясь ими, цисплатин и карбоплатин. Один вариант способов комбинированного лечения с использованием ингибитора развития кровеносных сосудов относится к лечению рака молочной железы.

В другом варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят вместе с противораковым средством, которое прямо или косвенно ингибирует эпидермальный фартор роста или рецептор EGFR. Ингибиторы EGFR, приемлемые для совместного введения с пролекарством фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению, включают гефитиниб и эрлотониб.

В другом варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят вместе с противораковым средством, которое прямо или косвенно ингибирует индуцируемый гипоксией альфа-фактор 1 (HIF1a) или ингибирует белок или фермент, такой как транспортер глюкозы или VEGF, экспрессия или активность которого повышается при увеличении уровней HIF1a. Ингибиторы HIF1a, приемлемые для использования в данном варианте и композиций по настоящему изобретению и способов их применения, включают ингибиторы киназы Р13, LY294002, рапамицин, ингибиторы гистондезацетилазы, такие как [(E)-(1S,4S,10S,21R)-7-[(Z)-этилиден]-4,21-диизопропил-2-окса-12,13-дитиа-5,8,20,23-тетраазабицикло[8,7,6]трикос-16-ен-3,6,9,19,22-пентанон (FR901228, депсипептид), ингибиторы белка теплового шока 90 (Hsp90), такие как гелданамицин, 17-аллиламиногелданамицин (17-AAG) и другие аналоги гелданамицина, радицикол и производные радицикола, такие как KF58333, генистеин, инданон, стауроспорин, ингибиторы протеинкиназы-1 (МЕК-1), такие как PD98059 (1'-амино-3'-метоксифлавон), РХ-12 (1-метилпропил-2-имидазолилдисульфид), плеуротин РХ-478, 1,4-диоксиды хиноксалина, бутират натрия (NaB), нитропуррузид натрия (SNP) и другие доноры NP, ингибиторы микроканальцев, такие как новобиоцин, панзем (2-метоксиэстрадиол или 2-МЕ2), винкристины, таксаны, эпотилоны, дискодермолид и производные любых вышеуказанных веществ; кумарины, аналоги барбитуровой и тиобарбитуровой кислоты, камптотецины и YC-1, соединение, описанное в публикации Biochem. Pharmacol., 15 Apr. 2001, 61(8):947-954, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки, и его производные.

В другом варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят вместе со средством, препятствующим развитию кровеносных сосудов, которое включает, не ограничиваясь ими, средства, препятствующие развитию кровеносных сосудов, выбираемые из группы, включающей ангиостатин, средство, ингибирующее или оказывающее антагонистическое действие на VEGF, батимастат, каптоприл, ингибитор, выделяемый из хряща, генистеин, эндостатин, интерлейкин, лавендустин А, ацетат медроксипрегестерона, рекомбинантный тромбоцитарный фактор человека 4, таксол, текогалан, талидомид, тромбоспондин, TNP-470 и авастин. Другие ингибиторы развития кровеносных сосудов, пригодные для целей комбинированной терапии с использованием и композиций по настоящему изобретению и способов их применения, включают ингибиторы Сох-2, такие как целекоксиб (Celebrex), диклофенак (Voltaren), этодолак (Lodine), фенопрофен (Nalfon), индометацин (Indocin), кетопрофен (Orudis, Oruvail), кеторалак (Toradol), оксапрозин (Daypro), набуметон (Relafen), сулиндак (Clinoril), толметин (Tolectin), рофекоксиб (Vioxx), ибупрофен (Advil), напроксен (Aleve, Naprosyn), аспирин и ацетаминофен (Tylenol).

Кроме того, поскольку пировиноградная кислота играет важную роль в развитии кровеносных сосудов, вместе с соединением, препятствующим развитию кровеносных сосудов, и пролекарством фосфорамидатного алкилатора при лечении рака могут быть использованы имитаторы пирувата и ингибиторы гликолиза, такие как галогенпируваты, в том числе бромпируват. В другом варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора при лечении рака вводят вместе со средством, препятствующим развитию кровеносных сосудов, и другим противораковым средством, которое включает, не ограничиваясь ими, цитотоксический агент, выбираемый из группы, включающей алкилаторы, цисплатин, карбоплатин и ингибиторы микроканальцев.

Помимо комбинации пролекарства фосфорамидатного алкилатора вместе с вышеописанными средствами настоящее изобретение относится к разным синергическим комбинациям пролекарства фосфорамидатного алкилатора и других противораковых средств. Специалисты в данной области могут легко определить противораковые средства, которые оказывают “синергическое” действие вместе с пролекарством фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению. Например, в публикациях Vendetti, “Relevance of Transplantable Animal-Tumor Systems to the Selection of New Agents for Clinical Trial”, Pharmacological Basis of Cancer Chemotherapy, Williams and Wilkins, Baltimore, 1975, and Simpson Herren et al., 1985, “Evaluation of Vivo Tumor Models for Predicting Clinical Activity for Anticancer Drugs”, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 26:330, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки, описаны методы, позволяющие определить способность двух лекарственных средств оказывать синергическое действие.

Несмотря на то что синергическое действие не требуется для достижения терапевтического эффекта при выполнении способов по настоящему изобретению, один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака при наличии синергизма между пролекарством фосфорамидатного алкилатора и другим противораковым средством. Два лекарственных средства могут обладать терапевтическим синергизмом, если комбинированная схема введения двух лекарственных средств обеспечивает гораздо лучшее уничтожение раковых клеток по сравнению с суммарным действием отдельных лекарственных средств при оптимальных или максимальных переносимых дозах. “Степень синергизма” можно определить в виде чистого логарифма уничтожения опухолевых клеток при оптимальной схеме комбинированного лечения минус чистый логарифм уничтожения опухолевых клеток при оптимальной дозе наиболее активного отдельно используемого средства. Более чем 10-кратная разница (один логарифм) в уничтожении клеток считается показателем терапевтического синергизма.

При использовании пролекарства фосфорамидатного алкилатора с другим противораковым средством по крайней мере в некоторых вариантах осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят до начала лечения другим лекарственным средством или лекарственными средствами и введение обычно продолжают на протяжении всего курса лечения другим лекарственным средством или лекарственными средствами. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственное средство, вводимое вместе с пролекарством фосфорамидатного алкилатора, вводят в меньшей дозе и необязательно в течение более продолжительных периодов времени, чем без использования пролекарства фосфорамидатного алкилатора. Такая терапия с использованием “низкой дозы” предполагает, например, введение противоракового средства, которое включает, не ограничиваясь ими, паклитаксель, доцетаксель, доксорубицин, цисплатин или карбоплатин, в более низкой дозе и в течение более продолжительного периода времени вместе с пролекарством фосфорамидатного алкилатора, вводимого в соответствии со способами по настоящему изобретению.

Указанные способы могут быть использованы для улучшения результатов лечения субъектов по сравнению с применяемыми в настоящее время методами лечения, которые выражаются в более эффективном уничтожении раковых клеток или прекращении роста раковых клеток, а также уменьшении нежелательных побочных эффектов другой терапии. При использовании в комбинации с пролекарством фосфорамидатного алкилатора дозу дополнительного противоракового средства определяют исходя из стандартных доз таких лекарственных средств (то есть при использовании без пролекарства фосфорамидатного алкилатора) или вводят в меньшем количестве по сравнению со стандартными дозами.

Введение пролекарства фосфорамидатного алкилатора в соответствии со способами по настоящему изобретению позволяет лечащему врача лечить рак существующими (или разрешенными позже) лекарственными средствами в более низких дозах (по сравнению с используемыми в настоящее время), что ослабляет некоторые или все токсические побочные эффекты таких лекарственных средств. Точная доза может быть различной для разных субъектов в зависимости от целого ряда факторов, включающих используемую комбинацию лекарственных средств, конкретное заболевание, подлежащее лечению, состояние здоровья и анамнез субъекта, но может быть определена специалистом в данной области с учетом настоящего описания изобретения.

Лечащим врачам известны конкретные схемы введения известных и разрешенных химиотерапевтических средств или средств, препятствующих развитию кровеносных сосудов (то есть рекомендованная эффективная доза), которые описаны, например, в публикации Physician's Desk Reference 2003, (Physicians' Desk Reference, 57th Ed) Medical Economics Company, Inc., Oradell, N.J., и/или могут быть предоставлены Федеральным управлением по контролю за лекарствами. Иллюстративные схемы введения определенных противораковых средств приведены также ниже в настоящем описании изобретения.

Противораковые средства могут быть классифицированы как алкилаторы, антрациклины, антибиотики, ингибиторы ароматазы, бисфосфонаты, ингибиторы циклооксигеназы, модуляторы рецепторов эстрогенов, антагонисты фолатов, неорганические арсенаты, ингибиторы микроканальцев, модификаторы, нитрозомочевины, аналоги нуклеозидов, ингибиторы остеокластов, платинасодержащие соединения, ретиноиды, ингибиторы топоизомеразы 1, ингибиторы топоизомеразы 2 и ингибиторы тирозинкиназы. В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора можно вводить вместе с любым противораковым средством, относящимся к любому из вышеуказанных классов, или можно вводить до или после лечения любым таким лекарственным средством или комбинацией таких лекарственных средств. Кроме того, пролекарство фосфорамидатного алкилатора можно вводить в комбинации с биопрепаратами (такими как интерфероны, интерлейкины, колониестимулирующие факторы и моноклональные антитела). Биопрепараты, используемые для лечения рака, известны в данной области и включают, например, трастузумаб (Herceptin), тозитумомаб и131I тозитумомаб (Bexxar), ритуксимаб (Rituxan).

Алкилаторы, используемые при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, бусульфан (Myleran, Busulfex), хлорамбуцил (Leukeran), ифосфамид (вместе с MESNA или без него), циклофосфамид (Cytoxan, Neosar), глюфосфамид, мелфалан, L-PAM (Alkeran), дакарбазин (DTIC-Dome) и темозоламид (Temodar). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят вместе с алкилатором для лечения рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является хроническим миелогенным лейкозом, множественной миеломой или атипической астроцитомой.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем введения алкилатора в виде пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению, используемых отдельно или в комбинации по крайней мере с одним другим алкилатором или его пролекарством. Алкилаторы, такие как, например, циклофосфамид, ифосфамид, глюфосфамид, мехлорэтамин, мелфалан, хлорамбуцил, дакарбазин, темозоломид, кармустин, стрептозоцин, бендамустин, бусульфан, тиотепа, цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин, и типы рака, подлежащие лечению такими алкилаторами, используемыми отдельно или в комбинации с другими противораковыми или химиозащитными средствами, описаны например, в приведенной выше публикации Hardman et al.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем совместного введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора по крайней мере с одним алкилатором, в частности циклофосфамидом, причем подлежащим лечению раком являются злокачественные лимфомы III и IV стадии, множественная миелома, лейкоз, грибовидный микоз, нейробластома, аденокарцинома яичника, ретинобластома и карцинома молочной железы. В случае вводной терапии циклофосфамид вводят внутривенно в виде раздельных доз в количестве 1500-1800 мг/м2 в течение трех-пяти дней; в случае поддерживающей терапии в дозах 350-550 мг/м2 каждые 7-10 дней или в дозах 110-185 мг/м2 внутривенно два раза в неделю. В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят вместе с циклофосфамидом, используемым в таких же или меньших дозах и/или в течение более продолжительного периода времени, чем при введении одного циклофосфамида.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению в соответствии со схемой лечения рака, включающей использование по крайней мере одного алкилатора, являющегося мехлорэтамином. Например, мехлорэтамин используют в комбинированной химиотерапии МОРР (мехлорэтамин, онковин (винкристин), прокарбазин и преднизон) при лечении субъектов, страдающих болезнью Ходжкина, и вводят в виде внутривенной инъекции ударной дозы в количестве 6 мг/м2 в 1-й и 8-й дни 28-дневных циклов каждого курса лечения.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению в соответствии со схемой лечения рака, включающей использование по крайней мере одного алкилатора, являющегося ифосфамидом. Ифосфамид используют для лечения саркомы у детей и взрослых, карциномы шейки матки и легкого и в комбинации с другими лекарственными средствами при лечении рака яичка. Ифосфамид используют в качестве части схем лечения ICЕ (ифосфамид, карбоплатин и этопозид) и RICE (ритуксан и ICЕ) для лечения лимфом (см. приведенную выше публикацию Hardman et al.).

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению в соответствии со схемой лечения рака, включающей использование по крайней мере одного алкилатора, являющегося глюфосфамидом. Глюфосфамид используют в клинических условиях для лечения рака поджелудочной железы или рака поджелудочной железы, устойчивого к гемзару. Глюфосфамид может быть использован для лечения рака молочной железы, болезни Ходжкина, рака желудочно-кишечного тракта или в качестве части схемы лечения GCE (глюфосфамид, карбоплатин и этопозид) или RGCE (ритуксан и GCE) для лечения лимфом (Tidmarsh et al., заявка на патент РСТ № РСТ/US2005/047314, поданная 22 декабря 2005 г., и заявка на патент РСТ, озаглавленная “Glufosfamide combination therapy”, декларация поверенного № 021305-005900РС, заявки на патент США №№ 60/760599 и 60/719787 и публикация патента РСТ WO 2005/076888, которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки).

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению в соответствии со схемой лечения рака, включающей использование по крайней мере одного алкилатора, выбираемого из группы, включающей этиленимины и метилмеламины. В другом варианте осуществления изобретения этиленимин является триэтиленмеламином или тиотепа.

Тиотепа может быть использован для лечения аденокарциномы молочной железы, яичника и мочевого пузыря, злокачественных лимфом, бронхогенных карцином и опухоли Вильмса. Тиотепа использовали в высоких дозах в комбинированной химиотерапии вместе с циклофосфамидом при лечении субъектов, страдающих резистентными злокачественными заболеваниями, наряду с аутотрансплантацией кости и для лечения разных типов рака, включающих рак мочевого пузыря, яичника, молочной железы, легкого, головного мозга и лимфомы (см. публикации International Agency for Research on Cancer Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans, 1975, 9:286, Lyon, France; International Agency for Research on Cancer Monographs on the Evalution of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans, 1990, 50:415, Lyon, France; and MEDLINEplus, 2003, Drug Information: Thiotepa, National Library of Medicine). Метилмеламин, в частности альтретамин, используют для лечения запущенного рака яичника после безуспешного применения методов лечения первого цикла.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению в соответствии со схемой лечения рака, включающей использование по крайней мере одного алкилатора, являющегося мелфаланом, хлорамбуцилом или бендамустином. Мелфалан, используемый для лечения множественной миеломы, можно вводить перорально. Хлорамбуцил используют для лечения хронического лимфолейкоза и первичной макроблобулинемии. Бендамустин, разработанный в компании Salmedix Inc., может быть использован для лечения злокачественных заболеваний крови, таких как, например, неходжкинская лимфома, хронический лимфолейкоз и множественная миелома.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению в соответствии со схемой лечения рака, включающей использование по крайней мере одного алкилатора, являющегося бусульфаном. Бусульфан используют для лечения хронического гранулоцитарного лейкоза и хронического миелогенного лейкоза. Могут быть использованы высокие дозы бусульфана в сочетании с циклофосфамидом при лечении субъектов, страдающих острым миелогенным лейкозом, до трансплантации костного мозга.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению в соответствии со схемой лечения рака, включающей использование по крайней мере одного алкилатора, являющегося нитрозомочевиной. В другом варианте осуществления изобретения таким алкилатором, как нитрозомочевина, является кармустин. Кармустин может быть использования для лечения болезни Ходжкина, лимфом, миелом, злокачественных астроцитом, метастазирующих опухолей головного мозга, меланомы и опухолей желудочно-кишечного тракта. В другом варианте осуществления изобретения нитрозомочевина является стрептозоцином, который используют для лечения карциномы инсулоцитов поджелудочной железы.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению в соответствии со схемой лечения рака, включающей использование по крайней мере одного алкилатора, являющегося триазеном. В одном варианте осуществления изобретения алкилатор триазен является дакарбазином. Дакарбазин используют для лечения злокачественной меланомы, болезни Ходжкина и саркомы у взрослых. В другом варианте осуществления изобретения таким алкилатором как триазен является темозоломид. Темозоломид может быть использован для лечения злокачественных глиом.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения рака путем введения пролекарства фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению в соответствии со схемой лечения рака, включающей использование по крайней мере одного алкилатора, являющегося координационным комплексом платины. В одном варианте осуществления изобретения алкилатор, представляющий собой координационный комплекс платины, является цисплатином. Цисплатин может быть использован для лечения рака мочевого пузыря, головы и шеи, эндометрия, мелкоклеточного рака легкого и некоторых опухолей у детей. Цисплатин, используемый отдельно или в сочетании с циклофосфамидом, применяют для лечения запущенного рака яичника. Комбинированную химиотерапию цисплатином в сочетании с блеомицином, этопозидом и винбластином применяют для лечения запущенного рака яичка и в сочетании с паклитакселем, циклофосфамидом или доксорубицином для лечения карциномы яичника.

Антрациклины, используемые при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, доксорубицин (Adriamycin, Doxil, Rubex), митоксантрон (Novantrone), идарубицин (Idamycin), валрубицин (Valstar) и эпирубицин (Ellence). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с антрациклином при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является острым нелимфоцитарным лейкозом, саркомой Капоши, раком предстательной железы, раком мочевого пузыря, метастазирующим раком яичника и раком молочной железы.

В качестве одного примера можно привести соединение (8S,10S)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-альфа-L-ликсогексопиранозил)окси]-8-гликолоил-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-1-метокси-5,12-нафтацендион, широко известное как доксорубицин, которое является цитотоксическим антрациклиновым антибиотиком, выделяемым из культур Streptomyces peucetius, вариант caesius. Доксорубицин успешно применяется для достижения регрессии диссеминированных опухолей, таких как острый лимфобластный лейкоз, острый миелобластный лейкоз, опухоль Вильмса, нейробластома, саркома мягких тканей и костей, рак молочной железы, рак яичника, переходно-клеточный рак мочевого пузыря, рак щитовидной железы, лимфомы ходжкинского и неходжкинского типа, бронхогенный рак и рак желудка. Доксорубицин обычно вводят в дозе, равной 30-75 мг/м2, в виде однократной внутривенной инъекции с интервалами в 21 день; в виде еженедельной внутривенной инъекции в дозе 20 мг/м2; или в дозах 30 мг/м2 в течение трех последовательных дней, повторяемых каждые четыре недели. В соответствии со способами по настоящему изобретению введение пролекарства фосфорамидатного алкилатора начинают до и продолжают после введения доксорубицина в таких дозах (или в более низких дозах). Пролекарства циклического антрациклинового цитотоксина, пригодные для использования в способах по настоящему изобретению, описаны в заявке на патент РСТ № US05/008161, Matteuci et al.

Антибиотики, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, дактиномицин, актиномицин D (Cosmegen), блеомицин (Blenoxane), даунорубицин и дауномицин (Cerubidine, DanuoXome). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с антибиотиком при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является раком, выбираемым из группы, включающей острый лимфоцитарный лейкоз, другие лейкозы и саркому Капоши.

Ингибиторы ароматазы, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, анастрозол (Arimidex) и летроазол (Femara). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с ингибитором ароматазы при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является раком молочной железы.

Бифосфонатные ингибиторы, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь им, золедронат (Zometa). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с бифосфонатным ингибитором при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является раком, выбираемым из группы, включающей множественную миелому, костные метастазы из солидных опухолей или рак предстательной железы.

Ингибиторы циклооксигеназы, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь им, целекоксиб (Celebrex). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с ингибитором циклооксигеназы при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является раком ободочной кишки или предраковым состоянием, известным как семейный аденоматозный полипоз.

Модуляторы рецепторов эстрогена, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, тамоксифен (Nolvadex) и фулвестрант (Faslodex). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с модулятором рецепторов эстрогена при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является раком молочной железы или лечение проводят для профилактики возникновения или рецидива рака молочной железы.

Антагонисты фолатов, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, метотрексат и треметрексат. В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с антагонистом фолата при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является остеосаркомой.

В качестве одного примера можно привести такое соединение как N-[4-[[(2,4-диамино-6-птеридинил)метилметиламино]бензоил]-L-глутаминовая кислота, широко известное как метотрексат, которое является противофолатным средством, применяемым при лечении хориокарциномы матки и субъектов, страдающих хориоаденомой и пузырным заносом. Указанное лекарственное средство пригодно также для лечения запущенной злокачественной лимфомы и запущенных форм грибовидного микоза. Метотрексат вводят следующим образом. В случае хориокарциномы ежедневно выполняют внутримышечные инъекции в дозах, равных 15-30 мг, в течение пяти дней и при необходимости такие курсы повторяют с интервалом в одну или несколько недель. В случае лейкозов выполняют внутримышечные инъекции два раза в неделю в дозах, равных 30 мг/м2. В случае грибовидного микоза дважды в неделю выполняют внутримышечные инъекции в дозах, равных 50 мг или альтернативно 25 мг. В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с метотрексатом, используемым в указанных дозах (или более низких дозах). 5-Метил-6-[[(3,4,5-триметоксифенил)амино]метил]-2,4-хиназолиндиамин (обычно широко известный как триметрексат) является еще одним противофолатным средством, которое можно вводить совместно с пролекарством фосфорамидатного алкилатора.

Неорганические арсенаты, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь им, триоксид мышьяка (Trisenox). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с неорганическим арсенатом при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является резистентным острым промиелоцитарным лейкозом (APL).

Ингибиторы микроканальцев (в используемом здесь значении “ингибитор микроканальцев” является любым средством, которое препятствует агрегации или дезагрегации микроканальцев), пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, винкристин (Oncovin), винбластин (Velban), паклитаксель (Taxol, Paxene), винорелбин (Navelbine), доцетаксель (Taxotere), эпотилон В, или D, или их производные и дискодермолид или его производные. Тубулинсвязывающие противораковые средства и их пролекарства, которые могут быть использованы при осуществлении способов по настоящему изобретению, описаны в заявке на патент РСТ № РСТ/US2005/042095, Matteucci et al.; заявках на патент США, озаглавленных “Tubulin Binding Anti Cancer Agents and Prodrugs Thereof” (номера дел поверенного 021305-008500US, 021305-008400US и 021305-004520US). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с ингибитором микроканальцев при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является раком яичника, раком молочной железы, немелкоклеточным раком легкого, саркомой Капоши и метастазирующим раком молочной железы или яичника. В качестве одного примера можно привести соединение 22-оксовинкалейкобластин, широко известное также как винкристин, которое является алкалоидом, получаемым из барвинка (Vinca rosea, Linn.) и используемым при лечении острого лейкоза. Установлено, что указанное лекарственное средство пригодно для использования в комбинации с другими онколитическими средствами при лечении болезни Ходжкина, лимфосаркомы, ретикулосаркомы, рабдомиосаркомы, нейробластомы и опухоли Вильма. Винкристин вводят в виде еженедельных внутривенных инъекций в дозах, равных 2 мг/м2, для детей и 1,4 мг/м2 для взрослых. В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с винкристином, используемым в указанных дозах. В одном варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора не применяют до начала лечения ингибитором микроканальцев, таким как таксан, а вводят одновременно или через несколько дней, или через неделю после начала лечения ингибитором микроканальцев.

Модификаторы, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь им, лейковорин (Wellcovorin), который применяют для лечения рака прямой и ободочной кишки вместе с другими лекарственными средствами, такими как 5-фторурацил. В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с модификатором и другим противораковым средством при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является раком ободочной кишки. В одном варианте осуществления изобретения модификатор является соединением, повышающим способность клетки поглощать глюкозу, которое включает, не ограничиваясь им, соединение N-гидроксимочевины. Установлено, что N-гидроксимочевина усиливает способность клетки поглощать 2-дезоксиглюкозу (см. публикацию Smith et al., 1999, Cancer Letters 141:85, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки), и введение N-гидроксимочевины в дозах, которые, как известно, увеличивают поглощение 2-дезоксиглюкозы, для лечения лейкоза совместно с 2-дезоксиглюкозой и пролекарством фосфорамидатного алкилатора по настоящему изобретению является одним вариантом осуществления способов лечения по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления изобретения пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят при лечении рака совместно с оксидом азота или предшественником оксида азота, таким как органический нитрит или нитрат спермина, так как указанные последними соединения стимулируют поглощение глюкозы.

Нитрозомочевины, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, прокарбазин (Matulane), ломустин, CCNU (CeeBU), кармустин (BCNU, BiCNU, Gliadel Wafer) и эстрамустин (Emcyt). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с нитрозомочевиной при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является раком предстательной железы или глиобластомой, включая рецидивирующую мультиформную глиому.

Аналоги нуклеозидов, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, меркаптопурин, 6-МР (Purinethol), фторурацил, 5-FU (Adrucil), тиогуанин, 6-TG (Thioguanine), гидроксимочевину (Hydrea), цитарабин (Cytosar-U, DepoCyt), флоксуридин (FUDR), флударабин (Fludara), азацитидин (Vidaza), пентостатин (Nipent), кладрибин (Leustatin, 2-CdA), гемцитабин (Gemzar) и капецитабин (Xeloda). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с аналогом нуклеозида при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является В-клеточным лимфолейкозом (CLL), волосковоклеточным лейкозом, аденокарциномой поджелудочной железы, метастазирующим раком молочной железы, немелкоклеточным раком легкого или метастазирующим раком прямой и ободочной кишки. В качестве одного примера можно привести соединение 5-фтор-2,4-(1Н,3Н)пиримидиндион, также широко известное как 5-фторурацил, которое представляет собой аналог нуклеозида и является антиметаболитом, позволяющим эффективно облегчать рак ободочной кишки, прямой кишки, молочной железы, желудка и поджелудочной железы у субъектов, которые считаются неоперабельными или не поддаются лечению другими средствами. 5-Фторурацил вводят в курсе начальной терапии в дозах, равных 12 мг/м2, в виде внутривенных инъекций один раз в день в течение 4 последовательных дней, при этом суточная доза не превышает 800 мг. При отсутствии токсичности в течение всего курса лечения внутривенно вводят 6 мг/кг на 6-й, 8-й, 10-й и 12-й дни. Лечение не проводят на 5-й, 7-й, 9-й или 11-й дни. Субъектам, находящимся в состоянии повышенного риска, или субъектам с нарушением питания в течение трех дней вводят суточную дозу, равную 6 мг/кг, при этом суточная доза не превышает 400 мг. При отсутствии токсичности во время лечения можно ввести 3 мг/кг на 5-й, 7-й и 9-й дни. Лечение не проводят на 4-й, 6-й или 8-й дни. Курс лечения определяет последовательность инъекций в каждой схеме лечения. В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с 5-FU, используемым в указанных дозах, или с пролекарством Xeloda при использовании правильно подобранных доз. В качестве другого примера можно привести соединение 2-амино-1,7-дигидро-6Н-пурин-6-тион, также широко известное как 6-тиогуанин, которое является аналогом нуклеозида, позволяющим эффективно лечить острые нелимфоцитарные лейкозы. 6-Тиогуанин вводят перорально в дозах около 2 мг/кг массы тела в сутки. Общая суточная доза может быть введена за один раз. Если после четырех недель введения указанной дозы не происходит улучшения, доза может быть осторожно увеличена до 3 мг/кг/сутки. В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с 6-TG, используемым в указанных дозах (или более низких дозах).

Ингибиторы остеокластов, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь им, памидронат (Aredia). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с ингибитором остеокластов при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак представляет собой остеолитические костные метастазы рака молочной железы, и при лечении данного заболевания пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят также совместно с одним или несколькими дополнительными противораковыми средствами.

Соединения платины, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, цисплатин (Platinol) и карбоплатин (Paraplatin). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с соединением платины при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является метастазирующим раком яичка, метастазирующим раком яичника, раком яичника и переходно-клеточным раком мочевого пузыря. В качестве одного примера можно привести соединение цис-диаминдихлорплатину (II), широко известное как цисплатин, которое применяют для временного облегчения метастазирующего рака яичка и яичника и для лечения переходно-клеточного рака мочевого пузыря, не подлежащего хирургическому лечению или лучевой терапии. Цисплатин, применяемый для лечения запущенного рака мочевого пузыря, вводят в виде внутривенных инъекций в дозах, равных 50-70 мг/м2, один раз в три-четыре недели. В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с цисплатином, используемым в указанных дозах (или более низких дозах). Вместе с соединением платины и пролекарством фосфорамидатного алкилатора можно вводить одно или несколько дополнительных противораковых средств. В качестве одного примера можно привести платинол, бленоксан и велбам, которые можно вводить совместно с пролекарством фосфорамидатного алкилатора. В качестве другого примера можно привести платинол и адриамицин, которые можно вводить совместно с пролекарством фосфорамидатного алкилатора.

Ретиноиды, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, третиноин, ARTA (Vesanoid), алитретиноин (Panretin) и бексаротен (Targretin). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с ретиноидом при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является раком, выбираемым из группы, включающей APL, саркому Капоши и Т-клеточную лимфому.

Ингибиторы топоизомеразы 1, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, топотекан (Hycamtin) и иринотекан (Camptostar). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с ингибитором топоизомеразы 1 при лечении рака. Ингибиторы топоизомеразы и их пролекарства, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, описаны в заявке на патент РСТ № РСТ/US2005/041959, Matteucci et al. В одном варианте осуществления изобретения рак является метастазирующим раком яичника, ободочной или прямой кишки, мелкоклеточным раком легкого. Однако, как было указано выше, в одном варианте осуществления способов по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят до или после либо до и после введения ингибитора топоизомеразы 1, но не одновременно с введением указанного ингибитора.

Ингибиторы топоизомеразы 2, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь ими, этопозид, VP-16 (Vepesid), тенипозид, VM-26 (Vumon) и фосфат этопозида (Etopophos). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с ингибитором топоизомеразы 2 при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является раком, выбираемым из группы, включающей резистентные опухоли яичка, резистентный острый лимфобластный лейкоз (АLL) и мелкоклеточный рак легкого. Однако, как было указано выше, в одном варианте осуществления способов по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят до или после либо до и после введения ингибитора топоизомеразы 2, но не одновременно с введением указанного ингибитора.

Ингибиторы тирозинкиназы, пригодные для использования при осуществлении способов по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь им, иматиниб (Gleevec). В соответствии со способами по настоящему изобретению пролекарство фосфорамидатного алкилатора вводят совместно с ингибитором тирозинкиназы при лечении рака. В одном варианте осуществления изобретения рак является CML, метастазирующей или неоперабельной злокачественной стромальной опухолью желудочно-кишечного тракта.

Аналоги лонидамина, пригодные для использования при осуществлении настоящего изобретения, описаны в заявках на патенты США №№ 11/346632, 60/764427, 60/764438, Matteucci et al.; в заявках, озаглавленных “Heterocyclic Lonidamine Analogs” (декларация поверенного № 021305-007220US; 021305-007900US), и публикациях РСТ WO 2006/015191, WO 2006/015263 и WO 2006/01007 A2.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способам лечения рака, в соответствии с которыми субъекту вводят пролекарство фосфорамидатного алкилатора или его фармацевтически приемлемую соль и одно или несколько дополнительных противораковых средств. Конкретные варианты других противораковых средств, пригодных для использования в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь ими, 5-метил-6-[[(3,4,5-триметоксифенил)амино]метил]-2,4-хиназолиндиамин или его фармацевтически приемлемую соль; (8S,10S)-10-(3-амино-2,3,6-тридезоксиальфа-L-ликсогексопиранозил)окси]-8-гликолоил-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-1-метокси-5,12-нафтацендион или его фармацевтически приемлемую соль; 5-фтор-2,4(1Н,3Н)пиримидиндион или его фармацевтически приемлемую соль; 2-амино-1,7-дигидро-6Н-пурин-6-тион или его фармацевтически приемлемую соль; 22-оксовинкалейкобластин или его фармацевтически приемлемую соль; 2-оксид 2-бис[(2-хлорэтил)амино]тетрагидро-2Н-1,3,2-оксазафосфорина или его фармацевтически приемлемую соль; N-[4-[[2,4-диамино-6-птеридинил)метил]метиламино]бензоил]-L-глутаминовую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль; цисдиаминодихлорплатину (II).

IV. Примеры

Любая ссылка в приведенных ниже примерах на соединение, обозначенное буквой, относится к структуре, изображенной рядом или выше указанной буквы на соответствующих схемах реакций.

Синтез

Способы синтеза пролекарств фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению приведены в разделе IIb. Исходные вещества, использованные в способах синтеза пролекарств фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению, были по возможности приобретены у коммерческих производителей, таких как, например, Sigma-Aldrich Co. 1-N-Метил-2-нитроимидазол-5-метанол был приобретен в компании Syngene, India. Исходные вещества, которые нельзя приобрести коммерческим путем, могут быть синтезированы стандартными методами, описанными в научной литературе. С такими методами можно ознакомиться при помощи инструментальных средств поиска литературы, такого как SciFinder, предоставляемого Американским химическим обществом, или Beilstein в программном обеспечении MDL.

Чувствительные к влаге соединения, такие как, например, POCl3 и PCl3 и их моно- и дихлорпроизводные, подвергали взаимодействию с использованием безводных растворителей и в атмосфере азота или аргона. Продукт выделяли из реакционной смеси путем соответствующей обработки с последующим выполнением ваккуумной перегонки, кристаллизации, хроматографии на колонках или препаративной тонкослойной хроматографии. Приемлемый элюент для хроматографии соединения на колонках можно определить при ознакомлении с настоящим описанием изобретения и/или путем измерения Rf соединения при помощи тонкослойной хроматографии и выбора растворителя, который позволяет отделить требуемое соединение от нежелательных соединений. Выбор конкретного элюента может зависеть наряду с другими факторами от полярности соединения, существования других близко элюируемых соединений, типа используемой стационарной фазы, такой как силикагель или оксид алюминия, и величины давления, используемого для элюирования растворителя в стационарной фазе. На практике для отделения одного и того же соединения могут быть использованы разные составы растворителей.

Отделенные соединения анализировали в отношении чистоты стандартными аналитическими методами, такими как ТСХ, ЯМР-спектроскопия и ЖХ-МС, и хранили в морозильной камере или холодильнике во избежание воздействия влаги, света или воздуха. Исходные растворы соединений пролекарств фосфорамидатных алкилаторов получали в ДМСО и хранили в морозильной камере.

Пример 1

Синтез соединения 23

К раствору 5-нитрофурфурилового спирта (200 мг, 1,4 ммоль) в ТГФ (10 мл) при -78°С в виде одной порции добавляли POCl3 и затем по каплям добавляли триэтиламин (TEA, 0,22 мл, 1,54 ммоль). Температуру повышали до -30°С в течение одного часа, добавляли гидрохлорид 2-хлорэтиламина и затем ТЕА (1 мл, 7 ммоль). Температуру повышали до комнатной температуры, взаимодействие продолжали еще в течение одного часа, затем реакционную смесь гасили водой и отделяли органический слой. Водный слой экстрагировали DCM, объединенный органический раствор сушили и концентрировали. Соединение 23 отделяли флэш-хроматографией на колонках и анализировали при помощи ЖХ/МС и ЯМР-спектроскопии, результаты которых свидетельствовали о чистоте продукта.

Пример 2

Синтез соединения 5

Суспензию хлорида N-метил-2-хлорэтиламмония (10 мг) в POCl3 (40 мл) нагревали с обратным холодильником (135°С) в течение ночи. Избыток POCl3 удаляли в вакууме, продукт 5i отгоняли в вакууме в виде светло-желтого масла и анализировали при помощи1Н и31Р ЯМР-спектроскопии, результаты которой свидетельствовали о чистоте продукта.

К раствору соединения 5i (1 мг, 4,75 ммоль) и хлорида N-метил-2-хлорэтиламмония (0,62 мг, 4,75 ммоль) в ТГФ при -78°С медленно добавляли диизопропилэтиламин (DIEA, 1,65 мл, 9,5 ммоль) и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение одного часа, разбавляли этилацетатом и промывали насыщенным раствором соли. Органический слой сушили над MgSO4 и концентрировали с образованием остатка, который отделяли флэш-хроматографией, получая при этом соединение 5ii в виде масла.

К раствору N-метил-2-нитроимидазол-5-метанола (0,5 г, 3,2 ммоль) в диметоксиэтане (DME) добавляли бис(триметилсилил)амид лития (3,2 ммоль, 3,2 мл, 1М раствор в ТГФ) при -78°С. Через 5 минут добавляли соединение 5ii (2,9 ммоль, 770 мг) и реакционную смесь нагревали до -20°С, разбавляли этилацетатом и промывали насыщенным раствором соли. Органический слой сушили над MgSO4 и концентрировали. Продукт очищали флэш-хроматографией с использованием 6-12% метанола в DCM, получая при этом соединение 5.

Соединения 8 и 16 были синтезированы способом, использованным для получения соединения 5.

Пример 3

Синтез соединения 35

К раствору этаноламина (6,03 мл, 100 ммоль) и К2СО3 (13,8 г, 100 ммоль) в ДМФА (38 мл) по каплям добавляли раствор пара-толуолсульфонилхлорида (19 г, 100 ммоль) при комнатной температуре и реакционную смесь нагревали до 120°С (температура бани). К реакционной смеси добавляли К2СО3 (27,6 г, 200 ммоль), затем по каплям добавляли 1,3-дибромпропан (10 г, 50 ммоль). Реакционную смесь нагревали в течение более двух часов, охлаждали до комнатной температуры, выливали в воду (250 мл) и экстрагировали этилацетатом. Органический слой сушили над Na2SO4 и концентрировали с образованием соединения 35а в виде желтого масла, которое использовали при выполнении следующей реакции.

Раствор соединения 35а (5 г) в водном растворе HBr (48%, 50 мл) перегоняли для удаления водной части (примерно 20 мл) и реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 40 часов. Затем перегонкой удаляли дополнительную водную часть (5 мл) и реакционную смесь нагревали с обратным холодильником (4 часа). Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли водой (20 мл) и фильтровали через подушку из целита. Фильтрат концентрировали досуха с образованием остатка, который трижды упаривали вместе с этанолом, затем добавляли большой объем ацетона, твердый продукт 35b белого цвета фильтровали, дважды промывали ацетоном и использовали на описанном ниже этапе фосфорилирования.

Суспензию соединения 35b (1 г) в POCl3 (14 мл) нагревали при 130°С в течение примерно 14 часов и избыток POCl3 удаляли в вакууме при 130°С (температура бани). Остаток очищали хроматографией на колонке с силикагелем, используя 10-80% смесь ЕТОАс/гексана, с образованием продукта 35с, который превращали в соединение 35 по настоящему изобретению способом, описанным в примере 2, путем отделения хроматографией на колонке с силикагелем с использованием 10-80% смеси ацетона/толуола в качестве элюента.

Пример 4

Синтез соединения 7

Соединение 7 было получено при использовании хлорида N-циклопропил-2-хлорэтиламмония в соответствии с приведенной ниже схемой реакций

К раствору циклопропиламина (25 г) в сухом ТГФ (30 мл) по каплям добавляли раствор 2-бромэтанола (17,6 г, 0,141 моль) в 30 мл ТГФ в течение 35 минут. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре и нагревали при 50°С в течение 75 минут. Реакционную смесь охлаждали и концентрировали с образованием оранжевого масла, к которому добавляли раствор гидроксида натрия (7 г) в воде (50 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 минут и 4 раза экстрагировали этилацетатом (75 мл). Объединенный органический слой сушили (MgSO4) и упаривали с образованием оранжевого маслянистого остатка. Остаток перегоняли в вакууме при 53-56°С (1 мм Hg), получая при этом промежуточный спирт (5,94 г, выход 42%) в виде прозрачной, бесцветной жидкости, которая по результатам анализов ЖХ/МС и1Н ЯМР была признана чистой.

К раствору промежуточного спирта (3,7 г, 36,6 ммоль) в сухом ТГФ (30 мл) добавляли раствор HCl в диоксане (4,0 М, 18,3 мл, 73,2 ммоль). Реакционную смесь охлаждали до 0°С и при помощи шприца добавляли SOCl2 (6,50 г, 54,9 ммоль). Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником (6 часов), охлаждали и концентрировали с образованием остатка. Остаток растирали в сухом эфире (100 мл), фильтровали и остаточные летучие вещества удаляли в вакууме, получая при этом соединение 7i (5,42 г, выход 95%), которое по результатам анализа1Н ЯМР было признано чистым.

Соединение 7i (3,00 г, 19,2 ммоль) добавляли к POCl3 (15 мл) и нагревали с обратным холодильником в атмосфере азота в течение 7,5 часа. Реакционную смесь концентрировали и образовавшееся масло подвергали вакуумной перегонке в аппарате для молекулярной перегонки, получая при этом соединение 7ii в виде прозрачного, светло-желтого масла (3,6 г, выход 79%), которое по результатам анализа1Н ЯМР было признано чистым.

Соединение 7ii (0,50 г, 2,11 ммоль) и гидрохлорид N-циклопропил-2-хлорэтиламина (0,33 г, 2,11 ммоль) объединяли в сухом ТГФ в атмосфере аргона. Реакционную смесь охлаждали до -78°С и при помощи шприца медленно добавляли DIEA (0,545 г, 4,22 ммоль), медленно нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 1,5 часа и концентрировали с образованием оранжевого маслянистого остатка. Остаток отделяли флэш-хроматографией на силикагеле, используя 0-50% гексана в этилацетате, в результате было получено 315 мг (47% от теоретического значения) бледно-желтого масла, которое по результатам анализа МС было признано соединением 7iii.

N-Метил-2-нитроимидазол-5-метанол (76,8 мг, 0,489 ммоль) частично растворяли в сухом ТГФ (2 мл) в атмосфере аргона. Реакционную смесь охлаждали до -78°С и добавляли раствор бис(триметилсилил)амида лития в ТГФ (1,6 М, 0,306 мл, 0,489 ммоль). Через 15 минут добавляли раствор соединения 7iii (172 мг, 0,538 ммоль) в 2 мл ТГФ. Через 15 минут реакционную смесь медленно нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 2 часов, выливали в 25 мл воды и трижды экстрагировали этилацетатом (30 мл). Объединенные органические слои сушили над MgSO4 и концентрировали с образованием желтого маслянистого остатка. Остаток отделяли флэш-хроматографией в 0-10% метанола в DCM, получая при этом соединение 7 (110 мг, выход 51%) в виде желтого масла, которое по результатам анализов ЖХ-МС и1Н ЯМР было признано чистым.

Пример 5

Синтез соединений 6 и 15

К суспензии хлорида бис(2-хлорэтил)аммония (1,43 г, 8,01 ммоль) в дихлорметане (DCM) добавляли трихлорид фосфора (0,32 мл, 3,64 ммоль) при комнатной температуре и затем добавляли ТЕА (3,05 мл, 21,84 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут и затем добавляли N-метил-2-нитроимидазолилметанол (0,474 г, 3,31 ммоль) в DME. Реакционную смесь перемешивали в течение 0,5 часа, охлаждали до -20°С и добавляли трет-бутилгидропероксид (0,7 мл, 3,82 ммоль, 5,5 М раствор в декане). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры в течение одного часа и выливали в 10% водный раствор HCl. Органический слой отделяли и водный слой экстрагировали DCM. Объединенный органический раствор сушили над MgSO4 и концентрировали с образованием остатка, который очищали флэш-хроматографией с 6-12% метанола в DCM, получая при этом соединение 6.

Соединение 15 было синтезировано способом, описанным выше для синтеза соединения 6.

Пример 6

Синтез соединений 23, 26 и 36

К раствору N-метил-2-нитроимидазол-5-метанола (180 мг, 1,14 ммоль), трифенилфосфина (300 мг, 1,14 ммоль) и иприта изофосфорамида (1с, 127 мг, 0,57 ммоль) в ТГФ (10 мл) по каплям добавляли диизопропилазодикарбоксилат (DIAD, 0,22 мл, 1,14 ммоль) при комнатной температуре. Через два часа реакционную смесь концентрировали и остаток отделяли флэш-хроматографией с 30-100% ацетона в толуоле, получая при этом соединение 36.

Соединения 23 и 26 были синтезированы способом, описанным в примере 6.

Пример 7

Синтез соединения 1

N-Метил-2-нитроимидазол-5-метанол (50 мг, 0,318 ммоль) растворяли в сухом ТГФ (2 мл) в атмосфере азота. Раствор охлаждали до -78°С и при помощи шприца добавляли раствор бис(триметилсилил)амида лития (1М раствор в толуоле, 0,35 мл, 0,35 ммоль). Через 5 минут добавляли раствор дихлорида бис(хлорэтил)фосфорамида (91 мг, 0,35 ммоль) в ТГФ (2 мл). Реакционную смесь перемешивали при 78°С в течение 30 минут, температуру понижали до -20°С, используя баню со смесью NaCl со льдом, и в течение 5 минут через реакционную смесь барботировали безводный аммиак. Реакционную смесь продували азотом, нагревали до комнатной температуры, выливали в 25 мл воды и экстрагировали этилацетатом (4×25 мл). Объединенные органические слои сушили (MgSO4) и концентрировали с образованием бледно-желтого масла, которое отделяли флэш-хроматографией на силикагеле, используя 0-10% метанола в дихолорметане, в результате чего было получено соединение 1 (32 мг, выход 28%) в виде масла, которое затвердевало при выстаивании и по результатам анализов ЖХ/МС и1Н ЯМР было признано чистым.

Пример 8

Синтез соединений 25, 26

К раствору бромида 2-бромэтиламмония (19,4 г) в DCM (90 мл) при -10°С добавляли раствор POCl3 (2,3 мл) в DCM (4 мл) и затем ТЕА (14,1 мл) в DCM (25 мл). Реакционную смесь фильтровали, фильтрат концентрировали примерно до 30% от исходного объема и фильтровали. Остаток промывали DCM (3×25 мл) и объединенные порции DCM концентрировали с образованием твердого вещества, к которому добавляли смесь ТГФ (6 мл) и воды (8 мл). ТГФ удаляли в роторном испарителе, полученный раствор охлаждали в течение ночи в холодильнике. Образовавшийся осадок фильтровали, промывали водой (10 мл) и простым эфиром (30 мл) и сушили в вакууме с образованием 2,1 г соединения

Иприт изофосфорамидата

может быть синтезирован способом, описанным в примере 8, при использовании хлорида 2-хлорэтиламмония вместо бромида 2-бромэтиламмония. Синтез иприта изофосфорамида описан в научной литературе (см., например. приведенную выше публикацию Wiessler et al.).

Токсин фосфорамидатного алкилатора:

превращали в соединения 24 и 25 способом, описанным в примере 6, с использованием соответствующего триггера-ОН.

Пример 9

Синтез соединений 37-105

Нижеследующие соединения 37-105 были синтезированы в результате выполнения реакции сочетания Мицунобу, описанной выше для синтеза соединения 25 или 36, соответствующей замены триггера-ОН и использования аналога иприта ифосфамида. Например, для синтеза соединений 40, 81, 83, 87, 89, 95, 96, 100 и 104 был использован аналог иприта ифосфамида НОР(=O)(NHCH2CH2Cl)2; для синтеза соединений 50, 53, 55, 56, 58-65, 68-71, 73-75, 77-80, 82, 84-86, 88, 90-92, 94, 97-99, 101-103 и 105 был использован аналог иприта ифосфамида НОР(=О)(NHCH2CH2Br)2; для синтеза соединений 37, 39, 52, 54 и 93 был использован аналог иприта ифосфамида, являющийся R-энантиомером НОР(=О)(NHCHMeCH2Cl)2; для синтеза соединений 38, 41, 51 и 57 был использован аналог иприта ифосфамида, являющийся S-энантиомером НОР(=О)(NHCHMeCH2Cl)2; для синтеза соединений 43-45 и 49 был использован аналог иприта ифосфамида, являющийся R-энантиомером НОР(=О)(NHCH(CHMe2)CH2Cl)2; и для синтеза соединений 46-48 был использован аналог иприта ифосфамида, являющийся S-энантиомером НОР(=О)(NHCH(CHMe2)CH2Cl)2.

Разные соединения триггера-ОН, использованные для синтеза соединений 37-105, включали следующие соединения триггера-ОН: 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-метанол, 1-N-метил-5-нитроимидазол-2-метанол, 5-нитрофуран-2-метанол, 5-нитротиофен-2-метанол;

Приведенные ниже соединения были получены способом, описанным в примере 6.

В примерах 10-26 описан синтез разных соединений триггера-ОН, использованных для синтеза пролекарств фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению.

Пример 10

Синтез соединения 52i

Раствор соединения 52ii (100 мг, 0,48 ммоль), соединения 52iii (73 мг, 0,48 ммоль) и КОАс (190 мг, 1,92 ммоль) в ДМФА (5 мл) трижды дегазировали и добавляли PdCl2 (dppf) (36 мг, 0,048 ммоль) при комнатной температуре в атмосфере аргона. Реакционную смесь нагревали при 60°С в течение двух часов, разбавляли этилацетатом (ЕА) и промывали насыщенным раствором соли. Органический слой сушили, концентрировали и остаток отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента этилацетат/гексан (0-80%), в результате было получено соединение 52i.

Соединения 55i, 63i, 59i, 65i и 68i были получены аналогичным образом в соответствии с приведенными ниже схемами реакций:

Пример 11

К раствору соединения 68ii (100 мг, 0,31 ммоль) и 3-амино-1-пропанола (0,047 мл, 0,62 ммоль) в ТГФ (2,5 мл) добавляли DIEA (0,162 мл, 0,93 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи и концентрировали с образованием остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента этилацетат/гексан (0-80%), в результате было получено соединение 68i.

Соединение 69i было получено аналогичным образом в соответствии с приведенной ниже схемой реакций:

Пример 12

К раствору соединения 70ii (100 мг, 0,87 ммоль) и соединения 70iii (112 мг, 0,87 ммоль) в ацетоне (8 мл) добавляли К2СО3 (78,6 мг, 0,87 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали при 60°С, перемешивая в течение 1 часа, фильтровали и концентрировали с образованием остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя этилацетат/гексан (0-60%), в результате было получено соединение 70i.

Соединение 51i было получено аналогичным образом в соответствии с приведенной ниже схемой реакций:

Пример 13

(Триггеры НАР - проверить номера)

Раствор соединения 59ii (200 мг, 0,96 ммоль) и соединения 59iii (127 мг, 0,96 ммоль) в ДМФА (3 мл) трижды дегазировали, добавляли PdCl2 (dppf) (50 мг, 0,07 ммоль), затем CuI (8,5 мг, 0,043 ммоль) и ТЕА (0,27 мл, 1,92 ммоль) при комнатной температуре в атмосфере аргона и реакционную смесь нагревали при 60°С в течение двух часов. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом, промывали насыщенным раствором соли, органический слой отделяли, сушили и концентрировали с образованием остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента этилацетат/гексан (0-70%), в результате было получено соединение 58i.

Пример 14

К суспензии соединения 67i (472 мг, 2,69 ммоль) в DCM (20 мл) добавляли фенилдихлорфосфат (0,2 мл, 1,34 ммоль) при -20°С, затем по каплям добавляли ТЕА (0,75 мл, 5,38 ммоль) и смесь перемешивали. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и выливали в насыщенный раствор соли, органический слой отделяли и водный слой экстрагировали DCM. Объединенные органические слои сушили над MgSO4 и концентрировали. Остаток отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента этилацетат/гексан (10-100%), в результате было получено соединение 67ii. К раствору соединения 67ii (42 мг) в EtOH (5 мл) добавляли оксид платины(IV) (20 мг), реакционную смесь дегазировали и интенсивно перемешивали в атмосфере водорода в течение 0,5 часа. Реакционную смесь разбавляли МеОН, фильтровали через фильтр с впрыскиванием, фильтрат концентрировали в вакууме и упаривали вместе с толуолом, получая при этом соединение 67iii. Соединение 67iii подвергали взаимодействию с 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-метанолом в результате выполнения реакции Мицунобу, описанной в способе синтеза соединения 36.

Пример 15

Синтез соединений 106 и 107

К раствору 5-нитрофурфурилового спирта (200 мг, 1,4 ммоль) в ТГФ (10 мл) добавляли POCl3 (0,13 мл, 1,4 ммоль) при -78°С и затем по каплям добавляли ТЕА (0,216 мл, 1,54 ммоль). Температуру реакции повышали до -10°С в течение 1 часа, добавляли гидрохлорид 2-(фенилсульфонил)этиламина (832 мг, 3,5 ммоль) и затем добавляли ТЕА (1 мл, 7 ммоль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 1 часа, гасили водой и отделяли органический слой. Водный слой дважды экстрагировали DCM, объединенные органические слои сушили и концентрировали с образованием остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента ацетон/толуол (30-100%), в результате был получен продукт 106. Соединение 107

было синтезировано аналогичным способом.

Представленные ниже соединения 108-112

были синтезированы способом, описанным для синтеза соединения 35 в примере 3, при замене соединения

соединением

.

Пример 16

Синтез соединений 113-117

Соединение 113 было синтезировано способом, описанным в примере 7. К раствору соединения 113ii (181 мг, 1,16 ммоль) в ТГФ (8 мл) по каплям добавляли LiN(TMS)2 (1,2 мл, 1 М раствор в ТГФ, 1,2 ммоль) при -78°С и затем добавляли соединение 1i. Реакционную смесь нагревали до -20°С и в течение 5 минут через реакционную смесь барботировали NH3. К реакционной смеси добавляли воду (20 мл) и трижды экстрагировали этилацетатом (30 мл). Объединенные органические слои сушили и концентрировали с образованием остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя ацетон/толуол (30-100%), в результате было получено соединение 113.

Соединения 114-117 были синтезированы способом, описанным для соединения 13, при замене

соответствующим триггером-ОН, используемым в качестве исходного вещества.

Пример 17

Синтез октадейтерированного ифосфамида и соединения 64 (октадейтерированное соединение 25)

48% HBr (60 мл) по каплям добавляли к d4-этаноламину при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем осторожно нагревали с обратным холодильником, медленно перегоняли и в течение 2 часов собирали 16 мл жидкости, пока температура не повышалась до 155°С (масляная баня). Указанную процедуру повторяли дважды, используя 60 мл 48% HBr, и продолжали перегонку в течение еще 5 часов. Было собрано 90 мл жидкости. Полученный раствор нагревали при 165°С в течение 2 часов и упаривали в вакууме. Остаток перекристаллизовывали из абсолютного этанола (10 мл) и этилацетата (30 мл), в результате чего было получено 11,3 г гидробромида d4-2-бромэтамина (соединение 64i). Соединение 64i (19,5 ммоль, 1,0 экв.) по каплям добавляли к суспензии гидробромида d4-2-бромэтамина (40,0 ммоль, 2,05 экв.) в сухом DCM (100 мл) в атмосфере аргона при -20°С и затем по каплям добавляли ТЕА (81,9 ммоль, 4,2 экв.) при -20°С. Реакционную смесь перемешивали при -20°С в течение 0,5 часа и при комнатной температуре в течение 2 часов, выливали в воду и дважды экстрагировали DCM (30 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором соли, сушили над Na2SO4 и концентрировали при пониженном давлении с образованием остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента гексан/этилацетат (100:70 (об/об)), в результате чего было получено 7,0 г соединения 64ii. К раствору соединения 64ii (7,0 г) в МеОН (160 мл) добавляли PtO2 (0,7 г), реакционную смесь дегазировали, трижды заменяя атмосферу Н2, перемешивали в атмосфере Н2 в течение 3 часов при комнатной температуре и разбавляли МеОН до растворения белого твердого вещества в реакционной смеси. Разбавленную реакционную смесь фильтровали, фильтрат концентрировали при пониженном давлении с образованием остатка, который дважды промывали безводным простым эфиром, получая 2,9 г соединения 64iii. К суспензии соединения 64iii (1,92 г, 1,0 экв.) 1-N-метил-2-нитроимидазолметанола (1,01 г, 1,1 экв.) и PPh3 (2,39 г, 1,5 экв.) в ТГФ (20 мл) добавляли DIAD (1,76 мл, 1,5 экв.) в атмосфере аргона при 0°С. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов, нагревая от 0°С до комнатной температуры, после чего удаляли летучие вещества в ваккууме с образованием остатка. Остаток отделяли флэш-хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюента ацетон/толуол (100:70 (об/об)), в результате было получено 1,35 г соединения 64.

Пример 18

Синтез соединения 2i

Виниловое производное 2iii было синтезировано в соответствии с описанием, приведенным в публикации Cavalleri et al., J. Het. Chem., 1972, 9:979, и подвергнуто оксимеркурированию следующим образом. Hg(OАc)2 (208 мг, 0,653 ммоль) растворяли в воде (0,7 мл) и ТГФ (0,7 мл) и добавляли соединение 2iii (100 мг, 0,653 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часа, порциями добавляли NaBH4 (25 мг), перемешивали в течение 15 минут, выливали в воду и экстрагировали этилацетатом, этилацетатный слой сушили и концентрировали с образованием остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюенте этилацетат/гексан (0-100%), в результате было получено соединение 2i (16 мг).

Пример 19

Синтез соединения 94i

Раствор соединения 94iii (7,1 г) в Ac2O (9,7 мл) по каплям добавляли в раствор дымящей азотной кислоты (1,5 мл) в АсОН (12 мл) при 0°С. Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры, перемешивали в течение 1 часа, по каплям добавляли дымящую азотную кислоту (1 мл) и перемешивали в течение 1,5 часа. Реакционную смесь выливали в воду, экстрагировали этилацетатом, этилацетатный слой сушили и концентрировали с образованием остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента этилацетат/гексан (0-100%), в результате было получено соединение 94ii. Соединение 94ii (600 мг, 1,77 ммоль) суспендировали в метаноле (10 мл) при 0°С и в реакционную смесь порциями добавляли NaBH4 (141 мг) в течение 5 минут. NaBH4 (100 мг) трижды добавляли через каждый час, реакционную смесь перемешивали в течение 3,5 часа, выливали в воду и экстрагировали этилацетатом, этилацетатный слой сушили и концентрировали с образованием остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента этилацетат/гексан (0-100%), в результате было получено соединение 94i (289 мг) в виде желтого твердого вещества.

Пример 20

Синтез соединения 96i

Смесь соединения А (1,4 г), CuCN (0,56 г) и ДМФА (25 мл) перемешивали при 140°С в течение 35 минут, выливали на 300 мл измельченного льда и перемешивали в течение 10 минут. Реакционную смесь фильтровали и остаток отделяли хроматографией на колонке, используя в качестве элюента гексан/этилацетат (от 1:0 до 2:3), в результате чего было получено соединение 96iii в виде желтого масла (617 мг). Соединение 96iii превращали в спирт 96i и отделяли хроматографией на колонке в соответствии со способом получения соединения 94iii, используя при выполнении данной реакции в качестве растворителя ТГФ вместо МеОН.

Пример 21

Синтез соединения 99i

Смесь соединения 99ii (500 мг), PdCl2(PPh3)2 (208 мг) и CuI (56,4 мг) суспендировали в ТЕА (15 мл), реакционную смесь дегазировали и 6 раз продували Ar. Через реакционную смесь барботировали пропин в течение 15 минут и взаимодействие продолжали в атмосфере пропина на бане с температурой 50°С в течение 2 часов. Реакционную смесь выливали в этилацетат и фильтровали, фильтрат концентрировали с образованием остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента этилацетат/гексан (0-100%), в результате было получено соединение 99i (286 мг).

Пример 22

Синтез сложного этилового эфира 1-N-метил-2-аминоимидазол-5-карбоновой кислоты

Этилформиат (500 мл) добавляли к гидрохлориду сложного метилового эфира саркозина (82 г, 585,7 ммоль, измельченный в порошок до выполнения реакции), находящемуся в круглодонной колбе емкостью 1 л. Реакционную смесь охлаждали на бане со смесью воды со льдом и перемешивали, к колбе присоединяли патрубок для отвода газа, медленно добавляли NaH (60% масляная суспензия, 54 г, 1,35 моль) в течение 2 часов и перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 14 часов. Летучие вещества удаляли в роторном испарителе с образованием остатка, который дважды растирали в гексане (500 мл), получая при этом липкую светло-коричневую пасту, которую растворяли в этаноле (400 мл) и концентрированной HCl (50 мл) и перемешивали при 110°С в течение 1,5 часа. Реакционную смесь охлаждали, белый осадок отфильтровывали и остаток дважды промывали 25 мл этанола. Фильтрат упаривали с образованием густого коричневого масла, к которому добавляли 10% водный раствор НОАс, Н2NCN (45 г, 1,07 моль) и ацетат натрия (88 г, 1,07 моль). Реакционную смесь перемешивали при 90-100°С в течение 1,5 часа с образованием прозрачного раствора, который охлаждали, значение рН доводили до 1, используя концентрированную HCl, и полученный раствор концентрировали до 1/5 первоначального объема в роторном испарителе при температуре не выше 45°С. Концентрированную реакционную смесь осторожно нейтрализовали, добавляя К2СО3 до значения рН 8-9, и экстрагировали этилацетатом (5×200 мл и затем 3×50 мл). Объединенные этилацетатные слои сушили над MgSO4, фильтровали и летучие вещества удаляли, получая при этом 48 г сложного этилового эфира 1-N-метил-2-аминоимидазол-5-карбоновой кислоты.

Пример 23

Синтез сложного этилового эфира 1-N-метил-2-аминоимидазол-5-карбоновой кислоты

Этилформиат (850 мл) добавляли к хлористоводородной соли сложного метилового эфира саркозина (205 г, 1,46 моль, измельченный в порошок до использования), карбонату калия (205 г, 1,48 моль) и EtOH (8090 мл), перемешивали в течение ночи при комнатной температуре и фильтровали. Фильтрат концентрировали в роторном испарителе, в результате остаток разделялся на два слоя. Верхний слой отделяли и нижний слой экстрагировали этилацетатом. Объединенные этилацетатные слои и верхний слой сушили над MgSO4, фильтровали и концентрировали с образованием 185 г (81%) сложного метилового эфира N-формилсаркозина, который использовали при выполнении следующей реакции. NaH (60% масляная суспензия, 16,0 г, 0,4 моль) осторожно добавляли несколькими порциями в течение 1 часа к смеси сложного метилового эфира N-формилсаркозина (50 г, 0,34 моль) и этилформиата (160 мл), охлаждаемой на бане со смесью воды со льдом. Реакционную смесь перемешивали, температуру повышали до комнатной температуры и продолжали перемешивать смесь в течение ночи. Реакционную смесь дважды растирали в гексане (каждый раз по 100 мл), остаток растворяли в EtOH (100 мл) и концентрированной HCl (60 мл) и реакционную смесь перемешивали при 110°С. Через 1 час реакционную смесь охлаждали, фильтровали, остаток промывали EtOH и фильтрат концентрировали с образованием густого коричневого масла. Масло добавляли к 10% НОАс в воде (200 мл), NH2CN (35 г) и ацетату натрия (90 г) и перемешивали при 95°С. Через 1 час реакционную смесь концентрировали до 1/3 первоначального объема в роторном испарителе и значение рН доводили примерно до 9, добавляя карбонат натрия. Затем реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (8×100 мл), объединенные этилацетатные слои сушили, фильтровали и концентрировали с образованием остатка, который очищали перекристаллизацией, получая при этом сложный этиловый эфир 1-N-метил-2-аминоимидазол-5-карбоновой кислоты (“сложный эфир аминозамещенной кислоты”).

Пример 24

Синтез сложного этилового эфира 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-карбоновой кислоты

Раствор сложного эфира аминозамещенной кислоты (36,94 г, 0,218 моль) в 200 мл уксусной кислоты по каплям добавляли к раствору нитрита натрия (100 г, 1,449 моль) и воды (300 мл), охлаждаемому на бане со смесью воды со льдом, и перемешивали. Температуру реакционной смеси, которая была равна примерно -5-10°С, повышали до комнатной температуры и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь экстрагировали DCM (3×150 мл). Объединенный слои DCM сушили и упаривали с образованием красноватого остатка, который отделяли хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента этилацетат/гексан (30%), в результате был получен сложный этиловый эфир 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-карбоновой кислоты (“сложный эфир нитрозамещенной кислоты”) в виде светло-коричневого твердого вещества (27 г, выход 62%).

Способ, описанный в примере 24, и использование водного раствора уксусной кислоты является усовершенствованием способа с использованием примерно 7% серной кислоты (об/об) для образования иона диазония из сложного эфира аминозамещенной кислоты. При использовании водного раствора серной кислоты объем реакционной смеси увеличивается, что затрудняет эффективное перемешивание реакционной смеси. Например, при выполнении реакции с использованием 150 г сложного эфира аминозамещенной кислоты необходимый объем реакционной смеси равен примерно 12 л. Липкий сложный эфир нитрозамещенной кислоты, образующийся в качестве продукта в водном растворе серной кислоты, делает невозможным перемешивание реакционной смеси.

Пример 25

Синтез 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-карбоновой кислоты

Суспензию сложного эфира нитрозамещенной кислоты (39,2 г, 196,9 ммоль) в 1н. растворе NaOH (600 мл) и воде (200 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 20 часов с образованием прозрачного светло-коричневого раствора. Значение рН реакционной смеси доводили примерно до 1, добавляя концентрированную HCl, и реакционную смесь экстрагировали этилацетатом (5×150 мл). Объединенные этилацетатные слои сушили над MgSO4 и концентрировали, получая при этом 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-карбоновую кислоту (“нитрозамещенная кислота”) в виде светло-коричневого твердого вещества (32,2 г, 95%).

Пример 26

Синтез 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-карбоновой кислоты

Смесь нитрозамещенной кислоты (30,82 г, 180,23 ммоль) и триэтиламина (140 мл, 285 ммоль) в безводном ТГФ (360 мл) перемешивали при охлаждении реакционной смеси на бане со смесью ацетонитрила с сухим льдом (температура <-20°С). К охлаждаемой реакционной смеси по каплям добавляли изобутилхлорформиат (37,8 мл, 288 ммоль) в течение 10 минут, перемешивали в течение 1 часа, добавляли боргидрид натрия (36 г, 947 ммоль) и затем по каплям добавляли воду в течение 1 часа, поддерживая температуру около или ниже 0°С. Реакционную смесь нагревали до 0°С. Твердое вещество отфильтровывали и промывали ТГФ. Объединенные порции в ТГФ упаривали, получая при этом 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-метанол в виде оранжевого твердого вещества (25 г), которое перекристаллизовывали из этилацетата.

Пример 27

Синтез соединения 119

К суспензии 1-N-метил-2-нитроимидазол-5-метанола (50 мг, 0,32 ммоль) в DME добавляли LiN(TMS)2 при -78°С и интенсивном перемешивании. Через 10 минут добавляли соединение 119i (67 мг, 0,32 ммоль) и реакционную смесь нагревали до комнатной температуры. Через 1 час реакционную смесь концентрировали и остаток отделяли хроматографией на силикагеле (0-100% ацетон/толуол), получая при этом соединение 119.

Примеры 28А-28V

Соединения 134-155 были синтезированы с использованием соответствующего замещенного фосфорамидата и гидроксизамещенного триггера (триггер-ОН) способами, описанными в приведенных выше примерах 1-27.

Пример 29А

Следующие соединения характеризуются указанной ниже растворимостью:

СоединениеРастворимость (в физиологическом растворе при комнатной температуре)1010 мг/мл2515 мг/мл7310 мг/мл155<1 мг/мл

Пример 29В

Анализ антипролиферативной активности

Воздействие пролекарств фосфорамидатных алкилаторов на пролиферацию клеток определяли путем исследования антипролиферативной активности указанных соединений при выполнении многолуночного анализа с использованием аламарового синего. Рост клеток, который сравнивали в присутствии и отсутствии испытуемого соединения, измеряли при помощи флуоресцентного спектрометра для прочтения планшетов при длине волны возбуждения 550 нм и длине волны излучения 590 нм (см. Biosource International Inc., Tech. Application Notes, Use of Alamar Blue in the measurement of Cell Viability and Toxicity, Determing IC50). Были исследованы нижеследующие линии клеток в количестве 20000 клеток/лунку/500 мкл среды: клетки NCI-H460 (ATCC HTB-177, среда RPMI (Gibco Products, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)), клетки НТ29 (АТСС НТВ-38б среда RPMI (Gibco)), клетки MES-SA (ATCC CRL-1976, среда 5а МакКоя (АТСС)), клетки MES-SA/Dx5 ((ATCC CRL-1977), среда 5а МакКоя (АТСС)), клетки ACHN (ATCC CRL-1611, минимальная питательная среда, Eagle (ATCC)), клетки РС3 (АТСС CRL-1435, среда F12K Хэма (АТСС)). Клетки высевали в стеклянные вставки, помещенные в каждую лунку 24-луночного планшета, за один день до испытания соединений, при этом плотность клеток и среда соответствовали вышеуказанным. Через 24 часа указанные планшеты распределяли в две группы: группа клеток, выращиваемых в условиях аноксии, и группа клеток, выращиваемых в присутствии воздуха. Испытуемое соединение добавляли в каждую лунку (объем 200 мкл) исследуемых групп в концентрациях от 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 до 0,01 мкМ. Все испытуемые соединения последовательно разводили в полной среде с конечными концентрациями ДМСО, которые были меньше или равны 1% в каждой лунке. Клетки в группе, выращиваемой в условиях аноксии, инкубировали в течение 2 часов в анаэробной камере Bactron II. Клетки в группе, выращиваемой в присутствии воздуха, инкубировали в течение 2 часов в стандартных термостатах для культуры ткани. Испытуемое соединение оставляли для воздействия в течение 2 часов и затем удаляли из каждой лунки, клетки промывали 500 мкл среды и инкубировали в течение 3 дней в 500 мкл свежей среды. Через 3 дня клетки окрашивали 10% аламаровым синим в течение 2 часов, после чего измеряли способность клеток пролиферировать (как было указано выше) и высчитывали значения 50% ингибирующей рост концентрации (GI50 (также определяемой как IC50 в настоящем описании изобретения)) испытуемых соединений, которые представлены в приведенной ниже таблице Х.

Пример 30

Анализ антипролиферативной активности - кислородная зависимость

Кислородную зависимость пролекарств фосфорамидатных алкилаторов определяли путем исследования антипролиферативной активности указанных соединений при выполнении вышеописанного многолуночного анализа с использованием аламарового синего (см. пример 29). Клетки NCI-H460 (ATCC HTB-177, среда RPMI (Gibco)) или НТ29 (АТСС НТВ-38, среда RPMI (Gibco)) высевали в количестве 20000 клеток/лунку/500 мкл среды в стеклянные вставки, помещенные в каждую лунку 24-луночных планшетов, за один день до выполнения исследования. Клетки инкубировали в течение 2 часов в анаэробной камере Bactron II, которую продували газами с требуемыми концентрациями кислорода, изменяющимися от условий аноксии до 0,1; 0,3; 0,6; 1,0 и 10% кислорода, и воздухом. Высчитанные значения IC50 (мкМ) представлены в приведенной ниже таблице Y1 (клетки Н460) или таблице Y2 (клетки НТ29).

Таблица Y2
Значения IC50 (мкМ) в клетках НТ29СоединениеN20,1% О20,3% О20,6% О21% О210% О2Воздух252  25  >100

Пример 31

Анализ клоногенного выживания - кислородной зависимости

Кислородную зависимость пролекарств фосфорамидатных алкилаторов определяли при помощи анализа клоногенного выживания. Клетки культивировали в 60 мм стеклянных чашках (5×105 клеток/чашку в 5 мл среды) в течение 2 дней до испытания соединений. Были исследованы нижеследующие линии клеток: клетки NCI-H460 (АТСС НТВ-177, среда RPMI (Gibco)), клетки НТ29 (АТСС НТВ-38, среда RPMI (Gibco)), клетки РС3 (АТСС CRL-1435, среда F12R Хэма (АТСС)). Испытуемое соединение растворяли в полной среде непосредственно перед испытанием и сразу же добавляли к клеткам (объем 2 мл). Условия аноксии или гипоксии (менее 200 частей на миллион О2) создавали, помещая стеклянные чашки в анаэробную камеру Bactron II или алюминиевые сосуды (см. пример 33) на 2 часа. В анаэробной камере создавали требуемые условия насыщения кислородом от 200 частей на миллион до воздушной среды, продувая анаэробную камеру предварительно калиброванными газами до выполнения эксперимента. В алюминиевых сосудах условия аноксии или гипоксии создавали, подвергая стеклянные чашки, находящиеся в предварительно нагретых воздухонепроницаемых алюминиевых держателях, пятикратной быстрой откачке газа и продувке смесью 95% азота с 5% диоксида углерода на водяной бане с температурой 37°С, расположенной на качающейся платформе (контрольные образцы также подвергали продувке). После пятой откачки и продувки платформу (с водяной баней и держателями) встряхивали в течение 5 минут, затем выполняли еще одну откачку и продувку и держатели переносили в шейкер, находящийся в термостате при 37°С, где клетки подвергали воздействию лекарственного средства в течение 1-2 часов. Уровни насыщения кислородом от 200 частей на миллион до воздушной среды достигались путем изменения степени и числа откачек. Концентрации кислорода в среде и газовых фазах контролировали при помощи кислородного электрода (Anima, Phoenixville, PA), помещенного в специально модифицированный алюминиевый держатель, позволяющий контролировать как газовые, так и жидкие фазы. После окончания воздействия лекарственного средства стеклянные чашки удаляли из камеры или алюминиевых сосудов и клетки промывали средой для удаления лекарственного средства. Затем клетки обрабатывали трипсином и культивировали в пластиковых чашках Петри для определения клоногенного выживания. Через 10-14 дней чашки окрашивали кристаллическим фиолетовым (0,25% в 95% этанола) и подсчитывали колонии, содержащие более 50 клеток (см. пример 33). Высчитанные значения 90% ингибирующей рост концентрации (IC90, уничтожение 90% клеток, выживание 10% клеток) испытуемых соединений представлены в приведенной ниже таблице Y3.

Таблица Y3
Значения IC90 (мкМ)Соединение (линия клеток)N20,1% О20,6% О2Воздух23 (Н460)0,3 0,6525 (Н460)0,10,453025 (НТ29)0,2 34025 (РС3)0,3  5024 (Н460)0,07 0,251435 (Н460)0,5 33037 (Н460)0,2 59070 (Н460)2 820

Пример 32

Электрохимия

Электрохимические свойства и восстановительные потенциалы пролекарств фосфорамидатных алкилаторов определяли на основании циклических вольтамперограмм указанных соединений, полученных в устройстве Bioanalytical Systems, Inc. Все эксперименты выполняли, используя стеклографитовые рабочие электроды (диаметром 3,0 мм), электроды сравнения Ag/AgCl и вспомогательные электроды из платиновой проволоки. Соединения растворяли в 1 мл метанола с достижением конечных концентраций лекарственного средства от 0,5 до 1,5 мМ после добавления 9 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS). Полученный раствор добавляли в сосуд с клетками для электрохимических исследований и барботировали аргон в течение 5 минут для удаления большей части кислорода. Циклическую вольтамперометрию выполняли при помощи стеклографитового рабочего электрода со скоростью сканирования 100 и 10000 мВ/сек. Одну серию испытаний выполняли при помощи ртутного электрода CGME (CGME в режиме SMDE, капилляр с отверстием 150 мкм, размер капли 8), но на вольтамперограммах, полученных при помощи ртутного электрода и стеклографитового электрода, были обнаружены весьма незначительные различия, поэтому в дальнейшем ртутный электрод не использовали. Восстановительные потенциалы одного или нескольких электронов испытуемых соединений, полученные при каждой скорости сканирования, представлены в приведенной ниже таблице.

Восстановительные потенциалы (мВ)Соединение100 мВ/сек10000 мВ/сек1-596-6385-606-63436-609-63425-594-62624-568-63634-584-66378-704-74682-428, -610-414, -76988-559-629108-614-593103-638, -769, -875-7562-NO2-имидазол-634-6935-NO2-фуран-487-6384-NO2-бензол-712, -1106-735, -1268

Пример 33

Анализ клоногенного выживания

Пролекарства фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению исследовали при помощи нижеследующего анализа. Экспоненциально выращиваемые клетки Н460 человека (полученные из АТСС) высевали в 60 мм стеклянные чашки с надрезами при плотности от 2,5 до 5×105 клеток/чашку и выращивали в среде RPMI, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, в течение 2 дней до обработки лекарственными средствами. В день исследования в полной среде готовили исходные растворы лекарственных средств с известными концентрациями и в каждую чашку добавляли 2 мл требуемого исходного раствора. Для достижения полного равновесия между окружающей газовой фазой и жидкой фазой снимали крышку стеклянной чашки и встряхивали чашку в течение 5 минут на ротационном шейкере. Чашки удаляли и хранили в защитной камере с перчатками. Из защитной камеры с перчатками откачивали воздух и закачивали сертифицированную газовую смесь, вызывающую аноксию (95% азота и 5% диоксида углерода), или газовую смесь, создающую аэробные условия (отсутствие гипоксии) (95% воздуха и 5% диоксида углерода). Затем клетки инкубировали с лекарственным средством в течение 2 часов при 37°С.

В конце обработки пролекарством чашки удаляли из сосудов и пролекарство быстро удаляли из клеток. Чашки промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером и раствором трипсина-EDTA и затем обрабатывали трипсином в течение 5 минут при 37°С. Отделенные клетки нейтрализовали средой и сывороткой и собирали центрифугированием в течение 5 минут с ускорением 100×g. Клетки ресуспендировали в количестве примерно 1×106 клеток/мл и разводили в 10 раз для получения исходных концентраций для культивирования. Концентрацию каждого исходного раствора определяли при помощи счетчика частиц Coulter Z2. Чашки с известным числом клеток помещали в термостат на 7-10 дней. Колонии фиксировали и окрашивали раствором 95% этанола и 0,25% кристаллического фиолетового. Подсчитывали колонии, содержащие более 50 клеток, и определяли число выживших клеток.

Анализы клоногенного выживания клеток НТ29 выполняли так же, как было описано выше и в примере 31.

Цитотоксичность соединений (таблицы 1А и 1В) определяли в условиях гипоксии и отсутствия гипоксии при помощи анализа клоногенного выживания с использованием линий клеток Н460 и НТ29 в соответствии с описанием, приведенным в примерах 31 и 33, и выражали в виде IC90 в мкМ, а также при помощи анализа антипролиферативной активности, который представлял собой модификацию многолуночного анализа, описанного в публикации Hay et al., J. Med. Chem., 2003, 46:169-82, с использованием линий клеток Н460, НТ29, НСТ116 и DX-5, и выражали в виде IС50 в мкМ (см. пример 29). Отношение IC50 или IC90, определенное в условиях гипоксии и отсутствия гипоксии, именуется отношением гипоксической цитотоксичности (HRC) и может служить мерой избирательной цитотоксичности пролекарств по настоящему изобретению в условиях гипоксии.

Таблица 1В№ соед.НТ29DX-5НСТ116 РСHRCP HRCP HRC HNHNPCHN HN 1501000,4100>2>1001>100>100   237,5 2         510>100  >10       655>100  >2 5>100>20   77(100)>100  >5(1) 0,683140   3655(35)>1003 >2 7,5>100>135>100>202516>100  >6 1>100>1000,9>100>100340,857  70    0,131077С = пролиферация; С = клоногенное выживание; Н = гипоксия; N = отсутствие гипоксии

Пример 34

Влияние соединения 25 на распределение клеточного цикла

Клетки (Н60, РС3 и НТ29) высевали с плотностью 1,0×106 клеток/3 мл среды в 60 мм чашку. После прикрепления клеток в течение 24 часов клетки подвергали воздействию соединения 25 в указанных концентрациях в течение 2 часов в условиях отсутствия гипоксии (воздух) или аноксии (азот). Клетки дважды промывали и инкубировали в течение еще 22 часов в свежей среде. Затем клетки обрабатывали трипсином, центрифугировали и фиксировали в 75% этанола в течение по крайней мере 24 часов при -20°С. Распределение клеточного цикла определяли при помощи проточной цитометрии (Guava, Hayward, CA) с использованием реагента клеточного цикла Guava (Guava, Hayward, CA). Полученные данные показывают, что соединение 25 блокирует клеточный цикл в зависимости от содержания кислорода и концентрации в нескольких линиях раковых клеток человека.

Клетки Н460мкМ G0/G1SG2/M0Воздух561230 Азот5911260,005Воздух381842 Азот5012380,05Воздух581128 Азот307590,5Воздух581128 Азот2331405Воздух42659 Азот47151750Воздух141965 Азот331411

Клетки РС3мкМ G0/G1SG2/M0Воздух541333 Азот6012280,0005Воздух551232 Азот5910310,005Воздух521334 Азот5611320,05Воздух551233 Азот4312440,5Воздух551332 Азот2133465Воздух551232 Азот353826

Клетки НТ29мкМ G0/G1SG2/M0Воздух501436 Азот4713390,005Воздух521235 Азот4614400,05Воздух501535 Азот3711520,5Воздух481437 Азот88845Воздух471339 Азот14503650Воздух    Азот   

Пример 35

Модель клеточных сфероидов

Две линии раковых клеток человека были использованы в исследованиях клеточных сфероидов для определения эффективности пролекарств фосфорамидатных алкилаторов, активированных в условиях гипоксии. Клетки аденокарциномы прямой и ободочной кишки НТ29 (рак ободочной кишки) высевали непосредственно в 125 мл вращающуюся колбу в количестве 10000 клеток/мл и выращивали в среде RPMI, содержащей 10% FBS и антибиотики. В процессе деления указанные клетки сцеплялись друг с другом и образовывали сфероиды. Клетки рака легкого Н460 высевали в колбу, поверхность которой не обеспечивала сцепления, в результате образовывались маленькие шарики клеток, которые можно было высевать во вращающуюся колбу. Для активации посеянных клеток Н460 колбы для культуры ткани площадью 150 см2 покрывали 1% агарозой, в каждую колбу вводили 10000 клеток и выращивали в среде RPMI, содержащей 10% FBS и антибиотики, в течение 3-5 дней до посева в культуры с постоянным перемешиванием. Для обеих линий клеток питательную среду меняли каждый день после того, как сфероиды становились видимыми.

Для определения морфологии и локализации гипоксических областей в интактном сфероиде целые сфероиды подвергали гистологическому анализу. Для получения замороженных срезов интактные сфероиды промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), погружали в ОСТ, быстро замораживали в растворе 2-метилбутана и сухого льда и хранили при -80°С. Для получения залитых парафином срезов интактные сфероиды фиксировали в свежеприготовленном растворе 4% параформальдегида в PBS, заливали парафином и изготавливали срезы.

Для оценки способности пролекарства фосфорамидатного алкилатора проникать во внутренние гипоксические раковые клетки, активироваться, высвобождать фосфорамидатный алкилатор и уничтожать внутренние раковые клетки измеряли клоногенное выживание сфероидов, подвергаемых воздействию лекарственного средства в течение 2 часов.

Сфероиды вводили в новую питательную среду и инкубировали в течение по крайней мере 1 часа до начала экспериментов. Сфероиды размером 500-600 мкм выделяли путем фильтрации культуры сфероидов через несколько стерильных фильтров с определенным размером ячеек. 10-20 сфероидов вводили в силицированную 60 мм чашку из пирекса с насечками, содержащую 3 мл среды с требуемой концентрацией испытуемого соединения. Чашки помещали в герметично закрытые алюминиевые сосуды, из которых несколько раз откачивали и закачивали сертифицированные газы, содержащие 5% СО2 и требуемое количество О2 (0% О2, 3% О2, 10% О2 или воздух). Сфероиды инкубировали на качающейся водяной бане для уравновешивания О2, растворенного в растворе, и сохранения целостности сфероидов в растворе в течение 2 часов. Испытуемое соединение удаляли, сфероиды промывали и полностью разрушали трипсином. Так как некротическое ядро содержит клеточный дебрис, потребовалась обработка ДНКазой I для получения однородной взвеси отдельных клеток. Клетки ресуспендировали в количестве 106/мл и культивировали для определения клоногенного выживания.

Сначала выполняли эксперименты по определению реакции на дозу, культивируя монослойные клетки в атмосфере азота, 0,6% О2 или воздуха, для установления соответствующего диапазона доз и кислородной зависимости высвобождения фосфорамидатного алкилатора из пролекарства фосфорамидатного алкилатора. В конце исследования выполняли эксперименты по клоногенному выживанию, при этом данные суммировали на основании значений IC90 или С90 (ингибирующая концентрация, вызывающая уничтожение 90% клеток и выживание 10% клеток). Даунорубицин и цисплатин, которые проникают в сфероиды в разной степени, использовали для уничтожения внешних аэробных раковых клеток сфероида. Даунорубицин использовали для проникновения во внешние слои многослойного сфероида благодаря высокому сродству к клеткам и цисплатин использовали в дозах, обеспечивающих уничтожение только внешних аэробных раковых клеток. В качестве контрольного образца биовосстановительного средства, которое уничтожало клетки в условиях гипоксии в монослойных культурах, но не в многослойных культурах клеток вследствие высокой реактивности и плохой проникающей способности, использовали тирапазамин как в экспериментах с монослойными культурами, так и в экспериментах со сфероидами, как показано в приведенной ниже таблице для клеток Н460, подвергнутых воздействию в течение 2 часов.

Значения IC90 для клеток Н460, подвергнутых воздействию в виде монослоев или сфероидовЛекарственное средствоМонослойная культураСфероидN20,6% O2Воздух10% О2Цисплатин4,2 мкМ7,7 мкМ7,3 мкМ8,0 мкМДаунорубицин0,16 мкМ  19 мкМТирапазамин14 мкМ27 мкМ>100 мкМ>200 мкМ

Несколько пролекарств фосфорамидатных алкилаторов испытывали в сфероидах для определения их способности проникать во внутренние гипоксические раковые клетки, активироваться и уничтожать гипоксические клетки. Результаты представлены в приведенной ниже таблице.

Значения IC90 для клеток Н460, подвергнутых воздействию пролекарств фосфорамидатных алкилаторов в виде монослоев или сфероидов в течение 2 часовСоединениеМонослойная культураСфероидN20,6% O2Воздух10% О2250,1 мкМ0,6 мкМ20 мкМ15 мкМ240,07 мкМ0,25 мкМ4 мкМ3 мкМ97   13 мкМ701,25 мкМ  25,5 мкМ10,35 мкМ 75 мкМ>>100 мкМ361 мкМ 100 мкМ>>100 мкМ35   22 мкМ

Аналогичные результаты эффективности соединения 25 были продемонстрированы в сфероидах НТ29, как показано в приведенной ниже таблице.

СоединениеМонослойная культураСфероидN20,6% O2Воздух10% О2250,2 мкМ3 мкМ40 мкМ29 мкМ

Пролекарство фосфорамидатного алкилатора объединяли с цисплатином или даунорубицином и сфероиды подвергали воздействию указанной комбинации в течение 2 часов, после чего измеряли клоногенное выживание. Результаты представлены в приведенной ниже таблице.

СоединениеIC50 (мкМ)Даунорубицин17Соединение 259Даунорубицин + соединение 252,3

СоединениеIC50 (мкМ)IC99 (мкМ)Цисплатин14 Соединение 2512 Цисплатин + соединение 252,35,4

Пролекарства фосфорамидатных алкилаторов способны проникать во внутренние клетки сфероида и уничтожать гипоксические раковые клетки при использовании отдельно или в комбинации с другим лекарственным средством, которое направленно воздействует на аэробные раковые клетки.

Пример 36

Анализ антипролиферативной активности - клетки с мутантной репарацией ДНК

Клетки яичника китайского хомячка с мутацией в отношении специфических путей репарации ДНК были получены из АТСС. Нижеследующие линии клеток были исследованы в количестве 2500 или 3000 клеток/лунку/500 мкл модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (Gibco), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и антибиотики: клетки АА8 (АТСС CRL-1859), клетки ЕМ9 (АТСС CRL-1861), клетки UV41 (АТСС CRL-1860), клетки UV135 (ATCC CRL-1867), клетки IRS1SF. Все линии клеток первоначально исследовали при помощи анализа антипролиферативной активности, и клетки, которые демонстрировали чувствительность, повторно исследовали при помощи анализа клоногенного выживания (описанного выше) для подтверждения результатов пролиферации. Клетки подвергали воздействию выбранных доз пролекарств фосфорамидатных алкилаторов по настоящему изобретению в течение 2 часов в гипоксических или аэробных условиях, после чего испытуемое соединение удаляли и клетки анализировали. В приведенной ниже таблице представлены линии клеток, указаны пути мутации и специфический дефект гена.

Линия клетокПуть мутацииДефект генаАА8Отсутствует (клетки дикого типа)(Отсутствует)ЕМ9Эксцизионная репарация основанийXRCC1UV135Эксцизионная репарация нуклеотидовXPGUV41Эксцизионная репарация и гомологичная рекомбинацияXPFIRS1SFГомологичная рекомбинацияXRCC3

В приведенной ниже таблице показаны результаты воздействия соединений 25 и 36 на разные линии клеток в аноксических или аэробных условиях и анализа пролиферации путем измерения IC50

СоединениеАА8 (аноксия/ воздух)ЕМ9 (аноксия/ воздух)UV41 (аноксия/ воздух)UV135 (аноксия/ воздух)IRS1SF (аноксия/ воздух)362/>1004/>1000,03/202/>1000,3/59258/>1007/>1000,2/956/>1002/>100

В приведенной ниже таблице показаны значения IC90 для анализа клоногенного выживания выбранных клеток, подвергнутых воздействию соединения 25 в аноксических или аэробных условиях

Линия клетокIC90 (мкМ) N2ВоздухАА80,85>300UV410,0217Irs1SF0,0220

Только линии клетки с дефектом гомологичной рекомбинации были чувствительны к воздействию соединения 25 в условиях гипоксии. Так как клетки UV41 характеризуются как эксцизионной репарацией нуклеотидов, так как гомологичной рекомбинацией, соединение 25, вероятно, также продуцирует значительное количество моноаддуктов. Однако клетки UV135, которые также характиризуются эксцизионной репарацией нуклеотидов, были не чувствительны к воздействию соединения 25. Преобладающим поражением, вызванным соединением 25, было образование поперечных сшивок между цепями ДНК. Указанные результаты были подтверждены в клетках UV41 и irs1SF при выполнении анализа клоногенного выживания. Воздействие испытуемого соединения в аэробных условиях вызывало такой же спектр чувствительности, что и в условиях гипоксии, из чего следует, что в результате образования поперечных сшивок между цепями ДНК возникает также аэробная токсичность. Соединение 36 вызывало аналогичную картину чувствительности в мутантных линиях клеток, из чего следует, что соединение 36 также образует поперечные сшивки между цепями ДНК.

Пример 37

Анализ многослойных культур клеток

В данном примере показано воздействие соединения 25 на проницаемость ткани с использованием многослойной культуры клеток (МСС) и дана оценка любого эффекта присутствия. Многослойные культуры клеток инкубировали в насыщенной кислородом среде (20% О2 и 5% О2) или в гипоксической среде (примерно 0% О2), при этом культуры клеток подвергали воздействию испытуемого соединения с одной стороны (подвергаемая воздействию поверхность, негипоксическая сторона), в то время как другая сторона была временно защищена от воздействия (дальняя сторона, гипоксическая сторона). При инкубации МСС в среде с 20% О2 или 5% О2 возникал градиент кислорода от поверхности, находящейся под воздействием среды, в направлении дальней поверхности культуры. Последние 50 мкм ткани испытывали кислородное голодание. Степень сокращения О2 была больше при использовании среды, газированной 5% О2, по сравнению с 20% О2; инкубация с 5% О2 гораздо ближе отражала ситуацию, имеющую место in vivo. Инкубация МСС в среде с 0% О2 моделировала гипоксию с ограниченной перфузией, когда кровеносные сосуды опухоли полностью лишены кислорода, и испытуемое соединение должно проникать на большее расстояние, чтобы воздействовать на все клетки. Еще большая преграда возникает на пути проникновения лекарственного средства, если его проникновению препятствует связывание активированного лекарственного средства.

Эксперименты с многослойными культурами клеток выполняли в средах, газированных 0, 5 или 20% О2 в течение 45 минут до и во время инкубации с испытуемым соединением. Клетки НСТ116 выращивали до толщины, равной 150 мкм, на твердой подложке, при этом одну сторону культуры загораживали, создавая условия для возникновения гипоксии вследствие ограничения диффузии. Культуры подвергали воздействию испытуемого соединения в течение 1 часа при 0% О2, 5% О2 или 20% О2 и определяли эффективность воздействия, измеряя ингибирование внедрения BrdU. Культуры инкубировали в течение второго часа в свежей среде при 20% О2, удаляли из устройства и возвращали в камеру с нормальными условиями роста, где среда обтекала обе стороны МСС. Культуры инкубировали в течение 24 часов, затем метили BrdUrd и изготавливали срезы при низких температурах. Результат мечения BrdUrd подвергнутой воздействию стороны и дальней стороны многослойной культуры клеток анализировали путем иммуногистохимического окрашивания, визуализации с помощью микроскопа и компьютерного анализа изображений для оценки воздействия соединения 25 на пролиферацию клеток.

Когда культуры подвергали воздействию возрастающих доз соединения 25 при 20% О2, требовалось в 5 раз меньше соединения на дальней (гипоксической) стороне по сравнению с подвергнутой воздействию (негипоксической) стороной для получения сравнимых результатов, что свидетельствует о проникновении и активации соединения 25 в условиях гипоксии. Когда МСС подвергали воздействию испытуемого соединения в физиологически более верных условиях наличия 5% О2, соединение 25 в 10 раз эффективнее ингибировало внедрение BrdU на гипоксической стороне по сравнению с негипоксической стороной. Негипоксические стороны культур при 5% и 20% О2 в равной степени подвергались воздействию соединения 25.

Соединение 25 оказывает более эффективное воздействие на гипоксическую сторону культур при 5% О2, чем при 0% О2. Сравнение негипоксической и гипоксической сторон культур при 5% О2 показало, что соединение 25 эффективно проникает через относительно хорошо насыщенную кислородом ткань. Соединение 25 способно уничтожать гипоксические клетки, расположенные на расстоянии примерно 150 мкм от функциональных кровяных сосудов. Примерно трехкратное уменьшение воздействия соединения 25 на гипоксическую сторону наблюдалось при 0% О2 по сравнению с воздействием при 5% О2. Эффект присутствия наблюдался только при самой высокой концентрации.

В приведенной ниже таблице показан эффект воздействия возрастающих доз соединения 25 при измерении IC50 (концентрация, ингибирующая внедрение BrdU на 50%).

Сторона0% О2 (мкМ)5% О2 (мкМ)20% О2 (мкМ)Гипоксическая~1,10,72,6Негипоксическая~1,78,0>10

Пример 38

Метаболизм соединения 25 микросомным белком человека и мыши

Метаболическую устойчивость пролекарства фосфорамидатного алкилатора (соединение 25) определяли in vitro, используя микросомные белки печени человека (HLM), крысы (RLM) и мыши (MLM), содержащие цитохром Р450-ферменты. Раствор соединения 25 (500 мкл, 5 мкМ) получали, разбавляя исходный раствор в ДМСО в 100 раз в мостиковом растворе вода:метанол, добавляя микросомный белок (1 мг/мл) в PBS/MgCl2 и выполняя ферментативные реакции, инициируемые путем добавления раствора NADPH. 50 мкл реакционной смеси удаляли через 0, 10, 20 и 30 минут после добавления раствора NADPH, белки осаждали ацетонитрилом и прозрачный супернатант анализировали на содержание соединения 25 при помощи жидкостной хроматографии с обращенной фазой и масс-спектрометрии. В качестве положительных контрольных образцов использовали нифедипин и тестостерон. В первом исследовании сравнивали RLM и MLM (таблица 1) и во втором исследовании сравнивали HLM и RLM (таблицы 2А и 2В).

Таблица 1СоединениеМетаболическая устойчивость (% через 30 минут)RLMMLMСоединение 2584%89%Нифедипин6%4%Тестостерон0%6%

Таблица 2АСоединениеМетаболическая устойчивость (% через 30 минут) НLMRLMСоединение 25127%137%Нифедипин22%2%Тестостерон65%33%

Таблица 2В№ соед.Метаболическая устойчивость (MLM) (% через 30 минут)Устойчивость в плазме (% через 30 минут)MTD (мг/ мл)Внутривенное введение мышамВнутрибрюшинное введение мышамt 1/2 (час)Сmax (мкг/мл)AUC (мкг/мл × час)Vss (л/кг)CL (мл/мин/кг)t 1/2 (час)Сmax (мкг/мл)AUC (мкг/мл × час)190100 0,263512,51,484,00,2529,9 55(20)100(85) 0,0816,94,51,25185 31,06060250        7085250        1640          237184 0,157,82,33,33680,168,53,52592102 (через 20 мин) 0,11 (6,7 мин)27,5   0,18 (11 мин)22,9 265685         342885 (через 20 мин)         355685         3690604000,2427,710,81,2777,40,184426,1

Пример 39

Фармакокинетика пролекарств фосфорамидатных алкилаторов in vivo

Разные фармакокинетические параметры пролекарств фосфорамидатных алкилаторов в плазме определяли у мышей CD-1 за исключением случаев, указанных в приведенной ниже таблице 3.

Таблица 3Средство (мг/кг)Доза (мг/кг)Способ введенияПрепаратТmax (мин)Сmax (мкг/мл)AUC (мкг-час/мл)Период полураспада (мин)2350внутрибрюшинно25% PEG/75% физиологический раствор 5,008,502109,602350Внутривенно25% PEG/75% физиологический раствор5,007,801368,873650внутрибрюшинно25% PEG/75% физиологический раствор15,044,0143911,03650Внутривенно25% PEG/75% физиологический раствор5,0027,764614,11а50внутрибрюшинно25% PEG/75% физиологический раствор15,029,9--1а50Внутривенно25% PEG/75% физиологический раствор5,0035,012,515,3550внутрибрюшинно25% PEG/75% физиологический раствор5,003,0057,42,56550Внутривенно25% PEG/75% физиологический раствор5,0016,92704,673720внутрибрюшиннокремофор:этанол:
физиологический раствор (1:2:7)2,0012,619623,23720Внутривеннокремофор:этанол:
физиологический раствор (1:2:7)2,0015,01729,008525внутрибрюшинно10% PEG5,003,9389,110,012825внутрибрюшинно10% PEG5,003,851028,312450внутрибрюшиннофизиологический раствор5,007,6064,04,10а Мыши Balb/c.

Пример 40

Фармакокинетика соединения 25 in vivo

Разные фармакокинетические параметры соединения 25 в плазме или опухоли определяли у мышей CD-1 за исключением случаев, указанных в приведенной ниже таблице 4.

Таблица 4Доза (мг/кг)Способ введенияПрепаратТmax (мин)Сmax (мкг/мл)AUC (мкг-час/мл)Период полураспада (мин)Fc (%)150аВнутрибрюшиннофизиологический раствор5,0090,1123958,7-150а,bВнутрибрюшиннофизиологический раствор15,03,38307данных нет-100пероральнофизиологический раствор15,015,878495,2-50Внутрибрюшинно30% PEG/70% физиологический раствор5,0022,943811,0-50Внутривенно30% PEG/70% физиологический раствор2,027,53256,7-50Внутрибрюшинно30% PEG/70% физиологический раствор15,09,2---50Внутривенно30% PEG/70% физиологический раствор2,027,517710,1-50Внутрибрюшиннофизиологический раствор5,0038,56357,91-50пероральнофизиологический раствор15,00,9340,425,713,625Внутрибрюшинно10% PEG45,06,332474,43 а “Голые” мыши с опухолью Н460.
b Опухоль РК.
с Биологическая доступность.

Пример 41

Ингибирование цитохромом Р450 метаболизма соединения 25

Было получено восемь реакционных лунок со 100 мкл раствора, содержащего 50 мМ фосфата калия, рН 7,4, 2,6 мМ NADP+, 6,6 мМ глюкоза-6-фосфата, 0,8 ед./мл глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназы, и серийными разведениями испытуемого соединения (такого как соединение 25) в отношении 1:3, а также восемь лунок с серийными разведениями приемлемого положительного контрольного ингибитора (такого как фурафиллин для CYP1A2, сульфафеназол для CYP2C9, N-бензилнирванол для CYPC219, хинидин для CYP2D6 и кетоконазол для CYP3А4) в отношении 1:3. Концентрации испытуемого соединения находились в пределах от 0,0229 до 200 мкМ. Реакции инициировали, добавляя 100 мкл предварительно нагретого раствора фермента/субстрата. Контрольная реакционная смесь для нулевого периода времени была получена путем добавления 50 мл 10% раствора муравьиной кислоты (400 мл ацетонитрила для 2С19) в воде к 100 мл раствора кофактора для инактивации ферментов и последующего добавления 100 мл раствора фермента/субстрата. Была также приготовлена контрольная реакционная смесь без ингибитора. Реакционные смеси инкубировали при 37°С в течение необходимого периода времени, после чего реакции прекращали, добавляя 50 мл 10% раствора муравьиной кислоты в воде (400 мл ацетонитрила для 2С19). Полученные реакционные смеси анализировали при помощи ВЭЖХ/МС/МС на наличие метаболитов в исследуемом субстрате (фенацетин для CYP1A2, диклофенак для CYP2C9, (S)-мефенитоин для CYPC219, декстрометорфан для CYP2D6 и мидазолам, тестостерон и нифедипин для CYP3А4). Каждый анализ выполняли дважды. Ниже приведен краткий обзор значений IC50.

Таблица 5 IC50 (мМ)ИзоформаКонтрольный образецСоединение 251А28,6NI2С90,20~102С196,0NI2D60,21>50Мидазолам 3А40,049>50Нифедипин 3А40,03NIТестостерон 3А40,10>50NI = Значительного ингибирования не обнаружено

Пример 42

Определение потенциальных метаболитов соединения 25, образующихся в гепатоцитах мыши, крысы, собаки и человека

Соединение 25 инкубировали с криоконсервированными гепатоцитами мыши, крысы, собаки, обезьяны и человека в концентрации 10 мкМ. Реакции прекращали через 0 (до начала инкубации), 30, 60 и 120 минут путем гашения ацетонитрилом, продукт центрифугировали и анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) вместе с масс-спектрометрией (ЖХ/МС/МС). Потенциальные метаболиты идентифицировали, выполняя полное сканирование в пределах от 100 до 520 атомных единиц массы. Ионные спектры потенциальных метаболитов сравнивали с ионным спектром исходного соединения для определения родства каждого потенциального метаболита с соединением 25. Исчезновение исходного соединения (соединение 25) и появление потенциальных метаболитов с течением времени контролировали, сравнивая высоту пиков в каждый период времени.

Пример 43

Определение фармакокинетики соединения 25 и его метаболитов in vivo у крысы, собаки и обезьяны

Фармакокинетические параметры соединения 25 и его метаболитов у крыс Sprague Dawley определяли после однократного внутривенного введения 5, 20, 50 и 100 мг/кг соединения 25. Фармакокинетику соединения 25 и его метаболитов можно также определить у коротконогих гончих собак и обезьян циномологус после однократного внутривенного введения 20 мг/кг соединения 25. Концентрации соединения 25 и его метаболитов в плазме определяли методом ЖХ/МС/МС и вычисляли средние фармакокинетические параметры.

Пример 44

Исследование баланса массы у крыс

Интактным крысам Sprague-Dawley и крысам с канюлей в желчном пузыре внутривенно вводили однократную дозу14С-меченного соединения 25. В определенные периоды времени брали пробы плазмы крови, мочи и фекалий и путем подсчета в сцинтилляционном счетчике (LSC) определяли общую радиоактивность.

Пример 45

Количественная авторадиография всего организма

Крысам Sprague-Dawley внутривенно вводили однократную дозу14С-меченного соединения 25. В определенные периоды времени умерщвляли по одной крысе. Кровь центрифугировали для получения плазмы и в крови, и плазме определяли уровни радиоактивности. Замороженные тушки крыс погружали в 2% СМС, замораживали в блоке и изготавливали срезы толщиной 40 мкм при помощи криомикротома CM 3600 Leica. Полученные срезы лиофилизовали, устанавливали в наклонное положение и экспонировали на фосфорных фотопластинках наряду с14С-меченными авторадиографическими эталонами для последующей калибровки программного обеспечения для анализа изображений. Экспонированные изображения сканировали при помощи Molecular Dynamics Storm 820 или 860. Степень радиоактивности в отобранных тканях, включающих жировую ткань (бурую и белую), надпочечник, кровь, головной мозг (полушарие, мозжечок, продолговатый мозг), кость, костный мозг, слепую кишку и ее содержимое, эпидидимис, пищевод, глазное яблоко (сосудистая оболочка глазного яблока, внутриглазная жидкость, хрусталик глаза), железу Хардериана, сердце, почку (корковый слой, мозговой слой, бугорок и весь срез), толстую кишку и ее содержимое, печень, легкое, субмаксиллярный лимфатический узел, поджелудочную железу, гипофиз, предстательную железу, слюнную железу, семенные пузырьки, скелетные мышцы, кожу, желудок (и его содержимое), тонкую кишку (и ее содержимое), селезенку, спинной мозг, трахею, щитовидную железу и мочевой пузырь (и его содержимое) измеряли путем анализа изображений. Для каждого животного были получены авторадиолюминограммы и цифровые изображения.

Пример 46

Связывание соединения 25 с белком плазмы

Связывание соединения 25 с белком в плазме мыши, крысы, собаки, обезьяны и человека определяли путем ультрафильтрации. Для выполнения ультрафильтрации аликвоты плазмы, в которую добавляли соединение 25 в трех концентрациях, вводили в виде трех одинаковых образцов в устройство Centrifree®. Все образцы плазмы затем уравновешивали при 37°С. Устройство Centrifree® центрифугировали при 37°С в течение 30 минут с ускорением 2500×g. К 75 мкл аликвоте ультрафильтрата добавляли I.S. (дейтерированное соединение 25) и анализировали при помощи ЖХ/МС/МС. Ультрафильтраты анализировали и подвергали количественному определению с использованием эталонов ультрафильтратов человека для построения калибровочной кривой.

Пример 47

В примере 47 показана пригодность соединения по настоящему изобретению для лечения рака с использованием модели ксенотрансплантата рака ободочной кишки НТ-29 у мышей.

Самок мышей СВ17/SCID (приобретенных в компании Charles River, Cambridge, MA) в возрасте 7-8 недель оставляли для адаптации в течение по крайней мере трех дней и содержали в стерильных условиях. Линия клеток рака ободочной кишки человека НТ-29 была получена из Американской коллекции типовых культур. Указанную линию клеток культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки выдерживали в термостате при 37°С с 5% СО2. Клетки НТ-29 удаляли из культуры и инокулировали в количестве 3×106 клеток/животное в подкожное пространство брюшины. Когда опухоли вырастали до среднего объема, равного 100 мм3 (8-й день), каждой группе из 10 мышей в течение трех недель вводили только наполнитель (физиологический раствор и PEG (10 мл/кг массы тела животного), группа 1), только соединение 36 (растворенное в 30% циклодекстрина в PBS) при суточной дозе 20, 60 или 200 мг/кг (соответственно группы 2, 3 и 4) и соединение 36 в суточной дозе 20, 60 и 200 мг/кг, которую вводили через 2-3 часа после введения дозы 10 мг/кг 5-FU (в физиологическом растворе (соответственно группы 5, 6 и 7) и сравнивали с группой, которой вводили только 5-FU в дозе 10 мг/кг (группа 8), как показано в приведенной ниже таблице.

Массу тела каждой мыши регистрировали два раза в неделю. Рост каждого ксенотрансплантата контролировали путем наружного измерения опухолей в двух направлениях при помощи штангенциркуля два раза в неделю. Объем опухоли (V) определяли из следующего уравнения: V = (L × W2)/2, где L означает длину и W означает ширину ксенотрансплантата. Объемы опухолей измеряли два раза в неделю.

Введение соединения 36 в дозе 20, 60 и 200 мг/кг/сутки уменьшало рост опухоли по сравнению с введением только наполнителя. Введение комбинации соединения 36 и 5-FU вызывало большее ингибирование роста опухоли в зависимости от дозы по сравнению с наполнителем. Кроме того, комбинации 60 и 200 мг/кг соединения 36 и 5-FU уменьшали рост опухоли в большей степени, чем введение только 5-FU.

ГруппаЛечение (мг/кг)% ингибирования по сравнению с  группой 1группой 822034,6-36016,1-420020,2-520+5-FU35,73,3660+5-FU46,913,37200+5-FU58,22385-FU38,7-

Противоопухолевое действие сопровождалось некоторой потерей массы тела и периодической смертностью, особенно в группе, которой вводили высокую дозу соединения 36, а также в других группах. В целом соединение 36 ингибировало рост опухолей в разной степени.

Пример 48

В примере 48 показана пригодность соединения по настоящему изобретению для лечения рака с использованием модели ксенотрансплантата рака ободочной кишки человека NCI H460 у мышей.

Самок мышей СВ17/SCID (приобретенных в компании Charles River, Cambridge, MA) в возрасте 7-8 недель оставляли для адаптации в течение по крайней мере трех дней и содержали в стерильных условиях. Линия клеток рака ободочной кишки человека NCI H460 была получена из Американской коллекции типовых культур. Указанную линию клеток культивировали и собирали способом, описанным в примере 47, и инокулировали в количестве 1×106 клеток/животное в подкожное пространство брюшины. Когда опухоли вырастали до среднего объема, равного 100 мм3 (8-й день), каждой группе мышей в течение трех недель вводили, как указано в приведенной ниже таблице, соединение 25 (2,5 мг/мл в 10% PEG; способ введения - внутрибрюшинно) и таксол (1 мг/мл в 5% EtOH, 5% кремофора и 90% физиологического раствора; способ введения - внутривенно через 2 часа после введения соединения 25). Массу тела и объем опухолей измеряли в соответствии с описанием, приведенным в примере 47.

Протокол лечения

Группа (n=10)ЛечениеДоза (мг/кг)Схема введения1а*Отсутствует (NA)NANA1b*Физиологический растворNA(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели2НаполнительNA(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели3Соединение 2525(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели4Соединение 2550(через день × 3 раза) в неделю × 2 недели5Соединение 25100(через 6 дней × 1 раз) в неделю × 2 недели6ТаксолNA(через день × 3 раза) в неделю × 2 недели7Соединение 2525(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели Таксол10(через день × 3 раза) в неделю × 2 недели8Соединение 2550(через день × 3 раза) в неделю × 2 недели Таксол10(через день х 3 раза) в неделю х 2 недели9Соединение 25100(через 6 дней × 1 раз) в неделю × 2 недели Таксол10(через день × 3 раза) в неделю × 2 неделиГруппы 1а и 1b n=5;
q1d/qd = каждый день; q2d = через день; q7d = через 6 дней на седьмой.

Результаты, приведенные в таблице Х2, получены на основании измерения объема опухолей на 29-й день, когда у мышей, которым вводили наполнитель, объем опухоли достиг 946 мм3. Группы из 5 мышей, которым вводили физиологический раствор или не подвергали никакому воздействию, были включены в исследование для определения эффекта наполнителя, но не были использованы для сравнений в данном анализе.

Группа% ингибирования по сравнению сгруппой 2группой 6350,1-452-546,7-765,938,8863,131,7952,612,5646-

Полученные результаты показывают, что все три схемы введения соединения 25 обеспечивали одинаковые степени ингибирования роста опухолей, при этом дополнительное благоприятное воздействие оказывала комбинированная терапия, особенно при ежедневном введении. Каждая комбинированная терапия сопровождалась одинаковой потерей массы тела, но не достаточно большой, чтобы привести к гибели животных. В целом результаты показывают, что соединение 25 оказывает эффективное действие в данной модели рака легкого и благоприятно дополняет действие стандартного химиотерапевтического средства, таксола.

При переводе дозы, вводимой мышам, в эквивалентную дозу для человека (HED) установлено, что терапевтически эффективная доза соединения 25 равна примерно 2-8 мг/кг/сутки при лечении рака, в частности рака легкого, при введении отдельно или в комбинации с таксолом (Taxol™), при этом частота введения суточной дозы может быть сокращена при использовании более высоких доз по сравнению с более низкими дозами.

Пример 49

В примере 49 показана пригодность соединения по настоящему изобретению для лечения рака с использованием модели ксенотрансплантата немелкоклеточного рака легкого Н460 у мышей. Самок мышей СВ17/SCID (приобретенных в компании Charles River, Cambridge, MA) в возрасте 7-8 недель оставляли для адаптации в течение по крайней мере трех дней и содержали в стерильных условиях. Линия клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI H460 была получена из Американской коллекции типовых культур. Указанную линию клеток культивировали и собирали способом, описанным в примере 47, и инокулировали в количестве 3×106 клеток/животное в подкожное пространство брюшины. Когда опухоли вырастали до среднего объема, равного 100 мм3 (8-й день), каждой группе мышей (десять мышей в группе) в течение трех недель вводили, как указано в приведенной ниже таблице: соединение 25 (2,5 мг/мл в 10% PEG; способ введения - внутрибрюшинно), соединение 24 (0,3, 0,1 мг/мл в 10% PEG, способ введения - внутрибрюшинно) и таксол (1 мг/мл в 5% EtOH, 5% кремофора и 90% физиологического раствора; способ введения - внутривенно через 2 часа после введения испытуемого соединения).

Протокол лечения

ГруппаЧисло мышейЛечениеДоза (мг/кг)Схема введения110Наполнитель*NA(каждый день × 5 раз) в неделю × 3 недели28Таксол10(через день × 3 раза) в неделю × 2 недели38Соединение 243(каждый день × 5 раз) в неделю × 3 недели49Соединение 241(каждый день× 5 раз) в неделю × 3 недели  Таксол10(через день × 3 раза) в неделю × 2 недели58Соединение 243(каждый день × 5 раз) в неделю × 3 недели  Таксол10(через день × 3 раза) в неделю × 2 недели68Соединение 2525(каждый день × 5 раз) в неделю × 3 недели  Таксол10(через день × 3 раза) в неделю × 2 недели* -50% PEG
NA = Отсутствует

Массу тела и объем опухолей измеряли в соответствии с описанием, приведенным в примере 47. В приведенной ниже таблице представлены результаты ингибирования роста опухоли, полученные на 27-й день. Сравнение было сделано на 27-й день, так как данный день был последним днем измерений в группе животных, которым вводили наполнитель, после чего указанных животных умерщвляли.

Группа% ингибирования по сравнению с группой 1группой 2339,9-416-32,7551,523,3656,831,7236,7-

Полученные результаты показывают, что суточные дозы, равные 3 мг/кг соединения 24 и 25 мг/кг соединения 25, ингибировали рост опухоли и что соединение 25 было несколько более эффективным как в случае монотерапии, так и в комбинации с таксолом. Указанные действия сопровождались небольшим снижением массы тела, особенно в группе, которой вводили соединение 25 + таксол.

При переводе дозы, вводимой мышам, в эквивалентную дозу для человека (HED) установлено, что терапевтически эффективная доза соединения 25 равна 2 мг/кг/сутки при лечении рака, в частности рака легкого, при введении отдельно или в комбинации с таксолом (Taxol™), и терапевтически эффективная доза соединения 24 равна 0,25 мг/кг/сутки при лечении рака, в частности рака легкого, при введении отдельно или в комбинации с таксолом (Taxol™).

Пример 50

В примере 50 показана пригодность соединения по настоящему изобретению для лечения рака с использованием модели ксенотрансплантата рака ободочной кишки человека НТ-29 у мышей. Самок мышей СВ17/SCID (приобретенных в компании Charles River, Cambridge, MA) в возрасте 7-8 недель оставляли для адаптации в течение по крайней мере трех дней и содержали в стерильных условиях. Линия клеток рака ободочной кишки человека НТ-29 была получена из Американской коллекции типовых культур. Указанную линию клеток культивировали и собирали способом, описанным в примере 47, и инокулировали в количестве 3×106 клеток/животное в подкожное пространство брюшины. Когда опухоли вырастали до среднего объема, равного 100 мм3 (8-й день), каждой группе мышей (десять животных в группе) в течение трех недель вводили, как указано в приведенной ниже таблице, соединение 24 (в 10% PEG; способ введения - внутрибрюшинно за 2 часа до введения 5-FU или цисплатина (CDDP; в физиологическом растворе) в дни проведения комбинированной терапии; только 5-FU (в физиологическом растворе) или только CDDP.

Протокол лечения

ГруппаЧисло мышейЛечениеДоза (мг/кг)Схема введения1*8Физиологический раствор10 мл/кгвнутривенно, через 2 дня × 4 раза2*85-FU50внутривенно, через 2 дня × 4 раза3*4Никакого леченияN/AN/A4**9Наполнитель (физиологический раствор)10 мл/кгвнутрибрюшинно (каждый день × 5 раз) в неделю × 3 недели5**95-FU50внутривенно, через 2 дня × 4 раза6**9CDDP5внутривенно, один раз7**9Соединение 243внутрибрюшинно (каждый день × 5 раз) в неделю × 3 недели8**9Соединение 246внутрибрюшинно (каждый день × 5 раз) в неделю × 3 недели9**9Соединение 246внутрибрюшинно (каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели  5-FU50внутривенно, через 2 дня × 4 раза10**9Соединение 243внутрибрюшинно (каждый день × 5 раз) в неделю × 3 недели  CDDP5внутривенно, один раз11**9Соединение 246внутрибрюшинно (каждый день × 5 раз) в неделю × 3 недели  CDDP5внутривенно, один раз12**8Никакого леченияN/AN/A*Опухоль расположена в боку.
**Опухоль расположена в брюшине; Q3d = через 2 дня на третий.
N/A = отсутствует.

В контрольных группах опухоли имплантировали в двух положениях, что является частью отдельного исследования влияния расположения опухоли на рост опухоли в контрольных группах. Полученные данные не влияли на выводы, сделанные по результатам исследования, и все способы лечения сравнивали с группой животных, имевших опухоли в той же части тела, которым вводили наполнитель. Массу тела и объем опухоли измеряли в соответствии с описанием, приведенным в примере 47. В приведенной ниже таблице показано ингибирование роста опухоли на 25-й день, когда опухоли у животных, которым вводили наполнитель, достигли максимального размера и животные в данной группе были умерщвлены.

Группа% ингибирования по сравнению сгруппой 4группой 6744,1-842,1-971,128,91053,224,81150,720,9559,3-637,4-

Полученные результаты показывают, что соединение 24, вводимое в режиме монотерапии, ингибировало рост опухоли на уровне немного больше 40%, в то время как в комбинации с CDDP или 5FU ингибировало рост опухоли примерно на 50-70%. В соответствии с данным примером наиболее терапевтически эффективной комбинацией была комбинация соединения 24 и 5-FU. Воздействие на рост опухоли сопровождалось небольшим снижением массы тела мышей во время лечения; однако мыши набирали утраченную массу после окончания лечения.

При переводе дозы, вводимой мышам, в эквивалентную дозу для человека (HED) установлено, что терапевтически эффективная доза соединения 24 равна примерно 0,25-0,50 мг/кг/сутки при лечении рака, в частности рака ободочной кишки, при введении отдельно или в комбинации с 5FU или CDDP.

Пример 51

В примере 51 показана пригодность соединения по настоящему изобретению для лечения рака с использованием модели ксенотрансплантата немелкоклеточного рака легкого Н460 у мышей. Самок мышей СВ17/SCID (приобретенных в компании Charles River, Cambridge, MA) в возрасте 7-8 недель оставляли для адаптации в течение по крайней мере трех дней и содержали в стерильных условиях. Линия клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI H460 была получена из Американской коллекции типовых культур. Указанную линию клеток культивировали и собирали способом, описанным в примере 47, и инокулировали в количестве 3×106 клеток/животное в подкожное пространство брюшины. Когда опухоли вырастали до среднего объема, равного 100 мм3 (8-й день), начинали лечение, в соответствии с которым группам из 10 мышей вводили наполнитель (группа 1), CDDP в дозе 3 или 6 мг/кг (соответственно группы 2 и 3, внутривенно один раз), соединение 25 в дозе 50 мг/кг в физиологическом растворе 5 раз в неделю в течение двух недель (группа 4), соединение 25 в дозе 100 мг/кг через 2 дня на третий 5 раз (группа 5) или комбинацию каждой дозы соединения 25 с 3 или 6 мг/кг CDDP (соответственно группы 6 и 7). Результаты для групп, которым вводили 50 мг/кг соединения 25, приведены на фиг.1. На фиг.2 показаны аналогичные результаты для соединения 25, вводимого в дозе 100 мг/кг.

Результаты, полученные при использовании соединения 25 в физиологическом растворе, показывают значительное уменьшение в зависимости от дозы объема опухоли и замедление роста опухоли при введении суточной дозы, равной 50 мг/кг, при этом введение 100 мг/кг позволяло сократить частоту введения по сравнению с применением суточной дозы, равной 50 мг/кг. Полученные данные также показывают, что обе схемы введения увеличивают эффективность CDDP в указанной модели.

При переводе дозы, вводимой мышам, в эквивалентную дозу для человека (HED) установлено, что терапевтически эффективная доза соединения 25 равна примерно 4-8 мг/кг/сутки при лечении рака, в частности рака легкого, при введении отдельно или в комбинации с 5FU или CDDP, при этом частота введения суточной дозы может быть сокращена при использовании более высоких доз по сравнению с более низкими дозами.

Пример 52

В примере 52 показана пригодность соединения по настоящему изобретению для лечения рака с использованием модели ксенотрансплантата рака ободочной кишки человека НТ-29 у мышей. Самок мышей СВ17/SCID (приобретенных в компании Charles River, Cambridge, MA) в возрасте 7-8 недель оставляли для адаптации в течение по крайней мере трех дней и содержали в стерильных условиях. Линия клеток рака ободочной кишки человека НТ-29 была получена из Американской коллекции типовых культур. Указанную линию клеток культивировали и собирали способом, описанным в примере 47, и инокулировали в количестве 3×106 клеток/животное в подкожное пространство брюшины. Когда опухоли вырастали до среднего объема, равного 100 мм3 (8-й день), каждой группе мышей (десять животных в группе) в течение трех недель вводили, как указано в приведенной ниже таблице соединение 25 в физиологическом растворе (способ введения - внутрибрюшинно, за 2 часа до введения CDDP в дни проведения комбинированной терапии) и CDDP (в физиологическом растворе, внутривенно).

Протокол лечения

Группа (n=9)Испытуемый продуктДоза (мг/кг)Схема введения1Физиологический раствор10 мл/кг(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели2CDDP5один раз3Соединение 2550(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели4Соединение 25100(через день × 3 раза) в неделю × 2 недели5Соединение 25100Через 2 дня × 5 раз6Соединение 25100Через 6 дней × 2 раза7Соединение 2550(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели CDDP5один раз8Cоединение 25100(через день × 3 раза) в неделю × 2 недели CDDP5один раз9Соединение 25100Через 2 дня × 5 раз CDDP5один раз10Соединение 25100Через 6 дней × 2 раза CDDP5один раз

Массу тела и объем опухоли измеряли в соответствии с описанием, приведенным в примере 47. Данные основаны на измерении объема опухолей на 25-й день, когда опухоли в группе животных, которым вводили наполнитель, достигли достаточно большого размера, требующего умерщвления мышей. Результаты ингибирования роста опухолей представлены в приведенной ниже таблице.

Группа% ингибирования по сравнению сгруппой 1группой 2328,2-430,1-531,3-648,1-750,730,8844,227,5936,221,51051,833,2224,2-

Полученные результаты показывают, что монотерапия с использованием соединения 25 в физиологическом растворе в дозе 50 мг/кг/сутки и 100 мг/кг/сутки в соответствии с разными схемами введения вызывает ингибирование роста опухоли в модели рака ободочной кишки и комбинированная терапия с использованием соединения 25 и CDDP повышает эффективность соединения 25 в отношении лечения рака ободочной кишки в указанной модели. Указанные действия сопровождались средним снижением массы тела, которое было больше в группах, подвергаемых комбинированной терапии, но мыши набирали утраченную массу тела после окончания лечения.

При переводе дозы, вводимой мышам, в эквивалентную дозу для человека (HED) установлено, что терапевтически эффективная доза соединения 25 равна примерно 4-8 мг/кг/сутки при лечении рака, в частности немелкоклеточного рака легкого, при введении отдельно или в комбинации с CDDP, при этом частота введения суточной дозы может быть сокращена при использовании более высоких доз по сравнению с более низкими дозами.

Пример 53

В примере 53 показана пригодность соединения по настоящему изобретению для лечения рака с использованием модели ксенотрансплантата немелкоклеточного рака легкого Н460 у мышей. Самок мышей СВ17/SCID (приобретенных в компании Charles River, Cambridge, MA) в возрасте 7-8 недель оставляли для адаптации в течение по крайней мере трех дней и содержали в стерильных условиях. Линия клеток немелкоклеточного рака легкого человека NCI H460 была получена из Американской коллекции типовых культур. Указанную линии клеток культивировали и собирали способом, описанным в примере 47, и инокулировали в количестве 3×106 клеток/животное в подкожное пространство брюшины. Когда опухоли вырастали до среднего объема, равного 100 мм3, начинали лечение, в соответствии с которым группам из 10 мышей вводили наполнитель (группа 1), CDDP в дозе 6 мг/кг (внутривенно один раз, группа 2), соединение 25 в дозе 150 мг/кг в физиологическом растворе один раз в неделю в течение двух недель (внутрибрюшинно, группа 3) или комбинацию двух лекарственных средств (группа 4).

Результаты, представленные на фиг.3, показывают, что введение соединения 25 в дозе 150 мг/кг/неделю в большей степени уменьшало рост опухоли, чем введение только CDDP, и что введение комбинации двух лекарственных средств вызывало дополнительный благоприятный эффект. Приведенные результаты также показывают, что в течение двухнедельного лечения средний объем опухоли не изменился, что свидетельствует о полном ингибировании роста опухоли. Полученные данные показывают, что режим монотерапии с введением соединения 25 в дозе 150 мг/кг/сутки один раз в неделю является наиболее эффективным из всех схем введения, описанных в предыдущих примерах (примеры 47-52). В данном исследовании наблюдалось незначительное изменение массы тела, свидетельствующее о низкой токсичности данной схемы введения лекарственных средств.

При переводе дозы, вводимой мышам, в эквивалентную дозу для человека (HED) установлено, что терапевтически эффективная доза соединения 25 равна примерно 12 мг/кг/сутки при лечении рака, в частности немелкоклеточного рака легкого, при введении отдельно или в комбинации с CDDP и частоте введения, необязательно соответствующей одному разу в неделю.

Пример 54

В примере 54 показана эффективность соединения 25, вводимого в виде внутрибрюшинной инъекции ударной дозы или внутрибрюшинного вливания отдельно или в комбинации с цисплатинов в модели ксенотрансплантатов Н460 у мышей. Самок гомозиготных “голых” мышей Nu-Foxn1nu (приобретенных в компании Charles River, Cambridge, MA) в возрасте 6 недель оставляли для адаптации в течение по крайней мере трех дней и содержали в стерильных условиях. Линия клеток рака ободочной кишки человека НТ-29 была получена из Американской коллекции типовых культур. Указанную линию клеток культивировали и собирали способом, описанным в примере 47, и инокулировали в количестве 3×106 клеток/животное в подкожное пространство брюшины. Когда опухоли вырастали до среднего объема, равного 100 мм3 (8-й день), каждой группе мышей (10 животных в группе) в течение трех недель вводили, как указано в приведенной ниже таблице, соединение 25 (в дозе 15 мг/мл физиологического раствора, способ введения - внутрибрюшинно, за 2 часа до введения CDDP в дни проведения комбинированной терапии) и CDDP (в физиологическом растворе, внутривенно).

Протокол лечения

Группа Испытуемый продуктДоза (мг/кг)Схемы введенияКонцентрация дозы:объем дозы 1Физиологический раствор10через 6 дней × 20 мг/мл:10 мл/кг2CDDP6через 6 дней × 20,6 мг/мл:10 мл/кг3Соединение 25150через 6 дней х 215 мг/мл:10 мл/кг4Соединение 25150через 6 дней × 215 мг/мл:10 мл/кг CDDP6через 6 дней × 20,6 мг/мл:10 мл/кг5Соединение 25150через 6 дней × 210 мг/мл:15 мл/кг6Физиологический раствор0,2 мл200 мкл - 1 неделя × 2*0 мг/мл:1 мкл/час7Соединение 2515 мг/мл200 мкл - 1 неделя × 2*15 мг/мл:1 мкл/час* Насос Alzet, 200 мкл в течение 1 недели × 2 раза (в конце первой недели был реимплантирован новый насос).

Массу тела и объем опухолей определяли в соответствии с описанием, приведенным в примере 47. Результаты представлены на фиг.4. Полученные данные показывают, что, хотя непрерывное введение соединения 25 отдельно или в комбинации с CDDP является эффективным, периодическое введение, например, один раз в неделю, оказывает более благоприятное терапевтические действие при лечении некоторых типов рака, таких как немелкоклеточный рак легкого.

Пример 55

Комбинированная терапия соединением 25 и гемцитабином

Комбинацию соединения 25 и гемцитабина вводили “голым” мышам, которым были имплантированы опухоли, полученные из раковых клеток поджелудочной железы человека типа MiPaca2. Опухоль MiPaca-2 является высокоинвазивной, быстро растущей опухолью, которая вызывает гибель животных, не подвергаемых никакому лечению, в течение 20-30 дней. В опухолевые клетки трансфицировали геном красного флуоресцентного белка. Мышам внутрибрюшинно вводили контрольный наполнитель, гемцитабин, соединение 25, соединение 24 и комбинации гемцитабина/соединения 25 или гемцитабина/соединения 24, как показано в приведенной ниже таблице (8 мышей/группе). Соединения 24 и 25, которые были предоставлены компанией Threshold Pharmaceuticals, Inc. в виде сухого порошка, вводили в физиологическом растворе. Гемцитабин был приобретен коммерческим путем и приготовлен непосредственно перед использованием в соответствии с инструкциями изготовителя.

Протокол лечения

Группа СоединениеДоза (мг/кг)Схема введения1Наполнитель10 мг/кг(каждый день* × 5 раз) в неделю × 2 недели2Гемцитабин200каждую неделю* × 3 недели3Соединение 2530(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели4Соединение 246(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели5Гемцитабин200каждую неделю × 3 недели Соединение 2530(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели6Гемцитабин200каждую неделю × 3 недели Соединение 246(каждый день × 5 раз) в неделю × 2 недели* qd = каждый день; qw = каждая неделя

Опухоли визуализировали один раз в неделю до конца исследования, когда были получены изображения вскрытого тела. В группе 1 опухоли росли быстро (фиг.5) и к 30-му дню вызвали 100% смертность (фиг.6).

В группах 3 и 4 наблюдались незначительное воздействие на объем опухоли и выживание. В группе 2 наблюдались значительное уменьшение объема опухоли и более длительный период выживания. В группе 6 наблюдалось среднее уменьшение размера опухоли, но проведенное лечение не оказало дополнительного влияния на выживание. В отличие от этого в группе 5 наблюдались значительное уменьшение роста опухоли и значительное увеличение периода выживания по сравнению с группой 2. В группе 5 произошло быстро уменьшение пяти из 8 опухолей после лечения и в течение короткого периода времени опухоли перестали флуоресцировать (фиг.7).

Четыре из указанных опухолей сохраняли нулевой уровень флуоресценции до конца эксперимента, поэтому считалось, что такие опухоли были полностью вылечены. Ни одна из опухолей в группе 2 не была признана вылеченной. Полученные результаты показывают, что комбинированная терапия соединением 25 и гемцитабином позволяет получить благоприятные результаты в указанной модели рака по сравнению с монотерапией гемцитабином с точки зрения вылечивания опухоли. Результаты показывают, что уменьшение опухолей у животных, которым вводили комбинацию соединения 25 в дозе 30 мг/кг/сутки и гемцитабин, было гораздо больше, чем у животных, которым вводили гемцитабин в виде единственного лекарственного средства.

При переводе дозы, вводимой мышам, в эквивалентную дозу для человека (HED) установлено, что терапевтически эффективная доза соединения 25 равна примерно 2,5 мг/кг/сутки при лечении рака, в частности рака поджелудочной железы, в комбинации с гемцитабином.

Пример 56

Известно, что молекулы, позволяющие эффективно лечить заболевания человека, в том числе рак, могут быть токсичными в дозах, которые примерно соответствуют или немного превышают дозы, необходимые для достижения благоприятных результатов. Для определения соответствующей дозы и способа введения такого соединения необходимо установить его токсичность. Как правило, на начальных этапах определения токсической дозы используют грызунов, таких как мыши, получая таким образом предварительные данные, которые могут служить основой для аналогичных исследований с привлечением более крупных животных или с участием людей. Испытуемые соединения (соединения 24, 25 и 36) были испытаны на мышах в виде предварительных экспериментов для определения доз, приемлемых для более крупных животных. Соединение 25 было испытано в дозах до 300 мг/кг, которые вводили в виде однократной дозы, при этом было установлено, что указанные дозы вызывают почечную токсичность, в частности некроз почечных канальцев и появление белка в моче. Кроме того, наблюдалось временное уменьшение числа лейкоцитов. Однако при более низких дозах (100 и 200 мг/кг) была отмечена незначительная токсичность. Указанные дозы являются приблизительными дозами, которые могут быть использованы для введения более крупным животным, таким как крысы и собаки, в целях подтверждения наличия такой токсичности и предупреждения о необходимости контроля функции почек у человека.

Несмотря на то что настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления, специалистам в данной области должно быть понятно, что в объем изобретения, представленного в формуле изобретения, входят также модификации и усовершенствования. Все публикации и патентные документы (патенты, опубликованные заявки на патенты и неопубликованные заявки на патенты), приведенные в настоящем описании изобретения, включены в качестве ссылки, о чем специально указано в настоящем описании изобретения. Ссылки на публикации и патентные документы нельзя рассматривать как признание таких документов в качестве материалов, относящихся к предмету заявки, а также к ее содержанию или дате подачи. Специалистам в данной области должно быть понятно, что настоящее изобретение, представленное в виде описания и примеров, может быть реализовано в разных вариантах осуществления и что описание изобретения и примеры служат только для иллюстрации и не ограничивают нижеследующую формулу изобретения.

Реферат

Настоящее изобретение относится к пролекарствам фосфорамидатных алкилаторов, которые могут быть использованы для лечения рака отдельно или в комбинации с другими противоопухолевыми средствами, формулы ! ! где каждый X4 обозначает Сl или Вr. Технический результат - получение новых соединений, обладающих антипролиферативной активностью, и фармацевтических композиций на их основе. 7 н. и 2 з.п.ф-лы, 7 ил., 37 табл.

Формула

1. Соединение формулы:

в котором каждый Х4 обозначает Сl или Вr.
2. Соединение по п.1, имеющее формулу:
3. Соединение по п.1, имеющее формулу:
4. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по п.1 и фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель.
5. Способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, соединения по п.1.
6. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по п.2 и фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель.
7. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, содержащая соединение по п.3 и фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель.
8. Применение соединения по п.2 для получения лекарственного средства для лечения рака.
9. Применение соединения по п.3 для получения лекарственного средства для лечения рака.

Документы, цитированные в отчёте о поиске

Пролекарство для терапии опухолей и воспалительных заболеваний

Авторы

МАТТЕУЧЧИ Марк (US)
ДУАНЬ Цзянь-Синь (US)
ЦЗЯО Хайлун (US)
КАЙЗЕРМАН Джекоб (US)
АММОНС Стив (US)
MATTEUCHCHI MARK
DUAN TSZJAN-SIN
TSZJAO KHAJLUN
KAJZERMAN DZHEKOB
AMMONS STIV
MATTEUCHCHI MARK
DUAN' TSZJAN'-SIN'
TSZJAO KHAJLUN
KAJZERMAN DZHEKOB
AMMONS STIV

Патентообладатели

TRESHOLD FARMAS JUTIKALZ INK
TRESHOLD FARMAS'JUTIKALZ, INK.

Заявители

TRESHOLD FARMAS JUTIKALZ INK
TRESHOLD FARMAS'JUTIKALZ, INK.
0
0
0
0
Невозможно загрузить содержимое всплывающей подсказки.
Поиск по товарам
Добавить свой товар
Сообщества
Товары
Участники
Патенты
Запросов

Поставщикам
О сервисе
Блогерам
Помощь
Представьтесь