Молекулярные конструкции с нацеливающими и эффекторными элементами и способы их применения - RU2703952C2

Вставочная последовательность, расположенная между двумя лизиновыми остатками, может представлять собой варианты из глициновых и сериновых остатков, имеющие в некоторой степени произвольные последовательности и (или) значения длины. Можно применять более длинные вставочные последовательности для полипептида с меньшим количеством лизиновых остатков и более короткие вставочные последовательности для полипептида с большим количеством лизиновых остатков. Во вставочные последовательности наряду с глицином и серином можно внедрять гидрофильные аминокислотные остатки, такие как аспарагиновая кислота и гистидин. В качестве альтернатив для вставочных последовательностей, образованных из глициновых и сериновых остатков, вставочные последовательности также можно взять из гибких растворимых петель широко распространенных человеческих сывороточных белков, таких как альбумин и иммуноглобулины.

В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина содержит 2-15 звеньев с последовательностью G_1-5SK. В качестве альтернативы, полипептид содержит последовательность (GSK)_2-15; т.е. полипептид содержит по меньшей мере два последовательных звена с последовательностью GSK. Например, центральная сердцевина по настоящему изобретению может содержать следующую аминокислотную последовательность:

в которой Ас представляет собой ацетильную группу.

В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина представляет собой полипептид, который содержит последовательность (Х_аа-K)_n, в которой Х_аа представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую 2-12 повторяющихся этиленгликолевых (EG) звеньев, а n представляет собой целое число от 2 до 15.

Как описано выше, центральная сердцевина по настоящему изобретению характеризуется тем, что она имеет азидную, алкиновую, тетразиновую или напряженную алкиновую группу или связана с ней на своем N- или С-конце. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина по настоящему изобретению содержит на своем N- или С-конце аминокислотный остаток, имеющий азидную или алкиновую группу. Аминокислотный остаток, имеющий азидную группу, может представлять собой L-азидогомоаланин (AHA), 4-азидо-L-фенилаланин, 4-азидо-D-фенилаланин, 3-азидо-L-аланин, 3-азидо-D-аланин, 4-азидо-L-гомоаланин, 4-азидо-D-гомоаланин, 5-азидо-L-орнитин, 5-азидо-D-орнитин, 6-азидо-L-лизин или 6-азидо-D-лизин. Например, центральная сердцевина по настоящему изобретению может иметь последовательность

Ac-(GSK)_2-7-(G_2-4S)_1-8-A^AH,

Ac-A^AH-(SG_2-4)_1-8-(GSK)_2-7,

Ac-A^AH-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-C,

Ac-C-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-A^AH,

Ac-K-(Xaa_2-12-K)_2-4-Xaa_2-12-A^AH,

Ac-A^AH-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_2-4,

Ac-A^AH-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_1-3-Xaa_2-12-C или

Ac-C-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_1-3-Xaa_2-12-A^AH,

в которой Хаа представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую определенное количество повторяющихся EG-звеньев, Ас представляет собой ацетильную группу, а А^АН представляет собой остаток AHA.

Типичная аминокислота, имеющая алкиновую группу, включает без ограничения L-гомопропаргилглицин (L-HPG), D-гомопропаргилглицин (D-HPG) или бета-гомопропаргилглицин (β-HPG). В этом случае центральная сердцевина по настоящему изобретению может иметь последовательность

Ac-(GSK)_2-7-(G_2-4S)_1-8-G^HP,

Ac-G^HP-(SG_2-4)_1-8-(GSK)_2-7,

Ac-G^HP-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-C,

Ac-C-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-G^HP,

Ac-K-(Xaa_2-12-K)_2-4-Xaa_2-12-G^HP,

Ac-G^HP-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_2-4,

Ac-G^HP-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_1-3-Xaa_2-12-C или

Ac-C-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_1-3-Xaa_2-12-G^HP,

в которой Xaa представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую определенное количество повторяющихся EG-звеньев, Ас представляет собой ацетильную группу, a G^HP представляет собой остаток HPG.

Следует отметить, что многие аминокислоты, содержащие азидную или алкиновую группу в своих боковых цепях, и пегилированные аминокислоты доступны коммерчески в защищенных t-boc (трет-бутилоксикарбонилом) или Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонилом) формах, легко применимых в твердофазном синтезе пептидов.

В соответствии с некоторыми рабочими примерами настоящего раскрытия центральная сердцевина может содержать последовательность

в которой Хаа представляет собой пегилированную аминокислоту, имеющую определенное количество повторяющихся EG-звеньев, Ас представляет собой ацетильную группу, A^AH представляет собой остаток AHA, a G^HP представляет собой остаток HPG.

В качестве альтернативы, центральная сердцевина по настоящему изобретению связана с соединяющей ветвью, которая имеет функциональную группу (например, азидную группу, алкиновую группу, тетразиновую или напряженную алкиновую группу) на своем свободном конце (т.е. на конце, не связанном с центральной сердцевиной). В этих случаях центральная сердцевина по настоящему изобретению содержит цистеиновый остаток на своем N- или С-конце. Для получения линкерного звена, связанного с соединяющей ветвью, цепь PEG, имеющая малеимидную группу на одном конце и функциональную группу на другом конце, связывается с цистеиновым остатком центральной сердцевины посредством реакции тиольной и малеимидной групп, происходящей между малеимидной группой цепи PEG и тиольной группой цистеинового остатка. В настоящем раскрытии цепь PEG, связанную с цистеиновым остатком центральной сердцевины, называют соединяющей ветвью, которая имеет функциональную группу на своем свободном конце.

Соединяющая ветвь предпочтительно имеет тетразиновую или напряженную алкиновую группу (например, циклооктеновую или циклооктиновую группу) на своем свободном конце. Эти соединяющие ветви имеют 2-12 EG-звеньев. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия тетразиновая группа представляет собой 1,2,3,4-тетразиновую, 1,2,3,5-тетразиновую, 1,2,4,5-тетразиновую группы или их производные. Напряженная алкиновая группа может быть циклооктеновой или циклооктиновой группой. В соответствии с рабочими примерами в настоящем раскрытии, циклооктеновая группа представляет собой транс-циклооктеновую (ТСО) группу, а пример напряженной алкиновой группы включает без ограничения дибензоциклооктиновую (DBCO), дифторциклооктиновую (DIFO), бициклонониновую (BCN) и дибензоциклооктиновую (DICO) группы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия тетразиновая группа представляет собой 6-метилтетразин.

Пример центральной сердцевины по настоящему изобретению, способной связываться с соединяющей ветвью, включает без ограничения

Ac-(GSK)_2-7-(G_2-4S)_1-8-C-Xaa_2-12-тетразин,

Ас-(GSK)_2-7-(G_2-4S)_1-8-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,

Ас-K-(Хаа_2-12-K)_2-4-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-тетразин,

Ас-K-(Хаа_2-12-K)_2-4-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,

Тетразин-Xaa_2-12-C(Ac)-(SG_2-4)_1-8-(GSK)_2-7,

Напряженный алкин-Хаа_2-12-С(Ас)-(SG_2-4)_1-8-(GSK)_2-7,

Тетразин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_2-4, и

Напряженный алкин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_2-4.

В качестве альтернативы, центральная сердцевина имеет азидную или алкиновую группу на одном конце и соединяющую ветвь с тетразиновой или напряженной алкиновой группой на другом конце. Примерами являются следующие:

Ac-A^AH-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-C-Xaa_2-12-тетразин,

Ас-А^АН-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,

Тетразин-Xaa_2-12-C(Ac)-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-A^AH,

Напряженный алкин-Хаа_2-12-С(Ас)-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-А^АН,

Ас-А^АН-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-тетразин,

Ас-А^АН-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,

Тетразин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-А^АН,

Напряженный алкин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-А^АН,

Ac-G^HP-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-C-Xaa_2-12-тетразин,

Ас-G^HP-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,

Тетразин-Xaa_2-12-C(Ac)-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-G^HP,

Напряженный алкин-Xaa_2-12-C(AC)-(SG_2-4)_0-7-(GSK)_2-6-(G_2-4S)_1-8-G^HP,

Ас-G^HP-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-тетразин,

Ас-G^HP-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Хаа_2-12-С-Хаа_2-12-напряженный алкин,

Тетразин-Xaa_2-12-C(Ac)-Xaa_2-12-K-(Xaa_2-12-K)_1-3-Xaa_2-12-G^HP, и

Напряженный алкин-Хаа_2-12-С(Ас)-Хаа_2-12-K-(Хаа_2-12-K)_1-3-Xaa_2-12-G^HP.

Полипептид также можно синтезировать с помощью рекомбинантной технологии путем экспрессии сконструированных сегментов генов в клетках-хозяевах бактерий или млекопитающих. Если сердцевина имеет большое количество лизиновых остатков и существенную длину, то предпочтительно получать полипептид в виде рекомбинантных белков. При использовании твердофазного синтеза по мере увеличения длины полипептида возрастает количество ошибок, а степень чистоты и (или) выход продукта снижаются. Для получения полипептида в клетках-хозяевах бактерий или млекопитающих вставочная последовательность в диапазоне от нескольких аминокислотных остатков до 10-20 остатков может располагаться между двумя остатками K. Кроме того, поскольку AHA и HPG не являются природными аминокислотами, кодируемыми генетическими кодами, N- или С-концевой остаток в этих рекомбинантных полипептидах представляет собой цистеин. После экспрессии и очистки рекомбинантных белков концевой цистеиновый остаток затем подвергают реакции с короткими бифункциональными сшивающими средствами, которые имеют малеимидную группу на одном конце, реагирующую с SH-группой цистеинового остатка, и алкиновую, азидную, тетразиновую или напряженную алкиновую группу на другом конце.

Синтез полипептида с применением пегилированных аминокислот включает меньшее количество этапов, чем в случае применения обычных аминокислот, таких как глициновые и сериновые остатки. В дополнение, можно использовать пегилированные аминокислоты с различной длиной (т.е. количеством повторяющихся этиленгликолевых звеньев), что обеспечивает гибкость для целей растворимости и некоторое расстояние между соседними аминогруппами лизиновых остатков. Центральные сердцевины также могут быть сконструированы таким образом, чтобы они содержали, помимо пегилированных аминокислот, искусственные аминокислоты, такие как D-формы аминокислот, гомоаминокислоты, N-метилированные аминокислоты и т.д. Для конструирования центральной сердцевины предпочтительно применяют пегилированные аминокислоты с различной длиной цепи полиэтиленгликоля (PEG), поскольку PEG-компоненты, содержащиеся в молекулах аминокислот, обеспечивают конформационную гибкость и надлежащее расстояние между конъюгирующими группами, повышают растворимость в воде и, как правило, являются слабоиммуногенными. Синтез центральной сердцевины, содержащей пегилированные аминокислоты, аналогичен процедурам синтеза обычных полипептидов.

Центральная сердцевина по настоящему изобретению для целей стабильности необязательно имеет на своем N-конце ацетильную группу, блокирующую аминогруппу.

Как может быть понятно, количество связывающих ветвей, связанных с центральной сердцевиной, определяется главным образом количеством лизиновых остатков, содержащихся в центральной сердцевине. Поскольку в центральной сердцевине по настоящему изобретению содержится по меньшей мере два лизиновых остатка, линкерное звено по настоящему изобретению может содержать множество связывающих ветвей.

Обратимся теперь к фигуре 1А. Согласно иллюстрации, линкерное звено 10А содержит центральную сердцевину 11а, содержащую один остаток HPG (G^HP) и четыре лизиновых (K) остатка, соответственно, разделенных вставочными последовательностями (обозначенными многоточием во всех графических материалах). Вставочные последовательности между остатком HPG и остатком K или между любыми двумя остатками K могут иметь одинаковые или разные аминокислотные последовательности. В этом примере четыре связывающие ветви 20a-20d связаны с лизиновыми остатками путем образования амидной связи между NHS-группой и аминогруппой лизинового остатка соответственно. Как может быть понятно, определенные признаки, обсуждаемые в данном документе в отношении линкерного звена 10A или любых других последующих линкерных звеньев, являются общими для других линкерных звеньев, раскрытых в данном документе, и, следовательно, некоторые или все из этих признаков также являются применимыми в следующих примерах, если это не противоречит контексту конкретного варианта осуществления. Однако, в целях краткости эти общие признаки могут не повторяться явным образом ниже.

На фигуре 1В представлено линкерное звено 10В в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего раскрытия. Центральная сердцевина 11b содержит один цистеиновый (С) остаток и шесть лизиновых (K) остатков, соответственно, разделенных вставочными последовательностями. В этом примере линкерное звено 10А содержит шесть связывающих ветвей 20a-20f, соответственно связанных с лизиновыми остатками. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия связывающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев.

В отличие от линкерного звена 10А на фигуре 1А, линкерное звено 1В дополнительно содержит соединяющую ветвь 60. Как обсуждается выше, цепь PEG, имеющая малеимидную группу на одном конце и функциональную группу на другом конце, применяется для образования соединяющей ветви 60. Таким образом, соединяющая ветвь 60 связана с цистеиновым остатком центральной сердцевины 11b посредством реакции тиольной и малеимидной групп. В этом примере функциональная группа на свободном конце соединяющей ветви 60 представляет собой тетразиновую группу 72. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия соединяющая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-12 повторяющихся EG-звеньев.

Если требуется высвобождение эффекторных элементов в участке-мишени, в связывающую ветвь можно вставить расщепляемую связь. Такая связь расщепляется путем кислотного/щелочного гидролиза, восстановления/окисления или под действием ферментов. Одним вариантом осуществления класса расщепляемых цепей PEG, которые можно применять для образования соединяющей ветви, является NHS-PEG_2-20-S-S-малеимид, где S-S представляет собой дисульфидную связь, которую можно подвергнуть медленному восстановлению, а NHS-группу применяют для конъюгирования с аминогруппой центральной сердцевины, связывая таким образом цепь PEG с центральной сердцевиной. Малеимидная группа на свободном конце связывающей ветви может быть замещена азидной, алкиновой, тетразиновой или напряженной алкиновой группой. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего раскрытия, связывающая ветвь представляет собой цепь PEG, которая имеет 2-20 повторяющихся EG-звеньев с дисульфидной связью на ее свободном конце (т.е. на конце, не связанном с центральной сердцевиной). Обратимся теперь к фигуре 1С, на которой каждая из пяти связывающих ветвей 21a-21f, соответственно связанных с остатками К центральной сердцевины 11b, представляет собой цепь PEG с дисульфидной связью на свободном конце связывающей ветви.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия, связывающая ветвь, связанная с остатком К центральной сердцевины, имеет функциональную группу (т.е. малеимидную, NHS, азидную, алкиновую, тетразиновую или напряженную алкиновую группу) на своем свободном конце. Если свободный конец связывающей ветви представляет собой азидную, алкиновую или циклооктиновую группу, то аминокислотный остаток на N- или С-конце центральной сердцевины предпочтительно представляет собой цистеиновый остаток, а свободный конец соединяющей ветви представляет собой тетразиновую или циклооктеновую группу. В качестве альтернативы, если свободный конец связывающей ветви представляет собой тетразиновую или циклооктеновую группу, то аминокислотный остаток на N- или С-конце центральной сердцевины имеет азидную или алкиновую группу, или аминокислотный остаток на N- или С-конце центральной сердцевины представляет собой цистеиновый остаток, а свободный конец соединяющей ветви представляет собой азидную, алкиновую или циклооктиновую группу.

В зависимости от функциональной группы (т.е. малеимидной, NHS, азидной, алкиновой, тетразиновой или напряженной алкиновой группы), присутствующих на свободном конце связывающей ветви, с помощью соответствующей функциональной группы можно разработать функциональный элемент (например, нацеливающий элемент, эффекторный элемент или элемент для улучшения фармакокинетических свойств) таким образом, что функциональный элемент может быть связан со свободным концом связывающей ветви посредством любой из следующих химических реакций:

(1) образование между ними амидной связи: в этом случае связывающая ветвь имеет NHS-группу на свободном конце, а функциональный элемент имеет аминогруппу;

(2) тиол-малеимидная реакция: в этом случае связывающая ветвь имеет малеимидную группу на свободном конце, а функциональный элемент имеет тиольную группу;

(3) реакция азид-алкинового циклоприсоединения, катализируемого медью (I) (CuAAC или клик-реакция для краткости): один из свободных концов связывающей ветви и функционального элемента имеет азидную группу, а другой имеет алкиновую группу; реакция CuAAC проиллюстрирована на схеме 1;

(4) реакция Дильса-Альдера с обратными электронными требованиями (iEDDA): один из свободных концов связывающей ветви и функционального элемента имеет тетразиновую группу, а другой имеет циклооктеновую группу; реакция iEDDA проиллюстрирована на схеме 2; или

(5) клик-реакция азид-алкинового циклоприсоединения, промотируемого напряжением (SPAAC): один из свободных концов связывающей ветви и функционального элемента имеет азидную группу, а другой имеет циклооктиновую группу; реакция SPAAC проиллюстрирована на схеме 3.

«Схема 1. Реакция CuAAc»

«Схема 2. Реакция iEDDA»

«Схема 3. Реакция SPAAC»

В результате реакции CuAAC получают 1,5-дизамещенный 1,2,3-триазол. Реакция между алкином и азидом является весьма селективной, и в природных биомолекулах отсутствуют алкиновые и азидные группы. Более того, реакция является быстрой и нечувствительной к рН. Было выдвинуто предположение, что вместо применения меди (I), как, например, бромида меди или йодида меди, для катализа клик-реакции лучше применять смесь меди (II) и восстановителя, такого как аскорбат натрия, для получения меди (I) в реакционной смеси in situ. В качестве альтернативы, второй элемент может быть связан с N- или С-концом центральной сердцевины по настоящему изобретению посредством реакции без использования меди, в которой в качестве катализатора для катализа азид-алкинового циклоприсоединения применяется пентаметилциклопентадиенильный комплекс хлорида рутения.

В целях иллюстрации функциональные элементы, связанные со связывающими ветвями, называют первыми элементами. Очевидно, что количество первых элементов, которые несет линкерное звено по настоящему изобретению, зависит от количества остатков K в центральной сердцевине (и, таким образом, от количества связывающих ветвей). Соответственно, средний специалист в данной области при необходимости может регулировать количество первых элементов линкерного звена, например, для достижения желаемого нацеливания или терапевтического эффекта.

Пример линкерного звена 10D, имеющего первые элементы, проиллюстрирован на фигуре 1D. За исключением признаков, обсуждаемых в данном документе ниже, фигура 1D довольно сходна с фигурой 1В. Во-первых, в центральной сердцевине 11d имеется пять остатков K и соответственно с ними связаны, соответственно, пять связывающих ветвей 20а-20е. Во-вторых, линкерное звено 10D имеет пять первых элементов 30а-30е, связанных с каждой из связывающих ветвей 20а-20е. Как обсуждается ниже, необязательная тетразиновая группа 72 обеспечивает возможность конъюгирования с дополнительным функциональным элементом, другой молекулярной конструкцией (см. часть II или часть III ниже).

На фигуре 1Е представлен альтернативный пример, в котором линкерное звено 10Е имеет структуру, аналогичную структуре линкерного звена 1D, за исключением того, что каждая из связывающих ветвей 21а-21е линкера имеет дисульфидную связь на ее концевом элементе (т.е. на конце, связанном с каждым из первых элементов 30а-30е).

В качестве альтернативы, настоящее линкерное звено дополнительно содержит множество сопрягающих ветвей, каждая из которых имеет функциональную группу (т.е. малеимидную, NHS, азидную, алкиновую, тетразиновую или напряженную алкиновую группу) на одном конце и NHS или малеимидную группу на другом конце. С использованием реакции, аналогичной реакции между первым элементом и связывающей ветвью, сопрягающая ветвь может быть связана со связывающей ветвью с соответствующей функциональной группой - либо путем образования между ними амидной связи, либо посредством тиол-малеимидной реакции, реакции CuAAC, реакции iEDDA или реакции SPAAC. Таким образом, сопрягающая ветвь, связанная со связывающей ветвью, имеет NHS или малеимидную группу на своем свободном конце (или на конце связывания элементов, т.е. на конце, не связанном со связывающей ветвью); а первый элемент, в свою очередь, связан с концом связывания элементов сопрягающей ветви путем образования между ними амидной связи или посредством тиол-малеимидной реакции.

Обратимся теперь к фигуре 1F, на которой связывающая ветвь связана с остатком K центральной сердцевины 11d, как показано на фигуре 1D. По сравнению с линкерным звеном 10D, линкерное звено 10F дополнительно содержит сопрягающую ветвь 25, связанную со связывающими ветвями 22 посредством реакции SPAAC. Первый элемент 30, в свою очередь, связан с сопрягающей ветвью 25 - либо путем образования между ними амидной связи, либо посредством тиол-малеимидной реакции. Ромб 90, изображенный на фигуре 1F, обозначает собой химическую связь, полученную в результате реакции SPAAC между связывающей ветвью 22 и сопрягающей ветвью 25.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия, сопрягающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев. В качестве альтернативы, сопрягающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев с дисульфидной связью на ее концевом элементе (т.е. на свободном конце, не связанном со связывающей ветвью).

В одном рабочем примере сопрягающая ветвь имеет три повторяющихся EG-звена, а также дисульфидную связь на свободном конце (иначе называемом концом связывания элементов) сопрягающей ветви. В этом случае первый элемент, связанный с концом связывания элементов сопрягающей ветви, можно эффективно высвободить из настоящего линкерного звена посредством обработки восстановителем.

В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами осуществления настоящего раскрытия, первыми элементами являются финголимод, финголимод-фосфат, интерферон-β или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), специфичный к интегрину α4, β-амилоиду, вирусному белку, бактериальному белку.

Неограничивающие примеры вирусных белков включают в себя белок F респираторно-синцитиального вируса (RSV), белок gp120 вируса иммунодефицита человека 1 типа (HIV-1), гемагглютинин А (НА) белка вируса гриппа А или гликопротеин цитомегаловируса.

Примеры бактериального белка включают без ограничения эндотоксин грамотрицательных бактерий, мембранный антиген бактерии Clostridium difficile, липотейхоевую кислоту бактерии Staphylococcus aureus, сибиреязвенный токсин бактерии Bacillus anthracis или шигалодобный токсин I или II типа бактерии Escherichia coli.

В целях усиления намеченного или желаемого эффекта (например, терапевтического эффекта) линкерное звено по настоящему изобретению может дополнительно содержать второй элемент в дополнение к первому элементу. Например, второй элемент может представлять собой нацеливающий элемент либо эффекторный элемент. В необязательных вариантах осуществления настоящего раскрытия первый элемент представляет собой эффекторный элемент, а второй элемент может представлять собой другой эффекторный элемент, который действует аддитивно или синергично с первым элементом или независимо от него. Опять же необязательно, первый и второй элементы проявляют разные свойства; например, первый элемент представляет собой нацеливающий элемент, а второй элемент представляет собой эффекторный элемент, и наоборот. В качестве альтернативы, первый элемент представляет собой эффекторный элемент, а второй элемент представляет собой элемент, способный к улучшению фармакокинетических свойств линкерного звена, такого как растворимость, скорость выведения, период полувыведения и биодоступность. Выбор конкретного первого элемента и (или) второго элемента зависит от предполагаемого применения, при котором должно использоваться данное линкерное звено (или разветвленное линкерное звено). Примеры этих функциональных элементов обсуждаются ниже в части I-(iii) настоящего описания.

В структурном плане второй элемент связан с азидной, алкиновой, тетразиновой или напряженной алкиновой группой на N- или С-конце центральной сердцевины. В частности, второй элемент может быть необязательно конъюгирован с короткой цепью PEG (предпочтительно имеющей 2-12 повторяющихся EG-звеньев) и далее связан с N- или С-концевым аминокислотным остатком, имеющим азидную или алкиновую группу (например, остатком AHA или остатком HPG). В качестве альтернативы, второй элемент может быть необязательно конъюгирован с короткой цепью PEG и далее связан с соединяющей ветвью от центральной сердцевины.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина содержит аминокислоту, имеющую азидную группу (например, остаток AHA), на своем N- или С-конце; и, соответственно, второй элемент, имеющий алкиновую группу, связан с N- или С-концом центральной сердцевины посредством реакции CuAAC. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия центральная сердцевина содержит аминокислоту, имеющую алкиновую группу (например, остаток HPG), на своем N- или С-конце; а второй элемент, имеющий азидную группу, способен, таким образом, связываться с N- или С-концом центральной сердцевины посредством реакции CuAAC.

На фигуре 1G представлен пример линкерного звена 10G по настоящему изобретению, несущего множество первых элементов и один второй элемент. В этом примере центральная сердцевина 11с содержит один остаток HPG (G^HP) и пять лизиновых (K) остатков. Пять связывающих ветвей 20а-20е соответственно связаны с пятью остатками К центральной сердцевины 11с; а пять первых элементов 30а-30е соответственно связаны с указанными пятью связывающими ветвями 20а-20е посредством реакции тиольной и малеимидной групп. В дополнение к первым элементам, линкерное звено 10G дополнительно содержит один второй элемент 50, связанный с одним концом короткой цепи 62 PEG. Другой конец короткой цепи 62 PEG до конъюгирования с центральной сердцевиной 11с имеет азидную группу. Таким образом, азидная группа может реагировать с остатком HPG, имеющим алкиновую группу, посредством реакции CuAAC, так чтобы второй элемент 50 связывался с центральной сердцевиной 11с. Жирная точка 40, показанная на фигуре 1G, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции CuAAC, происходящей между остатком HPG и азидной группой.

В качестве альтернативы, второй элемент связан с центральной сердцевиной посредством соединяющей ветви. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия соединяющая ветвь имеет тетразиновую группу, которая может эффективно связываться со вторым элементом, имеющим ТСО-группу, посредством реакции iEDDA. В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия соединяющая ветвь имеет ТСО-группу, которая способна связываться со вторым элементом, имеющим тетразиновую группу, посредством реакции iEDDA. В реакции iEDDA используются напряженные циклооктены, которые характеризуются значительно сниженной энергией активации в противоположность терминальным алкинам, и поэтому устраняется необходимость в экзогенном катализаторе.

Обратимся теперь к фигуре 1Н, на которой центральная сердцевина 11d линкерного звена 10Н содержит концевой цистеиновый (С) остаток и пять лизиновых (K) остатков. Как показано на фигуре 1Н, пять связывающих ветвей 20а-20е соответственно связаны с пятью остатками K центральной сердцевины 11d, и далее пять первых элементов 30а-30е соответственно связаны с пятью связывающими ветвями 20а-20е посредством реакций тиольной и малеимидной групп. Цистеиновый остаток связан с соединяющей ветвью 60, которая до конъюгирования со вторым элементом содержит тетразиновую или ТСО-группу на своем свободном конце. В этом примере второй элемент 50, связанный с короткой цепью 62 PEG, имеющей соответствующую ТСО- или тетразиновую группу, может быть связан с соединяющей ветвью 60 посредством реакции iEDDA. Эллипс 70, показанный на фигуре 1Н, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции iEDDA, происходящей между соединяющей ветвью 60 и короткой цепью 62 PEG.

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия соединяющая ветвь до конъюгирования со вторым элементом имеет азидную группу. В связи с этим соединяющая ветвь может быть связана со вторым элементом, имеющим циклооктиновую группу (например, DBCO-, DIFO-, BCN- или DICO-группу) на свободном конце короткой цепи PEG, посредством реакции SPAAC, и наоборот.

Обратимся теперь к фигуре 1I, на которой линкерное звено 10I имеет сходную структуру с линкерным звеном 10Н на фигуре 1Н, за исключением того, что соединяющая ветвь 60 содержит азидную или циклооктиновую группу (например, DBCO-, DIFO-, BCN- или DICO-группу) вместо тетразиновой или ТСО-группы. Соответственно, второй элемент 50, связанный с короткой цепью 62 PEG, может иметь соответствующую циклооктиновую (например, DBCO, DIFO, BCN или DICO) или азидную группу, так что он может связываться с соединяющей ветвью 60 посредством реакции SPAAC. Ромб 90, показанный на фигуре 1I, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC, происходящей между соединяющей ветвью 60 и короткой цепью 62 PEG.

Схема 4 представляет собой типичную иллюстрацию способа получения линкерного звена по настоящему изобретению. На этапе 1 получают центральную сердцевину, содержащую аминокислотную последовательность (GSK)3 и L-азидогомоаланиновый (AHA) остаток на своем С-конце. На этапе 2 три связывающие ветви соответственно связываются с лизиновыми (K) остатками центральной сердцевины посредством образования амидной связи между NHS-группой и аминогруппой; связывающая ветвь, связанная с центральной сердцевиной, имеет малеимидную (Mal) группу на своем свободном конце. На этапе 3 три scFv антитела к антигену A (scFv α А) в качестве первого элемента соответственно связываются со связывающими ветвями посредством реакции тиольной и малеимидной групп. В то же время на этапе 4 один scFv антитела к антигену В (scFv α В) в качестве второго элемента связывается с короткой цепью PEG, имеющей 4 повторяющихся EG-звена и DBCO-группу на свободном конце. Наконец, на этапе 5 второй элемент связывается с остатком AHA центральной сердцевины посредством реакции SPAAC.

«Схема 4. Получение линкерного звена, связанного с двумя различными scFv посредством связывающей ветви и С-концевого аминокислотного остатка»

На схеме 5 проиллюстрирован другой пример способа получения линкерного звена по настоящему изобретению. На этапе 1 получают центральную сердцевину, содержащую аминокислотную последовательность (K-Хаа)₃ и цистеиновый остаток на своем С-конце. На этапе 2 цепь PEG (в качестве соединяющей ветви), имеющая малеимидную (Mal) группу на одном конце и тетразиновую группу на другом конце, связывается с цистеиновым остатком посредством реакции тиольной и малеимидной групп. Далее на этапе 3 три связывающие ветви соответственно связываются с лизиновыми (K) остатками центральной сердцевины. Далее три scFv антитела к антигену A (scFv α А) в качестве первых элементов соответственно связываются со связывающими ветвями посредством реакции тиольной и малеимидной групп, как описано на этапе 4. В то же время на этапе 5 один scFv антитела к антигену В (scFv α В) в качестве второго элемента связывается с короткой цепью PEG, имеющей 3 повторяющихся EG-звена и ТСО-группу на свободном конце. Наконец, на этапе 6 второй элемент связывается с соединяющей ветвью посредством реакции iEDDA.

«Схема 5. Получение линкерного звена, связанного с двумя различными scFv посредством связывающей ветви и соединяющей ветви»

Пегилирование представляет собой процесс, при котором цепь PEG прикрепляется к молекуле (например, лекарственному средству или белку) или связывается с ней. Известно, что пегилирование придает некоторые значительные фармакологические преимущества по сравнению с немодифицированной формой, такие как улучшенная растворимость, повышенная стабильность, увеличенная продолжительность циркуляции в крови и сниженная интенсивность протеолитического распада. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия второй элемент представляет собой цепь PEG, имеющую молекулярную массу приблизительно 20000-50000 дальтон.

На фигуре 1J представлен альтернативный пример линкерного звена по настоящему изобретению (линкерное звено 10J), в котором пять первых элементов 30 соответственно связаны с лизиновыми остатками посредством связывающих ветвей 20, а остаток HPG (G^HP) центральной сердцевины 11е связан с цепью 80 PEG посредством реакции CuAAC. Жирная точка 40, показанная на фигуре 1J, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции CuAAC, происходящей между остатком HPG и цепью 80 PEG.

На фигуре 1K представлен другой пример настоящего раскрытия, в котором N-конец центральной сердцевины 11d представляет собой цистеиновый остаток, связанный с соединяющей ветвью 60. Цепь 80 PEG может эффективно связываться с соединяющей ветвью 60 посредством реакции iEDDA. Эллипс 70 линкерного звена 10K представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции iEDDA, происходящей между соединяющей ветвью 60 и цепью 80 PEG.

На фигуре 1L представлен альтернативный пример линкерного звена по настоящему изобретению, в котором линкерное звено 10L имеет сходную структуру с линкерным звеном 10J на фигуре 1J, за исключением того, что цепь 80 PEG связана с соединяющей ветвью 60 посредством реакции SPAAC. Ромб 90, показанный на фигуре 1L, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC, происходящей между соединяющей ветвью 60 и цепью 80 PEG.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия линкерное звено по настоящему изобретению в дополнение к первому и второму элементам дополнительно содержит третий элемент. В этом случае один из N- и С-конца центральной сердцевины представляет собой аминокислоту, имеющую азидную или алкиновую группу, а другой из N- и С-конца центральной сердцевины представляет собой цистеиновый остаток. Лизиновые остатки центральной сердцевины соответственно связаны со связывающими ветвями, каждая из которых имеет малеимидную группу на своем свободном конце; тогда как цистеиновый остаток центральной сердцевины связан с соединяющей ветвью, которая имеет тетразиновую или напряженную алкиновую группу на своем свободном конце. Как описано выше, первый элемент, таким образом, связан со связывающей ветвью посредством реакции тиольной и малеимидной групп, а второй элемент связан с соединяющей ветвью посредством реакции iEDDA. Кроме того, третий элемент связан с концевой аминокислотой, имеющей азидную или алкиновую группу, посредством реакции CuAAC или реакции SPAAC.

Обратимся теперь к линкерному звену 10М на фигуре 1М, в котором центральная сердцевина 11f имеет остаток HPG (G^HP) на своем N-конце и цистеиновый остаток на своем С-конце. Связывающие ветви 20 и соединяющая ветвь 60 связаны соответственно с лизиновыми (K) остатками и цистеиновым (С) остатком центральной сердцевины 11f. Кроме того, пять первых элементов 30 соответственно связаны с пятью связывающими ветвями 20, второй элемент (т.е. цепь 80 PEG) связан с соединяющей ветвью 60, а третий элемент 50 связан с остатком HPG посредством короткой цепи 62 PEG. Жирная точка 40 указывает на химическую связь, образующуюся в результате реакции CuAAC, происходящей между остатком HPG и короткой цепью 62 PEG; а эллипс 70 представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции iEDDA, происходящей между соединяющей ветвью 60 и цепью 80 PEG.

На фигуре 1N представлен другой вариант осуществления настоящего раскрытия, в котором линкерное звено 10N имеет сходную структуру с линкерным звеном 10М на фигуре 1М, за исключением того, что короткая цепь 62 PEG связана с остатком HPG посредством реакции SPAAC вместо реакции iEDDA. Ромб 90 на фигуре 1N представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC, происходящей между короткой цепью 62 PEG и остатком HPG.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего раскрытия связывающие ветви имеют малеимидную группу на свободном конце для конъюгирования с первыми элементами, имеющими сульфогидрильную группу, посредством реакции тиольной и малеимидной групп. Кроме того, на конце пептидной сердцевины существует один цистеиновый или аминокислотный остаток с азидной или алкиновой группой для прикрепления соединяющей ветви для связывания со вторым элементом.

Для специалистов в данной области понятно, что можно осуществлять изменения. На свободном конце связывающих ветвей можно применять конъюгирующую группу, отличную от малеимидной, такую как азидная, алкиновая, тетразиновая или напряженная алкиновая, для связывания с первыми элементами с помощью реакции CuAAC, реакции iEDDA или реакции SPAAC. Кроме того, не является необходимым наличие цистеинового остатка (или аминокислотного остатка с азидной или алкиновой группой) на N- или С-конце пептидной сердцевины. Более того, в состав пептидной сердцевины можно включить два или более таких остатка для прикрепления нескольких соединяющих ветвей для связывания со множеством вторых элементов.

I-(ii) Сердцевина на основе химического соединения для использования в разветвленном линкере

В дополнение к линкерному звену, описанному в части I-(i) настоящего раскрытия, в данном документе также раскрыто другое линкерное звено, в котором в качестве центральной сердцевины вместо полипептида используется химическое соединение. В частности, химическое соединение представляет собой бензол-1,3,5-триамин, 2-(аминометил)-2-метилпропан-1,3-диамин, трис(2-аминоэтил)амин, бензол-1,2,4,5-тетраамин, 3,3',5,5'-тетраамин-1,1'-бифенил, тетракис(2-аминоэтил)метан, тетракис(этиламин)гидразин, N,N,N',N'-тетракис(аминоэтил)этилендиамин, бензол-1,2,3,4,5,6-гексаамин, 1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-гексакис(метиламин)бензол-1,3,5-триамин, 1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N-октакис(метиламин)бензол-1,2,4,5-триамин, бензол-1,2,3,4,5,6-гексаамин или N,N-бис[(1-амино-3,3-диаминоэтил)пентил]метандиамин. Каждое из этих химических соединений имеет 3 или более аминогрупп в идентичной или симметричной конфигурации. Таким образом, если одна из аминогрупп химического соединения конъюгирована с соединяющей ветвью, то все молекулы химического соединения имеют одинаковую конфигурацию.

Каждое химическое соединение, перечисленное выше, содержит множество аминогрупп, и поэтому с химическим соединением можно связать множество цепей PEG, имеющих NHS-группы, посредством образования амидной связи между аминогруппой и NHS-группой, что аналогично механизму связывания, описанному в части I-(i) настоящего раскрытия; связываемую таким образом цепь PEG обозначают как связывающую ветвь, которая имеет функциональную группу (например, NHS, малеимидную, азидную, алкиновую, тетразиновую, циклооктеновую или циклооктиновую группу) на своем свободном конце. В то же время по меньшей мере одна из аминогрупп сердцевины на основе химического соединения связывается с другой цепью PEG, которая имеет NHS-группу на одном конце и функциональную группу (например, азидную, алкиновую, тетразиновую, циклооктеновую или циклооктиновую группу) на другом конце; связываемую таким образом цепь PEG обозначают как соединяющую ветвь, которая имеет функциональную группу на своем свободном конце.

Соответственно, первый элемент может быть связан со связывающей ветвью посредством (1) образования между ними амидной связи, (2) тиол-малеимидной реакции, (3) реакции CuAAC, (4) реакции iEDDA или (5) реакции SPAAC. Между тем, второй элемент может быть связан с соединяющей ветвью посредством реакции CuAAC, реакции iEDDA или реакции SPAAC.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия связывающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев; предпочтительно связывающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев с дисульфидной связью на ее свободном конце (т.е. конце, не связанном с центральной сердцевиной). Соединяющая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-12 повторяющихся EG-звеньев. В одном варианте осуществления как связывающая, так и соединяющая ветви имеют 12 повторяющихся EG-звеньев, при этом один конец соединяющей ветви представляет собой NHS-группу, а другой конец соединяющей ветви представляет собой алкиновую группу.

Согласно альтернативному варианту осуществления настоящего раскрытия, линкерное звено дополнительно содержит множество сопрягающих ветвей, каждая из которых связана с каждой связывающей ветвью. Множество первых элементов соответственно связано со множеством сопрягающих ветвей. В одном варианте осуществления сопрягающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев. В другом варианте осуществления сопрягающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев с дисульфидной связью на конце связывания элементов, не связанном со связывающей ветвью.

На схемах 6 и 7, соответственно, показано связывание между центральной сердцевиной на основе химического соединения и связывающей ветвью, а также соединяющей ветвью. В схемах 6 и 7 «NHS» представляет сложный NHS-эфир, «Mal» представляет малеимидную группу, «азид» представляет азидную группу, а «алкин» представляет алкиновую группу.

Требование наличия нескольких NH₂-групп, существующих в симметричной и идентичной ориентации в химическом соединении, служащем в качестве центральной сердцевины, выдвигается по следующей причине: если одна NH₂-группа применяется для присоединения бифункциональной связывающей ветви с группой N-гидроксисукцинимидильного (NHS) сложного эфира и алкиновой, азидной, тетразиновой или напряженной алкиновой группой, то продукт, а именно сердцевина с соединяющей ветвью, имеющей алкиновую, азидную, тетразиновую или напряженную алкиновую группу, является однородным и может быть очищен. Такой продукт можно затем применять для получения разветвленных линкерных звеньев, в которых все остальные NH₂-группы присоединены к связывающим ветвям с малеимидными или другими соединяющими группами на других концах. Если химическое соединение имеет несколько NH₂-групп в несимметричных ориентациях, то продукт с одной бифункциональной связывающей ветвью/соединяющей ветвью не является однородным.

«Схема 6. Связывание связывающей и соединяющей ветвей, имеющих, соответственно, малеимидную группу и азидную группу, с центральной сердцевиной»

«Схема 7. Связывание связывающей и соединяющей ветвей, имеющих, соответственно, малеимидную группу и алкиновую группу, с центральной сердцевиной»

Некоторые из этих симметричных химических соединений можно дополнительно модифицировать с получением центральных сердцевин с большим количеством связывающих ветвей/соединяющих ветвей. Например, тетракис(2-аминоэтил)метан, который можно синтезировать из широко распространенных химических соединений или получить коммерческим путем, можно применять в качестве сердцевины для конструирования линкерных звеньев с четырьмя связывающими ветвями/соединяющими ветвями. Тетракис(2-аминоэтил)метан может реагировать с бис(сульфосукцинимидил)субератом с получением продукта конденсации двух молекул тетракис(2-аминоэтил)метана, который можно применять в качестве сердцевины для конструирования линкерных звеньев, имеющих шесть связывающих ветвей/соединяющих ветвей. Линкерные звенья, соответственно, имеющие 3 связывающие ветви/соединяющие ветви, 4 связывающие ветви/соединяющие ветви и 6 связывающих ветвей/соединяющих ветвей, могут удовлетворять большинство потребностей в конструировании нацеливающих/эффекторных молекул, имеющих конфигурацию с сочлененными линкерами.

Очевидно, что количество связывающих ветвей и (или) соединяющих ветвей и элементов, связанных с ними, может изменяться в зависимости от количества аминогрупп, содержащихся в центральной сердцевине. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления количество связывающих ветвей/соединяющих ветвей и соответствующих связывающихся элементов, связанных с ними, находится в диапазоне, составляющем приблизительно 1-7.

Обратимся теперь к фигуре 2, на которой показан бензол-1,2,4,5-тетраамин, имеющий 4 аминогруппы. Три аминогруппы соответственно связаны со связывающими ветвями 20, а одна аминогруппа связана с соединяющей ветвью 60, которая имеет азидную группу на своем свободном конце. С тремя связывающими ветвями 20 далее соответственно связаны три первых элемента 30 посредством реакции тиольной и малеимидной групп, и с соединяющей ветвью 60 связан один второй элемент 50 посредством реакции CuAAC. Жирная точка 40, показанная на фигуре 2, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции CuAAC, происходящей между соединяющей ветвью 60 и вторым элементом 50.

I-(iii) Функциональные элементы, подходящие для использования в разветвленном линкере

В случае, если линкерное звено (или разветвленной линкер) содержит только первый элемент, но не второй и (или) третий элемент, первый элемент является эффекторным элементом, который может оказывать терапевтическое воздействие на субъект. С другой стороны, если это линкерное звено содержит другие элементы в дополнение к первому элементу, то по меньшей мере один из таких элементов представляет собой эффекторный элемент, тогда как другой может быть другим эффекторным элементом, нацеливающим элементом или элементом, способным улучшать одно или несколько фармакокинетических свойств линкерного звена (например, растворимость, скорость выведения, период полувыведения и биодоступность). Например, линкерное звено может иметь два различных типа эффекторных элементов, один эффекторный элемент и один нацеливающий элемент или один элемент, улучшающий фармакокинетические свойства, два разных типа нацеливающих элементов и один вид эффекторного элемента, два разных типа эффекторных элементов и один вид нацеливающего элемента или один вид нацеливающих элементов, один вид эффекторного элемента и один элемент, способный улучшать фармакокинетическое свойство линкерного звена.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия, нацеливающим элементом или эффекторным элементом является финголимод, финголимод-фосфат, интерферон-β или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), специфичный к интегрину α4, β-амилоиду, вирусному или бактериальному белку.

Примеры вирусных белков включают, без ограничения, белок F вируса респираторной синцитии (RSV), белок gp120 вируса иммунодефицита человека типа 1 (HIV-1), гемагглютинин А (НА) белка вируса гриппа А и гликопротеин цитомегаловируса.

Иллюстративные примеры бактериальных белков включают эндотоксин грамотрицательных бактерий, мембранный антиген бактерии Clostridium difficile, липотейхоевую кислоту бактерии Staphylococcus aureus, сибиреязвенный токсин бактерии Bacillus anthracis или шигаподобный токсин I или II типа бактерии Escherichia coli.

Элементом, улучшающим фармакокинетические свойства, может являться длинная цепь PEG, имеющая молекулярную массу приблизительно 20000-50000 дальтон.

Конкретные примеры функциональных элементов, включенных в данный разветвленный линкер для лечения конкретного заболевания, обсуждаются ниже.

Для лечения заболевания ЦНС, такого как рассеянный склероз, в одном примере линкерного звена может использоваться финголимод, финголимод-фосфат, интерферон-β или scFv, специфичный к интегрину α4, в качестве первого элемента (эффекторного элемента). Для лечения болезни Альцгеймера в данном линкерном звене может использоваться scFv, специфичный к β-амилоиду, в качестве первого элемента (эффекторного элемента). Необязательно, линкерное звено для лечения рассеянного склероза, болезни Альцгеймера или других заболеваний ЦНС может дополнительно содержать второй элемент - scFv, специфичный к рецептору трансферрина, в качестве нацеливающего элемента.

Аналогично, scFv, специфичный к вирусному или бактериальному белку, может использоваться в качестве нацеливающего элемента (первого элемента) для лечения инфекции, вызванной вирусом или бактерией. В этих случаях линкерное звено может содержать необязательный второй элемент, такой как scFv, специфичный к CD32 или к CD16b, в качестве эффекторного элемента.

I-(iv) Использование разветвленного линкера

Настоящее раскрытие также относится к способу лечения различных заболеваний с использованием подходящего линкерного звена. В целом, способ включает стадию введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества линкерного звена в соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия.

По сравнению с ранее известными терапевтическими конструкциями линкерное звено по настоящему изобретению, обсуждаемое в части I, является преимущественным по двум пунктам.

(1) Количество функциональных элементов можно регулировать в соответствии с потребностями и (или) способами применения. Линкерное звено по настоящему изобретению может содержать два элемента (т.е. первый и второй элементы) или три элемента (т.е. первый, второй и третий элементы) в соответствии с требованиями способа применения (например, заболеванием, подвергаемым лечению, путем введения линкерного звена по настоящему изобретению и авидностью и (или) аффинностью связывания антитела, переносимого линкерным звеном по настоящему изобретению). Например, в случаях прямой доставки линкерного звена по настоящему изобретению в ткань/орган (например, при обработке глаза), один элемент, выступающий в качестве эффекторного элемента, может быть достаточным, что, таким образом, будет устранять необходимость во втором элементе, выступающем в качестве нацеливающего элемента. Однако в случаях периферической доставки линкерного звена по настоящему изобретению (например, при пероральном, энтеральном, назальном, местном, чресслизистом введении, внутримышечной, внутривенной или внутрибрюшинной инъекции) может быть необходимым, чтобы линкерное звено по настоящему изобретению одновременно содержало нацеливающий элемент, специфично нацеливающий линкерное звено по настоящему изобретению на очаг поражения; и эффекторный элемент, проявляющий терапевтический эффект в очаге поражения. В целях повышения эффективности нацеливания или лечения, или повышения стабильности линкерного звена по настоящему изобретению в линкерное звено по настоящему изобретению можно дополнительно включить третий элемент (например, второй нацеливающий элемент, второй эффекторный элемент или цепь PEG).

(2) Первый элемент представлен в форме «связки». Как описано ранее, количество первых элементов может изменяться в зависимости от количества лизиновых остатков, содержащихся в центральной сердцевине. Если количество лизиновых остатков в центральной сердцевине находится в диапазоне от 2 до 15, то в каждом линкерном звене может содержаться по меньшей мере два первых элемента. Таким образом, вместо предоставления всего одной молекулы (например, цитотоксического лекарственного средства и антитела), что может выполняться в рамках традиционных терапевтических конструкции или способа, линкерное звено по настоящему изобретению способно предоставлять большее количество функциональных элементов (в качестве нацеливающих элементов либо в качестве эффекторных элементов) одновременно, что, таким образом, существенно улучшает терапевтический эффект.

В определенных способах терапевтического применения желательным является наличие одной копии нацеливающего или эффекторного элемента. Например, одна копия нацеливающего элемента может использоваться для предотвращения нежелательных эффектов из-за чрезмерно жесткой связки. Это соображение относится к случаю, если scFv обладает относительно высокой аффинностью к антигену-мишени, а также если антиген-мишень является мембранным антигеном на нормальных клетках, которые не являются больными клетками-мишенями. В качестве примера, при использовании scFv, специфичного к CD3 или CD16a, для задействования Т-клеток или NK-клеток для уничтожения клеток-мишеней, таких как клетки щитовидной железы у пациентов, пораженных болезнью Грейвса, желательна одна копия scFv, специфичная к CD3 или CD16a, чтобы можно было избежать нежелательных эффектов из-за сшивки CD3 или CD16a. Аналогично, при использовании scFv, специфичного к CD32 или к CD16b, для задействования фагоцитарных нейтрофилов и макрофагов для обезвреживания вирусных или бактериальных частиц, связанных с антителом, или их продуктов, желательна одна копия scFv. Кроме того, при использовании scFv, специфичного к рецептору трансферрина, для переноса эффекторных молекул лекарственного средства к ГЭБ при лечении заболеваний ЦНС, желательна одна копия scFv, специфичного к рецептору трансферрина. В еще одном примере желательным является наличие только одной копии длинноцепочечного PEG для усиления фармакокинетических свойств. Две или более длинных цепей PEG могут обуславливать образование сплетений и влиять на свойства связывания нацеливающих или эффекторных элементов.

ЧАСТЬ II. Молекулярные конструкции с сочлененными линкерами для лечения определенных заболеваний

Другой аспект настоящего раскрытия относится к молекулярной конструкции, содержащей по меньшей мере два линкерных звена, в которой одно линкерное звено несет один или несколько нацеливающих элементов, а другое линкерное звено несет один или несколько эффекторных элементов или элементов, улучшающих фармакокинетические свойства. В настоящем описании молекулярные конструкции как с нацеливающими, так и с эффекторными элементами (терапевтическими или фармакокинетическими) называются молекулярными конструкциями с сочлененными линкерами. В соответствии с различными вариантами осуществления настоящего раскрытия каждое линкерное звено, содержащееся в таких молекулярных конструкциях с сочлененными линкерами, может представлять собой разветвленные линкеры на основе пептидной сердцевины или сердцевины на основе химического соединения, рассмотренные выше в части I настоящего раскрытия. В соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия, по меньшей мере одно из линкерных звеньев молекулярной конструкции по настоящему изобретению содержит полипептидную сердцевину. Предпочтительно, по меньшей мере два линкерных звена молекулярной конструкции по настоящему изобретению содержат полипептидные сердцевины. Более предпочтительно, все линкерные звенья молекулярной конструкции по настоящему изобретению, соответственно, содержат полипептидные сердцевины.

II-(i) Структура молекулярной конструкции с сочлененными линкерами

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция содержит два линкерных звена, и линкерные звенья соединены друг с другом посредством реакции CuAAC (с применением меди или пентаметилциклопентадиенильного комплекса хлорида рутения в качестве катализатора), реакции SPAAC либо реакции iEDDA. В вариантах осуществления одно линкерное звено связано со множеством первых элементов, выступающих в качестве нацеливающих элементов, а другое линкерное звено связано со множеством вторых элементов, выступающих в качестве эффекторных элементов.

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего раскрытия молекулярная конструкция содержит три линкерных звена, при этом первое и второе линкерные звенья соединены друг с другом посредством реакции iEDDA, и далее третье линкерное звено соединено с первым или вторым линкерными звеньями посредством реакции CuAAC. В качестве альтернативы, первое и второе линкерные звенья соединены друг с другом посредством реакции iEDDA, и третье линкерное звено соединено с первым или вторым линкерными звеньями посредством реакции SPAAC. В вариантах осуществления первое, второе и третье линкерные звенья, соответственно, несут множество первых, вторых и третьих элементов, при этом первый, второй и третий элементы являются разными. В соответствии с одним вариантом осуществления два из трех элементов (т.е. первого, второго и третьего элементов) представляют собой нацеливающие элементы, а один из трех элементов представляет собой эффекторный элемент. В соответствии с другим вариантом осуществления два из трех элементов представляют собой эффекторные элементы, а один из трех элементов представляет собой нацеливающий элемент. В соответствии с еще одним вариантом осуществления один из трех элементов представляет собой нацеливающий элемент, другой из трех элементов представляет собой эффекторный элемент, а оставшийся из трех элементов представляет собой элемент, способный к улучшению фармакокинетических свойств молекулярной конструкции, такого как растворимость, скорость выведения, период полувыведения и биодоступность.

Сначала обратимся к фигурам 3A-3D, на которых, соответственно, показано связывание между двумя линкерными звеньями. На фигуре 3А показана молекулярная конструкция, содержащая два линкерных звена (100А, 200А), соединяющихся друг с другом посредством реакции iEDDA. Первое линкерное звено 100А содержит первую центральную сердцевину 110а, связывающую ветвь 120 (в качестве первой связывающей ветви) и соединяющую ветвь 130а (в качестве первой соединяющей ветви), при этом связывающая и соединяющая ветви соответственно связаны с первой центральной сердцевиной 110а на одном из концов. Аналогично, второе линкерное звено 200А содержит вторую центральную сердцевину 210а, связывающую ветвь 220 (в качестве второй связывающей ветви) и соединяющую ветвь 230а (в качестве второй соединяющей ветви), при этом связывающая и соединяющая ветви соответственно связаны со второй центральной сердцевиной 210а на одном из концов. Одна из соединяющих ветвей 130а и 230а имеет тетразиновую группу на своем свободном конце, а другая из соединяющих ветвей 130а и 230а имеет ТСО-группу. В частности, если соединяющая ветвь 130а имеет тетразиновую группу 152 на своем свободном конце (т.е. на конце, не присоединенном к первой центральной сердцевине 110а), то соединяющая ветвь 230а будет иметь ТСО-группу 154 на своем свободном конце (т.е. на конце, не присоединенном ко второй центральной сердцевине 210а), и наоборот. Соответственно, два линкерных звена (100А, 200А) соединяются друг с другом посредством реакции iEDDA, происходящей между соответствующими свободными концами соединяющих ветвей 130а и 230а. Эллипс 156, показанный на фигуре 3А, представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции iEDDA, происходящей между соединяющими ветвями 130а и 230а.

В показанном варианте осуществления каждая из связывающих ветвей 120 и 220 имеет малеимидную группу на своем свободном конце. Соответственно, первый нацеливающий элемент 140 и первый эффекторный элемент 240, каждый из которых имеет тиольную группу, связаны соответственно со связывающими ветвями 120 и 220 посредством реакции тиольной и малеимидной групп.

В соответствии с одним вариантом осуществления как первая, так и вторая центральные сердцевины 110а и 210а, показанные на фигуре 3А, представляют собой полипептидные сердцевины. В соответствии с другим вариантом осуществления как первая, так и вторая центральные сердцевины 110а и 210а, показанные на фигуре 3А, представляют собой сердцевины на основе химического соединения. В соответствии с еще одним вариантом осуществления одна из первой и второй центральных сердцевин 110а и 210а, показанных на фигуре 3А, представляет собой полипептидную сердцевину, а другая из первой и второй центральных сердцевин 110а и 210а, показанных на фигуре 3А, представляет собой сердцевину на основе химического соединения.

На фигуре 3В представлен альтернативный вариант осуществления настоящего раскрытия, в котором как первая, так и вторая центральные сердцевины 110b и 210b представляют собой полипептидные сердцевины и связаны соответственно с первым нацеливающим элементом 140 и первым эффекторным элементом 240 посредством связывающих ветвей 120 и 220. Уникальным признаком данного варианта осуществления является то, что одна из центральных сердцевин 110b и 210b содержит аминокислотный остаток, имеющий азидную группу (например, остаток AHA), на своем N- или С-конце, а другая из центральных сердцевин 110b и 210b содержит аминокислотный остаток, имеющий алкиновую группу (например, остаток HPG), на своем N- или С-конце, и такая конфигурация обеспечивает возможность непосредственного связывания центральных сердцевин 110а и 210а друг с другом, т.е. без присоединения с помощью каких-либо соединяющих ветвей, как показано на фигуре 3А.. В частности, если центральная сердцевина 110b содержит аминокислотный остаток, имеющий азидную группу 162, на своем N- или С-конце, то центральная сердцевина 210b будет содержать аминокислотный остаток, имеющий алкиновую группу 164, на своем N- или С-конце, и наоборот. Соответственно, линкерные звенья 100В и 200В могут непосредственно соединяться друг с другом посредством реакции CuAAC, происходящей между N- или С-концевыми аминокислотными остатками центральных сердцевин 110b и 210b. Жирная точка 166, показанная на фигуре 3В, представляет химическую связь, образующуюся между N- или С-концевыми аминокислотными остатками.

Фигура 3С представляет собой другой вариант осуществления настоящего раскрытия. Линкерные звенья 100С и 200С имеют сходные структуры с линкерными звеньями 100А и 200А, за исключением того, что соединяющие ветви 130b и 230b, соответственно, имеют азидную группу 162 и DBCO-группу 172 вместо азидной группы 152 и алкиновой группы 154, показанных в линкерных звеньях 100А и 200А на фигуре 3А. В частности, центральная сердцевина 110а связана с соединяющей ветвью 130b (в качестве первой соединяющей ветви), имеющей азидную группу 162 на своем свободном конце; а центральная сердцевина 210а связана с соединяющей ветвью 230b (в качестве второй соединяющей ветви), имеющей DBCO-группу 172 на своем свободном конце. Линкерные звенья 100С и 200С далее соединяются друг с другом посредством реакции SPAAC, происходящей между соединяющими ветвями 130b и 230b; с образованием при этом химической связи 182, показанной в виде ромба.

В одном варианте осуществления как первая, так и вторая центральные сердцевины 110а и 210а, показанные на фигуре 3С, представляют собой полипептидные сердцевины. В другом варианте осуществления как первая, так и вторая центральные сердцевины 110а и 210а, показанные на фигуре 3С, представляют собой сердцевины на основе химического соединения. В еще одном варианте осуществления одна из первой и второй центральных сердцевин 110а и 210а, показанных на фигуре 3С, представляет собой полипептидную сердцевину, а другая из первой и второй центральных сердцевин 110а и 210а, показанных на фигуре 3С, представляет собой сердцевину на основе химического соединения.

Очевидно, что два линкерных звена могут соединяться друг с другом посредством реакции CuAAC, происходящей между центральной сердцевиной и соединяющей ветвью. Обратимся теперь к фигуре 3D, на которой центральная сердцевина 110b содержит N- или С-концевой аминокислотный остаток, имеющий азидную группу 162 (например, остаток AHA), а центральная сердцевина 210а связана с соединяющей ветвью 230b, имеющей ТСО-группу 172 на своем свободном конце. Соответственно, линкерные звенья 100В и 200С могут соединяться посредством реакции SPAAC, происходящей между центральной сердцевиной 110b и соединяющей ветвью 230b; с образованием при этом химической связи 182.

В соответствии с одним вариантом осуществления линкерные звенья 100В и 200С, показанные на фигуре 3D, соответственно, содержат полипептидные сердцевины. В соответствии с другим вариантом осуществления центральная сердцевина 100В, показанная на фигуре 3D, представляет собой полипептидную сердцевину, а центральная сердцевина 200С, показанная на фигуре 3D, представляет собой сердцевину на основе химического соединения.

В качестве альтернативы, линкерное звено, которое содержит N- или С-концевой аминокислотный остаток, имеющий алкиновую группу (например, остаток HPG), и линкерное звено, содержащее соединяющую ветвь с азидной группой на своем свободном конце, могут соединяться друг с другом посредством азид-алкинового циклоприсоединения, происходящего между центральной сердцевиной и соединяющей ветвью.

Следует понимать, что по меньшей мере одно из линкерных звеньев данной молекулярной конструкции может дополнительно содержать сопрягающую ветвь, в которой один конец сопрягающей ветви связан со связывающей ветвью, а другой конец связан с функциональным элементом (нацеливающим элементом или эффекторным элементом), как показано в части I. Например, настоящая молекулярная конструкция может содержать два линкерных звена, в которых первый элемент непосредственно связан с первой связывающей ветвью, а второй элемент связан со второй связывающей ветвью через связь сопрягающей ветви. В качестве альтернативы, настоящая молекулярная конструкция может содержать два линкерных звена, где первый и второй элементы, соответственно, связаны с первой и второй связывающими ветвями через связи первой и второй сопрягающих ветвей.

Предпочтительно, если по меньшей мере одна из первой и второй связывающих ветвей связана с сопрягающей ветвью или с функциональным элементом посредством реакции CuAAC или реакции SPAAC, то первый и второй линкерные звенья соединены друг с другом посредством реакции iEDDA. В качестве альтернативы, если по меньшей мере одна из первой и второй связывающих ветвей связана с сопрягающей ветвью или с функциональным элементом посредством реакции iEDDA, то первое и второе линкерные звенья соединены друг с другом посредством реакции CuAAC или реакции SPAAC.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления сопрягающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев. В соответствии с другими вариантами осуществления сопрягающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев с дисульфидной связью на конце связывания элементов, не связанной со связывающей ветвью.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего раскрытия, первый элемент представляет собой scFv, специфичный к рецептору трансферрина, а второй элемент представляет собой интерферон-β (IFN-β), финголимод, финголимод-фосфат или scFv, специфичный к интегрину α4 или к β-амилоиду. Согласно другому варианту осуществления настоящего раскрытия, первый элемент представляет собой scFv, специфичный к вирусному или бактериальному белку, а второй элемент представляет собой scFv, специфичный к CD16b или к CD32.

По сравнению с другими терапевтическими конструкциями, молекулярная конструкция по настоящему изобретению является преимущественной по меньшей мере по трем следующим аспектам:

(1) линкерные звенья, содержащие определенные количество и (или) тип нацеливающих/эффекторных элементов, можно получать независимо, а затем переходить к их соединению друг с другом посредством реакции CuAAC, реакции iEDDA или реакции SPAAC;

(2) количество и вид нацеливающих и (или) эффекторных элементов можно изменять в соответствии с требованиями способа применения (например, с заболеванием, подвергаемым лечению, и авидностью и (или) аффинностью связывания нацеливающего и (или) эффекторного элемента). Комбинацию нацеливающих и эффекторных элементов можно регулировать в соответствии с конкретными потребностями и (или) способами применения. Каждый из нацеливающих и эффекторных элементов по настоящему изобретению можно изменять в зависимости от таких факторов, как конкретное состояние, подвергаемое лечению, физическое состояние пациента и (или) тип заболевания, подвергаемого лечению. Практикующий клиницист может объединить наиболее подходящий нацеливающий элемент и наиболее подходящий эффекторный элемент, чтобы достичь наилучшего терапевтического эффекта. В соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия нацеливающий элемент может представлять собой фактор роста, пептидный гормон, цитокин или фрагмент антитела; а эффекторный элемент может представлять собой иммуномодулятор, хелатообразователь в комплексе с радиоактивным нуклидом, цитотоксическое лекарственное средство, цитокин, растворимый рецептор или антитело; и

(3) по сравнению с другими реакциями присоединения реакция CuAAC, реакция iEDDA или реакция SPAAC является более эффективной в отношении соединения любых двух линкерных звеньев.

Обратимся теперь к фигуре 4, на которой проиллюстрированы шесть библиотек, получаемых независимо. В этом варианте осуществления библиотеки 1-6, соответственно, содержат множество линкерных звеньев 300А, 300В, 300С, 400А, 400В и 400С, связанных с функциональными элементами. Все линкерные звенья 300А, 300В и 300С сходны по структуре; при этом каждое из линкерных звеньев 300А, 300В и 300С содержит одну центральную сердцевину 310, одну соединяющую ветвь 330, связанную с ней и имеющую тетразиновую группу 350 на своем свободном конце, и определенное количество связывающих ветвей 320. Например, линкерное звено 300А содержит четыре связывающие ветви 320, и, соответственно, с четырьмя связывающими ветвями 320 могут быть соответственно связаны четыре нацеливающих элемента 340а. Аналогично, два нацеливающих элемента 340b и пять нацеливающих элементов 340с могут быть соответственно связаны с линкерными звеньями 300В и 300С. Нацеливающие элементы 340а, 340b и 340с могут быть одинаковыми или разными. Что касается линкерных звеньев 400А, 400В и 400С, каждое из этих линкерных звеньев содержит одну центральную сердцевину 410, одну соединяющую ветвь 430, связанную с ней и имеющую напряженную алкиновую группу 450 на своем свободном конце, и определенное количество связывающих ветвей 420. Как показано, три эффекторных элемента 440а, пять эффекторных элементов 440b и восемь эффекторных элементов 440с могут быть соответственно связаны с линкерными звеньями 400А, 400В и 400С. Эффекторные элементы 440а, 440b и 440с могут быть одинаковыми или разными. Библиотеки 1-6 можно получать независимо. Специалист в данной области может выбрать первое линкерное звено из библиотек 1, 2 и 3 и второе линкерное звено из библиотек 4, 5 и 6, затем перейти к соединению первого и второго линкерных звеньев посредством реакции iEDDA, происходящей между тетразиновой группой 350 и напряженной алкиновой группой 450, чтобы получить молекулярную конструкцию с определенным количеством нацеливающих и эффекторных элементов.

На основании идеи библиотек можно получать молекулярные конструкции по настоящему изобретению с различными конфигурациями в зависимости от выбранных библиотек. На фигуре 5А представлен пример молекулярной конструкции по настоящему изобретению, в которой каждая из первой и второй центральных сердцевин (310, 410) связана с тремя связывающими ветвями (320, 420) и одной соединяющей ветвью (330, 430). Три первых нацеливающих элемента 340 соответственно связаны со связывающими ветвями 320; и три первых эффекторных элемента 440 соответственно связаны со связывающими ветвями 420. Два линкерных звена соединяются друг с другом посредством реакции iEDDA, происходящей между двумя соединяющими ветвями 330 и 430, с образованием при этом химической связи 356. В этой конфигурации в одной молекулярной конструкции может переноситься равное количество нескольких нацеливающих и (или) эффекторных элементов.

На фигуре 5В представлен другой пример молекулярной конструкции по настоящему изобретению, в которой первая и вторая центральные сердцевины, соответственно, содержат разные количества аминогрупп (например, лизиновых остатков), и, соответственно, молекулярная конструкция содержит неравное количество нацеливающих и эффекторных элементов. В показанном примере первая центральная сердцевина 310 связана с одной соединяющей ветвью 330 и двумя связывающими ветвями 320. Вторая центральная сердцевина 410 связана с одной соединяющей ветвью 430 и пятью связывающими ветвями 420. Соответственно, два нацеливающих элемента 340 соответственно связаны со связывающими ветвями 320; и пять эффекторных элементов 440 соответственно связаны со связывающими ветвями 420. Эллипс 356 на фигуре 5В представляет связь между двумя соединяющими ветвями 330 и 430.

В необязательных вариантах осуществления молекулярная конструкция по настоящему изобретению может дополнительно содержать относительно длинную цепь PEG, присоединенную к первой либо второй центральной сердцевине, так чтобы молекулярная конструкция по настоящему изобретению могла распадаться вдали от ретикулоэндотелиальной системы и достигала более длительного периода полувыведения после введения субъекту. В случае, когда белок модифицируют цепью PEG, чтобы улучшить его фармакокинетические свойства и (или) снизить иммуногенность, предпочтительным является PEG с длиной до 20000-50000 дальтон. Соответственно, в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для присоединения нацеливающих и эффекторных элементов применяются связывающие ветви относительно более короткой длины, а цепь PEG весом 20000-50000 дальтон присоединяют к любому из линкерных звеньев с целью увеличения периода полувыведения in vivo молекулярной конструкции по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления для конструирования молекулярной конструкции по настоящему изобретению применяют несколько scFv-фрагментов в качестве нацеливающих и (или) эффекторных элементов. Фармацевтические средства с конфигурацией нацеливающий элемент/эффекторный элемент на основе молекулярных конструкций, содержащих scFv-фрагменты, должны иметь более длительные периоды полувыведения in vivo, чем отдельные фрагменты антител. Для некоторых способов клинического применения желательно значительно увеличить период полувыведения фармацевтических средств, чтобы устранить необходимость в частом введении лекарственных средств; в этих случаях цепи PEG массой 20000-50000 дальтон можно применять в качестве связывающих ветвей для связывания с scFv-фрагментами, которые служат в качестве нацеливающих или эффекторных элементов. PEG с такими значениями длины применяли для модификации большого количества терапевтических белков для увеличения их периодов полувыведения.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия линкерное звено может содержать две связывающие ветви, соответственно связанные с различными функциональными элементами. Обратимся теперь к фигуре 6, на которой молекулярная конструкция содержит два линкерных звена 100А и 200D. Первый и второй функциональные элементы 140 и 240 (один служит в качестве нацеливающего элемента, а другой служит в качестве эффекторного элемента) связаны соответственно с первой центральной сердцевиной 110а и второй центральной сердцевиной 210с посредством связывающих ветвей 120 и 220; и две центральные сердцевины 110а и 210с соединены друг с другом посредством реакции iEDDA, происходящей между соединяющими ветвями 130а и 230а, при этом эллипс 156 представляет химическую связь, образующуюся между ними. В дополнение к функциональному элементу 240, вторая центральная сердцевина 210с дополнительно связана с цепью PEG 260. В частности, вторая центральная сердцевина 210с содержит остаток AHA, который можно подвергнуть реакции и связать с цепью PEG 260, имеющей напряженную алкиновую группу, посредством реакции SPAAC, при этом ромб 182 представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC. В зависимости от намеченного и желаемого применения третий элемент может представлять собой второй нацеливающий элемент, второй эффекторный элемент или элемент, способный к улучшению фармацевтического свойства молекулярной конструкции. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия цепь PEG 260 имеет молекулярную массу приблизительно 20000-50000 дальтон.

На основании данной идеи линкерное звено может содержать множество связывающих ветвей, которые могут быть связаны со множеством функциональных элементов. Например, линкерное звено может содержать 5-12 связывающих ветвей, которые могут быть связаны с 5-12 функциональными элементами. Это является особенно применимым в случаях, когда функциональные элементы представляют собой малые молекулы, такие как терапевтические лекарственные средства или агонисты Toll-подобных рецепторов. Линкерное звено, несущее несколько молекул терапевтических лекарственных средств, называется в данном документе «связкой» лекарственных средств.

Кроме того, полипептидные сердцевины можно использовать для получения молекулярной конструкции, содержащей три линкерных звена. Соответственно, другой аспект настоящего раскрытия направлен на молекулярную конструкцию, содержащую три линкерных звена. Среди трех линкерных звеньев два из них могут быть присоединены друг к другу посредством реакции iEDDA, а третье линкерное звено присоединяется к любому из двух линкерных звеньев посредством реакции SPAAC или реакции CuAAC. Логическое обоснование получения конструкций с несколькими линкерными звеньями (например, тремя линкерными звеньями) заключается в том, что в их состав можно включить два различных набора нацеливающих элементов или два различных набора эффекторных элементов.

Обратимся теперь к фигуре 7, на которой молекулярная конструкция содержит три линкерных звена (500, 600, 700А). Линкерные звенья 500, 600, 700А, соответственно, содержат центральную сердцевину (510, 610, 710) и связывающую ветвь (520, 620, 720) с функциональным элементом (540, 640, 740), связанным с ней. Линкерное звено 600 характеризуется тем, что оно содержит цистеиновый остаток на одном из его N- или С-конца, связанный с соединяющей ветвью 630; и аминокислотный остаток, имеющий азидную или алкиновую группу, на другом из его N- или С-конца. Одна из соединяющих ветвей 530 и 630 имеет тетразиновую группу на своем свободном конце, а другая из соединяющих ветвей 530 и 630 имеет напряженную алкиновую группу на своем свободном конце. Соответственно, линкерные звенья 500 и 600 могут соединяться друг с другом посредством реакции iEDDA, происходящей между соединяющими ветвями 530 и 630, согласно способу связывания, описанному на фигуре 3А. Что касается связывания с линкерным звеном 700, если N- или С-концевой аминокислотный остаток центральной сердцевины 610 имеет азидную группу (например, остаток AHA), то центральная сердцевина 710 содержит аминокислоту, имеющую алкиновую группу (например, остаток HPG), на своем N- или С-конце; или если N- или С-концевой аминокислотный остаток центральной сердцевины 610 имеет алкиновую группу (например, остаток HPG), то центральная сердцевина 710 содержит аминокислоту, имеющую азидную группу (например, остаток AHA), на своем N- или С-конце. Таким образом, согласно способу связывания, описанному на фигуре 3В, линкерные звенья 600 и 700А могут непосредственно соединяться друг с другом посредством реакции CuAAC, происходящей между N- или С-концевыми аминокислотными остатками центральных сердцевин 610 и 710, без наличия соединяющих ветвей. Эллипс 560 и жирная точка 670 на фигуре 7, соответственно, представляют химические связи, образующиеся в результате реакции iEDDA и реакции CuAAC.

В качестве альтернативы, два из трех линкерных звеньев могут быть присоединены друг к другу посредством реакции iEDDA, а третье линкерное звено присоединяется к любому из двух линкерных звеньев посредством реакции SPAAC. Обратимся теперь к фигуре 7В, на которой линкерные звенья 500 и 600 соединены друг с другом посредством реакции iEDDA, описанной на фигуре 7А, тогда как линкерное звено 700В связано с линкерным звеном 600 посредством реакции SPAAC, происходящей между центральной сердцевиной 610 и соединяющей ветвью 730. Ромб 672 на фигуре 7В представляет химическую связь, образующуюся в результате реакции SPAAC.

Очевидно, что количество функциональных элементов 540, 640 и 740, соответственно связанных с линкерными звеньями 500, 600, 700А или 700В в каждом случае является разным в зависимости от намеченного применения. Согласно идее библиотек, показанной на фигуре 4, линкерные звенья, соответственно, несущие различные количества и (или) типы функциональных элементов, можно получать по отдельности в виде различных библиотек, и специалист в данной области может выбрать и объединить желаемые линкерные звенья из библиотек в соответствии с различными способами применения.

В целом, соединяющую ветвь молекулярной конструкции по настоящему изобретению, описанную в вышеприведенных аспектах и (или) вариантах осуществления настоящего раскрытия, которая имеет азидную, алкиновую, тетразиновую или напряженную алкиновую группу на конце, конструируют как цепь PEG, имеющую 2-12 повторяющихся EG-звеньев. Связывающую ветвь конструируют как цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев; предпочтительно связывающая ветвь представляет собой цепь PEG, имеющую 2-20 повторяющихся EG-звеньев с дисульфидной связью на свободном конце, не связанном с центральной сердцевиной.

Использование полипептида в качестве центральной сердцевины обеспечивает универсальность молекулярной конструкции по настоящему изобретению, при которой несколько копий или типов нацеливающих/эффекторных элементов могут присутствовать в одной конструкции и, соответственно, достигается повышение специфичности доставки лекарственных средств и действенности в намеченных участках-мишенях. Используемая молекулярная конструкция, содержащая несколько линкерных звеньев, может принимать большое количество конфигураций. Несколькими примерами являются: первое линкерное звено, несущее три scFv в качестве нацеливающих элементов, и второе линкерное звено, несущее 5 терапевтических лекарственных средств; первое линкерное звено, несущее три scFv в качестве нацеливающих элементов, и второе линкерное звено, несущее три scFv в качестве эффекторных элементов; первое линкерное звено, несущее два scFv из первого набора нацеливающих элементов, второе линкерное звено, несущее два scFv из второго набора нацеливающих элементов, и третье линкерное звено, несущее 5 терапевтических лекарственных средств; первое линкерное звено, несущее 2 bi-scFv в качестве нацеливающих элементов, и второе линкерное звено, несущее два scFv в качестве эффекторных элементов; или первое линкерное звено, несущее три scFv в качестве нацеливающих элементов, второе линкерное звено, несущее два scFv в качестве эффекторных элементов, со связывающей ветвью с прикрепленным длинноцепочечным PEG массой 20000-50000 дальтон в целях увеличения фармакокинетических свойств.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения бифункциональный PEG, выступающий в качестве связывающей ветви, применяют для связывания антиген-связывающих фрагментов антител, которые служат в качестве нацеливающих или эффекторных элементов, с аминогруппами, расположенными в полипептидной сердцевине. Каждый PEG может иметь NHS-группу на одном конце и малеимидную группу на другом конце. NHS-группа может соединяться с аминогруппой в полипептидной сердцевине, а малеимидная группа может соединяться с сульфогидрильной группой цистеинового остатка scFv, bi-scFv или Fab-фрагмента антитела. scFv и bi-scFv конструируют таким образом, чтобы они имели полипептидный линкер с концевым цистеиновым остатком на С-конце. Fab можно получить из целого IgG путем расщепления пепсином, и свободные сульфогидрильные группы получают из межцепочечной дисульфидной связи посредством реакции мягкого восстановления.

На схемах 8-12 представлены некоторые рабочие примеры, соответственно, показывающие соединение и получение определенных линкерных звеньев.

Схема 8 представляет собой схематическое изображение, на котором показано получение молекулярной конструкции по настоящему изобретению в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего раскрытия, в которой NHS представляет сложный NHS-эфир, Mal представляет малеимидную группу, A^AH представляет L-азидогомоаланиновый (AHA) остаток, G^HP представляет гомопропаргилглициновый (HPG) остаток, Ас представляет ацетильную группу, a scFv представляет одноцепочечный вариабельный фрагмент. На этапе 1, соответственно, получают первую центральную сердцевину, содержащую аминокислотную последовательность (GSK)₃ и L-азидогомоаланиновый (AHA) остаток на своем С-конце; и вторую центральную сердцевину, содержащую аминокислотную последовательность (GSK)₅ и гомопропаргилглициновый (HPG) остаток на своем С-конце. В целях стабилизации полипептида N-концы первой и второй центральных сердцевин, соответственно, модифицируют ацетильной группой. На этапе 2 связывающие ветви соответственно связываются с лизиновыми остатками в первой и второй центральных сердцевинах посредством образования амидной связи между ними; связывающая ветвь, связанная с центральной сердцевиной, имеет малеимидную группу на свободном конце. На этапе 3 первый нацеливающий элемент (т.е. антитело), имеющий тиольную группу (например, цистеиновый остаток), связывается со связывающей ветвью, связанной с первой центральной сердцевиной, посредством реакции тиольной и малеимидной групп; аналогично, эффекторный элемент (т.е. лекарственное средство), имеющий тиольную группу, связывается со связывающей ветвью, связанной со второй центральной сердцевиной, посредством реакции тиольной и малеимидной групп. На этапе 4 два линкерных звена соединяются посредством реакции CuAAC, происходящей между остатками AHA и HPG.

«Схема 8. Соединение линкерных звеньев посредством С-концевых аминокислотных остатков»

Нацеливающий/эффекторный элемент необязательно может связываться с центральной сердцевиной альтернативным способом. Схема 9 представляет собой схему, иллюстрирующую соединение эффекторного элемента с полипептидной сердцевиной, при котором сперва связывающая ветвь связывается с центральной сердцевиной, а затем эффекторный элемент (т.е. лекарственное средство) связывается со связывающей ветвью посредством реакции тиольной и малеимидной групп.

«Схема 9. Способ соединения эффекторного элемента с полипептидной сердцевиной посредством связывания со связывающими ветвями»

В альтернативном способе на схеме 10 эффекторный элемент (т.е. лекарственное средство) соединяется со связывающей ветвью с получением конъюгата связывающая ветвь-эффектор (т.е. PEG-лекарственное средство); далее конъюгат связывающая ветвь-эффектор связывается с центральной сердцевиной посредством образования амидной связи между лизиновыми остатками и группами сложного NHS-эфира.

«Схема 10. Альтернативный способ соединения эффекторного элемента с полипептидной сердцевиной сначала путем конъюгирования с цепью PEG, а затем связывания с аминогруппами лизиновых остатков»

В качестве альтернативы, связывающие ветви в конфигурации с сочлененными линкерами также можно применять для связывания с биспецифическими scFv, которые выступают в качестве нацеливающих элементов или эффекторных элементов. Эти конфигурации будут увеличивать специфичность нацеливания и (или) действенность эффекторных механизмов.

На схеме 11 представлен пример получения молекулярной конструкции по настоящему изобретению, которая содержит два линкерных звена; оба линкерных звена содержат аминокислотную последовательность (K-Хаа₄)₃ и цистеиновый (С) остаток на своем С-конце.

«Схема 11. Получение молекулярной конструкции посредством реакции iEDDA, происходящей между соединяющими ветвями»

На этапе 1 две соединяющие ветви соответственно связываются с остатками С линкерных звеньев, при этом одна из соединяющих ветвей имеет малеимидную (Mal) группу на одном конце и тетразиновую группу на другом конце, а другая соединяющая ветвь имеет Mal-группу на одном конце и ТСО-группу на другом конце. На этапе 2 связывающие ветви соответственно связываются с лизиновыми (K) остатками посредством образования амидной связи между связывающей ветвью и остатком K. Далее на этапе 3 три scFv антитела к антигену A (scFv α А) и три scFv антитела к антигену В (scFv α В) соответственно связываются со связывающими ветвями линкерных звеньев посредством реакции тиольной и малеимидной групп. Наконец, на этапе 4 два линкерных звена соединяются друг с другом посредством реакции iEDDA, происходящей между тетразиновой группой и ТСО-группой.

На схеме 12 представлен пример получения молекулярной конструкции, содержащей три линкерных звена, в котором два линкерных звена, соответственно связанных с scFv α А и scFv α В, соединяются друг с другом посредством реакции iEDDA, описанной на схеме 11, а третье линкерное звено соединяется со вторым линкерным звеном посредством реакции CuAAC.

«Схема 12. Получение молекулярной конструкции, имеющей три линкерных звена с тремя функциональными элементами»

В этом примере третье линкерное звено представляет собой «связку» лекарственных средств. Эту схему реакций, однако, можно применять к третьему линкерному звену с другими элементами, такими как scFv. В примере настоящего изобретения центральное линкерное звено (т.е. второе линкерное звено) содержит остаток HPG (GHP) на своем N-конце, и, соответственно, «связка» лекарственных средств, конъюгированная с остатком AHA (ААН), может связываться со вторым линкерным звеном посредством реакции CuAAC, происходящей между остатками HPG и AHA. В качестве альтернативы, центральное линкерное звено может содержать остаток AHA на своем N- или С-конце и может связываться с третьим линкерным звеном, несущим соединяющую ветвь с DBCO или другой напряженной алкиновой группой, посредством реакции SPAAC. Образованная таким образом молекулярная конструкция на схеме 12 имеет три функциональных элемента: scFv α A, scFv α В и молекулу лекарственного средства. Молекулярные конструкции с тремя линкерными звеньями могут нести три набора scFv, из них два набора в качестве нацеливающих элементов и один набор в качестве эффекторных элементов или один набор в качестве нацеливающих элементов и два набора в качестве эффекторных элементов.

Если все нацеливающие и эффекторные элементы представляют собой scFv и применяются связывающие ветви весом 600 дальтон (12 EG-звеньев), то молекулярная конструкция в общей сложности с шестью scFv имеет молекулярную массу приблизительно 170000 дальтон. Молекулярная конструкция с семью scFv имеет молекулярную массу приблизительно 200000 дальтон, а молекулярная конструкция с восемью scFv имеет молекулярную массу приблизительно 230000 дальтон. Большинство молекулярных конструкций по настоящему изобретению имеют значения молекулярной массы, составляющие менее 200000 дальтон, и несколько молекулярных конструкций имеют значения молекулярного веса, составляющие 200000-250000 дальтон.

Если в одной молекулярной конструкции необходимо перенести четыре различных набора scFv, то предпочтительным является наличие одного линкерного звена, несущего сочлененный одноцепочечный биспецифический scFv (bi-scFv), такой как scFv1-scFv2 (например, специфичный к HER2 и HER3), и двух других линкерных звеньев, каждое из которых несет один scFv (т.е., соответственно, scFv3 и scFv4). Существует два способа конструирования биспецифического scFv1-scFv2. В «тандемной» конфигурации расположение представлено как V_L1-V_H1-V_L2-V_H2 или V_H1-V_L1-V_H2-V_L2; в конфигурации «диатела» расположение представлено как V_L2-V_L1-V_H1-V_H2 или V_H2-V_H1-V_L1-V_L2. Надлежащие линкеры с повторами GGGGS (SEQ ID NO: 6) или других последовательностей расположены между доменами иммуноглобулинов.

Как показывает практика, пептидный или PEG-линкер, который содержит малеимидную и азидную группы, может полимеризоваться при длительном хранении вследствие спонтанной реакции присоединения между малеимидной и азидной группами. Таким образом, предпочтительно, чтобы каждое линкерное звено получали заново и независимо и подвергали процессу присоединения к нацеливающим или эффекторным элементам в линкерных звеньях и незамедлительно проводили соединение линкерных звеньев посредством клик-реакции. Альтернативный предпочтительный вариант осуществления заключается в том, что как нацеливающие элементы, так и эффекторные элементы конъюгируют с линкерными звеньями с алкиновыми группами, и алкиновую группу в одном из линкерных звеньев далее превращают в азидную группу с помощью короткого гомобифункционального линкера с азидными группами на обоих концах. Линкерные звенья, одно с алкиновой группой, а другое с азидной группой, далее соединяют посредством клик-реакции.

Предпочтительные связывающие ветви для настоящего изобретения представляют собой PEG. Длина связывающих ветвей важна по нескольким соображениям. Они должны быть достаточно длинными, чтобы обеспечивать гибкость связанных scFv или других типов функциональных элементов для достижения антигенных участков-мишеней на поверхности клеток-мишеней без стерических ограничений; но недостаточно длинными, чтобы обуславливать образование внутримолекулярных и межмолекулярных сплетений связывающих ветвей и связанных с ними scFv-фрагментов или функциональных элементов или излишне увеличивать размер целой молекулярной конструкции, препятствуя проникновению в ткани. Связывающие ветви, которые являются слишком длинными, также могут быть неспособны обеспечивать сближение молекул антигенов с образованием компактных кластеров, если такие кластеры необходимы для инициирования процесса передачи сигнала для осуществления апоптоза или других клеточных эффектов. Оптимальную длину связывающих ветвей для различных типов комбинаций антигенов-мишеней и связывающихся с ними средств может определить любой специалист в соответствующей области техники без проведения излишних экспериментов. Связывающая ветвь NHS-(PEG)₁₂-малеимид (примерно 500 дальтон) является предпочтительной в ряде молекулярных конструкций по настоящему изобретению. Полностью растянутый (PEG)₁₂ имеет длину 40-50

Применимые связывающие ветви и соединяющие ветви не ограничены цепями PEG. Можно применять пептиды, содержащие глицин, серии и другие гидрофильные аминокислотные остатки, а также полисахариды и другие биосовместимые линейные полимеры, модифицированные таким образом, что они содержат NHS- и малеимидные группы.

Для определенных способов терапевтического применения желательно, чтобы эффекторные элементы в молекулярных конструкциях по настоящему раскрытию высвобождались из связывающих ветвей, так чтобы они могли поступать в клетки в участке-мишени, в том числе в клетки, связанные с нацеливающими элементами, или окружающие клетки, вызывая фармакологические эффекты. В этих случаях в связывающую ветвь встраивают расщепляемую связь. Были разработаны расщепляемые связи, восприимчивые к расщеплению путем гидролиза, воздействия кислот, восстановления и под действием ферментов. Например, в конструировании терапевтических конструкций применяли пептидные сегменты, восприимчивые к действию матриксных металлопротеиназ, присутствующих в воспаленных тканях. Один вариант осуществления настоящего изобретения заключается в применении PEG-линкеров NHS-PEG_2-12S-S-малеимид со связью S-S рядом с малеимидной группой, где S-S представляет собой дисульфидную связь, которую можно подвергнуть медленному восстановлению.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия нацеливающий элемент, описанный в вышеупомянутых вариантах осуществления, выбран из группы, состоящей из фактора роста, пептидного гормона, цитокина и фрагмента антитела; а эффекторный элемент представляет собой иммуномодулятор, хелатообразователь в комплексе с радиоактивным нуклидом, терапевтическое лекарственное средство, цитокин, растворимый рецептор или антитело.

В вариантах осуществления антитело находится в форме антиген-связывающего фрагмента (Fab), вариабельного фрагмента (Fv), одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), однодоменного антитела (sdAb) или биспецифического одноцепочечного вариабельного фрагмента (bi-scFv). В соответствии с одним вариантом осуществления bi-scFv представляет собой биспецифический тандемный scFv или биспецифический scFv в форме диатела.

Для сохранения диффундирующей способности молекулярных конструкций предпочтительным является размер молекулы, составляющий менее 250000 дальтон. Таким образом, scFv-фрагменты являются предпочтительными для большинства вариантов осуществления. На уровне ДНК гены конструируют так, чтобы V_L и V_H были связаны в виде единого полипептида в любом порядке (V_L и V_H или V_H и V_L) пептидным линкером из 10-25 аминокислотных остатков, преобладающими остатками в котором являются глицин и серин. На С-конце встраивают короткий фрагмент с глициновым и сериновым и концевым цистеиновым остатками. Рекомбинантные scFv и bi-scFv можно получать в бактериях, таких как Е. coli и Pseudomonas putida, в дрожжах, таких как Pichia pastoris, или в клетках млекопитающих, таких как линии клеток СНО и HEK293.

В лаборатории авторов настоящего изобретения было получено большое количество антител IgG, Fab, scFv и различных фрагментов антител, белков на основе Fc и других рекомбинантных антител в линиях клеток HEK293 и СНО для проведения экспериментов в системах in vitro и в животных моделях. В лаборатории также были разработаны линии клеток для получения антител для клинических испытаний с участием людей. Для удобства можно использовать систему транзиентной экспрессии HEK293 для получения до 1 г IgG или фрагментов антител с применением нескольких колб на 1-2 литра в научно-исследовательской лаборатории. scFv-фрагменты, подлежащие применению в молекулярных конструкциях по настоящему изобретению, как правило, не имеют углеводной модификации, и углеводная модификация не требуется для активности связывания scFv с их антигенными мишенями. Более того, в scFv-фрагменте присутствует только одна дисульфидная связь и один концевой цистеин. Поэтому для получения scFv были разработаны маломасштабные бактериальные системы экспрессии в качестве производственной альтернативы. В случае с Е. coli использовали системы экспрессии для извлечения scFv из внутриклеточных телец-включений, из периплазмы и в секретируемой форме. scFv в большинстве случаев можно очищать с помощью аффинной колонки с белком L, который взаимодействует с VH большинства легких κ-цепей, или, в других случаях, с помощью ионообменных колонок.

В основе примеров настоящего изобретения лежит платформа с сочлененными линкерами, в которой в качестве нацеливающих и (или) эффекторных элементов используются главным образом scFv и Fab. Однако, также можно подвергать скринингу конкретные связывающие молекулы из больших библиотек связывающих молекул на основе sdAb или других фрагментов антител. Библиотеки связывающих молекул, в основе которых не лежат домены иммуноглобулинов, но которые напоминают антитела тем, что они характеризуются аффинностью специфичного связывания с выбранными молекулами-мишенями, включают (1) аптамеры, которые представляют собой олигонуклеотиды или короткие пептиды, выбранные для связывания с молекулами-мишенями, (2) финомеры, которые представляют собой небольшие связывающие белки, полученные из домена SH3 человеческого Fyn, (3) аффимеры, которые представляют собой связывающие белки, полученные из семейства цистатинов-ингибиторов цистеиновых протеиназ, и (4) дарпины (искусственные белки с анкириновыми повторами), которые представляют собой белки, полученные методами генной инженерии, со структурами, полученными из природных белков-анкиринов, и состоят из 3, 4 или 5 повторяющихся мотивов этих белков. Эти миметики антител имеют молекулярные массы, составляющие приблизительно 10000-20000 дальтон.

II-(ii) Функциональные элементы, подходящие для использования с молекулярной конструкцией с сочлененными линкерами

Как обсуждалось выше, данный сочлененный линкер содержит по меньшей мере два линкерных звена, в которых первое линкерное звено несет один или несколько целевых элементов, а второе линкерное звено несет один или несколько эффекторных элементов или элементов, повышающих фармакокинетические свойства, и наоборот. Конкретные примеры функциональных элементов, включенных в данную молекулярную конструкцию с сочлененными линкерами для лечения конкретного заболевания, обсуждаются ниже.

Для лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) scFv, специфичный к рецептору трансферрина, может использоваться в качестве нацеливающего элемента данных молекулярных конструкций с сочлененными линкерами в связи с эффекторными элементами, подходящими для конкретного заболевания ЦНС. Например, в молекулярных конструкциях с сочлененными линкерами для лечения рассеянного склероза в качестве эффекторного элемента могут использоваться финголимод, финголимод-фосфат, интерферон-β или scFv, специфичный к интегрину α4. В случае болезни Альцгеймера в иллюстративных молекулярных конструкциях с сочлененными линкерами в качестве эффекторного элемента может использоваться scFv, специфичный к β-амилоиду.

При заболеваниях или состояниях, связанных с инфекцией, scFv, специфичный к CD16b или к CD32, может использоваться в качестве эффекторного элемента, тогда как нацеливающий элемент зависит от причины инфекции. В частности, если инфекция вызвана вирусом, в качестве нацеливающего элемента используется scFv, специфичный к вирусному белку, а если инфекция вызвана бактерией, то в качестве нацеливающего элемента используется scFv, специфичный к бактериальному белку. Иллюстративные примеры вирусных белков включают, без ограничения, белок F респираторно-синцитиального вируса (RSV), белок gp120 вируса иммунодефицита человека 1 типа (HIV-1), гемагглютинин А (НА) белка вируса гриппа А или гликопротеин цитомегаловируса. Примеры бактериального белка включают без ограничения эндотоксин грамотрицательных бактерий, мембранный антиген бактерии Clostridium difficile, липотейхоевую кислоту бактерии Staphylococcus aureus, сибиреязвенный токсин бактерии Bacillus anthracis или шигаподобный токсин I или II типа бактерии Escherichia coli.

II-(iii) Использование молекулярной конструкции с сочлененными линкерами

Настоящее раскрытие также относится к способу лечения различных заболеваний с использованием подходящей молекулярной конструкции с сочлененными линкерами. Как правило, способ включает стадию введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества молекулярной конструкции с сочлененными линкерами в соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия.

ЧАСТЬ III. Молекулярные конструкции на основе Fc для лечения заболеваний центральной нервной системы или инфекционных заболеваний

III-(i) Структура молекулярной конструкции на основе Fc

Иммуноглобулиновое антитело в широком смысле конфигурации на основе Fc может служить в качестве основы для нацеливающего или эффекторного элемента, и его соответствующий эффекторный или нацеливающий элемент может быть включен в его состав на С-конце его двух тяжелых γ-цепей в форме доменов scFv. В типичной конфигурации «на основе Fc» двухцепочечный IgG.Fc применяют в качестве основы для молекулярной платформы. Каждая из полипептидных цепей слита с одним или двумя нацеливающими и одним или двумя эффекторными элементами, так что на каждой цепи находится в общей сложности от двух до трех элементов. Молекула Т-Е с конфигурацией на основе Fc будет иметь в общей сложности от четырех до шести элементов (например, scFv или любых других фрагментов антител). Fc-часть молекулярных конструкций необязательно также заключает в себе Fc-опосредованные эффекторные функции, ADCC и (или) комплемент-опосредованную активацию. Хотя в некоторых других способах применения такие Fc-опосредованные эффекторные функции не рассматриваются.

При конструировании молекулярных конструкций на основе Fc нацеливающие элементы располагают на N- или С-конце. Если эффекторные элементы функционируют посредством связывания с компонентом клеточной поверхности, то они также должны размещаться на данном конце. Если эффекторные элементы функционируют путем связывания с растворимыми факторами и их нейтрализации, то они могут располагаться между концевым нацеливающим или эффекторным элементом и СН2-СН3.

Путем выбора элементов Т-Е данной молекулярной конструкции на основе Fc молекулярная конструкция может использоваться для лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) или инфекционных заболеваний. Настоящее раскрытие также полезно тем, что в некоторых вариантах осуществления в нем используется линкерное звено в соответствии с первым аспектом настоящего раскрытия, которое представляет собой легкое средство для управления количеством нацеливающих и эффекторных элементов настоящих молекулярных конструкций на основе Fc. В зависимости от выбранных нацеливающих и (или) эффекторных элементов настоящая молекулярная конструкция на основе Fc может принимать различные конфигурации, которые обсуждаются ниже, соответственно.

В настоящих молекулярных конструкциях на основе Fc как нацеливающий элемент, так и эффекторный элемент представляют собой антитела или их фрагменты.

Фигура 8А представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее молекулярную конструкцию 800А на основе Fc в соответствии с определенными вариантами осуществления настоящего раскрытия. Как проиллюстрировано, молекулярная конструкция 800А на основе Fc содержит две идентичные цепи 810 СН2-СН3, пару эффекторных элементов Е1, связанных с N-концами цепей 810 СН2-СН3, и пару нацеливающих элементов Т1, связанных с С-концами цепей 810 СН2-СН3. В этой иллюстративной конфигурации как нацеливающий элемент Т1, так и эффекторный элемент Е1 представляют собой scFv.

Молекулярная конструкция 800В на основе Fc, проиллюстрированная на фигуре 8В, довольно сходна по структуре с молекулярной конструкцией 800А на основе Fc на фигуре 8А, за исключением того, что два эффекторных элемента Е1 соответственно связаны с С-концами цепей 810 СН2-СН3, а два нацеливающих эффектора соответственно связаны с С-концами цепей 810 СН2-СН3.

В соответствии с определенными вариантами осуществления как эффекторные элементы, так и нацеливающие элементы связаны с N-концами цепей СН2-СН3. Например, если как эффекторный элемент, так и нацеливающий элемент находятся в форме одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv), то эффекторный элемент и нацеливающий элемент могут быть связаны в тандемной конфигурации или в конфигурации диатела с образованием, таким образом, биспецифического scFv, связанного с N-концом цепи СН2-СН3.

Молекулярная конструкция 800С на основе Fc (фигура 8С) содержит Fc-часть, и, соответственно, с N-концом каждой цепи 810 СН2-СН3 связан биспецифический scFv Т1-Е1.

В некоторых примерах пара эффекторных элементов или пара нацеливающих элементов имеет конфигурацию Fab (т.е. состоит из домена V_H-CH1 и домена V_L-Cκ); этот Fab-фрагмент связан с N-концами цепей СН2-СН3, так что молекулярная конструкция на основе Fc принимает конфигурацию IgG. В этих случаях пара элементов, которая не находится в конфигурации Fab, может быть связана с С-концами пары сегментов СН2-СН3.

Например, в молекулярной конструкции 900 на основе Fc на фигуре 9 каждый из двух нацеливающих элементов Т1 содержит домен 820 V_H-CH1 и домен 825V_L-Cκ с образованием, таким образом, конфигурации Fab 830, связанной с N-концами цепей 810 СН2-СН3, так что молекулярная конструкция 900 на основе Fc принимает конфигурацию IgG. В этом случае пара эффекторных элементов Е1 связана с С-концами пары цепей 810 СН2-СН3.

Согласно некоторым вариантам осуществления, данная молекулярная конструкция на основе Fc имеет эффекторный элемент, являющийся пептидом.

Например, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего раскрытия, эффекторный элемент может представлять собой пептид с определенным терапевтическим эффектом, тогда как нацеливающий элемент представляет собой антитело или его фрагмент (см. фигуры 10А и 10В). Как показано на фигуре 10А, молекулярная конструкция 1000А на основе Fc содержит пару нацеливающих элементов Т1 (в виде scFv), связанных с N-концами пары сегментов 1210 СН2-СН3, и пару эффекторных элементов Е1 (в форме терапевтических пептидов), связанную с С-концами пары сегментов 1210 СН2-СН3.

Аналогично, в молекулярной конструкции 1000В на основе Fc на фигуре 10В пара нацеливающих элементов Т1 (в виде scFv) связана с С-концами пары сегментов 1210 СН2-СН3, а пара эффекторных элементов Е1 (в форме терапевтических пептидов) связана с N-концами пары сегментов 1210 СН2-СН3.

Следует понимать, что для молекулярных конструкций на основе Fc, в которых в качестве эффекторного элемента используется пептид, нацеливающий элемент может быть встроен в Fab-фрагмент, так что молекулярные конструкции принимают конфигурацию IgG.

В конфигурации, изображенной на фигурах 8А-10В, цепи СН2-СН3 унаследованы от человеческих иммуноглобулинов γ1 или γ4. Как правило, выбирают γ1, если желательны Fc-опосредованные функции, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и комплемент-опосредованная активность (воспалительная активация или лизис клеток-мишеней). В случае если Fc-опосредованных функций следует избегать, для создания настоящих молекулярных конструкций на основе Fc выбирается γ4.

III-(ii) Функциональные элементы, подходящие для использования с молекулярной конструкцией на основе Fc

Теперь, когда основные типы структурной организации молекулярных конструкций на основе Fc были обсуждены выше, определенные комбинации конкретного (конкретных) эффекторного (эффекторных) элемента (элементов) и нацеливающего (нацеливающих) элемента (элементов) представлены ниже для целей иллюстрации.

Для лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) антитело (или его фрагмент), специфичное к рецептору трансферрина, можно использовать в качестве нацеливающего элемента в связи с эффекторными элементами, подходящими для конкретного заболевания ЦНС. Например, в молекулярных конструкциях на основе Fc для лечения рассеянного склероза в качестве эффекторного элемента может использоваться scFv, специфичный к интегрину α4. В случае болезни Альцгеймера в иллюстративных молекулярных конструкциях на основе Fc в качестве эффекторного элемента может использоваться scFv, специфичный к β-амилоиду. Вышеупомянутые молекулярные конструкции на основе Fc для лечения заболеваний ЦНС могут принимать конфигурацию, описанную в связи с любой из фигур 8А-8С и с фигурой 9.

В молекулярных конструкциях на основе Fc для лечения рассеянного склероза в качестве эффекторных элементов могут также использоваться INF-β1a или INF-β1b. В этом случае молекулярные конструкции на основе Fc могут принимать конфигурацию, описанную в связи с фигурами 10А или 10В.

При создании молекулярных конструкций на основе Fc для лечения заболеваний/состояний, связанных с инфекцией (таких как вирусные инфекции или бактериальные инфекции), в качестве нацеливающего элемента можно использовать антитело (или его фрагмент), специфичное к вирусному белку или к бактериальному белку. Что касается эффекторных элементов для лечения инфекций, можно использовать антитело (или его фрагмент), специфичное к CD32 или к CD16b. Эти молекулярные конструкции на основе Fc могут принимать конфигурацию, описанную в связи с любой из фигур 8А-8С и с фигурой 9.

Сущностью настоящего изобретения являются логическое обоснование и идея использования конкретной комбинации или составления пар нацеливающих и эффекторных элементов. Использование конфигурации слияния с Fc в молекулярных конструкциях является предпочтительным вариантом осуществления. Для специалистов в данной области возможным является связывание пар нацеливающих и эффекторных элементов по настоящему изобретению с использованием других молекулярных платформ, таких как пептиды, белки (например, альбумин), полисахариды, полиэтиленгликоль и другие типы полимеров, которые служат в качестве структурной основы для прикрепления нескольких молекулярных элементов.

III-(iii) Использование молекулярной конструкции на основе Fc

Настоящее раскрытие также относится к способу лечения заболеваний ЦНС с использованием подходящей молекулярной конструкции на основе Fc. Как правило, способ включает стадию введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества молекулярной конструкции на основе Fc в соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия.

Настоящее раскрытие также относится к способу лечения инфекций с использованием подходящей молекулярной конструкции на основе Fc. Как правило, способ включает стадию введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества молекулярной конструкции на основе Fc в соответствии с вариантами осуществления настоящего раскрытия.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ

Пример 1. Синтез пептида 1 (SEQ ID NO: 18), пептида 2 (SEQ ID NO: 27) и пептида 3 (SEQ ID NO: 19) в качестве пептидных сердцевин и конъюгирование SH-группы их цистеинового остатка с малеимид-PEG3-транс-циклооктеном (ТСО) в качестве соединяющей ветви

Синтезированные пептиды 1, 2 и 3 (Chinapeptide Inc., Shanghai, China) обрабатывались сходным образом. Очищенный пептид растворяли в 100 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA, в конечной концентрации 2 мМ. Растворенный пептид восстанавливали с помощью 1 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) при 25°С в течение 2 часов. Для конъюгирования SH-группы цистеинового остатка с малеимид-PEG3-ТСО (Conju-Probe Inc.) с получением функциональной связывающей ТСО-группы пептид и малеимид-PEG3-ТСО смешивали в молярном соотношении 1/7,5 и инкубировали при рН 7 и 25°С в течение 18 часов. Пептид, конъюгированный с ТСО, очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC на колонке Supelco С18 (250 мм × 10 мм; 5 мкм) с применением подвижной фазы в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты, линейного градиента 0-100% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 25°С.

Идентификацию синтезированных ТСО-пептидов (см. ниже) проводили методом масс-спектрометрии MALDI-TOF. Масс-спектрометрический анализ проводили в центре спектрометрии (Mass Core Facility) при Институте молекулярной биологии (Institute of Molecular Biology (IMB), Academia Sinica, Taipei, Taiwan). Измерения осуществляли на масс-спектрометре Bruker Autoflex III для MALDI-TOF/TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany).

Синтезированный ТСО-функционализированный пептид 1, как показано ниже, имел молекулярную массу 2078,9 дальтон.

Синтезированный ТСО-функционализированный пептид 2, как показано ниже, имел молекулярную массу 2020,09 дальтон.

ТСО-функционализированный пептид 3, как показано ниже, имел молекулярную массу 3381,85 дальтон.

Пример 2. Синтез пептида 1 в качестве пептидной сердцевины и конъюгирование SH-группы его цистеинового остатка с малеимид-PEG₄-тетразином в качестве соединяющей ветви

Синтезированный пептид 1 (Chinapeptide Inc., Shanghai, China) растворяли в 100 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA, в конечной концентрации 2 мМ. Растворенный пептид восстанавливали с помощью 1 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) при 25°С в течение 2 часов. Для конъюгирования SH-группы цистеинового остатка с малеимид-PEG4-тетразином (Conju-probe Inc., San Diego, USA) с получением функциональной связывающей группы тетразин, пептид и малеимид-PEG₄-тетразин смешивали в соотношении 1/5 и инкубировали при рН 7 и температуре 4°С в течение 18 часов. Пептид, конъюгированный с тетразином, очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC на колонке Supelco С18 (250 мм × 10 мм; 5 мкм) с применением подвижной фазы в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты, линейного градиента 0-100% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин, и температуры колонки 25°С.

Синтезированный тетразин-функционализированный пептид 1, как показано ниже, имел молекулярную массу 2185,2 дальтон.

Пример 3. Синтез линкерного звена путем конъюгирования NHS-PEG₁₂-Mal с NH₂-группами ТСО-функционализированного пептида 1 в качестве связывающих ветвей

Три связывающих ветви PEG₁₂-малеимида прикрепляли к пептидной сердцевине, ТСО-функционализированному пептиду 1. Сшивающее средство, NHS-PEG₁₂-малеимид (сукцинимидиловый сложный эфир [(N-малеимидопропионамидо)додекаэтиленгликоля]), приобретали у Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, USA). Процедуру конъюгирования осуществляли согласно инструкции изготовителя. Вкратце, пептид с лизиновыми остатками растворяли в буфере для конъюгирования, представляющем собой фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,5) при 100 мМ. Затем сшивающее средство NHS-PEG₁₂-малеимид добавляли к растворенному пептиду с конечной концентрацией 1 мМ (в 10-кратном молярном избытке по отношению к 0,1 мМ раствору пептида). Реакционные смеси инкубировали в течение 18 часов при комнатной температуре. ТСО-функционализированный пептид 1, конъюгированный с малеимидом-PEG₁₂, очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Supelco С18 (250 мм × 4,6 мм, 5 мкм) с применением подвижной фазы в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом 0-100% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 25°С.

Идентификацию ТСО-функционализированного пептида 1, конъюгированного с малеимидом-PEG₁₂, проводили методом масс-спектрометрии MALDI-TOF.

Синтезированный ТСО-функционализированный пептид 1, конъюгированный с малеимидом-PEG₁₂, имел молекулярную массу 4332 дальтон. Как проиллюстрировано ниже, ТСО-пептид 1, конъюгированный с малеимидом-PEG₁₂, представлял собой линкерное звено на основе пептидной сердцевины, несущее одну ТСО-группу и три связывающих ветви PEG с малеимидными группами.

Пример 4: Синтез линкерного звена путем конъюгирования NHS-PEG₁₂-Mal с NH₂-группами тетразин-функционализированного пептида 1 в качестве связывающих ветвей

К пептидной сердцевине на основе тетразин-функционализированного пептида 1 прикрепляли три PEG₁₂-малеимидные связывающие ветви. Сшивающее средство NHS-PEG12-малеимид (сукцинимидиловый сложный эфир [(N-малеимидопропионамидо)додекаэтиленгликоля]) приобретали у Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, USA). Процедуру конъюгирования осуществляли согласно инструкции производителя. Вкратце, пептид с лизиновыми остатками растворяли в буфере для конъюгирования, представляющем собой фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,5), при 100 мМ. Затем к растворенному пептиду добавляли сшивающее средство MHS-PEG₁₂-малеимид в конечной концентрации 1 мМ (в 10-кратном молярном избытке по отношению к 0,1 мМ раствору пептида). Реакционные смеси инкубировали в течение 18 часов при комнатной температуре. Тетразин-функционализированный пептид 1, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, очищали с помощью обращенно-фазовой HPLC на колонке Supelco С18 (250 мм × 4,6 мм; 5 мкм) с применением подвижной фазы в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом 0-100% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 25°С.

Синтезированный тетразин-функционализированный пептид 1, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, проиллюстрированный ниже, представлял собой линкерное звено на основе пептидной сердцевины, несущее одну соединяющую ветвь с тетразиновой группой и две связывающие ветви PEG с малеимидными группами. Результат масс-спектрометрии MALDI-TOF на фигуре 11 показывает, что молекулярная конструкция имела молекулярную массу 4461 дальтон.

Пример 5: Конъюгирование молекул финголимода и финголимод-фосфата с помощью сшивающего средства NHS-PEG₅-NHS

Финголимод был приобретен у Biotang Inc. (Lexington, USA), а финголимод-фосфат - у KM3 Scientific Corporation (New Taipei City, Taiwan). NH₂-группу молекулы финголимода подвергали взаимодействию с гомо-бифункциональным сшивающим средством, NHS-PEG₅-NHS, как показано на схеме 13. Финголимод растворяли в 100% ДМСО при конечной концентрации 10 мМ; NHS-PEG₅-NHS растворяли в 100% ДМСО при конечной концентрации 250 мМ. Для активации NH₂-группы финголимода, 6% (об./об.) к раствору финголимода добавляли основной фосфатно-солевой буферный раствор (рН 12,7) и затем инкубировали в течение 10 минут. Сшивающее средство NHS-PEG₅-NHS добавляли к раствору финголимода при конечной концентрации 30 мМ (в 3-кратном молярном избытке по отношению к 10 мМ раствора финголимода). Реакционную смесь инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре.

«Схема 13. Конъюгирование молекул финголимода с помощью сшивающего средства NHS-PEG₅-NHS»

Финголимод-фосфат растворяли в 100% ДМСО при конечной концентрации 5 мМ, а сшивающее средство NHS-PEG₅-NHS растворяли в 100% ДМСО при конечной концентрации 250 мМ. Сшивающее средство NHS-PEG₅-NHS добавляли к раствору финголимод-фосфата с конечной концентрацией 15 мМ (в 3-кратном молярном избытке по отношению к 5 мМ раствора финголимод-фосфата). Реакционную смесь инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре, затем добавляли 18% (об./об.) кислотный буфер (рН=0,88) для остановки реакции. Растворитель выпаривали в вакууме.

Финголимод, конъюгированный с NHS-PEG₅, и финголимод-фосфат, конъюгированный с NHS-PEG₅, растворяли в 30% ацетонитриле и затем очищали с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ с на колонке Supelco С18 (250 мм × 4,6 мм, 5 мкм) с применением подвижной фазы в виде ацетонитрила и 0,1% трифторуксусной кислоты с линейным градиентом 30-100% ацетонитрила в течение 30 минут при скорости потока 1,0 мл/мин и температуре колонки 25°С.

На фигуре 12 показано, что синтезированный финголимод, конъюгированный с NHS-PEG₅, как показано на схеме 13, имел молекулярную массу 725,41 дальтон.

Синтезированный финголимод-фосфат, конъюгированный с NHS-PEG₅, как проиллюстрировано ниже, имел молекулярную массу 803,3 дальтона.

Пример 6: Конъюгирование молекул финголимода с помощью связывающей ветви азидо-NHS-S-S-PEG₃

NH₂-группу молекулы финголимода подвергали взаимодействию гетеро-бифункционального расщепляемого линкера NHS-S-S-PEG₃-азидо (Conju-probe Inc.) с молярным соотношением 1:3. Продукт, азидо-PEG3-S-S-финголимод, очищали с помощью ВЭЖХ для удаления избыточных непрореагировавших молекул финголимода. Процедуры конъюгирования и очистки были аналогичны процедурам, описанным в предыдущем примере.

Синтезированный финголимод, конъюгированный с азидо-PEG₃-S-S, как показано ниже, имел молекулярную массу 629,33 дальтона.

Пример 7: Конъюгирование молекул финголимода, конъюгированного с азидо-PEG₃-S-S, с помощью сшивающего средства NHS-PEG₄-дибензилциклооктина (DBCO)

Молекулы финголимода, конъюгированного с азидо-PEG₃-S-S, растворяли в 100% ДМСО при конечной концентрации 10 мМ, а сшивающее средство NHS-PEG₄-DBCO растворяли в 100% ДМСО при конечной концентрации 250 мМ. Сшивающее средство NHS-PEG₄-DBCO в количестве 5 мкл добавляли к 400 мкл раствора финголимода, конъюгированного с азидо-PEG₃-S-S, до конечного молярного соотношения 1/3,2 (NHS-PEG₄-DBCO: финголимод, конъюгированный с азидо-PEG₃-S-S) в 100 мМ фосфатно-солевого буферного раствора при рН 7,5. Реакционную смесь инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре.

Синтезированный финголимод, конъюгированный с NHS-PEG₄-PEG₃-S-S, как показано ниже, имел молекулярную массу 1278,61 дальтона. Два изотопических пика также наблюдались в спектре PC при 1279,64 и 1280,635, что соответствует [М+Н+1]⁺ и [М+Н+2]⁺.

Пример 8: Конъюгирование молекул финголимода, конъюгированного с NHS-PEG₅, с ТСО-функционализированным пептидом 2 и 3

ТСО-функционализированный пептид 2 растворяли в 100 мМ фосфатно-солевого буферного раствора при рН 7,5 до концентрации 20 мМ, а финголимод, конъюгированный с NHS-PEG₅, растворяли в 100% ДМСО до концентрации 50 мМ.

ТСО-функционализированный пептид 2 и финголимод, конъюгированный с NHS-PEG₅, смешивали при молярном соотношении 1/42 в 100% ДМСО и инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем к реакционному раствору вновь добавляли ТСО-функционализированный пептид 2 до конечного молярного соотношения 1/13,5 (ТСО-функционализированный пептид 2: финголимод, конъюгированный с NHS-PEG₅) в 100% ДМСО. Смесь дополнительно инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре. На фигуре 13 показано, что «связка» лекарственных средств ТСО-функционализированного пептида 2 и финголимода имела молекулярную массу 5069 дальтон.

ТСО-функционализированный пептид 3 растворяли в 100 мМ фосфатно-солевого буферного раствора при рН 7,5 до концентрации 10 мМ, а финголимод, конъюгированный с NHS-PEG₅, растворяли в 100% ДМСО до концентрации 50 мМ.

ТСО-функционализированный пептид 3 и финголимод, конъюгированный с NHS-PEG₅, смешивали при молярном соотношении 1/4 при комнатной температуре в течение ночи. На фигуре 14 показано, что «связка» лекарственных средств ТСО-функционализированного пептида 3 и финголимода имела молекулярную массу 9479 дальтон, что указывает на факт конъюгирования десяти молекул финголимода в линкерное звено ТСО-функционализированного пептида 3.

Синтезированная «связка» лекарственных средств, проиллюстрированная ниже, состояла из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из пяти молекул финголимода.

Вторая синтезированная «связка» лекарственных средств, проиллюстрированная ниже, состояла из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из десяти молекул финголимода.

Пример 9. Конъюгирование молекул финголимод-фосфата, конъюгированного с NHS-PEG₅, с ТСО-функционализированным пептидом 2.

ТСО-функционализированный пептид 2 и финголимод-фосфат, конъюгированный с NHS-PEG₅, смешивали при молярном соотношении 1/42 в 100 мМ фосфатно-солевого буферного раствора при рН 7,5 при комнатной температуре в течение 3 часов. Масс-спектрометрический анализ продемонстрировал, что «связка» лекарственных средств ТСО-функционализированного пептида 2 и финголимод-фосфата имела молекулярную массу 5 379,16 дальтона (фигура 15).

Синтезированная «связка» лекарственных средств, проиллюстрированная ниже, состояла из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из пяти молекул финголимод-фосфата в качестве эффекторных элементов.

Пример 10: Конъюгирование молекул финголимода, конъюгированного с NHS-PEG₄-PEG₃-S-S, с ТСО-функционализированным пептидом 2

Пять молекул финголимода, конъюгированного с NHS-PEG₄-PEG₃-S-S, прикрепляли к ТСО-функционализированному пептиду 2. Конъюгирование молекул финголимода, конъюгированного с NHS-PEG₄-PEG₃-S-S, с NH₂-группами лизиновых остатков ТСО-функционализированного пептида 2 было выполнено аналогично предыдущему примеру. Идентификацию проводили методом масс-спектрометрии MALDI-TOF.

Синтезированная «связка» лекарственных средств, как показано ниже, имела молекулярную массу 7815 дальтон; она состояла из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из пяти молекул финголимода.

Пример 11: Получение рекомбинантного эктодомена человеческого CD32a с помощью системы сверхэкспрессии HEK293F

Последовательность кодирования генов помещали в экспрессионную кассету pG1K. Аминокислотная последовательность внеклеточной части человеческого CD32a, которая экспрессировалась в виде рекомбинантного белка с гистидиновой меткой, представлена под номером SEQ ID NO: 28. Рекомбинантный эктодомен человеческого CD32a экспрессировали в экспрессирующей системе суспензионной культуры клеток FreeStyle 293F и соответствующей среде (Invitrogen, Carlsbad, USA). Клетки FreeStyle 293F высевали при плотности 1,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл в культуре объемом 600 мл и выдерживали в течение 18-24 часов перед трансфекцией, чтобы гарантировать активное деление клеток во время трансфекции. В процессе трансфекции трансфицировали 1,0×10⁷клеток в среде объемом 96 мл в колбе Эрленмейера объемом 2 литра с использованием линейного полиэтиленимина со средней молекулярной массой 25 кДа (Polysciences, Warrington, USA) в качестве трансфекционного реагента. Трансфицированные клетки инкубировали при температуре 37°С в течение 4 ч после трансфекции в орбитальном шейкере (125 об/мин), затем их плотность доводили свежей средой до 2,5×10⁶ клеток/мл и инкубировали в течение 4-5 дней. Надосадочную жидкость культуры собирали и белок в среде очищали с использованием аффинной хроматографии на никеле. На фигуре 16 показан анализ SDS-PAGE очищенного белка эктодомена человеческого CD32a.

Пример 12: Получение рекомбинантного эктодомена человеческого рецептора трансферрина-1 (TfR1) с помощью системы сверхэкспрессии HEK293F

Последовательность кодирования генов помещали в экспрессионную кассету pG1K. Аминокислотная последовательность эктодомена человеческого TfR1, которая экспрессировалась в виде рекомбинантного белка с гистидиновой меткой, представлена под номером SEQ ID NO: 29. Рекомбинантный эктодомен человеческого TfR1 экспрессировали в экспрессирующей системе суспензионной культуры клеток FreeStyle 293F и соответствующей среде (Invitrogen, Carlsbad, USA). Клетки FreeStyle 293F высевали при плотности 1,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл в культуре объемом 600 мл и выдерживали в течение 18-24 часов перед трансфекцией, чтобы гарантировать активное деление клеток во время трансфекции. В процессе трансфекции 1,0×10⁷ клеток в 96 мл среды в 2-литровой смесительной колбе Эрленмейера трансфицировали с использованием линейного полиэтиленимина со средней молекулярной массой 25 кДа (Polysciences, Wamngton, USA) в качестве трансфекционного реагента. Трансфицированные клетки инкубировали при температуре 37°С в течение 4 ч после трансфекции в орбитальном шейкере (125 об/мин), затем их плотность доводили свежей средой до 2,5×10⁶ клеток/мл и инкубировали в течение 4-5 дней. Надосадочную жидкость культуры собирали и белок в среде очищали с использованием аффинной хроматографии на никеле. На фигуре 17 показан анализ SDS-PAGE очищенного белка эктодомена человеческого TfR1.

Пример 13: Получение scFv mAb, специфичного к белку F вируса RSV, mAb, специфичного к эндотоксину, и mAb, специфичного к эктодомену CD32a, с помощью системы сверхэкспрессии Expi293F

V_L и V_H scFv, специфичные к белку F вируса RSV, были получены из моноклонального антитела паливизумаба; V_L и V_H scFv, специфичные к эндотоксину, были получены из моноклонального антитела WN1 222-5 (патент США 5858728); V_L и V_H scFv, специфичные к эктодомену CD32a, были получены из MDE-8 (публикация патентной заявки США US 2007/3253958). ScFv, полученный из этих антител, был сконструирован таким образом, чтобы содержать гибкий линкер GGGGSGGGGS и концевой цистеиновый остаток на С-конце. Цистеиновый остаток обеспечивает сульфогидрильную группу для конъюгирования с малеимидной группой, присутствующей на свободных концах связывающих ветвей в различных линкерных звеньях. Для получения scFv mAb, специфичного к белку F вируса RSV, mAb, специфичного к эндотоксину, и mAb, специфичного к внеклеточному компоненту CD32a, использовали последовательности ДНК V_L и V_H трех антител с дальнейшей оптимизацией кодонов. Были синтезированы последовательности ДНК, кодирующие V_L-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-V_H-(GGGGS)₂-C. Аминокислотные последовательности scFv mAb, специфичные к белку F вируса RSV, mAb, специфичные к эндотоксину, и mAb, специфичные к эктодомену CD32a, полученные для экспериментов по изобретению, приведены под номерами SEQ ID NO: 30-32, соответственно.

Для получения белков scFv с использованием системы экспрессии клеток млекопитающих для экспериментов использовалась система сверхэкспрессии, основанная на клеточной линии Expi293F™. В системе использовался набор для трансфекции ExpiFectamine™ 293 (Life Technologies, Carlsbad, USA), состоящий из линии клеток Expi293F™, реагента ExpiFectamine™ 293 на основе катионных липидов и усилителей трансфекции 1 и 2 ExpiFectamine™ 293, а также среды, которая была частью системы экспрессии (Gibco, New York, USA).

Последовательность, кодирующую scFv, помещали в кассету экспрессии pG1K. Клетки Expi293F высевали при плотности 2,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл в среду для экспрессии Expi293F и выдерживали в течение 18-24 часов перед трансфекцией, чтобы убедиться в том, что клетки на момент трансфекции активно делились. В процессе трансфекции 7,5×10⁸ клеток в 255 мл среды в 2-литровой смесительной колбе Эрленмейера трансфицировали с помощью реагента для трансфекции ExpiFectamine™ 293. Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С в течение 16-18 часов после трансфекции в орбитальном шейкере (125 об/мин), и к клеткам в смесительную колбу добавляли усилитель трансфекции 1 и усилитель трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293, и их инкубировали в течение 5-6 дней. Образцы надосадочной жидкости культуры собирали, и белки scFv в среде очищали с помощью аффинной хроматографии на белке L.

На фигурах 18А и 18В показаны результаты анализов SDS-PAGE и ELISA очищенного scFv mAb, специфичного к белку F вируса RSV; на фигурах 18С и 18D показаны результаты анализов SDS-PAGE и ELISA очищенного scFv mAb, специфичного к эндотоксину; на фигурах 18Е и 18F показаны результаты анализов SDS-PAGE и ELISA очищенного scFv mAb, специфичного к эктодомену CD32a. 96-луночные планшеты для анализа ELISA (Greiner Bio-one) покрывали белком F вируса RSV при концентрации 5 мкг/мл, эндотоксином при концентрации 10 мкг/мл и эктодоменом CD32a при концентрации 5 мкг/мл, соответственно. Очищенные scFv обнаруживали с помощью белка L, конъюгированного с HRP, в соотношении 1:5000.

Результаты анализа ELISA показывают, что каждый очищенный белок scFv специфически связан со своим антигеном (белок F вируса RSV, эндотоксин или эктодомен CD32a), при этом scFv адалимумаба (scFv антитела к TNF-α) использовали в качестве отрицательного контроля.

Пример 14: Получение scFv mAb, специфичного к эктодомену TfR1, и mAb, специфичного к β-амилоиду, с помощью системы сверхэкспрессии Expi293F

V_L и V_H scFv, специфичные к эктодомену TfR1, были получены из моноклонального антитела OX26; V_L и V_H scFv, специфичные к β-амилоиду, были получены из моноклонального антитела бапинеузумаба. ScFv, полученный из этих антител, был сконструирован таким образом, чтобы содержать гибкий линкер GGGGSGGGGS и концевой цистеиновый остаток на С-конце. Цистеиновый остаток обеспечивает сульфогидрильную группу для конъюгирования с малеимидной группой, присутствующей на свободных концах связывающих ветвей в различных линкерных звеньях. Для получения scFv mAb, специфичного к эктодомену TfR1, и mAb, специфичного к β-амилоиду, использовали последовательности ДНК V_L и V_H двух антител с дальнейшей оптимизацией кодонов. Были синтезированы последовательности ДНК, кодирующие V_L-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-V_H-(GGGGS)₂-C. Аминокислотные последовательности scFv mAb, специфичные к эктодомену TfR1, и mAb, специфичные к β-амилоиду, полученные для экспериментов по изобретению, приведены под номерами SEQ ID NO: 33 и 34, соответственно.

Для получения белков scFv с помощью систем экспрессии в клетках млекопитающих применяли систему сверхэкспрессии на основе линии клеток Expi293F™. В системе использовался набор для трансфекции ExpiFectamine™ 293 (Life Technologies, Карлсбад, США), состоящий из линии клеток Expi293F™, реагента ExpiFectamine™ 293 на основе катионных липидов и усилителей трансфекции 1 и 2 ExpiFectamine™ 293, а также среды (Gibco, Нью-Йорк, США).

Последовательность, кодирующую scFv, помещали в кассету экспрессии pG1K. Клетки Expi293F высевали при плотности 2,0×106 жизнеспособных клеток/мл в среду для экспрессии Expi293F и выдерживали в течение 18-24 часов перед трансфекцией, чтобы убедиться в том, что клетки на момент трансфекции активно делились. В процессе трансфекции 7,5×108 клеток в 255 мл среды в 2-литровой смесительной колбе Эрленмейера трансфицировали с помощью реагента для трансфекции ExpiFectamine™ 293. Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С в течение 16-18 часов после трансфекции в орбитальном шейкере (125 об/мин), и к клеткам в смесительную колбу добавляли усилитель трансфекции 1 и усилитель трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293, и их инкубировали в течение 5-6 дней. Образцы надосадочной жидкости культуры собирали, и белки scFv в среде очищали с помощью аффинной хроматографии на белке L. На фигурах 19А и 19В показаны анализы очищенных scFv для mAb, специфичных к эктодомену TfR1, по методам SDS-PAGE и ELISA, соответственно. На фигурах 19С и 19D показаны анализы очищенного scFv для mAb, специфичных к β-амилоиду, по методам SDS-PAGE и ELISA, соответственно. Планшеты для анализа ELISA покрывали эктодоменом TfR1 при концентрации 5 мкг/мл и β-амилоидом при концентрации 5 мкг/мл, соответственно. Очищенные scFv обнаруживали с помощью белка L, конъюгированного с HRP, в соотношении 1:5000.

Результаты анализа ELISA показывают, что каждый очищенный scFv-белок специфически связан со своим антигеном (эктодоменом TfR1 или β-амилоидом), при этом только белок L, конъюгированный с HRP, использовали в качестве отрицательного контроля.

Пример 15: Конструирование и селекция scFv на фаговых носителях, специфичных к эктодомену человеческого CD32a

Клоны фагов, несущие scFv, специфичные к эктодомену человеческого CD32a, были получены по контракту с лабораторией доктора An-Suei Yang (Genomics Research Center, Academia Sinica, Taipei, Taiwan). Рамочная последовательность библиотеки scFv GH2 была получена из антител G6 к VEGF Fab (код в белковом банке 2FJG) и клонирована в сайты рестрикции SfiI и NotI вектора фагмида pGANTAB5E (GE Healthcare), несущие устойчивость к ампициллину, промотор lacZ, лидерную последовательность ре1В для секреции scFv-фрагментов в надосадочную жидкость культуры, Е-метку, применимую для обнаружения. Домены V_H и V_L scFv-матрицы были диверсифицированы отдельно на основе процедуры олигонуклеотид-направленного мутагенеза; три CDR в каждом из вариабельных доменов были диверсифицированы одновременно. Использовали библиотеку scFv, содержащую более 10⁹ клонов для селекции по эктодомену CD32a.

96-луночные планшеты Maxisorp (Nunc), покрытые рекомбинантньши белками CD32a (1 мкг/100 мкл PBS на лунку), использовали для пэннинга антител к CD32a. Вкратце, лунки покрывали человеческим CD32a, встряхивая покрывающий раствор в лунках в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем лунки, покрытые CD32a, обрабатывали блокирующим буфером (5% снятого молока в PBST (фосфатно-солевой буферный раствор с 0,1% твин-20)) в течение 1 часа при комнатной температуре. Рекомбинантные фаги в блокирующем буфере, разведенные до 8×10¹¹ КОЕ/мл, добавляли в лунки, покрытые CD32a, в течение 1 часа с осторожным встряхиванием; КОЕ обозначает колониеобразующую единицу. Затем лунки энергично промывали 10 раз PBST, а затем 6 раз PBS для удаления неспецифических связывающих фагов. Связанные фаги элюировали, используя 0,1 М HCl/глицинового буфера при рН 2,2, и элюированный раствор немедленно нейтрализовали 2 М трис-базовым буфером при рН 9,0. Для фаговой инфекции использовали штамм Е. coli ER2738 (OD600 = ~0,6) при температуре 37°С в течение 30 минут; неинфицированные бактерии Е. coli удаляли путем обработки ампициллином в течение 30 минут. После обработки ампициллином добавляли вспомогательный фаг M13KO7, несущий устойчивость к канамицину, с еще одной инкубацией в течение одного часа. Отобранные фаги, полученные с помощью вспомогательного фага в культуре Е. coli, амплифицировали, энергично встряхивая в течение ночи при температуре 37°С в присутствии канамицина. Амплифицированные фаги осаждали в PEG/NaCl и затем ресуспендировали в PBS для следующих циклов селекции/амплификации. В общей сложности на эктодомене CD32a выполняли три последовательных раунда пэннинга, повторяя эту процедуру селекции/амплификации.

Колонии ER2738, инфицированные фагами, были подсчитаны на планшетах с сериями разведении и рассчитаны титры фагов с получением выходного титра/мл (КОЕ/мл) за один раунд пэннинга. После трех раундов пэннинга было получено 1000-кратное увеличение выходного титра фагов от 1,6Е+04 КОЕ/лунка до 2,2Е+07 КОЕ/лунка. Коэффициенты отношения выходного/входного титра фагов в результате каждого раунда показаны на фигуре 20А. Для каждого раунда пэннинга коэффициенты отношения выходного/входного титра фагов показаны по оси у. Наблюдалось четкое обогащение положительных клонов в течение трех раундов пэннинга. Третий раунд пэннинга привел к 100-кратному соотношению выходного/входного титра фагов, полученного в первом раунде, поскольку связывающие клоны стали доминирующей популяцией в библиотеке.

В типичной процедуре отбора после трех раундов антиген-пэннинга на лунках с покрытием человеческого CD32a на планшетах для анализа ELISA приблизительно 80% связанных фаговых частиц были связаны с CD32a, особенно на планшетах для анализа ELISA, покрытых CD32a.

Пример 16: Анализ ELISA с одной колонией scFv на фаговых носителях, специфичных к эктодомену человеческого CD32a

Штамм бактерии Е. coli ER2738, инфицированный одноклональными фагами, каждый из которых в своем фагмиде содержал выбранный ген scFv, выращивали в середине логарифмического роста в бульоне 2YT (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, pH 7,0) с ампициллином 100 мкг/мл в глубокой лунке при температуре 37°С, сопровождая встряхиванием. После того как бульон достигал OD600 1,0, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мкг/мл. Планшеты инкубировали при температуре 37°С в течение ночи при энергичном встряхивании; после этого планшеты центрифугировали при 4000 g в течение 15 минут при температуре 4°С.

Для проверки связывания растворимого scFv проводили анализ ELISA. Вкратце, 96-луночный планшет Maxisorp (Nunc) покрывали эктодоменом CD32a (0,5 мкг/100 мкл PBS на лунку) или человеческим рецептором трансферрина-1 антигена для отрицательного контроля в течение 18 часов со встряхиванием при температуре 4°С. После обработки 300 мкл блокирующего буфера в течение 1 часа 100 мкл секретируемого scFv в надосадочной жидкости смешивали с 100 мкл блокирующего буфера и затем добавляли на покрытый планшет еще на 1 час. В течение 1 часа на планшет добавляли антитело козы к Е-метке (конъюгированное с HRP, 1:4000, кат. № АВ19400, Abcam). ТМБ субстрат (50 мкл на лунку) добавляли в лунки и измеряли поглощение на 450 нм после прекращения реакции добавлением 1N HCl (50 мкл на лунку).

В общей сложности 192 фаговых клона после третьего раунда пэннинга было подвергнуто настоящему анализу. Среди них 12 scFv-клонов, которые связывались с CD32a с дифференциалом OD450, превышающим 10, дополнительно характеризовались секвенирующими генами, кодирующими эти scFv. Было идентифицировано шесть различных последовательностей ДНК. На фигуре 20В показан результат анализа ELISA scFv-клона 22D1. Аминокислотная последовательность scFV-клона 22D1, которая связывается с человеческим CD32a при OD450 0,8, приведена под номером SEQ ID NO: 35.

Пример 17: Конструирование и селекция scFv на фаговых носителях, специфичных к эктодомену человеческого TfR1

Клоны фагов, несущие scFv, специфичные к эктодомену человеческого TfR1, были получены по контракту с лабораторией доктора An-Suei Yang (Genomics Research Center, Academia Sinica, Taipei, Taiwan). Рамочная последовательность библиотеки scFv GH2 была получена из антител G6 к VEGF Fab (код в белковом банке 2FJG) и клонирована в сайты рестрикции SfiI и NotI вектора фагмида pGANTAB5E (GE Healthcare), несущие устойчивость к ампициллину, промотор lacZ, лидерную последовательность pelB для секреции scFv-фрагментов в надосадочную жидкость культуры, Е-метку, применимую для обнаружения. Домены V_H и V_L scFv-матрицы были диверсифицированы отдельно на основе процедуры олигонуклеотид-направленного мутагенеза; три CDR в каждом из вариабельных доменов были диверсифицированы одновременно. Использовали библиотеку scFv, содержащую более 10⁹ клонов для селекции по эктодомену CD32a.

96-луночные планшеты Maxisorp (Nunc), покрытые рекомбинантными белками TfR1 (1 мкг/100 мкл PBS на лунку), использовали для пэннинга антител к TfR1. Вкратце, лунки покрывали человеческим TfR1, встряхивая покрывающий раствор в лунках в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем лунки, покрытые TfR1, обрабатывали блокирующим буфером (5% снятого молока в PBST (фосфатно-солевой буферный раствор с 0,1% твин-20)) в течение 1 часа при комнатной температуре. Рекомбинантные фаги в блокирующем буфере, разведенные до 8×10¹¹ КОЕ/мл, добавляли в лунки, покрытые TfR1, в течение 1 часа с осторожным встряхиванием; КОЕ обозначает колониеобразующую единицу. Затем лунки энергично промывали 10 раз PBST, а затем 6 раз PBS для удаления неспецифических связывающих фагов. Связанные фаги элюировали, используя 0,1 М HCl/глицинового буфера при рН 2,2, и элюированный раствор немедленно нейтрализовали 2 М трис-базовым буфером при рН 9,0. Для фаговой инфекции использовали штамм Е. coli ER2738 (OD600 = ~0,6) при температуре 37°С в течение 30 минут; неинфицированные бактерии Е. coli удаляли путем обработки ампициллином в течение 30 минут. После обработки ампициллином добавляли вспомогательный фаг M13KO7, несущий устойчивость к канамицину, с еще одной инкубацией в течение одного часа. Отобранные фаги, полученные с помощью вспомогательного фага в культуре E. coli, амплифицировали, энергично встряхивая в течение ночи при температуре 37°С в присутствии канамицина. Амплифицированные фаги осаждали в PEG/NaCl и затем ресуспендировали в PBS для следующих циклов селекции/амплификации. В общей сложности на эктодомене TfR1 выполняли три последовательных раунда пэннинга, повторяя эту процедуру селекции/амплификации.

Колонии ER2738, инфицированные фагами, были подсчитаны на планшетах с сериями разведении и рассчитаны титры фагов с получением выходного титра/мл (КОЕ/мл) за один раунд пэннинга. После трех раундов пэннинга было получено 10⁴-кратное увеличение выходного титра фагов от 3,74Е+03 КОЕ/лунка до 1,5Е+08 КОЕ/лунка. Коэффициенты соотношения выходного/входного титра фагов в результате каждого раунда показаны на фигуре 21А. Для каждого раунда пэннинга коэффициенты отношения выходного/входного титра фагов показаны по оси у. Наблюдалось четкое обогащение положительных клонов в течение трех раундов пэннинга. Третий раунд пэннинга привел к 10⁴-кратному соотношению выходного/входного титра фагов, полученного в первом раунде, поскольку связывающие клоны стали доминирующей популяцией в библиотеке.

В типичной процедуре отбора после трех раундов антиген-пэннинга на лунках с покрытием человеческим TfR1 на планшетах для анализа ELISA приблизительно 80% связанных фаговых частиц были связаны с TfR1, особенно на планшетах для анализа ELISA, покрытых TfR1.

Пример 18: Анализ ELISA с одной колонией scFv на фаговых носителях, специфичных к эктодомену человеческого TfR1

Штамм бактерии Е. coli ER2738, инфицированный одноклональными фагами, каждый из которых в своем фагмиде содержал выбранный ген scFv, выращивали в середине логарифмического роста в бульоне 2YT (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, pH 7,0) с ампициллином 100 мкг/мл в глубокой лунке при температуре 37°С, сопровождая встряхиванием. После того как бульон достигал OD600 1,0, добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мкг/мл. Планшеты инкубировали при температуре 37°С в течение ночи при энергичном встряхивании; после этого планшеты центрифугировали при 4000 g в течение 15 минут при температуре 4°С.

Для проверки связывания растворимого scFv проводили анализ ELISA. Вкратце, 96-луночный планшет Maxisorp (Nunc) покрывали эктодоменом TfR1 (0,5 мкг/100 мкл PBS на лунку) или антигена CD16b для отрицательного контроля в течение 18 часов со встряхиванием при температуре 4°С. После обработки 300 мкл блокирующего буфера в течение 1 часа 100 мкл секретируемого scFv в надосадочной жидкости смешивали с 100 мкл блокирующего буфера и затем добавляли на покрытый планшет еще на 1 час. В течение 1 часа на планшет добавляли антитело козы к Е-метке (конъюгированное с HRP, 1:4000, кат. № АВ19400, Abcam). ТМБ субстрат (50 мкл на лунку) добавляли в лунки и измеряли поглощение на 450 нм после прекращения реакции добавлением 1N HCl (50 мкл на лунку).

В общей сложности 192 фаговых клона после третьего раунда пэннинга было подвергнуто этому анализу. Среди них 12 scFv-клонов, которые связывались с TfR1 с дифференциалом OD450, превышающим 10, дополнительно характеризовались секвенирующими генами, кодирующими эти scFv. Было идентифицировано шесть различных последовательностей ДНК. На фигуре 21В показан результат анализа ELISA scFv-клона 12А1. Аминокислотная последовательность scFV-клона 12А1, которая связывается с человеческим TfR1 при OD450 1,7, приведена под номером SEQ ID NO: 36.

Пример 19. Получение TCO-scFv, специфичных к эктодомену CD32a

Последовательность ДНК, кодирующую SEQ ID NO: 32, синтезировали и экспрессировали в соответствии с вышеприведенными примерами. Для конъюгирования с Mal-PEG3-TCO (Conju-Probe, Inc.) цистеиновый остаток на С-конце очищенного scFv aHTH-CD32a mAb восстанавливали путем инкубирования с 5 мМ дитиотреитола (DTT) при комнатной температуре в течение 4 часов при осторожном встряхивании. Буфер, в котором находились восстановленные белки scFv, заменяли на натрий-фосфатный буфер (100 мМ фосфат натрия, рН 7,0, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA) путем применения колонки NAP-10 с Sephadex G-25. После реакции восстановления и замены буфера проводили конъюгирование в течение ночи при комнатной температуре в реакционном молярном соотношении 10:1 ([Mal-PEG₃-TCO]:[scFv]). Избыток сшивающего средства удаляли с помощью колонки для обессоливания, и анализировали scFv-продукты, конъюгированные с ТСО.

Результаты анализа методом масс-спектроскопии MALDI-TOF указывали на то, что образец scFv, конъюгированного с ТСО, специфичного к CD32a, имел молекулярную массу 27337 дальтон. Чистоту scFv, конъюгированных с ТСО, специфичных к CD32a, определяли посредством окрашивания кумасси синим 12% геля для SDS-PAGE. На фигуре 22А и фигуре 22В показаны анализы scFv, конъюгированного с ТСО, специфичного к CD32a, методом ELISA и мас-спектрометрическим методом, соответственно, в котором немодифицированные scFv антитела, специфичные к CD32a, применяли в качестве положительного контроля. В соответствии с результатами ELISA scFv, конъюгированный с ТСО, специфичный к CD32a, связывался с рекомбинантным эктодоменом человеческого CD32a.

Пример 20: Получение тетразин-scFv, специфичного к эктодомену TfR1

Последовательность ДНК под номером SEQ ID NO: 33 была синтезирована и экспрессирована, как в приведенных выше примерах. Для конъюгирования с Mal-PEG₄-тетразином (Conju-probe, Inc.) цистеиновый остаток на С-конце очищенного scFv mAb, специфичного к TfR1, восстанавливали путем инкубации с 5 мМ DTT при комнатной температуре в течение 4 часов при легком встряхивании. Буфер восстановленных белков scFv заменяли на натрий-фосфатный буфер (100 мМ натрия фосфата, рН 7,0, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA) с использованием колонки NAP-10 Sephadex G-25. После реакции восстановления и буферного обмена конъюгирование проводили в течение ночи при температуре 4°С при молярном соотношении реакции 10:1 ([Mal-PEG₄-тетразин]:[scFv]). Избыток сшивающего средства удаляли с помощью обессоливающей колонки и анализировали продукт scFv, конъюгированный с тетразином.

Результаты анализа методом масс-спектроскопии MALDI-TOF показали, что образец scFv, конъюгированного с тетразином, специфичного к TfR1, имел молекулярную массу 27086 дальтон. Чистоту scFv, конъюгированного с тетразином, специфичного к TfR1, идентифицировали с помощью анализа в 10% геле для SDS-PAGE методом окрашивания кумасси синим. На фигуре 23А и фигуре 23В показаны, соответственно, результаты анализа ELISA и масс-спектрометрии scFv, конъюгированного с тетразином, специфичного к TfR1, в котором немодифицированный scFv, специфичный к TfR1, использовался в качестве положительного контроля. Согласно результатам анализа ELISA, scFv, конъюгированный с тетразином, специфичный к TfR1, связался с рекомбинантным эктодоменом TfR1.

Пример 21. Конъюгирование трех scFv, специфичных к эндотоксину, с тремя малеимидно-PEG₁₂ связывающими ветвями на основе из тетразин-функционализированного пептида 1

Этот пример демонстрирует, что три scFv можно конъюгировать с тремя РЕП₁₂-малеимидными связывающими ветвями, размещенными на основе из тетразин-функционализированного пептида 1. Перед конъюгированием с тетразин-функционализированным пептидом 1, имеющим три PEG₁₂-малеимидные связывающие ветви, scFv, специфичный к эндотоксину, инкубировали с DTT в молярном соотношении 2:1 ([DTT]:[scFv]) при 25°С в течение 4 часов при осторожном встряхивании для сохранения его С-концевого цистеина в восстановленной форме. После этого буфер, в котором находился восстановленный scFv, специфичный к эндотоксину, заменяли на буфер для реакции присоединения между малеимидной группой и SH-группой (100 мМ натрия фосфата, рН 7,0, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA) путем применения колонки NAP-10 Sephadex G-25 (GE Healthcare). После восстановления и замены буфера проводили конъюгирование с тетразин-функционализированным пептидом 1, имеющим три малеимидно-PEG₁₂ связывающих ветви, в течение ночи при 4°С в молярном соотношении 1:4 ([линкер]: [белок]).

Тетразин-функционализированный пептид 1, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом и конъюгированный с тремя scFv, специфичными к эндотоксину, отделяли от свободного scFv, свободного тетразин-функционализированного пептида 1, конъюгированного с PEG₁₂-малеимидом, и тетразин-функционализированного пептида 1, конъюгированного с одним и двумя scFv, специфичными к эндотоксину, с помощью колонки для эксклюзионной хроматографии S75.

Фигура 24А представляет собой профиль элюирования В процессе FPLC синтезированного нацеливающего линкерного звена, состоящего из линкерного звена со свободной тетразиновой функциональной группой и набора из трех scFv, специфичных к человеческому эндотоксину, в качестве нацеливающих элементов, с объемом удержания 9,5 мл. Продукт (т.е. тетразин-функционализированный пептид 1, конъюгированный с PEG₁₂-малеимидом, имеющий свободную тетразиновую функциональную группу и конъюгированный с набором из трех scFv, специфичных к эндотоксину) был очищен в виде элюируемой фракции и показан на дорожке 4 (обозначено стрелкой) в анализе в 10% геле для SDS-PAGE, показанном на фигуре 24В.

Пример 22. Анализ нацеливающего линкерного звена, содержащего три scFv, специфичных к эндотоксину, связанных с тремя малеимидно-PEG₁₂ связывающими ветвями, размещенными на основе из тетразин-функционализированного пептида 1, с помощью MALDI-TOF

Состав образца нацеливающего линкерного звена с тремя scFv, специфичными к эндотоксину, связанных с тремя малеимидно-PEG₁₂ связывающими ветвями, размещенными на основе из тетразин-функционализированного пептида 1, анализировали с помощью MALDI-TOF. Экспериментальное медианное значение молекулярного веса согласовывалось с теоретическим медианным значением молекулярного веса трех scFv специфичных к эндотоксину, конъюгированных с тетразин-функционализированным пептидом 1 с тремя малеимидно-PEG₁₂ связывающими ветвями. В соответствии с масс-спектрометрическим профилем на фигуре 24С нацеливающее линкерное звено по настоящему изобретению имело медианный молекулярную массу, составляющую 81727 дальтон.

Ниже проиллюстрировано нацеливающее линкерное звено по настоящему изобретению, состоящее из линкерного звена со свободной тетразиновой функциональной группой и набора из трех scFv, специфичных к эндотоксину, в качестве нацеливающих элементов.

Пример 23: Получение нацеливающего линкерного звена на основе тетразин-функционализированного пептида 1 с тремя scFv, специфичными к белку F вируса RSV

Процедура конъюгирования scFv с линкерным звеном, а также очистка и анализ продукта была такой же, как в предыдущих примерах.

На фигуре 25 показан масс-спектрометрический анализ синтезированного нацеливающего линкерного звена, состоящего из линкерного звена со свободной тетразиновой функциональной группой и набора из трех scFv, специфичных к белку F вируса RSV, в качестве нацеливающих элементов (см. ниже). Как показано на фигуре 25, это нацеливающее линкерное звено имело молекулярную массу 81978 дальтон.

Пример 24. Коньюгирование трех scFv, специфичных к β-амилоиду, с тремя малеимидно-PEG₁₂-связывающими ветвями на основе ТСО-функционализированного пептида 1

Этот пример был выполнен для демонстрации того, что три scFv могут быть конъюгированы с тремя малеимидно-PEG₁₂-связывающими ветвями на основе ТСО-функционализированного пептида 1. До конъюгирования с ТСО-функционализированный пептидом 1, который имел три малеимидно-PEG₁₂-связывающих ветви, scFv, специфичный к β-амилоиду, инкубировали с DTT при молярном соотношении 2:1 ([DTT]:[scFv]) при комнатной температуре в течение 4 часов с легким встряхиванием для сохранения С-концевого цистеина в восстановленной форме. Затем буфер восстановленного scFv, специфичного к β-амилоиду, заменяли на буфер реакции связывания малеимид-SH (100 мМ натрия фосфата, рН 7,0, 50 мМ NaCl и 5 мМ EDTA) с использованием колонки NAP-10 Sephadex G-25 (GE Healthcare). После восстановления и буферного обмена конъюгирование с ТСО-функционализированным пептидом 1, имеющим три малеимидно-PEG₁₂-связывающих ветви, проводили в течение ночи при комнатной температуре при молярным соотношении 1:4 ([линкер]:[белок]).

Реакционную смесь из предыдущих примеров доводили до рН 5,0 и затем вносили в предварительно уравновешенную (5 мМ EDTA и 50 мМ натрия ацетата при рН 5,0) ионообменную колонку SP Sepharose FF (GE Healthcare). ТСО-функционализированный пептид 1, конъюгированный с малеимид-PEG₁₂, конъюгированный с тремя scFv, специфичными к β-амилоиду, элюировали с линейным градиентом 0-500 мМ натрия хлорида со скоростью потока 0,5 мл/мин в течение 100 минут. ТСО-функционализированный пептид 1, конъюгированный с малеимид-PEG₁₂, конъюгированный с тремя scFv, специфичными к β-амилоиду, отделяли от свободного scFv, свободного ТСО-функционализированного пептида 1, конъюгированного с малеимид-PEG₁₂, и ТСО-функционализированного пептида 1, конъюгированного с малеимид-PEG₁₂, конъюгированного с одним и двумя scFv, специфичными к β-амилоиду, с помощью ионообменной колонки SP Sepharose FF. Очищенный продукт, ТСО-функционализированный пептид 1, конъюгированный с малеимид-PEG₁₂, конъюгированный с тремя scFv, специфичными к β-амилоиду, концентрировали и проводили замену буфера на буфер клик-реакции, 100 мМ калия фосфата при рН 7,0.

На фигуре 26А представлен профиль элюирования ионообменной колонки SP Sepharose FF при FPLC на синтезированном эффекторном линкерном звене, состоящем из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из трех scFv, специфичных к β-амилоиду, в качестве эффекторных элементов. Символы #1 и #2, соответственно, указывают на пики элюирования ТСО-функционализированного пептида 1, конъюгированного с малеимидом-PEG₁₂, конъюгированного с двумя scFv и тремя scFv, специфичными к β-амилоиду. Продукт, ТСО-функционализированный пептид 1, конъюгированный с малеимидом-PEG₁₂, несущий свободную функциональную ТСО-группу и три scFv, специфичных к β-амилоиду, очищали и выявляли на дорожке 2 анализа SDS-PAGE в 8% геле, показанного на фигуре 26В.

Пример 25: Анализ эффекторного линкерного звена, содержащего три scFv, специфичных к β-амилоиду, связанных с тремя малеимидно-PEG₁₂-связывающими ветвями на основе ТСО-функционализированного пептида 1 методом масс-спектрометрии MALDI-TOF

Состав образца эффекторного линкерного звена из трех scFv, специфичных к β-амилоиду, связанного с тремя малеимидно-PEG₁₂-связывающими ветвями на основе ТСО-функционализированного пептида 1, анализировали методом масс-спектрометрии MALDI-TOF. Медиана экспериментальной молекулярной массы согласуется с медианой теоретической молекулярной массы трех scFv, специфичных к β-амилоиду, конъюгированных с ТСО-функционализированным пептидом 1, с тремя малеимидно-PEG₁₂-связывающими ветвями. В соответствии с масс-спектрометрическим профилем на фигуре 26С, синтезированное эффекторное линкерное звено имело среднюю молекулярную массу 87160 дальтон.

Здесь представлено синтезированное эффекторное линкерное звено, состоящее из линкерного звена со свободной функциональной ТСО-группой и набора из трех scFv, специфичных к β-амилоиду, в качестве нацеливающих элементов.

Пример 26: Получение молекулярной конструкции с тремя scFv, специфичными к белку F вируса RSV, в качестве нацеливающих элементов, и одним scFv, специфичным к эктодомену CD32a, в качестве эффекторного элемента

В этом примере нацеливающее линкерное звено из предыдущих примеров и TCO-scFv, специфичный к эктодомену CD32a, соединяли посредством реакции iEDDA между тетразиновой группой и ТСО-группой. В частности, нацеливающее линкерное звено имело три scFv, специфичных к белку F вируса RSV, и одну свободную тетразиновую группу.

Процедуру дотирования тетразиновой группы и ТСО-группы осуществляли в соответствии с инструкциями производителя (Jena Bioscience GmbH, Йена, Германия). Коротко говоря, к раствору, содержащему эффекторный элемент, добавляли 100 мкл нацеливающего линкерного звена (0,3 мг/мл) в молярном соотношении 1:1,2 ([тетразин]:[ТСО]). Реакционную смесь инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Продукт подвергали масс-спектрометрическому анализу и результат указывал на молекулярную массу, составляющую 113036 дальтон (фигура 27А).

Продукт в виде молекулярной конструкции из одного линкерного звена с тремя scFv, специфичными к к белку F вируса RSV, в качестве нацеливающих элементов и одним scFv, специфичным к эктодомену CD32a, в качестве эффекторного элемента проиллюстрирован ниже.

Пример 27. Получение молекулярной конструкции с тремя scFv, специфичными к эндотоксину, в качестве нацеливающих элементов и одним scFv, специфичным к эктодомену CD32a, в качестве эффекторного элемента

Нацеливающее линкерное звено, полученное в более раннем примере, и TCO-scFv, специфичный к эктодомену CD32a, соединяли посредством реакции iEDDA между тетразиновой группой и ТСО-группой.

Пример 28: Получение молекулярной конструкции с одним scFv, специфичным к эктодомену TfR1, в качестве нацеливающего элемента и трех scFv, специфичных к β-амилоиду, в качестве эффекторных элементов

Нацеливающее линкерное звено, полученное в примере выше, и тетразин-функционализированный scFv, специфичный к эктодомену TfR1, связывали посредством реакции iEDDA между тетразиновой группой и ТСО-группой.

Процедуру лигирования тетразиновой группы и ТСО-группы осуществляли согласно инструкциям изготовителя (Jena Bioscience GmbH, Jena, Germany). Вкратце, 12,6 мкл нацеливающего элемента (5,65 мг/мл) добавляли к раствору, содержащему линкерное звено с эффекторными элементами при молярном соотношении 10:1 ([тетразин]:[ТСО]). Реакционную смесь инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре. Продукт подвергали масс-спектрометрическому анализу, результат которого показал молекулярную массу 114248 дальтон (фигура 27С).

Продукт, как проиллюстрировано здесь, представлял собой молекулярную конструкцию с одним линкерным звеном, содержащим один scFv, специфичный к эктодомену TfR1, в качестве нацеливающего элемента, и три scFv, специфичные к β-амилоиду, в качестве эффекторных элементов.

Пример 29: Получение молекулярной конструкции с одним scFv, специфичным к эктодомену TfR1, в качестве нацеливающего элемента и пяти молекул финголимода в качестве эффекторных элементов

В этом примере была построена молекулярная конструкция с одним scFv, специфичным к эктодомену TfR1, и «связкой» лекарственных средств из пяти молекул финголимода. Молекулярную конструкцию создавали посредством реакции iEDDA между тетразиновой группой и ТСО-группой. Процедуру лигирования тетразиновой группы и ТСО-группы осуществляли в соответствии с инструкциями производителя (Jena Bioscience GmbH, Йена, Германия). Вкратце, 277 мкл эффекторного линкерного звена (0,126 мкмоль) добавляли к раствору, содержащему нацеливающий элемент из одного scFv, специфичного к эктодомену TfR1, при молярном отношении 5:1 ([ТСО]:[тетразин]). Реакционную смесь инкубировали в течение 3 часов при комнатной температуре.

Продукт, как проиллюстрировано ниже, представлял собой молекулярную конструкцию с одним scFv, специфичным к эктодомену TfR1, и одной «связкой» лекарственных средств, несущей пять молекул финголимода. На фигуре 28А и фигуре 28В показаны, соответственно, результаты анализов SDS-PAGE и масс-спектрометрии по настоящему изобретению. Основная полоса, стрелка #1, указывает на молекулярную конструкцию с одним scFv, специфичным к эктодомену TfR1, и «связкой» лекарственных средств из пяти молекул финголимода, а стрелка #2 указывает на неконъюгированный scFv, специфичный к эктодомену TfR1.

Масс-спектрометрический анализ показал, что молекулярная конструкция с одним scFv, специфичным к эктодомену TfR1, и «связкой» лекарственных средств из пяти молекул финголимода имела молекулярную массу 32105 дальтон.

Пример 30: Анализ биологической активности финголимода при коньюгировании с пептидной сердцевиной через связывающие ветви

Модифицированные молекулы финголимода (финголимод, конъюгированный с NHC-PEG₅, и «связка» лекарственных средств со свободной функциональной ТСО-группой и пятью молекулами финголимода) были синтезированы, как описано в предыдущих примерах. Для исследования биологической активности этих трех соединений выполняли анализ миграции под влиянием S1P в системе Трансвелл с первичными В-клетками, выделенными из РВМС (мононуклеары периферической крови) человека.

При получении первичных В-клеток человека В-клетки человека были выделены из РВМС (мононуклеары периферической крови) человека с помощью набора для изоляции В-клеток (Myttenyi Biotech). Затем выделенные В-клетки высевали и выдерживали в 15-см чашке в среде IMDM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (Gibco) и 20 нг/мл IL2 (Peprotech Inc.).

На фигуре 29А показан анализ выделенных S1P₁-экспрессирующих человеческих В-клеток, 2×10⁵ В-клеток инкубировали с 10 мкг/мл антитела рецептора S1P₁ (AbD Serotec) в PBS, содержащем 1% BSA, на льду в течение 30 минут. Клетки промывали и инкубировали с козьими антимышиными антителами IgG, конъюгированными с FITC, разведенными 1:200 в PBS/BSA, на льду в течение 30 минут в темноте. Затем клетки анализировали методом FACS (FACSCanto II, BD Biosciences).

Для хемотаксического анализа 100 мкл исследуемых В-клеток человека (4×10⁵ клеток) переносили в 1,5-мл пробирку Эппендорфа и добавляли финголимод, финголимод-фосфат, финголимод, конъюгированный с NHS-PEG₅, и «связку» лекарственных средств со свободной функциональной ТСО-группой и пятью молекулами финголимода, соответственно, при конечной концентрации 1 и 10 мкМ при температуре 37°С в течение 4 часов. Затем в верхнюю 6,5-мм камеру системы Трансвелл добавляли 100 мкл обработанных В-клеток с 5-микронной пористой полиэфирной мембранной вставкой (Corning), а нижняя камера системы Трансвелл содержала 500 мкл среды IMDM с молекулами сфингозин-1-фосфата при конечной концентрации 10 нМ. Через 3 часа мигрировавшие клетки в нижних камерах собирали и затем окрашивали трипановым синим и подсчитывали с помощью гемоцитометра. Для каждого измерения удельная миграция рассчитывалась следующим образом: [(Количество клеток в нижней камере)/(количество клеток в нижней + верхней камере)×100] - (процентная доля миграции клеток при 0 нМ аттрактанте)]. Результат в виде процентной доли конкретных мигрировавших клеток показан на фигуре 29В.

На фигуре 29В показаны результаты анализа биологической активности финголимода, конъюгированного с NHS-PEG₅, и «связки» лекарственных средств со свободной функциональной ТСО-группой и с пятью молекулами финголимода. Результат показывает, что молекула финголимода, конъюгированная со связывающей ветвью, имела биологическую активность в отношении блокировки миграции В-клеток, сходную с активностью немодифицированного финголимода.

Пример 31: Конструирование сегмента гена, кодирующего 2-цепочечный белок слияния IgG1.Fc, содержащий scFv, специфичный к белку F вируса RSV, и scFv, специфичный к эктодомену CD32a

Рекомбинантная цепь scFv1-CH2-CH3-scFv2 (человеческого γ1) была сконфигурирована путем слияния двух scFv, из которых первый, специфичный к белку F вируса RSV, сливали с N-концом домена СН2 IgG1.Fc через гибкую шарнирную область, а второй, специфичный к эктодомену CD32a, сливали с С-концом домена CH3 через гибкий линкер (GGGGS)₃.

Оба scFv находились в ориентации «V_l-линкер-V_H». V_L и V_H в каждом из двух scFv были связаны гидрофильным линкером GSTSGSGKPGSGEGSTKG. Последовательность рекомбинантной цепи в молекулярной конструкции белка слияния IgG1.Fc представлена под номером SEQ ID NO: 37.

Ниже проиллюстрирована конфигурация полученной 2-цепочечной молекулярной конструкции (scFv α RSV)-hlgG1.Fc-(scFv α CD32a).

Пример 32. Экспрессия и очистка рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния (scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32)

В этом примере последовательность, кодирующую ген, помещали в кассету экспрессии pcDNA3. Клетки Expi293F высевали при плотности 2,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл в среду для экспрессии Expi293F и выдерживали в течение 18-24 часов перед трансфекцией, чтобы убедиться в том, что клетки на момент трансфекции активно делились. В процессе трансфекции 7,5×10⁸ клеток в 255 мл среды в 2-литровой смесительной колбе Эрленмейера трансфицировали с помощью реагента для трансфекции ExpiFectamine™ 293. Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С в течение 16-18 часов после трансфекции в орбитальном шейкере (125 об/мин), к клеткам в смесительную колбу добавляли усилитель трансфекции 1 и усилитель трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293, и инкубировали их в течение 7 дней. Надосадочную жидкость культуры собирали, и рекомбинантный 2-цепочечный белок слияния (scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a) в среде очищали с помощью хроматографии на белке А. После замены буфера на PBS концентрацию белка (scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a) определяли и анализировали с помощью 12% SDS-PAGE, как показано на фигуре 30А. Молекулярная конструкция в конфигурации слияния с Fc была выявлена как основная полоса, соответствующая приблизительно 85 кДа, что согласовывалось с ожидаемым размером.

Пример 33. Анализ связывания рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния (scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a) методом ELISA

Для исследования связывающей способности рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния (scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a) как с белком F вируса RSV, так и с эктодоменом CD32a, был проведен анализ ELISA. Планшеты для анализа ELISA покрывали белком F вируса RSV (Sino Biological Inc.) при концентрации 2 мкг/мл. Рекомбинантный 2-цепочечный белок слияния (scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a) обнаруживали козьим античеловеческим антителом IgG1.Fc, конъюгированным с HRP. Результаты анализа ELISA на фигуре 30В показывают, что рекомбинантный 2-цепочечный белок слияния (scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv а CD32a) связывался с белком F вируса RSV, в качестве контрольного scFv использовался scFv адалимумаба.

На фигуре 30С показана активность связывания рекомбинантного Fc-белка слияния с эктодоменом CD32a. Планшеты для анализа ELISA покрывали рекомбинантным эктодоменом CD32a при концентрации 5 мкг/мл. Рекомбинантный 2-цепочечный белок слияния(scFv a RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a) обнаруживали козьим античеловеческим антителом IgG1.Fc, конъюгированным с HRP. На фигуре 30С показано, что рекомбинантный 2-цепочечный Fc-белок слияния (scFv α RSV)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a) обладал активностью связывания с рекомбинантным эктодоменом CD32a. Рекомбинантный 2-цепочечный белок (scFv α-эндотоксин)-IgG1.Fc использовали в качестве контрольного антитела.

Пример 34. Получение 2-цепочечного белка слияния на основе IgG1.Fc, содержащего scFv, специфичный к эндотоксину, и scFv, специфичный к эктодомену CD32a

Конфигурацию рекомбинантной цепи scFv1-CH2-CH3-scFv2 (на основе человеческого γ1) создавали путем слияния двух scFv, при этом первый из них, специфичный к эндотоксину, сливали с N-концом домена СН2 в IgG1.Fc с помощью гибкой шарнирной области, а второй из них, специфичный к эктодомену, сливали с С-концом домена СН3 с помощью гибкого линкера (GGGGS)₃.

Оба scFv находились в ориентации V_L-линкер-V_H. V_L и V_H в каждом из этих двух scFv были соединены гидрофильным линкером GSTSGSGKPGSGEGSTKG.

Последовательность рекомбинантной цепи в молекулярной конструкции белка слияния на основе IgG1.Fc показана под SEQ ID NO: 38. Экспрессию сконструированного гена в клетках Expi293F и очистку экспрессируемого белка слияния осуществляли в соответствии с предыдущими примерами. Определение характеристик новой конструкции осуществляли с помощью SDS-PAGE и ELISA. Результаты SDS-PAGE, представленные на фигуре 31А, указывают на то, что рекомбинантная цепь новой конструкции имела размер, составляющий приблизительно 85 кДа, что согласуется с ожидаемым размером.

На фигуре 31В показаны результаты анализа ELISA рекомбинантного 2-цепочечного белка (scFv α эндотоксина)-(scFv α CD32a)-hIgG1.Fc, связывающегося с бактериями Е. coli LPS 0111:В4 (Sigma Aldrich). Планшеты для анализа ELISA покрывали поли-L-лизином при концентрации 50 мкг/мл. Затем покрытые поли-L-лизином планшеты дополнительно покрывали бактериями Е. coli LPS 0111:В4 в концентрации 10 мкг/мл. Рекомбинантный белок слияния детектировали козьим античеловеческим антителом IgG.Fc, конъюгированным с HRP. Результаты анализа ELISA показывают, что этот рекомбинантный Fc-белок слияния обладал связывающей активностью по отношению к E.coli LPS 0111:В4 (Sigma Aldrich); фигура 31С показывает, что рекомбинантный Fc-белок слияния обладал связывающей активностью по отношению к эктодомену CD32a.

Ниже проиллюстрирована конфигурация полученной таким образом молекулярной 2-цепочечной конструкции (scFv α эндотоксин)-(scFv α CD32)-hIgG1.Fc.

Пример 35: Конструирование сегмента гена, кодирующего 2-цепочечный белок слияния IgG4.Fc, содержащий интерферон-β-1a, и scFv, специфичный к эктодомену TfR1

2-цепочечный белок слияния IgG.Fc получали путем конфигурирования (интерферон-β-1a)-CH2-CH3-(scFv α TfR1) (человеческого γ4) в рекомбинантной цепи. С-конец интерферона-β-1а сливали с N-концом СН2 через линкер GGGGSGGGASGGS. Фрагмент scFv, специфичный к эктодомену TfR1, сливали с С-концом домена СН3 через гибкий линкер (GGGGS)₃.

Фрагмент scFv (специфичный к эктодомену TfR1) находился в ориентации «V_L-линкер-V_H». V_L и V_H в scFv были связаны гидрофильным линкером GSTSGSGKPGSGEGSTKG. Последовательность рекомбинантной цепи в молекулярной конструкции белка слияния IgG4.Fc представлена под номером SEQ ID NO: 39.

Здесь проиллюстрирована конфигурация полученной 2-цепочечной молекулярной конструкции (интерферон-β-1a)-IgG4.Fc-(scFv α TfR1).

Пример 36: Экспрессия и очистка рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния (интерферон-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1)

В этом примере последовательность, кодирующую ген, помещали в кассету экспрессии pcDNA3. Клетки Expi293F высевали при плотности 2,0×10⁶ жизнеспособных клеток/мл в среду для экспрессии Expi293F и выдерживали в течение 18-24 часов перед трансфекцией, чтобы убедиться в том, что клетки на момент трансфекции активно делились. В процессе трансфекции 7,5×10⁸ клеток в 255 мл среды в 2-литровой смесительной колбе Эрленмейера трансфицировали с помощью реагента для трансфекции ExpiFectamine™ 293. Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С в течение 16-18 часов после трансфекции в орбитальном шейкере (125 об/мин) к клеткам в смесительной колбе добавляли усилитель трансфекции 1 и усилитель трансфекции 2 ExpiFectamine™ 293 и инкубировали в течение 7 дней. Надосадочную жидкость культуры собирали и рекомбинантный 2-цепочечный белок слияния (интерферон-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1) в среде очищали с помощью хроматографии на белке А. После замены буфера на PBS концентрацию белка (интерферон-β-1а)-hIgG4.Fc-( scFv α TfR1) определяли и анализировали с помощью 8% SDS-PAGE, как показано на фигуре 32А. Молекулярная конструкция в конфигурации слияния с Fc была выявлена как основная полоса, соответствующая приблизительно 80 кДа, что согласовывалось с ожидаемым размером.

Пример 37. Анализ связывания рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния (интерферон-β-1а)-hIgG1.Fc-(scFv α TfR1) методом ELISA и проточной цитометрии

Связывающую активность рекомбинантного (интерферон-β-1а)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1) анализировали с помощью анализа ELISA с использованием 96-луночного планшета, покрытого рекомбинантным белком (интерферон-β-1а)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1) в концентрации 5 мкг/мл, 100 мкл на лунку. Фрагмент scFv, специфичный к эктодомену TfR1, являлся отрицательным контролем. Рекомбинантный 2-цепочечный белок (интерферон-β-1а)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1) обнаруживали поликлональным кроличьим античеловеческим антителом к интерферону-β, конъюгированным с HRP (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, USA). Затем для проявления цвета добавляли 50 мкл ТМВ-субстрата. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1М HCl. Абсорбцию на 450 нм измеряли с помощью планшетного ридера. Каждый столбик представляет собой среднее значение OD450 для повторяющихся образцов.

На фигуре 32В показан результат анализа ELISA данной молекулярной конструкции. Результаты показывают, что белок слияния (интерферон-β-1а)-hIgG4.Fc-(scFv α TfR1) специфически связан с рекомбинантным эктодоменом белка TfR1.

Пример 38: Получение 2-цепочечного белка слияния IgG4.Fc, содержащего scFv, специфичный к интегрину α4, и scFv, специфичный к эктодомену TfR1

V_L и V_H фрагмента scFv, специфичного к интегрину α4, были получены из моноклонального антитела натализумаба. Двухцепочечный белок слияния IgG.Fc получали путем конфигурирования (scFv α интегрин α4)-CH2-CH3-(scFv α TfR1) (человеческого γ4) в рекомбинантной цепи. С-конец scFv, специфичного к интегрину α4, сливали с N-концом СН2 через линкер GGGGSGGGASGGS. Фрагмент scFv, специфичный к эктодомену TfR1, сливали с С-концом домена СН3 через гибкий линкер (GGGGS)₃. Результат анализа 8% SDA-PAGE на фигуре 33А показывает, что рекомбинантная цепь новой конструкции имела размер около 85 кДа (показано стрелкой), что соответствовало ожидаемому размеру.

Оба scFv находились в ориентации «V_L-линкер-V_H». V_L и V_H в каждом из двух scFv были связаны гидрофильным линкером GSTSGSGKPGSGEGSTKG. Последовательность рекомбинантной цепи в молекулярной конструкции белка слияния IgG4.Fc представлена под номером SEQ ID NO: 40.

Здесь проиллюстрирована конфигурация полученной 2-цепочечной молекулярной конструкции (scFv α интегрин α4)-IgG4.Fc-(scFv α TfR1).

Для исследования связывающей способности 2-цепочечного белка рекомбинантной цепи (scFv α интегрин α4)-IgG4.Fc-(scFv α TfR1) по отношению к Т-клеткам Jurkat, экспрессирующим интегрин α4, проводили анализ клеточного связывания методом проточной цитометрии.

1×10⁶ Т-клеток Jurkat выдерживали в среде RPMI1640, дополненной 10% FBS, с плотностью 1×10⁵. Клетки выдерживали при температуре 37°С с 5% CO₂ во влажной камере. 1×10⁶ Т-клеток Jurkat дважды промывали связывающим буфером (фосфатно-солевой буферный раствор с 0,1% FBS, 2 мМ EDTA и 20 нг/мл NaN₃). К промытым Т-клеткам Jurkat добавляли 10 мкг/мл Human BD Fc block™ (BD Biosciences, San Jose, US) для блокирования опосредованного рецептора Fc. Клетки промывали и инкубировали с 10 мкг/мл рекомбинантного белка (scFv α интегрин α4)-IgG4.Fc-(scFv α TfR1) на льду в течение 15 минут с использованием рекомбинантного 2-цепочечного белка (интерферон-β-1а)-IgG4. Fc-(scFv α TfR1) в качестве отрицательного контроля. Клетки снова промывали и инкубировали с козьим античеловеческим антителом IgG.Fc, конъюгированным с FITC (Caltag, Buckingham, UK), разбавленным в соотношении 1:200 в блокирующем буфере, на льду в течение 15 мин в темноте. Окрашенные клетки анализировали на проточном цитометре FACSCanto II (BD Biosciences).

На фигуре 33В показаны результаты анализа клеток рекомбинантного 2-цепочечного белка (scFv α integrin α4)-IgG4.Fc-(scFv α TfR1) методом окрашивания на Т-клетках Jurkat, экспрессирующих интегрин α4. Конструкция связывалась с Т-клетками Jurkat, в целом, положительно.

Пример 39: Анализ биологической активности 2-цепочечного белка IgG1.Fc, содержащего scFv, специфичный к эндотоксину, и scFv, специфичный к эктодомену CD32a, на макрофагоподобных клетках U937

Для проверки влияния рекомбинантного 2-цепочечного белка слияния (scFv α эндотоксина)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a) на ингибирование секреции TNF-α проводили анализ ELISA с определением количества секретируемого TNF-α в надосадочной жидкости с помощью макрофагоподобных клеток U937.

Клетки U937 выдерживали в RPMI1640, дополненном 10% фетальной бычьей сывороткой (Gibco) и 100 ед./мл пенициллин-стрептомицина (Gibco), при плотности от 3×10⁵ до 2×10⁶ клеток/мл. Клетки выдерживали при температуре 37°С с 5% CO₂ во влажной камере. Для дифференцирования U937 на макрофагоподобные клетки, 1×10⁶клеток/мл U937 инкубировали с 10 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА, Sigma Aldrich). Через 48 часов неприкрепившиеся клетки удаляли, а прикрепившиеся промывали и высевали в 96-луночные планшеты.

Дифференцированные клетки U937 в количестве 5×10⁴ клеток на лунку высевали в 96-луночные планшеты за день до анализа. Клетки стимулировали только добавлением 1 мкг/мл бактерий Е. coli LPS 0111: В4 (Sigma Aldrich) или предварительно приготовленной смеси LPS и 10 мкг/мл (scFv α эндотоксин)-hIgG1.Fc, 15 мкг/мл (scFv α эндотоксин)-hIgG1.Fc-(scFv α CD32a) или 2,5 мкг/мл анти-CD32a scFv. Стимуляция продолжалась в течение 2 часов до сбора надосадочной жидкости. Выработку TNF-α измеряли коммерчески доступным набором ELISA (Biolegend).

Уровни TNF-α в надосадочной жидкости с клетками U937 измеряли с использованием набора ELISA от R&D Systems. Лунки планшетов ELISA (Greiner Bio-One) покрывали 4 мкг/мл иммобилизованного антитела в PBS при температуре 4°С на ночь. Затем лунки блокировали добавлением 0,5% PBS в течение 1 часа и инкубировали с разбавленной надосадочной жидкостью культуры в течение 2 часов. Для обнаружения связанного TNF-α использовали 400 нг/мл меченого биотином детекторного антитела, а затем Streptavidin-HRP. Хромогенную реакцию проводили с использованием ТМВ-субстрата (Clinical Science Products) и останавливали добавлением 1N HCl. Планшеты считывали при поглощении на волне длиной 450 нм. Концентрации TNF-α определяли путем экстраполяции из 4-параметрических стандартных логистических кривых, полученных в результате разбавлений стандартного белка, поставляемого производителем.

На фигуре 34 показано, что рекомбинантный 2-цепочечный белок (scFv α эндотоксин)-hIgG.Fc-(scFv α CD32a) значительно снижал секрецию TNF-α, стимулированную бактериями Е. coli LPS 0111: В4, по сравнению с 2-цепочечным белком (scFv α эндотоксин)-hIgG1.Fc контрольных антител и scFv антител к CD32a или только со средой.

Очевидно, что вышеизложенное описание вариантов осуществления приведено только в качестве примера, и что специалисты в данной области способны выполнить их различные модификации. В вышеизложенном описании, примерах и данных представлено полное описание структуры и применения иллюстративных вариантов осуществления настоящего изобретения. Хотя различные варианты осуществления настоящего изобретения описаны выше с определенной степенью конкретности или со ссылкой на один или несколько отдельных вариантов осуществления, специалисты в данной области способны выполнить многочисленные изменения раскрытых вариантов осуществления без отступления от сущности или объема настоящего изобретения.