Способ диагностики молекулярного фенотипа пациента, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями - RU2672595C2

Чертежи

Показать все 56 чертежа(ей)

Описание

Изобретение относится к способу и набору реагентов для диагностики молекулярного фенотипа пациента, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, а также к лекарственному препарату для лечения такого пациента.

Хронические воспаления представляют собой все более разрастающийся круг проблем медицинского характера, имеющих большое социоэкономическое значение. К ним, в частности, относятся следующие группы заболеваний: аутоиммунные заболевания и заболевания ревматической клинико-морфологической группы (проявления, например, на коже, легких, почках, кровеносно-сосудистой системе, нервной системе, соединительной ткани, опорно-двигательном аппарате, эндокринной системе), аллергические реакции немедленного типа и астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), атеросклероз, псориаз и контактная экзема и хронические реакции отторжения после трансплантации органов и костного мозга. В последние десятилетия многие из этих заболеваний начинают все более заметно доминировать не только в промышленных регионах, но и отчасти во всем мире. Так, вот уже свыше 20% населения в Европе, Северной Америке, Японии и Австралии страдают аллергическими заболеваниями и астмой. Хроническая обструктивная болезнь легких на сегодняшний день занимает пятое место среди наиболее распространенных причин смерти во всем мире и к 2020 г. по прогнозам ВОЗ займет третье место. Лидирующая позиция в статистике заболеваемости и смертности во всем мире принадлежит атеросклерозу с сопутствующими ему заболеваниями - инфаркту миокарда, инсульту и окклюзии периферических артерий. Псориаз и контактная экзема наряду с нейродерматитом и вовсе являются наиболее распространенными хроническими воспалительными заболеваниями кожи.

Ввиду еще недостаточно изученного на сегодняшний день взаимодействия между факторами окружающей среды и генетической предрасположенностью регулирование иммунной системы в долгосрочной перспективе зачастую происходит неправильно. При этом для таких различных заболеваний можно констатировать следующие общие принципы:

(A) Происходит развитие чрезмерного иммунного ответа на обычно безвредные для человека антигены. Эти антигены могут быть частями окружающей среды (например, аллергены, в т.ч. пыльца, шерсть животных, продукты питания, клещи, химические вещества, в т.ч. консерванты, красители, чистящие и моющие средства). В таких случаях у пациентов развиваются аллергические реакции. Например, у активных и пассивных курильщиков возникает хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ). С другой стороны, иммунная система может реагировать и на компоненты собственного организма, воспринимать их как чужеродные и инициировать против них воспалительную реакцию. В таких случаях развивается аутоиммунное заболевание. В каждом таком случае безвредные, нетоксичные антигены ошибочно распознаются как чужеродные или опасные, и запускается неадекватная воспалительная реакция.

(B) Заболевания протекают в несколько фаз, к которым относятся инициирование, прогрессирование, т.е. развитие воспалительной реакции, и связанная с этим деструкция и перестройка с потерей функциональных возможностей органа (так называемое ремоделирование).

(C) Заболевания демонстрируют специфические для конкретного пациента субфенотипические признаки проявления.

(D) В процессах инициирования, поддержания, а также деструкции и перестройки непрерывно задействованы компоненты врожденного и приобретенного иммунитета. Под влиянием врожденного иммунитета (важные компоненты: антигенпредставляющие клетки с их разнообразными популяциями и система комплемента) происходит активация и дифференцировка клеток адаптивной иммунной системы (важные компоненты: Т- и В-лимфоциты). Т-клетки при дальнейшем течении берут на себя центральные функции путем дифференцировки в высокоспециализированные эффекторы.

При этом они активируют и приобретают определенные эффекторные механизмы, к которым, в частности, относятся следующие функции: образование антител, контроль функциональных возможностей эффекторных клеток иммунной системы (например, нейтрофильных, базофильных, эозинофильных гранулоцитов), обратная связь с функциями врожденной иммунной системы, влияние на функциональные возможности негемопоэтических клеток, например, эпителия, эндотелия, соединительной ткани, костей и хрящей и прежде всего нейрональных клеток. Здесь имеет место особое взаимодействие между иммунной и нервной системами, исходя из которого сформировалась концепция нейро-иммунологического взаимодействия при хронических воспалениях.

Поскольку уже упомянутые Т-клетки берут на себя центральные функции при течении болезни, решающую роль играет понимание их специализации. В дифференцировке наивных (неактивированных) клеток CD4⁺ в Th1- и/или Th2-клетки участвуют сложные каскады передачи сигнала.

Стимуляция соответствующим пептидным ГКГС-комплексом (главным комплексом гистосовместимости) через Т-клеточный рецептор вызывает клональную экспансию и программированную дифференцировку CD4⁺ Т-лимфоцитов в Т-хелперы [Т-клетки-помощники] Th1- или Тh2-клетки. Два этих подтипа различаются в зависимости от их цитокиновых профилей. Th1-клетки вырабатывают интерферон-γ (INFγ), интерлейкин 2 (IL-2) и фактор некроза опухоли-α, в то время как Тh2-клетки выделяют IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13. Бактериальные и вирусные инфекции вызывают иммунный ответ, в котором преобладают Th1-клетки. С другой стороны, Тh2-клетки регулируют выработку иммуноглобулиновых Ε антител IgE против паразитов. При этом между Th1- и Тh2-клетками имеет место равновесие. Нарушение этого равновесия приводит к возникновению заболеваний, так, чрезмерный ответ Th1-клеток связан с аутоиммунными заболеваниями, в то время как в основе аллергических заболеваний лежит слишком сильный ответ Тh2-клеток.

Известно, что Th1-цитокины вовлечены в патогенез аутоиммунных заболеваний, например, аутоиммунного увеита, экспериментального аллергического энцефаломиелита, сахарного диабета 1 типа или регионарного энтерита (болезни Крона), в то время как Тh2-цитокины (IL-4, IL-5, IL-13 и/или IL-9) участвуют в возникновении хронических воспалительных заболеваний дыхательных путей, например, эозинофилия дыхательных путей, астма, гиперсекреция слизи и гиперреактивность дыхательных путей. Основой этих заболеваний являются патофизиологические изменения во время образования типичных цитокинов за счет антигенспецифических Th-клеток. Субпопуляции Тh2-клеток в легком и в дыхательных путях вызывают в экспериментальной модели на животном характерные симптомы бронхиальной астмы.

В возникновении аутоиммунных заболеваний и хронических воспалительных реакций задействованы, помимо прочего, два транскрипционных фактора: ТМ-клетко-специфичный транскрипционный фактор Tbet и Тh2-клетко-специфичный транскрипционный фактор GATA-3.

Th1-клетко-специфичный транскрипционный фактор Tbet отвечает, прежде всего, за дифференцировку наивных CD⁴ +Т-клеток в Тh1-клетки. Его экспрессия контролируется по путям передачи сигнала Т-клеточного рецептора (TCR) и через INFγ-рецептор/STAT1 (рецептор интерферона-гамма). Tbet трансактивирует эндогенный INFγ-ген и вызывает выработку INFγ. Функция Tbet in vivo подтверждается и на нокаутированных мышах (Tbet-/-). У Tbet-дефицитных мышей количество Тh2-цитокинов повышено.

Известна функция Tbet в Т-клетках слизистых при возникновении воспалительных заболеваний кишечника. Транскрипционный фактор Tbet вызывает главным образом развитие Th1-клеток и контролирует выработку в этих клетках интерферона-гамма INFγ. За счет ингибирования Tbet баланс между Th1- и Тh2-клетками смещается в сторону Тh2-клеток.

Многие воспалительные заболевания, например, аллергическая астма, напротив, связаны с активацией Тh2-клеток. Тh2-клетки выполняют существенную функцию при развитии аллергических заболеваний, в частности, различных астматических заболеваний. Требуемая для этого дифференцировка Th0-клеток в Th2- клетки зависит от транскрипционного фактора GATA-3. GATA-3 является членом GATA-семейства транскрипционных факторов.

Тh2-клетко-специфичный транскрипционный фактор GATA-3 отвечает, прежде всего, за дифференцировку наивных CD4⁺ Т-клеток в Тh2-клетки. При этом управление дифференцировкой Тh2-клеток осуществляется, главным образом, по двум путям передачи сигнала: по пути Т-клеточного рецептора (TCR) и по пути IL-4- рецептора. Переданные от TCR сигналы активируют как Тh2-клетко-специфичные транскрипционные факторы c-Maf и GATA-3, так и транскрипционные факторы NFAT и АР-1. Активация IL-4 рецептора ведет к связыванию STAT6 с цитоплазматическим доменом IL-4- рецептора, где его фосфолируют Jak1- и Jak3-киназы. В свою очередь, фосфорилирование приводит к димеризации и транслокации STAT6 в клеточное ядро, где STAT6 активирует транскрипцию GATA-3 и других генов. GATA-3 представляет собой транскрипционный фактор с доменами типа цинковых пальцев, который выражается исключительно в зрелых Тh2-клетках, но не в Th1-клетках.

Тh2-клетки вырабатывают цитокины, например, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и GM-CSF. Поляризация в Th2 ингибирует Тh1-дифференцировку за счет подавления Tbet и наоборот. Однако экспрессия GATA-3 не ограничивается только Т-клетками. Экспрессию GATA-3 удавалось выявить и в эозинофильных, и базофильных гранулоцитах, лаброцитах (тучных клетках) и клетках эпителия. GATA-3 играет центральную роль в иммунопатогенезе хронических воспалительных заболеваний, в частности, аллергической астмы.

К общепризнанным препаратам для лечения хронических воспалительных заболеваний относятся, помимо прочего, кортикостероиды, антилейкотриены (ингибиторы лейкотриеновых рецепторов), иммуносупрессивные препараты и моноклональные антитела с антиммуноглобулином Е. Однако положительная реакция пациентов-астматиков на эти терапевтические средства проявляется по-разному. Долгое время оставалось неясным, с чем связаны эти различия в эффективности. В конечном счете подходящую пациенту терапию в каждом конкретном случае приходилось подбирать более или менее методом «проб и ошибок».

Однако лишь недавно удалось установить, что, например, пациентов, страдающих астмой, можно распределить по еще более мелким подгруппам (Woodruff et al., 2009, Τ- helper Type 2-driven Inflammation Defines Major Subphenotypes of Asthma («Т-хелпер 2-го типа-зависимое воспаление определяет основные субфенотипы астмы»), Am J Respir Crit Care Med, Vol 180, 388-395). Так, было показано, что среди пациентов с астмой есть, по меньшей мере, две подгруппы, обозначаемые как «Тh2-высокая» (Th2 high) и «Th2-низкая» (Th2 low). При этом для «Тh2-высокой» подгруппы пациентов с астмой характерна, помимо прочего, повышенная экспрессия гена POSTN, кодирующего периостин для протеина, а также генов для IL-13 и IL-5. «Th2-низкая» группа протестированных пациентов с астмой демонстрирует низкую экспрессию гена POSTN по сравнению с контрольной группой здоровых людей. Эти различные молекулярные фенотипы могли бы быть причиной разной эффективности распространенных терапевтических средств. Так, для «Th2-высокой» подгруппы удалось выявить улучшенную реакцию на лечение кортикостероидами.

Кроме того, удалось обнаружить, что две группы пациентов с астмой, а именно «Тh2-высокая» и «Тh2-низкая» демонстрируют разный отклик на терапию гуманизированным моноклональным антителом против IL-13 (Corren et al., 2011, Lebrikizumab Treatment in Adults with Asthma («Лечение астмы у взрослых»), The new england journal of medicine, 10.1056/NEJMoa1106469). При этом пациенты с астмой сначала эмпирическим путем были отнесены к «Th2-высокой» группе, если значения IgE в сыворотке крови были выше 100 МЕ/мл, а число эозинофильных гранулоцитов составляло 0,14×10⁹ клеток на литр или больше. Каждый пациент, показатели которого были ниже этих значений, был отнесен к «Тh2-низкой» группе. В качестве альтернативы классификацию осуществляли в зависимости от уровня периостина в сыворотке крови. Этот уровень служит суррогатным маркером для трудно обнаруживаемых в крови или дыхательных путях Тh2-цитокинов IL-13. При этом используется тот факт, что IL-13, помимо прочего, вызывает экспрессию периостин-кодирующего гена POSTN в клетках эпителия in vitro (Woodruff et al., 2007, Proc Natl Acad Sei USA., 104(40): 15858-63. Genome-wide profiling identifies epithelial cell genes associated with asthma and with treatment response to corticosteroids («Полногеномное профилирование выявляет гены клеток эпителия, связанные с астмой и с эффектом лечения кортикостероидами»). Пациенты с уровнем периостина в сыворотке крови выше среднего согласно классификации Corren et al., 2011, были отнесены к «периостин-высокой» группе. Как правило, для указанных подгрупп «Тh2-высокая» и «периостин-высокая» удавалось описать более эффективный отклик на лечение анти-IL-13- антителами.

Авторы WO 2009/124090 А1 также предложили определенную классификацию пациентов с астмой, причем в этой классификации задействуется экспрессия несколько генов-«кандидатов», например, POSTN, CLCA1 и SERPINB2. Поскольку регулирование этих генов Тп2-цитокинами IL-4 или IL-13, как известно, происходит с повышением экспрессии, этот кластер обозначают также как «IL-4/IL-13-профиль генной экспрессии» («IL-4/IL-13-Signature»). При этом наряду с определением уровня периостина в сыворотке крови, а также соответствующего количества мРНК (матричных, или информационных РНК) описывается определение значений IgE в сыворотке крови и определение количества эозинофильных гранулоцитов.

Недостаток стратификации пациентов на основе этой экспрессии генов, прежде всего POSTN, заключается в том, что наряду с «IL-4/IL-13-профилием генной экспрессии» значительную роль в генезе астмы играет цитокин IL-5. Кроме того, неизвестна роль протеина периостина в каскаде иммунных реакций, а значит, и в возникновении болезни.

Таким образом, поставленная задача заключается в том, чтобы найти биомаркер, подходящий для достоверного и в то же время удобного для применения в клинических условиях определения молекулярного фенотипа больных, страдающих каким-либо заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, с отнесением их к группам «Тh2-высокая» или «Тh2-низкая» и/или «Тh1-высокая» или «Тh1-низкая». Далее классифицированный таким образом пациент должен поддаваться лечению терапевтическим средством, обладающим особой эффективностью именно для этой подгруппы. Биомаркер должен сделать возможным индивидуальный прогноз эффективности терапевтического средства применительно к тому или иному пациенту, в частности, пациенту с астмой.

Согласно изобретению указанная задача решается с помощью способа диагностики молекулярного фенотипа больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, путем выбора молекулярного фенотипа из группы, в которую входят подгруппы «Тh2-высокая», «Тh2-низкая», «Тh1-высокая» и «Тh1-низкая», и путем количественного определения экспрессии генов GATA-3 и/или Tbet в биологическом изоляте пациента и ее применения для отнесения к какому-либо молекулярному фенотипу заболевания. При этом более точное отнесение к определенному типу больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, осуществляют путем количественного определения экспрессии генов транскрипционного фактора GATA-3 и/или транскрипционного фактора Tbet. Как уже отмечалось выше во вступительной части, в возникновении аутоиммунных заболеваний и хронических воспалительных реакций участвуют Th1-клетко-специфичный транскрипционный фактор Tbet и Тh2-клетко-специфичный транскрипционный фактор GATA-3. Поляризация в Th2 ингибирует дифференцировку в Th1-клетки за счет подавления Tbet и наоборот. В зависимости от уровня экспрессии GATA-3 и/или Tbet возможно закрепление за тем или иным молекулярным фенотипом, т.е. отнесение к какой-либо подгруппе заболевания, сопровождаемого хроническими воспалениями. Способ диагностики согласно изобретению позволяет с высокой степенью информативности без труда определять молекулярный фенотип в повседневных клинических условиях.

Транскрипционные факторы GATA-3 и Tbet являются центральными ключевыми молекулами при возникновении Th1- и/или Тh2-зависимых хронических воспалительных заболеваний. Поэтому прямое количественное определение экспрессии протеинов и/или мРНК-экспрессии представляет собой наилучший подход к стратификации пациентов, поскольку результат не может быть искажен никакими промежуточными механизмами.

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа уровень экспрессии GATA-3 и/или Tbet определяют по количеству протеина или мРНК. При этом количество протеина можно определить с помощью иммуноанализа. Иммуноанализ представляет собой предпочтительно твердофазный иммуноферментный анализ ИФА (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, исследование ELISA), радиоиммунный анализ РИА (radioimmunassay, RIA), электрохемилюминесцентный ЭХЛ иммуноанализ (electrochemiluminescence immunoassay, ECL), твердофазный иммуноферментный анализ с хемилюминесценцией (chemoluminescence-linked Immunosorbent assay, CLIA), твердофазный иммуноанализ с флуоресцентным усилением (fluorescence-linked Immunosorbent assay, FLIA) или мультиплексный иммуноанализ (multiplex-assay).

Преимуществом всех указанных видов анализа, наряду с высокой чувствительностью и специфичностью, является возможность автоматизации, поэтому все они прекрасно подходят для повседневного использования в клинических условиях. Разумеется, в рамках настоящего изобретения при необходимости может быть подобрано любое другое подходящее исследование для количественного учета количества протеинов GATA-3 и/или Tbet. Далее уровень экспрессии GATA-3 и/или Tbet может быть определен масс-спектрометрическими способами, хроматографическими способами, например, с помощью хроматографии в газовой фазе, жидкостными способами с отделением твердой фазы, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), или способами на основе микро- и нанофлюидных технологий.

При необходимости для определения экспрессии GATA-3 или Tbet с помощью анализа ИФА (ELISA) способ может включать следующие этапы:

- получение лизата посредством лизиса клеток;

- добавление лизата в лунку микротитрационного планшета, покрытого слоем первого антитела, специфичного к GATA-3- или Tbet;

- промывка микротитрационного планшета;

- добавление второго специфичного к GATA-3 или Tbet антитела в лунку микротитрационного планшета;

- промывка микротитрационного планшета;

- выявление и количественное определение GATA-3- или Tbet-протеина.

Для выявления второе специфичное антитело может быть маркировано, например, биотином, и может быть отдельно добавлен фермент, связанный со стрептавидином. Однако второе специфичное антитело может быть связано с ферментом напрямую. Если целесообразно, возможно также использование третьего связанного с ферментом антитела, направленного против второго специфичного антитела.

Фермент, которым предпочтительно является пероксидаза или щелочная фосфатаза, переносится подходящим субстратом, пригодным для колориметрии или хемилюминесценции и т.п.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения дополнительно или в качестве альтернативы указанному способу учета количества протеинов возможно определение количества мРНК GATA-3 и/или Tbet. Для этого предпочтительно подходит ПЦР (полимеразная цепная реакция), особенно предпочтительно количественная ПЦР, или микроматричный анализ. Порядок подбора специфических для GATA-3 и Tbet зондов и/или праймеров для указанных способов выявления специалисту в данной области техники известен.

Биологический изолят согласно предпочтительному варианту осуществления способа получали из цельной крови, мочи, мокроты, смывов от бронхоальвеолярного лаважа (BAL), биопсии, щеточной биопсии, ликвора, трахеального секрета, семенной жидкости, водяночной жидкости, слюны, пунктата или лимфатической жидкости. Стандартные методы получения подходящего биологического изолята специалисту известны.

GATA-3 и Tbet - это протеины, проявляющие свое действие в качестве транскрипционных факторов в ядре Т-клеток-хелперов подтипов Тh1 и Th2. Для определения концентрации этих обоих ядерных протеинов в определенном объеме биологического изолята, например, в определенном объеме цельной крови или т.п., клетки, образующие GATA-3 и Tbet, необходимо сначала изолировать, а затем подвергнуть лизису. Прямое выявление этих протеинов из сыворотки или плазмы крови человека едва ли представляется возможным, т.к. они содержатся там в концентрации, не поддающейся обнаружению. Поэтому анализ GATA-3 и Tbet при необходимости осуществляется в четыре этапа:

- отделение и изоляция GАТА-3/Tbet- экспрессирующих клеток от остальных клеточных компонентов цельной крови

- лизис клеток и выделение внутриклеточных / ядерных протеинов

- количественное определение концентрации GATA-3 и Tbet и

- нормирование обнаруженных концентраций GATA-3 и Tbet.

Согласно предпочтительному доработанному варианту способ согласно изобретению, независимо от того, определяется уровень экспрессии GATA-3 и/или Tbet по количеству протеинов или мРНК, включает также один или несколько следующих этапов:

(i) изоляция лейкоцитов, предпочтительно посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла;

(ii) повышение концентрации лейкоцитов, предпочтительно посредством гель-фильтрации; или

(iii) повышение концентрации Тh1/Th2-клеток, в частности, CD4⁺-T-клеток с помощью клетко-специфичных антител, которые предпочтительно связаны с магнитными гранулами-микроносителями.

Указанные этапы (i)-(iii) выполняют перед лизисом клеток и в каждом случае позволяют повысить чувствительность, а также информативность способа диагностики, т.к. гены GATA-3 и Tbet особенно в лейкоцитах выражаются по-разному.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения отнесение пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Тh2-высокой» подгруппы происходит, когда выполняется, по меньшей мере, одно из следующих условий:

a) экспрессия генов GATA-3 в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения,

b) отношение уровней экспрессии генов GATA-3 Tbet в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения.

Таким образом, «Тh2-высокая» подгруппа характеризуется высокой абсолютной экспрессией генов GATA-3 по сравнению с заданным контрольным значением. При этом в качестве контрольного значения - в случае определения количества протеинов - может использоваться соответствующее значение содержания протеина GATA-3 в изоляте здорового человека. Однако также возможно использование абсолютных контрольных значений. В случае определения количества мРНК в качестве контрольного значения может использоваться соответствующее значение количества GATA-3 мРНК в изоляте здорового человека. Однако опять же возможно применение абсолютных контрольных значений, например, количество копий/мл.

Отнесение пациента к указанному молекулярному фенотипу «Тh2-высокой» подгруппы в соответствии с предпочтительной формой осуществления способа согласно изобретению происходит, если в качестве альтернативы или дополнительно к повышенной экспрессии генов GATA-3 отношение уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения. При этом в качестве контрольного значения можно использовать соответствующее значение отношения уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet в изоляте здорового человека. Определение отношения уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet повышает достоверность суждения, т.к. при этом наряду с экспрессией генов GATA-3 в качестве дополнительного параметра выявляется экспрессия генов Tbet. Поскольку, как описано во вступлении, регулирование обоих транскрипционных факторов в процессе их экспрессии, происходит разнонаправленно, включение Tbet представляет собой средство внутреннего контроля для количественного определения экспрессии генов GATA-3.

Согласно предпочтительному доработанному варианту способ согласно изобретению для отнесения пациента к молекулярному фенотипу «Th2-высокой» подгруппы содержит этапы:

- выделение протеинов или РНК из клеток биологического изолята пациента;

- определение уровня экспрессии протеинов или мРНК для GATA-3 и/или Tbet;

- включение пациента в «Тh2-высокую» подгруппу, если выполняется, по меньшей мере, одно из перечисленных выше условий под пунктами а) или b).

В качестве альтернативы дополнительно к указанному определению экспрессии генов GATA-3 и/или Tbet происходит еще определение других параметров для достоверного включения в «Тh2-высокую» подгруппу. Так, например, можно измерять уровень IgE в сыворотке крови и число эозинофильных гранулоцитов. Закрепление за «Тh2-высокой» подгруппой происходит, если далее уровень IgE в сыворотке крови оказывается выше, чем 100 МЕ/мл и/или если число эозинофильных гранулоцитов составляет 0,14×109 клеток на литр или выше. В качестве альтернативы при необходимости может быть выполнено определение концентрации моноксида азота в выдыхаемом воздухе, т.е. определение значения FeNO.

Еще один предпочтительный вариант осуществления способа согласно изобретению включает отнесение пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Тh2-низкой» подгруппы, если выполняется, по меньшей мере, одно из следующих условий:

a) экспрессия генов GATA-3 в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения,

b) отношение уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения.

Таким образом, «Тh2-низкая» подгруппа характеризуется низкой абсолютной экспрессией генов GATA-3 по сравнению с заданным контрольным значением. При этом в качестве контрольного значения - в случае определения количества протеинов - может использоваться соответствующее значение содержания протеина GATA-3 в изоляте здорового человека. Здесь надо учитывать, что у пациента «Тh2-низкой» подгруппы с заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, абсолютная экспрессия генов GATA-3, тем не менее, будет, как правило, выше, чем в изоляте здорового человека. Однако абсолютная экспрессия генов GATA-3 может быть также ниже, чем у здорового человека. Но, во всяком случае, экспрессия генов GATA-3 не столь высока, как описано для «Тh2-высокой» подгруппы. Таким образом, отнесение пациента к «Тh2-низкой» подгруппе происходит, если у него содержание протеина GATA-3 по сравнению с изолятом здорового человека если и повышено, то умеренно. Однако можно использовать и фиксированные контрольные значения. В случае определения количества мРНК в качестве контрольного значения можно использовать соответствующее значение количества GATA-3 мРНК в изоляте здорового человека, причем отнесение пациента к «Тh2-низкой» подгруппе происходит, когда у него количество GATA-3 мРНК меньше, чем в соответствующем образце здорового человека или, во всяком случае, повышено незначительно. Однако, опять-таки, можно использовать и фиксированные контрольные значения.

Отнесение пациента к указанному молекулярному фенотипу «Th2-низкой» подгруппы в соответствии с предпочтительной формой осуществления способа согласно изобретению происходит, если в качестве альтернативы или дополнительно к уменьшенной экспрессии генов GATA-3 отношение уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения. При этом в качестве контрольного значения может использоваться соответствующее значение отношения уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet в изоляте здорового человека. Определение отношения уровней экспрессии генов GATA-3: Tbet и здесь повышает достоверность суждения, т.к. при этом наряду с экспрессией генов GATA-3 в качестве дополнительного параметра устанавливается экспрессия генов Tbet.

Поскольку, как описано во вступлении, регулирование обоих транскрипционных факторов в процессе их экспрессии, происходит разнонаправленно, включение Tbet в некоторой степени представляет собой средство внутреннего контроля для количественного определения экспрессии генов GATA-3.

Согласно предпочтительному доработанному варианту способ отнесения пациента к молекулярному фенотипу «Тh2-низкой» подгруппы согласно изобретению включает следующие этапы:

- выделение протеинов или РНК из клеток биологического изолята пациента;

- определение уровня экспрессии протеинов или мРНК для GATA-3 и/или Tbet;

- включение пациента в «Тh2-низкую» подгруппу, если выполняется, меньшей мере, одно из перечисленных выше условий под пунктами а) или b).

В качестве альтернативы дополнительно к указанному определению экспрессии генов GATA-3 и/или Tbet опять-таки определяются и другие параметры для достоверного включения в «Тh2-низкую» подгруппу. Так, например, можно измерять уровень IgE в сыворотке крови и число эозинофильных гранулоцитов. Отнесение к «Тh2-низкой» подгруппе происходит в том случае, если уровень IgE в сыворотке крови ниже, чем 100 МЕ/мл, и/или если число эозинофильных гранулоцитов составляет менее 0,14×10⁹ клеток на литр. В качестве альтернативы при необходимости может быть также определена концентрация моноксида азота в выдыхаемом воздухе, т.е. выполнено определение значения FeNO.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения отнесение пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Тh1-высокой» подгруппы происходит, если выполняется, по меньшей мере, одно из следующих условий:

a) экспрессия генов Tbet в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения,

b) отношение уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения.

Таким образом, «Th1-высокая» подгруппа характеризуется высокой абсолютной экспрессией генов Tbet по сравнению с заданным контрольным значением. При этом в качестве контрольного значения - в случае количественного определения протеинов - может использоваться соответствующее значение содержания протеина Tbet в изоляте здорового человека, причем отнесение пациента к «Th1-высокой» подгруппе происходит, если у него повышено содержание протеина Tbet. Однако можно также использовать и фиксированные контрольные значения. В случае определения количества мРНК в качестве контрольного значения можно использовать соответствующее значение количества мРНК Tbet в изоляте здорового человека, причем отнесение пациента к «Тh1-высокой» подгруппе происходит в том случае, если у него повышено количество мРНК Tbet. Однако, опять-таки, можно использовать и фиксированные контрольные значения.

Отнесение пациента к указанному молекулярному фенотипу «Тh1-высокой» подгруппы в соответствии с предпочтительной формой осуществления способа согласно изобретению происходит, если в качестве альтернативы или дополнительно к повышенной экспрессии генов Tbet отношение уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 в биологическом изоляте выше заданного контрольного значения. При этом в качестве контрольного значения можно использовать соответствующее значение отношения экспрессии генов Tbet: GATA-3 в изоляте здорового человека. Определение отношения уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 и здесь повышает достоверность суждения, т.к. при этом наряду с экспрессией генов Tbet в качестве дополнительного параметра устанавливается экспрессия генов GATA-3, а включение GATA-3 представляет собой средство внутреннего контроля для количественного определения экспрессии генов Tbet.

Согласно предпочтительному доработанному варианту способа отнесения пациента к молекулярному фенотипу «Th1-высокой» подгруппы согласно изобретению включает следующие этапы:

- выделение протеинов или РНК из клеток биологического изолята пациента;

- определение уровня экспрессии протеинов или мРНК для Tbet и/или GATA-3;

- включение пациента в «Th1-высокую» подгруппу, если выполняется, меньшей мере, одно из перечисленных выше условий под пунктами а) или b).

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу, позволяющему отнести пациента к тому или иному молекулярному фенотипу «Th1-низкой» подгруппы, если выполняется, по меньшей мере, одно из следующих условий:

a) экспрессия генов Tbet в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения,

b) отношение уровней экспрессии генов Tbet GATA-3 в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения.

Таким образом, «Th1-низкая» подгруппа характеризуется низкой абсолютной экспрессией генов Tbet по сравнению с заданным контрольным значением. При этом в качестве контрольного значения - в случае количественного определения протеинов - можно использовать соответствующее значение содержания протеина Tbet в изоляте здорового человека. Здесь следует учитывать, что у пациента «Th1-низкой» подгруппы с заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, абсолютная экспрессия генов Tbet, тем не менее, может быть выше, чем в изоляте здорового человека. Однако абсолютная экспрессия генов Tbet может также быть ниже, чем у здорового человека. Но, во всяком случае, экспрессия генов Tbet не столь высока, как описано для «Т1h-высокой» подгруппы. Таким образом, отнесение пациента к «Th1-низкой» подгруппе происходит, если у него содержание протеина Tbet по сравнению с изолятом здорового человека если и повышено, то умеренно. Однако можно использовать и фиксированные контрольные значения. В случае определения количества мРНК в качестве контрольного значения можно использовать соответствующее значение количества Tbet мРНК в изоляте здорового человека, причем отнесение пациента к «Тh1-низкой» подгруппе происходит, когда у него количество Tbet мРНК меньше, чем в соответствующем образце здорового человека или, во всяком случае, повышено незначительно. Однако, опять-таки, можно использовать и фиксированные контрольные значения.

Отнесение пациента к указанному молекулярному фенотипу «Th1-низкой» подгруппы в соответствии с предпочтительной формой осуществления способа согласно изобретению происходит, если в качестве альтернативы или дополнительно к пониженной экспрессии генов Tbet отношение уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения. При этом в качестве контрольного значения может использоваться соответствующее значение отношения уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 в изоляте здорового человека. Определение отношения уровней экспрессии генов Tbet: GATA-3 здесь тоже повышает достоверность суждения, т.к. при этом наряду с экспрессией генов Tbet в качестве дополнительного параметра устанавливается экспрессия генов GATA-3, и включение GATA-3 в некоторой степени представляет средство внутреннего контроля для количественного определения экспрессии генов Tbet.

Согласно предпочтительному доработанному варианту способ отнесение пациента к молекулярному фенотипу «Th1-низкой» подгруппы согласно изобретению включает несколько этапов:

- выделение протеинов или РНК из клеток биологического изолята пациента;

- определение уровня экспрессии протеинов или мРНК для Tbet и/или GATA-3;

- включение пациента в «Th1-низкую» подгруппу, если выполняется, меньшей мере, одно из перечисленных выше условий под пунктами а) или b).

В качестве альтернативы дополнительно к указанному определению экспрессии генов GATA-3 и/или Tbet могут определяться и другие параметры для достоверного включения в «Тh1-высокую» и «Th1-низкую» подгруппу. Так, например, можно определять число эозинофильных гранулоцитов или количественно определять уровень IgE в сыворотке крови. Отнесение к «Th1-высокой» подгруппе происходит в том случае, если уровень IgE в сыворотке крови ниже, чем 100 МЕ/мл, и/или если число эозинофильных гранулоцитов составляет менее 0,14×10⁹ клеток на литр. В противном случае пациент закрепляется за «Th1-низкой» подгруппой. В качестве альтернативы при необходимости можно еще также определять концентрацию моноксида азота в выдыхаемом воздухе, т.е. определять значение FeNO.

Чтобы учесть различия в подготовке образцов, может быть произведено нормирование концентраций GATA-3 и Tbet. Различия в подготовке образцов могут возникать, например, из-за разного числа клеток, подвергаемых лизису, в результате разных уровней эффективности лизиса в отдельных образцах или за счет разного содержания разных типов клеток в препаратах клеток. Согласно изобретению, помимо прочего, существуют следующие возможности нормирования: нормирование по общему содержанию протеина в клеточном лизате, нормирование по числу лизированных клеток или нормирование по концентрации специфических маркерных протеинов, которые обнаруживаются конкретно в определенных типах клеток.

Пациенты с диагностированным молекулярным фенотипом «Тh2-высокой» подгруппы при определенных обстоятельствах могут одновременно быть помещены в «Th1-низкую» подгруппу. Также пациенты диагностированным молекулярным фенотипом «Th1-высокой» подгруппы при определенных обстоятельствах одновременно могут быть отнесены к «Th2-низкой» подгруппе. Это обусловлено описанным выше фактом, что поляризация в Th2 ингибирует дифференцировку Th1- за счет подавления Tbet и наоборот.

В рамках настоящего изобретения осуществляется диагностика и лечение заболеваний, сопровождающихся хроническими воспалениями, например, аутоиммунных заболеваний, заболеваний ревматической клинико-морфологической группы (проявления, например, на коже, легких, почках, кровеносно-сосудистой системе, нервной системе, соединительной ткани, опорно-двигательном аппарате, эндокринной системе), аллергических реакций немедленного типа и астмы, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), атеросклероза, псориаза и контактной экземы, а также хронических реакций отторжения после трансплантации органов и костного мозга. Согласно изобретению возможны также диагностика и/или лечение опухолевых заболеваний, если GATA-3 или Tbet причастны к возникновению и/или если, как вторичное явление, прекращено их регулирующее действие.

В рамках настоящего изобретения хроническое воспалительное заболевание обусловлено либо Th2, например, аллергическая бронхиальная астма, риноконьюктивит, аллергический синусит, атопический дерматит, пищевые аллергии, пузырчатка, язвенный колит, паразитарные заболевания, либо Тh1, например, псориаз, аллергическая контактная экзема, регионарный энтерит, ХОБЛ, ревматоидный артрит, аутоиммунные заболевания, сахарный диабет 1 типа или рассеянный склероз.

Далее согласно изобретению упомянутая выше задача решается с помощью лекарственного препарата для лечения заболеваний, сопровождающихся хроническими воспалениями, у больного с тем или иным молекулярным фенотипом, причем молекулярный фенотип определяют с помощью способа в соответствии с одним или несколькими вариантами осуществления указанного способа диагностики согласно изобретению. При этом идентифицированный молекулярный фенотип включает, в частности, группы «Тh1-низкая», «Th1-высокая», «Тh2-низкая» или «Тh2-высокая».

Согласно предпочтительному варианту осуществления упомянутый лекарственный препарат содержит специфическую для GATA-3 или Tbet рибонуклеиновую кислоту или дезоксирибонуклеиновую кислоту, в частности, специфический для GATA-3 или Tbet ДНК-фермент.

Общая модель ДНК-фермента представляет собой модель «10-23» (Sontoro et al., 1997). ДНК-ферменты модели 10-23, именуемые также «10-23 ДНК-ферментами» - содержит каталитический домен из 15 нуклеотидов, у которого по бокам расположены два субстрат-связывающих домена. При этом каталитический домен предпочтительно содержит последовательность ggctagctacaacga (SEQ ID No. 154). Длина субстрат-связывающих доменов может варьироваться, домены могут иметь либо одинаковую, либо разную длину. В одном предпочтительном варианте длина субстрат-связывающих доменов составляет от 6 до 14 нуклеотидов, особенно предпочтительно, чтобы в каждом случае было, по меньшей мере, девять нуклеотидов. Такие ДНК-ферменты содержат общую последовательность nnnnnnnnnggctagctacaacgannnnnnnnn (SEQ ID NO 155). При этом особенно предпочтительны субстрат-связывающие домены, которые связывают мРНК, с кодированием для протеинов GATA-3 и Tbet.

Упомянутый каталитический центральный домен ggctagctacaacga представляет собой только один предпочтительный вариант осуществления. Специалисту в данной области техники известно, что «10-23 ДНК-ферменты» с сопоставимой биологической активностью могут быть сохранены с видоизмененным каталитическим доменом.

В одном особо предпочтительном варианте субстрат-связывающие домены являются полностью комплементарными по отношению к участку, который сбоку примыкает к сайту расщепления. Однако для связывания и расщепления целевой РНК ДНК-фермент не обязательно должен быть полностью комплементарным. ДНК-фермент типа 10-23 расщепляет целевую мРНК в последовательные пурин-пиримидиновые цепи. В рамках настоящего изобретения ДНК-ферменты предпочтительно содержат активные in vivo ДНК-ферменты против GATA-3 и Tbet согласно документу WO 2005/033314 А2, содержание которого излагается применительно к объему раскрытия настоящего изобретения.

Лекарственный препарат для специфического ингибирования экспрессии GATA-3 in vivo содержит, в частности, по меньшей мере, один ДНК-фермент, выбранный из группы, в которую входят ДНК-ферменты с одной последовательностью согласно одной из последовательностей от SEQ ID NO 1 до SEQ ID NO 70. Такой ДНК-фермент связывает предпочтительно с мРНК, кодирующей для GATA-3 гена человека с нуклеотидной последовательностью гена, выбранной из последовательностей SEQ ID NO 151 (GATA-3 человека из базы данных №: ХМ 043124), SEQ ID NO 152 (GATA-3 человека из базы данных №: Х58072) и SEQ ID NO 153 (GATA-3 человека, секвенсированная из плазмиды pCR2.1).

Лекарственный препарат для специфического ингибирования экспрессии GATA-3 in vivo содержит предпочтительно ДНК-фермент hgd40 с последовательностью 5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG (SEQ ID NO 40).

Лекарственный препарат для специфического ингибирования экспрессии Tbet in vivo содержит в частности, по меньшей мере, один ДНК-фермент, выбранный из ряда ДНК-ферментов с последовательностью в соответствии с одной из последовательностей от SEQ ID NO 71 до SEQ ID NO 148. Такой ДНК-фермент связывает предпочтительно с мРНК, которая кодирует для гена Tbet человека с нуклеотидной последовательностью гена, выбранной из последовательностей SEQ ID NO 149 (Tbet человека из базы данных №: NM 013351) и SEQ ID NO 150 (Tbet человека, секвенсированный из pBluescript-SK).

Лекарственный препарат для специфического ингибирования экспрессии Tbet in vivo содержит предпочтительно ДНК-фермент td69 с последовательностью 5'-GGCAATGAAggctagctacaacgaTGGGTTTCT (SEQ ID NO 139) или td70 с последовательностью 5'-TCACGGCAAggctagctacaacgaGAACTGGGT (SEQ ID NO 140).

В качестве альтернативы ДНК-ферментам лекарственный препарат для специфического ингибирования экспрессии GATA- 3 или Tbet может содержать подходящую малую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту.

Лекарственный препарат предпочтительно имеет состав, который способен вводить пациентам указанные специфические молекулы рибонуклеиновой или дезоксирибонуклеиновой кислоты в виде фармацевтически приемлемой композиции либо перорально, ректально, парентерально, внутривенно, внутримышечно, либо подкожно, интрацистернально, внутривагинально, внутрибрюшинно, интратекально, интраваскулярно, местно (присыпка, мазь или капли) или в форме аэрозоля. Дозировочные формы для местного приема лекарственного препарата согласно этому изобретению включают мази, присыпки, аэрозоли или ингаляционные средства. Активный компонент в стерильных условиях смешивают с физиологически приемлемым наполнителем и, в зависимости от потребностей, с возможными консервантами, буферами или вспенивателями.

Лекарственный препарат может применяться для терапии всех групп заболеваний, сопровождающихся хроническими воспалениями.

Согласно особо предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения лечение пациентов с молекулярным фенотипом «Тh2-высокой» подгруппы осуществляется с помощью GATA-3 специфического ДНК-фермента. Терапия пациента с молекулярным фенотипом «Тh1-высокой» подгруппы осуществляется с помощью специфичного к Tbet ДНК-фермента. Далее, лечение пациента с молекулярным фенотипом «Тh2-низкой» подгруппы осуществляется с помощью специфичного к Tbet ДНК-фермента, а лечение пациента с молекулярным фенотипом «Тh1-низкой» подгруппы может происходить с использованием GATA-3 ДНК-фермента.

Таким образом, лекарственный препарат согласно изобретению с GATA-3-специфическим ДНК-ферментом предусмотрен предпочтительно для лечения пациента с молекулярным фенотипом «Тh2-высокой» подгруппы, а лекарственный препарат с Tbet-специфическим ДНК-ферментом предусмотрен предпочтительно для лечения пациента с молекулярным фенотипом «Th1-высокой» подгруппы.

Согласно изобретению, особое преимущество лекарственного препарата по одному из указанных выше вариантов осуществления для специфической терапии диагностированной согласно изобретению подгруппы пациентов - а именно «Тh2-высокой», «Тh2-низкой, «Тh1-высокой» или «Th1-низкой» - заключается в том, что с помощью специфического лекарственного препарата, в частности, ДНК-фермента и/или малой интерферирующей РНК, происходит функциональная инактивация как раз тех кодирующих РНК-молекул транскрипционных факторов, у которых предварительно была установлена дифференциальная экспрессия, и которые участвуют в возникновении хронических воспалительных реакций и аутоиммунных заболеваний. Эта стратегия явно отличается от традиционных подходов, а также от упомянутого порядка действий, описанного в документе Corren et al., 2011, поскольку там, с одной стороны, определяли количество периостина (суррогатный маркер), но затем предлагали терапию против другой мишени, например, против IL-13 с помощью анти-IL-13 антитела. Лекарственный препарат согласно изобретению, напротив, отличается высокой специфичностью. Он вызывает клетко-специфическое вмешательство и специфичен для отделов и органов.

Формы выпуска лекарственного препарата согласно изобретению включают фармацевтически приемлемые композиции, содержащие модификации и «пролекарственные формы» (неактивные формы лекарства), если по достоверной медицинской оценке они не вызывают избыточной токсичности, раздражений или аллергических реакций у пациента. Термин «пролекарственные препараты» относится к соединениям, для улучшения ввода в организм трансформируемым, например, посредством гидролиза в крови.

Лекарственный препарат согласно изобретению может также применяться в форме гетерогенной эмульсии для аппликации указанных специфических нуклеиновокислотных молекул. Для этого указанная гетерогенная эмульсия включает внешнюю водную фазу W1, диспергированную во внешней водной фазе W1 масляную фазу 0 и диспергированную в масляной фазе 0 внутреннюю водную фазу W2, причем во внутренней водной фазе W2 предусмотрен, по меньшей мере, один электролит, выбранный из ряда щелочные и щелочноземельные галогениды и сульфаты, и, по меньшей мере, одна специфическая молекула рибонуклеиновой кислоты или дезоксирибонуклеиновой кислоты, предпочтительно специфичный к GATA-3 или Tbet ДНК-фермент, причем внешняя водная фаза W1 содержит гидрофильный эмульгатор, являющийся полимером этиленоксида и пропиленоксида, а масляная фаза 0 образована триацилглицеридами и содержит липофильный эмульгатор из ряда диметиконов. С помощью одной такой гетерогенной эмульсии можно, в частности, особенно эффективно защищать от нежелательного разрушения нуклеиновокислотные молекулы.

Вид дозировки определяет лечащий врач с учетом конкретных клинических факторов. Специалисту известно, что вид дозировки зависит от разных факторов, например, от размеров тела, веса, состояния кожных покровов, возраста, пола или общего состояния здоровья пациента, но также и от конкретно принимаемого средства, продолжительности и способа приема, а также от других медикаментов, которые могут даваться параллельно. При этом в соответствии с особенно предпочтительным вариантом осуществления количество активного компонента лекарственного препарата может быть адаптировано с учетом измеренного уровня экспрессии. Так, в результате включения в «Тh2-высокую» подгруппу и при выявленной очень высокой экспрессии генов GATA-3 может быть дана повышенная доза активного компонента, в частности, специфического к GATA-3 ДНК-фермента. Соответственно, при после включения в «Th1-высокую» подгруппу и при выявленной очень высокой экспрессии генов Tbet может быть дана повышенная доза активного компонента, в частности, специфического к Tbet ДНК-фермента.

Еще один аспект настоящего изобретения касается набора для диагностики молекулярного фенотипа больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, причем набор содержит, по меньшей мере, один специфический компонент для количественного определения протеина или мРНК GATA-3 и/или Tbet в биологическом изоляте пациента.

Набор реагентов для диагностики согласно изобретению может легко предлагаться в виде готового к применению «набора», включающего антитело или антиген, адсорбированный на поверхности носителя, и композицию IgG антител человека, которая, например, в случае с человеком, представляет собой композицию lgG-антител к клеткам человека, маркированных таким образом, что они выявляются посредством каскада реакций типа биотин-стрептавидин- пероксидаза или - щелочная фосфатаза.

В качестве альтернативы набор для диагностики наряду с носителем содержит также буфер и реагенты, например, реагенты, необходимые для подтверждения реакции, например, стрептавидин, который связан с маркером, дающим реакцию окрашивания.

В качестве альтернативы набор дополнительно содержит стандарт-образец GATA-3 и/или T-Bet для калибровки набора, причем для выявления количества протеина или мРНК у GATA-3 и/или Tbet применяется один стандарт-образец.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения для определения количества протеина в каждом случае содержится специфическое к GATA-3 и/или Tbet антитело. При необходимости, согласно одному из вариантов, могут содержаться другие компоненты для проведения какого-либо метода иммунологического анализа, в частности, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Еще один компонент для проведения твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) выбирают из ряда: лизирующий буфер для лизиса клеток, микротитрационный планшет, количественные стандарты протеина для GATA-3 и/или Tbet, вторичные антитела и связанный фермент для работы с субстратом для выявления. Наряду с первым специфичным к GATA-3- и/или Tbet антителом предпочтительно использовать еще одно специфичное к GATA-3- или Tbet антитело из набора.

Для количественного определения мРНК набор может содержать в каждом случае сайт-специфический зонд и/или праймер для генов GATA-3 и/или Tbet.

Другие признаки, детали и преимущества изобретения следуют из формулы изобретения, а также из следующего описания примеров вариантов осуществления изобретения с помощью чертежей.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 Влияние разных детергентов на выделение GATA-3 из стимулированных клеток Jurkat,

Фиг. 2a, 2b Результаты количественного определения Tbet и GATA-3 с помощью «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с использованием хромогенного субстрата (ELISA),

Фиг. 3 Градуировочная кривая твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) GATA-3 для количественного определения образцов

Фиг. 4 Градуировочная кривая твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) Tbet для количественного определения образцов,

Фиг. 5 Нормированное определение Tbet в лизатах мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС) у здоровых обследуемых и аллергиков,

Фиг. 6 Значительное улучшение при аллергическом воспалении дыхательных путей после четырехдневного лечения специфичным к GATA-3 ДНК-ферментом hgd40 (SEQ ID NO 40) по сравнению с мышами, не подвергавшимися терапии,

Фиг. 7 Влияние специфичного к GATA-3 ДНК-фермента hgd40 (SEQ ID NO 40) на количество возникающих при хроническом воспалении нейтрофилов, количество эозинофилов в BAL и выделение IL-5 (интерлекин-5) после восьминедельного лечения, и

Фиг. 8 Влияние специфичного к GATA-3 ДНК-фермента hgd40 (SEQ ID NO 40) на перибронхиальное / периваскулярное воспаление и гиперплазию бокаловидных клеток в тканях легких.

Материалы и методы:

Клетки можно изолировать, например, с помощью технологий, основанных на связи специфических антител. Здесь применяются магнитные гранулы-микроносители, поставляемые компаниями Miltenyi (система Macs), Dynal (гранулы-микроносители DynaBeads) или BD-Bioscience (iMAG). В качестве альтернативы это достигается за счет очистки клеток с помощью флюоресцентно-маркированного антитела в клеточных сортерах, например, производства компании Cytomation (MOFLO) или BD-Bioscience (FACS-Vantage). Чистота клеток-мишеней составляет предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 99%.

Способы изоляции РНК описаны, например, у Sambrook and Russell, Molecular Cloning («Клонирование молекулы нуклеиновых кислот»), A Laboratory Manual, издание 3-е, Cold Spring Harbor Laboratory (2001), New York, и в документе Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998), New York. Кроме того, для изоляции РНК средний специалист в данной области техники может использовать доступные в продаже наборы (технологии на основе диоксида кремния), например, набор реагентов RNeasy от компании Qiagen. Далее предпочтительно, выделять и очищать мРНК из клеток-мишеней путем применения доступных в продаже наборов, например, производства Qiagen (Oligotex mRNA Kit), Promega (система для изоляции мРНК mRNA PolyATract Isolation System) или Miltenyi (mRNAdirect).

Примеры осуществления изобретения

Пример варианта осуществления изобретения 1

GATA-3 и Tbet представляют собой протеины, проявляющие свое действие в качестве так называемых транскрипционных факторов в ядре Т-клеток-хелперов подтипа Th1 и Th2. Для определения концентрации обоих этих нуклеарных протеинов в определенном объеме биологического изолята, в частности, в определенном объеме цельной крови, клетки, образующие GATA-3 и Tbet, необходимо сначала изолировать, а затем лизировать. Прямое выявление этих протеинов из сыворотки или плазмы крови человека невозможно, т.к. они содержатся там в не поддающейся обнаружению концентрации. Поэтому анализ GATA-3 и Tbet выполняется в 4 этапа:

- отделение и изоляция клеток, экспрессирующих GATA-3/Tbet, от остальных клеточных компонентов цельной крови;

- лизис клеток и выделение внутриклеточных / ядерных протеинов;

- количественное определение концентрации GATA-3 и Tbet;

- нормирование обнаруженных концентраций GATA-3 и Tbet

Отделение и изоляция клеток, экспрессирующих GATA-3/Tbet, от остальных клеточных компонентов цельной крови

Для этого применяются разные по сложности способы, в частности, для отделения и изоляции в рамках настоящего изобретения выполняются следующие этапы:

- изоляция лейкоцитов из цельной крови посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла с последующей афинной очисткой клеточных типов Th1/Th2 с помощью антител к специфичным маркерам клеточной поверхности,

- при необходимости афинную очистку клеточных типов Th1/Th2 с помощью антител к специфичным маркерам клеточной поверхности можно выполнять и в виде 1-ступенчатого способа без предварительного повышения концентрации лейкоцитов; в определенных ситуациях для количественного определения протеинов GATA-3 и Tbet достаточно и изоляции лейкоцитов с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла из цельной крови;

- при необходимости вместо центрифугирования в градиенте плотности фиколла возможно также применение основанной на изучении цепочек гранул афинной очистки клеточных типов Th1/Th2 с использованием антитела к специфичным маркерам клеточной поверхности в планшете с глубокими лунками на 96 лунок;

- при необходимости вместо центрифугирования в градиенте плотности фиколла возможно также применение основанной на изучении цепочек гранул афинной очистки лейкоцитов с помощью антител к специфичным маркерам клеточной поверхности, например, в планшете с глубокими лунками на 96 лунок;

- при необходимости для получения препарата лейкоцитов может выполняться гипоосмотический лизис эритроцитов; или

- при необходимости лизис протеинов может осуществляться и сразу из цельной крови.

Лизис клеток и выделение внутриклеточных / ядерных протеинов

Для этого применяются разные способы и принципы, в частности, в рамках настоящего изобретения выполняются следующие технологические этапы:

- разрушение клеточных мембран лизирующим буфером на основе следующих принципов действия:

a) гипотонические лизирующие буферы, под действием которых клетки лопаются;

b) детергеносодержащие буферы, разрушающие клеточную мембрану и таким образом высвобождающие внутриклеточные протеины

c) буферы с высокой ионной силой и/или осмотически активные буферы, обезвоживающие клетки и за счет этого нарушающие клеточную целостность.

- физические способы, например, нагрев, шоковая заморозка или ультразвук

- механические способы, например, гомогенизация или растирание в ступке.

К возможным примерам детергеносодержащих буферов относятся:

- буферные системы с высокой концентрацией ионных (например, SDS или Cholat и их производные) или неионных (например, Triton или Tween-20) детергентов

- смеси из ионных и неионных детергентов (например, Ripa-буфер с 50 мМ Tris ⋅ HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолата натрия и 0,1% додецилсульфата натрия SDS)

- доступные в продаже лизирующие буферы неизвестного состава (например, М- PER)

Влияние разных детергентов на выделение GATA-3 стимулированных клеток Jurkat представлено на фиг. 1. При этом лизис клеток Jurkat (линия Т-клеток человека) посредством разных лизирующих буферов и количественного определения GATA-3 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) обнаружил особенно обильное выделение протеина GATA-3 при использовании буфера RIPA (1% RIPA). Удалось выявить примерно 50 нг/мл GATA-3.

Количественное определение концентрации GATA-3 и Tbet

Концентрация обоих транскрипционных факторов GATA-3 и Tbet может определяться принципиально разными способами. В рамках настоящего изобретения к ним, в частности, относятся:

- твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) твердофазный иммуноферментный анализ с хемилюминесценцией (CLIA)

- твердофазный иммуноанализ с флуоресцентным усилением (FLIA)

- масс-спектрометрические способы

- хроматографические способы (например, хроматография в газовой фазе)

- жидкостные способы с отделением твердой фазы (например, высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭЖХ)

- микро- и нанофлюидные технологии

На фиг. 2а и фиг. 2b приводятся результаты количественного определения Tbet и GATA-3 посредством «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа с использованием хромогенного субстрата (ELISA). Клетки получали центрифугированием в градиенте плотности фиколла из цельной крови. Клетки (стимулированные мононуклеарные клетки человека) лизировали Ripa-буфером. Лизат исследовали на предмет концентрации GATA-3 и Tbet с помощью двух методов-прототипов твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Концентрация обоих протеинов изображена относительно общей концентрации протеина в клеточных лизатах (нормирование на содержание протеина).

Результаты по фиг. 2а говорят о том, что Тh1-клетки демонстрируют более высокое содержание Tbet (ок. 160 нг/мл анализируемого вещества / мг протеина) по сравнению Тh2-клетками (ок. 56 нг/мл анализируемого вещества / мг протеина), и что это обстоятельство явно следует из результатов анализа ИФА (твердофазного иммуноферментного анализа):

Согласно фиг. 2b содержание GATA-3 в Тh2-клетках (приблизительно 10 нг/мл анализируемого вещества / мг протеина) выше по сравнению с содержанием в Th1-клетках (приблизительно 6 нг/мл анализируемого вещества / мг протеина). Таким образом, содержание GATA-3- в Тh2-клетках здесь выше более чем в 1,5 раза, а точнее, примерно в 1,7 раза, чем в Th1-клетках.

Кроме того, из фиг. 2а и 2b можно понять, что при нормировании по содержанию протеина количественное соотношение Tbet: GATA-3 в Th1-клетках существенно отличается от соответствующего отношения в Th2-клетках. Так, количественное соотношение Tbet: GATA-3 здесь в Th1-клетках составляет примерно 27, т.е. больше 20, в то время как соответствующее количественное соотношение в Тh2-клетках равно примерно 6, т.е. менее 10.

Количественное определение GATA-3 и Tbet в каждом случае производится с помощью «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Пример варианта осуществления изобретения 2 - GATA-3 твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA):

Для этого лунки микротитрационного планшета на 96 лунок покрыты специфическими к GATA-3 антителами. После добавления пробы и/или эталона GATA-3 образует связь с антителами на 96-луночном планшете. После промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют второе, специфическое биотинилированное антитело к GATA-3. После еще одной промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют маркированный пероксидазой стрептавидин. После промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют субстрат. Цветное проявление заканчивается по истечении заданного промежутка времени путем добавления стоп-реагента. Выполняют количественное определение интенсивности цветного проявления с помощью фотометрического считывающего устройства для микропланшетов (ридера). Количественное определение образцов выполняют путем сравнения с имеющимися эталонами с известной концентрацией протеина. На фиг. 3 представлена соответствующая градуировочная кривая твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) GATA-3.

В соответствии с примером варианта осуществления изобретения для проведения твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) GATA-3 выполняют, в частности, следующие этапы:

- размещение требуемого количества лунок в рамке 96-луночного планшета

- добавление буферного раствора для исследования в количестве 50 мкл/лунку

- добавление 100 мкл/лунку эталона / контроля / образца инкубация в течение 60 минут в шейкере

- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером каждый раз в количестве 400 мкл/лунку

- добавление биотинилированного анти-GATA-3 антитела в объеме 100 мкл/лунку

- инкубация в течение 60 минут в шейкере

- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером в количестве 400 мкл/лунку

- добавление маркированного пероксидазой стрептавидина в количестве 100 млк/лунку

- инкубация в течение 30 минут в шейкере

- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером в количестве 400 мкл/лунку

- добавление субстрата в количестве 100 млк/лунку инкубация в течение 30 минут

- прекращение реакции добавлением 100 мкл стоп-реагента количественное определение оптической плотности при 450 нм с помощью фотометрического считывающего устройства для микропланшетов (ридера)

Пример варианта осуществления изобретения 3 - твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) Tbet:

Выявление протеина Tbet выполняется в соответствии со следующим принципом исследования: количественное определение Tbet осуществляют с помощью «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Для этого в лунки микротитрационного планшета на 96 лунок наносят слой антител, специфических к Tbet. После добавления образца и/или эталона Tbet образует связь с антителами на 96-луночном планшете. После промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют второе антитело, специфическое к Tbet. После еще одной промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют маркированное пероксидазой антитело, специфичное к Tbet-специфичному антителу. После последней промывки для удаления несвязанных субстанций добавляют субстрат. Цветное проявление заканчивается по истечении заданного промежутка времени путем добавления стоп-реагента. Количественное определение интенсивности цветного проявления выполняют с помощью фотометрического считывающего устройства для микропланшетов (ридера). Количественное определение образцов производят путем сравнения с имеющимися эталонами с известной концентрацией протеина. На фигуре 4 изображена соответствующая градуировочная кривая твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) Tbet.

В соответствии с примером варианта осуществления изобретения для проведения твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) Tbet используют, в частности, следующие этапы:

- размещение требуемого количества лунок в рамке 96-луночного планшета

- добавление буферного раствора для исследования в количестве 50 мкл/лунку

- добавление 100 мкл/лунку эталона / контроля / образца

- инкубация в течение 60 минут в шейкере

- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером каждый раз в количестве 400 мкл/лунку

- добавление анти-Tbet антитела в объеме 100 мкл/лунку

- инкубация в течение 60 минут в шейкере

- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером в количестве 400 мкл/лунку

- добавление маркированного пероксидазой анти-Tbet-специфического антитела в объеме 100 млк/лунку

- инкубация в течение 30 минут в шейкере

- 4-кратная промывка всех лунок промывочным буфером в количестве 400 мкл/лунку

- добавление субстрата в количестве 100 млк/лунку

- инкубация в течение 30 минут

- прекращение реакции добавлением 100 мкл стоп-реагента

- количественное определение оптической плотности при 450 нм с

помощью фотометрического считывающего устройства для микропланшетов (ридера)

Нормирование концентраций GATA-3 и Tbet

Чтобы учесть различия в подготовке образцов, можно выполнить нормирование концентраций GATA-3 и Tbet. Различия в подготовке образцов могут возникнуть, например, по следующим причинам:

- разное число клеток, подвергаемое лизису

- разная эффективность лизиса у отдельных образцов, или

- разное содержание различных клеточных типов клеточных препаратов.

Согласно изобретению, помимо прочего, существуют следующие возможности нормирования:

- нормирование по общему содержанию протеина в клеточном лизате (см. пункт «Количественное определение концентрации GATA-3 и Tbet»)

- нормирование по числу клеток, которое было лизировано (см. фиг. 5), или

- нормирование по концентрации специфических маркерных протеинов, обнаруживаемых конкретно у определенных клеточных типов.

На фиг. 5. представлено нормированное определение Tbet в лизатах мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС). При этом лизису подвергали мононуклеарные клетки периферической крови здоровых обследуемых, а также пациентов, страдающих аллергическими заболеваниями, например, аллергической бронхиальной астмой, риноконьюктивитом, аллергическим синуситом, атопическим дерматитом, пищевыми аллергиями. Концентрацию Tbet нормировали по числу клеток в лизатах. Заболевание зависит от Тh2-клеток, и логично, что у аллергиков удалось выявить меньшую концентрацию Tbet (ок. 12 нг/мл/1 млн. клеток) по сравнению со здоровыми обследуемыми (ок. 27 нг/мл/1 млн. клеток). Таким образом, концентрация Tbet у аллергика была чуть более чем в 2 раза ниже по сравнению со здоровыми обследуемыми. Следовательно, здесь можно легко отнести пациентов к «Th1-низкому» молекулярному фенотипу, т.к. экспрессия генов Tbet в биологическом изоляте ниже заданного контрольного значения, здесь - экспрессии генов Tbet здоровых обследуемых.

Пример варианта осуществления изобретения 4

В модификации примеров 2 и 3 в соответствии с примером 4 для подготовки образцов клетки Th1/Th2 обогащаются с помощью магнитных гранул-микроносителей, которые покрыты клетко-специфичными антителами.

Затем производится выявление GATA-3 согласно порядку, описанному в примере 2.

Пример варианта осуществления изобретения 5

В модификации примеров 2 и 3 в соответствии с примером 5 для подготовки образцов лейкоциты обогащаются посредством гель-фильтрации. Затем производят выявление GATA-3 в порядке, описанном в примере 2.

Пример варианта осуществления изобретения 6

Специфичный к GATA-3 ДНК-фермент демонстрирует терапевтические эффекты на мышиной модели овальбумин-индуцированного аллергического воспаления дыхательных путей «Тh2-высокого» фенотипа.

Чтобы наилучшим образом воспроизвести клинический «Тh2-высокий» фенотип в мышиной модели, мышей линии BALB/c сенсибилизировали модельным аллергеном овальбумином (OVA) в присутствии адъюванта Аl(ОН)₃ на 0-е, 14-е и 21-е сутки путем внутрибрюшинной инъекции. На 24-26-е сутки мыши вдыхали овальбумин в форме 1%-ного аэрозоля, чтобы вызвать аллергическую воспалительную реакцию в легком с Тh2-доминированием. На 23-26-е сутки делали внутриносовые аппликации специфичного к GATA-3 ДНК-фермента hgd40 (SEQ ID NO 40), растворенного в фосфатно-солевом буферном растворе.

При этом линия мышей Balb/c отличается тем, что предпочтительно генерирует мощные Th2-отклики. Этот эффект усиливается за счет применения АL(ОН)₃ в качестве адъюванта, ощутимо поддерживающего формирование иммунных ответов с доминированием Th2. Описанная мышиная модель соответствующим образом характеризуется массивной инфильтрацией эозинофильных и Тh2-клеток в дыхательных путях, сопровождаемой гиперплазией слизеобразующих бокаловидных клеток с усиленной выработкой слизи, а также формированием гиперреактивности дыхательных путей. С иммунологической точки зрения, наряду со специфичными к аллергену Th2-клетками, характеризуемыми также вырабатыванием типичных цитокинов IL-4, IL-5 и IL-13, можно также устанавливать специфичные к овальбумину антитела иммуноглобулиновых классов IgE и lgG1 (у мыши оба Тh2-зависимые). Все эти параметры являются типичными клиническими признаками «Тh2-высокого» фенотипа (Wenzel et al., Am J Respir Crit Care Med. 1999 Sep; 160(3):1001-8; Woodruff et al., 2009). При этом сила реакции по некоторым параметрам в экспериментальной модели на животном проявляется еще даже более выраженно, чем в клинической ситуации у больного; так, например, эозинофильные гранулоциты составляют примерно 60-70% всех лейкоцитов в бронхоальвеолярном смыве (BAL) в мышиной модели, в то время как уже 3-5% этих клеток в мокроте пациента указывают на фенотип с доминированием Тh2.

В соответствии с фиг. 6 после четырехдневного лечения специфичным к GATA-3 ДНК-ферментом hgd40 (SEQ ID NO 40) удалось установить значительное улучшение состояния при аллергическом воспалении дыхательных путей по сравнению с мышами, не подвергавшимися терапии. Прежде всего, сократилось количество эозинофилов в бронхоальвеолярном смыве (BAL). Кроме того, удалось заметно снизить концентрации характерных для «Тh2-высокого» фенотипа цитокинов IL-5 и IL-13 в BAL.

Пример варианта осуществления изобретения 7

Специфичный к GATA-3 ДНК-фермент обнаруживает значимые терапевтические эффекты в мышиной модели хронического аллергического воспаления дыхательных путей с Тh2-доминированием.

Для воспроизведения наилучшим образом клинического «Тh2-высокого» фенотипа в мышиной модели хронического заболевания мышей линии BALB/c сенсибилизировали овальбумином (OVA) в присутствии адъюванта Аl(ОН)₃ на 0-е, 14-е и 21-е сутки путем внутрибрюшинной инъекции. Путем проводимых дважды в неделю провокационных тестов овальбумином в форме аэрозоля в течение 14 недель у мышей вызывали хроническое воспаление дыхательных путей. В течение последних восьми недель терапию проводили трижды в неделю путем внутриносовых аппликаций будесонидом или специфичным к GATA-3 ДНК-ферментом hdg40 (до 121-х суток).

В соответствии с фиг. 7 и 8 после восьминедельного лечения специфичным к GATA-3 ДНК-ферментом hgd40 (SEQ ID NO 40) удалось значительно сократить количество эозинофилов в BAL и к тому же констатировать уменьшение количества возникающих при хроническом воспалении нейтрофилов. Одновременно с этим в тканях легких было установлено снижение перибронхиального / периваскулярного воспаления и сокращение гиперплазии бокаловидных клеток. Одновременно в активированных с помощью стимулятора лимфоцитах у лиц, лечение которых осуществляли с применением hgd40, наблюдалось пониженное выделение IL-5. В группе, в которой применялся будесонид, напротив, не было установлено никакого значительного улучшения параметров.

Изобретение не ограничено предусмотренными здесь вариантами осуществления и может быть реализовано в разнообразных модификациях.

Все следующие из формулы, описания и фигур чертежей признаки и преимущества, включая конструктивные детали, конфигурации в пространстве и этапы осуществления способов, могут быть существенными для изобретения как сами по себе, так и в разных комбинациях.

Реферат

Предложенная группа изобретений относится к области медицины. Предложены способ и набор для диагностики молекулярного фенотипа больных, страдающих заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, с отнесением их к подгруппам «Th2-высокая», «Th2-низкая», «Th1-высокая» или «Th1-низкая». Предложен лекарственный препарат для лечения таких пациентов, содержащий специфичный к GATA-3 или Tbet ДНК-фермент. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективные методы определения молекулярного фенотипа больного, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями, и лекарственные средства, обладающие эффективностью для выявленной подгруппы больных. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 7 пр.

Формула