Мультидоменная везикула, содержащая иммуностимулирующий материал, способ её производства и содержащая её иммуномодулирующая композиция - RU2736639C1

Код документа: RU2736639C1

Чертежи

Показать все 52 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к мультидоменной везикуле, содержащей иммуностимулирующий материал, к способу получения мультидоменной везикулы и к иммуномодулирующей композиции, содержащей мультидоменную везикулу.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время используются липосомальные материалы, инкапсулирующие различные лекарства. Однако в методике, использующей такой единственный липосомальный материал, низкая эффективность загрузки и нестабильность in vivo указываются в качестве основных недостатков.

Недавно, чтобы активировать иммунные клетки, различные липосомы и эмульсионные материалы, загруженные иммуностимулирующими материалами (например, ASO1, ASO2 и AS15 от GSK и MF59 от Novartis AG), были использованы в качестве иммуностимулирующих материалов для профилактики или лечения различных инфекционных и онкологических заболеваний. Отдельные материалы на основе липосом представляют собой вакцинные композиции для профилактики инфекционных заболеваний, и в настоящее время они находятся на стадии клинических испытаний, но из-за малой продолжительности действия антигенов и иммуностимулирующих материалов был отмечен недостаток, заключающийся в том, что такой материал необходимо вводить дополнительно, два-три раза через равные промежутки времени.

Чтобы преодолеть недостатки, группа Darrell Irvine в MIT недавно разработала иммуностимулирующую противораковую вакцину с мультиламеллярной липосомной структурой (Nature Materials, 10, 243-251, 2011). Вакцина против рака была попыткой решить проблемы низкой эффективности и стабильности инкапсуляции, которые были фундаментальными недостатками одинарного липосомального материала, путем загрузки антигена и иммуностимулирующих материалов внутри липосомы с многослойной структурой, а затем использования ионов многовалентных металлов или химического линкера в каждом липидном слое для создания химической сшивающей структуры.

Однако, поскольку форма липосомы с мультиламеллярной структурой является очень неоднородной, и процесс получения мультиламеллярной структуры с определенной структурой является произвольным, в процессе общего производства имеются недостатки, заключающиеся в том, что вакцинная композиция, имеющая однородные характеристики, не может быть получена, и поскольку используются химические сшивающие связи, существует ограничение в том, что может возникнуть токсичность для человеческого организма.

Кроме того, в аналогичной форме, носитель лекарственного средства, называемый мультивезикулярной липосомой, из области техники, к которой относится данное изобретение, был раскрыт исследовательской группой Kim Shin-Il в Калифорнийском университете [Biochimica Biophysica Acta 1983 Mar. 9 728 (3) 339-348], исследовательской группой Mantripragada в 2002 [Progress of Lipids Research 41 (2002) 392-406], исследовательской группой Wafa в 2007 [International Journal of Pharmaceutics 331 (2007) 182-185] и т.п. Мультивезикулярная липосома состоит из смеси материалов, выбранных из группы, состоящей из нейтральных липидов, холестерина и триолеина.

В мультивезикулярной липосоме предшествующего уровня техники принцип, согласно которому микровезикулы поддерживают кластер микровезикул, состоит в том, что триолеиновый материал между липидными мембранами отдельных липосом фиксирует двойную мембрану так, что она не разрушается и не рассеивается даже при быстром изменении кривизны липидной мембраны, с которой он контактирует. Эти мультивезикулярные липосомы в настоящее время разрабатываются в качестве лекарственного средства, содержащего бупивакаин, который является средством от боли, и коммерчески доступны под торговым названием EXPAREL®.

Однако полученные таким образом мультивезикулярные липосомы имеют очень низкую эффективность стабилизации структуры, так что существует проблема в том, что в процессе приготовления (например, при центрифугировании, изменении температуры и тому подобном) микрокластеры распадаются, что приводит к неоднородному размеру или форме. Кроме того, установлено, что до настоящего времени не было найдено никакой мультивезикулярной липосомальной формы, в которую вводили бы иммуностимулирующее лекарственное средство. Между тем, важно разработать методику, позволяющую регулировать иммуносупрессию in vivo, для регуляции иммунной функции наряду с методикой иммуностимуляции. В частности, чтобы решить проблему низкой терапевтической эффективности и побочных эффектов противораковой иммунотерапии, крайне необходимо разработать методику, позволяющую преодолеть феномен иммуносупрессии в микроокружении рака.

Методы противораковой иммунотерапии для лечения рака с использованием иммунной системы in vivo имеют то преимущество, что побочные эффекты могут быть минимизированы по сравнению с существующими методами химиотерапии или лучевой терапии. Среди этих методов противораковой иммунотерапии проводилось активное изучение метода клеточного терапевтического агента, который активирует терапевтические иммунные клетки, такие как Т-клетки (включая CAR-T), дендритные клетки и клетки – натуральные киллеры in vitro, с последующим непосредственным введением терапевтических иммунных клеток в организм, метода противораковой вакцины для повышения противораковой эффективности путем введения в организм ракового антигена и иммуностимулирующих материалов для прямой активации иммунных клеток, присутствующих в организме, и тому подобного. Однако эти клеточные терапевтические агенты или противораковые вакцины обычно используются при заболеваниях, связанных с гемобластозами, и имеют недостаток в том, что большинство клеточных терапевтических агентов или противораковых вакцин имеют очень низкую терапевтическую эффективность против солидных раковых заболеваний.

Одна из этих причин связана с факторами микроокружения, которые подавляют иммунную функцию при солидном раке. Фактически, клетки (стромальные клетки миелоидного происхождения (MDSC), регуляторные T-клетки (Treg) и опухоль-ассоциированные макрофаги (TAM)), снижающие функцию иммунных клеток, или цитокины, вызывающие иммуносупрессию, метаболиты и тому подобное, активно действуют в микроокружении опухоли, тем самым быстро снижая активность иммуностимулирующих материалов и терапевтических иммунных клеток. Соответственно, существует настоятельная потребность в разработке новой методики терапевтической платформы, способной контролировать иммуносупрессивный фактор в микроокружении солидного рака, чтобы повысить терапевтическую эффективность против солидного рака.

В последнее время во всем мире активно проводятся исследования по разработке лекарственного средства, способного контролировать различные иммуносупрессивные факторы в микроокружении опухоли. Однако эти лекарственные средства легко разлагаются различными физиологическими средами и ферментами in vivo при введении в организм или доставке в ткани, отличные от опухолевого участка, и таким образом, имеют недостаток в том, что вызывают различные нежелательные побочные эффекты.

Чтобы преодолеть недостатки, в реальной клинической области были предприняты попытки усилить иммунотерапевтический эффект путем многократного введения лекарственного средства в высокой дозе, но различные токсические эффекты и побочные эффекты лекарственного средства привели к снижению терапевтических эффектов.

Следовательно, существует настоятельная потребность в разработке противоракового иммунотерапевтического агента, способного эффективно воздействовать на иммуносупрессивный фактор и минимизировать побочные эффекты, вызванные лекарственными средствами, путем высвобождения лекарственного средства, способного контролировать иммуносупрессивные факторы окружающей среды, которые ингибируют терапевтическую функцию иммунотерапевтического агента вокруг солидного рака, путем замедленного высвобождения в микроокружении солидного рака, и в методике улучшения терапевтического эффекта противораковой терапии с его использованием.

Описание изобретения

Техническая проблема, решаемая изобретением

Настоящее изобретение обеспечивает мультидоменную везикулу, содержащую иммуностимулирующий материал, способ получения мультидоменной везикулы и иммуномодулирующую композицию, содержащую мультидоменную везикулу.

Однако технические проблемы, которые должны быть решены с помощью настоящей заявки, не ограничиваются вышеупомянутыми проблемами, и другие проблемы, которые не упомянуты, могут быть очевидны для специалистов в данной области техники из следующего описания.

Техническое решение

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения обеспечивается мультидоменная везикула, содержащая: по меньшей мере две липосомы, контактирующие и соединенные друг с другом, и внешнюю стенку мультидоменной везикулы, окружающую по меньшей мере две липосомы. Мультидоменная везикула образована из масляной фазы и водной фазы, где: масляная фаза содержит первый иммуномодулирующий материал и жидкое масло; масляная фаза образует мембрану липосом и наружную стенку мультидоменной везикулы; водная фаза содержит второй иммуномодулирующий материал; водная фаза представляет собой внутреннюю водную фазу мембраны липосом и внешнюю водную фазу мембраны липосом; первый иммуномодулирующий материал представляет собой жирорастворимый иммуностимулирующий материал; второй иммуномодулирующий материал представляет собой водорастворимый иммуностимулирующий материал; и жидкое масло улучшает структурную стабильность по меньшей мере двух липосом, вступающих в контакт и связанных друг с другом.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечивается иммуномодулирующий материал, содержащий мультидоменную везикулу и антиген.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ получения мультидоменной везикулы, включающий этапы: получения раствора масляной фазы путем растворения первого иммуномодулирующего материала и жидкого масла в растворителе; получения эмульсии вода-в-масле (В/М) путем диспергирования первой водной фазы, содержащей второй иммуномодулирующий материал, в растворе масляной фазы; и смешивания эмульсии вода-в-масле со вторым водным раствором и выпаривания растворителя, где первый иммуномодулирующий материал представляет собой жирорастворимый иммуностимулирующий материал, а второй иммуномодулирующий материал представляет собой водорастворимый иммуностимулирующий материал.

Эффекты, достигаемые изобретением

Настоящее изобретение обеспечивает иммуномодулирующую мультидоменную везикулу, имеющую морфологию микроразмерных капсул, в которой множество липосом, включающих иммуномодулирующий материал в качестве основного компонента, связаны друг с другом, образуя соответствующие домены, а структурная стабильность множества липосом, связанных введенным жидким масляным компонентом, улучшена.

Кроме того, иммуномодулирующая композиция в соответствии с настоящим изобретением преодолевает недостатки низкой эффективности инкапсуляции и короткой эффективной продолжительности действия одинарного липосомального материала, используемого в качестве различных фармацевтических композиций, и имеет преимущество в том, что эффективная продолжительность действия иммуномодулирующего эффекта может быть увеличена.

Кроме того, способ получения мультидоменной везикулы в соответствии с настоящим изобретением имеет преимущества в том, что устойчивость и стабильность при хранении в процессе производства мультидоменной везикулы можно улучшить путем введения жидкого масла, такого как сквален, вместо триолеина, который вводили для того, чтобы поддерживать структурную стабильность мультилипосомы в предшествующем уровне техники; введение жидкого масла позволяет легко растворить типичные слаборастворимые иммуномодулирующие материалы, нерастворимые в общем органическом растворителе, и соответственно, можно получить мультидоменную везикулу, содержащую различные слаборастворимые иммуномодулирующие материалы.

Кроме того, мультидоменная везикула в соответствии с настоящим изобретением позволяет повысить эффективность инкапсуляции и эффективную продолжительность действия антигенов и иммуномодулирующих материалов с противоположными характеристиками заряда путем модуляции поверхностного заряда мультидоменной везикулы; и различные анионные или отрицательно заряженные иммуномодулирующие материалы и биоматериалы, такие как ДНК и РНК, могут быть эффективно загружены в мультидоменную везикулу путем включения катионного липида, образующего мультидоменную везикулу.

Кроме того, поскольку антигены и/или иммуномодулирующие материалы, загруженные на наружную стенку и внутри мультидоменной везикулы, высвобождаются, в то время как распад медленно происходит от внешней стенки мультидоменной везикулы к внутренней мембране, преимущество заключается в том, что эффективная продолжительность действия антигенов и иммуномодулирующих материалов может быть увеличена.

Между тем, мультидоменная везикула в соответствии с настоящим изобретением позволяет увеличить эффективную продолжительность действия иммуномодулирующего материала путем загрузки различных иммуномодулирующих материалов, имеющих липофильные свойства, на мембрану липосомы и/или наружную стенку мультидоменной везикулы; увеличить эффективную продолжительность действия иммуномодулирующего материала путем загрузки различных иммуномодулирующих материалов, имеющих гидрофильные свойства, внутри липосом, и позволяет увеличить эффективную продолжительность действия иммуномодулирующего материала путем одновременной загрузки различных иммуномодулирующих материалов, имеющих гидрофильные свойства, внутри липосом, и липофильного иммуномодулирующего материала на мембрану липосом и/или наружную стенку везикулы.

Кроме того, мультидоменная везикула в соответствии с настоящим изобретением позволяет покрывать поверхностно активное веществоом наружную часть мультидоменной везикулы, тем самым стабильно диспергируя мультидоменную капсулу в водном растворе.

Описание чертежей

Фиг.1 представляет собой схематическое изображение, иллюстрирующее структуру мультидоменной везикулы, модулирующей иммунную функцию (imMDV), в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.2(A)-(D) представляют полученное оптическим микроскопом изображение (А) и график (C), иллюстрирующий распределение по размеру мультидоменной везикулы, содержащей сквален, и полученное оптическим микроскопом изображение (В) и график (D), иллюстрирующий распределение по размеру мультидоменной везикулы, не содержащей сквален, в варианте осуществления настоящего изобретения (масштабная шкала: 20 мкм).

Фиг.3(A)-(C) представляют полученные оптическим микроскопом изображения мультидоменной везикулы, содержащей сквален, в варианте осуществления настоящего изобретения, а фиг. 3(D)-(F) представляют собой полученные оптическим микроскопом изображения мультидоменной везикулы, не содержащей сквален, в варианте осуществления настоящего изобретения (масштабная шкала: 4 мкм).

Фиг.4(A)-(D) представляют результаты анализа стабильности мультидоменной везикулы в варианте осуществления настоящего изобретения, микроскопические изображения мультидоменной везикулы, содержащей сквален, перед центрифугированием (A) и после центрифугирования (C), и микроскопические изображения мультидоменной везикулы, не содержащей сквален, до центрифугирования (B) и после центрифугирования (D).

Фиг.5 представляет полученное оптическим микроскопом изображение мультидоменной везикулы, содержащей MPLA (монофосфорил-липид А) на основе сквалена (imMDV(MPLA)), в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.6 иллюстрирует уровни экспрессии цитокинов, секретируемых, когда BMDC обрабатывали imMDV(SQ) в варианте осуществления настоящего изобретения (a: TNF-альфа и b: IL-6).

Фиг.7 иллюстрирует уровни экспрессии цитокинов, секретируемых, когда BMDC обрабатывали imMDV(MPLA) в варианте осуществления настоящего изобретения (a: TNF-альфа, b: IL-6 и c: IL-12p70).

Фиг.8 представляет собой график, иллюстрирующий характер высвобождения овальбумина (OVA) в зависимости от того, содержится ли сквален в мультидоменной везикуле, загруженной белковым антигеном (OVA), в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.9 иллюстрирует иммуномодулирующую мультидоменную везикулу, которая загружена имиквимодом (кислыми и основными структурами), который является иммуностимулирующим материалом в варианте осуществления настоящего изобретения (a: образец imMDV(R837-HCl), b: образец imMDV(R837-основание) и c: образец imMDV [R837-HCl:R837-основание (1:1)].

Фиг.10 иллюстрирует характер высвобождения R837 с течением времени в мультидоменной везикуле (imMDV(R837-HCl)) для модуляции иммунитета, при загрузке имиквимодом в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.11 иллюстрирует уровни экспрессии цитокина IL-6, секретируемого, когда BMDC обрабатывали мультидоменной везикулой (imMDV(R837-HCl)), загруженной имиквимодом в различных концентрациях, в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.12А представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 1 неделю после инъекции) против ракового антигена овальбумина (OVA) в отношении мультидоменной везикулы, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (образец imMDV(R837-HCl)/ 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV образец).

Фиг.12B представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 1 неделю после инъекции) против ракового антигена овальбумина (OVA) в отношении мультидоменной везикулы, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV(R837-основание) образец/ 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV образец).

Фиг.12C представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 1 неделю после инъекции) против ракового антигена овальбумина (OVA) по отношению к мультидоменной везикуле, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV[R837-HCl:R837-основание (1:1)/ 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV образец).

Фиг.13А представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 3 недели после инъекции) против ракового антигена овальбумина (OVA) в отношении мультидоменной везикулы, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV (R837-HCl) образец/ 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV образец).

Фиг.13B представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 3 недели после инъекции) против ракового антигена овальбумина (OVA) в отношении мультидоменной везикулы, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV(R837)-основание) образец/ 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV образец).

Фиг.13C представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 3 недели после инъекции) против ракового антигена овальбумина (OVA) по отношению к мультидоменной везикуле, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV [R837-HCl: R837-основание) (1:1) образец/ 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV образец).

Фиг.14А представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 5 недель после инъекции) против ракового антигена OVA в отношении мультидоменной везикулы, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV(R837-HCl) образец, 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV).

Фиг.14B представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 5 недель после инъекции) против ракового антигена OVA в отношении мультидоменной везикулы, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV(R837-основание) образец, 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV).

Фиг.14C представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 5 недель после инъекции) против ракового антигена OVA в отношении мультидоменной везикулы, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV[R837-HCl:R837-основание (1:1) образец, 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV).

Фиг.15А представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 1 неделю после бустерной иммунизации у мышей на 5-й неделе) против ракового антигена овальбумина (OVA) по отношению к мультидоменной везикуле, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV(R837-HCl) образец/ 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV образец).

Фиг.15B представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 1 неделю после бустерной иммунизации у мышей на 5-й неделе) против ракового антигена овальбумина (OVA) по отношению к мультидоменной везикуле, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV(R837-основание) образец/ 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV образец).

Фиг.15C представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG, через 1 неделю после бустерной иммунизации мышей на 5-й неделе) против ракового антигена овальбумина (OVA) в отношении мультидоменной везикулы, загруженной имиквимодом, в варианте осуществления настоящего изобретения (imMDV[R837-HCl: R837-основание (1:1) образец/ 1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: OVA + imMDV образец).

Фиг.16 представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG) против ракового антигена овальбумина (OVA) у мышей, которые были подвергнуты бустерной иммунизации, и мышей, которые не были подвергнуты бустерной иммунизации на 5 неделе после иммунизации образцом imMDV(R837-HCl) + OVA в варианте осуществления настоящего изобретения (1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: imMDV (R837-HCl) + OVA).

Фиг.17 является графиком, иллюстрирующим гуморальные иммунные эффекты (IgG) против ракового антигена овальбумина (OVA) у мышей, которые были подвергнуты бустерной иммунизации, и мышей, которые не были подвергнуты бустерной иммунизации на 5 неделе после иммунизации образцом imMDV(R837-основание) + OVA в варианте осуществления настоящего изобретения (1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: imMDV(R837-основание) + OVA).

Фиг.18 представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG) против ракового антигена овальбумина (OVA) у мышей, которые были подвергнуты бустерной иммунизации, и мышей, которые не получали бустерной иммунизации на 5 неделе после иммунизации образцом imMDV[R837-HCl: R837-основание (1:1) образец] + OVA в варианте осуществления настоящего изобретения (1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: imMDV [образец R837-HCl: R837-основание (1:1)].

Фиг.19 представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG) против ракового антигена овальбумина (OVA), которые устойчиво проявляются через 1, 2 и 6 недель после первичной и бустерной иммунизации на 5 неделе образцом imMDV(R837-HCl) + OVA в варианте осуществления настоящего изобретения (1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: imMDV (R837-HCl) + OVA образец).

Фиг.20 представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG) против ракового антигена овальбумина (OVA), которые устойчиво показаны через 1, 2 и 6 недель после первичной и бустерной иммунизации на 5 неделе образцом imMDV(R837-HCl) + OVA в варианте осуществления настоящего изобретения (1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: imMDV(R837-основание) + OVA образец).

Фиг.21 представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (IgG) против ракового антигена овальбумина (OVA), которые устойчиво проявляются через 1, 2 и 6 недель после первичной и бустерной иммунизации образцом imMDV[R837-HCl: R837-основание (1:1) образец] + OVA в варианте осуществления настоящего изобретения (1: PBS, 2: OVA, 3: OVA + R837-HCl и 4: imMDV [R837-HCl: R837-основание (1: 1) образец).

Фиг.22 представляет собой набор данных, сравнивающих гуморальные иммунные эффекты (IgG) против ракового антигена овальбумина (OVA), показанные на 1-4 неделе при иммунизации образцом imMDV(R837-HCl)+OVA с адъювантом в форме масла (DMSO)(R837) + OVA) в варианте осуществления настоящего изобретения (1: OVA, 2: imMDV (R837-HCl) + OVA, 3: DMSO (R837)+ OVA и 4: DMSO).

Фиг.23 представляет сравнение эффектов воспалительного ответа, показанных после иммунизации двумя вакцинами [imMDV(R837-HCl) + OVA и DMSO(R837) + OVA] у мышей в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.24 представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (через две недели после внутримышечной инъекции) иммуномодулирующих материалов против вирусного антигена гемагглютинина (HA) в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.25 представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты (через четыре недели после внутримышечной инъекции) иммуномодулирующих материалов против вирусного антигена гемагглютинина (HA) в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.26 представляет собой график, иллюстрирующий гуморальные иммунные эффекты иммуномодулирующих материалов против ракового антигена овальбумина (OVA) в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.27 представляет собой график, иллюстрирующий эффекты иммунной индукции клеток для иммуномодулирующих материалов против ракового антигена овальбумина (OVA) в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.28 демонстрирует полученные оптическим микроскопом изображения образцов мультидоменных везикул imMDV(SQ-Gem), imMDV(OA-Gem) и imMDV(Gem) в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.29 представляет собой график, подтверждающий, что загруженный гемцитабин медленно высвобождается в мультидоменной везикуле, содержащей сквален, тогда как большая часть загруженного лекарственного средства высвобождается в течение 24 часов в мультидоменной везикуле, не содержащей сквалена, в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.30 представляет собой график, подтверждающий, что при использовании вместо животного масла, такого как сквален, растительного масла с олеиновой кислотой, характер замедленного высвобождения загруженного гемцитабина проявляет форму плато в течение от 24 до 72 часов, а затем через 72 часа проявляет линейный характер, в варианте осуществления настоящего изобретения.

Фиг.31 является графиком, иллюстрирующим imMDV(паклитаксел) и характер высвобождения лекарственного средства из Примера 4-2 настоящего изобретения.

Фиг.32 иллюстрирует imMDV(доксорубицин) из Примера 4-2 настоящего изобретения.

Фиг.33 иллюстрирует imMDV(метотрексат) из Примера 4-2 настоящего изобретения.

Фиг.34 иллюстрирует imMDV(оксалиплатин) из Примера 4-2 настоящего изобретения.

Фиг.35 иллюстрирует imMDV(MK-2206) из Примера 4-3 настоящего изобретения.

Фиг.36 иллюстрирует imMDV(PF-04691502) из Примера 4-4 настоящего изобретения.

Фиг.37 иллюстрирует imMDV(азацитидин) из Примера 4-5 настоящего изобретения.

Фиг.38 является графиком, иллюстрирующим imMDV(ресмоностат) и характер высвобождения лекарственного средства из Примера 4-5 настоящего изобретения.

Фиг.39 представляет собой график, иллюстрирующий imMDV(панобиностат) и характер высвобождения лекарственного средства из Примера 4-5 настоящего изобретения.

Фиг.40 иллюстрирует imMDV(OTX015(iBET)) из Примера 4-5 настоящего изобретения.

Фиг.41 иллюстрирует imMDV(BLZ945) из Примера 4-6 настоящего изобретения.

Фиг.42 иллюстрирует imMDV(целекоксиб) из Примера 4-7 настоящего изобретения.

Фиг.43 иллюстрирует imMDV(GEM/R837) из Примера 5 настоящего изобретения.

Фиг.44 иллюстрирует imMDV(BLZ945/R837) из Примера 5 настоящего изобретения.

Способы в соответствии с изобретением

Далее примеры настоящего изобретения будут описаны подробно, так что специалисты в данной области техники, к которой относится настоящая заявка, могут легко выполнить настоящую заявку со ссылкой на прилагаемые чертежи. Однако настоящая заявка может быть реализована в различных формах и не ограничена вариантами осуществления, описанными в данном документе. Кроме того, чтобы четко объяснить настоящую заявку, части, которые не связаны с объяснением, опущены на чертежах, и подобные ссылочные позиции добавлены к аналогичным частям по всему описанию.

Во всем описании настоящей заявки, когда одна часть «соединена» с другой частью, это включает не только случай, когда они «напрямую связаны друг с другом», но также и случай, когда они «опосредованно связаны друг с другом» с другим элементом между ними.

Во всем описании настоящей заявки, когда один элемент расположен «на» другом элементе, это включает не только случай, когда один элемент приводится в контакт с другим элементом, но также и случай, когда между этими двумя элементами присутствует еще один элемент.

Во всем описании настоящей заявки, когда одна часть «включает» один составляющий элемент, если специально не описано иное, это не означает, что другой составляющий элемент исключен, но означает, что другой составляющий элемент может быть дополнительно включен. Во всем описании настоящей заявки термин степени, такой как «примерно» или «по существу», используется в соответствующем числовом значении или используется для обозначения значения, близкого к числовому значению, когда собственные производственные и материальные допустимые ошибки представлены в описанном значении, и используется для предотвращения незаконного использования недобросовестным нарушителем раскрытого содержания, включая числовое значение, показанное как точное или абсолютное, чтобы помочь пониманию настоящего изобретения. Во всем описании настоящей заявки такие термины, как «этап (осуществления или выполнения) ~» или «этап ~», не означают «этап для ~».

Во всем описании настоящей заявки термин «их комбинация (комбинации)», включенный в выражение типа Маркуша, означает смесь или комбинацию по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из составляющих элементов, описанных в выражении типа Маркуша, и означает включение по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из составляющих элементов.

Во всем описании настоящей заявки описание «A и/или B» означает «A или B, или A и B».

Далее варианты осуществления и примеры настоящего изобретения будут подробно описаны со ссылкой на прилагаемые чертежи. Однако настоящая заявка не может быть ограничена вариантами осуществления, примерами и чертежами.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения обеспечивается мультидоменная везикула, содержащая: по меньшей мере две липосомы, контактирующие и соединенные друг с другом, и внешнюю стенку мультидоменной везикулы, окружающую по меньшей мере две липосомы. Мультидоменная везикула образована из масляной фазы и водной фазы, где масляная фаза содержит первый иммуномодулирующий материал и жидкое масло; масляная фаза образует мембрану липосом и наружную стенку мультидоменной везикулы; водная фаза содержит второй иммуномодулирующий материал; водная фаза представляет собой внутреннюю водную фазу мембраны липосом и внешнюю водную фазу мембраны липосом; первый иммуномодулирующий материал представляет собой жирорастворимый иммуностимулирующий материал; второй иммуномодулирующий материал представляет собой водорастворимый иммуностимулирующий материал; и жидкое масло улучшает структурную стабильность по меньшей мере двух липосом, вступающих в контакт и связанных друг с другом.

Фиг.1 представляет поперечное сечение, иллюстрирующее структуру иммуномодулирующей мультидоменной везикулы (imMDV) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Как показано на фиг.1, мультидоменная везикула может включать наружную стенку мультидоменной везикулы, содержащую жирорастворимый иммуностимулирующий материал, и может иметь структуру капсулы размером примерно от 1 мкм до 100 мкм, которая содержит по меньшей мере две липосомы, образующих каждый домен внутри наружной стенки мультидоменной везикулы, окружающей по меньшей мере две липосомы.

Мультидоменная везикула, содержащая по меньшей мере две липосомы, может иметь усовершенствованную продолжительность действия материала активации иммунных клеток, эффективность активации иммунных клеток, эффективность инкапсуляции или физиологическую стабильность, по сравнению с одинарной липосомой и одинарной эмульсией в предшествующем уровне техники.

В варианте осуществления настоящего изобретения, как показано на фиг.1, внутренняя часть мембраны липосом относится к внутренней водной фазе, внешняя часть мембраны липосом относится к внешней водной фазе, а внутренняя водная фаза и внешняя водная фаза вместе означают «первую водную фазу». Внешняя водная фаза, которая находится снаружи мембраны липосом, относится к пространству между мембранами липосом и внешней стенкой мультидоменной везикулы. Кроме того, мультидоменная везикула может быть диспергирована в растворителе, и в этом случае дисперсионная фаза, в которой диспергирована мультидоменная везикула, то есть с внешней стороны мультидоменной везикулы, относится к «второй водной фазе».

В варианте осуществления настоящего изобретения мультидоменная везикула может иметь размер в диапазоне примерно от 1 мкм до 100 мкм, примерно от 1 мкм до 80 мкм, примерно от 1 мкм до 60 мкм, примерно от 1 мкм до 40 мкм, примерно от 1 до 20 мкм, примерно от 1 до 10 мкм, примерно от 10 до 100 мкм, примерно от 10 до 80 мкм, примерно от 10 до 60 мкм, примерно от 10 до 40 мкм, примерно от 10 до 20 мкм, примерно от 20 до 100 мкм, примерно от 20 до 80 мкм, примерно от 20 до 60 мкм, примерно от 20 до 40 мкм, примерно от 40 до 100 мкм, примерно от 40 до 80 мкм, примерно от 40 до 60 мкм, примерно от 60 до 100 мкм, примерно от 60 до 80 мкм, или примерно от 80 до 100 мкм.

В варианте осуществления настоящего изобретения мультидоменная везикула позволяет антигену и/или иммуномодулирующему материалу, загруженному в везикулу, иметь увеличенное время высвобождения по сравнению с одинарной липосомой или одинарной эмульсией, потому что распад медленно происходит от наружной стенки, составляющей внешнюю сторону везикулы, до внутренней мембраны, содержащей по меньшей мере две липосомы, и в результате можно модулировать функцию иммунных клеток in vivo в течение длительного периода времени.

В варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере две липосомы могут включать липосомы, внешние оболочки которых находятся в контакте друг с другом. Например, липосомы мультидоменной везикулы могут иметь улучшенную структурную стабильность и эффекты длительного высвобождения из мультидоменной везикулы, поскольку осуществляется межфазный контакт между внешними оболочками, и соответственно, липосомы не так быстро разрушаются, по сравнению с несколькими липосомами, где внешние оболочки отделены друг от друга.

В варианте осуществления настоящего изобретения жидкое масло может служить в качестве клея между доменами, состоящими из каждой липосомы, тем самым улучшая стабильность мультидоменной везикулы. Например, мультидоменная везикула может иметь улучшенную стабильность путем введения жидкого масла на внешнюю стенку доменной везикулы и обеспечения контакта внешних стенок липосом друг с другом, и соответственно, могут быть усилены эффекты замедленного высвобождения и структурная стабильность.

В варианте осуществления настоящего изобретения жирорастворимый иммуностимулирующий материал может быть легко загружен в мультидоменную везикулу в жидком масле. Например, имиквимод (R837) и тому подобное, являющиеся слаборастворимыми материалами, которые трудно растворить в общем органическом растворителе, легко растворяются жидким маслом, так что слаборастворимый материал может быть загружен в пространство между липосомами вместе с жидким маслом в мультидоменной везикуле.

В варианте осуществления настоящего изобретения жидкое масло может служить в качестве адъюванта, который способствует активации иммунных клеток, и может быть выбрано из группы, состоящей, например, из животного масла, растительного масла, токоферола, минерального масла, касторового масла и их комбинаций.

В варианте осуществления настоящего изобретения животное масло может включать рыбий жир.

В варианте осуществления настоящего изобретения рыбий жир может быть использован без ограничений, с тем условием, что он является метаболизируемым маслом, и может включать, например, масло печени трески, масло печени акулы, китовый жир или тому подобное. Масло печени акулы содержит сквален, молекулу, известную как 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, и ненасыщенный терпен, и может также включать насыщенный аналог сквалан. Рыбий жир, включая сквален или сквалан, легко доступен из коммерческих источников или может быть получен способами, известными в данной области техники.

В варианте осуществления настоящего изобретения масло животного происхождения может включать сало, смоляное (талловое) масло, говяжий жир и тому подобное.

В варианте осуществления настоящего изобретения растительное масло может представлять собой масло, полученное из орехов, семян, зерен или тому подобного, и может включать, например, арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло, оливковое масло или тому подобное.

В варианте осуществления настоящего изобретения токоферол может представлять собой токоферол-содержащий витамин Е. Хотя существуют различные токоферолы (α, β, γ, δ, ε или ξ), обычно можно использовать α-токоферол и, например, можно использовать DL-α-токоферол.

В варианте осуществления настоящего изобретения, путем введения жидкого масла в мультидоменную везикулу, иммуномодулирующий материал может быть легко растворен, и структурная стабильность мультидоменной везикулы может быть усилена. Например, когда в качестве жидкого масла используют сквален или олеиновую кислоту, липофильный или слаборастворимый иммуномодулирующий материал может быть легко солюбилизирован, и можно обеспечить синергетический эффект с иммуномодулирующим материалом посредством эффекта иммуноактивации (иммуностимуляции) для самих сквалена и олеиновой кислоты, и повышение структурной стабильности мультидоменной везикулы, но жидкое масло этим не ограничивается.

В варианте осуществления настоящего изобретения жирорастворимые и водорастворимые иммуностимулирующие материалы могут быть иммуномодулирующим материалом, экспрессируемым в раковых клетках при стрессе, например, белком теплового шока, или могут быть материалом, индуцирующим активацию Т-клеток.

В варианте осуществления настоящего изобретения жирорастворимые и водорастворимые иммуностимулирующие материалы могут включать по меньшей мере один материал, выбранный из группы, состоящей из агониста toll-подобных рецепторов, сапонина, противовирусного пептида, индуктора инфламмасомы, лиганда NOD, лиганда сенсора цитозольной ДНК (CDS), лиганда стимулятора генов интерферона (STING) и их комбинаций, но не ограничиваются ими.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может относиться к компоненту, способному вызывать сигнальный ответ через сигнальный путь TLT путем генерации эндогенного или экзогенного лиганда в качестве прямого лиганда или в качестве непрямого лиганда.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может представлять собой натуральный агонист toll-подобного рецептора или синтетический агонист toll-подобного рецептора.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может представлять собой агонист, способный вызывать сигнальный ответ через TLR-1, и может включать по меньшей мере один материал, выбранный из группы, состоящей, например, из триацилированного липопептида (ЛП); фенолрастворимого модулина; липопептида Mycobacterium tuberculosis; бактериального липопептида из S- (2,3-бис(пальмитоилокси)-(2-RS)-пропил)-N-пальмитоил-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-ОН; бактериального липопептида из Borrelia burgdorfei; тригидрохлорида (Pam3Cys) липопептида, который имитирует ацетилированный амино-конец липопептида OspA; и их комбинаций, но не ограничивается ими.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может включать агонист TLR-2 и может включать, например, Pam3Cys-Lip, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может включать агонист TLR-3 и может включать, например, Poly(I:C), Poly(ICLC), Poly(IC12U), амплиген и тому подобное, как серия Poly(I:C), но не ограничивается этим.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может включать агонист TLR-4 и может включать по меньшей мере один материал, выбранный из группы, состоящей, например, из препарата белка наружной мембраны Shigella flexneri, AGP, CRX-527, MPLA, PHAD, 3D-PHAD, GLA и их комбинаций, но не ограничивается ими.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может включать агонист TLR-5 и может включать, например, флагеллин или его фрагмент, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может включать агонист TLR-7 или агонист TLR-8, и может включать по меньшей мере один материал, выбранный из группы, состоящей, например, из имиквимода, R837, резиквимода или молекулы имидазохинолина, такой как R848; VTX-2337; CRX642; имидазохинолина, ковалентно связанного с фосфолипидной группой или фосфонолипидной группой; и их комбинаций, но не ограничивается ими.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может включать агонист TLR-9 и может включать, например, иммуностимулирующий олигонуклеотид, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующий олигонуклеотид может включать по меньшей мере один мотив CpG, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения сапонин может быть выбран из группы, состоящей из QS21, Quil A, QS7, QS17, β-эсцина, дигитонина и их комбинаций, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения противовирусный пептид может включать KLK, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения индуктор инфламмасомы может представлять собой трегалозо-6,6-дибегенат (TDB), но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения лиганд NOD может представлять собой NOD2 агонист-синтетический мурамилтрипептид (M-TriLYS) или N-гликозилированный мурамилдипептид (агонист NOD2), но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения лиганд CDS может представлять собой Poly(dA:dT), но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения лиганд STING может представлять собой cGAMP, di-AMP или di-GMP, но не ограничивается ими.

В варианте осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующий материал может включать комбинацию одного, или двух или более агонистов toll-подобных рецепторов и может включать двойной агонист TLR2 и TLR7 (CL401) или двойной агонист TLR2 и NOD2 (CL429), но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующий материал, включенный в мультидоменную везикулу, может быть выбран из группы, состоящей, например, из Pam3Cys-Lip, Poly (I:C), CRX-527, MPLA, флагеллина, имиквимода, резиквимода, CpG, QS21, M-MurNAc-Ала-D-изоГлн-Лиз (M-TriLys), трегалозо-6,6-дибегената (TDB), 8837, Poly(dA:dT), cGAMP и их комбинаций, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения жирорастворимый иммуностимулирующий материал может включать материал, выбранный из группы, состоящей, например, из катионного липида, MPLA, AGP, CRX-527, PHAD, 3D-PHAD, GLA, липопептида, Pam3Cys, Pam3Cys-Lip, DDA, имиквимода (основной формы), резиквимода (основной формы), VTX-2337, CRX642, сапонина (QS21), TDB, CL401, CL429 и их комбинаций.

В варианте осуществления настоящего изобретения гидрофильный иммуностимулирующий материал может включать материал, выбранный из группы, состоящей, например, из CpG, имиквимода (HCl формы), резиквимода (HCl формы), Poly(I:C), STING, флагеллина, сапонина, пептида KLK, пептида - агониста NOD, Poly(dA:dT) и их комбинаций. Например, гидрофильный материал может быть конъюгирован с внешней стенкой мультидоменной везикулы даже через группу химической связи терминальной группы, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения катионный липид индуцирует электростатическую силу притяжения с клеточной мембраной, которая является анионной, так что эффективность внутриклеточной доставки иммуномодулирующего материала может быть дополнительно улучшена.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения различные анионные или отрицательно заряженные иммуномодулирующие материалы и биоматериалы, такие как ДНК и РНК, могут быть эффективно загружены в мультидоменную везикулу путем включения катионного липида для образования мультидоменной везикулы. Например, анионные или отрицательно заряженные биоматериалы и/или иммуномодулирующие материалы на основе аминокислот ДНК или РНК могут быть загружены на наружную стенку мультидоменной везикулы или мембрану внутренних липосом, которая проявляет катионные характеристики, через электростатическую связь, но не ограничиваясь этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения катионный липид может включать материал, выбранный из группы, состоящей из 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан) -карбамоил]холестерина гидрохлорида (DC-холестерина), диметилдиоктадециламмония (DDA), 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний пропана (DOTAP), 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмоний пропана (DOTMA), 1,2-димиристолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолина (EPC), N1-[2-((1S)-1-[(3-аминопропил)амино]-4-[ди(3-аминопропил) амино]бутилкарбоксамидо)этил]-3,4-ди[олеилокси]-бензамида (MVL5), липида 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний пропана (DODAP) и их комбинаций, но не ограничивается этим.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения поверхностно активное вещество наносят на наружную поверхность мультидоменной везикулы, так что мультидоменная везикула может быть стабильно диспергирована в водном растворе.

Поверхностно активное вещество наносят на наружную поверхность мультидоменной везикулы, что позволяет диспергировать мультидоменную везикулу в водном растворе, и, например, поверхностно активное вещество на основе сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана (обычно называемый Tween), в частности, Полисорбат 20 и Полисорбат 80; сополимер этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO); октоксинол (например, Тритон Х-100 или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); в качестве фосфолипида (фосфолипидного компонента), фосфатидилхолин (лецитин), фосфатидилэтаноланилин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, фосфатидную кислоту, сфингомиелин и кардиолипин; этоксилат нонилфенола, такой как серия Tergitol ™ NP; жирный эфир полиоксиэтилена, полученный из лауриловых, цетиловых и олеиловых спиртов (известный как поверхностно активное вещество Brij), такой как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Brij 30); и сложный эфир сорбитана (обычно известный как SPAN), такой как сорбитан триолеат (Span85) и сорбитан монолаурат, можно использовать по отдельности или в комбинации по меньшей мере из двух поверхностно активных веществ. Например, в качестве поверхностно активного вещества может быть использована смесь этих поверхностно активных веществ, например, смесь Tween 80/ Span 85. Также может быть использована комбинация сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана и октоксинола. Другая полезная комбинация может включать лаурет 9, сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол. Поверхностно активное вещество может быть использовано в количестве от 0,001 до 20 масс.% в расчете на общую массу всей мультидоменной везикулы, и может быть использовано в количестве, например, от 0,01 до 1 масс.%, от 0,001 до 0,1 масс.%, от 0,005 до 0,02 масс.%; от 0,1 до 20 масс.%, от 0,1 до 10 масс.%, От 0,1 до 1 масс.% или примерно 0,5 масс.%.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечивается иммуномодулирующий материал, включающий мультидоменную везикулу в соответствии с настоящим изобретением и антиген.

В варианте осуществления настоящего изобретения антиген может быть выбран из группы, состоящей из белка, гена, клетки, вируса и их комбинаций, но не ограничивается этим. Например, белок может включать овальбумин, рекомбинантный белок, субъединицу и расщепленный белковый антиген, клетка может включать, например, дендритную клетку и Т-клетку, а вирус может включать, например, грипп, вирус гепатита B (HBV), вирус гепатита A (HAV) и вирус папилломы человека (HPV), но не ограничивается ими.

В варианте осуществления настоящего изобретения антиген может быть выбран из группы, состоящей из аттенуированного живого целого микроорганизма, инертного микроорганизма, разрушенного микроорганизма, белка патогена, рекомбинантного белка, гликированного белка, пептида, полисахаридов, липополисахаридов, липопептида, полинуклеотида, клетки, вируса и их комбинации, но не ограничивается ими. Например, антиген может включать антиген, полученный из вируса гриппа, или антиген, полученный из раковых клеток, но не ограничивается этим. Например, иммуномодулирующий материал для внутрикожного введения может включать по меньшей мере один антиген для индукции множественных иммунных ответов in vivo, но не ограничивается ими.

В варианте осуществления настоящего изобретения раковая клетка может быть получена с использованием линии раковых клеток или может быть выделена из раковой ткани (опухолевой ткани), присутствующей в организме. Кроме того, злокачественная опухоль может быть получена с применением противоракового лекарственного средства или облучения реальной раковой ткани, чтобы вызвать выработку белка, связанного с внутриклеточным стрессом, с последующим разрушением раковых клеток, но способ этим не ограничивается.

В варианте осуществления настоящего изобретения раковая клетка может включать раковые клетки легких, толстой кишки, центральной нервной системы, кожи, яичников, почек, молочной железы, желудка или толстой кишки, но не ограничивается этим.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения мультидоменной везикулы, включающий этапы: получения раствора масляной фазы путем растворения первого иммуномодулирующего материала и жидкого масла в растворителе; получения эмульсии вода-в-масле (В/М) путем диспергирования первой водной фазы, содержащей второй иммуномодулирующий материал, в растворе масляной фазы; и смешивания эмульсии вода-в-масле со вторым водным раствором и выпаривания растворителя, где первый иммуномодулирующий материал представляет собой жирорастворимый иммуностимулирующий материал, а второй иммуномодулирующий материал представляет собой водорастворимый иммуностимулирующий материал.

В варианте осуществления настоящего изобретения мультидоменная везикула обеспечивает для антигена и/или иммуномодулирующего материала, загруженного в везикулу, увеличенное время высвобождения по сравнению с одинарной липосомой или одинарной эмульсией, поскольку распад медленно происходит от наружной стенки, составляющей внешнюю сторону везикулы, до внутренней мембраны, содержащей по меньшей мере две липосомы, и в результате можно модулировать функцию иммунных клеток in vivo в течение длительного периода времени.

В варианте осуществления настоящего изобретения по меньшей мере две липосомы могут включать липосомы, внешние оболочки которых находятся в контакте друг с другом. Например, липосомы мультидоменной везикулы могут иметь улучшенную структурную стабильность и эффекты длительного высвобождения мультидоменной везикулы, поскольку осуществляется межфазный контакт между внешними оболочками, и соответственно, липосомы разрушаются медленнее, по сравнению с несколькими липосомами, у которых внешние оболочки отделены друг от друга.

В варианте осуществления настоящего изобретения жидкое масло служит связующим веществом между доменами, состоящими из каждой липосомы, и таким образом, характеризуется улучшением стабильности мультидоменной везикулы. Например, мультидоменная везикула может иметь улучшенную стабильность за счет введения жидкого масла на внешнюю стенку доменной везикулы и обеспечения контакта внешних стенок липосом друг с другом, и соответственно, эффекты замедленного высвобождения и структурная стабильность могут быть усилены.

В варианте осуществления настоящего изобретения липофильный иммуностимулирующий материал может быть легко загружен в мультидоменную везикулу жидким маслом. Например, имиквимод (R837) и тому подобное, являющиеся слаборастворимыми материалами, которые трудно растворить в общем органическом растворителе, легко растворяются жидким маслом, так что слаборастворимый материал может быть загружен в пространство между липосомами вместе с жидким маслом в мультидоменной везикуле.

В варианте осуществления настоящего изобретения животное масло может включать рыбий жир.

В варианте осуществления настоящего изобретения рыбий жир может быть использован без ограничений, если он является метаболизируемым маслом, и может включать, например, масло печени трески, масло печени акулы, китовый жир или тому подобное. Масло печени акулы содержит сквален, молекулу, известную как 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, и ненасыщенный терпен, и может также включать насыщенный аналог сквалан. Рыбий жир, включая сквален или сквалан, легко доступен из коммерческих источников или может быть получен способами, известными в данной области техники.

В варианте осуществления настоящего изобретения путем введения жидкого масла в мультидоменную везикулу иммуномодулирующий материал может быть легко растворен, и структурная стабильность мультидоменной везикулы может быть усилена. Например, когда в качестве жидкого масла используется сквален или олеиновая кислота, липофильный или слаборастворимый иммуномодулирующий материал может быть легко солюбилизирован, и можно обеспечить синергетический эффект с иммуномодулирующим материалом благодаря эффекту иммуноактивации сквалена и олеиновой кислоты, и повысить структурную стабильность мультидоменной везикулы, но жидкое масло этим не ограничивается.

В типичном варианте осуществления настоящего изобретения жирорастворимые и водорастворимые иммуностимулирующие материалы могут представлять собой иммуномодулирующий материал, экспрессируемый в раковых клетках при стрессе, например, белок теплового шока, или могут представлять собой материал, индуцирующий активацию T-клеток.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может включать агонист TLR-2, и может включать, например, Pam3Cys-Lip, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может включать агонист TLR-3 и может включать, например, Poly (I:C), Poly (ICLC), Poly(IC12U), амплиген и тому подобное, как серия Poly(I:C), но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения агонист toll-подобного рецептора может включать агонист TLR-7 или агонист TLR-8 и может включать по меньшей мере один материал, выбранный из группы, состоящей, например, из имиквимода, R837, резиквимода или молекулы имидазохинолина, такой как R848; VTX-2337; CRX642; имидазохинолина, ковалентно связанного с фосфолипидной группой или фосфонолипидной группой; и их комбинаций, но не ограничивается ими.

В варианте осуществления настоящего изобретения лиганд NOD может представлять собой агонист NOD2 – синтетический мурамилтрипептид (M-TriLYS) или N-гликозилированный мурамилдипептид (агонист NOD2), но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующий материал, включенный в мультидоменную везикулу, может быть выбран из группы, состоящей, например, из Pam3Cys-Lip, Poly (I: C), CRX-527, MPLA, флагеллина, имиквимода, резиквимода, CpG, QS21, M-MurNAc-Ала-D-изоГлн-Лиз (M-TriLys), трегалозо-6,6-дибегената (TDB), 8837, Poly(dA:dT), cGAMP и их комбинации, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения гидрофильный иммуномодулирующий материал может включать материал, выбранный из группы, состоящей, например, из CpG, имиквимода (формы HCl), резиквимода (формы HCl), Poly(I:C), STING, флагеллина, сапонина, пептида KLK, пептида-агониста NOD, Poly(dA:dT) и их комбинаций. Например, гидрофильный материал может быть конъюгирован с внешней стенкой мультидоменной везикулы даже через группу химической связи терминальной группы, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения посредством катионного липида индуцируется электростатическая сила притяжения с клеточной мембраной, которая является анионной, так что эффективность внутриклеточной доставки иммуномодулирующего материала может быть дополнительно улучшена.

Согласно варианту осуществления настоящего изобретения, путем включения катионного липида, различные анионные и/или отрицательно заряженные иммуномодулирующие материалы и биоматериалы, такие как ДНК и РНК, могут быть эффективно загружены в мультидоменную везикулу, чтобы образовать мультидоменную везикулу. Например, анионные или отрицательно заряженные биоматериалы и/или иммуномодулирующие материалы на основе аминокислот ДНК или РНК могут быть загружены на внешнюю стенку мультидоменной везикулы или мембрану внутренних липосом, которая проявляет катионные характеристики через электростатическую связь, но не ограничиваясь этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения катионный липид может включать материал, выбранный из группы, состоящей из 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан) -карбамоил]холестерина гидрохлорида (DC-холестерина), диметилдиоктадециламмония (DDA), 1,2-диолеоил-3-триметиламмония пропана (DOTAP), 1,2-ди-O-октадеценил-3-триметиламмония пропана (DOTMA), 1,2-димиристолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолина (EPC), N1-[2-((1S)-1-[(3-аминопропил)амино]-4-[ди(3-аминопропил) амино]бутилкарбоксамидо)этил]-3,4-ди[олеилокси]бензамида (MVL5), липида 1,2-диолеоил-3-диметиламмония пропана (DODAP) и их комбинаций, но не ограничивается этим.

Поверхностно активное вещество наносят на наружную поверхность мультидоменной везикулы, что позволяет диспергировать мультидоменную везикулу в водном растворе, и например, поверхностно активное вещество на основе сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана (обычно называемый Tween), в частности, Полисорбат 20 и Полисорбат 80; сополимер этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO); октоксинол (например, Тритон Х-100 или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); в качестве фосфолипида (фосфолипидного компонента), фосфатидилхолин (лецитин), фосфатидилэтаноланилин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилглицерин, фосфатидную кислоту, сфингомиелин и кардиолипин; нонилфенол этоксилат, такой как серия Tergitol™ NP; жирный эфир полиоксиэтилена, полученный из лауриловых, цетиловых и олеиловых спиртов (известный как поверхностно активное вещество Brij), такой как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Brij 30); и сложный эфир сорбитана (обычно известный как SPAN), такой как сорбитантриолеат (Span85) и сорбитанмонолаурат, можно использовать по отдельности или в комбинации по меньшей мере из двух поверхностно активных веществ.

Например, в качестве поверхностно активного вещества может быть использована смесь этих поверхностно активных веществ, например, смесь Tween 80/Span 85. Также может быть использована комбинация сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана и октоксинола. Другая полезная комбинация может включать лаурет 9, сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол. Поверхностно активное вещество может быть использовано в количестве от 0,001 до 20 масс.% в расчете на общую массу всей мультидоменной везикулы, и может быть использовано в количестве, например, от 0,01 до 1 масс.%, от 0,001 до 0,1 масс.%, от 0,005 до 0,02 масс.%; от 0,1 до 20 масс.%, от 0,1 до 10 масс.%, от 0,1 до 1 масс.% или примерно 0,5 масс.%.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечивается мультидоменная везикула, содержащая: по меньшей мере две липосомы, контактирующие и соединенные друг с другом, и внешнюю стенку мультидоменной везикулы, окружающую по меньшей мере две липосомы. Мультидоменная везикула образована из масляной фазы и водной фазы, где масляная фаза содержит первый иммуномодулирующий материал и жидкое масло; масляная фаза образует мембрану липосом и наружную стенку мультидоменной везикулы; водная фаза содержит второй иммуномодулирующий материал; водная фаза представляет собой внутреннюю водную фазу мембраны липосом и внешнюю водную фазу мембраны липосом; первый иммуномодулирующий материал и второй иммуномодулирующий материал являются материалами, контролирующими иммуносупрессивный фактор; и жидкое масло улучшает структурную стабильность по меньшей мере двух липосом, вступающих в контакт и связанных друг с другом.

Первый иммуномодулирующий материал и второй иммуномодулирующий материал могут дополнительно включать вышеописанный иммуностимулирующий материал. То есть первый иммуномодулирующий материал и второй иммуномодулирующий материал могут включать материал для контроля иммуносупрессивного фактора вместе с иммуностимулирующим материалом.

Кроме того, в соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения обеспечивается иммуномодулирующий материал, содержащий мультидоменную везикулу и антиген.

Кроме того, обеспечен способ получения мультидоменной везикулы, включающий этапы: получения раствора масляной фазы путем растворения первого иммуномодулирующего материала и жидкого масла в растворителе; получения эмульсии вода-в-масле (В/М) путем диспергирования первой водной фазы, содержащей второй иммуномодулирующий материал, в растворе масляной фазы; и смешивания эмульсии вода-в-масле со вторым водным раствором и выпаривания растворителя, где первый иммуномодулирующий материал и второй иммуномодулирующий материал представляют собой материалы, контролирующие иммуносупрессивный фактор.

В настоящем изобретении композиция для контроля микроокружения солидного рака на основе мультидоменной везикулы является новой формой иммуномодулирующей композиции для модуляции микроокружения рака и характеризуется включением лекарственного средства (материала для контроля иммуносупрессивного фактора), способного контролировать функции иммуносупрессивной клетки, и иммуносупрессивного материала, появляющегося в микроокружении солидного рака, в дополнение к ранее упомянутому материалу, который активирует иммунные клетки in vivo.

В соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения обеспечена иммуномодулирующая мультидоменная везикула, имеющая морфологию капсул микроразмера, в которой множество липосом, включающих материал для контроля иммуносупрессивного фактора, способно контролировать функции иммуносупрессивного фактора, то есть иммуносупрессивная клетка и иммуносупрессивный материал в качестве основного компонента соединяются друг с другом, образуя соответствующие домены, и улучшается структурная стабильность множества липосом, связанных введенным компонентом жидкого масла. Кроме того, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения обеспечена композиция противоракового терапевтического агента на основе новой мультидоменной везикулы, которая позволяет преодолеть недостатки низкой эффективности инкапсуляции и короткой эффективной продолжительности действия одинарного липосомного материала, используемого в качестве различных фармацевтических композиций, и увеличить эффективную продолжительность модуляции иммунной функции.

Мультидоменная везикула в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения имеет преимущество в том, что эффективное время действия материала, модулирующего иммунную систему, может быть увеличено, поскольку материал, контролирующий иммуносупрессивный фактор, способный контролировать функции иммуносупрессивной клетки, и иммуносупрессивный материал, загруженный на наружную стенку и внутри везикулы, высвобождается, в то время как распад медленно происходит от наружной стенки везикулы к внутренней мембране.

Кроме того, мультидоменная везикула в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения позволяет увеличить эффективную продолжительность действия иммуностимулирующего материала путем загрузки материала для контроля иммуносупрессивного фактора, способного контролировать функции различных иммуносупрессивных клеток, и иммуносупрессивных материалов, имеющих липофильные свойства, на мембрану липосом и/или наружную стенку мультидоменной везикулы.

Мультидоменная везикула в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения позволяет увеличить эффективную продолжительность действия материала, контролирующего иммуносупрессивный фактор, путем загрузки материала, контролирующего иммуносупрессивный фактор, способного контролировать функции различных иммуносупрессивных клеток, и иммуносупрессивных материалов, имеющих гидрофильные свойства, внутри липосом.

Мультидоменная везикула в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения позволяет увеличить эффективную продолжительность действия материала, контролирующего иммуносупрессивный фактор, способного контролировать функции иммуносупрессивной клетки, и иммуносупрессивного материала путем одновременной загрузки различных материалов для контроля иммуносупрессивного фактора, имеющих гидрофильные свойства, внутри липосомы, а материала, контролирующего липофильный иммуносупрессивный фактор, на мембрану липосом и/или наружную стенку везикулы.

В примере из настоящего изобретения примеры лекарственного средства, способного контролировать функцию клеток-супрессоров миелоидного происхождения (MDSC), то есть материала, контролирующего иммуносупрессивный фактор, включают тадалафил, силденафил, L-AME, нитроаспирин, целекоксиб, NOHA, бардоксолон метил, D,L-1-метил-триптофан, 5-фторурацил, гемцитабин, 17-DMAG, пептид-Fc гибридные белки, ATRA, витамин A, витамин D3, витамин E, антитела GR1, золедроновую кислоту, сунитиниб, акситиниб, доцетаксел, сорафениб, кукурбитацин B, JSI-124, анти-IL-17-антитела, анти-гликановые антитела, анти-VEGF-антитела, бевацизумаб, антрациклин, тасквинимод, иматиниб и циклофосфамид, но не ограничиваются ими.

В примере из настоящего изобретения ингибитор PI3K включает PX-866, вортманнин, PI-103, пиктилисиб, GDC-0980, PF-04691502, BEZ235, XL765, XL147, BAY80-6946, GSK-2126458, бупарлисиб, BYL719, AZD8186, GSK-2636771, CH5132799, INK-1117 и тому подобное.

В примере из настоящего изобретения материал ингибитора PI3K-дельта включает AMG-319, иделалисиб, TRG-1202, INCB050465, IPI-145, дувелисиб, акалисиб, TG-1202, RV1729, RP-6530, GDC-0032 и тому подобные.

В примере из настоящего изобретения материал ингибитора PI3K-гамма включает IPI-549, IPI-145 и тому подобное.

В примере настоящего изобретения примеры лекарственного средства, способного контролировать функцию регуляторных Т-клеток (Treg), то есть материала, контролирующего иммуносупрессивный фактор, включают антитела против CD25 (даклизумаб), базиликсимаб, LMB-2, денилейкин дифтитокс (Ontak), двухвалентный IL-2 гибридный токсин, анти-TGF-бета антитела, фрезолимумаб, ингибиторы TGF-бетаR-киназы, LY2157299, растворимый TGF-бетаR I/II, ипилимумаб, тремелимумаб, пембролизумаб, ниволумаб, TIM-3 антитела, LAG-3 антитела, антитела против CD39, антитела против CD73, ингибиторы A(2A)R, целекоксиб, индометацин, диклофенак, ибупрофен, антитела TNFR2, антитела против GITR, бевацизумаб, антитела против OX40 (CD134), растворимый GITR лиганд, блокады для рецепторов хемокинов (CCR4, 5, 6, 10), циклофосфамид, сунитиниб, флударабин, ингибиторы PI3K p110(дельта), CliniMAC, могамулизумаб, финголимод, регуляторы для микроРНК (miR-155, miR-146a, miR-181a), 5-аза-2-дезоксицитидин, паклитаксел, иматиниб, сорафениб, циклоспорин А, такролимус, дазатиниб, поли-G-олигонуклеотид, лиганды TLR8, гемцитабин и 5-фторурацил, но не ограничиваются ими.

В примере настоящего изобретения лекарственное средство, способное модулировать функцию ассоциированных с опухолью макрофагов (ТАМ), то есть материал, контролирующий иммуносупрессивный фактор, представляет собой лекарственное средство, способное ингибировать рекрутирование макрофагов, и включает ингибиторы CCL2/CCR2 (Yondeli, RS102895), ингибиторы M-CSF или M-CSFR (антитела против M-CSF, JNJ-28312141, GW2580), хемоаттрактанты (CCL5, CXCL-12, VEGF) и ингибиторы их рецепторов, ингибиторы HIF и тому подобные, но не ограничивается ими.

Кроме того, лекарственное средство, способное ингибировать выживание ТАМ, то есть материал, контролирующий иммуносупрессивный фактор, включает лекарственное средство, способное индуцировать экспрессию, из бисфосфонатов, клодроната, дазатиниба, анти-FR бета-антител, Shigella flexneri, легумаина и CD1d, но не ограничивается этим.

Кроме того, лекарственное средство, способное улучшать характеристики макрофагов М1, то есть материала, контролирующего иммуносупрессивный фактор, включает агонист TLR, который является агонистом NF-kB, антитела против CD40, тиазолидиндионы, тасквинимод, антитела против IL-10R, антитела против IL-10, олигонуклеотид (анти-IL-10R анти-IL-10), интерферон, который является агонистом STAT1, SHIP, способный индуцировать путь M1, GM-CSF, IL-12, тимозин альфа1, и тому подобное, но не ограничивается этим.

Кроме того, лекарство, способное ингибировать механизм, способствующий росту раковых клеток на основе макрофагов М2, то есть материал для контроля иммуносупрессивного фактора, включает сунитиниб, сорафениб, WP1066, корозоловую кислоту, олеаноловую кислоту, которые являются ингибиторами STAT3, ингибиторы STAT6, ингибиторы пути M2 (c-Myc, PPAR-альфа/гамма, PI3K, KLF4, HIFs, Ets2, DcR3 и mTOR), HRG, CuNG, MDXAA, силибинин и PPZ, но не ограничивается ими.

Кроме того, микроРНК-мишень, способная контролировать функцию макрофагов в микроокружении опухоли, включает miR-155, miR-511-3p и miR-26a.

Кроме того, целевое лекарственное средство, способное усиливать противоопухолевую эффективность путем таргетинга макрофагов в микроокружении опухоли, включает паклитаксел, доцетаксел, 5-фторурацил, алендронат, доксорубицин, симвастатин, гидразинокуркумин, амфотерицин В, ципрофлоксацин, рифабутин, рифампицин, эфавиренз, цисплатин, теофиллин, Pseudomonas экзотоксин A, золедроновую кислоту, трабектедин, силтуксимаб (анти-IL-6 антитела), дазатиниб, CpG-ODN, интерферон-альфа, -бета, -гамма, GM-CSF, IL-12, тимозин альфа-1, сунитиниб, 5,6-диметилксантенон-4-уксусную кислоту, силибинин, ингибиторы CCL2-CCR2 (PF-04136309, трабектедин, карлумаб), лиганд (имиквимод, 852A) блокатора передачи сигналов CSF1-CSF1R (BLZ945, PLX3397, эмактузумаб (RG7155), AMG-820, IMC-CS4, GW3580 и PLX6134) и Toll-подобный рецептор 7, ингибиторы NF-kB (N-ацетил-1-цистеин, витамин C, бортезомиб, аспирин, салицилаты, производные индолкарбоксамида, аналоги хиназолина, талидомид, метаболиты простагландина), ингибиторы HIF-1 (2ME2, 17-AAG, кампотецин, топотекан, плевротин, 1-метилпропил, 2-имидазолил дисульфид и YC-1), агонист CXCR4 (AMD3100, AMD1498), ALX40-4C, T22, T140, CGP64222 и KRH-1636, но не ограничивается ими.

Примером настоящего изобретения может быть композиция на основе мультидоменной везикулы, содержащая фактор, подавляющий иммуносупрессивное окружение (ингибиторы трансформирующего фактора роста бета (TGF-бета), нитроаспирин, ингибиторы циклооксигеназы-2 (СОХ2), ингибиторы индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), ингибиторы фосфодиэстеразы-5 (PDE-5) и лекарственные средства против интерлейкина 10 (IL-10)).

В примере настоящего изобретения ингибитор TGF-бета включает SB-505124, LY-364974 и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения нитроаспирин включает NCX 4040 и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения ингибитор СОХ-2 включает целекоксиб и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения ингибитор IDO включает индоксимод, NLG919 и тому подобное, но не ограничивается ими.

В примере настоящего изобретения ингибитор PDE-5 включает тадалафил (сиалис) и тому подобное, но не ограничивается этим.

В варианте осуществления настоящего изобретения материал для контроля иммуносупрессивного фактора микроокружения солидного рака, который содержит мультидоменную везикулу, может состоять из комбинаций по меньшей мере двух из лекарств, описанных выше.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения материал для контроля иммуносупрессивного фактора микроокружения солидного рака может представлять собой иммуномодулирующий материал, включающий мультидоменную везикулу, способный повышать терапевтическую эффективность, при которой естественные киллеры и Т-клетки, обладающие терапевтической способностью обнаруживать и непосредственно убивать раковые клетки, присутствующие в организме, эффективно выживают в организме.

Примером настоящего изобретения может быть композиция на основе мультидоменной везикулы, включающая антитела, служащие для супрессии иммунной контрольной точки (PD-1, PDL-1 CTLA-4, LAG-3, TIM-3 и CEACAM1) посредством метода активации Т-клеток путем прямого связывания в микроокружении солидного рака.

В примере настоящего изобретения антитело против CTLA-4 включает ипилимумаб и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения анти-PD1 антитело включает ниволумаб и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения анти-PDL1 антитело включает атезолизумаб и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения анти-LAG-3 антитело включает BMS-986016 и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения анти-TIM-3 антитело включает TSR-022 и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения анти-CEACAM1 антитело включает CM-24 и тому подобное, но не ограничивается этим.

Примером настоящего изобретения является композиция на основе мультидоменной везикулы, включающая фактор коактивации (OX40, CD137, CD27 и CD40) и тому подобное способом активации T-клеток посредством прямого связывания в микроокружении солидного рака.

В примере настоящего изобретения анти-OX40 включает RG7888 и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения анти-CD137 включает урелумаб и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения анти-CD27 включает варлилумаб и тому подобное, но не ограничивается этим.

В примере настоящего изобретения анти-CD40 включает BMS-986090 и тому подобное, но не ограничивается этим.

Примером настоящего изобретения является композиция на основе мультидоменной везикулы, содержащая лекарственное средство, способное подавлять факторы индукции иммуносупрессии (Treg, MDSC, TAM, IDO и PD-L1) с помощью метода активации Т-клеток посредством непрямого связывания в микроокружении солидной опухоли.

Примером настоящего изобретения может быть композиция на основе мультидоменной везикулы, включающая противораковый агент, который повышает эффективность иммунных клеток путем индукции иммуногенной гибели клеток посредством химиотерапии.

Примером настоящего изобретения является композиция на основе мультидоменной везикулы, включающая лекарственное средство, способное убивать раковые клетки или контролировать микроокружение опухоли с помощью эпигенетического механизма.

В настоящем изобретении в качестве примера эпигенетического механизма материал ингибитора ДНК-метилтрансферазы (DNMTi) включает материал, выбранный из 5-азацитидина, 5-аза-2-дезоксицитидина, децитабина, SGI-110, зебуларина, CP-4200, кладрибина, флударабина, клофарабина, прокаинамида, прокаина, гидралазина, дисульфирама, RG108, нанаомицина А, генистеина, эквола, куркумина, EGCG, ресвератрола, партенолида и тому подобного, но не ограничивается ими.

В настоящем изобретении, в качестве примера эпигенетического механизма, материал ингибитора гистондеацетилазы (HDACi) включает материал, выбранный из вориностата, абексиностата, субероиланилида, гидроксамовой кислоты, белиностата, панобиностата, ромидепсина, вальпроевой кислоты, энтиностата, гивиностата, резиминостата, квизиностата, прациностата, дациностата, пироксамида, CHR-3996, CBHA, трихостатина A, оксамфлатина, MC1568, тубацина, PCI-30451, тацединалина, моцетиностата, хидамида, BML-210, M344, бутирата, бутирата натрия, трапоксина А, апицидина, никотинамида, сплитомицина, EX-527, дигидрокумарина, теновина-D3, AGK2, AEM1, AEM2, камбинола, сиртинола, салермида, теновина-6, TMP-269, псаммаплина A, некстурастата A, RGFP966 и тому подобного, но не ограничивается этим.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров настоящего изобретения, но следующие Примеры приведены в качестве иллюстрации для облегчения понимания настоящего изобретения, и содержание настоящего изобретения не ограничивается следующими Примерами.

Пример 1. Получение и характеристика мультидоменной везикулы, включающей иммуномодулирующий материал

В примерах настоящего изобретения мультидоменную везикулу получали следующим образом.

1-1. Получение и характеристика мультидоменной везикулы на основе сквалена (imMDV(SQ))

Раствор масляной фазы получали растворением DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, полученную двойную эмульсию диспергировали в растворе дихлорметана. Дихлорметан удаляли с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы. Кроме того, контроль также получали таким же образом, как в Примере, за исключением того, что сквален не был включен.

В результате наблюдения структуры мультидоменной везикулы, как описано выше, с использованием оптического микроскопа и динамического рассеяния света (DLS, Otsuka Electronics Co., Ltd.), мультидоменная везикула, включающая сквален, имела однородный размер по сравнению с контролем, не включавшим сквален, и имела четкие контуры даже на границе с дисперсионной фазой [фиг.2(А) и 2(В)]. Напротив, можно видеть, что в контроле, не включающем сквален, сохранялись неправильные размеры и формы [фиг.2(С) и 2(D)].

Кроме того, фиг.3(A)-(C) представляют собой изображения, полученные путем оптической микроскопии мультидоменной везикулы, включающей сквален, а фиг.3(D)-(F) представляют собой изображения, полученные путем оптической микроскопии мультидоменной везикулы, не содержащей сквален. Как показано на фиг.3, можно видеть, что структуру мультидоменной везикулы можно четко наблюдать путем растворения флуоресцентного красителя родамина в растворе масляной фазы, и мультидоменная везикула, включающая сквален, имеет четкие контуры и диспергируется в водном растворе.

Когда был выполнен процесс удаления примесей для анализа стабильности после производства или процесс центрифугирования (около 2500 об./мин) для классификации мультидоменной везикулы по размеру, было видно, что мультидоменная везикула, включающая сквален [фиг.4(A) и 4(C)], сформировала стабильную структуру при минимальном изменении формы до и после центрифугирования, но большая часть структуры в контроле, не содержащем сквален, была разрушена [Фиг. 4(B) и 4(D)].

1-2. Получение и характеристика мультидоменной везикулы (imMDV-1: imMDV (MPLA)), включающей MPLA на основе сквалена.

Раствор масляной фазы получали растворением DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), монофосфориллипида A [MPLA, 10 мг, Avanti Polar Lipids, США], сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, образовавшуюся двойную эмульсию диспергировали в растворе дихлорметана. Дихлорметан удаляли с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы. Фиг.5 представляет собой оптическое изображение мультидоменной везикулы (imMDV-1:imMDV(MPLA)), включающей MPLA на основе сквалена.

Оценка эффекта активации иммунных клеток полученной мультидоменной везикулы

Влияние образцов imMDV(SQ) и imMDV(MPLA), полученных в Примерах 1-1 и 1-2, на активацию дендритных клеток, полученных из костного мозга (BMDC), и макрофагов, полученных из костного мозга (BMM), анализировали по секретируемым количествам провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6 и IL-12) с использованием экспериментального метода ИФА.

На Фиг.6 можно видеть, что при обработке imMDV(SQ) секреция TNF-α и IL-6 увеличивалась пропорционально используемой для обработки концентрации, и кроме того, на фиг.7 можно видеть, что даже когда проводили обработку imMDV(MPLA), секреция TNF-α, IL-6 и IL-12 увеличивалась пропорционально концентрации используемой для обработки мультидоменной везикулы.

Получение мультидоменной везикулы (imMDV), включающей антиген на основе сквалена (овальбумин) и определение характера высвобождения

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы), включающей овальбумин (5 мг, Sigma-Aldrich, США), в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, полученную двойную эмульсию диспергировали в растворе дихлорметана. Дихлорметан удаляли с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы. Кроме того, контроль также получали таким же образом, как в Примере, за исключением того, что сквален не был включен.

В результате анализа характеристик высвобождения мультидоменной везикулы, включающей антиген овальбумина и сквален (imMDV(SQ-OVA)), и мультидоменной везикулы, включающей только антиген овальбумина (imMDV(OVA)), было подтверждено, что антиген овальбумина медленно высвобождается из мультидоменной везикулы, включающей сквален, из-за замедленного высвобождения антигена овальбумина [фиг. 8].

1-3. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-2), включающей DDA на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), DDA (10 мг, Avanti Polar Lipids, США), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). После этого надосадочную жидкость удаляли после осаждения раствора масляной фазы с помощью центрифуги, и получали липосомы. Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-4. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-3), включающей MPLA/TDB на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), MPLA (10 мг), сквалена (12 мг), TDB (10 мг, Avanti Polar Lipids, США) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-5. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-4), включающей MPLA/DDA на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), MPLA (10 мг), DDA (10 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-6. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-5), включающей MPLA/QS21 на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), MPLA (10 мг), QS21 (10 мг, Desert King, США), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-7. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-6), включающей CpG на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолевата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы, 1 мг CpG, Bioneer, Корея) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 × g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-8. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-7), включающей Poly(I:C) на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы [5% сахарозы, 1 мг Poly(I:C) (Sigma-Aldrich, США)] в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 × g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-9. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-8), включающей резиквимод на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали растворением DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы, 5 мг резиквимода (Sigma-Aldrich, США)) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лзиина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-10. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-9), включающей имиквимод на основе сквалена, и подтверждение эффекта индукции иммунного ответа

Раствор масляной фазы получали растворением DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг), олеиновой кислоты (2 мг, Sigma-Aldrich, США), имиквимода (основная форма, Sigma-Aldrich, США) (5 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы. Имиквимод в форме HCl для растворения в водном растворе получали из имиквимода в форме основания посредством процесса, описанного ниже. 400 г имиквимода растворяли в смешанном растворе из 2000 мл дистиллированной воды и 900 мл н-бутанола (или 1-бутанола). К нему при перемешивании одновременно добавляли 150 мл 37% раствора HCl. После перемешивания раствора в интервале от 60 до 65°С до полного растворения имиквимода раствор охлаждали до 20-25°С и затем выдерживали в течение примерно 30 минут. Когда оставшийся раствор сушили в сушилке при комнатной температуре, можно было получить HCl имиквимод. После того, как полученный таким образом HCl-имиквимод растворялся во внутренней водной фазе во время процесса получения imMDV, imMDV получали, подвергая полученный раствор тому же процессу. Фиг.9 иллюстрирует изображения, полученные посредством оптического микроскопа, для мультидоменных везикул, в которые загружен имиквимод в форме HCl, загружен имиквимод в основной форме, и обе формы имиквимода загружены одновременно. Среди полученных мультидоменных везикул характер высвобождения имиквимода (imMDV (R837-HCl)) анализировали при 37°С с использованием камеры системы Transwell®. Количество высвобожденного лекарства определяли количественно, используя спектрометр УФ-Виз (фиг.10). Как показано на фиг.10, около 70% загруженного лекарства высвобождалось в течение более 8 суток. Кроме того, когда дендритные клетки, полученные из костного мозга (BMDC) обрабатывали образцом imMDV(R837-HCl), количество секретируемого типичного провоспалительного цитокина IL-6, связанного с иммунным ответом Th1, анализировали с использованием экспериментального метода ИФА. Как показано на фиг.11, было подтверждено, что секреция IL-6 была увеличена пропорционально использованной для обработки концентрации, и можно видеть, что R837-HCl, инкапсулированный в мультидоменной везикуле, высвобождается для активации иммунных клеток, подтверждая характер действия, подобный таковому для R837-HCl, используемого в качестве контроля.

Влияние мультидоменных везикул [imMDV(R837-HCl), imMDV(основание R837) и imMDV[R837-HCl:основание R837], включающих имиквимод, полученных в Примере, на образование антител против модельного антигена овальбумина было подтверждено в эксперименте на мышах (C57BL/6, самки в возрасте от 6 до 7 недель). Методом иммуноферментного анализа (ИФА) было определено, что гуморальный иммунный ответ увеличивался, когда 50 мкг мультидоменной везикулы вводили мышам.

Как видно на фиг.12A, 12B и 12C, было подтверждено, что гуморальный иммунный эффект (IgG, через 1 неделю после инъекции) против модельного антигена овальбумина (OVA) заметно повышен в экспериментальных группах, в которых применяли образцы мультидоменных везикул (12a: образец imMDV(R837-HCl), 12b: образец imMDV(основание R837) и 12c: образец imMDV[R837-HCl: R837-основание (1:1)]), в которых был загружен имиквимод. Кроме того, было подтверждено, что усиленный таким образом гуморальный иммунный эффект сохранялся даже через 3 недели (фиг.13A, 13B и 13C) и через 5 недель (фиг.14A, 14B и 14C) после инъекции.

Можно видеть, что гуморальный иммунный эффект заметно увеличивался, когда дополнительно проводили бустерную иммунизацию один раз спустя пять недель после первой инъекции (фиг.15A, 15B, 15C, 16, 17 и 18). Можно видеть, что усиленный гуморальный иммунный эффект устойчиво сохранялся даже через 1, 2 и 6 недель после бустерной иммунизации на 5 неделе (фиг.19, 20 и 21). Можно видеть, что индукция эффектов усиления иммунитета и устойчивости с помощью адъюванта на основе мультидоменных везикул превосходна даже по сравнению с адъювантом в масляной форме (DMSO(R837)), используемым на клинической стадии (фиг. 22). Прежде всего, наибольшим преимуществом является то, что феномен воспаления, развивающегося при введении адъюванта в масляной форме (DMSO(R837)), вообще не происходит, когда применяют адъювант на основе мультидоменной везикулы (imMDV (R837-HCl)) (фиг. 23).

1-11. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-10), включающей STING (циклическую ДНК) на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы, 1 мг STING (InvivoGen, США)) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-12. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-11), включающей MPLA/CpG на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг), MPLA (10 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы, 1 мг CpG) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-13. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-12), включающей MPLA и Poly (I:C) на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг), MPLA (10 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы [5% сахарозы, 1 мг Poly(I:C)] в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-14. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-13), включающей CpG/Poly(I:C) на основе сквалена

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы [5% сахарозы, 1 мг CpG и 1 мг Poly(I:C)] в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 × g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осадждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-15. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-14), включающей MPLA на основе касторового масла

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), MPLA (10 мг), касторового масла (12 мг, Sigma-Aldrich, США) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

1-16. Получение мультидоменной везикулы (imMDV-15), включающей MPLA на основе минерального масла

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), MPLA (10 мг), минерального масла (12 мг, Sigma-Aldrich, США) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Нвадосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали липосомы.

Пример 2. Оценка эффективности усиления иммунитета посредством мультидоменной везикулы против вирусного антигена

Чтобы исследовать специфический иммунный эффект против вирусов птичьего гриппа в образцах мультидоменных везикул, включающих материал, модулирующий иммунную функцию, полученных в Примере 1, исследовали влияние В-клеток, связанных, в частности, с выработкой антител при антителоспецифическомм иммунном ответе, на гуморальный иммунный ответ. Сначала самок мышей BALB/c и C57BL/6 (в возрасте от 5 до 6 недель) получали у KOATECH (Корея, Пхёнтхэк). Все эксперименты с использованием мышей проводились в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения Кореи по уходу и использованию лабораторных животных.

Сыворотки крови мышей собирали через 2 недели (фиг.24) и через 4 недели (фиг.25) после первой внутримышечной инъекции, и титр антител против белка HA в сыворотке крови измеряли методом иммуноферментного анализа (ИФА). В методе ИФА на планшете, покрытом белком HA, блокировали неспецифическое связывание с использованием ФБР/3% бычьего сывороточного альбумина (BSA), а затем сыворотку контрольной экспериментальной группы инкубировали при различных серийных разведениях. После этого добавляли мышиный IgG, к которому была присоединена пероксидаза хрена. Все инкубации проводили при 37°С в течение 1 часа, и сыворотку контрольной экспериментальной группы 3 раза промывали ФБР/ 0,05% Твином 20 после каждой стадии, упомянутой выше. После проявления реакции путем добавления 100 мкл тетраметилбензидина (TMB, BD Biosciences, США) в качестве субстрата, измеряли поглощение при 450 нм с помощью ИФА ридера, и результаты показаны на фиг.24 и 25.

Пример 3. Оценка эффективности усиления иммунитета против ракового антигена посредством мультидоменной везикулы

3-1: Подтверждение продукции OVA-специфических антител посредством мультидоменной везикулы

Вакциные эффекты, направленные на профилактику рака, мультидоменной везикулы, включающей материал, модулирующий иммунную функцию, полученной в Примере 1, были подтверждены с помощью эксперимента на мышах (C57BL/6, самки в возрасте от 6 до 7 недель). Методом иммуноферментного анализа (ИФА) было установлено, что гуморальный иммунный ответ был повышен, когда 50 мкг иммуномодулирующего материала (вакцины против рака), включающего мультидоменную везикулу, вводили мышам, и результаты показаны на фиг.26 (измерение количества продуцируемого IgG). Гуморальный иммунный ответ был подтвержден путем взятия пробы крови у мышей после вакцинации для сравнения продуцированного количества иммуноглобулина G (IgG) с контрольной группой.

3-2: Подтверждение специфического клеточно-опосредованного ответа Т-клеток с применением мультидоменной везикулы

Был исследован клеточный иммунный ответ Т-клеток из селезенки мыши с применением мультидоменной везикулы, включающей материал, модулирующий иммунную функцию. Три мыши были отобраны из группы OVA и группы OVA-мультидоменной везикулы среди мышей, привитых в Примере 3-1, и через две недели селезенку удаляли у каждой мыши, а затем ткань селезенки переносили в стерилизованную чашку Петри, селезенку измельчали, используя клеточный фильтр, и клетки отделяли из эпителиальной ткани. Затем содержимое чашки Петри переносили в пробирку вместимостью 50 мл, и заполняли пробирку средой RPMI, центрифугировали пробирку при 1500 об./мин в течение 5 минут, а затем 5 мл буфера для лизиса эритроцитов (Sigma Aldrich) (Германия) добавляли к осадку, из которого была удалена надосадочная жидкость, для лизиса эритроцитов, и выдерживали осадок на водяной бане при 30°С в течение от 5 минут до 10 минут. Клетки, внесенные в пробирку, промывали ФБР и затем суспендировали в среде RPMI для выделения спленоцитов. Выделенные спленоциты распределяли в 96-луночном планшете по 5×10⁵ клеток/100 мкл на чашке, покрытой IFN-гамма, и обрабатывали пептидом OVA, рестриктированным по МНС класса I, в концентрации 5 мкг/мл в течение 48 часов. После этого добавляли IFN-гамма, к которому была присоединена пероксидаза хрена. После проявления реакции путем добавления 100 мкл 3-амино-9-этилкарбазола (ACE, BD Biosciences, США) в качестве субстрата проводили измерение с помощью метода иммуноферментных пятен (ELISPOT) (фиг.27).

Пример 4. Получение мультидоменной везикулы, нагруженной лекарственным средством для модуляции микроокружения солидного рака

4-1. Получение мультидоменной везикулы, содержащей материал для удаления MDSC

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы, 5 мг гемцитабина (Gemzar®, Eli Lilly and Company, Индианаполис, Индиана, США)) в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). После этого смешанный раствор перемешивали вихревым способом в 3 мл внешней водной фазы (7,5% глюкозы, 40 мМ лизина) в течение 10 секунд. Наконец, хлороформ удаляли из полученной двойной эмульсии с использованием вакуумного испарителя, а остаточный растворитель удаляли, повышая температуру до 37°С. Надосадочную жидкость удаляли после выдерживания не содержащей растворителя дисперсии мультидоменных везикул при низкой температуре или осаждения дисперсии с помощью центрифуги, и получали мультидоменную везикулу (imMDV(SQ-Gem)). Мультидоменная везикула (imMDV(OA-Gem)), загруженная гемцитабином с включением масла олеиновой кислоты вместо жидкого масла сквалена, и мультидоменная везикула (imMDV(Gem)), загруженная гемцитабином, при этом не содержащая сквалена, может быть получена тем же способом, как описано выше. Фиг.28 иллюстрирует полученные с помощью оптического микроскопа изображения трех приготовленных таким способом образцов. Видно, что нагруженный гемцитабин в мультидоменной везикуле, включающей сквален, медленно высвобождается, тогда как большая часть нагруженного лекарственного средства высвобождается из мультидоменной везикулы, не содержащей сквален, в течение 24 часов (фиг. 29). Можно видеть, что когда вместо животного масла, такого как сквален, используют растительное масло с олеиновой кислотой, характер замедленного высвобождения загруженного гемцитабина проявляет форму плато в течение от 24 до 72 часов, а затем через 72 часа проявляет линейный характер. Это подразумевает, что характер высвобождения загруженного лекарственного средства можно модулировать с использованием жидкого масла (фиг.30).

4-2. Получение мультидоменной везикулы, включающей лекарство, индуцирующее иммуногенную гибель клеток

Паклитаксел, доксорубицин, метотрексат и оксалиплатин были выбраны по индукции гибели раковых клеток из числа противоопухолевых агентов, которые служат для того, чтобы антиген-презентирующие клетки эффективно распознавали противораковый агент, и были получены мультидоменные везикулы, загруженные этими лекарственными средствами. Мультидоменные везикулы были получены с использованием того же способа, что и в Примере 4-1, но imMDV(паклитаксел) (фиг.31) использовали путем добавления лекарственного средства паклитаксела к раствору в масляной фазе, а мультидоменные везикулы, такие как imMDV(доксорубицин) (фиг.32), imMDV(метотрексат) (фиг.33) и imMDV(оксалиплатин) (фиг.34) были получены путем добавления каждого лекарства к внутренней водной фазе. Как видно из фиг.31, можно видеть, что загруженный препарат медленно высвобождался в течение 2 недель.

4-3. Получение мультидоменной везикулы, содержащей материал для удаления Treg клеток

Раствор масляной фазы получали растворением DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы, (Иматиниб: Гливек® (Novartis Pharmaceuticals Corp, Восточный Ганновер, Нью-Джерси, США)) 5 мг), в которой МК-2206 (ингибитор Akt, SelleckChem, 5 мг) диспергировали в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). Посредством тех же последовательных процессов, что и в Примере 4-1, получали мультидоменную везикулу (фиг.35).

4-4. Получение мультидоменной везикулы, содержащей лекарство, способное контролировать передачу сигналов PI3K

Раствор масляной фазы получали путем растворения DOPC (10 мг), холестерина (8 мг), сквалена (12 мг) и глицерина триолеата (12 мг) в хлороформе (1 мл). Полученный раствор масляной фазы диспергировали в 1 мл внутренней водной фазы (5% сахарозы (Иматиниб: Гливек® (Novartis Pharmaceuticals Corp, Восточный Ганновер, Нью-Джерси, США)) 5 мг), в которой PF-04691502 (ингибитор PI3K, SelleckChem, 5 мг) диспергировали в течение 10 минут с использованием гомогенизатора (20000 х g). Посредством тех же последовательных процессов, что и в Примере 4-1, получали мультидоменную везикулу (фиг. 36).

4-5. Получение мультидоменной везикулы, включающей лекарственное средство, способное контролировать эпигенетический механизм

Среди лекарств, способных индуцировать эпигенетический механизм, были отобраны азацитидин, ресминостат, панобиностат и OTX015(iBET), и были получены мультидоменные везикулы, загруженные этими препаратами. В частности, мультидоменные везикулы, такие как imMDV(азацитидин) (фиг.37), imMDV (ресминостат) (фиг.38), imMDV(панобиностат) (фиг.39) и imMDV(OTX015(iBET)) (фиг.40) были получены с использованием того же способа, что и в Примере 4-1, для добавления каждого лекарственного средства во внутреннюю водную фазу. Как видно из фиг.38 и 39, можно видеть, что загруженный препарат медленно высвобождался в течение 2 недель.

4-6. Получение мультидоменной везикулы, содержащей материала для удаления ТАМ клеток

Использовали тот же способ, что и в примере 4-1, но BLZ945 (ингибитор киназы CSF-1R), который представляет собой лекарственное средство, способное удалять TAM клетки, растворяли в масляной фазе, а затем получали мультидоменную везикулу (фиг.41).

4-7. Получение мультидоменной везикулы, содержащей противоопухолевый ингибитор иммуносупрессивных цитокинов

После того, как 5 мг лекарства - противоопухолевого ингибитора иммуносупрессивных цитокинов (целекоксиб, Sigma-Aldrich), растворяли в масляной фазе в Примере 4-1, была получен мультидоменная везикула (фиг. 42).

Пример 5. Получение мультидоменной везикулы, в которой объединены материалы, осуществляющие иммуномодуляцию микроокружения солидного рака

В качестве примера получения мультидоменной везикулы, в которой были объединены материалы, модулирующие иммунную функцию в микроокружении солидного рака, получали мультидоменную везикулу (imMDV(GEM/R837)), имеющую стабильную структуру, одновременно содержащую гемцитабин (Пример 4-1), способный убивать MDSC и раковые клетки, и имиквимод (Пример 1-9), который представляет собой toll-подобный рецептор, служащий для активации иммунных клеток (фиг.43).

Кроме того, была получена мультидоменная везикула (imMDV(BLZ945/R837)), имеющая стабильную структуру, одновременно содержащая BLZ945 (Пример 4-6), который является лекарственным средством, способным удалять ТАМ клетки, и имиквимод (Пример 1-9), который является toll-подобным рецептором, служащим для активации иммунных клеток (фиг.44).

Вышеприведенное описание настоящего изобретения предоставлено в иллюстративных целях, и специалисты в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, поймут, что настоящее изобретение может быть легко модифицировано в другие конкретные формы без изменения технического духа или существенных признаков настоящего изобретения. Таким образом, следует понимать, что вышеописанные примеры являются лишь иллюстративными во всех аспектах и не являются ограничительными. Например, каждый составной элемент, который описан как единичная форма, может быть реализован в распространенной форме, и аналогично, составные элементы, которые описаны как распространенные формы, могут быть реализованы в объединенной форме. Объем настоящего изобретения представлен формулой изобретения, которая приведена ниже, а не подробным описанием, и следует понимать, что значение и объем формулы изобретения, а также всех изменений или модифицированных форм, полученных на основе эквивалентных концепций, относятся к объему настоящего изобретения.

Промышленная применимость

Мультидоменная везикула в соответствии с настоящим изобретением может увеличивать эффективную продолжительность действия иммуномодулирующего материала путем одновременной загрузки различных иммуномодулирующих материалов, имеющих гидрофильные свойства, внутри липосом, и липофильного иммуномодулирующего материала на мембрану липосом и/или наружную стенку везикулы. Кроме того, способ получения мультидоменной везикулы в соответствии с настоящим изобретением имеет преимущества в том, что устойчивость и стабильность при хранении в процессе производства мультидоменной везикулы могут быть улучшены путем введения жидкого масла, такого как сквален, где жидкое масло позволяет легко растворить типичные слаборастворимые иммуномодулирующие материалы, нерастворимые в общем органическом растворителе, и, соответственно, может быть получена мультидоменная везикула, содержащая различные слаборастворимые иммуномодулирующие материалы.

Реферат

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к мультидоменной везикуле, и может быть использовано в медицине. Согласно настоящему изобретению мультидоменная везикула содержит: по меньшей мере две липосомы, контактирующие и связанные друг с другом, и наружную стенку мультидоменной везикулы, окружающую указанные липосомы. Мультидоменная везикула образована из масляной фазы и водной фазы и может инкапсулировать иммуностимулирующие материалы в обеих фазах. В сравнении с известными липосомами мультидоменная везикула по настоящему изобретению обладает более высокой эффективностью загрузки активных агентов и большей стабильностьюin vivo.3 н. и 6 з.п. ф-лы, 44 ил., 5 пр.

Формула

1. Иммуностимулирующая мультидоменная везикула, содержащая:

по меньшей мере две липосомы, контактирующие и соединенные друг с другом, и наружную стенку иммуностимулирующей мультидоменной везикулы, окружающую по меньшей мере две липосомы,

где иммуностимулирующая мультидоменная везикула образована из масляной фазы и водной фазы,

масляная фаза содержит первый иммуностимулирующий материал и жидкое масло, и масляная фаза образует мембрану липосом и внешнюю стенку иммуностимулирующей мультидоменной везикулы,

водная фаза содержит второй иммуностимулирующий материал, и водная фаза представляет собой внутреннюю водную фазу мембраны липосом и внешнюю водную фазу мембраны липосом,

первый иммуностимулирующий материал представляет собой жирорастворимый иммуностимулирующий материал, а второй иммуностимулирующий материал представляет собой водорастворимый иммуностимулирующий материал, и

жидкое масло улучшает структурную стабильность по меньшей мере двух липосом, вступающих в контакт и связанных друг с другом,

где жидкое масло выбрано из группы, состоящей из сквалена, олеиновой кислоты, минерального масла, касторового масла и их комбинаций.

2. Иммуностимулирующая мультидоменная везикула по п.1, имеющая размер от 1 до 100 мкм.

3. Иммуностимулирующая мультидоменная везикула по п.1, в которой жирорастворимые и водорастворимые иммуностимулирующие материалы содержат материал, который индуцирует активацию антигенпрезентирующих клеток, В-клеток или Т-клеток.

4. Иммуностимулирующая мультидоменная везикула по п.1, в которой жирорастворимый иммуностимулирующий материал включает материал, выбранный из группы, состоящей из катионного липида, MPLA, AGP, CRX-527, PHAD, 3D-PHAD, GLA, липопептида, Pam3Cys, Pam3Cys-Lip, имиквимода (основной формы), резиквимода (основной формы), VTX-2337, CRX642, сапонина (QS21), TDB, CL401, CL429 и их комбинаций.

5. Иммуностимулирующая мультидоменная везикула по п.1, в которой водорастворимый иммуностимулирующий материал включает материал, выбранный из группы, состоящей из CpG, имиквимода (HCl формы), резиквимода (HCl формы), Poly(I:C), STING, флагеллина, сапонина, KLK пептида, пептида - агониста NOD, Poly(dA:dT) и их комбинаций.

6. Иммуностимулирующая мультидоменная везикула по п.4, в которой катионный липид содержит материал, выбранный из группы, состоящей из DC-холестерина, DDA, DOTAP, DOTMA, EPC, MVL5, DODAP и их комбинаций.

7. Иммуностимулирующий материал, включающий иммуностимулирующую мультидоменную везикулу по любому из пп.1-6 и антиген.

8. Иммуностимулирующий материал по п.7, в котором антиген выбран из группы, состоящей из белка, гена, клетки, вируса и их комбинаций.

9. Способ получения иммуностимулирующей мультидоменной везикулы, включающий этапы:

получения раствора масляной фазы путем растворения первого иммуностимулирующего материала и жидкого масла в растворителе;

получения эмульсии вода-в-масле (В/М) путем диспергирования первой водной фазы, содержащей второй иммуностимулирующий материал, в растворе масляной фазы; и

смешивания эмульсии вода-в-масле со вторым водным раствором и выпаривания растворителя,

где первый иммуностимулирующий материал представляет собой жирорастворимый иммуностимулирующий материал, а второй иммуностимулирующий материал представляет собой водорастворимый иммуностимулирующий материал,

где жидкое масло улучшает структурную стабильность по меньшей мере двух липосом, контактирующих и соединенных друг с другом,

и жидкое масло выбрано из группы, состоящей из сквалена, олеиновой кислоты, минерального масла, касторового масла и их комбинаций.

Документы, цитированные в отчёте о поиске

Повышение иммунного отклика у видов крупного рогатого скота

Композиции липидных везикул и способы применения

Авторы

ЛИМ, Ён Тайк (KR)

LIM YONG TAIK

LIM, Yong Taik

Патентообладатели

DANDI BIOSCIENCE INC

Заявители

DANDI BIOSCIENCE INC

СПК: A61K9/107 A61K9/1075 A61K9/127 A61K9/1271 A61K9/1277 A61K9/50 A61K9/5015 A61K31/282 A61K31/337 A61K31/40 A61K31/4045 A61K31/415 A61K31/4745 A61K31/506 A61K31/519 A61K31/704 A61K31/706 A61K31/7068 A61K39/00 A61K39/0011 A61K39/39 A61K2039/55555 A61K2039/55561 A61K47/06 A61K47/44 A61P31/16 A61P35/00 C12N2760/16134

МПК: A61K9/107 A61K9/127 A61K9/50 A61K39/00

Публикация: 2020-11-19

Дата подачи заявки: 2018-03-02

РОССТИП

Поиск по товарам

Добавить свой товар

Сообщества

Товары

Участники

Патенты

Запросов

Поставщикам

О сервисе

Блогерам

Помощь