Микроорганизм, продуцирующий путресцин или орнитин, и способ получения путресцина или орнитина с использованием этого микроорганизма - RU2759956C1

Описание

Область техники

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному микроорганизму для получения путресцина или орнитина и к способу получения путресцина или орнитина с использованием этих микроорганизмов.

Предшествующий уровень техники

Путресцин обнаружен у грамотрицательных бактерий или грибов и присутствует у различных видов в высокой концентрации. Поэтому ожидается, что он играет важные роли в метаболизме микроорганизмов. Как правило, путресцин представляет собой очень важное исходное вещество для синтеза полиамина найлона-4,6, и его получают, главным образом, способом химического синтеза. Способ химического синтеза состоит из 3-стадийного процесса, включающего реакцию каталитического окисления, стадию использования цианидного соединения и реакции гидрогенизации с использованием водорода под высоким давлением. В этом отношении для получения путресцина требуется разработать более экологически безопасный способ с использованием биомассы, который может уменьшать потребление энергии.

В этих обстоятельствах в качестве способов получения путресцина с использованием микроорганизма были раскрыты способы получения путресцина с высоким выходом путем трансформации E. coli и микроорганизма рода Corynebacterium (публикация международной заявки No. WO 2006/005603; публикация международной заявки No. WO 2009/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104 (4): 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88 (4): 859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95: 169-178, 2012).

Орнитин представляет собой вещество, широко распространенное у растений, животных и микроорганизмов, и его используют в качестве предшественника в биосинтезе аргинина, пролина и полиаминов. Орнитин играет важную роль в пути экскреции мочевины, продуцируемой из аминокислот или аммиака в орнитиновом цикле в метаболизме высших животных in vivo. Также орнитин используют в качестве пищевых добавок или фармацевтических лекарственных средств в промышленности для улучшения состояния при циррозе печени и функциональных расстройствах печени. Известные способы получения орнитина включают обработку казеина молока пищеварительными ферментами и использование трансформированной E. coli или микроорганизма рода Corynebacterium (патент Кореи No. 10-1372635; T. Gotoh et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 33: 773-777, 2010).

SugR, представляющий собой регулятор транскрипции в метаболизме сахара (далее SugR), известен как регулятор транскрипции у Corynebacterium, и ранее сообщалось, что SugR ингибирует ген, кодирующий PEP (фосфоенолпируват)-белок фосфотрансферазу системы PTS, и гены, ассоциированные с гликолизом сахаров (VF Wendisch, et al., J. Bacteriol. 190: 24, 8033-8044, 2008). Цитратсинтаза представляет собой фермент, который первым действует в цикле TCA (цикл трикарбоновых кислот) и может регулировать его скорость. Сообщалось, что модифицированный штамм Corynebacterium с пониженной активностью GltA увеличивал продуцирование аспартата и лизина (Shiio et al., Agric Biol Chem. 46; 101-107, 1982).

Техническая задача

Авторы настоящего изобретения подтвердили, что манипуляция с sugR, геном, кодирующим SugR, и gltA, геном, кодирующим цитратсинтазу, улучшает продуктивность по путресцину или орнитину, тем самым создав настоящее изобретение.

Решение технической задачи

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить рекомбинантный микроорганизм, который может продуцировать путресцин или орнитин с высоким выходом.

Другая задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения путресцина или орнитина с использованием вышеупомянутого микроорганизма.

Полезные эффекты изобретения

Авторы настоящего изобретения подтвердили, что одновременное повышение активности цитратсинтазы (далее GltA) при понижении активности SugR у микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего путресцин или орнитин, повышает уровень продуцирования путресцина или орнитина. Соответственно, микроорганизм по настоящему изобретению может быть широко использован для промышленного получения путресцина или орнитина, и этот микроорганизм можно широко применять в качестве эффективного и желаемого средства в экономическом аспекте и с точки зрения безопасности окружающей среды для обеспечения исходного вещества для получения различных полимерных продуктов, в которых путресцин или орнитин используются в качестве исходных веществ.

Наилучший способ осуществления изобретения

В одном аспекте настоящего изобретения предложен модифицированный микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого активность регулятора транскрипции метаболизма сахара (SugR) понижена по сравнению с его эндогенной активностью, 2) активность цитратсинтазы (GltA) повышена по сравнению с ее эндогенной активностью, или 3) активность SugR понижена по сравнению с его эндогенной активностью, и активность GltA повышена по сравнению с ее эндогенной активностью.

В примере воплощения по настоящему изобретению предложен модифицированный микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого активность SugR понижена по сравнению с его эндогенной активностью, и активность GltA повышена по сравнению с ее эндогенной активностью.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого SugR состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого GltA состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, где микроорганизм рода Corynebacterium выбран из группы, состоящей из Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum и Brevibacterium lactofermentum.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, в который дополнительно введена активность орнитиндекарбоксилазы (ODC).

В другом примере воплощения по настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого ODC состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого активность 1) орнитин-карбамоилтрансферазы (ArgF), 2) экспортера глутамата или 3) орнитин-карбамоилтрансферазы и экспортера глутамата дополнительно понижены по сравнению с их эндогенной активностью.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению дополнительно предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого орнитин-карбамоилтрансфераза состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, и экспортер глутамата состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого активность по меньшей мере одного выбранного из группы, состоящей из ацетил-гамма-глутамил-фосфатредуктазы (ArgC), ацетилглутаматсинтазы или орнитин-ацетилтрансферазы (ArgJ), ацетилглутаматкиназы (ArgB) и ацетилорнитин-аминотрнасферазы (ArgD), дополнительно повышена по сравнению с его эндогенной активностью.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого ацетил-гамма-глутамил-фосфатредуктаза состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 21, ацетилглутаматсинтаза или орнитин-ацетилтрансфераза состоят из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 25, ацетилглутаматкиназа состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 29, и ацетилорнитин-аминотрнасфераза состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 33.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению дополнительно предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого активность ацетилтрансферазы дополнительно понижена по сравнению с ее эндогенной активностью.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого ацетилтрансфераза состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 37.

В другом примере воплощения по настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого активность белка, состоящего из SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 41, дополнительно повышена по сравнению с его эндогенной активностью.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения путресцина или орнитина, включающий:

(1) культивирование микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего путресцин или орнитин, в среде; и

(2) выделение путресцина или орнитина из культивированного микроорганизма или из культуральной среды со стадии (1).

В одном примере воплощения по настоящему изобретению предложен способ получения путресцина или орнитина, в котором микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.

Далее настоящее изобретение описано более подробно.

Один аспект настоящего изобретения относится к микроорганизму рода Corynebacterium, продуцирующему путресцин или орнитин, у которого активность регулятора транскрипции метаболизма сахара (SugR) понижена по сравнению с его эндогенной активностью, 2 ) активность цитратсинтазы (GltA) повышена по сравнению с ее эндогенной активностью или 3) активность SugR понижена по сравнению с его эндогенной активностью и активность GltA повышена по сравнению с ее эндогенной активностью. В частности, настоящее изобретение относится к микроорганизму рода Corynebacterium, продуцирующему путресцин или орнитин, у которого активность регулятора транскрипции метаболизма сахара понижена по сравнению с его эндогенной активностью, и активность цитратсинтазы повышена по сравнению с ее эндогенной активностью.

Как его используют здесь, термин “регулятор транскрипции метаболизма сахара (SugR)” относится к ферменту, который широко задействован в качестве ингибитора в отношении генов, ассоциированных с различными аспектами метаболизма сахара, такими как потребление сахара и фосфотрансферазная система, гликолиз, ферментация, относящаяся к лактатдегидрогеназе, и так далее. В настоящем изобретении SugR включает как эндогенные белки, так и чужеродные белки в микроорганизме рода Corynebacterium, и в частности, SugR, происходящий из микроорганизма рода Corynebacterium.

В настоящем изобретении регулятор транскрипции метаболизма сахара может включать, без ограничения, любой белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, или любой белок, включающий аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше, и наиболее точно 99% или больше, с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями, при условии, что белок обладает по существу такой же активностью как регулятор транскрипции метаболизма сахара.

Дополнительно, поскольку аминокислотная последовательность белка, кодирующего вышеупомянутую активность, может отличаться в зависимости от вида или штамма микроорганизма, SugR можно не ограничивать в настоящем изобретении в отношении его происхождения, но SugR может иметь происхождение, например, из микроорганизма рода Corynebacterium, и в частности происходить из Corynebacterium glutamicum. Очевидно, что любая аминокислотная последовательность, которая имеет гомологию с вышеупомянутыми последовательностями и обладает биологической активностью по существу такой же как белок, представленный SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, или соответствующей таковой, также может входить в объем настоящего изобретения, несмотря на то, что аминокислотная последовательность может иметь делецию, модификацию, замену или вставку в части последовательности.

Полинуклеотид, кодирующий регулятор транскрипции метаболизма сахара по настоящему изобретению, при условии, что он обладает активностью, сходной с таковой регулятора транскрипции метаболизма сахара, может включать любой полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, или полинуклеотиды, кодирующие белки, имеющие гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше, и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями. Что касается полинуклеотида, кодирующего регулятор транскрипции метаболизма сахара, учитывая кодоны на основе вырожденности кодонов или те, которые предпочтительны для организмов для экспрессии этого регулятора, различные модификации могут быть выполнены в кодирующем участке в пределах объема без изменения аминокислотной последовательности полипептида, и в частности, полинуклеотид может включать полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 4, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин “цитратсинтаза (GltA)” относится к ферменту, вовлеченному в продуцирование различных внутриклеточных промежуточных продуктов биосинтеза и продуцирование восстановленной пуриновой нуклеиновой кислоты. Известно, что GltA действует как посредник в гидролитической конденсации между ацетил-CoA и оксалоацетатом для продуцирования цитрата. В настоящем изобретении GltA включает как эндогенные ферменты, так и чужеродные белки, присутствующие у микроорганизма рода Corynebacterium, и в частности, GltA, имеющий происхождение из микроорганизма рода Corynebacterium.

В настоящем изобретении GltA может включать, без ограничения, белки, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, и любой белок, который включает аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями, и обладает основной активностью посредника в гидролитической конденсации между ацетил-CoA и оксалоацетатом для продуцирования цитрата.

Дополнительно, поскольку аминокислотная последовательность белка, проявляющего активность, может варьировать в зависимости от вида или штамма микроорганизма, GltA может происходить, например, из Corynebacterium, и в частности, Corynebacterium glutamicum, но происхождение GltA не ограничено этим в настоящем изобретении. Очевидно, что любая аминокислотная последовательность, имеющая гомологию с вышеупомянутыми последовательностями и обладающая биологической активностью по существу такой же как белок, представленный SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, или соответствующей таковой, также может входить в объем настоящего изобретения, несмотря на то, что аминокислотная последовательность может иметь делецию, модификацию, замену или вставку в части последовательности.

Полинуклеотид, кодирующий GltA по настоящему изобретению, может включать полинуклеотиды, кодирующие аминокислоту SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7, или полинуклеотиды, кодирующие белки, имеющие гомологию 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями. В отношении полинуклеотида, кодирующего GltA, учитывая кодоны на основе вырожденности кодонов или те, которые предпочтительны для организмов для экспрессии GltA, различные модификации могут быть выполнены в кодирующем участке в пределах объема без изменения аминокислотной последовательности полипептида, и в частности, полинуклеотид может включать полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, но не ограничиваясь этим.

Как его используют здесь, термин “гомология” относится к степени идентичности при сравнении с данной аминокислотной последовательностью или полинуклеотидной последовательностью и может быть выражена в процентах. В настоящем изобретении гомологичные последовательности, обладающие такой же активностью как данная аминокислотная или полинуклеотидная последовательность или подобной активностью, обозначают в виде “% гомологии.” Например, гомологию можно подтвердить с использованием стандартного программного обеспечения для расчета параметров (например, таких параметров как показатель, идентичность и сходство), в частности BLAST 2.0, или сравнения последовательностей путем саузерн-блоттинга в определенных строгих условиях гибридизации, и подходящие условия, подлежащие определению, могут быть определены способом, который входит в уровень техники и хорошо известен специалисту в данной области техники (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).

Дополнительно полинуклеотиды, кодирующие SugR и цитратсинтазу по настоящему изобретению, можно гибридизовать в строгих условиях с полинуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 2 или 4, или SEQ ID NO: 6 или 8, или зондами, происходящими из полинуклеотидных последовательностей, соответственно, и могут представлять собой модифицированный тип, кодирующий SugR и цитратсинтазу, которые вовлечены в нормальные функции. Как его используют здесь, термин “строгие условия” относится к условиям, обеспечивающим возможность специфической гибридизации между полинуклеотидами. Например, строгие условия более конкретно описаны в литературе (например, J. Sambrook et al., там же).

В настоящем изобретении предприняли попытки снизить активность SugR, или повысить активность GltA, или применить как снижение активности SugR, так и повышение активности GltA одновременно в микроорганизме рода Corynebacterium, продуцирующем путресцин или орнитин, и в результате было подтверждено, что уровень продуцирования путресцина или орнитина повышался во всех модифицированных штаммах.

В частности, микроорганизм по настоящему изобретению может включать микроорганизмы как дикого типа, так и модифицированного типа при условии, что они могут продуцировать путресцин или орнитин. Например, микроорганизм может принадлежать роду Escherichia, роду Shigella, роду Citrobacter, роду Salmonella, роду Enterobacter, роду Yersinia, роду Klebsiella, роду Erwinia, роду Corynebacterium, роду Brevibacterium, роду Lactobacillus, роду Selenomanas, роду Vibrio, роду Pseudomonas, роду Streptomyces, роду Arcanobacterium и роду Alcaligenes. В частности, микроорганизм по настоящему изобретению может принадлежать роду Corynebacterium и, более конкретно, может быть выбран из группы, состоящей из Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum и Brevibacterium lactofermentum, и еще более конкретно может представлять собой Corynebacterium glutamicum, но не ограничиваясь этим.

В частности, как его используют здесь, выражение “продуцирующий путресцин или орнитин” относится к микроорганизму, обладающему продуктивностью по путресцину или орнитину, происходящему из родительского штамма, который имеет путресцин или орнитин в природном состоянии или не обладает продуктивностью по путресцину или орнитину.

Дополнительно микроорганизм, продуцирующий путресцин или орнитин, может быть модифицирован для снижения активности орнитин-карбамоилтрансферазы (ArgF), которая вовлечена в синтез аргинина, и/или активность экспортера глутамата (NCgl1221), который представляет собой белок, вовлеченный в экскрецию глутамата, по сравнению с их соответствующими эндогенными активностями.

Кроме того, микроорганизм, обладающий продуктивностью по путресцину, может быть модифицирован для снижения активности ацетилтрансферазы (NCgl1469), которая представляет собой белок, который ацетилирует путресцин, по сравнению с ее эндогенной активностью, и/или для введения активности ODC, которая представляет собой белок, превращающий орнитин в путресцин.

В частности, модификация по повышению или снижению активностей может происходить в процессе, называемом трансформацией в настоящем изобретении. Как его используют здесь, термин “трансформация” относится к процессу введения полинуклеотида, кодирующего определенный белок, или вектора, включающего промоторную последовательность с сильной или слабой активностью, и так далее, в клетку-хозяина, тем самым обеспечивая возможность экспрессии белка, кодируемого полинуклеотидом в клетке-хозяине, или индуцируя модификацию хромосомы клетки-хозяина.

Дополнительно полинуклеотид включает ДНК или РНК, кодирующую белок-мишень. Полинуклеотид может быть вставлен в любой форме при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, включающую все основные элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Традиционно экспрессионная кассета может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, домен связывания с рибосомой и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме экспрессионного вектора, способного к саморепликации. Дополнительно полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина как есть и функционально связан с последовательностью, необходимой для его экспрессии в клетке-хозяине, но не ограничиваясь этим.

Дополнительно, как его используют здесь, термин “функционально связанный” относится к функциональной связи между промоторной последовательностью, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего белок-мишень, по настоящему изобретению и вышеописанной последовательностью гена.

Как его используют здесь, термин “вектор” относится к любой ДНК-конструкции, которая включает полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок-мишень, которая функционально связана с подходящей контрольной последовательностью, способной экспрессировать белок-мишень в подходящей клетке-хозяине. Контрольная последовательность включает промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность, способную контролировать транскрипцию, последовательность, кодирующую подходящую мРНК домена связывания с рибосомой, и последовательности, способные контролировать терминацию транскрипции и трансляции. Вектор, после трансформации им подходящей клетки-хозяина, может реплицироваться или действовать независимо от генома хозяина, или может быть интегрирован в геном хозяина самостоятельно.

Вектор для использования в настоящем изобретении может быть конкретно не ограничен, при условии что вектор обладает способностью реплицироваться в клетке-хозяине, и можно использовать любой вектор, известный в данной области техники. Примеры традиционно используемого вектора могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фагового вектора или космидного вектора можно использовать pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и так далее; и в качестве плазмидного вектора можно использовать векторы на основе pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET и так далее. Вектор для использования в настоящем изобретении можно конкретно не ограничивать, но можно использовать любой известный вектор экспрессии. В частности, можно использовать векторы pDZ, pDZTn, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и так далее.

Как таковой, полинуклеотид, кодирующий чужеродный белок-мишень, может быть заменен на модифицированный полинуклеотид в хромосоме с помощью вектора для вставки в бактериальную хромосому. Вставка полинуклеотида в хромосому может быть выполнена с использованием любого известного в данной области техники способа, например, путем гомологичной рекомбинации, но не ограниваясь этим. Поскольку вектор по настоящему изобретению может быть вставлен в хромосому путем гомологичной рекомбинации, может быть дополнительно включен селективный маркер для подтверждения вставки в хромосому. Селективный маркер используют для отбора трансформированных клеток, то есть для подтверждения того, был ли вставлен целевой полинуклеотид, и можно использовать маркеры, способные обеспечивать возможность отбора фенотипов, таких как лекарственная устойчивость, потребность в питательных веществах, устойчивость к цитотоксическим агентам и экспрессия поверхностных белков. В условиях обработки селективными агентами только клетки, способные экспрессировать селективные маркеры, могут выживать или проявлять другие фенотипические признаки, и таким образом трансформированные клетки могут быть отобраны.

Как его используют здесь, термин “повышение активности” включает не только достижение более сильного действия, чем исходная функция, вследствие нового введения активности или повышения активности самого белка, но также включает повышение его активности путем повышения активности эндогенного гена, амплификации эндогенного гена под действием внутреннего(их) или внешнего(их) фактора(ов), делеции регуляторного(ых) фактора(ов) для ингибирования экспрессии гена, увеличение числа копий гена, введение гена из другого источника, модификации последовательности контроля экспрессии и, в частности, повышения активности фермента путем замены или модификации промотора и мутации внутри гена и так далее.

В частности, в настоящем изобретении усиление или повышение активности может быть выполнено путем:

1) увеличения числа копий полинуклеотида, кодирующего фермент,

2) модификации последовательности контроля экспрессии для увеличения экспрессии полинуклеотида,

3) модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме для повышения активности фермента, и

4) модификации путем их комбинации,

но способ не ограничен этим.

Увеличение числа копий полинуклеотида (способ 1) может быть выполнено в форме, в которой полинуклеотид функционально связан с вектором, или путем вставки полинуклеотида в хромосому клетки-хозяина, хотя способ специально не ограничен этими. В частности, увеличение числа копий полинуклеотида внутри хромосомы клетки-хозяина может быть выполнено путем введения вектора, который может реплицироваться и функционировать независимо от клетки-хозяина и с которым полинуклеотид, кодирующий белок по настоящему изобретению, функционально связан; или может быть выполнен путем введения вектора, который может вставлять полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, и с которым полинуклеотид функционально связан, в клетку-хозяина.

Далее, модификация последовательности контроля экспрессии для увеличения экспрессии полинуклеотида (способ 2) может быть выполнена путем индуцирования модификации в полинуклеотидной последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в полинуклеотидной последовательности или их комбинации для дополнительного повышения активности последовательности контроля экспрессии или путем замены полинуклеотидной последовательности на полинуклеотидную последовательность, имеющую более высокую активность, хотя способ специально не ограничен этим. Последовательность контроля экспрессии включает промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции.

Сильный экзогенный промотор может быть присоединен вместо исходного промотора к области, лежащей выше по ходу транскрипции от экспрессионной единицы полинуклеотида. Примеры сильного промотора могут представлять собой промотор CJ7, промотор lysCP1, промотор EF-Tu, промотор groEL, промотор aceA или aceB и так далее, и более конкретно, уровень экспрессии может быть улучшен путем функционального связывания с промотором lysCP1, имеющим происхождение из Corynebacterium (WO 2009/096689) или промотором CJ7 (патент Кореи No. 0620092 и WO 2006/065095), но сильный промотор не ограничен этим.

Кроме того, модификация полинуклеотидной последовательности на хромосоме (способ 3) может быть выполнена путем индуцирования модификации в последовательности контроля экспрессии путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены полинуклеотидной последовательности или их комбинации для дополнительного повышения активности полинуклеотидной последовательности, или путем замены полинуклеотидной последовательности на улучшенную полинуклеотидную последовательность, обладающую более высокой активностью, хотя способ специально не ограничен этими.

Как его используют здесь, “снижение активности” может быть достигнуто путем делетирования, частично или полностью, полинуклеотида, кодирующего белок, для снижения активности белка, путем модификации последовательности контроля экспрессии для уменьшения экспрессии полинуклеотида, путем модификации полинуклеотидной последовательности на хромосомах для снижения активности белка и способом, выбранным из их комбинации.

В частности, в настоящем изобретении снижение активности может быть достигнуто путем:

1) делетирования, частично или полностью, полинуклеотида, кодирующего белок,

2) модификации последовательности контроля экспрессии для уменьшения экспрессии полинуклеотида,

3) модификации полинуклеотидной последовательности на хромосомах для снижения активности белка, и

4) способа, выбранного из их комбинации,

но способ не ограничен этими.

В частности, способ делетирования, частично или полностью, полинуклеотида, кодирующего белок, может быть выполнен путем замены полинуклеотида, кодирующего эндогенный белок-мишень, в хромосоме на полинуклеотид, имеющий частичную делецию в полинуклеотидной последовательности, или ген-маркер с использованием вектора для вставки в хромосому в бактериях. Как его используют здесь, термин “часть” может варьировать в зависимости от типов полинуклеотидов, и в частности он может включать их в количестве от 1 до 300, более конкретно от 1 до 100 и еще более конкретно от 1 до 50.

Дополнительно, способ модификации последовательности контроля экспрессии может быть выполнен путем индуцирования модификации в последовательности контроля экспрессии путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в полинуклеотидной последовательности или их комбинации для дополнительного снижения активности последовательности контроля экспрессии или путем замены полинуклеотидной последовательности на полинуклеотидную последовательность, имеющую более слабую активность. Последовательность контроля экспрессии включает промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания с рибосомой, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции.

Дополнительно, способ модификации полинуклеотидной последовательности на хромосоме может быть выполнен путем индуцирования модификации в полинуклеотидной последовательности путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены в полинуклеотидной последовательности или их комбинации для дополнительного снижения активности белка или путем замены полинуклеотидной последовательности на улучшенную полинуклеотидную последовательность, обладающую более высокой активностью.

Дополнительно, способ делетирования регуляторного фактора, который ингибирует экспрессию белка с полинуклеотида, может быть выполнен путем замены полинуклеотида для фактора ингибирования экспрессии на полинуклеотид, имеющий частичную делецию в полинуклеотидной последовательности, или ген-маркер. Как его используют здесь, термин “часть” может варьировать с зависимости от типов полинуклеотидов, и в частности он может включать их в количестве от 1 до 300, более конкретно от 1 до 100 и еще более конкретно от 1 до 50.

Как его используют здесь, термин “эндогенная активность” относится к активному состоянию фермента в немодифицированном состоянии, например в природном состоянии, в котором он исходно присутствует у микроорганизма, и фраза “повышение по сравнению с его эндогенной активностью” относится к состоянию повышенной активности белка, которое присутствует у микроорганизма после манипуляции, такой как введение гена, проявляющего активность, или увеличение числа копий соответствующего гена, делеция фактора контроля ингибирования экспрессии гена или модификация последовательности контроля экспрессии, например использование промотора с улучшенной активностью по сравнению с активностью, которой обладал микроорганизм до манипуляции.

Микроорганизм рода Corynebacterium по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий продуктивностью по путресцину, в который дополнительно введена активность орнитин-декарбоксилазы (ODC).

Как его используют здесь, термин “орнитин-декарбоксилаза (ODC)” относится к ферменту, способному продуцировать путресцин путем опосредования декарбоксилирования орнитина. Несмотря на то, что микроорганизм рода Corynebacterium не имеет пути биосинтеза путресцина, когда ODC введена из чужеродного источника, путресцин синтезируется и высвобождается наружу из клеток. В настоящем изобретении ODC может состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17 или может включать, без ограничения, любой белок, который имеет гомологию 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутой аминокислотной последовательностью при условии, что белок обладает по существу такой же активностью ODC.

Дополнительно, поскольку аминокислотная последовательность белка, проявляющего активность, может варьировать в зависимости от вида или штамма микроорганизма, происхождение ODC не ограничено в настоящем изобретении, и в частности, может представлять собой ODC, имеющую происхождение из E. coli. Очевидно, что любая аминокислотная последовательность, которая имеет гомологию с вышеописанными последовательностями и обладает биологической активностью по существу такой же как белок с SEQ ID NO: 17, или соответствующей таковой, также может входить в объем настоящего изобретения, хотя аминокислотная последовательность может иметь делецию, модификацию, замену или вставку в части последовательности.

Полинуклеотид, кодирующий ODC по настоящему изобретению, может включать полинуклеотиды, кодирующие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, или полинуклеотиды, кодирующие белки, имеющие гомологию 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше, и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутой аминокислотной последовательностью. В отношении полинуклеотида, кодирующего ODC, учитывая кодоны на основе вырожденности кодонов или те, которые предпочтительны для организмов для экспрессии этого регулятора, различные модификации могут быть выполнены в кодирующем участке в пределах объема без изменения аминокислотной последовательности полипептида.

Микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого активности 1) орнитин-карбамоилтрансферазы (ArgF), 2) экспортера глутамата (NCgl1221) или 3) орнитин-карбамоилтрансферазы и экспортера глутамата дополнительно снижены по сравнению с их эндогенными активностями.

В настоящем изобретении орнитин-карбамоилтрансфераза может включать, без ограничения, любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 11, или любой белок, состоящей из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше, и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями, при условии, что белок обладает по существу такой же активностью как орнитин-карбамоилтрансфераза.

Дополнительно, экспортер глутамата по настоящему изобретению может включать, без ограничения, любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 15, или любой белок, включающий аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями, при условии, что белок обладает по существу такой же активностью как экспортер глутамата.

Дополнительно, микроорганизм рода Corynebacterium по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, у которого по меньшей мере одна активность, выбранная из группы, состоящей из ацетил-гамма-глутамил-фосфатредуктазы (ArgC), ацетилглутаматсинтазы или орнитин-ацетилтрансферазы (ArgJ), ацетилглутаматкиназы (ArgB) и ацетилорнитин-аминотрансферазы (ArgD), дополнительно повышена по сравнению с их эндогенными активностями.

В настоящем изобретении ацетил-гамма-глутамил-фосфатредуктаза может включать, без ограничения, любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 21, или любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями, при условии, что белок обладает по существу такой же активностью как ацетил-гамма-глутамил-фосфатредуктаза.

Дополнительно, ацетилглутаматсинтаза или орнитин-ацетилтрансфераза может включать, без ограничения, любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23 или SEQ ID NO: 25, или любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями, при условии, что белок обладает по существу такой же активностью как ацетилглутаматсинтаза или орнитин-ацетилтрансфераза.

В настоящем изобретении ацетилглутаматкиназа может включать, без ограничения, любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 29, или любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями, при условии, что белок обладает по существу такой же активностью как ацетилглутаматкиназа.

Дополнительно, в настоящем изобретении ацетилорнитин- аминотрансфераза может включать, без ограничения, любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 33, или любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями, при условии, что белок обладает по существу такой же активностью как ацетилорнитин-аминотрансфераза.

Более того, микроорганизм рода Corynebacterium по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий продуктивностью по путресцину, у которого активность ацетилтрансферазы (NCgl1469) дополнительно понижена по сравнению с ее эндогенной активностью.

В настоящем изобретении ацетилтрансфераза может включать любой белок, который может переносить ацетильную группу на путресцин. Ацетилтрансфераза может включать, без ограничения, любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 37, или любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями, при условии, что белок обладает по существу такой же активностью как ацетилтрансфераза.

Наконец, микроорганизм рода Corynebacterium по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, обладающий продуктивностью по путресцину, у которого активность NCgl2522 дополнительно повышена по сравнению с его эндогенной активностью.

В настоящем изобретении NCgl2522 представляет собой белок, играющий роль в высвобождении путресцина, и может включать любой белок, который может переносить ацетильную группу на путресцин. Ацетилтрансфераза может включать, без ограничения, любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 41, или любой белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию последовательности 70% или больше, в частности 80% или больше, более конкретно 90% или больше, еще более конкретно 95% или больше, даже еще более конкретно 98% или больше и наиболее точно 99% или больше с вышеупомянутыми аминокислотными последовательностями, при условии, что белок обладает по существу такой же активностью как NCgl2522.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения путресцина или орнитина, включающий:

(1) культивирование микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего путресцин или орнитин в среде; и

(2) выделение путресцина или орнитина из культивированного микроорганизма или из культуры со стадии (1).

В настоящем изобретении микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum.

Микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий путресцин или орнитин, по настоящему изобретению, является таким как описано выше.

В вышеизложенном способе микроорганизм можно культивировать путем периодического культивирования, непрерывного культивирования и периодического культивирования с подпиткой, известных в данной области техники, хотя они специально не ограничены этим. В частности, в отношении условий культивирования, подходящий pH (то есть оптимальный pH от 5 до 9, в частности pH от 6 до 8 и более конкретно pH 6,8) можно поддерживать с использованием оснований (например гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислот (например фосфорной кислоты или серной кислоты), хотя они специально не ограничены этим. Дополнительно, аэробные условия можно поддерживать путем добавления кислорода и кислород-содержащей газовой смеси к клеточной культуре. Температуру культуры можно поддерживать в диапазоне от 20°C до 45°C, и в частности от 25°C до 40°C, и микроорганизм можно культивировать в течение периода примерно от 10 часов до 160 часов. Путресцин или орнитин, продуцированные путем вышеописанного культивирования, могут секретироваться в культуральную среду или оставаться внутри клеток.

Дополнительно, источники углерода, такие как сахара и углеводороды (например глюкозу, сахарозу, лактозу, фруктозу, мальтозу, мелассу, крахмал и целлюлозу), масла и жиры (например масло сои, масло семян подсолнечника, арахисовое масло и кокосовое масло), жирные кислоты (например пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту и линолевую кислоту), спирты (например глицерин и этанол) и органические кислоты (например уксусную кислоту) в культуральной среде можно использовать по отдельности или в комбинации, но не ограничиваясь этим; источники азота, такие как азот-содержащие органические соединения (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевая мука и мочевина) или неорганические соединения (например сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония), можно использовать по отдельности или в комбинации, но не ограничиваясь этим; и источники калия, такие как однозамещенный фосфат калия, гидроортофосфат калия, а также соответствующие им натрийсодержащие соли, можно использовать по отдельности или в комбинации, но не ограничиваясь этим. Дополнительно, культуральная среда может содержать другие важные стимулирующие рост вещества, включая соли металлов (например сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты и витамины.

Способ выделения путресцина или орнитина, продуцируемых во время культивирования, по настоящему изобретению может быть выполнен с использованием подходящего способа культивирования, известного в данной области техники, например периодического культивирования, непрерывного культивирования или периодического культивирования с подпиткой, и таким образом целевое вещество может быть выделено из культуры.

Примеры осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно со ссылкой на соответствующие примеры воплощений. Однако раскрытые здесь примеры воплощений предназначены исключительно для иллюстративных целей и не предназначены никаким образом ограничивать объем настоящего изобретения.

Пример 1. Получение штаммов, ослабленных по гену sugR, из штаммов, обладающих продуктивностью по путресцину

Авторы настоящего изобретения подтвердили эффект ослабления sugR, который представляет собой ген, кодирующий SugR, у штамма, обладающего продуктивностью по путресцину.

1-1. Получение штаммов, ослабленных по гену sugR, из штамма на основе ATCC13032, обладающего продуктивностью по путресцину

Для подтверждения того, имеет ли отношение ослабление гена sugR к продуктивности по путресцину у штамма на основе Corynebacterium glutamicum ATCC13032, обладающего продуктивностью по путресцину (Публикация заявки на патент Кореи No. 10-2013-0082478), был получен штамм, ослабленный по sugR. Более конкретно, штамм, ослабленный по sugR, получали путем изменения инициирующего кодона гена sugR и замены промотора на B6-ослабленный промотор (Patek M (2005) Regulation of gene expression. In: Eggeling L, Bott M (eds) Handbook of Corynebacterium glutamicum. CRC, BocaRaton).

Сначала был получен вектор для изменения инициирующего кодона гена sugR. При рассмотрении области вблизи полинуклеотидной последовательности гена, кодирующего SugR, представленной в SEQ ID NO: 2, были получены пара праймеров SEQ ID NO: 43 и 44 для получения фрагментов для гомологичной рекомбинации выше по ходу транскрипции от инициирующего кодона гена sugR и пара праймеров SEQ ID NO: 45, 46 и 47 для получения фрагмента для гомологичной рекомбинации ниже по ходу транскрипции от инициирующего кодона гена sugR. Праймеры, используемые для изменения инициирующих кодонов, приведены в Таблице 1 ниже.

Таблица 1

ПЦР проводили с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы наряду с 2 парами праймеров, соответственно, для амплификации участка выше по ходу транскрипции и участка ниже по ходу транскрипции от инициирующего кодона гена sugR, соответственно, и материал, полученный в результате ПЦР, подвергали электрофорезу для получения желаемых фрагментов. В частности, ПЦР проводили в течение 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения цепи при 72°C в течение 30 секунд. Полученные таким образом фрагменты подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле и материал из полос, соответствующих желаемым размерам, элюировали и очищали.

Вектор pDZ (патент Кореи No. 10-0924065) обрабатывали BamHI и SalI и затем ПЦР-продукты штамма ATCC13032 подвергали клонированию слиянием (fusion cloning). “Клонирование слиянием” выполняли с использованием набора для клонирования In-Fusion^® HD Cloning Kit (Clontech). По существу были получены плазмиды pDZ-1'sugR(GTG) и pDZ-1'sugR(TTG).

В случае вектора для замены в B6-ослабленный промотор была получена SEQ ID NO: 48, представленная в Таблице 2 ниже, для получения вектора.

Таблица 2

ПЦР проводили с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 43 и 44 для получения фрагмента для гомологичной рекомбинации фрагмента выше по ходу транскрипции от инициирующего кодона гена sugR и пары праймеров SEQ ID NO: 48 и 47 для получения фрагмента для гомологичной рекомбинации ниже по ходу транскрипции от инициирующего кодона гена sugR, которые были получены при рассмотрении области вблизи полинуклеотидной последовательности гена, кодирующего SugR, представленной в SEQ ID NO: 2, и область выше по ходу транскрипции и область ниже по ходу транскрипции от инициирующего кодона гена sugR амплифицировали, соответственно, и материал, полученный в результате ПЦР, подвергали электрофорезу для получения желаемых фрагментов. Полученные таким образом фрагменты подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле и материал из полос, соответствующих желаемым размерам, элюировали и очищали. Вектор pDZ обрабатывали BamHI и SalI и затем ПЦР-продукты штамма ATCC13032 подвергали клонированию слиянием. Клонирование слиянием выполняли с использованием набора для клонирования In-Fusion^® HD Cloning Kit (Clontech). По существу была получена плазмида pDZ-1'sugR(B6).

Плазмиды pDZ-1'sugR(GTG), pDZ-1'sugR(TTG) и pDZ-1'sugR(B6) вводили в микроорганизм рода Corynebacterium KCCM11240P (Публикация заявки на патент Кореи No. 10-2013-0082478) путем электропорации для получения трансформантов и трансформанты высевали на чашку со средой BHIS (бульон с сердечно-мозговым экстрактом 37 г/л, сорбит 91 г/л и агар 2%), содержащей канамицин (25 мкг/мл) и X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолин-D-галактозид), и культивировали для получения колоний. Среди этих колоний отбирали голубые колонии, и таким образом были отобраны штаммы, в которые были введены плазмиды pDZ-1'sugR(GTG), pDZ-1'sugR(TTG) и pDZ-1'sugR(B6).

Выбранные штаммы культивировали при встряхивании (30°C, 8 часов) в среде CM (глюкоза 10 г/л, полипептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, мясной экстракт 5 г/л, NaCl 2,5 г/л, мочевина 2 г/л, pH 6,8) и последовательно разводили от 10^-4 до 10^-10, высевали на твердую среду, содержащую X-gal, и культивировали с образованием колоний.

Среди образованных таким образом колоний отбирали белые колонии, которые появлялись в относительно небольшом количестве, и в итоге выбирали штаммы, у которых инициирующий кодон sugR был заменен на GTG или TTG путем вторичного кроссинговера, или штаммы, у которых промотор был заменен на B6. В отношении отобранных в итоге штаммов проводили ПЦР с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 43 и 47 и подтвердили, что инициирующий кодон sugR был заменен на GTG или TTG либо промотор был преобразован в B6-ослабленный промотор, и модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum получили название KCCM11240P sugR (GTG), KCCM11240P sugR (TTG), KCCM11240P sugR (B6).

1-2. Получение штамма, ослабленного по гену sugR, из штамма на основе ATCC13869, обладающего продуктивностью по путресцину

DAB12-a ΔNCgl1469 (Публикация заявки на патент Кореи No. 10-2014-0115244), который представляет собой штамм на основе Corynebacterium glutamicum ATCC13869, обладающий продуктивностью по путресцину, получил название DAB12-b, и штамм, ослабленный по sugR, был получен на основе штамма DAB12-b.

В частности, для подтверждения последовательностей гена, кодирующего SugR, происходящих из Corynebacterium glutamicum ATCC13869, и белка, экспрессируемого на их основе, проводили ПЦР с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13869 в качестве матрицы наряду с парой праймеров SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 49.

Таблица 3

Более конкретно, ПЦР проводили в течение 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения цепи при 72°C в течение 1 минуты и 30 секунд.

Полученные таким образом ПЦР-продукты разделяли путем электрофореза и проводили анализ последовательностей, и в результате было подтверждено, что ген, кодирующий SugR, происходящий из Corynebacterium glutamicum ATCC13869, включает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. Сравнение белковой последовательности, кодируемой на ее основе, и аминокислотной последовательности SugR, происходящего из Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (SEQ ID NO: 1), выявило, что их гомология составила 99%.

Для изменения инициирующего кодона sugR, происходящего из Corynebacterium glutamicum ATCC13869, и замены B6-ослабленного промотора проводили ПЦР как в Примере 1-1 с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13869 в качестве матрицы наряду с праймерами, описанными в Таблицах 1 и 2 выше, и ПЦР-фрагменты области выше по ходу транскрипции и области ниже по ходу транскрипции от инициирующего кодона sugR амплифицировали, соответственно, и затем подвергали электрофорезу для получения желаемых фрагментов. В частности, ПЦР проводили в течение 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения цепи при 72°C в течение 30 секунд. Полученные таким образом фрагменты подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле и материал из полос, соответствующих желаемому размеру, элюировали и очищали.

Вектор pDZ обрабатывали BamHI и SalI и затем ПЦР-продукты штамма ATCC13032 подвергали клонированию слиянием. Клонирование слиянием выполняли с использованием набора для клонирования In-Fusion^® HD Cloning Kit (Clontech). По существу были получены плазмиды pDZ-2'sugR(GTG), pDZ-2'sugR(TTG) и pDZ-2'sugR(B6).

Плазмидами pDZ-2'sugR(GTG), pDZ-2'sugR(TTG) и pDZ-2'sugR(B6) трансформировали Corynebacterium glutamicum DAB12-b таким же образом, как в Примере 1-1, и отбирали штаммы, у которых инициирующий кодон sugR был заменен и/или промотор был преобразован в B6-ослабленный промотор. Отобранные таким образом модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum получили названия DAB12-b sugR(GTG), DAB12-b sugR(TTG) и DAB12-b sugR(B6), соответственно.

Пример 2. Получение штамма, усиленного по gltA, из штамма, обладающего продуктивностью по путресцину

Для подтверждения действия по усилению активности gltA, который представляет собой цитратсинтазу, у штамма, обладающего продуктивностью по путресцину, был получен модифицированный штамм, у которого ген gltA был введен в ген транспозона в хромосоме штамма, обладающего продуктивностью по путресцину. Использовали вектор pDZTn (WO 2009/125992) для трансформации, который может вводить ген в хромосому, и область гена транспозона микроорганизма рода Corynebacterium.

2-1. Получение штамма, усиленного по gltA, из штамма на основе ATCC13032, обладающего продуктивностью по путресцину

Фрагменты гена gltA амплифицировали с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы наряду с праймерами SEQ ID NO: 50 и 51 (Таблица 4). В частности, ПЦР проводили в течение 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения цепи при 72°C в течение 30 секунд или 1 минуты и 30 секунд. Полученные таким образом фрагменты подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле, и материал из полос, соответствующих желаемым размерам, элюировали и очищали.

Вектор pDZTn обрабатывали SpeI и затем ПЦР-продукты подвергали клонированию слиянием, соответственно. Клонирование слиянием выполняли с использованием набора для клонирования In-Fusion^® HD Cloning Kit (Clontech). Полученная таким образом плазмида получила название pDZTn1'-gltA.

Таблица 4

Полученную таким образом плазмиду вводили в штамм KCCM11240P путем электропорации для получения трансформанта и трансформант культивировали при встряхивании (30°C, 8 часов) в среде CM (глюкоза 10 г/л, полипептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, мясной экстракт 5 г/л, NaCl 2,5 г/л, мочевина 2 г/л, pH 6,8), последовательно разведенный от 10^-4 до 10^-10, высевали на твердую среду, содержащую X-gal, и культивировали с образованием колоний.

Среди образованных таким образом колоний отбирали белые колонии, которые появлялись в относительно небольшом количестве, и в итоге был отобран штамм, которому вторичным кроссинговером был введен ген, кодирующий gltA. В отношении отобранных в итоге штаммов, было подтверждено, что ПЦР была выполнена с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 50 и 51, и что ген, кодирующий gltA, был введен в них, и этот модифицированный штамм Corynebacterium glutamicum получил название KCCM11240P Tn::gltA.

2-2. Получение штамма, усиленного по gltA, из штамма на основе ATCC13869, обладающего продуктивностью по путресцину

В отношении штамма DAB12-b, используемого в Примере 1-2, был получен штамм, усиленный по gltA.

В частности, для подтверждения последовательностей гена, кодирующего gltA, имеющий происхождение от Corynebacterium glutamicum ATCC13869, и белка, экспрессируемого на их основе, проводили ПЦР с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13869 в качестве матрицы наряду с парой праймеров SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51.

В частности, ПЦР проводили в течение 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения цепи при 72°C в течение 1 минуты и 30 секунд. Полученные таким образом ПЦР-продукты разделяли электрофорезом и подвергали анализу последовательности, и в результате было подтверждено, что ген, кодирующий gltA, имеющий происхождение из Corynebacterium glutamicum ATCC13869, включает полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8. Сравнение кодируемой ею белковой последовательности и аминокислотной последовательности gltA, имеющей происхождение от Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (SEQ ID NO: 5), выявило, что гомология между ними составляет 99%.

Для усиления gltA, имеющего происхождение из Corynebacterium glutamicum ATCC13869, ПЦР проводили как в Примере 2-1 с использованием геномной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13869 в качестве матрицы наряду с праймерами SEQ ID NO: 50 и 51 для амплификации фрагментов гена. В частности, ПЦР проводили в течение 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и удлинения цепи при 72°C в течение 30 секунд или 1 минуты 30 секунд. Полученные таким образом ПЦР-фрагменты подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле и материал из полос, соответствующих желаемым размерам, элюировали и очищали.

Вектор pDZTn обрабатывали SpeI и затем ПЦР-продукты подвергали клонированию слиянием, соответственно. Клонирование слиянием выполняли с использованием набора для клонирования In-Fusion^® HD Cloning Kit (Clontech). Полученная таким образом плазмида получила название pDZTn2'-gltA. Плазмидой pDZTn2'-gltA трансформировали штамм Corynebacterium glutamicum DAB12-b также как в Примере 2-1 и таким образом отбирали штамм, у которого gltA был усилен. Отобранный таким образом модифицированный штамм Corynebacterium glutamicum получил название DAB12-b Tn:gltA.

Пример 3. Получение штаммов, обладающих продуктивностью по путресцину, с объединением ослабления по sugR и усиления gltA и подтверждение продуктивности этих штаммов по путресцину

Для подтверждения улучшения продуктивности по путресцину штаммов, ослабленных по sugR, полученных в Примерах 1-1 и 1-2 путем вставки гена gltA, ген gltA вводили в ген транспозона. В частности, использовали векторы pDZTn1'-gltA и pDZTn2'-gltA, полученные в Примерах 2-1 и 2-2.

В частности, плазмидой pDZTn1'-gltA трансформировали Corynebacterium glutamicum KCCM11240P sugR(GTG), -KCCM11240P sugR(TTG) и -KCCM11240P sugR(B6) таким же образом как в Примере 2-1 для получения штаммов, усиленных по gltA. Полученные таким образом модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum получили названия KCCM11240P sugR(GTG) Tn::gltA, KCCM11240P sugR(TTG) Tn::gltA и KCCM11240P sugR(B6) Tn::gltA, соответственно, и среди них KCCM11240P sugR(TTG) Tn::gltA (Corynebacterium glutamicum CC01-1147) был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов (KCCM) 28 ноября 2014 года под номером доступа KCCM11615P.

Дополнительно, плазмидой pDZTn2'-gltA трансформировали Corynebacterium glutamicum DAB12-b sugR(GTG), -DAB12-b sugR(TTG) и -DAB12-b sugR(B6) таким же образом как в Примере 2-2 для получения штаммов, усиленных по gltA. Полученные таким образом модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum получили названия DAB12-b sugR(GTG) Tn::gltA, DAB12-b sugR(TTG) Tn::gltA и DAB12-b sugR(B6) Tn::gltA, соответственно.

Пример 4. Оценка продуктивности по путресцину штаммов, обладающих продуктивностью по путресцину, с объединением ослабления sugR и усиления gltA

Для подтверждения эффекта ослабления sugR и усиления gltA у штаммов, обладающих продуктивностью по путресцину, в отношении продуцирования путресцина сравнивали продуктивность по путресцину модифицированных штаммов Corynebacterium glutamicum, обладающих продуктивностью по путресцину, полученных в Примерах 1, 2 и 3.

Более конкретно, 6 различных типов модифицированных штаммов Corynebacterium glutamicum (а именно KCCM11240P sugR (GTG) Tn::gltA/ KCCM11240P sugR (TTG) Tn::gltA/ KCCM11240P sugR (B6) Tn::gltA/ DAB12-b sugR (GTG) Tn::gltA/ DAB12-b sugR (TTG) Tn::gltA и DAB12-b sugR (B6) Tn::gltA)) и 2 различных типа родительских штаммов (а именно KCCM11240P и DAB12-b) высевали соответственно на чашки со средой CM (1% глюкозы, 1% полипептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% мясного экстракта, 0,25% NaCl, 0,2% мочевины, 100 мкл 50% NaOH, 2% агара, pH 6,8, в расчете на 1 л), содержащей 1 мМ аргинин, и культивировали при 30°C в течение 24 часов.

Каждый из культивируемых таким образом штаммов в количестве примерно одной платиновой петли инокулировали в 25 мл среды для титрования (8% глюкозы, 0,25% соевого белка, 0,50% твердой фазы кукурузного экстракта, 4% (NH₄)₂SO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄⋅7H₂O, 0,15% мочевины, 100 г биотина, 3 мг тиамина HCl, 3 мг кальций-пантотеновой кислоты, 3 мг никотинамида, 5% CaCO₃, в расчете на 1 л), и культивировали при 30°C со встряхиванием со скоростью 200 об/мин в течение 50 часов.

В среду ко всем культивируемым штаммам добавляли 1 мМ аргинин. После завершения культивирования измеряли концентрацию путресцина, полученного в каждой культуре, и результаты представлены в Таблице 5 ниже.

Таблица 5

Как показано в Таблице 5 выше, модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum с ослабленным sugR или усиленным gltA демонстрировали увеличение продуктивности по путресцину по сравнению с немодифицированным штаммом KCCM11240P на величину от 3% до 9%, и также модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum с одновременным ослабленным sugR и усиленным gltA демонстрировали увеличение продуктивности по путресцину на величину от 9% до 17%.

Кроме того, модифицированные варианты штамма DAB12-b с ослабленным sugR или усиленным gltA демонстрировали увеличение продуктивности по путресцину по сравнению с немодифицированным штаммом на величину от 4% до 9%, и также модифицированные варианты штамма DAB12-b с одновременно ослабленным sugR и усиленным gltA демонстрировали увеличение продуктивности по путресцину на величину от 10% до 13%.

Пример 5. Получение штаммов с повышенной способностью к секреции путресцина на основе штаммов, обладающих продуктивностью по путресцину, с объединением ослабления sugR и усиления gltA, и подтверждение продуктивности этих штаммов по путресцину

5-1. Получение штаммов с повышенной способностью к секреции путресцина на основе штаммов с объединением ослабления sugR и усиления gltA

Для подтверждения того, можно ли у штамма KCCM11401P с повышенной способностью к секреции путресцина (Публикация заявки на патент Кореи No. 10-2014-0115244) улучшить продуктивность по путресцину путем ослабления активности гена sugR и усиления активности гена gltA, были получены модифицированные штаммы.

Более конкретно, сначала плазмидами pDZ-1'sugR(GTG), pDZ-1'sugR(TTG) и pDZ-1'sugR(B6), полученными в Примере 1-1, трансформировали Corynebacterium glutamicum KCCM 11401P, и из них были выбраны штаммы, у которых инициирующий кодон sugR был преобразован в TTG, что в результате приводило к ослаблению sugR. Отобранные таким образом модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum получили названия KCCM11401P sugR(GTG), KCCM11401P sugR(TTG) и KCCM11401P sugR(B6), соответственно.

Затем, для подтверждения того, может ли продуктивность по путресцину быть улучшена путем повышения активности гена gltA, ген gltA вводили в ген транспозона штаммов с ослабленным геном sugR, полученных выше. В частности, использовали вектор pDZTn1'-gltA, полученный в Примере 2-1.

Более конкретно, плазмидой pDZTn1'-gltA, полученной в Примере 2-1, трансформировали KCCM11401P sugR(GTG), KCCM11401P sugR(TTG) и KCCM11401P sugR(B6), и отбирали штаммы, усиленные по gltA. Отобранные таким образом модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum получили названия KCCM11401P sugR(GTG) Tn::gltA, KCCM11401P sugR(TTG) Tn::gltA и KCCM11401P sugR(B6) Tn::gltA.

5-2. Оценка штаммов с повышенной способностью к секреции путресцина на основе штаммов, обладающих продуктивностью по путресцину, с объединением ослабления sugR и усиления gltA в отношении продуктивности по путресцину

Для подтверждения эффекта ослабления sugR и усиления gltA у штаммов, обладающих продуктивностью по путресцину, в отношении их продуцирования путресцина сравнивали продуктивность по путресцину у модифицированных штаммов Corynebacterium glutamicum, полученных в Примере 5-1.

Более конкретно, 7 различных типов модифицированных штаммов Corynebacterium glutamicum (то есть, KCCM11401P sugR(GTG), KCCM11401P sugR(TTG), KCCM11401P sugR(B6), KCCM11401P Tn::gltA, KCCM11401P sugR(GTG) Tn::gltA, KCCM11401P sugR(TTG) Tn::gltA и KCCM11401P sugR(B6) Tn::gltA) и один родительский штамм (KCCM11401P) высевали, соответственно, на чашку со средой CM (1% глюкозы, 1% полипептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% мясного экстракта, 0,25% NaCl, 0,2% мочевины, 100 мкл 50% NaOH, 2% агара, pH 6,8, в расчете на 1 л), содержащей 1 мМ аргинин, и культивировали при 30°C в течение 24 часов.

Каждый из культивируемых таким образом штаммов в количестве примерно одной платиновой петли инокулировали в 25 мл среды для титрования (8% глюкозы, 0,25% соевого белка, 0,50% твердой фазы кукурузного экстракта, 4% (NH₄)₂SO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄⋅7H₂O, 0,15% мочевины, 100 г биотина, 3 мг тиамина HCl, 3 мг кальций-пантотеновой кислоты, 3 мг никотинамида, 5% CaCO₃ 1 л, в расчете на 1 л), и культивировали при 30°C со встряхиванием со скоростью 200 об/мин в течение 50 часов.

Таблица 6

Как показано в Таблице 6 выше, модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum с ослабленным sugR или усиленным gltA демонстрировали повышение продуктивности по путресцину по сравнению с немодифицированным штаммом KCCM11401P на величину от 2% до 6%, и также модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum с одновременно ослабленным sugR и усиленным gltA демонстрировали повышение продуктивности по путресцину на величину от 9% до 15% по продуктивности по путресцину. Было подтверждено, что эти результаты согласуются с интерпретацией результатов, представленных в Таблице 5.

Пример 6. Получение штаммов, ослабленных по sugR, из штамма, обладающего продуктивностью по орнитину

Для подтверждения того, оказывает ли ослабление sugR, происходящего из Corynebacterium glutamicum ATCC13032, эффект в отношении продуктивности по орнитину, были получены модифицированные штаммы с использованием векторов, полученных в Примере 1-1.

Плазмиды, полученные в Примере 1-1, то есть pDZ-1'sugR(GTG), pDZ-1'sugR(TTG) и pDZ-1'sugR(B6), вводили в штамм KCCM11137P (Патент Кореи No. 10-1372635), который был получен с использованием Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве родительского штамма, путем электропорации для получения трансформантов и трансформанты высевали на чашку со средой BHIS (бульон с сердечно-мозговым экстрактом 37 г/л, сорбит 91 г/л и агар 2%), содержащей канамицин (25 мкг/мл) и X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолин-D-галактозид), и культивировали с получением колоний. Среди колоний отбирали голубые колонии, и таким образом были отобраны штаммы, в которые были введены плазмиды pDZ-1'sugR(GTG), pDZ-1'sugR(TTG) и pDZ-1'sugR(B6).

Выбранные штаммы культивировали при встряхивании (30°C, 8 часов) в среде CM (глюкоза 10 г/л, полипептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, мясной экстракт 5 г/л, NaCl 2,5 г/л, мочевина 2 г/л, pH 6,8) и последовательно разводили от 10^-4 до 10^-10, высевали на твердую среду, содержащую X-gal, и культивировали с образованием колоний. Среди колоний, образованных таким образом, отбирали белые колонии, которые появлялись в относительно небольшом количестве, и в итоге отбирали штаммы, у которых инициирующий кодон sugR был заменен на GTG или TTG путем вторичного кроссинговера, или штаммы, у которых промотор был заменен на B6. В отношении отобранных в итоге штаммов проводили ПЦР с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 43 и 47 и затем подтверждали, что инициирующий кодон sugR был заменен на GTG или TTG. Полученные модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum получили названия KCCM11137P sugR(GTG), KCCM11137P sugR(TTG) и KCCM11137P sugR(B6), соответственно.

Пример 7. Получение штаммов, усиленных по gltA, из штаммов, обладающих продуктивностью по орнитину

Для подтверждения эффекта усиления гена gltA у штамма, обладающего продуктивностью по орнитину, на его продуцировние орнитина, был получен модифицированный штамм путем вставки гена gltA в хромосому штамма, обладающего продуктивностью по орнитину, с использованием векторов, полученных в Примере 2-1.

Более конкретно, векторы, полученные в Примере 2-1, вводили в штамм KCCM11137P (Патент Кореи No. 10-1372635) путем электропорации для получения трансформантов и трансформанты культивировали при встряхивании (30°C, 8 часов) в среде CM (глюкоза 10 г/л, полипептон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, мясной экстракт 5 г/л, NaCl 2,5 г/л, мочевина 2 г/л, pH 6,8), последовательно разводили от 10^-4 до 10^-10, высевали на твердую среду, содержащую X-gal, и культивировали с образованием колоний.

Среди колоний, образованных таким образом, отбирали белые колонии, которые появлялись в относительно небольшом количестве, и в итоге отбирали штаммы, которым был введен ген, кодирующий gltA, путем вторичного кроссинговера. В отношении отобранных в итоге штаммов проводили ПЦР с использованием пары праймеров SEQ ID NO: 50 и 51 и подтверждали, что им был введен ген, кодирующий gltA, и модифицированный штамм Corynebacterium glutamicum получил название KCCM11137P Tn::gltA.

Пример 8. Получение штаммов с объединением ослабления sugR и усиления gltA и подтверждение продуктивности этих штаммов по путресцину

8-1. Получение штаммов на основе ATCC13032, обладающих продуктивностью по орнитину, с объединением ослабления sugR и усиления gltA

Для подтверждения действия по усилению активности продуктивности по орнитину у ослабленных по sugR KCCM11137P sugR(GTG), KCCM11137P sugR(TTG) и KCCM11137P sugR(B6), полученных в Примере 6 путем вставки гена gltA в хромосому, ген gltA вводили в ген транспозона. В частности, использовали вектор pDZTn1'-gltA, полученный в Примере 2-1.

Плазмидой pDZTn1'-gltA трансформировали Corynebacterium glutamicum KCCM11137P sugR TTG таким же образом как в Примере 2-1 и отбирали штаммы, усиленные по gltA. Отобранные таким образом модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum получили названия KCCM11137P sugR(GTG) Tn::gltA, KCCM11137P sugR(TTG) Tn::gltA и KCCM11137P sugR(B6) Tn::gltA, соответственно.

8-2. Оценка штаммов с объединением ослабления sugR и усиления gltA в отношении продуктивности по орнитину

Для подтверждения эффекта ослабления sugR и усиления gltA у штаммов, обладающих продуктивностью по орнитину, на их продуцирование орнитина, сравнивали продуктивность по орнитину у модифицированных штаммов Corynebacterium glutamicum, полученных в Примере 8-1.

Более конкретно, 7 различных типов модифицированных штаммов Corynebacterium glutamicum (то есть, KCCM11137P sugR(GTG), KCCM11137P sugR(TTG), KCCM11137P sugR(B6), KCCM11137P Tn::gltA, KCCM11137P sugR(GTG) Tn::gltA, KCCM11137P sugR(TTG) Tn::gltA и KCCM11137P sugR(B6) Tn::gltA) и один родительский штамм (KCCM11137P), соответственно, высевали на чашку со средой CM (1% глюкозы, 1% полипептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% мясного экстракта, 0,25% NaCl, 0,2% мочевины, 100 мкл 50% NaOH, 2% агара, pH 6,8, в расчете на 1 л), содержащей 1 мМ аргинин, и культивировали при 30°C в течение 24 часов.

Каждый из культивированных таким образом штаммов в количестве примерно одной платиновой петли инокулировали в 25 мл среды для титрования (8% глюкозы, 0,25% соевого белка, 0,50% твердой фазы кукурузного экстракта, 4% (NH₄)₂SO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄⋅7H₂O, 0,15% мочевины, 100 г биотина, 3 мг тиамина HCl, 3 мг кальций-пантотеновой кислоты, 3 мг никотинамида, 5% CaCO₃, в расчете на 1 л), и культивировали со встряхиванием со скоростью 200 об/мин при 30°C в течение 50 часов. В среду ко всем культурам штаммов добавляли 1 мМ аргинин. По завершении культивирования измеряли концентрацию орнитина, продуцированного в каждой культуре, и результаты представлены в Таблице 7 ниже.

Таблица 7

Как показано в Таблице 7 выше, модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum с ослабленным sugR или усиленным gltA показали увеличение продуктивности по орнитину по сравнению с немодифицированным штаммом KCCM11137P на величину от 7% до 9%, и также модифицированные штаммы Corynebacterium glutamicum с одновременно ослабленным sugR и усиленным gltA демонстрировали увеличение продуктивности по орнитину на величину от 12% до 17% по продуктивности по орнитину.

В заключение, было подтверждено, что у штамма Corynebacterium, продуцирующего путресцин или орнитин, продуцирование путресцина и орнитина может быть увеличено путем ослабления sugR или усиления gltA, и когда gltA был усилен при одновременном ослаблении sugR, продуцирование путресцина и орнитина увеличивалось в большей степени.

На основании вышеизложенного специалист в области техники, к которой принадлежит данное изобретение, понимает, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отступления от технических идей или существенных признаков настоящего изобретения. В этом отношении примеры воплощений, раскрытые здесь, служат исключительно для иллюстративных целей и не предназначены ограничивать объем настоящего изобретения. С другой стороны, настоящее изобретение предназначено охватывать не только примеры воплощений, но также различные варианты, модификации, эквиваленты и другие воплощения, которые могут быть включены в пределах идеи и объема настоящего изобретения как определено в прилагаемой формуле.

--->

Перечень последовательностей

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION

<120> MICROORGANISMS FOR PRODUCING PUTRESCINE OR ORNITHINE AND PROCESS

FOR PRODUCING PUTRESCINE OR ORNITHINE USING THEM

<130> OPA16044

<150> KR10-2015-0090021

<151> 2015-06-24

<160> 51

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 259

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 SugR

<400> 1

Met Tyr Ala Glu Glu Arg Arg Arg Gln Ile Ala Ser Leu Thr Ala Val

1 5 10 15

Glu Gly Arg Val Asn Val Thr Glu Leu Ala Gly Arg Phe Asp Val Thr

20 25 30

Ala Glu Thr Ile Arg Arg Asp Leu Ala Val Leu Asp Arg Glu Gly Ile

35 40 45

Val His Arg Val His Gly Gly Ala Val Ala Thr Gln Ser Phe Gln Thr

50 55 60

Thr Glu Leu Ser Leu Asp Thr Arg Phe Arg Ser Ala Ser Ser Ala Lys

65 70 75 80

Tyr Ser Ile Ala Lys Ala Ala Met Gln Phe Leu Pro Ala Glu His Gly

85 90 95

Gly Leu Phe Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Thr Ala Leu Ala Asp Leu

100 105 110

Ile Ser Glu His Pro Ser Ser Lys Gln Trp Ser Ile Val Thr Asn Cys

115 120 125

Leu Pro Ile Ala Leu Asn Leu Ala Asn Ala Gly Leu Asp Asp Val Gln

130 135 140

Leu Leu Gly Gly Ser Val Arg Ala Ile Thr Gln Ala Val Val Gly Asp

145 150 155 160

Thr Ala Leu Arg Thr Leu Ala Leu Met Arg Ala Asp Val Val Phe Ile

165 170 175

Gly Thr Asn Ala Leu Thr Leu Asp His Gly Leu Ser Thr Ala Asp Ser

180 185 190

Gln Glu Ala Ala Met Lys Ser Ala Met Ile Thr Asn Ala His Lys Val

195 200 205

Val Val Leu Cys Asp Ser Thr Lys Met Gly Thr Asp Tyr Leu Val Ser

210 215 220

Phe Gly Ala Ile Ser Asp Ile Asp Val Val Val Thr Asp Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ala Ser Phe Val Glu Gln Leu Arg Glu Arg Asp Val Glu Val Val

245 250 255

Ile Ala Glu

<210> 2

<211> 780

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 sugR

<400> 2

atgtacgcag aggagcgccg tcgacagatt gcctcattaa cggcagttga gggacgtgta 60

aatgtcacag aattagcggg ccgattcgat gtcactgcag agacgattcg acgagacctt 120

gcggtgctag accgcgaggg aattgttcac cgcgttcacg gtggcgcagt agccacccaa 180

tctttccaaa ccacagagtt gagcttggat actcgtttca ggtctgcatc gtcagcaaag 240

tactccattg ccaaggcagc gatgcagttc ctgcccgctg agcatggcgg actgttcctc 300

gatgcgggaa ctactgttac tgctttggcc gatctcattt ctgagcatcc tagctccaag 360

cagtggtcga tcgtgaccaa ctgcctcccc atcgcactta atctggccaa cgccgggctt 420

gatgatgtcc agctgcttgg aggaagcgtt cgcgcgatca cccaggctgt tgtgggtgac 480

actgcgcttc gtactctcgc gctgatgcgt gcggatgtag tgttcatcgg caccaacgcg 540

ttgacgttgg atcacggatt gtctacggcc gattcccaag aggctgccat gaaatctgcg 600

atgatcacca acgcccacaa ggtggtggtg ttgtgtgact ccaccaagat gggcaccgac 660

tacctcgtga gctttggcgc aatcagcgat atcgatgtgg tggtcaccga tgcgggtgca 720

ccagcaagtt tcgttgagca gttgcgagaa cgcgatgtag aagttgtgat tgcagaatga 780

780

<210> 3

<211> 257

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 SugR

<400> 3

Met Tyr Ala Glu Glu Arg Arg Arg Gln Ile Ala Ser Leu Thr Ala Val

1 5 10 15

Glu Gly Arg Val Asn Val Thr Glu Leu Ala Gly Arg Phe Asp Val Thr

20 25 30

Ala Glu Thr Ile Arg Arg Asp Leu Ala Val Leu Asp Arg Glu Gly Ile

35 40 45

Val His Arg Val His Gly Gly Ala Val Ala Thr Gln Ser Phe Gln Thr

50 55 60

Thr Glu Leu Ser Leu Asp Thr Arg Phe Arg Ser Ala Ser Ser Ala Lys

65 70 75 80

Tyr Ser Ile Ala Lys Ala Ala Met Gln Phe Leu Pro Ala Glu His Gly

85 90 95

Gly Leu Phe Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Thr Ala Leu Ala Asp Leu

100 105 110

Ile Ser Glu His Pro Ser Ala Lys Gln Trp Ser Ile Val Thr Asn Cys

115 120 125

Leu Pro Ile Ala Leu Asn Leu Ala Asn Ala Gly Leu Asp Asp Val Gln

130 135 140

Leu Leu Gly Gly Ser Val Arg Ala Ile Thr Gln Ala Val Val Gly Asp

145 150 155 160

Thr Ala Leu Arg Thr Leu Ala Leu Met Arg Ala Asp Val Val Phe Ile

165 170 175

Gly Thr Asn Ala Leu Thr Leu Asp His Gly Leu Ser Thr Ala Asp Ser

180 185 190

Gln Glu Ala Ala Met Lys Ser Ala Met Ile Thr Asn Ala His Lys Val

195 200 205

Val Val Leu Cys Asp Ser Thr Lys Met Gly Thr Asp Tyr Leu Val Ser

210 215 220

Phe Gly Ala Ile Ser Asp Ile Asp Val Val Val Thr Asp Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Ala Ser Phe Val Glu Gln Leu Arg Glu Arg Asp Val Glu Val Val

245 250 255

Ile

<210> 4

<211> 780

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 sugR

<400> 4

atgtacgcag aggagcgccg tcgacagatt gcctcattaa cggcagttga gggacgtgta 60

aatgtcacag aattagcggg ccgattcgat gtcactgcag agacgattcg acgagacctt 120

gcggtgctag accgcgaggg aattgttcac cgcgttcacg gtggcgcagt agccacccaa 180

tctttccaaa ccacagagtt gagcttggat actcgtttca ggtctgcatc gtcagcaaag 240

tactccattg ccaaggcagc gatgcagttc ctgcccgctg agcatggcgg actgttcctc 300

gatgcgggaa ctactgttac tgctttggcc gatctcattt ctgagcatcc tagcgccaag 360

cagtggtcga tcgtgaccaa ctgcctcccc atcgcactta atctggccaa cgccgggctt 420

gatgatgtcc agctacttgg aggaagcgtt cgcgcgatca cccaggctgt tgtgggtgac 480

actgcgcttc gtactctcgc gctgatgcgt gcggatgtag tgttcatcgg caccaacgcg 540

ttgacgttgg atcacggatt gtctacggcc gattcccaag aggctgccat gaaatctgcg 600

atgatcacca acgcccacaa ggtggtggtg ttgtgtgact ccaccaagat gggcaccgac 660

tacctcgtga gctttggcgc aatcagcgat atcgatgtgg tggtcaccga tgcgggtgca 720

ccagcaagtt tcgttgagca gttgcgagaa cgcgatgtag aagttgtgat tgcagaatga 780

780

<210> 5

<211> 437

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 GltA

<400> 5

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 6

<211> 1314

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 gltA

<400> 6

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggacca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aatgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagagcaac cacggtggcg acgcaaccga gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tacttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaacga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 7

<211> 437

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 GltA

<400> 7

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

1 5 10 15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

20 25 30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

35 40 45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

50 55 60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

85 90 95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

100 105 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

115 120 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

130 135 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145 150 155 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

165 170 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

195 200 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

210 215 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225 230 235 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

245 250 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

260 265 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

290 295 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

325 330 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

340 345 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Cys Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

355 360 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

370 375 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385 390 395 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile

405 410 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Lys Glu Ser Arg Lys Leu Val

420 425 430

Pro Arg Glu Glu Arg

435

<210> 8

<211> 1314

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 gltA

<400> 8

atgtttgaaa gggatatcgt ggctactgat aacaacaagg ctgtcctgca ctaccccggt 60

ggcgagttcg aaatggacat catcgaggct tctgagggta acaacggtgt tgtcctgggc 120

aagatgctgt ctgagactgg actgatcact tttgacccag gttatgtgag cactggctcc 180

accgagtcga agatcaccta catcgatggc gatgcgggaa tcctgcgtta ccgcggctat 240

gacatcgctg atctggctga gaatgccacc ttcaacgagg tttcttacct acttatcaac 300

ggtgagctac caaccccaga tgagcttcac aagtttaacg acgagattcg ccaccacacc 360

cttctggacg aggacttcaa gtcccagttc aacgtgttcc cacgcgacgc tcacccaatg 420

gcaaccttgg cttcctcggt taacattttg tctacctact accaggatca gctgaaccca 480

ctcgatgagg cacagcttga taaggcaacc gttcgcctca tggcaaaggt tccaatgctg 540

gctgcgtacg cacaccgcgc acgcaagggt gctccttaca tgtacccaga caactccctc 600

aacgcgcgtg agaacttcct gcgcatgatg ttcggttacc caaccgagcc atacgagatc 660

gacccaatca tggtcaaggc tctggacaag ctgctcatcc tgcacgctga ccacgagcag 720

aactgctcca cctccaccgt tcgtatgatc ggttccgcac aggccaacat gtttgtctcc 780

atcgctggtg gcatcaacgc tctgtccggc ccactgcacg gtggcgcaaa ccaggctgtt 840

ctggagatgc tcgaagacat caagaacaac cacggtggcg acgcaaccgc gttcatgaac 900

aaggtcaaga acaaggaaga cggcgtccgc ctcatgggct tcggacaccg cgtttacaag 960

aactacgatc cacgtgcagc aatcgtcaag gagaccgcac acgagatcct cgagcacctc 1020

ggtggcgacg atcttctgga tctggcaatc aagctggaag aaattgcact ggctgatgat 1080

tgcttcatct cccgcaagct ctacccgaac gtagacttct acaccggcct gatctaccgc 1140

gcaatgggct tcccaactga cttcttcacc gtattgttcg caatcggtcg tctgccagga 1200

tggatcgctc actaccgcga gcagctcggt gcagcaggca acaagatcaa ccgcccacgc 1260

caggtctaca ccggcaagga atcccgcaag ttggttcctc gcgaggagcg ctaa 1314

<210> 9

<211> 319

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ArgF

<400> 9

Met Thr Ser Gln Pro Gln Val Arg His Phe Leu Ala Asp Asp Asp Leu

1 5 10 15

Thr Pro Ala Glu Gln Ala Glu Val Leu Thr Leu Ala Ala Lys Leu Lys

20 25 30

Ala Ala Pro Phe Ser Glu Arg Pro Leu Glu Gly Pro Lys Ser Val Ala

35 40 45

Val Leu Phe Asp Lys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Phe Ser Phe Asp Ala

50 55 60

Gly Ile Ala His Leu Gly Gly His Ala Ile Val Val Asp Ser Gly Ser

65 70 75 80

Ser Gln Met Gly Lys Gly Glu Ser Leu Gln Asp Thr Ala Ala Val Leu

85 90 95

Ser Arg Tyr Val Glu Ala Ile Val Trp Arg Thr Tyr Ala His Ser Asn

100 105 110

Phe His Ala Met Ala Glu Thr Ser Thr Val Pro Leu Val Asn Ser Leu

115 120 125

Ser Asp Asp Leu His Pro Cys Gln Ile Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ile

130 135 140

Val Glu Asn Leu Ser Pro Glu Glu Gly Pro Ala Gly Leu Lys Gly Lys

145 150 155 160

Lys Ala Val Tyr Leu Gly Asp Gly Asp Asn Asn Met Ala Asn Ser Tyr

165 170 175

Met Ile Gly Phe Ala Thr Ala Gly Met Asp Ile Ser Ile Ile Ala Pro

180 185 190

Glu Gly Phe Gln Pro Arg Ala Glu Phe Val Glu Arg Ala Glu Lys Arg

195 200 205

Gly Gln Glu Thr Gly Ala Lys Val Val Val Thr Asp Ser Leu Asp Glu

210 215 220

Val Ala Gly Ala Asp Val Val Ile Thr Asp Thr Trp Val Ser Met Gly

225 230 235 240

Met Glu Asn Asp Gly Ile Asp Arg Thr Thr Pro Phe Val Pro Tyr Gln

245 250 255

Val Asn Asp Glu Val Met Ala Lys Ala Asn Asp Gly Ala Ile Phe Leu

260 265 270

His Cys Leu Pro Ala Tyr Arg Gly Lys Glu Val Ala Ala Ser Val Ile

275 280 285

Asp Gly Pro Ala Ser Lys Val Phe Asp Glu Ala Glu Asn Arg Leu His

290 295 300

Ala Gln Lys Ala Leu Leu Val Trp Leu Leu Ala Asn Gln Pro Arg

305 310 315

<210> 10

<211> 960

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 argF

<400> 10

atgacttcac aaccacaggt tcgccatttt ctggctgatg atgatctcac ccctgcagag 60

caggcagagg ttttgaccct agccgcaaag ctcaaggcag cgccgttttc ggagcgtcca 120

ctcgagggac caaagtccgt tgcagttctt tttgataaga cttcaactcg tactcgcttc 180

tccttcgacg cgggcatcgc tcatttgggt ggacacgcca tcgtcgtgga ttccggtagc 240

tcacagatgg gtaagggcga gtccctgcag gacaccgcag ctgtattgtc ccgctacgtg 300

gaagcaattg tgtggcgcac ctacgcacac agcaatttcc acgccatggc ggagacgtcc 360

actgtgccgc tggtgaactc cttgtccgat gatctgcacc catgccagat tctggctgat 420

ctgcagacta tcgtggaaaa cctcagccct gaagaaggcc cagcaggcct taagggtaag 480

aaggctgtgt acctgggcga tggcgacaac aacatggcca actcctacat gattggcttt 540

gccaccgcgg gcatggatat ttccatcatc gctcctgaag ggttccagcc tcgtgcggaa 600

ttcgtggagc gcgcggaaaa gcgtggccag gaaaccggcg cgaaggttgt tgtcaccgac 660

agcctcgacg aggttgccgg cgccgatgtt gtcatcaccg atacctgggt atccatgggt 720

atggaaaacg acggcatcga tcgcaccaca cctttcgttc cttaccaggt caacgatgag 780

gtcatggcga aagctaacga cggcgccatc ttcctgcact gccttcctgc ctaccgtggc 840

aaagaagtgg cagcctccgt gattgatgga ccagcgtcca aagttttcga tgaagcagaa 900

aaccgcctcc acgctcagaa agcactgctg gtgtggctgc tggccaacca gccgaggtaa 960

960

<210> 11

<211> 319

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 ArgF

<400> 11

Met Thr Ser Gln Pro Gln Val Arg His Phe Leu Ala Asp Asp Asp Leu

1 5 10 15

Thr Pro Ala Glu Gln Ala Glu Val Leu Thr Leu Ala Ala Lys Leu Lys

20 25 30

Ala Ala Pro Phe Ser Glu Arg Pro Leu Glu Gly Pro Lys Ser Val Ala

35 40 45

Val Leu Phe Asp Lys Thr Ser Thr Arg Thr Arg Phe Ser Phe Asp Ala

50 55 60

Gly Ile Ala His Leu Gly Gly His Ala Ile Val Val Asp Ser Gly Ser

65 70 75 80

Ser Gln Met Gly Lys Gly Glu Thr Leu Gln Asp Thr Ala Ala Val Leu

85 90 95

Ser Arg Tyr Val Glu Ala Ile Val Trp Arg Thr Tyr Ala His Ser Asn

100 105 110

Phe His Ala Met Ala Glu Thr Ser Thr Val Pro Leu Val Asn Ser Leu

115 120 125

Ser Asp Asp Leu His Pro Cys Gln Ile Leu Ala Asp Leu Gln Thr Ile

130 135 140

Val Glu Asn Leu Ser Pro Glu Glu Gly Pro Ala Gly Leu Lys Gly Lys

145 150 155 160

Lys Ala Val Tyr Leu Gly Asp Gly Asp Asn Asn Met Ala Asn Ser Tyr

165 170 175

Met Ile Gly Phe Ala Thr Ala Gly Met Asp Ile Ser Ile Ile Ala Pro

180 185 190

Glu Gly Phe Gln Pro Arg Ala Glu Phe Val Glu Arg Ala Glu Lys Arg

195 200 205

Gly Gln Glu Thr Gly Ala Lys Val Val Val Thr Asp Ser Leu Asp Glu

210 215 220

Val Ala Gly Ala Asp Val Val Ile Thr Asp Thr Trp Val Ser Met Gly

225 230 235 240

Met Glu Asn Asp Gly Ile Asp Arg Thr Thr Pro Phe Val Pro Tyr Gln

245 250 255

Val Asn Asp Glu Val Met Ala Lys Ala Asn Asp Gly Ala Ile Phe Leu

260 265 270

His Cys Leu Pro Ala Tyr Arg Gly Lys Glu Val Ala Ala Ser Val Ile

275 280 285

Asp Gly Pro Ala Ser Lys Val Phe Asp Glu Ala Glu Asn Arg Leu His

290 295 300

Ala Gln Lys Ala Leu Leu Val Trp Leu Leu Ala His Gln Pro Arg

305 310 315

<210> 12

<211> 960

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 argF

<400> 12

atgacttcac aaccacaggt tcgccatttc ctggctgatg atgatctcac ccctgcagag 60

caggcagagg ttttgaccct agccgcaaag ctcaaggcag cgccgttttc ggagcgtcca 120

ctcgagggac caaagtccgt tgcagttctt tttgataaga cttcaactcg tactcgcttc 180

tccttcgacg cgggcatcgc tcatttgggt ggacatgcca tcgtcgtgga ttccggcagc 240

tcacagatgg gtaagggcga gaccctgcag gacaccgcag ctgtattgtc ccgctacgtg 300

gaagcaattg tgtggcgcac ctacgcacac agcaatttcc acgccatggc ggagacgtcc 360

actgtgccac tggtgaactc cttgtccgat gatctgcacc catgccagat tctggctgat 420

ctgcagacca tcgtggaaaa cctcagccct gaagaaggcc cagcaggcct taagggtaag 480

aaggctgtgt acctgggcga tggcgacaac aacatggcca actcctacat gattggcttt 540

gccaccgcgg gcatggatat ctccatcatc gctcctgaag ggttccagcc tcgtgcggaa 600

ttcgtggagc gcgcggaaaa gcgtggccag gaaaccggcg cgaaggttgt tgtcaccgac 660

agcctcgacg aggttgccgg cgccgatgtt gtcatcaccg atacctgggt atccatgggt 720

atggaaaacg acggcatcga tcgcaccaca cctttcgttc cctaccaggt caacgatgag 780

gtcatggcga aagctaacga cggcgccatc ttcctgcact gccttcctgc ctaccgcggc 840

aaagaagtgg cagcctccgt gattgatgga ccagcgtcca aagttttcga tgaagcagaa 900

aaccgcctcc acgctcagaa agcactgctg gtgtggctgc tggcccacca gccgaggtaa 960

960

<210> 13

<211> 533

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 NCgl1221

<400> 13

Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn

1 5 10 15

Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala

20 25 30

Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Arg

35 40 45

Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala

50 55 60

Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met

65 70 75 80

Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala

85 90 95

Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln

100 105 110

Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys

115 120 125

Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val

130 135 140

Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg

145 150 155 160

Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val

165 170 175

Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro

180 185 190

Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser

195 200 205

Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu

210 215 220

Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro

225 230 235 240

Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln

245 250 255

Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu

260 265 270

Ile Ile Ser Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser

275 280 285

Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr

290 295 300

Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu

305 310 315 320

Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala

325 330 335

Asp Asn Ala Asp Ala Ser Val Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu

340 345 350

Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu

355 360 365

Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp

370 375 380

Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val

385 390 395 400

Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu

405 410 415

Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser

420 425 430

Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser

435 440 445

Glu Thr Ser Ala Pro Val Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr

450 455 460

Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Asn Val Glu Thr Gln Gln Glu

465 470 475 480

Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu

485 490 495

Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr

500 505 510

Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala

515 520 525

Pro Thr Ser Thr Pro

530

<210> 14

<211> 1602

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 NCgl1221

<400> 14

atgattttag gcgtacccat tcaatatttg ctctattcat tgtggaattg gattgtcgat 60

accggttttg atgtagcaat tatcctggtc ttggcgtttt tgattccacg tatcggccga 120

ctggccatgc gtattatcaa gcgccgagtg gagtctgcag ccgatgcgga caccactaag 180

aaccagctcg cgttcgccgg cgttggcgtt tatatcgcgc aaattgtggc gtttttcatg 240

cttgccgtct ccgcgatgca ggcttttggt ttctctctcg cgggcgctgc gattccggca 300

accattgcgt cagctgccat tggccttggt gcgcagtcga ttgttgcgga cttcttggcc 360

ggatttttca tcctgacgga aaagcaattc ggcgtgggtg actgggtgcg ttttgagggc 420

aacggcatcg ttgtcgaagg caccgtcatt gagatcacca tgcgcgcgac caaaattcgc 480

acgattgcac aagagaccgt gatcatcccc aactccacgg cgaaagtgtg catcaacaat 540

tctaataact ggtcgcgtgc ggttgtcgtt attccgatcc ccatgttggg ttctgaaaac 600

atcacagatg tcatcgcgcg ctctgaagct gcgactcgtc gcgcacttgg ccaggagaaa 660

atcgcaccgg aaatcctcgg tgaactcgat gtgcacccag ccacggaagt cacgccgcca 720

acggtggtcg gcatgccgtg gatggtcacc atgcgtttcc tcgtgcaagt caccgccggc 780

aatcaatggc tggtcgaacg cgccatccgc acagaaatca tcagcgaatt ctgggaagaa 840

tacggcagcg caaccactac atcgggaacc ctcattgatt ccttacacgt tgagcatgaa 900

gagccaaaga cctcgcttat cgacgcctcc ccccaggctc ttaaggaacc gaagccggag 960

gctgcggcga cggttgcatc gctagctgca tcctctaacg acgatgcaga caatgcagac 1020

gcctcggtga tcaatgcagg caatccagag aaggaacttg attccgatgt gctggaacaa 1080

gaactctcca gcgaagaacc ggaagaaaca gcaaaaccag atcactctct ccgaggcttc 1140

ttccgcactg attactaccc aaatcggtgg cagaagatcc tgtcgtttgg cggacgtgtc 1200

cgcatgagca cgtccctgtt gttgggtgcg ctgctcttgc tgtcactatt taaggtcatg 1260

actgtggaac caagtgagaa ttggcaaaac tccagtggat ggctgtcacc aagcactgcc 1320

acctcaactg cggtgaccac ctccgaaact tccgcgccag taagcacgcc ttcgatgaca 1380

gtgcccacta cggtggagga gaccccaacg atggaatcta acgtcgaaac gcagcaggaa 1440

acctcaaccc ctgcaaccgc aacgccccag cgagccgaca ccatcgaacc gaccgaggaa 1500

gccacgtcgc aggaggaaac gactgcgtcg cagacgcagt ctccagcagt ggaagcacca 1560

accgcggtcc aagagacagt tgcgccgacg tccacccctt ag 1602

<210> 15

<211> 533

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 NCgl1221

<400> 15

Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn

1 5 10 15

Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala

20 25 30

Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln

35 40 45

Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala

50 55 60

Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met

65 70 75 80

Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala

85 90 95

Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln

100 105 110

Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys

115 120 125

Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val

130 135 140

Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg

145 150 155 160

Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val

165 170 175

Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro

180 185 190

Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser

195 200 205

Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu

210 215 220

Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro

225 230 235 240

Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln

245 250 255

Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu

260 265 270

Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser

275 280 285

Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr

290 295 300

Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu

305 310 315 320

Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala

325 330 335

Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu

340 345 350

Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu

355 360 365

Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp

370 375 380

Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val

385 390 395 400

Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu

405 410 415

Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser

420 425 430

Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser

435 440 445

Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr

450 455 460

Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu

465 470 475 480

Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu

485 490 495

Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr

500 505 510

Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala

515 520 525

Pro Thr Ser Thr Pro

530

<210> 16

<211> 1602

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 NCgl1221

<400> 16

atgattttag gcgtacccat tcaatatttg ctctattcat tgtggaattg gattgtcgat 60

accggttttg atgtagcaat tatcctggtc ttggcgtttt tgattccacg tatcggccga 120

ctggccatgc gtattatcaa gcagcgagtg gagtctgcag ccgatgcgga caccactaag 180

aaccagctcg cgttcgctgg cgttggcgtt tatatcgcgc aaattgtggc gtttttcatg 240

cttgccgtct ccgcgatgca ggcttttggt ttctctctcg cgggcgctgc gattccggca 300

accattgcgt cagctgccat tggtcttggt gcgcagtcga ttgttgcgga cttcttggcc 360

ggatttttca tcctgacgga aaagcaattc ggcgtgggtg actgggtgcg ctttgagggc 420

aacggcatcg ttgttgaagg caccgtcatt gagatcacca tgcgcgcgac caaaattcgc 480

acgattgcac aagagaccgt gatcatcccg aactccacgg cgaaagtgtg catcaacaat 540

tctaataact ggtcgcgtgc ggttgtcgtt attccgatcc ccatgttggg ttctgaaaac 600

atcacagatg tcatcgcgcg ctctgaagct gcgactcgtc gcgcacttgg ccaggagaaa 660

atcgcaccgg aaatcctcgg tgaactcgat gtgcacccag ccacggaagt cacaccgcca 720

acggtggtcg gcatgccgtg gatggtcacc atgcgtttcc tcgtgcaagt caccgccggc 780

aatcaatggc tggtcgaacg cgccatccgc acagaaatca tcaacgaatt ctgggaagaa 840

tacggcagcg caaccactac atcgggaacc ctcattgatt ccttacacgt tgagcatgaa 900

gagccaaaga cctcgcttat cgacgcctcc ccccaggctc ttaaggaacc gaagccggag 960

gctgcggcga cggttgcatc gctagctgca tcgtctaacg acgatgcaga caatgcagac 1020

gcctcggcga tcaatgcagg caatccagag aaggaacttg attccgatgt gctggaacaa 1080

gaactctcca gcgaagaacc ggaagaaaca gcaaaaccag atcactctct ccgaggcttc 1140

ttccgcactg attactaccc aaatcggtgg cagaagatcc tgtcgtttgg cggacgtgtc 1200

cgcatgagca cttccctgtt gttgggtgcg ctgctcttgc tgtcactatt taaggtcatg 1260

actgtggaac caagtgagaa ttggcaaaac tccagtggat ggctgtcacc aagcactgcc 1320

acctcaactg cggtgaccac ctccgaaact tccgcgccag caagcacgcc ttcgatgaca 1380

gtgcccacta cggtggagga gaccccaacg atggaatcta gcgtcgaaac gcagcaggaa 1440

acctcaaccc ctgcaaccgc aacgccccag cgagccgaca ccatcgaacc gaccgaggaa 1500

gccacgtcgc aggaggaaac gactgcatcg cagacgcagt ctccagcagt ggaagcacca 1560

accgcggtcc aagaaacagt tgcgccgacg tccacccctt ag 1602

<210> 17

<211> 711

<212> PRT

<213> Escherichia coli SpeC

<400> 17

Met Lys Ser Met Asn Ile Ala Ala Ser Ser Glu Leu Val Ser Arg Leu

1 5 10 15

Ser Ser His Arg Arg Val Val Ala Leu Gly Asp Thr Asp Phe Thr Asp

20 25 30

Val Ala Ala Val Val Ile Thr Ala Ala Asp Ser Arg Ser Gly Ile Leu

35 40 45

Ala Leu Leu Lys Arg Thr Gly Phe His Leu Pro Val Phe Leu Tyr Ser

50 55 60

Glu His Ala Val Glu Leu Pro Ala Gly Val Thr Ala Val Ile Asn Gly

65 70 75 80

Asn Glu Gln Gln Trp Leu Glu Leu Glu Ser Ala Ala Cys Gln Tyr Glu

85 90 95

Glu Asn Leu Leu Pro Pro Phe Tyr Asp Thr Leu Thr Gln Tyr Val Glu

100 105 110

Met Gly Asn Ser Thr Phe Ala Cys Pro Gly His Gln His Gly Ala Phe

115 120 125

Phe Lys Lys His Pro Ala Gly Arg His Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Glu

130 135 140

Asn Val Phe Arg Ala Asp Met Cys Asn Ala Asp Val Lys Leu Gly Asp

145 150 155 160

Leu Leu Ile His Glu Gly Ser Ala Lys Asp Ala Gln Lys Phe Ala Ala

165 170 175

Lys Val Phe His Ala Asp Lys Thr Tyr Phe Val Leu Asn Gly Thr Ser

180 185 190

Ala Ala Asn Lys Val Val Thr Asn Ala Leu Leu Thr Arg Gly Asp Leu

195 200 205

Val Leu Phe Asp Arg Asn Asn His Lys Ser Asn His His Gly Ala Leu

210 215 220

Ile Gln Ala Gly Ala Thr Pro Val Tyr Leu Glu Ala Ser Arg Asn Pro

225 230 235 240

Phe Gly Phe Ile Gly Gly Ile Asp Ala His Cys Phe Asn Glu Glu Tyr

245 250 255

Leu Arg Gln Gln Ile Arg Asp Val Ala Pro Glu Lys Ala Asp Leu Pro

260 265 270

Arg Pro Tyr Arg Leu Ala Ile Ile Gln Leu Gly Thr Tyr Asp Gly Thr

275 280 285

Val Tyr Asn Ala Arg Gln Val Ile Asp Thr Val Gly His Leu Cys Asp

290 295 300

Tyr Ile Leu Phe Asp Ser Ala Trp Val Gly Tyr Glu Gln Phe Ile Pro

305 310 315 320

Met Met Ala Asp Ser Ser Pro Leu Leu Leu Glu Leu Asn Glu Asn Asp

325 330 335

Pro Gly Ile Phe Val Thr Gln Ser Val His Lys Gln Gln Ala Gly Phe

340 345 350

Ser Gln Thr Ser Gln Ile His Lys Lys Asp Asn His Ile Arg Gly Gln

355 360 365

Ala Arg Phe Cys Pro His Lys Arg Leu Asn Asn Ala Phe Met Leu His

370 375 380

Ala Ser Thr Ser Pro Phe Tyr Pro Leu Phe Ala Ala Leu Asp Val Asn

385 390 395 400

Ala Lys Ile His Glu Gly Glu Ser Gly Arg Arg Leu Trp Ala Glu Cys

405 410 415

Val Glu Ile Gly Ile Glu Ala Arg Lys Ala Ile Leu Ala Arg Cys Lys

420 425 430

Leu Phe Arg Pro Phe Ile Pro Pro Val Val Asp Gly Lys Leu Trp Gln

435 440 445

Asp Tyr Pro Thr Ser Val Leu Ala Ser Asp Arg Arg Phe Phe Ser Phe

450 455 460

Glu Pro Gly Ala Lys Trp His Gly Phe Glu Gly Tyr Ala Ala Asp Gln

465 470 475 480

Tyr Phe Val Asp Pro Cys Lys Leu Leu Leu Thr Thr Pro Gly Ile Asp

485 490 495

Ala Glu Thr Gly Glu Tyr Ser Asp Phe Gly Val Pro Ala Thr Ile Leu

500 505 510

Ala His Tyr Leu Arg Glu Asn Gly Ile Val Pro Glu Lys Cys Asp Leu

515 520 525

Asn Ser Ile Leu Phe Leu Leu Thr Pro Ala Glu Ser His Glu Lys Leu

530 535 540

Ala Gln Leu Val Ala Met Leu Ala Gln Phe Glu Gln His Ile Glu Asp

545 550 555 560

Asp Ser Pro Leu Val Glu Val Leu Pro Ser Val Tyr Asn Lys Tyr Pro

565 570 575

Val Arg Tyr Arg Asp Tyr Thr Leu Arg Gln Leu Cys Gln Glu Met His

580 585 590

Asp Leu Tyr Val Ser Phe Asp Val Lys Asp Leu Gln Lys Ala Met Phe

595 600 605

Arg Gln Gln Ser Phe Pro Ser Val Val Met Asn Pro Gln Asp Ala His

610 615 620

Ser Ala Tyr Ile Arg Gly Asp Val Glu Leu Val Arg Ile Arg Asp Ala

625 630 635 640

Glu Gly Arg Ile Ala Ala Glu Gly Ala Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Leu Cys Val Val Pro Gly Glu Val Trp Gly Gly Ala Val Gln Arg Tyr

660 665 670

Phe Leu Ala Leu Glu Glu Gly Val Asn Leu Leu Pro Gly Phe Ser Pro

675 680 685

Glu Leu Gln Gly Val Tyr Ser Glu Thr Asp Ala Asp Gly Val Lys Arg

690 695 700

Leu Tyr Gly Tyr Val Leu Lys

705 710

<210> 18

<211> 2136

<212> DNA

<213> Escherichia coli speC

<400> 18

atgaaatcaa tgaatattgc cgccagtagt gaactggtat cccgactttc ttctcatcgt 60

cgcgtggtgg cgttgggaga tactgatttt acggacgtcg cggcagtcgt cattaccgct 120

gcggatagtc gcagtggcat tcttgcgttg cttaagcgca ccggttttca tctaccggtg 180

tttttgtatt ccgaacatgc tgttgaatta cctgcgggcg ttacggcggt aatcaacggc 240

aacgagcagc agtggctgga gctggaatcc gcagcctgtc agtatgaaga gaatttgctg 300

ccaccgtttt atgacacgct gacgcagtac gttgagatgg gcaacagcac ctttgcttgc 360

cctggacatc aacatggtgc gttttttaaa aagcatcctg ccggacgcca tttttacgat 420

ttctttggtg agaacgtctt tcgcgccgat atgtgtaacg ctgacgtaaa attgggcgat 480

ctgcttattc atgaaggatc ggcgaaagat gcgcagaaat tcgcagccaa agtctttcat 540

gccgataaaa cctattttgt gctgaacggc acatcggcag cgaataaagt ggtgacgaat 600

gcgctgttaa cgcgtggcga tctggtgctc ttcgaccgta acaaccataa gtcgaatcat 660

cacggcgcgc tgattcaggc gggggcgacg ccggtctatc tggaagcttc acgcaacccg 720

tttggtttca ttggcggtat tgatgcgcac tgttttaatg aagagtatct gcgccagcaa 780

attcgcgacg ttgcgccaga aaaagccgac ctgccgcgcc cgtatcgcct ggcgattatt 840

cagctgggaa cctatgacgg cactgtctat aacgcccgtc aggtgatcga taccgttggg 900

catctgtgtg attacattct gtttgattcc gcgtgggtcg gttatgaaca atttatcccg 960

atgatggcgg atagctcgcc gctgctgtta gaacttaacg aaaacgatcc ggggatcttt 1020

gtgactcagt cggtgcacaa acagcaggcg ggattctcac agacgtcgca gatccataaa 1080

aaagataacc atatccgcgg acaggcgcgt ttttgcccgc ataagcggtt gaataacgcc 1140

tttatgctcc atgcttctac cagccctttc tatccgctgt ttgctgcact ggatgttaac 1200

gccaaaattc atgaagggga gagtgggcgt cggctgtggg ctgagtgtgt tgagataggg 1260

attgaagcgc gcaaggctat tcttgcgcgc tgtaagctgt tccgcccgtt tatcccgccc 1320

gttgttgatg gcaaattgtg gcaggattat ccgacatcag tgttagccag cgaccgccgt 1380

tttttcagtt ttgagccggg ggcgaagtgg cacggctttg aaggatatgc cgcggatcag 1440

tattttgttg atccgtgcaa gctgttactc actacaccag gtatcgatgc cgaaaccggc 1500

gaatatagcg actttggcgt tccggcgacg attctggcgc actatctgcg tgagaacggc 1560

attgtgccgg agaagtgcga tctcaactcc attctgtttt tattaactcc ggcggaaagc 1620

cacgagaagc tggcacaact ggtggcgatg ctggcgcaat ttgaacagca tattgaggat 1680

gactcgccgc tggttgaggt gttgccgagc gtttataaca agtatccggt gcgctatcgc 1740

gactacaccc tgcgccagtt gtgtcaggag atgcacgatc tgtatgtcag tttcgacgtc 1800

aaagacctac aaaaagcgat gttccgccag cagagtttcc cgtcagtggt gatgaacccc 1860

caggatgcgc atagcgctta tattcgcggt gacgtggagt tggtgcggat tcgtgatgcc 1920

gaagggcgaa ttgcggcaga aggggcgttg ccttatccac ctggcgtgct ttgcgtggta 1980

cccggggaag tctggggtgg ggcggttcaa cgttatttcc ttgcactgga agaaggggtg 2040

aatttgttgc cgggattttc gccggagctg caaggtgttt atagcgaaac cgatgcggat 2100

ggcgtgaaac ggttgtacgg ttatgtgttg aagtaa 2136

<210> 19

<211> 357

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ArgC

<400> 19

Met Ile Met His Asn Val Tyr Gly Val Thr Met Thr Ile Lys Val Ala

1 5 10 15

Ile Ala Gly Ala Ser Gly Tyr Ala Gly Gly Glu Ile Leu Arg Leu Leu

20 25 30

Leu Gly His Pro Ala Tyr Ala Ser Gly Glu Leu Glu Ile Gly Ala Leu

35 40 45

Thr Ala Ala Ser Thr Ala Gly Ser Thr Leu Gly Glu Leu Met Pro His

50 55 60

Ile Pro Gln Leu Ala Asp Arg Val Ile Gln Asp Thr Thr Ala Glu Thr

65 70 75 80

Leu Ala Gly His Asp Val Val Phe Leu Gly Leu Pro His Gly Phe Ser

85 90 95

Ala Glu Ile Ala Leu Gln Leu Gly Pro Asp Val Thr Val Ile Asp Cys

100 105 110

Ala Ala Asp Phe Arg Leu Gln Asn Ala Ala Asp Trp Glu Lys Phe Tyr

115 120 125

Gly Ser Glu His Gln Gly Thr Trp Pro Tyr Gly Ile Pro Glu Met Pro

130 135 140

Gly His Arg Glu Ala Leu Arg Gly Ala Lys Arg Val Ala Val Pro Gly

145 150 155 160

Cys Phe Pro Thr Gly Ala Thr Leu Ala Leu Leu Pro Ala Val Gln Ala

165 170 175

Gly Leu Ile Glu Pro Asp Val Ser Val Val Ser Ile Thr Gly Val Ser

180 185 190

Gly Ala Gly Lys Lys Ala Ser Val Ala Leu Leu Gly Ser Glu Thr Met

195 200 205

Gly Ser Leu Lys Ala Tyr Asn Thr Ser Gly Lys His Arg His Thr Pro

210 215 220

Glu Ile Ala Gln Asn Leu Gly Glu Val Ser Asp Lys Pro Val Lys Val

225 230 235 240

Ser Phe Thr Pro Val Leu Ala Pro Leu Pro Arg Gly Ile Leu Thr Thr

245 250 255

Ala Thr Ala Pro Leu Lys Glu Gly Val Thr Ala Glu Gln Ala Arg Ala

260 265 270

Val Tyr Glu Glu Phe Tyr Ala Gln Glu Thr Phe Val His Val Leu Pro

275 280 285

Glu Gly Ala Gln Pro Gln Thr Gln Ala Val Leu Gly Ser Asn Met Cys

290 295 300

His Val Gln Val Glu Ile Asp Glu Glu Ala Gly Lys Val Leu Val Thr

305 310 315 320

Ser Ala Ile Asp Asn Leu Thr Lys Gly Thr Ala Gly Ala Ala Val Gln

325 330 335

Cys Met Asn Leu Ser Val Gly Phe Asp Glu Ala Ala Gly Leu Pro Gln

340 345 350

Val Gly Val Ala Pro

355

<210> 20

<211> 1074

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 argC

<400> 20

atgatcatgc ataacgtgta tggtgtaact atgacaatca aggttgcaat cgcaggagcc 60

agtggatatg ccggcggaga aatccttcgt ctccttttag gccatccagc ttatgcatct 120

ggtgaactag aaatcggagc actcaccgcg gcatcaaccg caggcagcac gctcggtgaa 180

ttgatgccac acattccgca gttggcggat cgtgttattc aagacaccac agctgaaact 240

ctagccggtc atgatgtcgt atttctagga cttccacacg gattctctgc agaaattgca 300

cttcagctcg gaccagatgt cacagtgatt gactgtgcag ctgactttcg tctgcaaaat 360

gctgcagatt gggagaagtt ctacggctca gagcaccagg gaacatggcc ttatggcatt 420

ccagaaatgc caggacaccg cgaggctctt cgtggtgcta agcgtgtagc agtgccagga 480

tgtttcccaa ccggtgcaac cttggctctt cttcctgcgg ttcaagcggg acttatcgag 540

ccagatgttt ccgtagtgtc catcaccggc gtatcaggtg caggtaagaa agcatctgtt 600

gcactacttg gctcggaaac catgggttca ctcaaggcgt acaacacctc cggaaagcac 660

cgccacaccc cggaaattgc ccagaacctc ggcgaagtca gcgacaagcc agtcaaggtg 720

agcttcaccc cagtgcttgc accgttacct cgcggaattc tcaccactgc aaccgcacct 780

ttgaaagaag gcgttaccgc agaacaggct cgcgcagtat atgaagagtt ctatgcacag 840

gaaaccttcg tgcatgttct tccagaaggt gcacagccac aaacccaagc agttcttggc 900

tccaacatgt gccacgtgca ggtagaaatt gatgaggaag caggcaaagt ccttgttacc 960

tccgcaatcg ataacctcac caagggaact gccggcgccg ctgttcagtg catgaactta 1020

agcgttggtt ttgatgaggc agcaggcctg ccacaggtcg gcgtcgcacc ttaa 1074

<210> 21

<211> 347

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 ArgC

<400> 21

Met Thr Ile Lys Val Ala Ile Ala Gly Ala Ser Gly Tyr Ala Gly Gly

1 5 10 15

Glu Ile Leu Arg Leu Leu Leu Gly His Pro Ala Tyr Ala Ser Gly Glu

20 25 30

Leu Glu Ile Gly Ala Leu Thr Ala Ala Ser Thr Ala Gly Ser Thr Leu

35 40 45

Gly Glu Leu Met Pro His Ile Pro Gln Leu Ala Asp Arg Val Ile Gln

50 55 60

Asp Thr Thr Ala Glu Thr Leu Ala Gly His Asp Val Val Phe Leu Gly

65 70 75 80

Leu Pro His Gly Phe Ser Ala Glu Ile Ala Leu Gln Leu Gly Pro Asp

85 90 95

Val Thr Val Ile Asp Cys Ala Ala Asp Phe Arg Leu Gln Asn Ala Ala

100 105 110

Asp Trp Glu Lys Phe Tyr Gly Ser Glu His Gln Gly Thr Trp Pro Tyr

115 120 125

Gly Ile Pro Glu Ile Pro Gly His Arg Glu Ala Leu Arg Gly Ala Lys

130 135 140

Arg Val Ala Val Pro Gly Cys Phe Pro Thr Gly Ala Thr Leu Ala Leu

145 150 155 160

Leu Pro Ala Val Gln Ala Gly Leu Ile Glu Pro Asp Val Ser Val Val

165 170 175

Ser Ile Thr Gly Val Ser Gly Ala Gly Lys Lys Ala Ser Val Ala Leu

180 185 190

Leu Gly Ser Glu Thr Met Gly Ser Leu Lys Ala Tyr Asn Thr Ser Gly

195 200 205

Lys His Arg His Thr Pro Glu Ile Ala Gln Asn Leu Gly Glu Val Ser

210 215 220

Asp Lys Pro Val Lys Val Ser Phe Thr Pro Val Leu Ala Pro Leu Pro

225 230 235 240

Arg Gly Ile Leu Thr Thr Ala Thr Ala Pro Leu Lys Glu Gly Val Thr

245 250 255

Ala Glu Gln Ala Arg Ala Val Tyr Glu Glu Phe Tyr Ala Gln Glu Thr

260 265 270

Phe Val His Val Leu Pro Glu Gly Ala Gln Pro Gln Thr Gln Ala Val

275 280 285

Leu Gly Ser Asn Met Cys His Val Gln Val Glu Ile Asp Glu Glu Ala

290 295 300

Gly Lys Val Leu Val Thr Ser Ala Ile Asp Asn Leu Thr Lys Gly Thr

305 310 315 320

Ala Gly Ala Ala Val Gln Cys Met Asn Leu Ser Val Gly Phe Asp Glu

325 330 335

Ala Ala Gly Leu Pro Gln Val Gly Val Ala Pro

340 345

<210> 22

<211> 1044

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 argC

<400> 22

atgacaatca aggttgcaat cgcaggagcc agtggatatg ccggcggaga aatccttcgt 60

ctccttttag gccatccagc ttatgcatct ggtgaactag aaatcggagc actcaccgcg 120

gcatcaaccg caggcagcac gctcggtgaa ttgatgccac acattccgca gttggcggat 180

cgtgttattc aagacaccac agctgaaact ctagccggtc atgatgtcgt atttctagga 240

cttccacacg gattctctgc agaaattgca cttcagctcg gaccagatgt cacagtgatt 300

gactgtgcag ctgactttcg tctgcaaaat gctgcagatt gggagaagtt ctacggctca 360

gagcaccagg gaacatggcc ttatggcatt ccagaaatac caggacaccg cgaggctctt 420

cgtggtgcta agcgtgtagc agtgccagga tgtttcccaa ccggtgcaac cttggctctt 480

cttcctgcgg ttcaagcggg acttatcgag ccagatgttt ccgtagtgtc catcaccggc 540

gtatcaggtg caggtaagaa agcatctgtt gcactacttg gctcggaaac catgggttca 600

ctcaaggcgt acaacacctc cggaaagcac cgccacaccc cggaaattgc ccagaacctc 660

ggcgaagtca gcgacaagcc agtcaaggtg agcttcaccc cagtgcttgc accgttacct 720

cgcggaattc tcaccactgc aaccgcacct ttgaaagaag gcgttaccgc agagcaggct 780

cgcgcagtat atgaagagtt ctatgcacag gaaaccttcg tgcatgttct tccagaaggt 840

gcacagccac aaacccaagc agttcttggc tccaacatgt gccacgtgca ggtagaaatt 900

gatgaggaag caggcaaagt ccttgttacc tccgcaatcg ataacctcac caagggaact 960

gccggcgccg ctgttcagtg catgaactta agcgttggct ttgatgaggc agcaggcctg 1020

ccacaggtcg gcgtcgcacc ttaa 1044

<210> 23

<211> 388

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ArgJ

<400> 23

Met Ala Glu Lys Gly Ile Thr Ala Pro Lys Gly Phe Val Ala Ser Ala

1 5 10 15

Thr Thr Ala Gly Ile Lys Ala Ser Gly Asn Pro Asp Met Ala Leu Val

20 25 30

Val Asn Gln Gly Pro Glu Phe Ser Ala Ala Ala Val Phe Thr Arg Asn

35 40 45

Arg Val Phe Ala Ala Pro Val Lys Val Ser Arg Glu Asn Val Ala Asp

50 55 60

Gly Gln Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Ala Gly Asn Ala Asn Ala Cys

65 70 75 80

Asn Gly Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Arg Glu Ser Val Ser His Leu

85 90 95

Ala Gln Asn Leu Gly Leu Glu Asp Ser Asp Ile Gly Val Cys Ser Thr

100 105 110

Gly Leu Ile Gly Glu Leu Leu Pro Met Asp Lys Leu Asn Ala Gly Ile

115 120 125

Asp Gln Leu Thr Ala Glu Gly Ala Leu Gly Asp Asn Gly Ala Ala Ala

130 135 140

Ala Lys Ala Ile Met Thr Thr Asp Thr Val Asp Lys Glu Thr Val Val

145 150 155 160

Phe Ala Asp Gly Trp Thr Val Gly Gly Met Gly Lys Gly Val Gly Met

165 170 175

Met Ala Pro Ser Leu Ala Thr Met Leu Val Cys Leu Thr Thr Asp Ala

180 185 190

Ser Val Thr Gln Glu Met Ala Gln Ile Ala Leu Ala Asn Ala Thr Ala

195 200 205

Val Thr Phe Asp Thr Leu Asp Ile Asp Gly Ser Thr Ser Thr Asn Asp

210 215 220

Thr Val Phe Leu Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Thr Pro Thr Gln

225 230 235 240

Asp Glu Leu Asn Asp Ala Val Tyr Ala Ala Cys Ser Asp Ile Ala Ala

245 250 255

Lys Leu Gln Ala Asp Ala Glu Gly Val Thr Lys Arg Val Ala Val Thr

260 265 270

Val Val Gly Thr Thr Asn Asn Glu Gln Ala Ile Asn Ala Ala Arg Thr

275 280 285

Val Ala Arg Asp Asn Leu Phe Lys Cys Ala Met Phe Gly Ser Asp Pro

290 295 300

Asn Trp Gly Arg Val Leu Ala Ala Val Gly Met Ala Asp Ala Asp Met

305 310 315 320

Glu Pro Glu Lys Ile Ser Val Phe Phe Asn Gly Gln Ala Val Cys Leu

325 330 335

Asp Ser Thr Gly Ala Pro Gly Ala Arg Glu Val Asp Leu Ser Gly Ala

340 345 350

Asp Ile Asp Val Arg Ile Asp Leu Gly Thr Ser Gly Glu Gly Gln Ala

355 360 365

Thr Val Arg Thr Thr Asp Leu Ser Phe Ser Tyr Val Glu Ile Asn Ser

370 375 380

Ala Tyr Ser Ser

385

<210> 24

<211> 1167

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 argJ

<400> 24

atggcagaaa aaggcattac cgcgccgaaa ggcttcgttg cttctgcaac gaccgcgggt 60

attaaagctt ctggcaatcc tgacatggcg ttggtggtta accagggtcc agagttttcc 120

gcagcggccg tgtttacacg taaccgagtt ttcgcagcgc ctgtgaaggt gagccgagag 180

aacgttgctg atggccagat cagggctgtt ttgtacaacg ctggtaatgc taatgcgtgt 240

aatggtctgc agggtgagaa ggatgctcgt gagtctgttt ctcatctagc tcaaaatttg 300

ggcttggagg attccgatat tggtgtgtgt tccactggtc ttattggtga gttgcttccg 360

atggataagc tcaatgcagg tattgatcag ctgaccgctg agggcgcttt gggtgacaat 420

ggtgcagctg ctgccaaggc gatcatgacc actgacacgg tggataagga aaccgtcgtg 480

tttgctgatg gttggactgt cggcggaatg ggcaagggcg tgggcatgat ggcgccgtct 540

cttgccacca tgctggtctg cttgaccact gatgcatccg ttactcagga aatggctcag 600

atcgcgctgg ctaatgctac ggccgttacg tttgacaccc tggatattga tggatcaacc 660

tccaccaatg acaccgtgtt cctgctggca tctggcgcta gcggaatcac cccaactcag 720

gatgaactca acgatgcggt gtacgcagct tgttctgata tcgcagcgaa gcttcaggct 780

gatgcagagg gtgtgaccaa gcgcgttgct gtgacagtgg tgggaaccac caacaacgag 840

caggcgatta atgcggctcg cactgttgct cgtgacaatt tgttcaagtg cgcaatgttt 900

ggatctgatc caaactgggg tcgcgtgttg gctgcagtcg gcatggctga tgctgatatg 960

gaaccagaga agatttctgt gttcttcaat ggtcaagcag tatgccttga ttccactggc 1020

gctcctggtg ctcgtgaggt ggatctttcc ggcgctgaca ttgatgtccg aattgatttg 1080

ggcaccagtg gggaaggcca ggcaacagtt cgaaccactg acctgagctt ctcctacgtg 1140

gagatcaact ccgcgtacag ctcttaa 1167

<210> 25

<211> 388

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 ArgJ

<400> 25

Met Ala Lys Lys Gly Ile Thr Ala Pro Lys Gly Phe Val Ala Ser Ala

1 5 10 15

Thr Thr Ala Gly Ile Lys Ala Ser Gly Asn Pro Asp Met Ala Leu Val

20 25 30

Val Asn Gln Gly Pro Glu Phe Ser Ala Ala Ala Val Phe Thr Arg Asn

35 40 45

Arg Val Phe Ala Ala Pro Val Lys Val Ser Arg Glu Asn Val Ala Asp

50 55 60

Gly Gln Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Ala Gly Asn Ala Asn Ala Cys

65 70 75 80

Asn Gly Leu Gln Gly Glu Lys Asp Ala Arg Glu Ser Val Ser His Leu

85 90 95

Ala Gln Asn Leu Gly Leu Glu Asp Ser Asp Ile Gly Val Cys Ser Thr

100 105 110

Gly Leu Ile Gly Glu Leu Leu Pro Met Asp Lys Leu Asn Thr Gly Ile

115 120 125

Asp Gln Leu Thr Ala Glu Gly Ala Leu Gly Asp Asn Gly Ala Ala Ala

130 135 140

Ala Lys Ala Ile Met Thr Thr Asp Thr Val Asp Lys Glu Thr Val Val

145 150 155 160

Phe Ala Asp Gly Trp Thr Val Gly Gly Met Gly Lys Gly Val Gly Met

165 170 175

Met Ala Pro Ser Leu Ala Thr Met Leu Val Cys Leu Thr Thr Asp Ala

180 185 190

Ser Val Thr Gln Glu Met Ala Gln Ile Ala Leu Ala Asn Ala Thr Ala

195 200 205

Val Thr Phe Asp Thr Leu Asp Ile Asp Gly Ser Thr Ser Thr Asn Asp

210 215 220

Thr Val Phe Leu Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ile Thr Pro Thr Gln

225 230 235 240

Asp Glu Leu Asn Asp Ala Val Tyr Ala Ala Cys Ser Asp Ile Ala Ala

245 250 255

Lys Leu Gln Ala Asp Ala Glu Gly Val Thr Lys Arg Val Ala Val Thr

260 265 270

Val Val Gly Thr Thr Asn Asn Glu Gln Ala Ile Asn Ala Ala Arg Thr

275 280 285

Val Ala Arg Asp Asn Leu Phe Lys Cys Ala Met Phe Gly Ser Asp Pro

290 295 300

Asn Trp Gly Arg Val Leu Ala Ala Val Gly Met Ala Asp Ala Asp Met

305 310 315 320

Glu Pro Glu Lys Ile Ser Val Phe Phe Asn Asp Gln Ala Val Cys Leu

325 330 335

Asp Ser Thr Gly Ala Pro Gly Ala Arg Glu Val Asp Leu Ser Gly Ala

340 345 350

Asp Ile Asp Val Arg Ile Asp Leu Gly Thr Ser Gly Glu Gly Gln Ala

355 360 365

Thr Val Arg Thr Thr Asp Leu Ser Phe Ser Tyr Val Glu Ile Asn Ser

370 375 380

Ala Tyr Ser Ser

385

<210> 26

<211> 1167

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 argJ

<400> 26

atggccaaaa aaggcattac cgcgccgaaa ggcttcgttg cttctgcaac gaccgcgggt 60

attaaagctt ctggcaatcc tgacatggcg ttggtggtta accagggtcc agagttttcc 120

gcagcggccg tgtttacacg caaccgagtt ttcgcagcgc ctgtgaaggt gagccgggag 180

aacgttgctg atggccagat cagggctgtt ttgtacaacg ctggtaatgc taatgcgtgt 240

aatggtctgc agggtgagaa ggatgctcgt gagtctgttt ctcatctagc tcaaaatttg 300

ggcttggagg attccgatat tggtgtgtgt tccactggtc ttattggtga gttgcttccg 360

atggataagc tcaatacagg tattgatcag ctgaccgctg agggcgcttt gggtgacaat 420

ggtgcagctg ctgccaaggc gatcatgacc actgacacgg tggataagga aaccgtcgtg 480

tttgctgatg gttggactgt cggcggaatg ggcaagggcg tgggcatgat ggcgccgtct 540

cttgccacca tgctggtctg cttgaccact gatgcatccg ttactcagga aatggctcag 600

attgcgctgg ctaatgctac ggccgttacg tttgacaccc tggatattga tggatcaacc 660

tccaccaatg acaccgtgtt cctgctggca tctggcgcta gcggaatcac cccaactcag 720

gatgaactca acgatgcggt gtacgcagct tgttctgata tcgcagcgaa gcttcaggct 780

gatgcagagg gggtgaccaa gcgcgttgct gtgacagtgg tgggaaccac caacaacgag 840

caggcgatca atgcggctcg cacggttgct cgtgacaatt tgttcaagtg cgcaatgttt 900

ggatctgatc caaactgggg tcgcgtgttg gctgcagtcg gcatggctga tgctgatatg 960

gaaccagaga agatttctgt gttcttcaat gatcaagcag tatgccttga ttccactggc 1020

gctcctggtg ctcgtgaggt ggatctttcc ggcgctgaca ttgatgtccg aattgatttg 1080

ggcaccagtg gggaaggcca ggcaacagtt cgaaccactg acctgagctt ctcctacgtg 1140

gagatcaact ccgcgtacag ctcttaa 1167

<210> 27

<211> 317

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ArgB

<400> 27

Met Asn Asp Leu Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Val Arg Ala Asn Val

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ala Leu Pro Trp Leu Gln His Phe Arg Asp Lys Ile Val

20 25 30

Val Val Lys Tyr Gly Gly Asn Ala Met Val Asp Asp Asp Leu Lys Ala

35 40 45

Ala Phe Ala Ala Asp Met Val Phe Leu Arg Thr Val Gly Ala Lys Pro

50 55 60

Val Val Val His Gly Gly Gly Pro Gln Ile Ser Glu Met Leu Asn Arg

65 70 75 80

Val Gly Leu Gln Gly Glu Phe Lys Gly Gly Phe Arg Val Thr Thr Pro

85 90 95

Glu Val Met Asp Ile Val Arg Met Val Leu Phe Gly Gln Val Gly Arg

100 105 110

Asp Leu Val Gly Leu Ile Asn Ser His Gly Pro Tyr Ala Val Gly Thr

115 120 125

Ser Gly Glu Asp Ala Gly Leu Phe Thr Ala Gln Lys Arg Met Val Asn

130 135 140

Ile Asp Gly Val Pro Thr Asp Ile Gly Leu Val Gly Asp Ile Ile Asn

145 150 155 160

Val Asp Ala Ser Ser Leu Met Asp Ile Ile Glu Ala Gly Arg Ile Pro

165 170 175

Val Val Ser Thr Ile Ala Pro Gly Glu Asp Gly Gln Ile Tyr Asn Ile

180 185 190

Asn Ala Asp Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ile Gly Ala Glu

195 200 205

Arg Leu Leu Val Leu Thr Asn Val Glu Gly Leu Tyr Thr Asp Trp Pro

210 215 220

Asp Lys Ser Ser Leu Val Ser Lys Ile Lys Ala Thr Glu Leu Glu Ala

225 230 235 240

Ile Leu Pro Gly Leu Asp Ser Gly Met Ile Pro Lys Met Glu Ser Cys

245 250 255

Leu Asn Ala Val Arg Gly Gly Val Ser Ala Ala His Val Ile Asp Gly

260 265 270

Arg Ile Ala His Ser Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Met Gly Gly Ile

275 280 285

Gly Thr Met Val Leu Pro Asp Val Phe Asp Arg Glu Asn Tyr Pro Glu

290 295 300

Gly Thr Val Phe Arg Lys Asp Asp Lys Asp Gly Glu Leu

305 310 315

<210> 28

<211> 954

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 argB

<400> 28

atgaatgact tgatcaaaga tttaggctct gaggtgcgcg caaatgtcct cgctgaggcg 60

ttgccatggt tgcagcactt ccgcgacaag attgttgtcg tgaaatatgg cggaaacgcc 120

atggtggatg atgatctcaa ggctgctttt gctgccgaca tggtcttctt gcgcaccgtg 180

ggcgcaaaac cagtggtggt gcacggtggt ggacctcaga tttctgagat gctaaaccgt 240

gtgggtctcc agggcgagtt caagggtggt ttccgtgtga ccactcctga ggtcatggac 300

attgtgcgca tggtgctctt tggtcaggtc ggtcgcgatt tagttggttt gatcaactct 360

catggccctt acgctgtggg aacctccggt gaggatgccg gcctgtttac cgcgcagaag 420

cgcatggtca acatcgatgg cgtacccact gatattggtt tggtcggaga catcattaat 480

gtcgatgcct cttccttgat ggatatcatc gaggccggtc gcattcctgt ggtctctacg 540

attgctccag gcgaagacgg ccagatttac aacattaacg ccgataccgc agcaggtgct 600

ttggctgcag cgattggtgc agaacgcctg ctggttctca ccaatgtgga aggtctgtac 660

accgattggc ctgataagag ctcactggtg tccaagatca aggccaccga gctggaggcc 720

attcttccgg gacttgattc cggcatgatt ccaaagatgg agtcttgctt gaacgcggtg 780

cgtgggggag taagcgctgc tcatgtcatt gacggccgca tcgcgcactc ggtgttgctg 840

gagcttttga ccatgggtgg aattggcacg atggtgctgc cggatgtttt tgatcgggag 900

aattatcctg aaggcaccgt ttttagaaaa gacgacaagg atggggaact gtaa 954

<210> 29

<211> 317

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 ArgB

<400> 29

Met Asn Asp Leu Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Val Arg Ala Asn Val

1 5 10 15

Leu Ala Glu Ala Leu Pro Trp Leu Gln His Phe Arg Asp Lys Ile Val

20 25 30

Val Val Lys Tyr Gly Gly Asn Ala Met Val Asp Asp Asp Leu Lys Ala

35 40 45

Ala Phe Ala Ala Asp Met Val Phe Leu Arg Thr Val Gly Ala Lys Pro

50 55 60

Val Val Val His Gly Gly Gly Pro Gln Ile Ser Glu Met Leu Asn Arg

65 70 75 80

Val Gly Leu Gln Gly Glu Phe Lys Gly Gly Phe Arg Val Thr Thr Pro

85 90 95

Glu Val Met Asp Ile Val Arg Met Val Leu Phe Gly Gln Val Gly Arg

100 105 110

Asp Leu Val Gly Leu Ile Asn Ser His Gly Pro Tyr Ala Val Gly Thr

115 120 125

Ser Gly Glu Asp Ala Gly Leu Phe Thr Ala Gln Lys Arg Met Val Asn

130 135 140

Ile Asp Gly Val Pro Thr Asp Ile Gly Leu Val Gly Asp Ile Ile Asn

145 150 155 160

Val Asp Ala Ser Ser Leu Met Asp Ile Ile Glu Ala Gly Arg Ile Pro

165 170 175

Val Val Ser Thr Ile Ala Pro Gly Glu Asp Gly Gln Ile Tyr Asn Ile

180 185 190

Asn Ala Asp Thr Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Ile Gly Ala Glu

195 200 205

Arg Leu Leu Val Leu Thr Asn Val Glu Gly Leu Tyr Thr Asp Trp Pro

210 215 220

Asp Lys Ser Ser Leu Val Ser Lys Ile Lys Ala Thr Glu Leu Glu Ala

225 230 235 240

Ile Leu Pro Gly Leu Asp Ser Gly Met Ile Pro Lys Met Glu Ser Cys

245 250 255

Leu Asn Ala Val Arg Gly Gly Val Ser Ala Ala His Val Ile Asp Gly

260 265 270

Arg Ile Ala His Ser Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Met Gly Gly Ile

275 280 285

Gly Thr Met Val Leu Pro Asp Val Phe Asp Arg Glu Asn Tyr Pro Glu

290 295 300

Gly Thr Val Phe Arg Lys Asp Asp Lys Asp Gly Glu Leu

305 310 315

<210> 30

<211> 954

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 argB

<400> 30

atgaatgact tgatcaaaga tttaggctct gaggtgcgcg caaatgtcct cgctgaggcg 60

ttgccatggt tgcagcattt ccgcgacaag attgttgtcg tgaaatatgg cggaaacgcc 120

atggtggatg atgatctcaa ggctgctttt gctgccgaca tggtcttctt gcgcaccgtg 180

ggcgcaaaac cagtggtggt gcacggtggt ggacctcaga tttctgagat gctaaaccgt 240

gtgggtctcc agggcgagtt caagggtggt ttccgtgtga ccactcctga ggtcatggac 300

attgtgcgca tggtgctctt tggtcaggtc ggtcgcgatt tagttggttt gatcaactct 360

catggccctt acgctgtggg aacctccggt gaggatgccg gcctgtttac cgcgcagaag 420

cgcatggtca acatcgatgg cgtacccact gatattggtt tggtcggaga catcattaat 480

gtcgatgcct cttccttgat ggatatcatc gaggccggtc gcattcctgt ggtctctacg 540

attgctccag gcgaagacgg ccagatttac aacatcaacg ccgataccgc agcgggtgct 600

ttggctgcag cgattggtgc agaacgcctg ctggttctca ccaatgtgga aggtctgtac 660

accgattggc ctgataagag ctcactggtg tccaagatca aggccaccga gctggaggcc 720

attcttccgg gacttgattc cggcatgatt ccaaagatgg agtcttgctt gaatgcggtg 780

cgtgggggag taagcgctgc tcatgtcatt gacggccgca tcgcgcactc ggtgttgctg 840

gagcttttga ccatgggtgg aattggcacg atggtgctgc cggatgtttt tgatcgggag 900

aattatccgg aaggcaccgt ttttagaaaa gacgacaagg atggggaact gtaa 954

<210> 31

<211> 391

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ArgD

<400> 31

Met Ser Thr Leu Glu Thr Trp Pro Gln Val Ile Ile Asn Thr Tyr Gly

1 5 10 15

Thr Pro Pro Val Glu Leu Val Ser Gly Lys Gly Ala Thr Val Thr Asp

20 25 30

Asp Gln Gly Asn Val Tyr Ile Asp Leu Leu Ala Gly Ile Ala Val Asn

35 40 45

Ala Leu Gly His Ala His Pro Ala Ile Ile Glu Ala Val Thr Asn Gln

50 55 60

Ile Gly Gln Leu Gly His Val Ser Asn Leu Phe Ala Ser Arg Pro Val

65 70 75 80

Val Glu Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Arg Phe Ser Leu Asp Asp Ala

85 90 95

Thr Leu Ala Ala Gln Thr Arg Val Phe Phe Cys Asn Ser Gly Ala Glu

100 105 110

Ala Asn Glu Ala Ala Phe Lys Ile Ala Arg Leu Thr Gly Arg Ser Arg

115 120 125

Ile Leu Ala Ala Val His Gly Phe His Gly Arg Thr Met Gly Ser Leu

130 135 140

Ala Leu Thr Gly Gln Pro Asp Lys Arg Glu Ala Phe Leu Pro Met Pro

145 150 155 160

Ser Gly Val Glu Phe Tyr Pro Tyr Gly Asp Thr Asp Tyr Leu Arg Lys

165 170 175

Met Val Glu Thr Asn Pro Thr Asp Val Ala Ala Ile Phe Leu Glu Pro

180 185 190

Ile Gln Gly Glu Thr Gly Val Val Pro Ala Pro Glu Gly Phe Leu Lys

195 200 205

Ala Val Arg Glu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Leu Met Ile Thr Asp

210 215 220

Glu Val Gln Thr Gly Val Gly Arg Thr Gly Asp Phe Phe Ala His Gln

225 230 235 240

His Asp Gly Val Val Pro Asp Val Val Thr Met Ala Lys Gly Leu Gly

245 250 255

Gly Gly Leu Pro Ile Gly Ala Cys Leu Ala Thr Gly Arg Ala Ala Glu

260 265 270

Leu Met Thr Pro Gly Lys His Gly Thr Thr Phe Gly Gly Asn Pro Val

275 280 285

Ala Cys Ala Ala Ala Lys Ala Val Leu Ser Val Val Asp Asp Ala Phe

290 295 300

Cys Ala Glu Val Ala Arg Lys Gly Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Ala

305 310 315 320

Lys Val Asp Gly Val Val Asp Val Arg Gly Arg Gly Leu Met Leu Gly

325 330 335

Val Val Leu Glu Arg Asp Val Ala Lys Gln Ala Val Leu Asp Gly Phe

340 345 350

Lys His Gly Val Ile Leu Asn Ala Pro Ala Asp Asn Ile Ile Arg Leu

355 360 365

Thr Pro Pro Leu Val Ile Thr Asp Glu Glu Ile Ala Asp Ala Val Lys

370 375 380

Ala Ile Ala Glu Thr Ile Ala

385 390

<210> 32

<211> 1176

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 argD

<400> 32

atgagcacgc tggaaacttg gccacaggtc attattaata cgtacggcac cccaccagtt 60

gagctggtgt ccggcaaggg cgcaaccgtc actgatgacc agggcaatgt ctacatcgac 120

ttgctcgcgg gcatcgcagt caacgcgttg ggccacgccc acccggcgat catcgaggcg 180

gtcaccaacc agatcggcca acttggtcac gtctcaaact tgttcgcatc caggcccgtc 240

gtcgaggtcg ccgaggagct catcaagcgt ttttcgcttg acgacgccac cctcgccgcg 300

caaacccggg ttttcttctg caactcgggc gccgaagcaa acgaggctgc tttcaagatt 360

gcacgcttga ctggtcgttc ccggattctg gctgcagttc atggtttcca cggccgcacc 420

atgggttccc tcgcgctgac tggccagcca gacaagcgtg aagcgttcct gccaatgcca 480

agcggtgtgg agttctaccc ttacggcgac accgattact tgcgcaaaat ggtagaaacc 540

aacccaacgg atgtggctgc tatcttcctc gagccaatcc agggtgaaac gggcgttgtt 600

ccagcacctg aaggattcct caaggcagtg cgcgagctgt gcgatgagta cggcatcttg 660

atgatcaccg atgaagtcca gactggcgtt ggccgtaccg gcgatttctt tgcacatcag 720

cacgatggcg ttgttcccga tgtggtgacc atggccaagg gacttggcgg cggtcttccc 780

atcggtgctt gtttggccac tggccgtgca gctgaattga tgaccccagg caagcacggc 840

accactttcg gtggcaaccc agttgcttgt gcagctgcca aggcagtgct gtctgttgtc 900

gatgacgctt tctgcgcaga agttgcccgc aagggcgagc tgttcaagga acttcttgcc 960

aaggttgacg gcgttgtaga cgtccgtggc aggggcttga tgttgggcgt ggtgctggag 1020

cgcgacgtcg caaagcaagc tgttcttgat ggttttaagc acggcgttat tttgaatgca 1080

ccggcggaca acattatccg tttgaccccg ccgctggtga tcaccgacga agaaatcgca 1140

gacgcagtca aggctattgc cgagacaatc gcataa 1176

<210> 33

<211> 391

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 ArgD

<400> 33

Met Ser Thr Leu Glu Thr Trp Pro Gln Val Ile Ile Asn Thr Tyr Gly

1 5 10 15

Thr Pro Pro Val Glu Leu Val Ser Gly Lys Gly Ala Thr Val Thr Asp

20 25 30

Asp Gln Gly Lys Val Tyr Ile Asp Leu Leu Ala Gly Ile Ala Val Asn

35 40 45

Ala Leu Gly His Ala His Pro Ala Ile Ile Glu Ala Val Thr Asn Gln

50 55 60

Ile Gly Gln Leu Gly His Val Ser Asn Leu Phe Ala Ser Arg Pro Val

65 70 75 80

Val Glu Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Arg Phe Ser Leu Asp Asp Ala

85 90 95

Thr Leu Ala Ala Gln Thr Arg Val Phe Phe Cys Asn Ser Gly Ala Glu

100 105 110

Ala Asn Glu Ala Ala Phe Lys Ile Ala Arg Leu Thr Gly Arg Ser Arg

115 120 125

Ile Leu Ala Ala Val His Gly Phe His Gly Arg Thr Met Gly Ser Leu

130 135 140

Ala Leu Thr Gly Gln Pro Asp Lys Arg Glu Ala Phe Leu Pro Met Pro

145 150 155 160

Ser Gly Val Glu Phe Tyr Pro Tyr Gly Asp Thr Asp Tyr Leu Arg Lys

165 170 175

Met Val Glu Thr Asn Pro Thr Asp Val Ala Ala Ile Phe Leu Glu Pro

180 185 190

Ile Gln Gly Glu Thr Gly Val Val Pro Ala Pro Glu Gly Phe Leu Lys

195 200 205

Ala Val Arg Glu Leu Cys Asp Glu Tyr Gly Ile Leu Met Ile Thr Asp

210 215 220

Glu Val Gln Thr Gly Val Gly Arg Thr Gly Asp Phe Phe Ala His Gln

225 230 235 240

His Asp Gly Val Val Pro Asp Val Val Thr Met Ala Lys Gly Leu Gly

245 250 255

Gly Gly Leu Pro Ile Gly Ala Cys Leu Ala Thr Gly Arg Ala Ala Glu

260 265 270

Leu Met Thr Pro Gly Lys His Gly Thr Thr Phe Gly Gly Asn Pro Val

275 280 285

Ala Cys Ala Ala Ala Lys Ala Val Leu Ser Val Val Asp Asp Ala Phe

290 295 300

Cys Ala Glu Val Thr Arg Lys Gly Glu Leu Phe Lys Glu Leu Leu Ala

305 310 315 320

Lys Val Asp Gly Val Val Asp Val Arg Gly Arg Gly Leu Met Leu Gly

325 330 335

Val Val Leu Glu Arg Asp Val Ala Lys Gln Ala Val Leu Asp Gly Phe

340 345 350

Lys His Gly Val Ile Leu Asn Ala Pro Ala Asp Asn Ile Ile Arg Leu

355 360 365

Thr Pro Pro Leu Val Ile Thr Asp Glu Glu Ile Ala Asp Ala Val Lys

370 375 380

Ala Ile Ala Glu Thr Ile Ala

385 390

<210> 34

<211> 1176

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 argD

<400> 34

atgagcacgc tggaaacttg gccacaggtc attattaata cgtacggcac cccaccagtt 60

gagctggtgt ccggcaaggg cgcaaccgtc accgatgacc agggcaaagt ctacatcgac 120

ttgctcgcgg gcatcgcagt caacgcgttg ggccacgccc acccggcgat catcgaggcg 180

gtcaccaacc agatcggcca acttggtcac gtctcaaact tgttcgcatc caggcccgtc 240

gtcgaggtcg ccgaggagct catcaagcgt ttttcgcttg acgacgccac cctcgccgcg 300

caaacccggg ttttcttctg caactcgggc gccgaagcaa acgaggctgc tttcaagatt 360

gcacgcttga ctggtcgttc ccggattctg gctgcagttc atggtttcca cggccgcacc 420

atgggttccc tcgcgctgac tggccagcca gacaagcgtg aagcattcct gccaatgcca 480

agcggtgtgg agttctaccc ttacggcgac accgattact tgcgcaaaat ggtagaaacc 540

aacccaacgg atgtggctgc tatcttcctc gagccaatcc agggtgaaac gggcgttgtt 600

ccagcacctg aaggattcct caaggcagtg cgcgagctgt gcgatgagta cggcatcttg 660

atgatcaccg atgaagtcca gactggcgtt ggccgtaccg gcgatttctt tgcacatcag 720

cacgatggcg ttgttcccga tgtggtgacc atggccaagg gacttggcgg cggtcttccc 780

atcggtgctt gtttggccac tggccgtgca gctgaattga tgaccccagg caagcacggc 840

accactttcg gtggcaaccc agttgcttgt gcagctgcca aggcagtgct gtctgttgtc 900

gatgacgctt tctgcgcaga agttacccgc aagggcgagc tgttcaagga acttcttgcc 960

aaggttgacg gcgttgtaga cgtccgtggc aggggcttga tgttgggcgt ggtgctggag 1020

cgcgacgtcg caaagcaagc tgttcttgat ggttttaagc acggcgttat tttgaatgca 1080

ccggcggaca acattatccg tttgaccccg ccgctggtga tcaccgacga agaaatcgca 1140

gacgcagtca aggctattgc cgagacaatc gcataa 1176

<210> 35

<211> 203

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 NCgl1469

<400> 35

Met Ser Pro Thr Val Leu Pro Ala Thr Gln Ala Asp Phe Pro Lys Ile

1 5 10 15

Val Asp Val Leu Val Glu Ala Phe Ala Asn Asp Pro Ala Phe Leu Arg

20 25 30

Trp Ile Pro Gln Pro Asp Pro Gly Ser Ala Lys Leu Arg Ala Leu Phe

35 40 45

Glu Leu Gln Ile Glu Lys Gln Tyr Ala Val Ala Gly Asn Ile Asp Val

50 55 60

Ala Arg Asp Ser Glu Gly Glu Ile Val Gly Val Ala Leu Trp Asp Arg

65 70 75 80

Pro Asp Gly Asn His Ser Ala Lys Asp Gln Ala Ala Met Leu Pro Arg

85 90 95

Leu Val Ser Ile Phe Gly Ile Lys Ala Ala Gln Val Ala Trp Thr Asp

100 105 110

Leu Ser Ser Ala Arg Phe His Pro Lys Phe Pro His Trp Tyr Leu Tyr

115 120 125

Thr Val Ala Thr Ser Ser Ser Ala Arg Gly Thr Gly Val Gly Ser Ala

130 135 140

Leu Leu Asn His Gly Ile Ala Arg Ala Gly Asp Glu Ala Ile Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Ala Thr Ser Thr Arg Ala Ala Gln Leu Tyr Asn Arg Leu Gly Phe

165 170 175

Val Pro Leu Gly Tyr Ile Pro Ser Asp Asp Asp Gly Thr Pro Glu Leu

180 185 190

Ala Met Trp Lys Pro Pro Ala Met Pro Thr Val

195 200

<210> 36

<211> 612

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 NCgl1469

<400> 36

atgagtccca ccgttttgcc tgctacacaa gctgacttcc ctaagatcgt cgatgttctg 60

gttgaagcat tcgccaacga tccagcattt ttacgatgga tcccgcagcc ggaccccggt 120

tcagcaaagc ttcgagcact tttcgaactg cagattgaga agcagtatgc agtggcggga 180

aatattgatg tcgcgcgtga ttctgaggga gaaatcgtcg gcgtcgcgtt atgggatcgg 240

ccagatggta atcacagtgc caaagatcaa gcagcgatgc tcccccggct cgtctccatt 300

ttcgggatca aggctgcgca ggtggcgtgg acggatttga gttcggctcg tttccacccc 360

aaattccccc attggtacct ctacaccgtg gcaacatcta gttctgcccg tggaacgggt 420

gttggcagtg cgcttcttaa tcacggaatc gctcgcgcgg gtgatgaagc tatctatttg 480

gaggcgacgt cgactcgtgc ggctcaacta tataaccgtc tgggatttgt gcccttgggt 540

tatatcccct cagatgatga tggcactcct gaactggcga tgtggaaacc gccagcgatg 600

ccaactgttt aa 612

<210> 37

<211> 203

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 NCgl1469

<400> 37

Met Ser Pro Thr Val Leu Pro Ala Thr Gln Ala Asp Phe Pro Lys Ile

1 5 10 15

Val Asp Val Leu Val Glu Ala Phe Ala Asn Asp Pro Ala Phe Leu Arg

20 25 30

Trp Ile Pro Gln Pro Asp Pro Gly Ser Ala Lys Leu Arg Ala Leu Phe

35 40 45

Glu Leu Gln Ile Glu Lys Gln Tyr Ala Val Ala Gly Asn Ile Asp Val

50 55 60

Ala Arg Asp Ser Glu Gly Glu Ile Val Gly Val Ala Leu Trp Asp Arg

65 70 75 80

Pro Asp Gly Asn His Ser Ala Lys Asp Gln Ala Ala Ile Leu Pro Arg

85 90 95

Leu Val Ser Ile Phe Gly Ile Lys Ala Ala Gln Val Ala Trp Thr Asp

100 105 110

Leu Ser Ser Ala Arg Phe His Pro Lys Phe Pro His Trp Tyr Leu Tyr

115 120 125

Thr Val Ala Thr Ser Ser Ser Ala Arg Gly Thr Gly Val Gly Ser Ala

130 135 140

Leu Leu Asn His Gly Ile Ala Arg Ala Gly Asp Glu Ala Ile Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Ala Thr Ser Thr Arg Ala Ala Gln Leu Tyr Asn Arg Leu Gly Phe

165 170 175

Val Pro Leu Gly Tyr Ile Pro Ser Asp Asp Asp Gly Thr Pro Glu Leu

180 185 190

Ala Met Trp Lys Pro Pro Ala Met Pro Thr Val

195 200

<210> 38

<211> 612

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 NCgl1469

<400> 38

atgagtccca ccgttttgcc tgctacacaa gctgacttcc ctaagatcgt cgatgttctg 60

gttgaagcat tcgccaacga tccagcattt ttacgatgga tcccgcagcc ggaccccggt 120

tcagcaaagc ttcgagcact tttcgaactg cagattgaga agcagtatgc agtggcggga 180

aatattgatg tcgcgcgtga ttctgaggga gaaatcgtcg gcgtcgcgtt atgggatcgg 240

ccagatggta atcacagtgc caaagatcaa gcagcgatac tcccccggct cgtctccatt 300

ttcgggatca aggctgcgca ggtggcgtgg acggatttga gttcggctcg tttccacccc 360

aaattccccc attggtacct ctacaccgtg gcaacatcta gttctgcccg tggaacgggt 420

gttggcagtg cgcttcttaa tcacggaatc gctcgcgcgg gtgatgaagc tatctatttg 480

gaggcgacgt cgactcgtgc ggctcaacta tataaccgtc tgggatttgt gcccttgggt 540

tatatcccct cagatgatga tggcactcct gaactggcga tgtggaaacc gccagcgatg 600

ccaactgttt aa 612

<210> 39

<211> 494

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 NCgl2522

<400> 39

Met Thr Ser Glu Thr Leu Gln Ala Gln Ala Pro Thr Lys Thr Gln Arg

1 5 10 15

Trp Ala Phe Leu Ala Val Ile Ser Gly Gly Leu Phe Leu Ile Gly Val

20 25 30

Asp Asn Ser Ile Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Leu Leu Arg Glu Gln Leu

35 40 45

Ala Ala Thr Glu Thr Gln Ala Leu Trp Ile Ile Asn Ala Tyr Pro Leu

50 55 60

Leu Met Ala Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu Gly Asp Lys Ile

65 70 75 80

Gly His Arg Arg Met Phe Leu Met Gly Leu Ser Ile Phe Gly Ile Ala

85 90 95

Ser Leu Gly Ala Ala Phe Ala Pro Thr Ala Trp Ala Leu Val Ala Ala

100 105 110

Arg Ala Phe Leu Gly Ile Gly Ala Ala Thr Met Met Pro Ala Thr Leu

115 120 125

Ala Leu Ile Arg Ile Thr Phe Glu Asp Glu Arg Glu Arg Asn Thr Ala

130 135 140

Ile Gly Ile Trp Gly Ser Val Ala Ile Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro

145 150 155 160

Ile Ile Gly Gly Ala Leu Leu Glu Phe Phe Trp Trp Gly Ser Val Phe

165 170 175

Leu Ile Asn Val Pro Val Ala Val Ile Ala Leu Ile Ala Thr Leu Phe

180 185 190

Val Ala Pro Ala Asn Ile Ala Asn Pro Ser Lys His Trp Asp Phe Leu

195 200 205

Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Ile Ile Thr Ile

210 215 220

Lys Glu Ser Val Asn Thr Ala Arg His Met Pro Leu Leu Leu Gly Ala

225 230 235 240

Val Ile Met Leu Ile Ile Gly Ala Val Leu Phe Ser Ser Arg Gln Lys

245 250 255

Lys Ile Glu Glu Pro Leu Leu Asp Leu Ser Leu Phe Arg Asn Arg Leu

260 265 270

Phe Leu Gly Gly Val Val Ala Ala Gly Met Ala Met Phe Thr Val Ser

275 280 285

Gly Leu Glu Met Thr Thr Ser Gln Arg Phe Gln Leu Ser Val Gly Phe

290 295 300

Thr Pro Leu Glu Ala Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Ala Leu Gly Ser

305 310 315 320

Phe Pro Met Ser Ile Ile Gly Gly Ala Asn Leu His Arg Trp Gly Phe

325 330 335

Lys Pro Leu Ile Ser Gly Gly Phe Ala Ala Thr Ala Val Gly Ile Ala

340 345 350

Leu Cys Ile Trp Gly Ala Thr His Thr Asp Gly Leu Pro Phe Phe Ile

355 360 365

Ala Gly Leu Phe Phe Met Gly Ala Gly Ala Gly Ser Val Met Ser Val

370 375 380

Ser Ser Thr Ala Ile Ile Gly Ser Ala Pro Val Arg Lys Ala Gly Met

385 390 395 400

Ala Ser Ser Ile Glu Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr Leu Leu Ser

405 410 415

Val Ala Ile Leu Gly Ser Leu Phe Pro Phe Phe Tyr Ser Leu His Ala

420 425 430

Pro Ala Glu Val Ala Asp Asn Phe Ser Ala Gly Val His His Ala Ile

435 440 445

Asp Gly Asp Ala Ala Arg Ala Ser Leu Asp Thr Ala Tyr Ile Asn Val

450 455 460

Leu Ile Ile Ala Leu Val Cys Ala Val Ala Ala Ala Leu Ile Ser Ser

465 470 475 480

Tyr Leu Phe Arg Gly Asn Pro Lys Gly Ala Asn Asn Ala His

485 490

<210> 40

<211> 1485

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 NCgl2522

<400> 40

atgacttcag aaaccttaca ggcgcaagcg cctacgaaaa cccaacgttg ggctttcctc 60

gccgttatca gcggtggtct ctttctgatc ggtgtagaca actcgattct ctacaccgca 120

ctccctctgc tgcgtgaaca gctcgcagcc accgaaaccc aagcgttgtg gatcatcaac 180

gcatatcccc tgctcatggc gggccttctt ttgggtaccg gcactttggg tgacaaaatc 240

ggccaccgcc ggatgttcct catgggcttg agcattttcg gaatcgcttc acttggtgct 300

gcgtttgctc caactgcgtg ggctcttgtt gctgcgagag ctttccttgg catcggtgcg 360

gcaacgatga tgcctgcaac cttggctctg atccgcatta cgtttgagga tgagcgtgag 420

cgcaacactg caattggtat ttggggttcc gtggcaattc ttggcgctgc ggcaggcccg 480

atcattggtg gtgcgctgtt ggaattcttc tggtggggtt cggttttcct cattaacgtt 540

ccggtggctg ttatcgcgtt gatcgctacg ctttttgtgg cgccggccaa tatcgcgaat 600

ccgtctaagc attgggattt cttgtcgtcg ttctatgcgc tgctcacact tgctgggttg 660

atcatcacga tcaaggaatc tgtgaatact gcacgccata tgcctcttct tttgggtgca 720

gtcatcatgt tgatcattgg tgcggtgttg tttagcagtc gtcagaagaa gatcgaggag 780

ccacttctag atctgtcgtt gttccgtaat cgccttttct taggcggtgt ggttgctgcg 840

ggcatggcga tgtttactgt gtccggtttg gaaatgacta cctcgcagcg tttccagttg 900

tctgtgggtt tcactccact tgaggctggt ttgctcatga tcccagctgc attgggtagc 960

ttcccgatgt ctattatcgg tggtgcaaac ctgcatcgtt ggggcttcaa accgctgatc 1020

agtggtggtt ttgctgccac tgccgttggc atcgccctgt gtatttgggg cgcgactcat 1080

actgatggtt tgccgttttt catcgcgggt ctattcttca tgggcgcggg tgctggttcg 1140

gtaatgtctg tgtcttccac tgcgattatc ggttccgcgc cggtgcgtaa ggctggcatg 1200

gcgtcgtcga tcgaagaggt ctcttatgag ttcggcacgc tgttgtctgt cgcgattttg 1260

ggtagcttgt tcccattctt ctactcgctg catgccccgg cagaggttgc ggataacttc 1320

tcggcgggtg ttcaccacgc gattgatggc gatgcggcgc gtgcatcttt ggacaccgca 1380

tacattaacg tgttgatcat tgccctagta tgcgcagtag cggctgctct gatcagcagt 1440

taccttttcc gcggaaatcc gaagggagcc aataatgcgc actag 1485

<210> 41

<211> 494

<212> PRT

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 NCgl2522

<400> 41

Met Ile Ser Glu Thr Leu Gln Ala Gln Ala Pro Thr Lys Thr Gln Arg

1 5 10 15

Trp Ala Phe Leu Ala Val Ile Ser Gly Gly Leu Phe Leu Ile Gly Val

20 25 30

Asp Asn Ser Ile Leu Tyr Thr Ala Leu Pro Leu Leu Arg Glu Gln Leu

35 40 45

Ala Ala Thr Glu Thr Gln Ala Leu Trp Ile Ile Asn Ala Tyr Pro Leu

50 55 60

Leu Met Ala Gly Leu Leu Leu Gly Thr Gly Thr Leu Gly Asp Lys Ile

65 70 75 80

Gly His Arg Arg Met Phe Leu Met Gly Leu Ser Ile Phe Gly Ile Ala

85 90 95

Ser Leu Gly Ala Ala Phe Ala Pro Thr Ala Trp Ala Leu Val Ala Ala

100 105 110

Arg Ala Phe Leu Gly Ile Gly Ala Ala Thr Met Met Pro Ala Thr Leu

115 120 125

Ala Leu Ile Arg Ile Thr Phe Glu Asp Glu Arg Glu Arg Asn Thr Ala

130 135 140

Ile Gly Ile Trp Gly Ser Val Ala Ile Leu Gly Ala Ala Ala Gly Pro

145 150 155 160

Ile Ile Gly Gly Ala Leu Leu Glu Phe Phe Trp Trp Gly Ser Val Phe

165 170 175

Leu Ile Asn Val Pro Val Ala Val Ile Ala Leu Ile Ala Thr Leu Phe

180 185 190

Val Ala Pro Ala Asn Ile Ala Asn Pro Ser Lys His Trp Asp Phe Leu

195 200 205

Ser Ser Phe Tyr Ala Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Ile Val Thr Ile

210 215 220

Lys Glu Ser Val Asn Thr Ala Arg His Leu Pro Leu Leu Val Gly Ala

225 230 235 240

Ile Ile Leu Leu Ile Ile Gly Ala Val Leu Phe Ser Ser Arg Gln Lys

245 250 255

Lys Ile Glu Glu Pro Leu Leu Asp Leu Ser Leu Phe Arg Asn Arg Leu

260 265 270

Phe Leu Gly Gly Val Val Ala Ala Gly Met Ala Met Phe Thr Val Ser

275 280 285

Gly Leu Glu Met Thr Thr Ser Gln Arg Phe Gln Leu Ser Val Gly Phe

290 295 300

Thr Pro Leu Glu Ala Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Ala Leu Gly Ser

305 310 315 320

Phe Pro Met Ser Ile Ile Gly Gly Ala Asn Leu His Arg Trp Gly Phe

325 330 335

Lys Pro Leu Ile Ser Gly Gly Phe Leu Ala Thr Ala Val Gly Ile Ala

340 345 350

Leu Cys Ile Trp Gly Ala Thr His Thr Asp Gly Leu Pro Phe Phe Ile

355 360 365

Ala Gly Leu Phe Phe Met Gly Ala Gly Ala Gly Ser Val Met Ser Val

370 375 380

Ser Ser Thr Ala Ile Ile Gly Ser Ala Pro Val Arg Lys Ala Gly Met

385 390 395 400

Ala Ser Ser Ile Glu Glu Val Ser Tyr Glu Phe Gly Thr Leu Leu Ser

405 410 415

Val Ala Ile Leu Gly Ser Leu Phe Pro Phe Phe Tyr Ser Leu His Ala

420 425 430

Pro Ala Glu Val Ala Asp Asn Phe Ser Ala Gly Val His His Ala Ile

435 440 445

Tyr Gly Asp Ala Ala Arg Ala Ser Leu Asp Thr Ala Tyr Ile Asn Val

450 455 460

Leu Ile Ile Ala Leu Val Cys Ala Val Ala Ala Ala Leu Ile Ser Ser

465 470 475 480

Tyr Leu Phe Arg Gly Asn Pro Lys Gly Ala Asn Asn Ala His

485 490

<210> 42

<211> 1485

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869 NCgl2522

<400> 42

atgatttcag aaactttgca ggcgcaagcg cctacgaaaa cccaacgttg ggctttcctc 60

gctgttatca gcggtggtct ctttctgatc ggtgtagaca actcaatcct ctacaccgca 120

ctccccctgc tgcgtgaaca actcgcagcc actgaaaccc aagcgttgtg gatcatcaac 180

gcatatcccc tgctcatggc gggtcttctt ttgggtaccg gcactttggg tgacaaaatc 240

ggccaccgcc ggatgttcct catgggcttg agcattttcg gaatcgcttc acttggcgct 300

gcgtttgctc caactgcgtg ggctcttgtt gctgcgagag ctttccttgg catcggtgcg 360

gcgacgatga tgcccgcaac cttggctctg atccgcatta cgtttgaaga tgaacgcgaa 420

cggaacaccg cgattggcat ttggggttct gtggcaattc ttggcgcggc ggcaggtccg 480

atcattggtg gtgcgctgtt ggaattcttc tggtggggtt cggttttcct cattaacgtt 540

ccggtggctg ttatcgcgtt gatcgctacg ctttttgtgg cgccggccaa tatcgcgaat 600

ccgtccaagc actgggattt cttatcctcg ttctatgcat tgcttaccct tgcaggtttg 660

attgtcacca tcaaagaatc ggtaaacact gcacgtcatc tgccactgct tgtaggtgcc 720

atcatcttgc ttatcattgg tgcggtgttg tttagcagtc gtcagaagaa gatcgaggag 780

ccacttctag atctgtcgtt gttccgtaat cgccttttct taggcggtgt ggttgctgcg 840

ggcatggcga tgtttactgt gtccggtttg gaaatgacta cctcgcagcg tttccagttg 900

tctgtgggtt tcactccact tgaggctggt ttgctcatga tcccagctgc attgggtagc 960

ttcccgatgt ctattatcgg tggtgcaaac ttgcatcgtt ggggcttcaa accgctgatc 1020

agtggtggtt tccttgccac ggcagtcggc atcgccctgt gtatttgggg cgcgactcat 1080

actgatggtt tgccgttttt catcgcgggt ctgttcttca tgggcgcggg tgctggttcg 1140

gtaatgtctg tgtcttccac tgcgattatc ggttccgcgc cggtgcgtaa ggctggcatg 1200

gcgtcgtcga tcgaagaggt ctcttatgag ttcggcacgc tgttgtctgt cgcgattttg 1260

ggtagcttgt tcccattctt ctactcgctg catgccccgg cagaggttgc ggataacttc 1320

tcggcgggtg ttcaccacgc gatttatggc gatgcggcgc gtgcatcttt ggacaccgca 1380

tacattaacg tgttgatcat tgccctagta tgcgcagtag cggctgctct gatcagcagt 1440

taccttttcc gcggaaatcc gaagggagcc aataatgcgc actag 1485

<210> 43

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sugR F1_ SalI праймер

<400> 43

cttgcatgcc tgcaggtcga caggattcat ctggcatctg gc 42

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sugR -R1 праймер

<400> 44

gtcactcctt aaagcaaaaa gcc 23

<210> 45

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sugR -F2_GTG праймер

<400> 45

tttttgcttt aaggagtgac gtgtacgcag aggagcgccg tc 42

<210> 46

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sugR -F2_TTG праймер

<400> 46

tttttgcttt aaggagtgac ttgtacgcag aggagcgccg tc 42

<210> 47

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sugR -R2_BamHI праймер

<400> 47

cgagctcggt acccggggat ccgcgagagt acgaagcgca gt 42

<210> 48

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sugR F3 праймер

<400> 48

tttttgcttt aaggagtgac gaaggcaacc atgaactcta atgtacgcag aggagcgccg 60

tc 62

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sugR R праймер

<400> 49

ggacttgcag tgactgtaag aa 22

<210> 50

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gltA F_speI праймер

<400> 50

gaaggaatga gttcctcgag actagtactc ggcacccatc cttgtc 46

<210> 51

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gltA R_speI праймер

<400> 51

gttattagat gtcgggccca ctagtgtgct gtacatgctc cttgaaaatc 50

<---

Реферат

Группа изобретений относится к модифицированному микроорганизму для получения орнитина и к способу получения орнитина с использованием этого микроорганизма. Предложен модифицированный микроорганизмCorynebacterium glutamicum, продуцирующий орнитин, с пониженной активностью регулятора транскрипции метаболизма сахара (SugR) по сравнению с эндогенной активностьюCorynebacterium glutamicumи повышенной активностью цитратсинтазы (GltA) по сравнению с эндогенной активностьюCorynebacterium glutamicum, где этотCorynebacterium glutamicumобладает способностью продуцировать орнитин. Также предложен способ получения орнитина с использованием указанного микроорганизма. Группа изобретений обеспечивает получение орнитина с высоким выходом. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 7 табл., 8 пр.

Формула