Глюкозочувствительная система доставки инсулина с использованием чувствительных к гипоксии нанокомпозитов - RU2719584C2

Чертежи

Описание

Родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет и преимущество в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №62/150622, поданной 21 апреля 2015 г., полное раскрытие которой включено в настоящий документ посредством отсылки.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Раскрытый в настоящем документе объект изобретения относится к системам и композициям, таким как везикулы, наночастицы, микроиглы и микроигольчатые матрицы, для глюкозочувствительной доставки средств для лечения диабета, таких как инсулин и/или его биоактивные производные. Раскрытый в настоящем документе объект изобретения дополнительно относится к способам получения композиций и к способам доставки средств для лечения диабета нуждающемуся в этом субъекту.

Уровень техники

Сахарный диабет представляет собой группу метаболических заболеваний, характеризующихся накоплением глюкозы в крови. См. Pickup et al., Diabetes-Metabolism Research and Reviews, 24, 604-610 (2008); и Stumvoll et al,. Lancet, 365, 1333-1346 (2005). По данным на 2014 г. 387 миллионов человек страдают диабетом во всем мире, и к 2035 г. их число составит 592 миллиона. См. Mo et al., Chemical Society Reviews, 43, 3595-3629 (2014); и

В течение последнего десятилетия предприняли попытку разработать трансдермальные инъекционные устройства с иглами микронного масштаба для доставки инсулина. См. Martanto et al., Pharmaceutical Research, 947-952 (2004); Narayan, J. Biomedical Nanotechnology, 10, 2244-2260 (2014); Ling et al., Acta Biomaterialia, 9, 8952-8961 (2013); Prausnitz et al., Nature Biotechnology, 26, 1261-1268 (2008); и Yang et al., Nature Communications, 4, (2013), doi 10.1038/ncomms2715. Тем не менее, по-прежнему существует потребность в дополнительных системах доставки инсулина и связанных с ними композициях, в частности, в системах доставки «замкнутого контура», которые могут быстро доставлять инсулин субъекту в ответ на изменения содержания глюкозы в крови и практически без боли.

Сущность изобретения

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает композицию, содержащую: (a) амфифильный полимерный материал, причем амфифильный полимерный материал содержит гидрофильный полимер, конъюгированный с чувствительной к гипоксии гидрофобной группой, причем указанная чувствительная к гипоксии гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, который может восстанавливаться в присутствии гипоксического окружения с образованием гидрофильного фрагмента; (b) средство для лечения диабета, необязательно при этом средство для лечения диабета представляет собой инсулин или его биоактивное производное; и (c) окисляющее глюкозу средство.

Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофильный полимер является биоразлагаемым. Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофильный полимер представляет собой такую полиаминокислоту, как полиглутаминовая кислота, синтетический блок-сополимер или полисахарид, необязательно при этом гидрофильный полимер представляет собой полисахарид, дополнительно необязательно при этом полисахарид представляет собой глюкозаминогликан. Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофильный полимер представляет собой гиалуроновую кислоту.

Согласно некоторым вариантам осуществления чувствительный к гипоксии фрагмент содержит нитроимидазол. Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофобная группа ковалентно связана с гидрофильным полимером. Согласно некоторым вариантам осуществления амфифильный полимерный материал содержит гидрофильный полимер, конъюгированный с аминогруппой амино-замещенного предшественника гидрофобной группы, тем самым образуя амид между указанной аминогруппой и группой карбоновой кислоты, присутствующей на гидрофильном полимере. Согласно некоторым вариантам осуществления амфифильный полимерный материал содержит гиалуроновую кислоту, конъюгированную с 6-(2-нитроимидазол)гексиламином.

Согласно некоторым вариантам осуществления окисляющее глюкозу средство представляет собой глюкозооксидазу (GOx). Согласно некоторым вариантам осуществления средство для лечения диабета представляет собой инсулин или его биоактивное производное, причем инсулин или его биоактивное производное выбраны из следующего: человеческий инсулин, рекомбинантный человеческий инсулин, инсулин от не являющегося человеком животного, инсулин короткого действия, аналог инсулина ультракороткого действия, инсулин средней продолжительности действия и/или инсулин длительного действия. Согласно некоторым вариантам осуществления средство для лечения диабета представляет собой рекомбинантный человеческий инсулин. Согласно некоторым вариантам осуществления амфифильный полимерный материал образует везикулу, инкапсулирующую указанное средство для лечения диабета и указанное окисляющее глюкозу средство.

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает наночастицу, содержащую: (a) амфифильный полимерный материал, причем амфифильный полимерный материал содержит гидрофильный полимер, конъюгированный с чувствительной к гипоксии гидрофобной группой, причем указанная чувствительная к гипоксии гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, который может восстанавливаться в присутствии гипоксического окружения с образованием гидрофильного фрагмента; (b) средство для лечения диабета, необязательно инсулин или его биоактивное производное; и (c) окисляющее глюкозу средство.

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает везикулу, содержащую амфифильный полимерный материал, содержащий гидрофильный полимер, конъюгированный с чувствительной к гипоксии гидрофобной группой, причем указанная чувствительная к гипоксии гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, который способен к восстановлению в гипоксическом окружении с образованием гидрофильного фрагмента, и дополнительно при этом (i) средство для лечения диабета, необязательно инсулин или его биоактивное производное, и (ii) окисляющее глюкозу средство содержатся внутри указанной везикулы. Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофильный полимер представляет собой такую полиаминокислоту, как полиглутаминовая кислота, синтетический блок-сополимер или такой полисахарид, как глюкозаминогликан, необязательно при этом гидрофильный полимер представляет собой гиалуроновую кислоту. Согласно некоторым вариантам осуществления чувствительный к гипоксии фрагмент содержит нитроимидазол. Согласно некоторым вариантам осуществления средство для лечения диабета представляет собой рекомбинантный человеческий инсулин. Согласно некоторым вариантам осуществления окисляющее глюкозу средство представляет собой глюкозооксидазу (GOx).

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает микроигольчатую матрицу, содержащую везикулу, содержащую амфифильный полимерный материал, содержащий гидрофильный полимер, конъюгированный с чувствительной к гипоксии гидрофобной группой, причем указанная чувствительная к гипоксии гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, который способен к восстановлению в гипоксическом окружении с образованием гидрофильного фрагмента, и дополнительно при этом (i) средство для лечения диабета, необязательно инсулин или его биоактивное производное, и (ii) окисляющее глюкозу средство содержатся внутри указанной везикулы. Согласно некоторым вариантам осуществления микроигольчатая матрица содержит множество микроигл, причем каждая из указанного множества микроигл характеризуется длиной, составляющей от приблизительно 20 до приблизительно 1000 мкм. Согласно некоторым вариантам осуществления каждая из множества микроигл характеризуется длиной, составляющей приблизительно 600 мкм.

Согласно некоторым вариантам осуществления микроигольчатая матрица предусмотрена как часть кожного пластыря, необязательно при этом указанный пластырь содержит один или несколько защитных слоев и/или совместимых с кожей клеевых основ.

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает систему доставки инсулина замкнутого контура, содержащую микроигольчатую матрицу, содержащую везикулу, содержащую амфифильный полимерный материал, содержащий гидрофильный полимер, конъюгированный с чувствительной к гипоксии гидрофобной группой, причем указанная чувствительная к гипоксии гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, который способен к восстановлению в гипоксическом окружении с образованием гидрофильного фрагмента, и дополнительно при этом (i) инсулин или его биоактивное производное и (ii) окисляющее глюкозу средство содержатся внутри указанной везикулы.

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает способ доставки средства для лечения диабета нуждающемуся в этом субъекту, причем способ включает (a) получение микроигольчатой матрицы, содержащей везикулу, содержащую амфифильный полимерный материал, содержащий гидрофильный полимер, конъюгированный с чувствительной к гипоксии гидрофобной группой, причем указанная чувствительная к гипоксии гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, который способен к восстановлению в гипоксическом окружении с образованием гидрофильного фрагмента, и дополнительно при этом (i) средство для лечения диабета, необязательно инсулин или его биоактивное производное, и (ii) окисляющее глюкозу средство содержатся внутри указанной везикулы, и (b) нанесение указанной матрицы на поверхность кожи указанного субъекта, при этом когда глюкоза контактирует с микроигольчатой матрицей, она окисляется, тем самым создавая гипоксическое окружение, что приводит к восстановлению чувствительного к гипоксии фрагмента с образованием гидрофильного фрагмента, приводя к разрушению везикул и высвобождению средства для лечения диабета, содержащегося в везикулах.

Согласно некоторым вариантам осуществления доставка средства для лечения диабета происходит со скоростью, соответствующей концентрации глюкозы, контактирующей с микроигольчатой матрицей. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект представляет собой млекопитающее. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект болен диабетом.

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает способ получения микроигольчатой матрицы для глюкозочувствительной доставки средства для лечения диабета, необязательно инсулина или его биоактивного производного, причем способ включает: (a) получение водного раствора везикулы, содержащей амфифильный полимерный материал, содержащий гидрофильный полимер, конъюгированный с чувствительной к гипоксии гидрофобной группой, причем указанная чувствительная к гипоксии гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, который способен к восстановлению в гипоксическом окружении с образованием гидрофильного фрагмента, и дополнительно при этом (i) средство для лечения диабета, необязательно инсулин или его биоактивное производное, и (ii) окисляющее глюкозу средство содержатся внутри указанной везикулы; (b) диспергирование указанного водного раствора в форму, содержащую множество полостей для микроигл, тем самым обеспечивая заполненную форму; (c) высушивание заполненной формы для удаления воды; и (d) удаление формы с получением микроигольчатой матрицы. Согласно некоторым вариантам осуществления способ дополнительно включает поперечно-сшивающие полимерные материалы в микроигольчатой матрице. Согласно некоторым вариантам осуществления поперечное связывание осуществляют под воздействием ультрафиолетового (УФ) облучения.

Согласно некоторым вариантам осуществления стадию (b) проводят в условиях вакуума. Согласно некоторым вариантам осуществления после стадии (b) форму центрифугируют для уплотнения мицелл в полости для микроигл.

Согласно некоторым вариантам осуществления перед стадией (c) дополнительный гидрофильный полимер и/или химическое поперечно-сшивающее средство добавляют к форме, необязательно при этом форму центрифугируют после добавления дополнительного гидрофильного полимера и/или химического поперечно-сшивающего средства, дополнительно необязательно при этом дополнительный гидрофильный полимер представляет собой модифицированную гиалуроновую кислоту, такую как модифицированная алкиленом и/или модифицированная акрилатом гиалуроновая кислота.

Согласно некоторым вариантам осуществления стадию (c) проводят в вакуумном эксикаторе. Согласно некоторым вариантам осуществления форма содержит силикон.

Соответственно, цель раскрытого в настоящем документе объекта изобретения - предусмотреть композиции, везикулы, наночастицы, микроиглы, микроигольчатые матрицы, системы и способы глюкозочувствительной доставки средства для лечения диабета, такого как инсулин и/или его производное, а также способы получения микроигольчатых матриц. Эту и другие цели достигают полностью или частично с помощью раскрытого в настоящем документе объекта изобретения.

Цель раскрытого в настоящем документе объекта изобретения, который был указан выше, другие цели и преимущества раскрытого в настоящем документе объекта изобретения станут очевидными специалистам в настоящей области техники после изучения приведенного ниже описания раскрытого в настоящем документе объекта изобретения и неограничивающих фигур и примеров.

Краткое описание чертежей

Фигура 1A представляет собой схематическое изображение, на котором показано образование глюкозочувствительной системы доставки инсулина, содержащей чувствительную к гипоксии везикулу, которая также в настоящем документе называется глюкозочувствительная везикула (GRV), полученную с использованием чувствительной к гипоксии (HS) гиалуроновой кислоты (HA) и нагруженную инсулином и окисляющим глюкозу ферментом, т.е. глюкозооксидазой (GOx); восстановление гидрофобного чувствительного к гипоксии фрагмента, т.е. 2-нитроимидазола (NI), в GRV с образованием гидрофильных фрагментов (2-аминоимидазола), запускаемое гипоксией, вызванной окислением глюкозы с помощью GOx; и последующая разборка GRV и высвобождение инсулина из GRV.

На фигуре 1В показаны схематические изображения содержащего глюкозочувствительные везикулы (GRV) пластыря на основе микроигольчатой матрицы для in vivo доставки инсулина, запускаемой гипергликемическим состоянием. Микроиглы могут содержать GRV, описанные для фигуры 1A, и пластырь можно наносить на кожу. При состоянии нормогликемии высвобождается небольшое количество инсулина; но при гипергликемическом состоянии запускается высвобождение инсулина из микроигл.

Фигура 2A представляет собой серию полученных с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (TEM) изображений глюкозочувствительных везикул (GRV), нагруженных инсулином и глюкозооксидазой (i) перед инкубацией в 400 миллиграммах на децилитр (мг/дл) раствора глюкозы, (ii) через 20 минут инкубации в 400 мг/дл раствора глюкозы, (iii) через 1 час инкубации в 400 мг/дл раствора глюкозы, или (iv) через 24 часа инкубации в 400 мг/дл раствора глюкозы.

Фигура 2B представляет собой гистограмму, на которой показано распределение по размерам глюкозочувствительных везикул (GRV) перед инкубацией в 400 мг/дл раствора глюкозы.

Фигура 2C представляет собой гистограмму, на которой показано распределение по размерам глюкозочувствительных везикул (GRV) после инкубации в 400 мг/дл раствора глюкозы в течение 24 часов.

Фигура 2D представляет собой 2,5-мерное (2,5D) флуоресцентное изображение раствора нагруженных инсулином, меченым флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), глюкозочувствительных везикул (GRV) перед инкубацией в 400 мг/дл раствора глюкозы.

Фигура 2E представляет собой 2,5-мерное (2,5D) флуоресцентное изображение раствора нагруженных инсулином, меченым флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), глюкозочувствительных везикул (GRV) после инкубации в 400 мг/дл раствора глюкозы в течение 1 ч при 37°С.

Фигура 2F представляет собой график, на котором показан профиль длительности фосфоресценции для глюкозочувствительных везикул (GRV), инкубированных в растворах глюкозы, содержащих различные концентрации глюкозы и содержащих молекулярный зонд концентрации кислорода. Данные представлены для GRV, инкубированных в 100 мг/дл раствора глюкозы (заштрихованные кружки) и в 400 мг/дл раствора глюкозы (заштрихованные треугольники). Для сравнения данные представлены для GRV, инкубированных в натрий-фосфатном буфере (PBS) без глюкозы (заштрихованные квадраты).

Фигура 2G представляет собой график, на котором показано зависимое от времени поглощение ультрафиолетового (УФ) излечения (при 330 нанометрах (нм)) глюкозочувствительных везикул (GRV) в различных растворах глюкозы при 37 градусах Цельсия (°С). Данные представлены для GRV, инкубированных в 100 мг/дл раствора глюкозы (заштрихованные кружки) и в 400 мг/дл раствора глюкозы (заштрихованные треугольники). Для сравнения данные представлены для GRV, инкубированных в натрий-фосфатном буфере (PBS) без глюкозы (заштрихованные квадраты). Планки погрешностей показывают среднеквадратичное отклонение (s.d.) для трех повторностей.

Фигура 3A представляет собой график, на котором показано in vitro суммарное высвобождение инсулина из глюкозочувствительных везикул (GRV), инкубированных в различных растворах глюкозы с различной концентрацией глюкозы (0 мг/дл глюкозы (т.е. PBS, заштрихованные квадраты); 100 мг/дл глюкозы (заштрихованные кружки); и 400 мг/дл глюкозы (заштрихованные треугольники) при 37 градусах Цельсия (°С).

Фигура 3B представляет собой график, на котором показаны саморегулируемые профили глюкозочувствительных везикул (GRV), содержащих глюкозооксидазу (GOx) и инсулин (GRV (E+I), незаштрихованные кружки), и сходных GRV, содержащий половину количества GOx (GRV(1/2E+I), заштрихованные кружки). Скорость высвобождения инсулина показана как функция от концентрации глюкозы (т.е. 100 мг/дл, 200 мг/дл или 400 мг/дл).

Фигура 3C представляет собой профиль пульсирующего высвобождения глюкозочувствительных везикул (GRV), подвергнутых последовательно воздействию 100 мг/дл раствора глюкозы в течение 10 минут и затем 400 мг/дл раствора глюкозы в течение 10 минут для нескольких повторений.

Фигура 3D представляет собой спектры кругового дихроизма (CD) раствора нативного инсулина (незаштрихованные кружки) и раствора инсулина, высвобожденного из глюкозочувствительных везикул (GRV), инкубированных в 400 мг/дл раствора глюкозы (заштрихованные кружки). Планки погрешностей представляют среднеквадратичное отклонение для трех повторностей.

Фигура 4A представляет собой схематическое изображение иллюстративного технологического процесса для пластырей на основе микроигольчатой (MN) матрицы, нагруженной глюкозочувствительными везикулами (GRV) согласно раскрытому в настоящем документе объекту изобретения из силиконовой формы.

Фигура 4B представляет собой фотографию иллюстративной микроигольчатой (MN) матрицы согласно раскрытому в настоящем документе объекту изобретения. Масштабная полоска в правом нижнем углу фотографии представляет 1 сантиметр (см).

Фигура 4C представляет собой полученное с помощью флуоресцентного микроскопа изображение микроигл (MN), нагруженных глюкозочувствительными везикулами (GRV), содержащими меченый флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) инсулин. Вставка представляет собой приближенное изображение одной из микроигл. Масштабная полоска представляет 200 микрометров (мкм).

Фигура 4D представляет собой полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM) изображение иллюстративной микроигольчатой (MN) матрицы согласно раскрытому в настоящем документе объекту изобретения. Масштабная полоска представляет 200 микрометров (мкм).

Фигура 4E представляет собой график, на котором показаны механические свойства микроигл (MN), нагруженных не связанных поперечными связями и связанных поперечными связями глюкозочувствительными везикулами (GRV).

Фигура 5A представляет собой группу изображений следующего: (вверху слева) спина мыши и кожа на ней (область внутри круга), чрескожно обработанная с помощью пластыря на основе микроигольчатой (MN) матрицы согласно раскрытому в настоящем документе объекту изобретения; (вверху справа) окрашивание с помощью трипанового синего, показывающее проникновение MN в кожу мыши; и (внизу) окрашенный гематоксилином и эозином (H&E) срез кожи мыши, в которую проникла только одна из MN. На изображении вверху справа масштабная полоска представляет 500 мкм (мкм). На изображении внизу масштабная полоска представляет 100 мкм (мкм); мышечная и жировая ткани показаны с помощью "M" и "F", соответственно; и область, где происходит проникновение MN, указана пунктирной линией.

Фигура 5B представляет собой график содержаний глюкозы в крови во время in vivo исследований осуществляемого с помощью пластыря на основе нагруженной глюкозочувствительными везикулами (GRV) микроигольчатой (MN) матрицы лечения диабета I типа у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином (STZ). Данные представлены для мышей, получавших лечение с помощью холостой MN (MN, не содержащей инсулин или фермент, незаштрихованные треугольники); MN, нагруженной GRV, содержащими только человеческий рекомбинантный инсулин (GRV(I), заштрихованные кружки); MN, нагруженной GRV, содержащими инсулин и фермент глюкозооксидазу (GRV(E+I), заштрихованные квадраты); и MN, нагруженной инсулином и половиной количества фермента (GRV(1/2E+I), незаштрихованные квадраты). В качестве контроля представлены данные для мышей, получивших лечение с помощью инъекции инсулина (незаштрихованные кружки).

Фигура 5C представляет собой график концентраций инсулина в плазме во время in vivo исследований осуществляемого с помощью пластыря на основе нагруженной глюкозочувствительными везикулами (GRV) микроигольчатой (MN) матрицы лечения диабета I типа у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином (STZ). Представлены данные для мышей, получивших лечение с помощью MN матрицы, нагруженной только человеческим рекомбинантным инсулином (GRV(I), заштрихованные треугольники); MN матрицы, нагруженной инсулином и ферментом глюкозооксидазой (GRV(E+I), заштрихованные квадраты); и NM матрицей, нагруженной инсулином и половиной количества фермента (GRV(1/2E+I), заштрихованные кружки).

Фигура 5D представляет собой полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM) изображение пластыря на основе нагруженной глюкозочувствительными везикулами (GRV) микроигольчатой (MN) матрицы после проникновения в спину мыши в течение 4 часов. MN нагружали с помощью GRV, содержащих инсулин и фермент глюкозооксидазу (т.е. GRV(E+I)). Масштабная полоска представляет 200 мкм (мкм).

Фигура 5E представляет собой график данных, полученных в in vivo тест на толерантность к глюкозе в крови у диабетических мышей через 1 час после введения пластыря на основе нагруженной глюкозочувствительными везикулами (GRV) микроигольчатой (MN) матрицы, в котором GRV содержали инсулин и фермент глюкозооксидазу (т.е. GRV(E+I), заштрихованные кружки). Для сравнения также показаны данные для здоровых мышей (заштрихованные квадраты) и для диабетических мышей через 1 час после введения пластыря на основе MN матрицы, в котором MN нагружены только инсулином (заштрихованные треугольники).

Фигура 5F представляет собой график, на котором показана ответная реакция на введенную с помощью интрапериотнеальной инъекции глюкозу у мышей из теста, описанного для фигуры 5E, рассчитанная на основе площади под кривой (AUC) через 120 минут с исходным уровнем, установленным на нулевой минуте показателем содержания глюкозы.

Фигура 5G представляет собой график, на котором показаны изменения содержания глюкозы в крови у мышей, получивших лечение с помощью дополнительного введения пластырь на основе микроигольчатой (MN) матрицы через 1 час после введения первого пластырь на основе нагруженной глюкозочувствительными везикулами (GRV) MN матрицы, где первый пластырь на основе нагруженной GRV MN матрицы содержал GRV, нагруженные инсулином и ферментом глюкозооксидазой (т.е. GRV(E+I)). Дополнительный пластырь на основе MN матрицы содержал GRV, нагруженные как инсулином, так и ферментом глюкозооксидазой (GRV(E+I)+GRV(E+I), незаштрихованные квадраты); GRV, нагруженные инсулином и половиной количества фермента (GRV(E+I)+(GRV(1/2E+1), заштрихованные кружки); или только инсулином (GRV(E+I)+инсулин, незаштрихованные кружки). Для сравнения также показаны данные для мышей, которые не получали второй пластырь на основе МЫ матрицы (GRV(E+I), заштрихованные квадраты). Черными стрелками указаны временные точки введения первого и второго пластыря на основе MN матрицы.

Фигура 5H представляет собой график, на котором показаны изменения содержания глюкозы в крови у здоровых мышей, получивших лечение с помощью пластырей на основе нагруженной глюкозочувствительными везикулами (GRV) микроигольчатой (MN) матрицы с течением времени. Данные представлены для мышей, получивших лечение с помощью пластыря на основе нагруженной GRV MN матрицы, где GRV содержали как инсулин, так и фермент глюкозооксидазу (GRV(E+I), заштрихованные кружки), и где GRV содержали только инсулин (GRV(I), заштрихованные треугольники). Для сравнения представлены данные для мышей, которым вводили инъекцию инсулина (инсулин, заштрихованные квадраты). Черной стрелкой показана временная точка введения.

Фигура 5I представляет собой график количественного определения гипогликемического индекса мышей, описанных для фигуры 5H. Гипогликемический индекс рассчитывали из разницы между начальным показателем содержания глюкозы в крови и низшим показателем содержания глюкозы в крови, деленной на время, в течение которого достигнут низший показатель содержания глюкозы в крови. *P<0,05 для введения с помощью пластыря на основе содержащей глюкозочувствительные везикулы (GRV) микроигольчатой (MN) матрицы с GRV, нагруженными ферментом и инсулином (GRV(E+I)), по сравнению с пластырем на основе MN матрицы, нагруженной инсулином (GRV(I)). Планки погрешностей показывают s.d. (n=5).

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Раскрытый в настоящем документе объект изобретения далее будет описан более полно со ссылкой на прилагаемые фигуры и примеры, в которых показаны репрезентативные варианты осуществления. Тем не менее, раскрытый в настоящем документе объект изобретения можно реализовать в различных формах и его не следует рассматривать как ограниченный вариантами осуществления, представленными в настоящем документе. Напротив, указанные варианты осуществления предусмотрены с тем, чтобы настоящее раскрытие было исчерпывающим и полным и полностью передавало объем вариантов осуществления специалистам в настоящей области техники. Определенные компоненты на фигурах необязательно представлены в масштабе, вместо чего акцент сделан на иллюстрацию принципов раскрытого в настоящем документе объекта изобретения (в некоторых случаях схематично).

Если не указано иное, все используемые в настоящем документе технические и научные термины имеют такие же значения, которые, как правило, понятны специалисту в настоящей области техники, к которой относится настоящее изобретение. Все публикации, заявки на выдачу патента, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки.

Во всем описании изобретения и формуле изобретения представленная химическая формула или название должны охватывать все активные оптические и стереоизомеры, а также рацемические смеси, в которых существуют такие изомеры и смеси.

I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Наряду с тем, что считается, что приведенные ниже термины будут хорошо понятны специалисту в настоящей области техники, приведенные ниже определения представлены для содействия объяснению раскрытого в настоящем документе объекта изобретения.

Согласно исторически сложившемуся соглашению в области патентного права термины в единственном числе относятся к "одному или нескольким" при использовании в настоящей заявке, включая в себя формулу настоящего изобретения. Таким образом, например, ссылка на "композицию" или "полимер" включает в себя множество таких композиций или полимеров и тому подобное.

Если не указано иное, все числа, выражающие количества, относящиеся к размеру, условиям реакции и т.д., используемые в настоящем описании изобретения и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях с помощью термина "приблизительно". Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, представленные в описании настоящего изобретения и прилагаемой формуле изобретения, представляют собой приближенные величины, которые могут варьировать в зависимости от требуемых свойств, которые стремились получить с помощью раскрытого в настоящем документе объекта изобретения.

Предусмотрено, что используемый в настоящем документе термин "приблизительно" в отношении значения или количества размера (т.е. диаметра), массы, концентрации или процентного отношения включает в себя вариации, составляющие в одном примере ±20% или ±10%, в другом примере ±5%, в другом примере ±1%, и в еще одном примере ±0,1% от установленного количества, поскольку такие вариации являются подходящими для осуществления раскрытых способов.

Используемый в настоящем документе термин "и/или", используемый в контексте перечисления объектов, относится к объектам, присутствующим отдельно или в комбинации. Таким образом, например, фраза "А, В, С и/или D" включает в себя А, В, С и D отдельно, но также включает в себя любую и все комбинации и подкомбинации А, В, С и D.

Термин "содержащий", который является синонимом "включая в себя", "включающий в себя" или "характеризующийся", является включающим или неограниченным и не исключает дополнительные, не перечисленные элементы или стадии способов. "Содержащий" представляет собой специальный термин, используемый в формулировке формулы изобретения, который означает, что названные элементы являются существенными, но можно добавить другие элементы, и это все еще будет образовывать конструкт в пределах объема формулы изобретения.

Используемая в настоящем документе фраза "состоящий из" исключает какой-либо элемент, стадию или ингредиент, не указанные в пункте формулы изобретения. Если фраза "состоит из" появляется в функциональной части формулы изобретения, а не непосредственно после ограничительной части пункта формулы изобретения, она ограничивает только элемент, представленный в этой части формулы изобретения; другие элементы не исключены из пункта формулы изобретения в целом.

Используемая в настоящем документе фраза "состоящий по существу из" ограничивает объем пункта формулы изобретения указанными материалами или стадиями, а также теми, которые не оказывают существенного влияния на основную(ые) и новую(ые) характеристику(и) заявленного объекта изобретения.

В отношении терминов "содержащий", "состоящий из" и "состоящий по существу из", если один из этих трех терминов используют в настоящем документе, раскрытый в настоящем документе и заявленный объект изобретения может включать в себя использование любого из других двух терминов.

Используемый в настоящем документе термин "алкил" включает в себя C_1-20 включительно, линейные (т.е. "неразветвленные"), разветвленные или циклические, насыщенные или по меньшей мере частично и в некоторых случаях полностью ненасыщенные (т.е. алкенильные и алкинильные) углеводородные цепи, включая в себя например, группы метила, этила, пропила, изопропила, бутила, изобутила, трет-бутила, пентила, гексила, октила, этенила, пропенила, бутенила, пентенила, гексенила, октенила, бутадиенила, пропинила, бутинила, пентинила, гексинила, гептинила и аленнила. "Разветвленная" относится к алкильной группе, в которой группа низшего алкила, такая как метил, этил или пропил, прикреплена к неразветвленной алкильной цепи. "Низший алкил" относится к алкильной группе, характеризующейся 1 - приблизительно 8 атомами углерода (т.е. С_1-8 алкил), например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомами углерода. "Высший алкил" относится к алкильной группе, характеризующейся приблизительно 10 - приблизительно 20 атомами углерода, например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 атомами углерода. Согласно определенным вариантам осуществления "алкил" относится, в частности, к С_1-8 неразветвленным алкилам. Согласно другим вариантам осуществления "алкил" относится, в частности, к С_1-8 алкилам с разветвленной цепью.

Алкильные группы могут необязательно являться замещенными ("замещенный алкил") одним или несколькими заместителями алкильных групп, которые могут являться одинаковыми или различными. Термин "заместитель алкильной группы" включает в себя без ограничения алкил, замещенный алкил, гало, нитро, амино, ариламино, ацил, гидроксил, арилоксил, алкоксил, алкилтио, арилтио, аралкилоксил, аралкилтио, карбоксил, алкоксикарбонил, оксо и циклоалкил. Необязательно в алкильную цепь может быть введен один или несколько атомов кислорода, серы или замещенных или незамещенных атомов азота, причем заместитель азота представляет собой водород, низший алкил (который также в настоящем документе называется "алкиламиноалкил") или арил.

Таким образом, используемый в настоящем документе термин "замещенный алкил" включает в себя алкильные группы, определенные в настоящем документе, в которых один или несколько атомов или функциональных групп алкильной группы замещены другим атомом или функциональной группой, включая в себя, например, алкил, замещенный алкил, галоген, арил, замещенный арил, алкоксил, гидроксил, нитро, амино, алкиламино, диалкиламино, сульфат и меркапто.

Термин "арил" используют в настоящем документе для обозначения ароматического заместителя, который может представлять собой одно ароматическое кольцо или многочисленные ароматические кольца, которые слиты вместе, связаны ковалентно или соединены общей группой, такой как без ограничения метиленовый или этиленовый фрагмент. Общая связывающая группа также может представлять собой карбонил, как в бензофеноне, или кислород, как в дифенилэфире, или азот, как в дифениламине. Термин "арил" специально включает в себя гетероциклические ароматические соединения. Ароматическое(ие) кольцо(а) может(могут) содержать фенил, нафтил, бифенил, дифенилэфир, дифениламин и бензофенон, среди прочего. Согласно конкретным вариантам осуществления термин "арил" означает циклическое ароматическое соединение, содержащее приблизительно 5 - приблизительно 10 атомов углерода, например, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 атомов углерода, и включая в себя 5- и 6-членые углеводородные и гетероциклические ароматические кольца.

Арильная группа может являться необязательно замещенной ("замещенный арил") одним или несколькими заместителями арильной группы, которые могут являться одинаковыми или различными, причем "заместитель арильной группы" включает в себя алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил, аралкил, гидроксил, алкоксил, арилоксил, аралкилоксил, карбоксил, ацил, гало, нитро, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, аралкоксикарбонил, ацилоксил, ациламино, ароиламино, карбамоил, алкилкарбамоил, диалкилкарбамоил, арилтио, алкилтио, алкилен и -NR'Rʺ, где R' и Rʺ может каждый представлять собой независимо водород, алкил, замещенный алкил, арил, замещенный арил и аралкил.

Таким образом, используемый в настоящем документе термин "замещенный арил" включает в себя арильные группы согласно представленному в настоящем документе описанию, в которых один или несколько атомов или функциональных групп арильной группы замещены другим атомом или функциональной группой, включая в себя, например, алкил, замещенный алкил, галоген, арил, замещенный арил, алкоксил, гидроксил, нитро, амино, алкиламино, диалкиламино, сульфат и меркапто.

Конкретные примеры арильных групп включают в себя без ограничения циклопентадиенил, фенил, фуран, тиофен, пиррол, пиран, пиридин, имидазол, бензимидазол, изотиазол, изоксазол, пиразол, пиразин, триазин, пиримидин, хинолин, изохинолин, индол, карбазол и подобное.

Термин "аралкил" относится к алкил-арильной группе, необязательно при этом алкильная и/или арильная группа содержит один или несколько заместителей алкильной или арильной группы.

Согласно некоторым вариантам осуществления термин "двухвалентная" относится к группе, которая может связывать (например, ковалентно связывать) или являться связанной с двумя другими группами, такими как другие алкильные, аралкильные, циклоалкильные или арильные группы. Как правило, два различных сайта на двухвалентной группе (например, два различных атома) могут связываться с группами на других молекулах. Например, двухвалентная группа может представлять собой группу алкилена.

"Алкилен" может относиться к неразветвленной или разветвленной двухвалентной алифатической углеводородной группе, характеризующейся 1 - приблизительно 20 атомами углерода, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 атомами углерода. Алкиленовая группа может являться неразветвленной, разветвленной или циклической. Алкиленовая группа также может являться необязательно ненасыщенной и/или замещенной одним или несколькими "заместителями алкильной группы". Необязательно в алкиленовую группу может быть введен один или несколько атомов кислорода, серы или замещенных или незамещенных атомов азота (которые также в настоящем документе называются "алкиламиноалкил"), где заместитель азота представляет собой алкил, как описано ранее. Иллюстративные алкиленовые группы включают в себя метилен (-CH₂-); этилен (-CH₂-CH₂-); пропилен (-(CH₂)₃-); циклогексилен (-C₆H₁₀-); -CH=CH-CH=CH-; -CH=CH-CH₂-; -(CH₂)_q-N(R)-(CH₂)_r-, где каждый из q и r независимо представляют собой целое число от 0 до приблизительно 20, например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, и R представляет собой водород или низший алкил; метилендиоксил (-O-CH₂-O-); и этилендиоксил (-O-(CH₂)₂-O-). Алкиленовая группа может содержать приблизительно 2 - приблизительно 3 атомов углерода и может дополнительно содержать 6-20 атомов углерода.

"Арилен" относится к двухвалентной арильной группе.

Термин "амино" относится к группе -NR'Rʺ, где R' и Rʺ каждый независимо выбран из группы, включая в себя Н и замещенный и незамещенный алкил, циклоалкил, гетероцикл, аралкил, арил и гетероарил. Согласно некоторым вариантам осуществления аминогруппа представляет собой -NH₂."Аминоалкил" и "аминоарил" относятся к группе - NR'Rʺ, причем R' является таким, как определено в настоящем документе выше для амино, и Rʺ представляет собой замещенный или незамещенный алкил или арил, соответственно.

Термины "карбоксилат" и "карбоновая кислота" могут относиться к группам -С(=O)O^- и -С(=O)ОН, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления "карбоксилат" может относиться или к группе -С(=O)O^-, или к группе -С(=O)ОН.

Термин "амид" относится к группе, характеризующейся формулой -С(=O)-NRRʺ, где R и Rʺ каждый независимо представляет собой Н, алкил, замещенный алкил, аралкил, замещенный аралкил, арил или замещенный арил.

Термины "наноразмерный", "наноматериал", "наноразмерный полимер" "нанокластер" и "наночастица" относятся к структуре (например, везикуле), характеризующейся по меньшей мере одним участком с размером (например, длиной, шириной, диаметром и т.д.), составляющим меньше чем приблизительно 1000 нм. Согласно некоторым вариантам осуществления размер составляет меньше (например, меньше чем приблизительно 500 нм, меньше чем приблизительно 250 нм, меньше чем приблизительно 200 нм, меньше чем приблизительно 150 нм, меньше чем приблизительно 125 нм, меньше чем приблизительно 100 нм, меньше чем приблизительно 80 нм, меньше чем приблизительно 70 нм, меньше чем приблизительно 60 нм, меньше чем приблизительно 50 нм, меньше чем приблизительно 40 нм, меньше чем приблизительно 30 нм или даже меньше чем приблизительно 20 нм). Согласно некоторым вариантам осуществления размер составляет меньше чем приблизительно 10 нм.

Согласно некоторым вариантам осуществления наночастица является приблизительно сферической. Если наночастица является приблизительно сферической, характеристический размер может соответствовать диаметру сферы. В дополнение к сферическим формам наночастица или другой наноразмерный материал может являться дисковидным, продолговатым, полиэдрическим, стержневидным, кубическим или характеризоваться неправильной формой. Наноразмерный материал также может характеризоваться неправильной формой или содержать кластеры сфер, стержней, дисков или кубов.

Используемый в настоящем документе термин "микро" (например, в термине "микроигла") относится к структуре, характеризующейся по меньшей мере одним участком с размером, составляющим меньше чем приблизительно 1000 мкм (мкм). Согласно некоторым вариантам осуществления термин "микро" относится к структуре, характеризующейся размером, составляющим от приблизительно 1 мкм до приблизительно 1000 мкм.

Термин "диаметр" является принятым настоящей области техники и его используют в настоящем документе для обозначения или физического диаметра, или гидродинамического диаметра. Диаметр по существу сферической частицы может относиться к физическому или гидродинамическому диаметру. Используемый в настоящем документе диаметр несферической частицы может относиться к наибольшему линейному расстоянию между двумя точками на поверхности частицы. В отношении многочисленных частиц диаметр частиц, как правило, относится к среднему диаметру частиц. Диаметр частиц можно измерить с использованием разнообразных техник в настоящей области техники, включая в себя без ограничения динамическое рассеяние света.

"Монодисперсный" используют в настоящем документе для описания популяции частиц, в которой все частицы характеризуются одинаковым или почти одинаковым размером. Например, "монодисперсный" может относиться к распределениям частиц, в которых 90% распределения находится в пределах 15%, 10% или 5% медианного размера частиц.

Термины "полимер" и "полимерный" относятся к химическим структурам, которые характеризуются повторяющимися звеньями (т.е. множественными копиями данной химической подструктуры). Используемые в настоящем документе полимеры могут относиться к группам, характеризующимся больше чем 10 повторяющимися звеньями и/или к группам, в которых повторяющееся звено отличается от метилена. Полимеры могут быть образованы из полимеризируемых мономеров. Полимеризируемый мономер представляет собой молекулу, которая содержит один или несколько реакционноспособных фрагментов {например, простые эфиры силокси, гидроксилы, амины, виниловые группы (т.е. углерод-углеродные двойные связи), галогениды (т.е. Cl, Br, F и I), сложные эфиры, активированные сложные эфиры и подобное}, которые могут реагировать с образованием связей с другими молекулами. Как правило, каждая молекула полимеризируемого мономера может связываться с двумя или больше другими молекулами. В некоторых случаях полимеризируемый мономер будет связываться только с одной другой молекулой, образуя конец полимерного материала. Некоторые полимеры содержат биоразлагаемые связи, такие как сложные эфиры или амиды, так чтобы они могли разлагаться с течением времени при биологических условиях.

"Сополимер" относится к полимеру, происходящему из больше чем одного вида мономера.

Используемый в настоящем документе термин "блок-сополимер" относится к сополимеру, который содержит блоки (т.е. полимерные подструктуры целого сополимера) в линейной последовательности. "Блок" относится к части сополимера, которая характеризуется по меньшей мере одним признаком, который не характерен для смежных частей макромолекулы. Таким образом, "блок-сополимер" может относиться к сополимеру, в котором смежные блоки являются структурно различными, т.е. каждый из указанных блоков содержит составные звенья, происходящие из различных характеристических видов мономера, или с различным составом или последовательным распределением составных звеньев.

Используемый в настоящем документе термин "биосовместимый", как правило, относится к материалу и любым его метаболитам или продуктам разложения, которые, как правило, являются нетоксическими для реципиента и не вызывают у реципиента каких-либо существенных неблагоприятных эффектов.

Используемый в настоящем документе термин "биоразлагаемый", как правило, относится к материалу, который будет разлагаться или разрушаться при физиологических условиях до меньших звеньев или химических соединений, которые способны подвергаться метаболизму, удаляться или выводиться из организма субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления время разложения зависит от состава и морфологии полимера. Подходящие периоды разложения составляют от дней до недель. Например, согласно некоторым вариантам осуществления полимер может разлагаться в течение периода времени, составляющего от семи дней до 24 недель, необязательно от семи дней до двенадцати недель, необязательно от семи дней до шести недель или дополнительно необязательно от семи дней до трех недель.

Термин "гидрофильный" может относиться к группе, которая растворяется или предпочтительно растворяется в воде и/или водных растворах.

Термин "гидрофобный" относится к группам, которые незначительно растворяются в воде и/или водных растворах и/или которые предпочтительно растворяются в жирах и/или неводных растворах.

Термин "амфифильный" относится к молекуле или полимеру, который содержит как гидрофильные, так и гидрофобные группы.

Термины "конъюгат" и "конъюгированный" может относиться к композициям, которые содержат по меньшей мере два различных химических фрагмента или молекулы (например, малые молекулы, полимеры, белки и т.д.), связанные друг с другом, например, посредством ионных, координационных или ковалентных связей. Согласно некоторым вариантам осуществления термин "конъюгат" относится к фрагментам или молекулам, которые ковалентно связаны друг с другом. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат может содержать два различных химических фрагмента, ассоциированных друг с другом посредством межмолекулярных сил, таких как водородные связи, лондоновские дисперсионные силы, вандерваальсово взаимодействие и т.д.

Используемый в настоящем документе термин "инсулин" относится к инсулину из организма человека или другого млекопитающего. Согласно некоторым вариантам осуществления термин "инсулин" относится к человеческому инсулину. Согласно некоторым вариантам осуществления термин "инсулин" относится к рекомбинантному человеческому инсулину.

Используемый в настоящем документе термин "биоактивное производное" относится к человеческому инсулину или инсулину другого млекопитающего, в котором один или несколько аминокислотных остатков заменены другим аминокислотным остатком или подвергнуты делеции, в котором цепь A и/или цепь B удлиннены путем добавления одного или нескольких аминокислотных остатков на N-конце или на С-конце и/или в котором инсулин модифицирован путем добавления одного или нескольких химических заместителей. Производное может функционировать для замещения эндогенного инсулина и сохранения по меньшей мере некоторой биологической активности эндогенного инсулина. Производные инсулина могут характеризоваться другой фармакокинетикой, чем эндогенный инсулин. Специалист в настоящей области техники может оптимизировать дозировки на основании фармакокинетики производного инсулина относительно человеческого инсулина на основании известной фармакокинетики.

Используемый в настоящем документе термин "средство для лечения диабета" может относиться к терапевтическому средству, которое лечит диабет или его осложнение (такое как без ограничения диабетическая нейропатия, диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия, глаукома и диабетический кетоацидоз) или другого нарушения метаболизма глюкозы, приводящего к гипергликемии. Согласно некоторым вариантам осуществления средство для лечения диабета представляет собой инсулин или его биоактивное производное или неинсулиновое лечебное средство, известное в настоящей области техники для применения в лечении диабета. Подходящие неинсулиновые лечебные средства для применения в лечении диабета включают в себя без ограничения инсулин-сенсибилизирующие лекарственные средства, ингибиторы DPP IV, глюкагон-подобный пептид 1 (GLP-1) и его аналоги, повышающие секрецию инсулина средства, такие как без ограничения сульфонилмочевины, меглитиниды, глюкозозависимый инсулинотропный пептид (GIP), активаторы рецептора инсулина, бигуаниды, тиазолидиндионы, ингибиторы альфа-глюкозидазы и подобное. Согласно некоторым вариантам осуществления средство для лечения диабета представляет собой инсулин или биоактивное производное.

Термины "поперечно-сшивающий реагент" или "поперечно-сшивающее средство" относятся к соединению, которое включает в себя по меньшей мере две реакционноспособные функциональные группы (или группы, которые можно деблокировать или с которых можно снять защитные группы с получением реакционноспособных функциональных групп), которые могут являться одинаковыми или различными. Согласно некоторым вариантам осуществления две реакционноспособные функциональные группы могут характеризоваться различной химической реакционной способностью (например, две реакционноспособные функциональные группы являются реакционноспособными (например, образуют связи, такие как ковалентные связи) с различными типами функциональных групп на других молекулах, или одна из двух реакционноспособных функциональных групп характеризуется тенденцией реагировать быстрее с конкретной функциональной группой на другой молекуле, чем другая реакционноспособная функциональная группа). Таким образом, поперечно-сшивающий реагент можно использовать для соединения (например, с помощью ковалентной связи) двух других структур (например, молекул, полимеров, белков, нуклеиновых кислот, везикул, липосом, наночастиц, микрочастиц и т.д.) с образованием поперечно-сшитой композиции.

Термин "везикула" может относиться к искусственно созданной частице (согласно некоторым вариантам осуществления наночастице), содержащей жидкость, заключенную в концентрический слой или слои молекулы или полимера (например, амфифильного полимера). В жидкости может быть растворено или суспендировано одно или несколько терапевтических средств (например, малых молекул, белков, нуклеиновых кислот и т.д.). Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытого в настоящем документе объекта изобретения жидкость может содержать средство для лечения диабета, такое как инсулин или его биоактивное производное, и окисляющее глюкозу средство, такое как глюкозооксидаза, растворенные в водном растворе. Жидкость может содержать больше чем одно терапевтическое средство, например, как инсулин или его биоактивное производное, так и другое терапевтическое средство, такое как неинсулиновое средство для лечения диабета или его осложнения. Согласно некоторым вариантам осуществления каждое терапевтическое средство может представлять собой растворимое в воде терапевтическое средство.

Используемый в настоящем документе термин "гипергликемия" может относиться к состоянию, при котором повышенное количество глюкозы циркулирует в плазме крови субъекта по отношению к здоровому индивидууму. Гипергликемию можно диагностировать с использованием способов, известных в настоящей области техники, включая в себя измерение содержаний глюкозы в крови натощак.

Используемый в настоящем документе термин "гиперинсулинемия" может относиться к состоянию, при котором наблюдают повышенные уровни циркулирующего инсулина, одновременно с этим содержания глюкозы в крови являются либо повышенными, либо нормальными. Гиперинсулинемию может вызвать инсулинорезистентность, ассоциированная с дислипидемией, например, высоким содержанием триглицеридов, высоким содержанием холестерина, высоким содержанием липопротеинов низкой плотности (LDL) и низким содержанием липопротеинов высокой плотности (HDL); высокими содержаниями мочевых кислот; синдромом поликистозных яичников; диабетом II типа и ожирением.

Используемый в настоящем документе термин "инсулинорезистентность" может относиться к состоянию, при котором нормальное количество инсулина не способно вызывать нормальный физиологический или молекулярный ответ. В некоторых случаях гиперфизиологическое количество инсулина, либо эндогенно произведенного, либо введенного экзогенно, способно преодолеть инсулинорезистентность, полностью или частично, и произвести биологический ответ.

Используемый в настоящем документе термин "метаболический синдром" может относиться к связанному кластеру признаков, который включает в себя без ограничения гиперинсулинемию, аномальную толерантность к глюкозе, ожирение, перераспределение жира в область живота или верхнюю часть тела, гипертензию, дисфибринолиз и дислипидемию, характеризующуюся высоким содержанием триглицеридов, низким содержанием липопротеинов высокой плотности (HDL) и высоким содержанием частиц с низкой плотностью - липопротеинов низкой плотности (LDL). Субъекты, характеризующиеся метаболическим синдромом, подвержены риску развития диабета 2 типа и/или других нарушений (например, атеросклероза).

Используемый в настоящем документе термин "толерантность к глюкозе" может относиться к способности субъекта контролировать содержание глюкозы в плазме и/или инсулина в плазме, когда поступление глюкозы в организм колеблется. Например, толерантность к глюкозе включает в себя способность снижать содержание глюкозы в плазме обратно до уровня перед потреблением глюкозы не позднее приблизительно 120 минут или около этого.

II. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Подобная искусственной поджелудочной железе глюкозочувствительная система доставки инсулина замкнутого контура, которая способна "секретировать" инсулин в ответ на повышенное содержание глюкозы в крови, может обеспечить требуемый путь регулирования гликемии с минимальным усилием для пациента и потенциальными улучшениями в отношении гликемии и качества жизни. См. Bratlie et al., Advanced Healthcare Materials, 1(3):267-284 (2012); Ravaine et al., J. Controlled Release, 132(1):2-11 (2008); и Wu et al., Chem. Rev., 111(12):7855-7875 (2011). Современные системы замкнутого контура комбинируют модуль мониторинга глюкозы и запускаемый датчиком модуль высвобождения инсулина. См. Bratlie et al., Advanced Healthcare Materials, 1(3):267-284 (2012); и Ravaine et al., J. Controlled Release, 132(1):2-11 (2008). Например, существуют электронные/механические устройства замкнутого контура, которые используют датчик непрерывного мониторинга содержания глюкозы, откалиброванный пациентом, и внешний инфузионный насос инсулина. См. Veiseh et al., Nature Reviews Drug Discovery, 14(1):45-57 (2015). Тем не менее, с такими устройствами могут быть связаны такие различные проблемы, как гарантирование точной обратной связи на сигнал и предотвращение биологического загрязнения.

Одним путем избежать указанных проблем является химический подход, в котором используют нагруженную инсулином матрицу, содержащую глюкозочувствительные элементы. Матрицу можно разработать так, чтобы она подвергалась структурным трансформациям, например, сжатию, набуханию или диссоциации, в ответ на изменения концентрации глюкозы, приводя к стимулируемому глюкозой высвобождению инсулина. См. Gordijo et al., Adv. Funct. Mater., 21(1):73-82 (2011); Gu et al,. ACS Nano, 7(8):6758-6766 (2013); Katoaka et al., J. Am. Chem. Soc., 120(48):12694-12695 (1998); и Gu et al., ACS Nano, 7(5):4194-4201 (2013). Возможные глюкозочувствительные фрагменты для синтетических устройств замкнутого контура включают в себя фенилборную кислоту (PBA), связывающий глюкозу белок (GBP) и глюкозооксидазу (GOx). К сожалению, большинство существующих синтетических систем замкнутого контура были ограничены in vitro исследованиями, при этом относительно небольшое их количество продемонстрировало применимость in vivo вследствие конкретных проблем, связанных с каждой глюкозочувствительной стратегией. Например, РВА и ее производные, как известно, обратимо взаимодействуют с молекулами полиатомных спиртов, такими как глюкоза (см. Aronoff et al., Carbohydr. Res., 40(2):299-309 (1975)); но для эффективного взаимодействия между глюкозой и РВА и последующего структурного изменения матрицы, как правило, необходимо основное значение рН, превышающее значение в физиологической среде. Также оставалась неустановленной безопасность и токсичность конъюгатов РВА. Конканавалин A (Con A) представляет собой наиболее широко используемую GBP для доставки инсулина, как правило, на основании своих многочисленных сайтов связывания и конкурентного взаимодействия с глюкозой и декстраном (используемым в качестве материала матрицы). См. Kim et al., J. Controlled Release, 11(1):193-201 (1990). Тем не менее, in vivo токсичность и нестабильность Con A ограничивает его клинические применения. См. Tiegs et al., J. Clin. Invest., 90(1):196 (1992).

GOx представляет собой фермент, который может превращать глюкозу в глюконовую кислоту в присутствии кислорода:

См. Wu et al., Chem. Rev., 111(12):7855-7875 (2011). Глюкозочувствительные системы, в которых используют GOx, ранее объединяли с рН-чувствительными материалами, которые могут или протонироваться, или разлагаться при локальном снижении рН, стимулированом увеличением концентрации глюкозы. Однако эффективность таких зависимых от снижения рН способов может быть снижена за счет медленной ответной реакцией, особенно в забуференной физиологической среде. См. Veiseh et al., Nature Reviews Drug Discovery, 14(1):45-57 (2015).

Раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает способ доставки инсулина, который комбинирует: (1) быструю ответную реакцию, для лучшей имитации фармакокинетики нормальной активности поджелудочной железы; (2) простоту введения; и (3) биосовместимость без длительных побочных эффектов. Более конкретно, раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает устройства для доставки инсулина (и/или других средств для лечения диабета) на основе чувствительных к гипоксии везикул, содержащих (например, растворенный в жидкости, заключенной в везикулу) инсулин (и/или другое средство для лечения диабета) и окисляющее глюкозу средство (например, GOx). Вместо использования ферментативно индуцированных изменений рН, раскрытые в настоящем документе устройства обладают преимуществом в локальном создании гипоксии вследствие потребления кислорода во время окисления глюкозы в качестве триггера для быстрого стимулирования высвобождения инсулина (и/или другого средства для лечения диабета) в ответ на гипергликемию. Коэффициент транспорта кислорода, как было показано, являлся более медленным, чем коэффициент диффузии иона водорода in vivo (см. Fletcher, Biophys. J., 29(3):437-458 (1980); Michaels et al. AICHE J., 21(5):985-996 (1975); и Dowd et al., Journale of Bone and Joint Surgery, British Volume, 65(1):79-83 (1983)), указывая на то, что более быстрый ответ может быть достигнут, если в глюкозочувствительные составы на основе окисляющих глюкозу средств включены чувствительные к гипоксии материалы.

Согласно одному варианту осуществления раскрытого в настоящем документе объекта изобретения для достижения чувствительного к гипоксии преобразования модифицированные 2-нитроимидазолом (NI) материалы использовали в качестве чувствительного к гипоксии материала. NI представляет собой гидрофобный компонент, который часто используют при визуализации злокачественных опухолей вследствие его высокой чувствительности гипоксическому состоянию в местах локализации опухоли. См. Nunn et al., Eur. J. Nucl. Med., 22(3):265-280 (1995); и Krohn et al., J. Nucl. Med., 49(Suppl. 2): 129S-148S (2008). NI можно превратить в гидрофильный 2-аминоимидазол в гипоксическом окружении посредством одноэлектронного восстановления, катализируемого серий нитроредуктаз, соединенных с биовосстанавливающим средством, таким как никотинамидаденинидинуклеотидфосфат (NADPH), кофермент, который содержится в больших количествах в биологических тканях. См. Nunn et al., Eur. J. Nucl. Med., 22(3):265-280 (1995); Krohn et al., J. Nucl. Med., 49(Suppl. 2):129S-148S (2008); Edwards, J. Antimicrob. Chemother., 31(1):9-20 (1993); и Takasawa et al., Stroke, 39(5):1629-1637(2008). (25-28).

Как показано на фигуре 1A, амин-функционализированный NI конъюгировали с биосовместимым, биоразлагаемым полимером, гиалуроновой кислотой (НА; молекулярная масса: 300 кДа). Посредством самосборки амфифильная чувствительная к гипоксии НА (HS-HA) легко может образовывать наноразмерные глюкозочувствительные везикулы (GRV), которые могут инкапсулировать рекомбинантный человеческий инсулин (и/или другое средство для лечения диабета) и окисляющее глюкозу средство, такое как GOx, в водном растворе. В присутствии высокого содержания глюкозы в крови растворенный кислород может быстро поглощаться вследствие окисления глюкозы, катализируемого окисляющим глюкозу средством, что приводит к локальному гипоксическому окружению. Группы NI на HS-HA затем восстанавливаются в гидрофильные 2-аминоимидазолы в присутствии NADPH и редуктазы, что приводит к диссоциации GRV и последующему высвобождению инсулина (и/или другого средства для лечения диабета).

Для повышения простоты введения раскрытые в настоящем документе GRV можно загрузить в пластырь на основе микроигольчатой (MN) матрицы для безболезненной доставки средства для лечения диабета (например, инсулина). См. фигуры 1B и 4A. Например, как показано на фигуре 4A, матрицу микроигл можно изготовить из поперечно-сшитой HA, где поперечное связывание может улучшить жесткость микроигл и ограничить потерю GRV из игл. Как показано на фигуре 1B, при подкожном введении GRV, загруженные в микроиглы, подвергаются разборке при воздействии на них высокого содержания глюкозы в интерстициальной жидкости в кровеносных и лимфатических капиллярных сетях, тем самым стимулируя высвобождение средства для лечения диабета (например, инсулина), который может быть быстро поглощен через региональные лимфатические и кровеносные капилляры. Как описано в настоящем документе ниже, иллюстративный "умный инсулиновый пластырь" с чувствительным к гипоксии, глюкозочувствительным механизмом может проявлять быструю регулируемую содержанием глюкозы ответную реакцию и надежное предотвращение гипогликемии в мышиной модели диабета 1 типа.

III. ГЛЮКОЗОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ВЕЗИКУЛЫ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К НИМ КОМПОЗИЦИИ И СИСТЕМЫ

Система доставки инсулина замкнутого контура, которая "секретирует" инсулин в ответ на содержание глюкозы в крови, имеет большие перспективы в лечении диабета 1 типа и прогрессирующего диабета 2 типа и улучшении качества жизни страдающих диабетом пациентов. Раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает согласно некоторым вариантам осуществления устройство глюкозочувствительной доставки для доставки инсулина и/или другого средства для лечения диабета с использованием безболезненного пластыря на основе микроигольчатой матрицы, содержащего чувствительные к гипоксии везикулы, которые могут быстро диссоциироваться и высвобождать инкапсулированное терапевтическое средство или средства (например, инсулин) при воздействии локального гипоксического окружения, созданного с помощью ферментативного окисления глюкозы при гипергликемическом состояния. Указанный "умный инсулиновый пластырь" может регулировать содержание глюкозы в крови с быстрой ответной реакцией и с предотвращением гипогликемии.

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает композиции для доставки средства для лечения диабета (например, инсулина или его биоактивных производных) нуждающемуся в этом субъекту, например, для контроля диабета или другого нарушения метаболизма глюкозы, которое приводит к гипергликемии. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе композиции могут обеспечить глюкозочувствительную доставку замкнутого контура средства для лечения диабета нуждающемуся в этом субъекту, тем самым обеспечивая более экономически эффективный и простой контроль диабета, а также профилактику гипогликемических осложнений лечения диабета.

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает композицию, содержащую:

(а) амфифильный полимерный материал, причем амфифильный полимерный материал содержит гидрофильный полимер, конъюгированный с чувствительной к гипоксии гидрофобной группой, причем чувствительная к гипоксии гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, который может восстанавливаться в присутствии гипоксического окружения с образованием гидрофильного фрагмента;

(b) средство для лечения диабета, необязательно инсулин или его биоактивное производное; и

(с) окисляющее глюкозу средство.

Гидрофильный полимер может представлять собой синтетический или встречающийся в природе биосовместимый полимер. Подходящие гидрофильные полимеры могут включать в себя фрагменты с полярными или заряженными боковыми цепями. Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофильный полимер может являться биоразлагаемым. Подходящие гидрофильные полимеры включают в себя без ограничения полиаминокислоты (такие как полиглутаминовая кислота, полиаспарагиновая кислота и т.д.), синтетические блок-сополимеры (например, в которых по меньшей мере один блок содержит гидрофильную полимерную цепь) и полисахариды, такие как глюкозаминогликаны (GAG). Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофильный полимер представляет собой GAG, такой как гиалуронан или гиалуроновая кислота; гепарин, гепарансульфат, хондроитинсульфат, дерматансульфат и кератинсульфат. Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофильный полимер представляет собой гиалуроновую кислоту.

Как указано выше, гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, например, фрагмент, который может подвергаться химической реакции или другому структурному изменению в ответ на снижение содержания кислорода (например, в растворителе или физиологическом окружении при контакте с амфифильным полимерным материалом). Например, чувствительная к гипоксии группа может подвергаться реакции или реакциям восстановления в ответ на уменьшение содержания кислорода. Реакцию или реакции восстановления можно катализировать ферментом. Согласно некоторым вариантам осуществления снижение содержания кислорода может являться результатом локализованного истощения кислорода, вызванного активностью окисляющего глюкозу средства, которое окисляет глюкозу при контакте с амфифильным полимерным материалом. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления гипоксия представляет собой побочный эффект увеличения n концентрации глюкозы вблизи амфифильного полимерного материала и ассоциирована с окисляющим глюкозу средством.

Репрезентативные чувствительные к гипоксии фрагменты включают в себя нитро-замещенные арильные группы. Согласно некоторым вариантам осуществления чувствительный к гипоксии фрагмент представляет собой нитроимидазол (например, 2-нитроимидазол). Нитроимидазол может содержать один или несколько заместителей арильной группы (например, алкил, гало и т.д.), замещенных на атомах углерода и/или атомах азота имидазольного кольца, т.е. в дополнение к нитрогруппе, замещенной на имидазольном кольце. Согласно некоторым вариантам осуществления чувствительный к гипоксии фрагмент может включать в себя больше чем одну нитрогруппу.

Согласно некоторым вариантам осуществления гидрофобная группа ковалентно связана с гидрофильным полимером. Например, гидрофобная группа может быть основана на молекуле-предшественнике, которая включает в себя аминогруппу. Аминогруппа молекулы-предшественника может образовывать амидную связь с группой карбоновой кислоты, присутствующей на гидрофильном полимере. Согласно некоторым вариантам осуществления амфифильный полимерный материал может содержать гиалуроновую кислоту (или другой гидрофильный полимер, который содержит карбоксильные группы боковых цепей), конъюгированную с замещенным 2-нитроимидазолом алкиламином, таким как без ограничения 6-(2-нитроимидазол)гексиламин, 5-(2-нитроимидазол)пентиламин, 4-(2-нитроимидазол)бутиламин, 7-(2-нитроимидазол)гептиламин, 8-(2-нитроимидазол)октиламин и подобное.

Можно использовать любое подходящие окисляющее глюкозу средство. Согласно некоторым вариантам осуществления окисляющее глюкозу средство представляет собой фермент, такой как глюкозооксидаза (GOx) (ЕС1.1.3.4), который окисляет глюкозу с получением пероксида водорода и D-глюконо-δ-актона, циклической формы глюконовой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления окисляющее глюкозу средство может представлять собой биологически активный вариант GOx.

Согласно некоторым вариантам осуществления средство для лечения диабета представляет собой инсулин или его биоактивное производное, такие как человеческий инсулин, рекомбинантный человеческий инсулин, инсулин от не являющегося человеком животного (например, бычий, свиной) или любой другой инсулин, включая в себя производные инсулина. Согласно некоторым вариантам осуществления инсулин происходит из того же вида, что и предусмотренный реципиент, т.е. человеческий инсулин для лечения людей. Инсулин или его биоактивное производное может включать в себя смеси различных инсулинов и/или производных. Инсулин или его биоактивное производное может включать в себя инсулины короткого действия, аналоги инсулина ультракороткого действия, инсулины средней продолжительности действия и/или инсулины длительного действия. Согласно некоторым вариантам осуществления инсулин или его биоактивное производное представляет собой инсулин короткого действия или инсулин ультракороткого действия.

Инсулины короткого действия начинают действовать не позднее, чем через 1-20 минут, достигая пика приблизительно через 1 час и продолжая работать от трех до пяти часов. Инсулину короткого действия необходимо приблизительно два часа до полной абсорбции в системный кровоток. Инсулины короткого действия включают в себя регулярный рекомбинантный человеческий инсулин (такой как HUMULIN™ продаваемый Lilly, и NOVOLIN™, продаваемый NovoNordisk). Бычьи и свиные инсулины, которые отличаются по нескольким аминокислотам от человеческого инсулина, но являются биоактивными у людей, также представляют собой инсулины короткого действия.

Инсулины ультракороткого действия включают в себя инсулины, которые были модифицированы или характеризуются измененными положениями аминокислот для усиления их скорости абсорбции. Существуют три типа доступных коммерческих аналогов инсулина ультракороткого действия: инсулин лиспро (инсулин с перестановкой лизина и пролина, продаваемый Eli Lilly как HUMALOG™), инсулин глулизин (продаваемый Sanofi-Aventis как APIDRA™) и инсулин аспарт (продаваемый Novo Nordisk как NOVOLOG™).

Инсулин средней продолжительности действия характеризуется более длительной продолжительностью действия, чем инсулин короткого действия, но он медленнее начинает действовать и ему требуется больше времени для достижения своей максимальной силы. Инсулин средней продолжительности действия, как правило, начинает действовать не позднее, чем через 2-4 часа после инъекции, достигает пика приблизительно через 4-14 часов после инъекции и остается эффективным вплоть до 24 часов после инъекции. Типы инсулина средней продолжительности действия включают в себя NPH (нейтральный протамин Хагедорна, или НПХ) и инсулин LENTE™. Инсулин NPH содержит протамин, который замедляет скорость абсорбции так, чтобы инсулину понадобилось больше времени для достижения кровотока, но характеризуется более длительным пиком и продолжительностью действия.

Инсулины длительного действия включают в себя Humulin™ U от Eli Lilly (пролонгированная цинковая суспензия человеческого инсулина Ultralente™ (происхождение - рекомбинантная ДНК)); и инсулин гларгин (LANTUS™ Aventis). Инсулин гларгин представляет собой рекомбинантный аналог человеческого инсулина, который может характеризоваться продолжительностью действия, составляющей вплоть до 24 часов. Он отличается от человеческого инсулина тем, что содержит глицин вместо аспарагина в положении 21 и два аргинина, добавленных к карбокси-концу бета-цепи. LANTUS™ состоит из инсулина гларгина, растворенного в прозрачной водной жидкости (100 МЕ, 3,6378 мг инсулина гларгина, 30 мкг цинка, 2,7 мг м-крезола, 20 мг глицерина 85% и вода до 1 мл).

Дополнительно или в качестве альтернативы инсулину или его биоактивному производному, раскрытая в настоящем документе композиция может содержать неинсулиновое активное средство, известное в настоящей области техники для лечения диабета, или его осложнения, или другого нарушения метаболизма глюкозы. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления раскрытая в настоящем документе композиция может включать в себя неинсулиновое лекарственное средство для лечения диабета, такое как без ограничения неинсулиновые средства для лечения диабета, перечисленные в настоящем документе ниже, например, глюкагон-подобный пептид 1 (GLP1) или его аналог, ингибитор альфа-глюкозидазы, сульфонилмочевина, тиазолидиндион или бигуанид.

Согласно некоторым вариантам осуществления амфифильный полимерный материал образует наночастицу, которая содержит средство для лечения диабета (например, инсулин или его биоактивное производное и/или другое средство для лечения диабета) и окисляющее глюкозу средство, заключенные или захваченные внутри наночастицы (например, в порах или других внутренних пространствах внутри наночастицы) или иным образом нековалентно ассоциированные с полимерным материалом. Согласно некоторым вариантам осуществления восстановление чувствительного к гипоксии фрагмента может разрушать структуру наночастицы (например, так как амфифильный полимер становится более гидрофильным), позволяя средству для лечения диабета (например, инсулину или его биоактивному производному) диспергироваться из наночастицы (например, путем диффузии). Согласно некоторым вариантам осуществления амфифильный полимерный материал образует везикулу, инкапсулирующую средство для лечения диабета (например, инсулин или его биоактивное производное) и окисляющее глюкозу средство. Восстановление чувствительного к гипоксии фрагмента (например, в ответ на гипоксию, являющуюся результатом увеличения активности окисляющего глюкозу средства вследствие увеличения содержания глюкозы) может приводить к разборке везикулы и высвобождению средства для лечения диабета (например, инсулина или его производного).

Согласно некоторым вариантам осуществления наночастицы и/или везикулы характеризуются средним диаметром, составляющим от приблизительно 50 до приблизительно 500 нм. Согласно некоторым вариантам осуществления средний диаметр составляет от приблизительно 50 до приблизительно 250 нм. Согласно некоторым вариантам осуществления средний диаметр составляет от приблизительно 80 до приблизительно 160 нм (например, приблизительно 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155 или 160 нм). Согласно некоторым вариантам осуществления наночастицы и/или везикулы характеризуются средним диаметром (например, измеренным посредством динамического рассеяния света), составляющим приблизительно 118 нм. Согласно некоторым вариантам осуществления наночастицы и/или везикулы могут являться монодисперсными или почти монодисперсными (например, при этом по меньшей мере приблизительно 80% распределения находится в пределах 15%, 10% или 5% медианного размера частиц).

Согласно некоторым вариантам осуществления композиции согласно раскрытому в настоящем документе объекту изобретения, например, наночастицы и/или везикулы, можно использовать для получения микроиглы или микроигольчатой матрицы для доставки средства для лечения диабета (например, инсулина или его биоактивного производного).

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает микроигольчатую матрицу, содержащую множество микроигл, содержащих везикулы и/или наночастицы, причем везикулы и/или наночастицы содержат амфифильный полимерный материал, содержащий гидрофильный полимер, конъюгированный (например, ковалентно конъюгированный) с чувствительной к гипоксии гидрофобной группой, причем указанная чувствительная к гипоксии гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, который способен к восстановлению в гипоксическом окружении с образованием гидрофильного фрагмента, и дополнительно при этом (i) средство для лечения диабета, необязательно инсулин или его биоактивное производное, и (ii) окисляющее глюкозу средство содержатся внутри указанной везикулы. Согласно некоторым вариантам осуществления микроигольчатая матрица может содержать множество микроигл, причем каждая из указанного множества микроигл характеризуется длиной, составляющей от приблизительно 20 до приблизительно 1000 мкм (например, приблизительно 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или приблизительно 1000 мкм). Согласно некоторым вариантам осуществления каждая из множества микроигл характеризуется длиной, составляющей от приблизительно 500 мкм до приблизительно 700 мкм. Согласно некоторым вариантам осуществления каждая микроигла может характеризоваться приблизительно конической или пирамидальной формой. Согласно некоторым вариантам осуществления конец микроиглы может составлять меньше чем приблизительно 100 мкм, меньше чем приблизительно 75 мкм, меньше чем приблизительно 50 мкм, меньше чем приблизительно 40 мкм, меньше чем приблизительно 30 мкм или меньше чем приблизительно 20 мкм. Согласно некоторым вариантам осуществления конец каждой из микроигл может составлять приблизительно 10 мкм.

Микроигольчатая матрица может содержать множество микроигл, причем основания микроигл расположены в любой подходящей двухмерной конфигурации. Микроиглы можно расположить в правильном порядке (например, в форме квадрата, прямоугольника, круга, овала или другой формы), где расстояние между отдельными микроиглами остается одинаковым или варьирует повторяющимся образом, или в неправильном порядке (например, где расстояние между отдельными микроиглами варьирует без видимых повторений).

Согласно некоторым вариантам осуществления микроигольчатую матрицу можно предусмотреть как часть кожного пластыря. Согласно некоторым вариантам осуществления микроигольчатая матрица может содержать один или несколько защитных слоев (например, для защиты микроигольчатой матрицы от влаги или физического повреждения (например, царапин). Согласно некоторым вариантам осуществления микроигольчатая матрица может содержать слой, который продолжается за пределы матрицы (например, в одной плоскости с основанием матрицы), который содержит совместимую с кожей клеевую основу для содействия прикреплению матрицы к коже.

Раскрытые в настоящем документе микроигольчатые матрицы могут высвобождать средство или средства для лечения диабета (например, инсулин или его биоактивное производное и/или другое средство для лечения диабета) глюкозочувствительным или глюкозозависимым образом. Согласно некоторым вариантам осуществления скорость высвобождения средства или средств для лечения диабета (например, инсулина или биоактивного производного) зависит от концентрации глюкозы, контактирующей с матрицей (например, скорость высвобождения быстрее, когда матрица контактирует с повышенными концентрациями глюкозы). Согласно некоторым вариантам осуществления микроигольчатая матрица представляет собой систему доставки инсулина замкнутого контура.

IV. СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предлагает способ доставки средства для лечения диабета, такого как инсулин или биоактивное производное инсулина, нуждающемуся в этом субъекту, причем способ предлагает введение композиции (например, наночастицы и/или везикулы) согласно раскрытому в настоящем документе объекту изобретения субъекту. Введение можно осуществить любым подходящим путем (например, пероральным, внутривенным путем (i.v.), интраперитонеально (i.p.), подкожным, внутримышечным, трансдермальным путем или посредством ингаляции). Раскрытые в настоящем документе композиции можно получить в терапевтически эффективном количестве в любом подходящем фармацевтически приемлемом носителе (например, воде), несущей среде или разбавителе.

Под "терапевтически эффективным количеством" подразумевают, что введение такого количества индивидууму, либо в однократной дозе, либо в качестве части серии доз, является эффективным, чтобы произвести на субъекта измеряемый эффект. Например, терапевтически эффективное количество может представлять собой количество, необходимое для уменьшения или снижения концентрации глюкозы в крови субъекта или чтобы вызвать улучшение в тесте на толерантность к глюкозе. Таким образом, терапевтически эффективное количество может представлять собой количество, достаточное для снижения или уменьшения любого уровня (например, исходного уровня) глюкозы в плазме натощак (FPG), причем, например, количество является достаточным, чтобы снизить уровень FPG, составляющий больше чем 200 мг/дл, до меньше чем 200 мг/дл, или при этом количество является достаточным, чтобы снизить уровень FPG, составляющий от приблизительно 175 мг/дл до приблизительно 200 мг/дл, до меньше чем начальный уровень. Согласно некоторым вариантам осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточное для снижения уровня FPG до меньше чем приблизительно 150 мг/дл, меньше чем приблизительно 125 мг/дл, меньше чем приблизительно 120 мг/дл, меньше чем приблизительно 115 мг/дл или меньше чем приблизительно 110 мг/дл. Терапевтически эффективное количество можно отрегулировать в соответствии с режимом введения доз и диагностическим анализом состояния субъекта (например, уровнями мониторинга глюкозы и/или инсулина в плазме). Терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости от состояния здоровья и физического состояния субъекта, массы субъекта, необходимой степени разрешения заболевания, активности инсулина или производного инсулина (или другого средства для лечения диабета), активности окисляющего глюкозу средства, состава и т.д.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ включает получение микроигольчатой матрицы согласно раскрытому в настоящем документе объекту изобретения и нанесение указанной матрицы на поверхность кожи субъекта. Когда глюкоза контактирует с микроигольчатой матрицей, она окисляется, тем самым создавая гипоксическое окружение, что приводит к восстановлению чувствительного к гипоксии фрагмента гидрофобной группы амфифильного полимерного материала, тем самым образуя гидрофильный фрагмент. Образование гидрофильного фрагмента может приводить к разрушению везикул и/или наночастиц, содержащих амфифильный полимерный материал, и высвобождению средства для лечения диабета (например, инсулина или биоактивного производного инсулина), содержащегося в везикулах и/или наночастицах. Согласно некоторым вариантам осуществления доставка средства для лечения диабета (например, инсулина или биоактивного производного инсулина) происходит со скоростью, соответствующей концентрации глюкозы, контактирующей с микроигольчатой матрицей.

Согласно некоторым вариантам осуществления больше чем одну микроигольчатую матрицу можно наносить на поверхность кожи субъекта, например, одновременно или последовательно. Например, микроигольчатые матрицы можно наносить последовательно каждые несколько часов. Согласно некоторым вариантам осуществления одну или несколько матриц можно наносить перед, во время или не позднее чем через несколько минут (например, не позднее чем через приблизительно 5 - приблизительно 120 минут) после приема пищи субъектом. Согласно некоторым вариантам осуществления матрицу наносят перед приемом пищи субъектом и вторую матрицу наносят не позднее чем через несколько минут после приема пищи субъектом.

Микроигольчатая матрица может включать в себя подходящую стандартную дозировку средства для лечения диабета (например, инсулина или его биоактивного производного), подходящую для подлежащего лечению субъекта (например, на основании массы тела субъекта) и/или на основании фактической или предполагаемой концентрации глюкозы в крови у подлежащего лечению субъекта (например, на основании фактического или предполагаемого потребления пищи (особенно потребления углеводов) субъектом). Термин "стандартная дозировка" может относиться к отдельной единице дозирования, содержащей заданное количество инсулина, окисляющего глюкозу средства и/или другого терапевтического средства, достаточное для получения требуемого или измеряемого эффекта.

Согласно некоторым вариантам осуществления одно или несколько дополнительных терапевтических средств содержатся внутри везикул и могут высвобождаться вместе со средством для лечения диабета (например, инсулином или его биоактивным производным). Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное терапевтическое средство является растворимым в воде. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой белок или производное белка.

Согласно некоторым вариантам осуществления везикула может включать в себя как инсулин (или его биоактивное производное), так и дополнительное терапевтическое средство, причем дополнительное терапевтическое средство представляет собой другое средство для лечения диабета или его осложнения (например, диабетической нейропатии, диабетической ретинопатии, диабетической нефропатии, глаукомы, диабетического кетоацидоза, бактериальных или грибковых инфекций). Например, согласно некоторым вариантам осуществления дополнительное терапевтическое средство может включать в себя одно или несколько неинсулиновых активных средств, известных в настоящей области техники и используемых в лечении диабета (например, диабета 2 типа). Неинсулиновые средства для лечения диабета могут попадать в несколько обширных классов лекарственных средств, включая в себя без ограничения инсулин-сенсибилизирующие лекарственные средства, ингибиторы DPP IV и аналоги GLP1, повышающие секрецию инсулина средства, включая в себя без ограничения сульфонилмочевины, такие как ацетогексамид (DYMELOR), хлорпропамид (DIABINESE), толазамид (TOLINASE), толбутамид (ORINASE), глимепирид (АМАРИЛ), глипизид (GLUCOTROL), глипизид пролонгированного высвобождения (GLUCOTROL XL), глибурид (DIABETA, MICRONASE), глибурид микронизированный (GLYNASE, PRESTAB), меглитиниды, такие как натеглинид (STARLIX) и репаглинид (PRANDIN), глюкозозависимый инсулинотропный пептид (GIP), глюкагон-подобный пептид (GLP)-1, морфилиногуанид BTS 67582, ингибиторы фосфодиэстеразы и производные сложного эфира сукцината, активаторы рецептора инсулина; инсулин-сенсибилизирующие бигуаниды, такие как метформин (GLUCOPHAGE), тиазолидиндионы (TZD), такие как троглитазон (REZULIN), пиоглитазон (ACTOS), розиглитазон (AVANDIA), МСС-555, ривоглитазон, циглитазон; не относящийся к TZD агонист рецепторов-γ, активируемых пролифераторами пероксисом (PPAR-γ) GL262570, ингибиторы альфа-глюкозидазы, такие как акарбоз (PRECOSE) и миглитол (GLYSET), комбинированные средства, такие как глюкованс (GLUCOPHAGE с GLYBURIDE), ингибиторы тирозинфосфатазы, такие как ванадий, ингибиторы PTP-1B и активаторы AMPK, включая в себя 5-аминоимидазол-4-карбоксамидрибонуклеозид (AICAR), и другие средства, такие как эксендин (EXENATIDE (синтетический эксендин-4)) и амилин (SYMLIN™ (прамлинтид ацетат)), D-хиро-инозитол, измененные пептидные лиганды (NBI-6024), комплекс anergix DB, ингибируемый ГАМК меланокортин, понижающее уровень глюкозы средство (ALT-4037), аэродоз (AEROGEN), имитаторы инсулина, инсулиноподобный фактор роста-1 отдельно или в комплексе с ВР3 (SOMATOKLINE), метоклопрамид HCL (Emitasol/SPD 425), аналоги мотилида/эритромицина и миметики GAG. Согласно определенным вариантам осуществления неинсулиновое средство для лечения диабета может представлять собой инсулин-сенсибилизирующее средство, такое как без ограничения тиазолидиндион, например, розиглитазон, пиоглитазон, троглитазон, MCC-555, ривоглитазон, циглитазон и подобное и их комбинации.

Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, получающий лечение согласно раскрытому в настоящем документе объекту изобретения, представляет собой субъекта - человека, хотя следует понимать, что описанные в настоящем документе способы являются эффективными в отношении всех видов позвоночных, которые, как подразумевается, включены в термин "субъект".

Более конкретно, согласно настоящему документу предусмотрено лечение млекопитающих, таких как люди, а также тех млекопитающих, которые являются важными ввиду их исчезновения (такие как амурские тигры), являются экономически важными (животные, разводимые на фермах для нужд человека) и/или социально значимыми (животные, которых содержат в качестве домашних питомцев или в зоопарках) для людей, например, плотоядные животные, кроме людей (такие как кошки и собаки), свиньи (свиньи, боровы и дикие кабаны), жвачные (такие как крупный рогатый скот, волы, овцы, жирафы, олени, козы, бизоны и верблюды) и лошади. Таким образом, варианты осуществления способов, описанных в настоящем документе, включают в себя лечение сельскохозяйственных животных, включая в себя без ограничения одомашненных свиньих (свиньи и боровы), жвачных, лошадей, сельскохозяйственную птицу и подобное.

Как правило, раскрытые в настоящем документе способы можно использовать для лечения субъектов с диабетом или другим нарушением метаболизма глюкозы, который приводит к увеличенной концентрации глюкозы в крови (т.е. гипергликемии). Фраза "нарушение метаболизма глюкозы" может включать в себя любое нарушение, характеризующееся клиническим симптомом или комбинацией клинических симптомов, который ассоциирован с повышенным содержанием глюкозы и/или повышенным содержанием инсулина у субъекта по отношению к здоровому индивидууму. Повышенные содержания глюкозы и/или инсулина могут проявляться при следующих заболеваниях, нарушениях и состояниях: гипергликемия, диабет II типа, гестационный диабет, диабет I типа, инсулинорезистентность, нарушенная толерантность к глюкозе, гиперинсулинемия, нарушенный метаболизм глюкозы, преддиабет, другие метаболические нарушения (такие как метаболический синдром, который также называется синдром X) и ожирение, среди прочего.

Говоря в широком смысле, термины "диабет" и "диабетический" относятся к прогрессирующему заболеванию метаболизма углеводов, включающему в себя неадекватную продукцию или утилизацию инсулина, часто характеризующемуся гипергликемией и гликозурией. Используемые в настоящем документе термины "преддиабет" и "преддиабетический" могут относиться к состоянию, при котором у субъекта отсутствуют характеристики, симптомы и подобное, как правило, наблюдаемые при диабете, но у субъекта есть характеристики, симптомы и подобное, которые, если их оставить без лечения, могут прогрессировать до диабета. Наличие указанных состояний можно определить с использованием, например, или анализа содержания глюкозы в плазме натощак (FPG), или перорального теста на толерантность к глюкозе (OGTT). Для обоих анализов, как правило, необходимо, чтобы субъект не ел в течение по меньшей мере 8 часов до начала анализа.

В анализе FPG содержание глюкозы в крови субъекта измеряют после завершения голодания; как правило, субъект голодает в течение ночи и содержание глюкозы в крови измеряют утром до приема субъектом пищи. У здорового субъекта, как правило, концентрация FPG составляет приблизительно 90 - приблизительно 100 мг/дл, у субъекта с "преддиабетом", как правило, концентрация FPG составляет приблизительно 100 - приблизительно 125 мг/дл, и у субъекта с "диабетом", как правило, содержание FPG составляет выше приблизительно 126 мг/дл.

В OGTT содержание глюкозы в крови субъекта измеряют после голодания и снова через два часа после того, как субъект выпивает содержащий большое количество глюкозы напиток. Через два часа после потребления содержащего большое количество глюкозы напитка у здорового субъекта, как правило, концентрация глюкозы в крови составляет ниже приблизительно 140 мг/дл, у субъекта с преддиабетом, как правило, концентрация глюкозы в крови составляет приблизительно 140 - приблизительно 199 мг/дл, и у страдающего диабетом субъекта, как правило, концентрация глюкозы в крови составляет приблизительно 200 мг/дл или выше.

Наряду с тем, что приведенные выше гликемические значения относятся к субъектам - людям, у субъектов - мышей нормогликемию, умеренную гипергликемию и явную гипергликемию определяют иным образом. Здоровый субъект - мышь после 4-часового голодания, как правило, характеризуется концентрацией FPG, составляющей приблизительно 100 - приблизительно 150 мг/дл, субъект - мышь с "преддиабетом", как правило, характеризуется концентрацией FPG, составляющей приблизительно 175 - приблизительно 250 мг/дл, и субъект - мышь с "диабетом", как правило, характеризуется концентрацией FPG, составляющей выше приблизительно 250 мг/дл.

Согласно некоторым вариантам осуществления субъект болен диабетом. Субъект может характеризоваться наличием диабета 1 типа или 2 типа. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект может характеризоваться наличием гестационного диабета или преддиабета. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект может характеризоваться наличием нарушения метаболизма глюкозы, отличного от диабета (например, метаболический синдром, нарушенный метаболизм глюкозы, гиперинсулинемия и т.д.). Подходящих кандидатов для лечения с использованием раскрытых в настоящем документе способов можно определить с использованием диагностических способов, известных в настоящей области техники, например, путем оценки содержаний глюкозы и/или инсулина в плазме. Например, подходящие субъекты могут включать в себя людей, характеризующихся концентрацией глюкозы в крови натощак (например, через 8-10 часового голодания), составляющей выше чем приблизительно 100 мг/дл, выше чем приблизительно 110 мг/дл, выше чем приблизительно 120 мг/дл, выше чем приблизительно 150 мг/дл или выше чем приблизительно 200 мг/дл. Подходящие субъекты также могут включать в себя людей, характеризующихся постпрандиальной концентрацией глюкозы в крови через 2 часа, составляющей больше чем приблизительно 140 мг/дл, больше чем приблизительно 150 мг/дл или больше чем приблизительно 200 мг/дл. Концентрация глюкозы можно представить в таких единицах, как миллимоль на литр (ммоль/л), что можно получить путем деления мг/дл на 18.

V. СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОИГОЛЬЧАТЫХ МАТРИЦ

Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытый в настоящем документе объект изобретения предусматривает способ получения микроигольчатой матрицы для глюкозочувствительной доставки средства для лечения диабета (например, инсулина или его биоактивного производного). Согласно некоторым вариантам осуществления способ может включать следующее:

(а) получение водного раствора везикулы и/или наночастицы согласно раскрытому в настоящем документе объекту изобретения;

(b) диспергирование указанного водного раствора в форму, содержащую множество полостей для микроигл, тем самым обеспечивая заполненную форму;

(c) высушивание заполненной формы для удаления воды; и

(d) удаление формы с получением микроигольчатой матрицы.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ может дополнительно предусматривать поперечно-сшивающие полимерные материалы в микроигольчатой матрице. Например, согласно некоторым вариантам осуществления химическое поперечно-сшивающее средство (например, N,N-метиленбисакриламид) и/или фотоинициатор можно добавить к форме перед высушиванием. Согласно некоторым вариантам осуществления образование поперечных связей можно осуществить под воздействием УФ облучения после удаления формы.

Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительный полимер можно добавить к форме перед высушиванием. Дополнительный полимер может быть одинаковым или отличным от гидрофильного полимера амфифильного полимерного материала. Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительный полимер представляет собой модифицированную гиалуроновую кислоту, такую как модифицированная алкиленом и/или модифицированная акрилатом гиалуроновая кислота.

Согласно некоторым вариантам осуществления заполнение формы на стадии (b) можно проводить в условиях вакуума и/или оно может включать центрифугирование формы (например, для содействия эффективной и/или повышенной упаковке везикул в полости для микроигл).

Согласно некоторым вариантам осуществления форму можно высушивать в эксикаторе или вакуумном эксикаторе.

Согласно некоторым вариантам осуществления форма может содержать полимер, такой как силикон (например, полидиметилсилокcан (PDMS)). Форма может содержать приблизительно 10, 50, 100, 250, 500, 1000 или больше микрополостей. Расстояние от кончика до кончика между концами микрополостей может составлять приблизительно 100 мкм - приблизительно 1000 мкм (например, приблизительно 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или приблизительно 1000 мкм).

Согласно некоторым вариантам осуществления полученную микроматрицу можно упаковать, например, для хранения или транспортировки. Например, упаковка может включать в себя полимерную пленку, такую как влаго- и/или газонепроницаемая полимерная пленка. Матрицы можно упаковать индивидуально или в упаковки для многочисленных матриц.

Примеры

Представленные ниже примеры включены для предоставления специалисту в настоящей области техники руководства для осуществления на практике репрезентативных вариантов осуществления раскрытого в настоящем документе объекта изобретения. В свете настоящего раскрытия и общего уровня квалификации в настоящей области техники специалистам в настоящей области техники понятно, что последующие примеры предназначены только для иллюстрации и что многочисленные изменения, модификации и замены можно осуществить, не отклоняясь от объема раскрытого в настоящем документе объекта изобретения.

Как правило, in vitro и in vivo результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента или дисперсионного анализа. При p-значении <0,05 различия между экспериментальными группами и контрольными группами считали статистически значимыми.

ПРИМЕР 1

РЕПРЕЗЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ К ГИПОКСИИ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ

Чувствительную к гипоксии гиалуроновую кислоту (HS-НА) синтезировали путем химического конъюгирования НА с 6-(2-нитроимидазол)гексиламином через образование амида. Все химические соединения приобретали у Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA), если не указано иное, и использовали в том виде, как получили. Натриевую соль гиалуроновой кислоты (молекулярная масса 300 кДа) приобретали у Freda Biochem Co., Ltd. (Shandong, China).

Вначале 6-(2-нитроимидазол)гексиламин синтезировали для реакции с карбоновыми кислотами НА. Вкратце, нитроимидазол (NI, 0,15 г, 1,3 ммоль) растворяли в DMF, к чему добавляли K₂CO₃ (0,28 г, 2,0 ммоль). Затем 6-(трет-бутилоксикарбониламино)гексилбромид (т.е. 6-(ВОС-амино)гексилбромид, 0,39 г, 1,4 ммоль) добавляли по каплям в раствор и перемешивали при 80°С в течение 4 ч. Твердые примеси удаляли из реакционной смеси с помощью фильтра и отмывали с помощью метанола. Остаточный растворитель затем испаряли с получением твердого продукта, который суспендировали в деионизированной (DI) воде и экстрагировали этилацетатом. Органический слой собирали и высушивали на сульфате натрия и затем концентрировали. Продукт снова растворяли в метаноле на льду. 5 мл 1,25 М HCl в метаноле добавляли к раствору и перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре (КТ), после чего растворитель удаляли с использованием роторного испарителя с получением амин-функционализированного NI. Далее 6-(2-нитроимидазол)гексиламин конъюгировали с НА в присутствии N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимидгидрохлорида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS). Кратко, 0,24 г НА (молекулярная масса: ~300 кДа) растворяли в воде, к чему добавляли EDC (0,56 г, 3,4 ммоль) и NHS (0,39 г, 3,4 ммоль) и перемешивали в течение 15 мин при КТ. Затем 6-(2-нитроимидазол)гексиламин (0,18 г, 0,85 ммоль) добавляли к смеси при КТ в течение 24 ч. Реакционный раствор подвергали тщательному диализу против смеси 1:1 DI воды и метанола в течение 1 дня и против DI воды в течение 2 дней. Затем HS-HA получали путем лиофилизации и характеризовали с помощью¹H ЯМР (Varian GEMINI 2300; Varian Inc., Palo Alto, California, USA).

6-(2-нитроимидазол)гексиламин:¹Н ЯМР (DMSO-d₆, 300 МГц, δ м.д.): 1,30-1,78 (м, 8Н, NH₂CH₂(CH₂)₄), 2,73 (с, 2Н, NH₂CH₂), 4,38 (с, 2H, NCH₂), 7,19 (с, 1H), 7,87 (с, 1Н).

HS-HA:¹Н ЯМР (D₂O, 300 МГц, δ м.д.): 1,88-2,40 (м, 8Н, NH₂CH₂(CH₂)₄), 2,87-3,19 (м, 4Н, NH₂CH₂, NCH₂), 7,19 (с, 1Н), 7,48 (с, 1Н).

ПРИМЕР 2

СИНТЕЗ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК ГЛЮКОЗОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ВЕЗИКУЛ (GRV)

GPV получали путем самосборки в водном растворе. Кратко, 20 мг амфифильной HS-HA растворяли в смеси вода/метанол (2/1, объем/объем) с последующим добавлением 10 мг человеческого инсулина и 1,0 мг GOx. Человеческий рекомбинантный инсулин (цинковую (Zn) соль, 27,5 МЕ/мг) приобретали у Life Technology (Carlsbad, California, USA). Эмульсию перемешивали при 4°С в течение 2 часов. Затем метанол удаляли с помощью диализа против DI воды в течение 1 дня. Значение рН полученного раствора GRV доводили до 5,3 (изоэлектрическая точка (pI) инсулина) для удаления незагруженного инсулина путем центрифугирования при 8000 об/мин в течение 10 мин и дополнительно фильтровали с помощью центрифужного фильтра (100000 Да - граница пропускания по молекулярной массе, Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) при pH 7,4. Конечный раствор GRV хранили при 4°С для дальнейшего исследования. Емкость загрузки инсулином (LC) GRV определяли путем измерения содержания загруженного инсулина с использованием анализа белка Кумасси Плюс (Thermo Fisher Scientific inc., Waltham, Massachusetts, USA). Дзета-потенциал и распределение GRV по размерам измеряли на анализаторе размера частиц, молекулярной массы и дзета-потенциала Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., Malvern, United Kingdom). Получаемые с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ) изображения GRV получали на приборе JEOL 2000FX ТЕМ (JEOL USA, Inc., Peabody, Massachusetts, USA).

Таким образом, путем самосборки чувствительной к гипоксии гиалуроновой кислоты формировали GRV, инкапсулирующие рекомбинантный человеческий инсулин и GOx в сердцевине. См. фигуру 1A. HS-HA получали путем образования амидной связи с амин-функционализированным NI в течение трех стадий, как описано в примере 1. Встраивание гидрофобных групп NI делает полученную HA амфифильной, обеспечивая образование GRV в водном растворе. Более того, NI обеспечивает чувствительный к гипоксии элемент, который, как предполагают, подвергается биовосстановлению при гипоксических условия. См. Nunn et al., Eug. J. Nucl. Med, 22(3):265-280 (1995); и Takasawa et al., Stroke, 39(5):1629-1637 (2008). Восстановленный продукт с аминогруппами является растворимым в воде, что приводит к разборке GRV. См. фигуре 1A.

GRV характеризовались сферической формой с монодисперсным размером. См. фигуре 2A, полученное с помощью ТЕМ изображение слева. Средний диаметр GRV определяли как составляющий 118 нм с помощью динамического рассеяния света (DLS) (см. фигуру 2B), что согласуется с наблюдениями, полученными с помощью ТЕМ. Дзета-потенциал GRV измеряли как -34,7±0,4 мВ вследствие остаточного карбоксила НА. Флуоресцентное изображение GRV с меченым флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) инсулином дополнительно подтвердило успешное инкапсулирование инсулина. См. фигуру 2D. Емкость загрузки инсулином GRV определяли как 8,7%. Не подвергаясь гипоксическим условиям, полученные GRV являлись в высокой степени стабильными, и не наблюдали значительного осаждения при 4°С в течение месяца.

ПРИМЕР 3

IN VITRO ГЛЮКОЗОЧУВСТВИТЕЛЬНОЕ ВЫСВОБОЖДЕНИЕ ИНСУЛИНА ИЗ GRV Для оценки глюкозочувствительной способности GRV GRV инкубировали в 600 мкл буфера PBS (NaCl, 137 мМ; KCl, 2,7 мМ; Na₂HPO₄, 10 мМ; KH₂PO₄, 2 мМ; рН 7,4) с 100 мкМ NADPH и 5 мкг/мл цитохром c-редуктазы. Различные количества глюкозы добавляли для получения растворов с конечной концентрацией глюкозы, составляющей 0 мг/дл, 100 мг/дл или 400 мг/дл. Раствор с концентрацией глюкозы, составляющей 400 мг/дл, представляет типичное гипергликемическое содержание глюкозы, раствор с концентрацией глюкозы, составляющей 100 мг/дл представляет нормогликемическое содержание глюкозы, и раствор с концентрацией глюкозы, составляющей 0 мг/дл использовали в качестве контроля. Смеси инкубировали при 37°С в контейнере с концентрацией кислорода, составляющей 21%, путем регуляции с помощью массового расходометра. В заданные моменты времени значение рН каждой смеси регистрировали с использованием рН-метра (AB15, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA), и затем значение рН доводили до pI инсулина для выделения высвобожденного инсулина с помощью центрифугирования при 8000 об/мин в течение 10 мин. Концентрацию остаточного инсулина, инкапсулированного в GRV, исследовали с использованием анализа белка Кумасси Плюс (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA). Поглощение обнаруживали при 595 нм на мультимодальном устройстве для прочтения планшетов INFINITE® 200 PRO (Tecan Группа Ltd., Zurich, Switzerland), и содержание инсулина калибровали с помощью стандартной кривой инсулина. Для построения графика поглощения GRV в УФ-видимом диапазоне растворов интенсивность поглощения измеряли при 330 нм в установленные моменты времени. Для оценки профиля высвобождения инсулина из GRV при различных условиях pH GRV инкубировали в буфере PBS при pH 4,0 или при pH 7,4 в присутствии как 100 мкМ NADPH, так и 5 мкг/мл цитохром c-редуктазы. Высвобожденный инсулин измеряли с использованием того же способа, который представлен выше. Спектры кругового дихроизма (CD) в дальнем ультрафиолетовом диапазоне излучения для раствора нативного инсулина и раствора инсулина, высвобожденного из GRV (0,1 мг/мл), анализировали с использованием спектрометра CD (Aviv Biomedical Inc., Lakewood, New Jersey, USA).

Потребление кислорода, вызванное окислением глюкозы, катализируемым с помощью GOx, измеряли с использованием чувствительного к кислороду фосфоресцентного молекулярного зонда. См. Will et al., Nat. Protoc., 1(6):2563-2572 (2006); и Fercher et al., Acs Nano, 5(7):5499-5508 (2011). Образец, подвергнутый воздействию гипергликемического раствора, характеризовался пониженной концентрацией кислорода по сравнению с другими двумя образцами. См. фигуру 2F. Он быстро достигал равновесия за 10 минут, что указывает на то, что скорость потребления кислорода достигала равновесия со скоростью растворения. Зарегистрированное значение pH раствора GRV в 400 мг/дл растворе глюкозы постоянно снижается с течением времени, дополнительно подтверждая превращение глюкозы в глюконовую кислоту, катализируемое с помощью GOx.

В указанном гипоксическом окружении нитрогруппы HS-HA эффективно восстанавливались с помощью электронов из NADPH, катализируемого редуктазой. Согласно спектрам поглощения GRV в УФ-видимом диапазоне снижение характеристического пика NI при 330 нм и образование нового пика при 280 нм, что соответствует характеристическому пику 2-аминоимидазола, также подтверждало, что нитрогруппа NI превращалась в аминогруппу путем реакции восстановления при гипоксических условиях после 2-часовой инкубации с 400 мг/дл раствора глюкозы. Остаточную концентрацию NI подергали мониторингу в режиме реального времени путем измерения поглощения в УФ-видимом диапазоне при 330 нм. Соответствующая интенсивность GRV, инкубированных с 400 мг/дл раствора глюкозы, постепенно снижалась с течением времени (см. фигуру 2G), указывая на замещение гидрофобных групп NI аминогруппами в сердцевине.

Напротив, намного более медленное снижение интенсивности поглощения наблюдали в образцах, относящихся к 100 мг/дл раствора глюкозы, и отсутствие снижения наблюдали в контрольном образце без глюкозы. Кроме того, соответствующие изменения конформации и размера GRV наблюдали на всех полученных с помощью ТЕМ изображениях и DLS. См. фигуру 2A и фигуру 2C.

Для дополнительного подтверждения высвобождения инсулина из подвергнутых разборке GRV, инсулин, конъюгированный с FITC, инкапсулировали в GRV. Флуоресцентный сигнал являлся более гомогенно распределенным во всем растворе через 1 ч, тогда как исходный раствор GRV показывал большое количество кластерного сигнала, указывая на высвобождение FITC-инсулина с течением времени. См. фигуру 2E.

Быстрый профиль высвобождения инсулина достигали из GRV, инкубированных в 400 мг/дл раствора глюкозы вследствие диссоциации GRV, тогда как только небольшое количество инсулина высвобождалось из GRV, инкубированных в растворах PBS с 0 или 100 мг/дл глюкозы. См. фигуру 3А. Для подтверждения того, что скорость высвобождения инсулина прямо соответствует восстановлению групп NI как результат содержания кислорода, а не пониженного уровня pH, исследовали кинетику высвобождения инсулина в растворе при pH=4,0. Результат показал, что наблюдали незначимое высвобождение инсулина в образце, инкубированном в растворе с pH=4,0, подтверждая, что GRV являются стабильными при кислых условиях. Кроме того, изменчивый кинетический профиль высвобождения инсулина наблюдали с помощью изменяющейся концентрации глюкозы. См. фигуры 3В. Максимальное 6,6-кратное различие в скорости высвобождения инсулина достигали, когда концентрацию глюкозы изменяли от 100 мг/дл до 400 мг/дл. Напротив, GRV, содержащие половину количества GOx, показали более медленную скорость высвобождения вследствие относительно более медленной скорости потребления кислорода, указывая на то, что скорость высвобождения инсулина можно регулировать путем изменения инкапсулированной дозы фермента. Более того, профиль высвобождение инсулина из GRV представлял пульсирующий профиль при воздействии альтернативно нормального и гипергликемического состояния, изменяя состояния каждые 20 мин в течение нескольких циклов. См. фигуру 3С. GRV быстро отвечали на изменения концентраций глюкоза по сравнению с существующими синтетическими системами замкнутого контура. См. Mo et al., ChSRv, 43(10):3595-3629 (2014); и Veiseh et al., Nature Reviews Drug Discovery, 14(1):45-57 (2015). Например, чувствительные к гипоксии GRV проявляли значимо более быструю скорость ответа на гипергликемические содержания по сравнению с инициируемыми pH-чувствительностью глюкозочувствительными наночастицами, описанными в литературе ранее (см. Gu et al., ACS nano; 7(5):4194-4201 (2013)), с одинаковым количеством ферментов. Без ограничения какой-либо теорией, полагают, что более быстрая скорость ответа раскрытых в настоящем документе GRV может быть обусловлена более быстрым достижением "точки структурной трансформации" для диссоциации состава, запускаемой локальным гипоксическим микроокружением в отличие от инициации с помощью локальной кислой среды. Обобщенно, результаты указывают на то, что разборка GRV и высвобождение инсулина представляет собой опосредованный глюкозой и зависимый от гипоксии процесс. Кроме того, вторичная конформационная структура инсулина, высвобожденного из GRV (0,1 мг/мл) сохранялась такой же, как у нативного инсулина, что показано с помощью спектров кругового дихроизма (CD). См. фигуру 3D.

ПРИМЕР 4

ПОЛУЧЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК ПЛАСТЫРЯ НА ОСНОВЕ GRV-НАГРУЖЕННОЙ МИКРОИГОЛЬЧАТОЙ (MN) МАТРИЦЫ

Для достижения удобного введения получали пластырь на основе микроигольчатой (MN) матрицы, содержащий GRV. Пластырь на основе микроигольчатой матрицы может являться как безболезненным, так и одноразовым.

Кратко, GRV вначале загружали на концы силиконовой формы для MN с помощью центрифугирования с последующим добавлением по каплям раствора модифицированной акрилатом НА (m-HA), содержащего поперечно-сшивающее средство N,N'-метиленбисакриламид (MBA) и фотоинициатор. См. фигуру 4A. Под действием УФ облучения игольная матрица на основе HA фотосшивалась, что могло помочь усилить жесткость MN и избежать нежелательной потери GRV из игл. Полученные MN характеризовались конической формой и иглы были расположены в 10×10 матрице с площадью, составляющей 6×6 мм (см. фигуру 4B), которую впоследствии иммобилизировали с помощью медицинской клейкой ленты. Каждая игла характеризовалась радиусом основания, составляющим 150 мкм, высотой, составляющей 600 мкм, и радиусом кончика, составляющей приблизительно 10 мкм. См. фигуре 4C. На фигуре 4D показано флуоресцентное изображение репрезентативной MN, которая содержит нагруженные FITC-инсулином GRV, указывая на то, что GRV были равномерно распределены внутри. Кроме того, путем измерения механической прочности с использованием устройства для растяжения-сжатия необходимую для разрушения силу для поперечно-сшитой MN определяли как 0,06 Н/игла, тогда как необходимая для разрушения сила составляла только 0,02 Н/игла для не поперечно-сшитой MN. См. фигуру 4E. Соответственно, вероятно, что жесткость MN улучшается с образованием поперечных связей, что может обеспечить достаточную силу для облегчения введения в кожу без разрушения.

Для исследования того, сохраняют ли GRV, инкапсулированные в MN, глюкозочувствительную способность после изготовления MN, концы игл, содержащих GRV, повторно растворяли в буфере PBS и обрабатывали с помощью растворов с различными концентрациями глюкозы. Наблюдали пренебрежимо малое различие в профиле высвобождения по сравнению с профилем высвобождения инсулина из исходных GRV.

ПРИМЕР 5

IN VIVO ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОИГЛ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА 1 ТИПА

Для оценки in vivo эффективности пластырей на основе MN матрицы для лечения диабета мышей с индуцированным стрептозотоцином (STZ) диабетом 1 типа (самцов C57B6, Jackson Lab, Bar Harbour, Maine, USA) разделяли на группы (по пять мышей на группу) и чрескожно вводили различные образцы пластырей на спину (см. фигуру 5A, вверху слева), включая в себя: холостая проба - MN пластырь, содержащий только m-HA; MN пластырь, нагруженный человеческим рекомбинантным инсулином; MN пластырь, нагруженный GRV, содержащими как инсулин, так и фермент (GRV(E+I)); MN пластырь, нагруженный GRV, содержащими инсулин и половину дозы фермента (GRV(1/2E+I)); и MN пластырь, нагруженный GRV, содержащими только инсулин (GRV(I)). Доза инсулина, вводимая каждой мыши, составляла 10 мг/кг. Содержание глюкозы, эквивалентное содержанию в плазме, измеряли в образцах из хвостовой вены (приблизительно 3 мкл) с использованием глюкометра Clarity GL2Plus (Clarity Diagnostics, Boca Raton, Florida, USA). Содержания глюкозы у мышей подвергали мониторингу в течение двух дней до введения, и все мыши голодали в течение ночи до введения различных пластырей. Содержания глюкозы у каждой мыши подвергали мониторингу (через 5, 15, 30, 60 минут и каждый час после этого) до возвращения к стабильной гипергликемии.

Для измерения концентрации инсулина в плазме in vivo 25 мкл образцы крови отбирали из хвостовой вены мышей в указанные временные точки. Сыворотку выделяли и хранили при -20°С до анализа. Концентрацию инсулина в плазме измеряли с использованием набора для проведения ELISA человеческого инсулина (Calbiotech, Spring Valley, California, USA) согласно протоколу производителя.

Раскрытые в настоящем документе пластыри на основе MN матрицы могут эффективно проникать в кожу на спине мыши, что видно по окрашиванию с помощью трипанового синего (см. фигуру 5A, вверху справа) и окрашиванию с помощью гематоксилина и эозина (H&E). См. фигуру 5A, внизу. Содержание глюкозы в крови получивших лечение мышей в каждой группе подвергали мониторингу с течением времени. Содержание глюкозы в крови у мышей, получивших лечение с помощью GRV(E+I)-нагруженного MN пластыря, быстро снижалось до почти 200 мг/дл в пределах 0,5 ч и сохранялось на нормогликемическом состоянии (<200 мг/дл) в течение вплоть до 4 ч до постепенного увеличения. См. фигуру 5B. Без ограничения какой-либо теорией, указанная быстрая скорость ответа, вероятно, обусловлена быстрым созданием локального гипоксического микроокружения, которое быстро активирует диссоциацию GRV; при этом относительно низкая скорость диффузии кислорода in vivo по сравнению с ионами водорода может дополнительно способствовать этому процессу. Когда дозу фермента в MN для каждой мыши снижали (от 1 мг/кг до 0,5 мг/кг), содержание глюкозы в крови у мышей, получивших лечение с помощью GRV(1/2E+I)-нагруженного MN пластыря, снижалось до приблизительно 350 мг/дл в пределах 0,5 ч и устойчиво увеличивалось после этого. При отсутствии фермента содержание глюкозы у мышей, которым вводили GRV(I)-нагруженный MN пластырь, не показало заметного снижения, указывая на то, что GRV являлись стабильными in vivo. Соответственно, мыши, которым вводили GRV(E+I)-нагруженный MN пластырь, представляли однородно повышенную концентрацию инсулина в плазме в течение по меньшей мере 24 часов по сравнению с мышами, которым вводили GRV(1/2E+I)-нагруженные или GRV(I)-нагруженные MN пластыри, что количественно определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). См. фигуру 5C. Полученное с помощью SEM изображение GRV(E+I)-нагруженного MN пластыря, введенного в кожу, показало разрушенные концы после лечения (см. фигуру 5D), дополнительно указывая на то, что нагруженные GRV подвергаются разборке и растворяются в подкожных тканях.

Тест на толерантность к глюкозе проводили для подтверждения in vivo чувствительности MN к глюкозе через 1 час после введения GRV(E+I)-нагруженного MN пластыря и нагруженного инсулином MN пластыря. Кратко, мыши голодали в течение ночи, и им вводили GRV(E+I)-нагруженный MN пластырь или нагруженный инсулином MN пластырь, каждый с дозой инсулина, составляющей 10 мг/кг для каждой мыши, и затем раствор глюкозы в PBS вводили с помощью интраперитонеальной инъекции всем мышам в дозе, составляющей 1,5 г/кг. Содержания глюкозы подвергали мониторингу через 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 и 120 минут после инъекции. Тест на толерантность к глюкозе на здоровых мышах использовали в качестве контроля. Аналогично, здоровым мышам, используемым для оценки гипогликемии, вводили нагруженный инсулином пластырь на основе MN, GRV(I)-нагруженный MN пластырь или GRV(E+I)-нагруженный MN пластырь, но не подвергали глюкозной нагрузке.

В тесте на толерантность к глюкозе, проведенном через 1 час после введения MN пластырей, контрольные здоровые мыши проявляли быстрое увеличение содержания глюкозы в крови при интраперитонеальной инъекции глюкозы с последующим постепенным снижением до нормогликемии. См. фигуру 5E. Диабетические мыши, получившие лечение с помощью GRV(E+I)-нагруженного MN пластыря, показали замедленное увеличение содержания глюкозы в крови после инъекции глюкозы, и затем быстрое снижение до нормального состояния в пределах 30 мин. Тем не менее, содержание глюкозы у мышей, которым вводили нагруженный инсулином MN пластырь, не снижалось через 120 мин. Площадь под кривой рассчитывали от 0 до 120 мин для измерения ответной реакции MN. Как показано на фигуре 5F, GRV(E+I)-нагруженный MN пластырь характеризовался значимо быстрым ответом в отношении глюкозной нагрузки.

Для дополнительной оценки способности MN контролировать содержание глюкозы in vivo проводили серийное введение MN пластырей. Содержание глюкозы у мышей, получивших лечение с помощью первого GRV(E+I)-нагруженного MN пластыря (доза инсулина для каждой мыши: 5 мг/кг) быстро снижалось до приблизительно 200 мг/дл в пределах 1 ч. См. фигуру 5G. Тем не менее, содержание глюкозы дополнительно не снижалось до гипогликемического уровня при нанесении другого (т.е. второго) GRV(E+I)-нагруженного MN пластыря (доза инсулина для каждой мыши: 5 мг/кг), и поддерживались концентрации глюкозы, составляющие приблизительно 200 мг/дл, в течение следующих 3 ч. Напротив, мыши, которым вводили второй GRV(I)-нагруженный MN пластырь (доза инсулина для каждой мыши: 5 мг/кг) или которые не получали дополнительный пластырь, показали быстрое увеличение содержания глюкозы до гипергликемического состояния за 3 ч. Другой группе мышей в дальнейшем вводили нагруженный инсулином MN пластырь, и их содержание глюкозы в крови продолжало снижаться, приводя к потенциальному риску гипогликемии. Исследование на здоровых мышах дополнительно показало, что существует небольшая утечка инсулина в GRV-нагруженных MN пластырях, и что они характеризуются сниженным гипогликемическим риском по сравнению с нагруженной инсулином MN. См. фигуру 5H. Соответствующий гипогликемический индекс (определяемый как падение содержания глюкозы от начального показателя до низшего показателя, деленное на время, за которое было достигнуто это падение) рассчитывали для количественного измерения степени, с которой инсулин вызывает гипогликемию. GRV-нагруженные MN показали сниженный гипогликемический индекс по сравнению с нагруженной инсулином MN при введении в нормогликемическом состоянии. См. фигуру 5I. Более того, НА встречается во всем организме человека, и пустые GRV не показывали значимой токсичности при различных исследованных концентрациях.

ПРИМЕР 6

ОБСУЖДЕНИЕ ПРИМЕРОВ 1-5

В современных основанных на GOx глюкозочувствительных системах доставки инсулина, в основном, используют матрицы, состоящие из pH-чувствительных материалов, которые высвобождают инсулин или за счет протонирования, или за счет разложения вследствие ферментативного образования глюконовой кислоты. Тем не менее, их эффективность может быть ограничена медленным ответом при изменении содержания глюкозы в крови, особенно в забуференной физиологической среде. Полагают, что раскрытые в настоящем документе GRV являются первой демонстрацией стратегии глюкозочувствительной доставки инсулина, основанной на чувствительном к гипоксии составе вместо pH-чувствительных составов. Локальное гипоксическое микроокружение быстро создавалось в растворе буфера PBS вследствие ферментативного потребления кислорода, что доказано с помощью чувствительного к кислороду фосфоресцентного зонда. В дальнейшем гидрофобные боковые цепи HS-HA подвергались восстановлению в гидрофильные цепи, приводя к разборке GRV, впоследствии увеличивая скорость высвобождения инсулина. Изменение в морфологии GRV наблюдали через 20 мин после инкубации в буфере PBS с 400 мг/дл глюкозы с помощью ТЕМ, что указывало на разборку GRV. In vitro и профиль высвобождения инсулина GRV показывал более быструю скорость высвобождения, чем основанные на чувствительности к pH глюкозочувствительные наночастицы, о которых сообщалось ранее. Кроме того, кинетические параметры высвобождения инсулина можно регулировать путем изменения дозы фермента как in vitro, так и in vivo, дополнительно указывая на то, что высвобождение инсулина из GRV подвергается опосредованному глюкозой и зависимому от гипоксии процессу.

GRV интегрировали в MN пластырь на основе НА для удобного, безболезненного и непрерывного введения доставки инсулина. Поперечно-сшитая НА матрица не только помогала улучшить механическую прочность и способность проникать в кожу, но также, как оказалось, ограничила потерю инсулина из GRV для предотвращения «взрывного» высвобождения. Кроме того, каркас как игольных пластырей, так и везикул выполнен из НА, которая является в высокой степени биосовместимой.

GRV(E+I)-нагруженные MN проявляли превосходное регулирование содержания глюкозы в нормальном диапазоне с более быстрой ответной реакцией. Более того, кроме высокочувствительных везикул, быстрый захват лимфатической системой посредством чрескожного введения также может вносить свой вклад в преимущества с точки зрения высокой скорости. In vivo тест на толерантность к глюкозе продемонстрировал, что GRV-нагруженные MN являлись более чувствительными к глюкозной нагрузке и могли эффективно предотвращать потенциальный риск развития гипогликемии. Кроме того, результаты серийного введения с MN показали, что они могли точно контролировать содержание глюкозы в нормальном диапазоне в течение более продолжительных периодов времени. Учитывая, что человеческий инсулин, используемый в указанных примерах, является относительно нечувствительным у мышей, действительная доза для потенциального применения у людей может являться значительно более низкой. Полагают, что раскрытый в настоящем документе "умный инсулиновый пластырь" предусматривает клиническую возможность для доставки инсулина замкнутого контура с быстрой ответной реакцией на глюкозу, безболезненным и безопасным способом.

Следует понимать, что различные детали раскрытого в настоящем документе объекта изобретения можно изменить, не отклоняясь от объема раскрытого в настоящем документе объекта изобретения. Более того, приведенное выше описание предусмотрено только с целью иллюстрации, а не с целью ограничения.

Реферат

Изобретение относится к композиция для глюкозочувствительной доставки средства для лечения диабета нуждающемуся в этом субъекту. Композиция содержит: амфифильный полимерный материал, причем амфифильный полимерный материал содержит гидрофильный полимер, конъюгированный с чувствительной к гипоксии гидрофобной группой, причем указанная чувствительная к гипоксии гидрофобная группа содержит чувствительный к гипоксии фрагмент, который может восстанавливаться в присутствии гипоксического окружения с образованием гидрофильного фрагмента, причем гидрофильный полимер выбран из группы, состоящей из полиаминокислоты, синтетического блок-сополимера и полисахарида, и причем чувствительная к гипоксии гидрофобная группа представляет собой нитроимидазол; средство для лечения диабета; и окисляющее глюкозу средство. Также предложены наночастица, везикула, микроигольчатая матрица, система доставки инсулина замкнутого контура, способ доставки средства для лечения диабета, способ получения микроигольчатой матрицы. Изобретение позволяет быстро доставлять инсулин субъекту в ответ на изменения содержания глюкозы в крови и практически без боли. 7 н. и 33 з.п. ф-лы, 27 ил., 6 пр.

Формула