Способы и композиции для лечения фенилкетонурии - RU2496489C2

Описание

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится, главным образом, к способам и материалам для лечения состояний и нарушений, связанных с метаболизмом фенилаланина и, более конкретно, к способам и материалам для лечения фенилкетонурии.

Описание связанной области

Фенилкетонурия (PKU) представляет собой гипераминоацидемию фенилаланина (Phe), связанную с врожденным нарушением метаболизма фенилаланина - мутацией гена, кодирующего фенилаланин-4-гидроксилазу (PAH), которая превращает фенилаланин в тирозин. В некоторых случаях происходит дополнительный метаболический дефект в синтетическом каскаде либо дигидроптеридина, либо тетрагидробиоптерина (BH4), кофакторов фенилаланин-4-гидроксилазы, что далее способствует гиперфенилаланинемии (HPA). В то время как нормальный уровень фенилаланина в плазме составляет приблизительно 0,05 мМ (1), пациенты с "классической" PKU без лечения имеют уровни фенилаланина в плазме выше 1 мМ, например, уровни фенилаланина от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2,5 мМ или более, и, хотя лечение диетой с низким содержанием фенилаланина имеет цель снижения уровня фенилаланина в плазме до менее чем 0,3 мМ, этого трудно достигнуть вследствие проблем с соблюдением режима питания. В США 1 на 10000 детей рождаются с PKU. Избыточные уровни фенилаланина в плазме, наблюдаемые при PKU, в сочетании с относительно высокой аффинностью фенилаланина к участкам связывания на белке-переносчике системы транспорта нейтральных аминокислот в гематоэнцефалическом барьере (BBB) приводит к (i) накоплению фенилаланина Phe и его нейротоксических метаболитов, например, фенилпирувата, фенилацетата, фениллактата, в головном мозге (ii) снижению уровней нейтральных аминокислот, не являющихся фенилаланином, проникающих в головной мозг, что приводит к нарушенному развитию и функционированию головного мозга, поскольку ключевые каскады метаболизма, например, синтез нейротрансмиттеров, требуют аминокислот-предшественников, таких как тирозин. Это снижение выражено для тирозина, снабжение которым с помощью плазмы является низким вследствие метаболического нарушения фермента, ответственного за превращение фенилаланина в тирозин. В настоящее время полагают, что неврологические дефициты PKU, главным образом, являются следствием снижения уровней не являющихся Phe нейтральных аминокислот, проникающих в головной мозг (2).

Хотя диета с низким содержанием фенилаланина может снизить уровни фенилаланина в плазме при "классической" PKU ниже 0,3 мМ и смягчить задержку психического развития, связанную с PKU без лечения, соблюдение диеты может быть проблематичным и оно может стать особенно проблематичным, когда пациенты с PKU достигают подросткового возраста, что приводит к повышению уровней фенилаланина в плазме и как к снижению умственных способностей, так и к изменениям белого вещества в головном мозге. В дополнение к требуемому соблюдению пациентом диеты, способы лечения на основе ограничения питания также требуют, чтобы пациент знал уровень фенилаланина, имеющегося в пище. Более того, также в результате диет с ограничением по фенилаланину может возникнуть дефицит питательных веществ.

Таким образом, разработаны альтернативные способы лечения. Например, для преодоления ожидаемого истощения нейротрансмиттеров дофамина и серотонина, пациентов с PKU лечили предшественниками нейротрансмиттеров тирозином и триптофаном (3). Для снижения входящего потока фенилаланина в головной мозг, пожилым пациентам с PKU вводили добавку из нейтральных аминокислот с разветвленной цепью, содержащих валин, изолейцин и лейцин (4), для которых было описано значительное улучшение в отношении расстройств поведения. Было сделано предположение, что добавление предшественников нейротрансмиттеров, тирозина и триптофана (2) в добавку Berry (4), должно привести к дальнейшему улучшению. Однако эффективность этих способов лечения с добавкой в диету аминокислот является спорной.

Ввиду указного выше, существует признанная необходимость в способах и композициях для лечения фенилкетонурии и других состояний и нарушений, связанных с метаболизмом фенилаланина. Конкретно, в предшествующем уровне техники отсутствуют способы лечения фенилкетонурии введением фенилаланин-4-гидроксилазы отдельно или в сочетании с одним или несколькими другими ферментами, которые повышают ее активность в отношении метаболизма фенилаланина. Настоящее изобретение удовлетворяет этой давно существующей потребности и желанию в данной области.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего фенилкетонурей. Способ включает введение одного или нескольких из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы субъекту в условиях, эффективных для доставки фенилаланин-4-гидроксилазы и/или фенилаланинаммиаклиазы в тонкий кишечник субъекта. В способе, предоставляется дополнительная стадия введения пептидазы субъекту в условиях, эффективных для доставки пептидазы в желудок и/или тонкий кишечник субъекта.

Также настоящее изобретение относится к способу увеличения терапевтической активности фенилаланин-4-гидроксилазы (PAH) у субъекта, страдающего фенилкетонурией. Способ включает введение одного или нескольких из тиолированной рекомбинантной фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы субъекту в условиях, эффективных для доставки тиолированной рекомбинантной фенилаланин-4-гидроксилазы и/или фенилаланинаммиаклиазы в тонкий кишечник субъекта. В способе также предусмотрена дополнительная стадия введения пептидазы, как описано выше. Настоящее изобретение, кроме того, относится к пероральной дозированной форме. Пероральная дозированная форма содержит одну или несколько центральных частей, содержащих один или оба из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы и растворяющееся в кишечнике покрытие на одной или нескольких центральных частях. В сходной пероральной дозированной форме, предусмотрен дополнительный компонент, содержащий пептидазу.

Другие и дополнительные аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего писания предпочтительных в настоящий момент вариантов осуществления изобретения. Эти варианты осуществления приведены для целей раскрытия.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Для того чтобы эти приведенные выше признаки, преимущества и задачи изобретения, а также прочее, которое станет очевидным, достигались и могли быть понятными в деталях, представлено более конкретное описание изобретения, кратко описанного выше, применительно к его определенным вариантам осуществления, которые проиллюстрированы в прилагаемых рисунках. Эти рисунки составляют часть описания. Однако следует отметить, что прилагаемые рисунки иллюстрируют предпочтительные варианты осуществления изобретения и, таким образом, их объем не следует считать ограничивающим.

На фиг.1 графически проиллюстрировано протеолитическое расщепление фенилаланингидроксилазы, фенилаланингидроксилазы, слитой со связывающим мальтозу белком, и фенилаланингидроксилазы в присутствии трипсина и химотрипсина.

На фиг. 2A-2B графически проиллюстрированы уровни в крови фенилаланина (фиг.2A) и тирозина (фиг.2B) у мышей с фенилкетонурией, которых кормили покрытыми растворимыми в кишечнике гранулами фенилаланингидроксилазы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как используют в настоящем документе, форма единственного числа может означать один или более. Как используют в настоящем документе в формуле изобретения, форма единственного числа, когда она используется вместе со словом "содержащий", может означать один или более одного. Как используют в настоящем документе "другой" может означать по меньшей мере второй или более. Более того, если контекстом не требуется иное, термины в форме единственного числа включают множественное число и термины в форме множественного числа включают единственное число.

Как используют в настоящем документе, термин "или" в формуле изобретения используется для обозначения "и/или", если явно не указано на отнесение к альтернативам или если альтернативы не являются взаимоисключающими, хотя описание основано на определении, которое относится только к альтернативам и "и/или".

Как используют в настоящем документе, "PAH" обозначает фенилаланингидроксилазу и ее конъюгаты, которые превращают фенилаланин в тирозин. PAH может представлять собой фенилаланин-4-гидроксилазу "дикого типа", например, выделенную из природных источников, таких как ткань печени, или она может представлять собой рекомбинантную фенилаланин-4-гидроксилазу, например, продуцируемую рекомбинантно путем экспрессии в пригодном хозяине, таком как E. coli. В случаях, когда фенилаланин-4-гидроксилаза представляет собой рекомбинантно продуцируемую фенилаланин-4-гидроксилазу, она может представлять собой рекомбинантно продуцируемую фенилаланин-4-гидроксилазу мыши, человека или другого млекопитающего, например, она может быть рекомбинантно продуцирована путем экспрессии гена фенилаланин-4-гидроксилазы мыши, человека или другого млекопитающего в E. coli или другом пригодном хозяине. Рекомбинантно продуцируемая фенилаланин-4-гидроксилаза может представлять собой полноразмерную фенилаланин-4-гидроксилазу, или она может представлять собой укороченную фенилаланин-4-гидроксилазу, при условии, безусловно, что укороченная фенилаланин-4-гидроксилаза сохраняет активность фенилаланин-4-гидроксилазы. Альтернативно рекомбинантно продуцируемая фенилаланин-4-гидроксилаза может быть слитой или иным образом конъюгированной с другими материалами, такими как материалы, которые способствуют выделению и/или очистке рекомбинантно продуцируемой фенилаланин-4-гидроксилазы, например, как и в случае, когда рекомбинантно продуцируемая фенилаланин-4-гидроксилаза является слитой со связывающим мальтозу белком (MBH). В определенных вариантах осуществления, рекомбинантно продуцируемая фенилаланин-4-гидроксилаза представляет собой фенилаланин-4-гидроксилазу, которая является тиолированной в области PAH, богатой серином/треонином/тирозином.

Как используют в настоящем документе, "область, богатая серином/треонином/тирозином" обозначает область фенилаланин 4-гидроксилазы, которая является богатой остатками серина, богатой остатками треонина, богатой остатками тирозина, и/или является богатой любым сочетанием из остатков серина, треонина и тирозина. Иллюстративно, одна такая область, богатая серином/треонином/тирозином фенилаланин-4-гидроксилазы представляет собой область вблизи аминокислотного остатка серин-16 фенилаланин-4-гидроксилазы. Пригодные способы получения рекомбинантно продуцируемой фенилаланин-4-гидроксилазы и тиолирования такой продуцированной рекомбинантно фенилаланин-4-гидроксилазы в области, богатой серином/треонином/тирозином, включают способы, представленные ниже.

Как используют в настоящем документе, "PAL" обозначает фенилаланинаммиаклиазу и ее конъюгаты, которые превращают фенилаланин в транс-коричную кислоту (например, пегилированная PAL).

Как используют в настоящем документе, "пептидаза" обозначает ферменты, которые расщепляют белки и пептидные цепи меньших размеров на свободные аминокислоты, и включает протеазы.

Указание на "пептидазу" в настоящем документе означает включение одной или нескольких пептидаз. Примеры пригодных пептидаз, которые можно использовать в способе по настоящему изобретению, включают трипсин, химотрипсин и сочетания трипсина и химотрипсина или одной или нескольких дипептидаз.

Как используют в настоящем документе, "растворяющееся в кишечнике покрытие" включает покрытие, которое (i) остается интактным в течение по меньшей мере 2 часов, когда оно контактирует с искусственными пищеварительными соками желудка, такими как HCl с pH 1 при от 36 до 38°C и (ii) впоследствии дезинтегрирует в пределах 30 минут в искусственных пищеварительных соках кишечника, таких как буферный раствор KH₂PO₄ с pH 6,8.

Как используют в настоящем документе, "лечение" или "лечить" означает лечение прямой или непрямой причины состояния, лечение симптомов состояния; или оба варианта. Подразумевают, что его эффект может быть полным или частичным по отношению к желаемому исходу. Как используют в настоящем документе, "субъект" означает любое животное, такое как любое млекопитающее, например, мыши, крысы, кошки, кролики, собаки, свиньи, лошади, коровы и приматы, такие как люди. Иллюстративно, "субъект", как используют в настоящем документе, включает людей, страдающих фенилкетонурией, человеческих младенцев, человеческих детей, человеческих подростков, взрослых людей, мужчин, женщин, людей в возрасте менее чем приблизительно 2 года, людей в возрасте приблизительно между 2 годами и 5 годами, людей в возрасте между приблизительно 5 и приблизительно 10 годами, людей в возрасте между приблизительно 10 и приблизительно 18 годами, людей в возрасте между приблизительно 18 и приблизительно 30 годами, людей в возрасте между приблизительно 30 и приблизительно 40 годами, людей в возрасте между приблизительно 40 и приблизительно 50 годами, людей в возрасте между приблизительно 50 и приблизительно 60 годами, людей в возрасте более 60 лет. В дополнение к субъектам, страдающим фенилкетонурией, подходящие субъекты-люди включают субъектов, которые также страдают тирозинемией. Подходящие субъекты-люди также включают субъектов, которые также страдают фенилкетонурией, но которые не страдают тирозинемией.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, страдающего фенилкетонурией, причем способ включает введение одной или нескольких из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы субъекту в условиях, эффективных для доставки фенилаланин-4-гидроксилазы и/или фенилаланинаммиаклиазы в тонкий кишечник субъекта.

В дополнение к этому варианту осуществления, способ включает введение пептидазы субъекту в условиях, эффективных для доставки пептидазы в желудок и/или тонкий кишечник субъекта. Пептидаза может представлять собой одну или несколько дипептидаз. Также, пептидазу можно вводить одновременно или последовательно с одной или несколькими из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы. Кроме того, пептидазу и одну или обе из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы вводят в отдельных составах или в одном составе. Составы могут быть покрыты растворяющимся в кишечнике покрытием. Также, составы могут быть изготовлены для замедленного высвобождения пептидазы(пептидаз) и/или одной или обеих из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы. Более того, одну или обе из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы можно включать в состав вместе с растворяющемся в кишечнике покрытием в качестве одного состава или отдельных составов.

В обоих вариантах осуществления фенилаланин-4-гидроксилаза может представлять собой полноразмерную или укороченную рекомбинантную фенилаланин-4-гидроксилазу. Также, фенилаланин-4-гидроксилаза может представлять собой фенилаланин-4-гидроксилазу млекопитающих. Например, фенилаланин-4-гидроксилаза может представлять собой фермент человека. Кроме того, фенилаланин-4-гидроксилаза может быть тиолированной в области, богатой серином/треонином/тирозином. В частности, тиол может находиться вблизи аминокислоты серин-16.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ повышения терапевтической активности фенилаланин-4-гидроксилазы (PAH) у субъекта, страдающего фенилкетонурией, причем способ включает введение одной или нескольких из тиолированной рекомбинантной фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы субъекту в условиях, эффективных для доставки тиолированной рекомбинантной фенилаланин A-гидроксилазы и/или фенилаланинаммиаклиазы в тонкий кишечник субъекта.

В дополнение к этому варианту осуществления, способ включает введение пептидазы, как описано выше. Пептидаза также является такой, как описано выше. Также, пептидаза и/или тиолированная фенилаланин-4-гидроксилаза и/или фенилаланинаммиаклиаза могут быть включены в состав, как описано выше. Также, составы могут быть изготовлены для замедленного высвобождения, как описано выше. Кроме того, тиолированная фенилаланин-4-гидроксилаза является такой, как описано выше.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена пероральная дозированная форма, содержащая одну или несколько центральных частей, содержащих одну или обе из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы; и растворяющееся в кишечнике покрытие на одной или нескольких центральных частях. В дополнение к этому варианту осуществления пероральная дозированная форма содержит пептидазу, такую как описана выше. В обоих вариантах осуществления, фенилаланин-4-гидроксилаза может представлять собой рекомбинантный и/или тиолированный фермент, как описано выше. Также, пероральная дозированная форма может представлять собой форму с замедленным высвобождением.

В настоящем документе предусмотрены способы и пероральные составы для лечения субъекта, страдающего фенилкетонурией, причем способ включает введение фенилаланингидроксилазы (PAH) и/или фенилаланинлиазы (PAL) субъекту в условиях, эффективных для доставки фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL в тонкий кишечник субъекта. Этого можно достигать рядом способов. Например, фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL можно вводить путем прямой инъекции в тонкий кишечник субъекта. Альтернативно фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL можно вводить непосредственно в тонкий кишечник субъекта постоянно, полупостоянно или временно посредством помещенной трубки, которая сообщается с тонким кишечником. Примеры таких трубок включают дуоденальные зонды, зонды для еюностомии и т.п., а также трубки, которые обычно используют для назоэнтеральной интубации, например, для доставки в двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и/или подвздошную кишку.

Альтернативно фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL можно доставлять в тонкий кишечник субъекта включением в состав фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL с растворяющимся в кишечнике покрытием и пероральным введением покрытой растворяющимся в кишечнике покрытием фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL субъекту. Покрытая растворяющимся в кишечнике покрытием фенилаланин-4-гидроксилаза и/или PAL может быть предоставлена, например, в дозированной форме, которая включает (i) центральную часть, содержащую фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, и (ii) растворяющееся в кишечнике покрытие, окружающее центральную часть. Термин "центральная часть" включает не только таблетки, пилюли, бусы, зерна и гранулы, но также капсулы, например, мягкие или твердые капсулы из желатина или крахмала. Такие центральные части можно изготавливать любым общепринятым способом. В центральных частях могут находиться другие фармацевтически приемлемые ингредиенты, например, ингредиенты, обычно используемые для изготовления фармацевтических композиций, например, наполнители, например, лактоза, вещества, способствующие скольжению, например, диоксид кремния, и смазывающие вещества, например, стеарат магния.

Растворяющееся в кишечнике покрытие может быть предназначено для обеспечения защиты фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL при pH менее 3, как в желудке, в целях обеспечения высвобождения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL при pH в местном окружении тонкого кишечника. Например, растворяющееся в кишечнике покрытие может быть предназначено для обеспечения высвобождения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL при pH дуоденальной части тонкого кишечника, при pH еюнальной части тонкого кишечника, и/или при pH подвздошной части тонкого кишечника. Для дальнейшей иллюстрации, растворяющееся в кишечнике покрытие может быть предназначено для обеспечения высвобождения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL при pH более чем приблизительно 4,5, приблизительно 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или 8. Растворяющееся в кишечнике покрытие может быть предназначено для быстрого высвобождения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, например, так чтобы после начала высвобождения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, по существу вся фенилаланин-4-гидроксилаза и/или PAL, например, более чем 60%, 70%, 80% или 90% и т.д. фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, содержащейся в дозированной форме, высвобождалось в течение менее чем 8 часов, например, в течение менее чем 7 часов, 6 часов, 5 часов, 4 часов, 3 часов, 2 часов или 1 часа, и т.д.

В качестве иллюстрации, пригодные растворяющиеся в кишечнике покрытия включают покрытия, которые включают один или несколько полимерных материалов, которые окружают центральную часть, содержащую фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL. Примеры пригодных растворяющихся в кишечнике покрытий, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению, включают покрытия, которые не обладают существенным растворением при уровнях pH менее 4,5, не обладают существенным растворением при уровнях pH менее 4, не обладают существенным растворением при уровнях pH менее 3,5, и т.д. Примеры пригодных покрытых растворяющимся в кишечнике покрытием дозированных форм, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению, включают дозированные формы, которые не обладают существенным высвобождением фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, содержащихся в дозированной форме, например, они обладают высвобождением менее 50%, например, менее 40%, 30%, 20% или 10% и т.д., в течение менее чем 3 часов, например в течение менее чем 2,5 часов, 2 часов, 1,5 часов или 1 часа, и т.д.

В качестве иллюстрации, для обеспечения предсказуемого профиля растворения, соответствующего типичному времени прохождения через тонкий кишечник человека, составляющему приблизительно 3 часа, и для обеспечения возможности воспроизводимого высвобождения в нем, растворяющееся в кишечнике покрытие может быть предназначено для того, чтобы оно начинало растворяться при значении pH между приблизительно 4,5 и 5,5, которое находится в пределах диапазона pH двенадцатиперстной кишки, и чтобы оно продолжало растворяться при диапазоне pH в тонком кишечнике, который составляет вплоть до приблизительно pH 7,2. Например, количество используемого растворяющегося в кишечнике покрытия можно выбирать так, чтобы растворяющееся в кишечнике покрытие по существу растворялось в течение времени прохождения через тонкий кишечник, составляющего приблизительно три часа, или количество используемого растворяющегося в кишечнике покрытия можно выбирать так, чтобы растворяющееся в кишечнике покрытие по существу растворялось задолго до времени прохождения через тонкий кишечник, составляющего приблизительно три часа. Например, растворяющееся в кишечнике покрытие по существу растворяется в течение 30 минут, 1 часа, 1,5 часов или 2 часов и т.д. после поступления в тонкий кишечник.

Растворяющиеся в кишечнике покрытия, пригодные для применения в способах по настоящему изобретению, включают полимеры растворяющегося в кишечнике покрытия, известные в данной области, например, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMCP-HP50, USP/NF 220824 HPMCP-HP55, USP/NF типа 200731 и HP55S; Shin Etsu Chemical), фталат поливинилацетата (COATERIC^TM; Colorcon Ltd.), фталат поливинилацетата (SURETERIC^TM; Colorcon, Ltd.), и фталат ацетата целлюлозы (AQUATERIC^TM; FMC Corp.) и т.п. Растворяющееся в кишечнике покрытие может включать сополимер метакриловой кислоты, например в случае, где сополимер метакриловой кислоты представляет собой водную дисперсию акриловой смолы. В качестве дальнейшей иллюстрации, в растворяющемся в кишечнике покрытии может быть использован анионный сополимер, образованный из метакриловой кислоты и этилакрилата, например, имеющий отношение свободных карбоксильных групп к сложному эфиру, составляющее приблизительно 1:1, и/или имеющий среднюю молекулярную массу приблизительно 250000. Один такой анионный сополимер поставляется в качестве водной дисперсии, содержащей 30% масс./масс. сухого лакового вещества, Rohm-Pharma Co., Germany (EUDRAGIT^TM L30D-55).

Некоторые растворяющиеся в кишечнике материалы покрытия, известные в данной области, являются кислыми по своему характеру и могут вызывать химическую деградацию неустойчивых к кислотам активных веществ при прямом контакте с активным веществом. Особенно это касается условий высокой температуры и влажности, имеющихся в ходе процессов нанесения водных растворяющихся в кишечнике покрытий. Для снижения этой вызываемой кислотой деградации, на частицы, зерна, пилюли и т.д. можно наносить защитную оболочку или подоболочку перед нанесением растворяющегося в кишечнике покрытия. Эта защитная оболочка физически разделяет неустойчивое к кислотам активное вещество и растворяющееся в кишечнике покрытие, и она может быть пригодна для повышения стабильности активного вещества. Для дальнейшего уменьшения этой проблемы полимер растворяющегося в кишечнике покрытия может быть выбран так, чтобы он имел значение pH, например, приблизительно pH 4,5 или более, или приблизительно 5 или более, и т.д., которое не вызывает существенной деградации каких-либо неустойчивых к кислотам активных веществ, содержащихся в центральной части.

При использовании кислого полимера растворяющегося в кишечнике покрытия, pH кислого полимера растворяющегося в кишечнике покрытия можно повышать с использованием пригодного подщелачивающего вещества, например, гидроксида натрия, до точки ниже pH, где целостность полимера в кишечнике может быть утрачена. Эту частичную нейтрализацию кислотой можно использовать для обеспечения более стабильной композиции для любых неустойчивых к кислотам активных веществ, содержащихся в центральной части. С использованием этого способа частичной нейтрализации кислоты, несовместимость между неустойчивым к кислотам активным веществом и растворяющимся в кишечнике покрытием может быть снижена до такой степени, чтобы защитная подоболочка между активным веществом и растворяющимся в кишечнике покрытием не была необходимой для снижения деградации центральной части. Способ частичной нейтрализации кислоты позволяет более быстрое высвобождение лекарственного средства, поскольку слой подоболочки может замедлять высвобождение лекарственного средства и поскольку pH растворяющегося в кишечнике покрытия должен будет только немного повыситься для того, чтобы произошло разрушение растворяющегося в кишечнике покрытия. Растворяющееся в кишечнике покрытие также может содержать пластификатор. Примеры пригодных пластификаторов включают триэтилцитрат (Citroflex-2), диэтилфталат, триацетин, трибутилсебацат и полиэтиленгликоль.

Количество используемого растворяющегося в кишечнике покрытия будет зависеть от ряда факторов, например, от требуемого профиля времени высвобождения, от типа материала(ов), используемого для получения растворяющегося в кишечнике покрытия и от того, используют ли подоболочку, и т.д. Например, масса используемого растворяющегося в кишечнике покрытия может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 30% от массы центральной части. В качестве иллюстрации, растворяющееся в кишечнике покрытие может включать сополимер метакриловой кислоты, например, в количестве приблизительно от 5% до 30%, предпочтительно, приблизительно от 10% до 20, по массе, и пластификатор, например, в количестве приблизительно от 1% до 6%, предпочтительно, приблизительно от 2% до 3%, по массе. Эти массы основаны на общей концентрации твердых веществ в растворе/суспензии растворяющегося в кишечнике покрытия.

Материал растворяющегося в кишечнике покрытия может быть предоставлен на поверхности дозированной формы, например, таблетки с растворяющимся в кишечнике покрытием, в которой материал растворяющегося в кишечнике покрытия окружает одну центральную часть, которая содержит фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL. Альтернативно материал растворяющегося в кишечнике покрытия можно использовать в процессе микроинкапсулирования, например, при котором материал растворяющегося в кишечнике покрытия используют для нанесения покрытия на поверхности множества центральных частей, содержащих фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, где множество покрытых растворяющемся в кишечнике покрытием центральных частей упакованы в капсулу или другую такую дозированную форму.

В качестве дальнейшей иллюстрации, пригодные растворяющиеся в кишечнике покрытия могут включать любое фармацевтически приемлемое покрытие, которое препятствует высвобождению активного вещества (фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL) в желудке и которое в достаточной степени дезинтегрирует в кишечнике при контакте с приблизительно нейтральными или щелочными пищеварительными соками для обеспечения высвобождения активного вещества (фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL) в тонкий кишечник. Различные тесты in vitro для определения того, относится ли или не относится покрытие к растворяющемуся в кишечнике покрытию, опубликованы в фармакопеях различных стран.

Толщина растворяющегося в кишечнике покрытия может варьировать и зависит, помимо прочего, от его проницаемости для воды и кислот. Количество растворяющегося в кишечнике покрытия может составлять приблизительно 16-30 мг, например, 16-20 мг или 16-25 мг на 1 желатиновую капсулу. Аналогичная толщина может быть применима в других составах. В качестве иллюстрации, пригодные растворяющиеся в кишечнике покрытия включают покрытия толщиной 5-100 мкм, например, 20-80 мкм.

Покрытие может быть пригодным образом выбрано из макромолекулярных полимеров, как известно, и оно является стандартом в данной области (5-8). Пригодные полимеры включают, но не ограничиваются ими, производные сложных эфиров целлюлозы, простые эфиры целлюлозы, акриловые смолы, такие как метилакрилатные сополимеры и сополимеры производных малеиновой кислоты и фталевой кислоты. В качестве дальнейшей иллюстрации, растворяющееся в кишечнике пленочное покрытие может быть изготовлено из фталата и тримеллитата ацетата целлюлозы, из сополимеров метакриловой кислот, например, сополимеров метилакриловой кислоты и ее сложных эфиров, содержащих по меньшей мере 40% метилакриловой кислоты, и из фталата гидроксипропилметилцеллюлозы.

Метилакрилаты включают метилакрилаты с молекулярной массой более 100000 Дальтон, на основе, например метилакрилата и метил- или этилметилакрилата в соотношении приблизительно 1:1. Пригодные метилакрилаты включают Endragit L, например, L 100-55, (Rohm GmbH, Darmstadt, Germany). Пригодные фталаты ацетата целлюлозы включают фталаты ацетата целлюлозы, имеющие содержание ацетила 17-26% и содержание фталата 30-40% с вязкостью приблизительно 45-90 спз. Пригодные тримеллитаты ацетата целлюлозы включают тримеллитаты ацетата целлюлозы, имеющие содержание ацетила 17-26%, содержание тримеллитила 25-35% с вязкостью приблизительно 15-20 спз. Примером пригодного тримеллитата ацетата целлюлозы является выпускаемый на рынок продукт CAT (Eastman Kodak Company, USA). Пригодные фталаты гидроксипропилметилцеллюлозы включают фталаты гидроксипропилметилцеллюлозы, имеющие молекулярную массу от 20000 до 100000 дальтон, например, от 80000 до 130000 дальтон, например, содержание гидроксипропила от 5 до 10%, содержание метокси от 18 до 24% и содержание фталила от 21 до 35%. Примером соответствующего фталата ацетата целлюлозы является выпускаемый на рынок продукт CAP (Eastman Kodak, Rochester N.Y., USA). Примеры пригодных фталатов гидроксипропилметилцеллюлозы включают выпускаемые на рынок продукты, имеющие содержание гидроксипропила 6-10%, содержание метокси 20-24%, содержание фталила 21-27%, молекулярную массу приблизительно 84000 Дальтон, известные под торговым названием HP50 и доступные от Shin-Etsu Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan. Другие примеры пригодных фталатов гидроксипропилметилцеллюлозы включают выпускаемые на рынок продукты, имеющие содержание гидроксипропила, содержание метокси и содержание фталила 5-9%, 18-22% и 27-35% соответственно, и молекулярную массу 78000 Дальтон, известные под торговым названием HP55 и доступные от Shin-Etsu Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan.

Растворяющееся в кишечнике покрытие можно наносить общепринятым способом, например, на центральную часть распыляют раствор растворяющегося в кишечнике покрытия. Пригодными растворителями для растворяющегося в кишечнике покрытия являются, например, органические растворители, например, спирт, например, этанол, кетон, например, ацетон, галогенированные углеводороды, например, CH₂Cl₂, или смеси таких растворителей, например, этанол/ацетон в соотношении, например, от 1:1 до 10:1. В такой раствор можно добавлять смягчитель, такой как ди-н-бутилфталат или триацетин, например, в соотношении материала покрытия к смягчителю от приблизительно 1:0,05 до приблизительно 1:0,3. Если желательно в случае фталатов целлюлозы и других кислых материалов покрытия, можно получать соль аммония и можно использовать водный раствор. Для покрытия можно использовать устройство для нанесения покрытия в псевдоожиженном слое. В одном иллюстративном варианте осуществления, центральные части обрабатывают при комнатной температуре или нагревают до 40°С, например, теплым воздухом при температуре от 40° до 70°С, перед напылением. Для избежания слипания центральных частей, процесс напыления можно прерывать через определенные промежутки времени, а затем центральные части снова нагревать. Однако также процесс можно проводить без прерывания процесса напыления, например, путем автоматического регулирования количества спрея с учетом температуры выпускаемого воздуха и/или центральных частей. Давление при напылении может варьировать в широких диапазонах. Пригодное давление для напыления включает давление от приблизительно 1 до приблизительно 1,5 бар. Дальнейшие детали по выбору, изготовлению и нанесению растворяющихся в кишечнике покрытий доступны в литературе (5-8).

Следует отметить, что часть фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, которые вводят субъекту может доставляться в другие сегменты желудочно-кишечного тракта субъекта, например, в желудок субъекта, при условии что существенная часть фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL доставляется в тонкий кишечник субъекта. Полагают, что кислое окружение желудка нарушает или существенно снижает активность фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, и, таким образом, любая фенилаланин-4-гидроксилаза и/или PAL, которая высвобождается в желудок, разрушается или становится неактивной.

Независимо от того, как фенилаланин-4-гидроксилаза и/или PAL доставляется в тонкий кишечник субъекта, например, посредством прямого введения в тонкий кишечник путем инъекции или зонда или посредством покрытой растворяющимся в кишечнике покрытием пероральной дозированной формы, способ по настоящему изобретению, необязательно, может дополнительно включать введение пептидазы субъекту в условиях, эффективных для доставки пептидазы в желудок и/или тонкий кишечник субъекта. В случаях, когда пептидаза является устойчивой к кислотам, ее можно добавлять в желудок или тонкий кишечник. В случае, когда кислые условия желудка могут нарушить или существенно снизить активность пептидазы, доставка в тонкий кишечник является предпочтительной. Пептидазу можно вводить последовательно с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL, где пептидазу вводят перед введением фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, например, от 5 минут до приблизительно 2 часов ранее, или где пептидазу вводят после введения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, например, от приблизительно 5 минут до приблизительно 2 часов после. Альтернативно пептидазу можно вводить одновременно с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL, где пептидазу вводят одновременно с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL или по существу в то же время, что и фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, например, где пептидазу и фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL вводят в пределах 5 минут друг от друга. В случаях, где пептидазу вводят одновременно с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL, пептидазу можно вводить с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL в отдельных составах, или пептидазу можно вводить с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL в одном составе, например, в одном покрытом растворяющимся в кишечнике покрытием составе. В случаях, когда пептидазу вводят с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL в одной дозированной форме, дозированная форма может быть изготовлена (i) чтобы доставлять пептидазу в желудок, а фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL в тонкий кишечник; (ii) чтобы доставлять пептидазу в тонкий кишечник и фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL в тонкий кишечник; (iii) чтобы доставлять пептидазу в одну часть тонкого кишечника, например, в двенадцатиперстную кишку, а фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL в другую часть тонкого кишечника, например, в тощую кишку и т.д.

Настоящее изобретение также относится к пероральной дозированной форме или составу, который включает фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL. Пероральная дозированная форма изготовлена так, чтобы доставлять фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL в тонкий кишечник субъекта. Примеры пригодной фенилаланин-4-гидроксилазы и PAL для применения в пероральных дозированных формах по настоящему изобретению включают фенилаланин-4-гидроксилазу и PAL, описанные в настоящем документе выше. Пероральная дозированная форма может быть покрыта растворяющимся в кишечнике покрытием для доставки фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL в кишечник. Детали, касающиеся растворяющихся в кишечнике покрытий и способов изготовления покрытых растворяющимся в кишечнике покрытием пероральных дозированных форм, содержащих фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, указаны в настоящем документе выше. Пероральная дозированная форма может быть покрыта растворяющимся в кишечнике покрытием, например, где пероральная дозированная форма включает одну содержащую фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL центральную часть, которая является покрытой растворяющимся в кишечнике покрытием. Пероральная дозированная форма может представлять собой покрытую растворяющимся в кишечнике покрытием капсулу, которая содержит фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, например, в форме гранул, порошка, суспензий и т.д. Пероральная дозированная форма может содержать множество центральных частей, содержащих фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, все из которых являются покрытыми растворяющимся в кишечнике покрытием, причем множество покрытых растворяющимся в кишечнике покрытием центральных частей упакованы в капсулу или другую дозированную форму.

Пероральная дозированная форма по настоящему изобретению может дополнительно включать пептидазу. Примеры пригодных пептидаз и способов изготовления таких дозированных форм включают пептидазы и способы, описанные в настоящем документе выше. Пероральная дозированная форма может быть изготовлена для доставки пептидазы в желудок субъекта, в тонкий кишечник субъекта, или в оба из них. Пептидаза в пероральной дозированной форме является покрытой растворяющимся в кишечнике покрытием, например, где пероральная дозированная форма включает одну центральную часть, содержащую как пептидазу, так и фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, которые являются покрытыми растворяющимся в кишечнике покрытием, и где пероральная дозированная форма находится в покрытой растворяющимся в кишечнике покрытием капсуле, которая содержит пептидазу и фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, например, в форме гранул, порошков, суспензий и т.д.

Фенилаланин-4-гидроксилаза и/или PAL и пептидаза могут быть покрытыми растворяющимся в кишечнике покрытием, например, где пероральная дозированная форма включает одну центральную часть, содержащую как пептидазу, так и фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, которые являются покрытыми растворяющимся в кишечнике покрытием. Пероральная дозированная форма может иметь множество центральных частей, содержащих как пептидазу, так и фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, каждая из которых является покрытой растворяющимся в кишечнике покрытием, и множество покрытых растворяющимся в кишечнике покрытием центральных частей упакованы в капсулу или другую дозированную форму. Пероральная дозированная форма может содержать множество центральных частей, некоторые из которых содержат пептидазу, а другие из которых содержат фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, так что каждая из центральных частей является покрытой растворяющимся в кишечнике покрытием и множество покрытых растворяющимся в кишечнике покрытий упакованы в капсулу или другую такую дозированную форму, и т.д. Альтернативно фенилаланин-4-гидроксилаза и/или PAL являются покрытыми растворяющимся в кишечнике покрытием, и пептидаза не является покрытым растворяющимся в кишечнике покрытием, например, где пероральная дозированная форма содержит множество центральных частей, содержащих фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, которые являются покрытыми растворяющимся в кишечнике покрытием, и множество содержащих пептидазу центральных частей, которые не являются покрытыми растворяющемся в кишечнике покрытием, и множество покрытых растворяющимся в кишечнике покрытием центральных частей и не покрытых растворяющимся в кишечнике покрытием центральных частей упакованы вместе в одну капсулу или другую такую дозированную форму.

Настоящее изобретение относится к способу увеличения активности PAH. Способ включает тиолирование области PAH, богатой серином/треонином/тирозином. Также настоящее изобретение относится к фенилаланин-4-гидроксилазе, которая является тиолированной в области PAH, богатой серином/треонином/тирозином, например, вблизи аминокислотного остатка серин-16 PAH. Пригодные способы тиолирования фенилаланин-4-гидроксилазы включают способы, которые сходны со способами, описанными в (9), которая включена в качестве ссылки.

Следующие примеры приведены для иллюстрации различных вариантов осуществления изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения никоим образом.

ПРИМЕР 1

Тиофосфорилирование PAH

Для реакции требуется белок (10,4 мг/мл), буфер (15 мМ Na-HEPES, pH 7,0, 3 мМ дитиотреитол, 0,03 мМ EDTA), 500 нМ ATP гамма S (получение 2 мМ=2,18 мг в 2 мл буфера), 500 мМ ATP, гель для SDS Page или гель с мочевиной, и 200 нМ протеинкиназа A (Upstate Biotechnology).

Протокол

Получают фенилаланингидроксилазу дикого типа человека (wt-hPAH) в 15 мМ Na-HEPES, pH 7,0, 3 мМ дитиотреитоле, 0,03 мМ EDTA, 0,1 мМ EGTA, и 10 Мм ацетате магния. Добавляют 200 нМ каталитической субъединицы PKA. Реакцию начинают добавлением 500 нМ ATPgamma-S и инкубированием при 30°C в течение 2-4 мин. Проводят параллельную реакцию, как указано выше, за исключением того, что реакцию начинают добавлением 500 нМ ATP. Белок концентрируют, пропуская его через YM10. Проводят как стандартный белковый анализ, так и стандартный ферментный анализ.

ПРИМЕР 2

Экспрессия и очистка рекомбинантной PAH (dt-hPAH):

Экспрессия dt-hPAH

2 мл среды LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, инокулируют BL21 (DE3) в течение 2-3 ч при 37°C до тех пор, пока OD при A₆₀₀ не достигнет 0,8. 1 мл клеток переносят в 12 л среды LB, содержащей 50 мк/мл ампициллина. Клетки выращивают в течение ночи при 37°C. Исходный раствор поддерживают в 25% глицерине. Проверяют, что OD при A₆₀₀ составляет приблизительно 0,8. В среду добавляют 0,5 мМ IPTG на 2-3 ч для индукции экспрессии. Клетки центрифугируют в большой центрифуге при 10000 g в течение приблизительно 10 мин. После образования клетками осадка, супернатант выливают и клетки соскребают в пластиковый мешок. Их выравнивают в "блин" и замораживают при 80°С.

Лизис клеток

Буфер представляет собой 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 200 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 0,2 мМ PMSF. Осадок ресуспенидруют в 300 мл буфера для лизиса. Проводят облучение ультразвуком в течение 20-30 мин. Устанавливают на 70% и облучают в течение 1 с при включении и 3 с при выключении в течение времени облучения 3 минуты с общим временем 12 мин. Клетки помещают на лед при ресуспендировании и облучении ультразвуком. Затем неочищенный экстракт центрифугируют при 98000 g при 4°C в течение 10 мин и супернатант сразу используют или замораживают при -80°С до применения.

Очистка лизата

Все стадии хроматографии проводят при 4°C. Буфер T является таким же, что и используют для лизиса клеток. Буфер E содержит 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 200 мМ NaCl и 1 мМ EDTA. Буфер S содержит 10 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 200 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 10 мМ мальтозу. Колонка представляет собой амилозную смолу. Белок разбавляют буфером T для снижения концентрации до 3 мг/мл перед нанесением на амилозную колонку (2,5 см × 10 см); это зависит от количества белка. Предварительно уравновешивают колонку буфером E. Промывают колонку 40 объемами колонки буфера E. Элюируют буфером S. Собирают фракцию объемом 1 мл и фракции объединяют.

Расщепление рестрикционной протеазой - фактором Xa

Объединенные фракции концентрируют до объема менее 5 мл. Измеряют концентрацию белка при 280 нм или с помощью анализа белков Pierce или анализа Bradford. Расщепляют белок фактором Xa (1:300) в течение 4 ч при 4°С.

Эксклюзионная хроматография

Используют колонку Superdex 200 HR (1,6 см × 60 см). Буфер N содержит 20 мМ Na-Hepes и 0,2 M NaCl, pH 7,0 (вновь полученный и дегазированный). Колонку уравновешивают буфером N со скоростью потока 0,38 мл/мин. Нагружают белок и элюируют буфером N. Собирают фракции объемом 1 мл.

ПРИМЕР 3

Расщепление фенилаланингидроксилазой

В щелочном окружении, pH 8,5, пищеварительного тракта, фермент фенилаланин-4-гидроксилаза млекопитающего (человека или мыши), экспрессированный рекомбинантно в E. Coli, является стабильным в течение вплоть до 24 часов при pH 8,5. Рекомбинантный фермент может быть полноразмерным или укороченным. Когда гидролитические ферменты трипсин и химотрипсин добавляют к рекомбинантной фенилаланин-4-гидроксилазе или ее конъюгатам в тестируемую пробирку при pH 8,5, время полужизни фермента составляет 6 часов.

Этот результат указывает на то, что если рекомбинантный фермент фенилаланин-4-гидроксилазу принимают в растворяющемся в кишечнике составе, он будет достаточно стабильным для превращения фенилаланина в тирозин в пищеварительном тракте, до того как фенилаланин может всосаться в кровоток. Это будет снижать уровни Phe в крови, обеспечивая лечение PKU. В таблице 1 сравнивается активность фенилаланин-4-гидроксилазы в присутствии трипсина и химотрипсина с активностью фенилаланин-4-гидроксилазы отдельно.

Данные по протеолизу приведены в таблице 2 и представлены на графике на фиг.1. Можно сделать заключение, что MBP-фенилаланин-4-гидроксилаза в присутствии трипсина и химотрипсина (MBPTC) является стабильной вплоть до 6 часов, однако после инкубации в течение ночи активность отсутствует. PAH (PAHTC) теряет активность через 15 минут, однако вновь приобретает некоторую активность через 4 часа. Возможно, что фрагмент может обладать некоторой активностью, которая возрастает вплоть до 6 часов. Активность после инкубации в течение ночи отсутствует. PAH без трипсина и химотрипсина по-видимому сохраняет свою активность даже после инкубации в течение ночи. Пробирка через 6 часов была разбита, и большая часть белка была утрачена.

ПРИМЕР 4

Эффект покрытой разрушающимся в кишечнике покрытием PAH in vivo на уровни Phe и Tyr

Рекомбинантную фенилаланин-4-гидроксилазу изготавливали, как описано, с получением 290 мг PAH. Маленькие пилюли фермента покрывали до размера 0,4-0,5 мм, так чтобы они могли проходить через пищевод мыши. Каждая пилюля содержала приблизительно 0,5 мг фермента. Поскольку мыши являются ночными животными, пилюли фермента вводили утром и одну дозу вводили вечером. В качестве контроля использовали пилюли плацебо того же размера. Также, в качестве контролей, мышам давали буфер. Каждой мыши вводили пилюли в течение трое суток, в дозе приблизительно 10 мг на кормление. Уровень фенилаланина (фиг.2A) и тирозина (фиг.2B) в крови определяли каждые сутки из крови хвостовой вены у мышей, которых кормили PAH, мышей которых кормили плацебо, мышей, которых кормили буфером и у нормальных контрольных мышей и у контрольных мышей с PKU. В таблицах 3 и 4 представлены средние уровни фенилаланина и тирозина в крови в течение 3 суток.

Следующие ссылки цитированы в настоящем документе.

1. Pardridge, "Blood-Brain Barrier Amino Acid Transport: Clinical Implications," chapter 6 in Inborn Errors of Metabolism in Humans, Cockburn et al., eds, 6 Lancaster, England: MTP Press Ltd. (1980)

2. Kaufman, 1998, J. Inher. Metab. Dis., 21 (Supp 3):4-19.3.

3. Lou, 1983, Lancet, 2:150-151.

4. Berry et al., 1990, Am. J. Dis. Child., 144:539-543.

5. Lachman et al., The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3rd ed., 1986, pp. 365-373.

6. Sucker et al., Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359.

7. Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, 4th ed., vol. 7, pp. 739-742 and 766-778, Springer Verlag, 1971.

8. Remington's Pharmaceutical Sciences, 13th ed., pp. 1689-1691, Mack PubL. Co., 1970.

9. Miranda et al., 2002, Journal of Biological Chemistry, 277(43):40937-40943.

Любые патенты и публикации, упомянутые в этом описании, являются показательными для уровня специалистов в области, к которой изобретение относится. Кроме того, эти патенты и публикации включены в настоящий документ в качестве ссылок в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была конкретно и отдельно включена в качестве ссылки.

Хотя предпочтительные варианты осуществления представлены и описаны в настоящем документе подробно, специалисту в данной области будут очевидно, что можно проводить различные модификации, добавления, замены и т.п. без отклонения от сущности изобретения, и их, таким образом, считают находящимися в объеме изобретения, как далее проиллюстрировано представленной ниже формулой изобретения.

Реферат

Заявленное изобретение относится к области медицины и предназначено для лечения фенилкетонурии. Заявлена пероральная дозированная форма, содержащая: a) фенилаланин-4-гидроксилазу и/или фенилаланинаммиак-лиазу; и b) по меньшей мере одну пептидазу, где a), b) или оба a) и b) имеют растворяющееся в кишечнике покрытие. Заявленное изобретение эффективно при лечении фенилкетонурии. 11 з.п. ф-лы, 3 ил., 4 табл., 4 пр.

Формула