Определение состояния раны - RU2749326C2

Чертежи

Показать все 12 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Изобретение в целом относится к изделиям и связанным с ними способам определения состояния раны, которая может представлять собой хроническую рану.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Рану можно определить как нарушение защитной функции кожи; потерю целостности эпителия, с потерей или без потери подлежащей соединительной ткани (т.е. мышц, костей, нервов) после повреждения кожи или подлежащих тканей/органов, вызванного, например, хирургическим вмешательством, ударом, порезом, химикатами, нагреванием/охлаждением, силой трения/сдвига, давлением или в результате заболевания, такого как язвы или карциномы нижних конечностей (Leaper and Harding, Wounds: Biology and Management, Oxford University Press (1998)).

Заживление ран включает восстановление любой поврежденной ткани, включая образование новых соединительных тканей и возобновленный рост эпителия (Copper, А review of different wound types and their principles of management in Wound Healing: A systematic approach to advanced wound healing and management, Cromwell Press, UK (2005)).

Раны можно классифицировать как острые или хронические. Острые раны включают раны, заживление которых происходит в виде последовательного каскада накладывающихся друг на друга процессов, что требует скоординированного совершения различных видов клеточной деятельности. И наоборот, хронической раной является рана, в которой нормальный процесс заживления раны нарушается в одной или нескольких точках в фазах заживления раны. Часто это может приводить к тому, что хроническая рана останавливается в определенной фазе заживления, такой как воспаление или пролиферация. Хронические раны часто идентифицируют по наличию приподнятого, гиперпролиферативного, но невыступающего края раны. Местная раневая среда, богатая продуктами воспаления и провоспалительными цитокинами, может содержать несбалансированную ферментативную среду, состоящую из избыточного количества матриксных металл о протеиназ и пониженного количества их ингибиторов, что приводит к разрушению внеклеточного матрикса (Menke et al. Impaired wound healing, Clinical Dermatology (2007)). Считается, что полученное в результате состояние глубокого воспаления является существенным фактором, воздействующим и замедляющим заживление. Кроме того, хроническим ранам часто может мешать накопление некротической или отторгающейся ткани в ложе раны. Сообщалось, что только в США хроническими ранами поражено примерно 5,7 миллиона пациентов, и они ежегодно обходятся в 20 миллиардов долларов США (Branski et al. A review of gene and stem cell therapy in cutaneous wound healing, Burns (2008)). Обычные хронические раны включают диабетические язвы, язвы сосудистого происхождения и пролежни (Werdin et al. Evidence-based Management Strategies for Treatment of Chronic Wounds, Eplasty (2009)).

Предполагается, что ведение заживления ран включает четыре основных элемента: ткань в ране и окружающая рану и ее состояние, наличие какого-либо воспаления и/или инфекции в ране или вокруг раны, баланс влажности в ране и качество краев раны (Ayello et al. TIME heals all wounds, Nursing (2004)).

В настоящее время доступны повязки, которые направлены на решение одного или более из этих основных элементов. Выбор подходящей повязки на рану включает рассмотрение текущей фазы заживления раны, ее специфических временных требований, а также потенциальных побочных эффектов. В идеале, повязки должны минимизировать боль и быть простыми в использовании. Эти повязки должны предотвращать трение и смещение, защищая при этом периульцерозную ткань и кожу. Было предложено комбинирование различных повязок на разных этапах процесса заживления. Например, использование гидрогелевых повязок для фазы очищения, повязок на пенной основе на стадии грануляции и использование либо гидроколлоидов, либо низкоадгезивных повязок для фазы эпителизации (Vaneau et al. Consensus panel recommendations for chronic and acute wound dressings, Archives of Dermatology (2007)).

US 5181905 относится к повязке для ран, на которой или внутри которой находится индикатор, который передает информацию о состоянии раны. Иллюстративные варианты осуществления и предпочтительный индикатор содержат чувствительные к температуре жидкие кристаллы, которые могут менять цвет при определенных температурах.

US 2004/0044299 A1 относится к повязке для ран, на которой или внутри которой содержится химическая композиция, которая меняет цвет в присутствии бактерий, и которую видно невооруженным глазом через наружную поверхность повязки.

GB 2340235 А относится к способу мониторинга бактериального загрязнения раны на основе концентрации АТФ в раневом экссудате вместе с сопутствующими устройствами и наборами.

WO 2012/074509 относится к датчикам на основе пластырей, которые предоставляют панель конкретных параметров анализируемого вещества, которые определяют одно или несколько физиологических состояний и/или уровень прогрессирования заживления раны.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Мониторинг состояния раны в настоящее время ограничен первоначальной оценкой лицом, осуществляющим уход, ответственным за регулярную смену повязки на ране, включая оценку одного или более из внешнего вида и/или запаха раны и/или объема образующегося экссудата. Такая оценка может указывать лицу, осуществляющему уход, что необходимо направить пациента к практикующему врачу или на дальнейший анализ раны и/или раневого экссудата.

Тем не менее, такие оценки не в состоянии проанализировать один или более компонентов экссудата в момент ухода, чтобы показать состояние раны.

Ввиду этого международная патентная заявка PCT/GB2016/050342, включенная в настоящий документ посредством ссылки, относится к изделию для мониторинга состояния раны, содержащему:

(i) биологически инертную матрицу, которая абсорбирует раневой экссудат; и

(ii) один или более реагентов на матрице или в матрице для измерения одного или более маркеров, содержащихся в раневом экссудате

причем изменение одного или более реагентов, вызванное одним или более маркерами, содержащимися в раневом экссудате, обеспечивает визуальное указание на изменение состояния раны.

Настоящее изобретение относится к разработкам этой технологии. Первая разработка касается использования сшитых и чувствительных к протеазам полимеров, которые разлагаются только тогда, когда (достаточно) присутствует протеазная активность в раневом экссудате, предпочтительно на предварительно определенном пороговом уровне или выше него. Вторая разработка относится к использованию чувствительных к протеазам полимеров в устройстве для мониторинга состояния раны ех situ в формате латерального потока. Следовательно, изделия, описанные в данном сения образца, зону реакции (при отсутствии (необязательно сшитых) чувствительных к недорогие средства для мониторинга состояния раны.

Таким образом, в первом аспекте в изобретении предоставлено изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из матрицы, которая абсорбирует раневую текучую среду, причем матрица содержит, по существу состоит или состоит из:

a. сшитых и чувствительных к протеазе полимеров, образующих зону реакции на/в матрице; и

b. окрашенных частиц;

при этом расположение полимеров и окрашенных частиц таково, что расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к транспорту окрашенных частиц вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде.

Ключевым моментом изобретения является тот факт, что сшитые и чувствительные к протеазе полимеры и окрашенные частицы расположены (относительно друг друга) так, что, когда матрица контактирует и абсорбирует (достаточное) количество раневой текучей среды, расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к (делает возможным) транспорт окрашенных частиц вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде. Как правило, этот транспорт окрашенных частиц находится вне зоны реакции. Он может происходить в направлении и в зону осмотра, в рамках определения и обсуждения настоящего изобретения. Кроме того, как дополнительно описано в настоящем документе, сшивание полимеров повышает устойчивость полимеров к расщеплению под действием протеазной активности (по сравнению с несшитым вариантом). Таким образом, до тех пор, пока протеазная активность не присутствует в достаточных количествах, указывая на изменение состояния раны, которая может быть на уровне или выше (предварительно определенного) порогового уровня протеазной активности, окрашенные частицы остаются фиксированными (располагаются) в матрице. Пороговый уровень активности указывает на незаживающую рану. Средние и медианные уровни протеазной активности в острых ранах по сравнению с хроническими (не заживающими) ранами, а также способы получения таких уровней известны в данной области (см. Trengove et al. Wound Rep. Reg., 1999, vol. 7, pages 442-452). Таким образом, соответствующие пороговые уровни можно получить для общего и/или индивидуального использования. Образование зоны реакции с подходящей чувствительностью к протеазам можно определить и отрегулировать эмпирически, например, на основании времени, в течение которого изделие в последующем должно оставаться в контакте с раневой текучей средой (напр., под повязкой на ране). Чувствительность к протеазам можно контролировать, например, регулируя степень сшивки между молекулами полимера, как описано в данном документе.

Перенос раневой текучей среды вдоль/через матрицу (вместе с окрашенными частицами, если в раневой текучей среде присутствует протеазная активность) может осуществляться любыми подходящими способами. Как правило, раневая текучая среда перемещается вдоль/через матрицу под действием капиллярного эффекта.

«Рану» можно определить как нарушение защитной функции кожи; потерю целостности эпителия с потерей или без потери подлежащей соединительной ткани (т.е. мышц, костей, нервов) после повреждения кожи или подлежащих тканей/органов, вызванного, например, хирургическим вмешательством, ударом, порезом, химикатами, нагреванием/охлаждением, силой трения/сдвига, давлением или в результате заболевания, такого как язвы или карциномы нижних конечностей.

«Раневую текучую среду», также называемую «раневой экссудат», следует понимать как текучую раневую среду, которая подвергается воздействию внешней среды вследствие нарушения защитной функции кожи и потери целостности эпителия, включающую, состоящую по существу или состоящую из гноя, сыворотки, воды и/или крови и дополнительно включающую, состоящую по существу или состоящую из одного или более липидов, полисахаридов, белков, в частности протеаз, таких как белки внеклеточного матрикса, включая коллагеназы (более конкретно, например, желатиназы), и клеточного дебриса.

Матрица абсорбирует раневую текучую среду и тем самым подвергает зону реакции воздействию раневой текучей среды. Во многих вариантах осуществления зона реакции образована на верхней поверхности матрицы, а раневая текучая среда абсорбируется через нижнюю поверхность. Таким образом, в таких вариантах осуществления матрица позволяет раневой текучей среде проходить в зону реакции. В некоторых вариантах осуществления размеры матрицы рассчитывают так, чтобы раневая текучая среда насыщала матрицу. В некоторых вариантах осуществления матрица может быть биологически инертной, т.е. она не взаимодействует и не инициирует реакцию биологической ткани, с которой она вступает в контакт. Изделия, содержащие биологически инертную матрицу, являются предпочтительными для применения in situ изделий в рамках настоящего изобретения при этом изделие помещают в контакт с раной в течение предварительно определенного периода времени. Вследствие биологической инертности риск неблагоприятной иммунной реакции со стороны раненого субъекта сводится к минимуму и предпочтительно устраняется совсем. Понятно, что конкретные размеры раны являются уникальными в каждом случае, и что размер повязки на рану соответствующим образом адаптируют, например, с использованием отрезания повязок по размеру. Следовательно, в других вариантах осуществления для применения in situ в ране матрица имеет размеры, подходящие и предназначенные для облегчения размещения изделия между повязкой на рану и раной. В определенных вариантах осуществления матрица имеет размеры толщина × ширина × длина по меньшей мере 2 мм × 10 мм × 10 мм, но не более 7 мм × 40 мм × 40 мм. В конкретном варианте осуществления матрица имеет размеры 5 мм × 25 мм × 25 мм. Верхняя и нижняя поверхности не обязательно должны быть квадратными во всех вариантах осуществления. Например, они могут быть прямоугольными или круглыми. В некоторых вариантах осуществления матрица может быть цилиндрической. Матрица также может быть представлена в формате отрезания по размеру при условии, что каждая отрезанная матрица образует изделие согласно настоящему изобретению (т.е. создает реакционную зону и окрашенные частицы, надлежащим образом расположенные в матрице). Для применения in situ матрица является достаточно мягкой и удобной, чтобы минимизировать или избежать причинения значительного дискомфорта в ране, особенно после наложения на рану. Применение повязки на рану оказывает на матрицу сжатие некоторого уровня. Соответственно, в дополнительных вариантах осуществления матрица является достаточно устойчивой к сжатию, чтобы обеспечить поддержание структуры матрицы, пригодной для абсорбции достаточных объемов раневой текучей среды, чтобы обеспечить функционирование изделия. В конкретных вариантах осуществления матрица способна абсорбировать и удерживать объем раневой текучей среды (экссудата), достаточный для дальнейшего (последующего и отдельного) анализа экссудата, как описано далее в настоящем документе. Например, в определенных вариантах осуществления матрица имеет емкость, чтобы абсорбировать объем по меньшей мере 0,2 мл (раневой текучей среды). В дополнительных вариантах осуществления матрица имеет емкость, чтобы абсорбировать объем в диапазоне 0,2-10 мл. Например, объем, составляющий по меньшей мере 0,2 мл, 0,3 мл, 0,4 мл, 0,5 мл, 1 мл, 2 мл, 3 мл, 4 мл, 5 мл или 10 мл. В конкретном варианте осуществления матрица имеет емкость, чтобы абсорбировать объем 3 мл (включая диапазон 2,5-3,4 мл).

В определенных вариантах осуществления матрица составлена из одного или нескольких материалов, выбранных из:

(i) полиуретана; и/или

(ii) полиэтилена; и/или

(iii) волокон целлюлозы; и/или

(iv) пористой гидрофильной пластмассы.

Пригодные пористые гидрофильные пластмассы включают пластмассы, продаваемые Porex Limited.

В других вариантах осуществления матрица содержит нетканый материал, такой как нетканый материал Orion, поставляемый Anowo Ltd. В конкретных вариантах осуществления нетканый материал имеет 4 унции веса на квадратный ярд.

Когда матрица выполняет двойные функции (т.е. обеспечивает визуальный индикатор протеазной активности в раневой текучей среде, а также удерживает объем экссудата, достаточный для дальнейшего анализа), матрица может содержать, состоять по существу или состоять из первой и второй частей. Соответственно, на всем протяжении раскрытия ссылка на «матрицу» включает ссылку на первую и/или вторую части матрицы. Таким образом, матрица может содержать, состоять по существу или состоять из первого и второго слоев. Эти две части или слои могут быть прикреплены друг к другу, например, посредством ламинирования. Каждая часть имеет один или более или все признаки матрицы, которые описаны в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления первая часть содержит, состоит по существу или состоит из сшитых и чувствительных к протеазам полимеров, образующих на ней/в ней зону реакции. Первая часть способна абсорбировать достаточное количество раневой текучей среды, чтобы позволить сшитым и чувствительным к протеазам полимерам (на первой части или в ней) вступать в контакт с раневой текучей средой и, следовательно, с протеазной активностью, которую она может содержать. Также первая часть, как правило, содержит, состоит по существу или состоит из окрашенных частиц. В целом, первая часть также представляет собой участок визуализации протеазной активности в раневой текучей среде.

В некоторых вариантах осуществления вторая часть способна абсорбировать раневую текучую среду в количестве, достаточном для последующего (и отдельного) анализа раневой текучей среды, как дополнительно описано в данном документе.

Соответственно, изобретение предоставляет изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из:

(i) первой (биологически инертной) матрицы, которая абсорбирует раневую текучую среду, которая содержит, состоит по существу или состоит из:

сшитых и чувствительных к протеазам полимеров, образующих зону реакции на/в матрице; и

окрашенных частиц;

при этом расположение полимеров и окрашенных частиц такое, что расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к транспорту окрашенных частиц вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде; и

(ii) второй (биологически инертной) матрицы, которая абсорбирует раневую текучую среду в количестве, достаточном для последующего (и отдельного) анализа раневой текучей среды.

Следовательно, матрицу можно расположить таким образом, чтобы вторая часть вступала в непосредственный контакт с раной, а первая часть опосредованно абсорбировала раневую текучую среду посредством жидкостной связи со второй частью.

Таким образом, первую часть можно наложить поверх второй части. Давление, оказываемое повязкой на рану, может удерживать части в жидкостном соединении in situ. В других вариантах осуществления их можно соединить более постоянным образом, например, посредством ламинирования.

В некоторых вариантах осуществления зону реакции можно эффективно разместить между первой и второй частями матрицы, необязательно вместе с окрашенными частицами (напр., заключенными в зоне реакции). Если протеазная активность в раневой текучей среде достаточна, чувствительные к протеазам полимеры разлагаются, тем самым высвобождая окрашенные частицы в раневую текучую среду. По мере того, как раневая текучая среда проходит в первую часть, на верхней поверхности виден цвет.

В дополнительных вариантах осуществления поверхность первой части, которая не находится в контакте со второй частью, покрыта или иным образом окружена прозрачной пленкой, чтобы защитить ее от физического повреждения. Раневая текучая среда, абсорбированная второй частью, все еще может достигать первой части через соединительную поверхность, которая обеспечивает возможность жидкостного соединения. Такое расположение гарантирует, что сшитые и чувствительные к протеазе полимеры, содержащиеся, состоящие по существу или состоящие на первой части матрицы или в ней, подвергаются воздействию раневой текучей среды. Прозрачность пленки позволяет визуально определять в момент ухода любой сигнал, генерируемый вследствие того, что сшитые и чувствительные к протеазам полимеры вступают в контакт с протеазной активностью в раневой текучей среде, как дополнительно описано в данном документе. В более широком смысле верхняя поверхность матрицы может содержать, состоять по существу или состоять из этих элементов.

В некоторых вариантах осуществления первая часть или слой матрицы существенно тоньше, чем вторая часть. В некоторых вариантах осуществления первая часть или слой содержит, состоит по существу или состоит из мембраны. В некоторых вариантах осуществления вторая часть содержит, состоит по существу или состоит из абсорбирующего вспененного материала, такого как полиуретановая пена. В конкретных вариантах осуществления, когда матрица содержит, состоит по существу или состоит из первой и второй части, как описано в данном документе, первая и вторая части могут состоять из одинаковых или разных материалов. В некоторых вариантах осуществления вторая часть состоит из полиуретана, который может быть в форме пены. В конкретных вариантах осуществления полиуретан представляет собой неизоцианатный полиуретан. В других вариантах осуществления первая и/или вторая часть может содержать нетканый материал, такой как нетканый материал Orion, поставляемый Anowo Ltd. В конкретных вариантах осуществления нетканый материал имеет массу 4 унции веса на квадратный ярд.

В конкретных вариантах осуществления окрашенные частицы заключены в полимеры. Таким образом, зона реакции в некоторых вариантах осуществления содержит, состоит по существу или состоит из окрашенных частиц. В таких вариантах осуществления окрашенные частицы не высвобождаются, пока в образце имеется (достаточная) протеазная активность. Таким образом, воздействие раневой текучей среды, содержащей недостаточную (в том числе отсутствующую) протеазную активность, не приводит к высвобождению окрашенных частиц из зоны реакции (до какой-либо заметной степени). Расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к высвобождению окрашенных частиц из полимеров вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде.

В некоторых вариантах осуществления визуальная индикация протеазной активности в раневой текучей среде, которая обеспечивается после высвобождения окрашенных частиц вдоль/через матрицу после расщепления полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, содержит, состоит по существу или состоит из рассеянных окрашенных частиц из их изначальной зоны осаждения на матрице (т.е. из зоны реакции, образованной до контакта с раневой текучей средой). Таким образом, окрашивание в зоне реакции уменьшается по интенсивности или исчезает совсем. Снижение интенсивности заметно визуально. В некоторых вариантах осуществления цветовую шкалу можно снабдить изделием, обеспечивающим ссылку на ожидаемые изменения/уровни цвета, если соответствующие протеазы активны в раневой текучей среде. Это может быть шкала, например, простая шкала отсутствующей, низкой или высокой активности или числовая шкала в некоторых вариантах осуществления. Шкалу можно снабдить рекомендациями для дальнейших действий в зависимости от результатов прочтения. В качестве альтернативы или в дополнение к наблюдению невооруженным глазом, снижение интенсивности цвета можно определять и/или количественно оценивать с использованием спектрофотометра или другого такого оборудования, подходящего для этой цели, которое хорошо известно специалисту в данной области. Таким образом, изделия согласно настоящему изобретению можно снабдить подходящим считывателем или можно интегрировать в устройство, способное выполнять/демонстрировать некоторый уровень автоматического считывания сигнала. Оно может быть количественным или полуколичественным в некоторых вариантах осуществления.

В конкретных вариантах осуществления матрица содержит визуальный символ, который перед воздействием раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности маскируется окрашенными частицами, которые могут быть заключены в полимеры. Например, визуальный символ можно напечатать на матрице с использованием любых подходящих средств (например, несмываемых чернил), поверх которых первоначально осаждают окрашенные частицы (которые могут быть заключены в полимеры). Как только матрица входит в контакт и абсорбирует (достаточное) количество раневой текучей среды, расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к транспорту окрашенных частиц вдоль/через матрицу, тем самым выявляя визуальный символ.

В дополнительных вариантах осуществления матрица содержит зону просмотра. До воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности зона просмотра не содержит окрашенных частиц. Таким образом, зона просмотра отделена от зоны реакции. Как правило, разделение происходит по меньшей мере в двух измерениях на поверхности матрицы. При воздействии раневой текучей среды расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к высвобождению окрашенных частиц вдоль/через матрицу в зону просмотра. Как следствие, цвет зоны просмотра, по-видимому, изменяется и/или усиливается благодаря перемещению окрашенных частиц в зону просмотра. Следовательно, в зоне просмотра обеспечивается визуальная индикация протеазной активности. В предпочтительных вариантах осуществления изменение и/или усиление цвета видно невооруженным глазом. В качестве альтернативы или в дополнение к наблюдению невооруженным глазом, уменьшение интенсивности цвета можно определить и/или количественно оценить с использованием спектрофотометра или другого такого оборудования, подходящего для этой цели, которое хорошо известно специалисту в данной области. Матрицу можно расположить так, чтобы ток раневой текучей среды предпочтительно шел в направлении к зоне просмотра из зоны реакции. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, например, матрица может содержать канал, направляющий ток текучей среды из зоны реакции к зоне просмотра. Однако это не обязательно во всех вариантах осуществления. В некоторых вариантах осуществления зона наблюдения может просто представлять собой видимую поверхность матрицы, которая не является зоной реакции и/или местом расположения окрашенных частиц при отсутствии (достаточной) протеазной активности.

В конкретных вариантах осуществления зона просмотра содержит, состоит по существу или состоит из молекул захвата для захвата окрашенных частиц. Это может помочь с выработкой легко интерпретируемого сигнала. Молекулы захвата могут располагаться так, чтобы создавать видимую линию или другой символ, который может сделать возможным некоторый уровень количественного определения сигнала (и, следовательно, протеазной активности). Молекулами захвата являются любые молекулы, способные связываться с окрашенными частицами. Они могут включать, состоять по существу или состоять, например, из антитела или аптамера, которые специфически связываются с окрашенными частицами. В конкретных вариантах осуществления молекулы захвата представляют собой антитела, которые специфически связываются с окрашенными частицами. Антитела могут быть моноклонального или поликлонального происхождения. Также можно использовать фрагменты и производные антитела, включая, без ограничения, Fab-фрагменты, ScFv, однодоменные антитела, наноантитела, антитела с тяжелой цепью, аптамеры и т.д., которые сохраняют функцию специфического связывания, и они включены в определение «антитела». Способы получения специфических антител и аптамеров хорошо известны специалистам в данной области. Антитела могут быть человеческого или нечеловеческого происхождения (например, грызунов, таких как крыса или мышь) и быть гуманизированными и т.д. в соответствии с известными методиками (Jones et al., Nature (1986) May 29-Jun. 4;321(6069):522-5; Roguska et al., Protein Engineering, 1996, 9(10):895-904; и Studnicka et al., Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure. Protein Engineering, 1994, Vol. 7, pg 805).

В дополнительных вариантах осуществления матрица содержит барьер, выровненный с (расположенным вниз по потоку) концом зоны просмотра. Другими словами, зона просмотра расположена между окрашенными частицами и барьером, а барьер расположен относительно зоны обзора так, что окрашенные частицы накапливаются в зоне просмотра после высвобождения окрашенных частиц вдоль/через матрицу в зону просмотра после расщепления полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде. Таким образом, барьер препятствует выходу окрашенных частиц за пределы зоны просмотра. Например, барьер может содержать, состоять по существу или состоять из пористого материала, причем поры имеют размер, который позволяет текучей среде и молекулам с молекулярной массой ниже порогового значения проходить через барьер, но которые не являются достаточно большими, чтобы позволить окрашенным частицам проходить за барьер. Специалист в данной области техники способен выбрать подходящие материалы с подходящим пороговым значением по молекулярной массе в зависимости от используемых окрашенных частиц. В качестве альтернативы, для вариантов осуществления, включающих пористую матрицу, барьер может содержать область самой матрицы, в которой область содержит поры с размером пор, меньшим, чем диаметр окрашенных частиц (в то же время делая возможным пассаж текучей среды). Такую область можно создать, например, путем раздавливания или иного сжатия этой области матрицы. Сжатие в достаточной степени уменьшает размер пор, так что он становится меньше диаметра окрашенных частиц. Таким образом, окрашенные частицы не могут проходить через раздавленную/сжатую область (барьер) и, следовательно, накапливаются в зоне просмотра после высвобождения окрашенных частиц вдоль/через матрицу в зону просмотра после расщепления полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде.

Согласно всем аспектам и вариантам осуществления изобретения, описанным в данном документе, окрашенные частицы могут содержать, состоять по существу или состоять из окрашенных микрочастиц. Как правило, окрашенные частицы нерастворимы (то есть не растворяются) в раневой текучей среде. В конкретных вариантах осуществления окрашенные частицы могут содержать, состоять по существу или состоять из частиц активированного угля и/или окрашенных микрочастиц полистирола (таких как полистирольные окрашенные Blur микросферы Polybead® (диаметр 0,5 микрон, 2,5% твердых веществ), полученных от Polysciences, Inc. (номер изделия 15709). В предпочтительных вариантах осуществления окрашенные частицы содержат, состоят по существу или состоят из окрашенных микрочастиц полистирола. Другие неограничивающие варианты осуществления окрашенных частиц для использования в изобретении включают фталоцианин-тетрасульфоновой кислоты медь тетранатриевую соль, окрашенные латексные микрочастицы, частицы золота и/или молекулы красителя, такие как фталоцианиновый синий BN (также называемый «Monastal Blue»; CAS 147-14-8). В целом, окрашенными частицами являются любые окрашенные частицы, которые можно обнаружить, как описано в данном документе или с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, и которые могут переноситься водной текучей средой вдоль/через матрицу.

Согласно всем аспектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, описанным в данном документе, заключение окрашенных частиц в (необязательно сшитые) в чувствительные к протеазам полимеры можно достигнуть путем сушки полимеров с окрашенными частицами. Как следствие, полимеры и, таким образом, зона реакции, принимают окраску заключенных частиц. Окрашенные частицы остаются заключенными в полимерах, до тех пор и пока полимеры не будут расщеплены вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, абсорбируемой изделием. После расщепления полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, окрашенные частицы транспортируются вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде. Как правило, это происходит из зоны реакции к зоне просмотра.

Заключение окрашенных частиц можно непосредственно контрастировать, используя растворимые красители, которые связаны с чувствительными к протеазам полимерами. Связь может быть прямой (например, ковалентная связь) или непрямой (например, адсорбция). Окрашенные частицы имеют преимущество в том, что они обеспечивают улучшенное окрашивание зоны реакции.

Специалисту в данной области будет очевидно, что с учетом вышеизложенного, конкретные варианты осуществления изобретения, описанные выше, позволяют их использовать ex situ в формате латерального потока. Таким образом, в изобретении также предоставлено:

Изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из:

а зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду

b зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, содержащей, состоящей по существу или состоящей из сшитых чувствительных к протеазам полимеров, при этом окрашенные частицы заключены в полимеры; и необязательно

с зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца и зоны реакции;

при этом зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны реакции (и зоны просмотра при наличии), и при этом расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, необязательно выше порогового уровня, приводит к переносу окрашенных частиц с раневой текучей средой вдоль/через матрицу, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности (которую можно наблюдать в зоне просмотра при наличии). Описанные выше варианты осуществления можно использовать к этому конкретному аспекту латерального потока mutatis mutandis, и они не повторяются здесь просто для краткости.

В дополнительных вариантах осуществления согласно всем вышеизложенным аспектам и вариантам осуществления, сшитые и чувствительные к протеазам полимеры (т.е. зона реакции) образуют барьер, который в отсутствие протеазной активности, необязательно выше порогового уровня, в раневой текучей среде предотвращает контакт раневой текучей среды с окрашенными частицами. Таким образом, зона реакции может образовывать барьер для тока раневой текучей среды, если в раневой текучей среде нет достаточной протеазной активности, чтобы разрушить барьер. В конкретных вариантах осуществления окрашенные частицы не обязательно заключены в полимеры, но находятся вниз по потоку барьера, образованного полимерами, другими словами, барьер расположен между точкой нанесения раневой текучей среды на матрицу и зоной на матрице, где первоначально осаждали окрашенные частицы. При использовании расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, необязательно выше порогового уровня, разрушает барьер и приводит к току окрашенных частиц вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде. В конкретных вариантах осуществления матрица дополнительно содержит зону просмотра, которая до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности не содержит окрашенных частиц. При воздействии раневой текучей среды расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к высвобождению окрашенных частиц вдоль/через матрицу в зону просмотра. Как следствие, цвет зоны просмотра, по-видимому, изменяется и/или усиливается благодаря перемещению окрашенных частиц в зону просмотра. Следовательно, в зоне просмотра обеспечивается визуальная индикация протеазной активности.

В предпочтительных вариантах осуществления изменение и/или усиление цвета видно невооруженным глазом. В качестве альтернативы или в дополнение к наблюдению невооруженным глазом, изменение и/или повышение интенсивности цвета можно определить и/или количественно оценить с использованием спектрофотометра или другого такого оборудования, подходящего для этой цели, которое хорошо известно специалисту в данной области. Таким образом, изделия согласно настоящему изобретению можно снабдить подходящим считывателем или можно интегрировать в устройство, способное выполнять некоторый уровень автоматического считывания сигнала. Оно может быть количественным или полуколичественным в некоторых вариантах осуществления.

В конкретных вариантах осуществления зона просмотра содержит, состоит по существу или состоит из молекул захвата для захвата окрашенных частиц. Это может способствовать выработке легко интерпретируемого сигнала. Молекулы захвата могут располагаться так, чтобы создавать видимую линию или другой символ, который может сделать возможным некоторый уровень количественного определения сигнала (и, следовательно, протеазной активности). Молекулами захвата являются любые молекулы, способные связываться с окрашенными частицами. Они могут включать, состоять по существу или состоять, например, из антитела или аптамера, который специфически связывается с окрашенными частицами. В конкретных вариантах осуществления молекулы захвата представляют собой антитела, которые специфически связываются с окрашенными частицами. Антитела могут быть моноклонального или поликлонального происхождения. Также можно использовать фрагменты и производные антитела, включая, без ограничения, Fab-фрагменты, ScFv, однодоменные антитела, наноантитела, антитела с тяжелой цепью, аптамеры и т.д., которые сохраняют функцию специфического связывания, и они включены в определение «антитела». Способы выработки специфических антител и аптамеров хорошо известны специалистам в данной области. Антитела могут быть человеческого или нечеловеческого происхождения (например, грызунов, таких как крыса или мышь) и быть гуманизированными и т.д. в соответствии с известными методиками (Jones et al., Nature (1986) May 29-Jun. 4;321(6069):522-5; Roguska et al., Protein Engineering, 1996, 9(10):895-904; и Studnicka et al., Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure. Protein Engineering, 1994, Vol. 7, pg 805).

В дополнительных вариантах осуществления матрица содержит второй барьер (т.е. в дополнение к барьеру, образованному сшитыми, чувствительными к протеазам полимерами), выровненный с (расположенным вниз по потоку) концом зоны просмотра. Другими словами, зона просмотра расположена между окрашенными частицами и вторым барьером, а второй барьер расположен относительно зоны обзора так, что окрашенные частицы накапливаются в зоне просмотра после высвобождения окрашенных частиц вдоль/через матрицу в зону просмотра после расщепления полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде. Таким образом, второй барьер препятствует выходу окрашенных частиц за пределы зоны просмотра. Например, барьер может содержать, состоять по существу или состоять из пористого материала, при этом поры имеют размер, который позволяет текучей среде и молекулам с молекулярной массой ниже порогового значения проходить через барьер, но которые не являются достаточно большими, чтобы позволить окрашенным частицам проходить за барьер. Специалист в данной области техники способен выбрать подходящие материалы с подходящим пороговым значением по молекулярной массе в зависимости от используемых окрашенных частиц. В качестве альтернативы, для вариантов осуществления, содержащих пористую матрицу, второй барьер может содержать область самой матрицы, в которой область содержит поры с размером пор меньшим, чем диаметр окрашенных частиц (в то же время делая возможным пассаж текучей среды). Такую область можно создать, например, путем раздавливания или иного сжатия этой области матрицы. Сжатие в достаточной степени уменьшает размер пор, так что он становится меньше диаметра окрашенных частиц. Таким образом, окрашенные частицы не могут проходить через раздавленную/сжатую область (второй барьер) и, следовательно, накапливаются в зоне просмотра после высвобождения окрашенных частиц вдоль/через матрицу в зону просмотра после расщепления полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде.

В конкретных вариантах осуществления матрица содержит визуальный символ, который до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности маскируется окрашенными частицами. Например, визуальный символ можно напечатать на матрице с использованием любых подходящих средств (например, несмываемых чернил), поверх которых первоначально осаждают окрашенные частицы. Как только матрица входит в контакт и абсорбирует (достаточное) количество раневой текучей среды, расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к транспорту окрашенных частиц вдоль/через матрицу, тем самым выявляя визуальный символ.

Таким образом, в свете вышеуказанного для специалистов в данной области будет очевидно, что варианты осуществления настоящего изобретения, описанные выше в отношении барьера, образованного сшитыми чувствительными к протеазам полимерами, позволяют их использовать ex situ в формате латерального потока. Таким образом, в связанном аспекте в изобретении также предоставлено:

Изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из:

а зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду

b зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, содержащей, состоящей по существу или состоящей из сшитых чувствительных к протеазам полимеров;

с зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, расположенной вниз по потоку зоны реакции; и необязательно

d зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца и зоны реакции;

при этом зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны реакции и зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц (и зоны просмотра при наличии), и при этом полимеры в зоне реакции образуют барьер, который предотвращает попадание раневой текучей среды в зону, содержащую, состоящую по существу или состоящую из окрашенных частиц (и зону просмотра при наличии). Расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, необязательно выше порогового уровня, разрушает барьер и приводит к переносу окрашенных частиц с раневой текучей средой вдоль/через матрицу, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности (которую можно наблюдать в зоне просмотра при наличии). Варианты осуществления, описанные выше в отношении барьера, образованного сшитыми чувствительными к протеазам полимерами, можно использовать в аспекте латерального проточного анализа mutatis mutandis и не повторяются здесь просто для краткости.

Согласно всем аспектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, описанным в данном документе, (необязательно сшитые) чувствительные к протеазам полимеры содержат, состоят по существу или состоят из сайтов расщепления для одной или более протеаз. Предпочтительно, чувствительные к протеазам полимеры содержат, состоят по существу или состоят из сайтов расщепления для многочисленных протеаз, отражающих протеазы, которые обычно ответственны за неправильное заживление раны, когда они присутствуют в избытке (как обсуждается более подробно в данном документе). Как следствие, (необязательно сшитые) чувствительные к протеазе полимеры могут быть предназначены для репликации среды внеклеточного матрикса раны, в частности границ раны. Таким образом, зона реакции может реплицировать внеклеточный матрикс раны. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полимеры можно рассматривать как молекулярные «волокна», причем между волокнами образованы необязательные поперечные связи. (Необязательно сшитые) чувствительные к протеазам полимеры могут образовывать гидрогелевую структуру (например, желатиновый гидрогель). В конкретных вариантах осуществления полимеры содержат, состоят по существу или состоят из белка/полипептида. Однако для специалистов в данной области должно быть очевидно, что синтетические полимеры также могут быть подходящими при условии, что они содержат, состоят по существу или состоят из одного или более сайтов расщепления по меньшей мере для одной протеазы. В конкретных вариантах осуществления полимер может содержать, состоять по существу или состоять из мономерных единиц как природного, так и неприродного происхождения. В конкретных вариантах осуществления полимер содержит, состоит по существу или состоит из необязательно сшитого коллагена. Коллаген может образовывать коллагеновую бляшку. В предпочтительных вариантах осуществления коллаген полностью, в значительной степени или частично денатурируют перед использованием в изобретении. Когда это происходит в результате частичного гидролиза коллагена, его называют «желатином», что хорошо известно специалисту в данной области. Таким образом, в этих предпочтительных вариантах осуществления полимер содержит, состоит по существу или состоит из необязательно сшитого желатина. В других вариантах осуществления полимер содержит, состоит по существу или состоит из необязательно сшитого эластина.

Согласно всем аспектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, описанным в данном документе, чувствительность к протеазной активности (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров можно регулировать многочисленными (комбинируемыми) средствами, прямо и опосредованно. Релевантные факторы включают продолжительность времени, в течение которого изделие будет находиться в контакте с раневой текучей средой (т.е. определяется тем, как долго зона реакции будет подвергаться воздействию раневой текучей среды). Например, в некоторых вариантах осуществления зона реакции, содержащая (необязательно сшитые) чувствительные к протеазам полимеры, дополнительно содержит один или более ингибиторов протеаз. В конкретных вариантах осуществления один или более ингибиторов протеаз могут быть (непосредственно (напр., ковалентно) или опосредованно (напр., посредством адсорбции)) связаны с (необязательно сшитыми) чувствительными к протеазам полимерами. Одна или более молекул ингибиторов протеаз, присутствующих в зоне реакции, ингибирует специфичные протеазы, присутствующие в раневой текучей среде и, следовательно, фактически снижает уровни присутствующей активной протеазы, которая способна расщеплять (необязательно сшитые) чувствительные к протеазе полимеры. Например, один или более ингибиторов протеаз может содержать, состоять по существу или состоять из иломастата (GM6001, галардин), который является ингибитором матричных металл о протеиназ для ряда ММР, особенно ММР-1, ММР-2, ММР-3, ММР-7, ММР-8, ММР-9, ММР-12, ММР-14 и т.д. и/или ингибитора эластазы Elastase Inhibitor-V от Calbiochem (2-(2-бромфенил)-5-хлор-3,1-бензоксазин-4-он), который представляет собой соединение бензоксазинона, которое действует как мощный ингибитор эластазы лейкоцитов человека (IC₅₀=29,5 нМ) путем ковалентной модификации серина активного центра с помощью реакции присоединения-элиминации Михаэля. Другое (непрямое) средство адаптации чувствительности к протеазной активности (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров состоит в том, чтобы дополнительно включать один или более жертвенных белков/полипептидов в зоне реакции, содержащих (необязательно сшитые) чувствительные к протеазам полимеры. Один или более жертвенных белков/полипептидов может, например, содержать, состоять по существу или состоять из альбумина и/или оптимизированных (синтетических) чувствительных к протеазам пептидов. Один или более жертвенных белков/полипептидов действуют как альтернатами (конкурентный) субстрат для протеаз в раневой текучей среде, тем самым перенаправляя протеазную активность от (необязательно сшитых) чувствительных к протеазе полимеров. Для тех вариантов осуществления, в которых чувствительные к протеазам полимер являются сшитыми, еще одним прямым средством адаптации чувствительности полимеров к протеазной активности является увеличение или уменьшение степени сшивания (как дополнительно описано в данном документе). Увеличение сшивания уменьшит чувствительность к протеазам, поскольку увеличение числа сшивок требует более интенсивного расщепления чувствительных к протеазам полимеров, прежде чем окрашенные частицы смогут транспортироваться вдоль/через матрицу раневой текучей средой. И наоборот, уменьшение сшивания увеличит чувствительность к протеазе, основываясь на том же принципе. Каждое из этих средств манипулирования чувствительностью к протеазной активности (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров можно использовать отдельно или в комбинации по мере целесообразности (в зависимости, например, от того, сшиты чувствительные к протеазам полимеры или нет).

Согласно всем аспектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, описанным в данном документе, сшивки, образующиеся между молекулами полимера, могут быть прямыми или опосредованными. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что сшивание молекул полимеров преимущественно стабилизирует молекулы полимеров в водных условиях и предотвращает постепенное растворение полимеров при отсутствии (диагностически релевантной) протеазной активности, что особенно актуально в контексте изделий, которые должны оставаться в ране в течение значительного периода времени (например, под повязкой на рану в течение более одного дня). Кроме того, как описано выше, сшивание усиливает устойчивость полимеров к расщеплению вследствие протеазной активности, только если протеазная активность присутствует в достаточных количествах, чтобы указывать на изменение состояния раны, которое может быть на (предварительно определенном) пороговом уровне или выше (предварительно определенного) порогового уровня протеазной активности. Как правило, молекулы немодифицированных полимеров сначала модифицируют одной или несколькими сшиваемыми группами, после чего молекулы модифицированных полимеров обрабатывают в подходящих для сшивания условиях (как описано в другом месте данного документа), чтобы получить сшитые полимеры. Подходящие для сшивания условия зависят от используемой сшиваемой группы. Например, подходящие условия могут включать, состоять по существу или состоять из использования ультрафиолетового (УФ) излучения, необязательно в присутствии подходящего фотоинициатора. Степень модификации молекул немодифицированных полимеров сшиваемыми группами можно контролировать путем регулирования относительных молярных концентраций полимера по отношению к сшиваемым группам и/или путем соответствующего изменения условий реакции для модификации, напр., варьирования рН и/или температуры реакции, которая может влиять/изменять состояние заряда мономерных единиц, из которых состоит, состоит по существу или состоит полимер и/или конформации полимера. Степень модификации можно определить количественно с помощью подходящих средств, известных в данной области техники, таких как ядерная магнитно-резонансная спектроскопия. Для этих вариантов осуществления изделия, пригодного для использования при определении in situ изменения состояния раны, предпочтительной является максимальная дериватизация полимера со сшиваемыми группами.

В предпочтительных вариантах осуществления молекулы полимера (обычно желатина, коллагена и или эластина) модифицируют метакрилатом, метакриловым ангидридом или их производными, после чего метакрилат, метакриловый ангидрид или их производные связываются вместе в подходящих условиях, известных специалистам в данной области техники. Таким образом, для этих вариантов осуществления сшивки между полимерами содержат, состоят по существу или состоят из метакрилата или его производных. Сшивания можно достигнуть при любых подходящих условиях, которые известны специалистам в данной области, например, посредством воздействия УФ-излучения, необязательно в присутствии подходящего фотоинициатора.

В других вариантах осуществления молекулы полимеров (как правило, желатина, коллагена и/или эластина) модифицируют глутаральдегидом или его производными, после/в течение чего глутаральдегид или его производные связываются вместе в подходящих условиях, известных специалистам в данной области. Таким образом, для этих вариантов осуществления сшивки между полимерами являются производными глютаральдегида или его производных. Сшивания можно достигнуть при любых подходящих условиях, которые известны специалистам в данной области.

Как описано в данном документе, согласно всем аспектам и вариантам осуществления настоящего изобретения, полимеры, используемые в изобретении, чувствительны к протеазам (то есть они содержат, состоят по существу или состоят по меньшей мере из одного сайта расщепления протеазы). В некоторых вариантах осуществления полимеры могут быть чувствительны к одной конкретной протеазе. В других более предпочтительных вариантах осуществления полимеры могут быть чувствительны к множеству протеаз (протеазам, характерным для процессов заживления ран in vivo). Как будет понятно специалисту, это будет зависеть от сайтов расщепления, присутствующих в полимере. Каждый сайт расщепления может подвергаться расщеплению одной конкретной протеазой или множеством протеаз. В качестве альтернативы или кроме того, полимер может содержать, состоять по существу или состоять из двух или более различных сайтов расщепления, расщепляемых различными протеазами. В целом, сайты расщепления содержат, состоят по существу или состоят из пептидной последовательности двух или более аминокислотных фрагментов, которые могут распознаваться одной или несколькими специфическими протеазами, способными разорвать по меньшей мере одну пептидную связь (между двумя аминокислотными фрагментами) в сайте расщепления. Сайты расщепления протеаз и реципрокные протеазы хорошо известны в данной области. Количество сайтов расщепления в полимере должно быть таким, чтобы после расщепления полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, полимеры в достаточной степени деградировали, чтобы привести к транспорту окрашенных частиц вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде. Специалист в данной области способен определить достаточное количество сайтов расщепления, используя рутинную экспериментальную работу с точки зрения этого требования. В конкретных вариантах осуществления сайты расщепления специфически распознаются и расщепляются сериновой протеазой, цистеиновой протеазой, аспарагиновой протеазой, треониновой протеазой и/или глутаминовой протеазой. В конкретных вариантах осуществления сайты расщепления специфически распознаются и расщепляются одной или несколькими матриксными металлопротеиназами, такими как ММР2, ММР8 и/или ММР9. В предпочтительных вариантах осуществления сайты расщепления специфически распознаются и расщепляются ферментами коллагеназой, желатиназой и/или эластазой (такой как нейтрофильная эластаза, более конкретно нейтрофильная эластаза человека). В еще одних вариантах осуществления сайты расщепления специфически распознаются и расщепляются протеазой катепсином, таким как катепсин G. В еще одних вариантах осуществления сайты расщепления специфически распознаются и расщепляются ферментом семейства папаинов, таким как стафопаин из Staphylococcus aureus. Преимущественно, чувствительные к протеазе полимеры могут расщепляться (что можно назвать «перевариваться») множеством протеаз, имеющих отношение к заживлению ран. Множество протеаз можно выбрать из всех протеаз, перечисленных выше.

В определенных вариантах осуществления, в соответствии со всеми аспектами и другими вариантами осуществления изобретения, описанными в настоящем документе, чувствительные к протеазам полимеры расщепляются (до любой значительной степени), только если протеазная активность в раневой текучей среде находится на уровне или выше предварительно определенного порогового уровня. В этих вариантах осуществления, если протеазная активность отсутствует или присутствует на уровнях ниже порогового значения, то вследствие отсутствия (до какой-либо значительной степени) расщепления полимеров вдоль/через матрицу транспортируется незначительное количество окрашенных частиц или они не транспортируются, и, следовательно, не обеспечивается визуальная индикация активности протеазы. Например, пороговый уровень активности протеаз может быть таким, какой ожидается в заживающей ране. Например, в заживающей ране можно ожидать некоторую активность коллагеназы, но избыточная активность может указывать на то, что состояние раны ухудшилось. В конкретных вариантах осуществления предварительно определенный пороговый уровень может находиться в диапазоне 0,0001-0,1 мг/мл. Например, он может составлять 0,0001 мг/мл, 0,00015 мг/мл, 0,00031 мг/мл, 0,00062 мг/мл, 0,001 мг/мл, 0,00125 мг/мл, 0,0025 мг/мл, 0,005 мг/мл, 0,01 мг/мл, 0,0125 мг/мл, 0,025 мг/мл, 0,05 мг/мл или 0,1 мг/мл. Пороговые значения можно применять к общей протеазной активности, обнаруживаемой в образце. В конкретных вариантах осуществления, в которых одна или более протеаз содержат, состоят по существу или состоят из коллагеназы/желатиназы, матриксной металлопротеиназы, такой как ММР2, ММР8 и/или ММР9, нейтрофильной эластазы (необязательно человеческой нейтрофильной эластазы) и/или ферментов семейства папаинов, таких как стафопаин из Staphylococcus aureus, предварительно установленный пороговый уровень может составлять 0,0001 мг/мл, 0,00015 мг/мл, 0,00031 мг/мл, 0,00062 мг/мл, 0,001 мг/мл, 0,00125 мг/мл, 0,0025 мг/мл, 0,005 мг/мл, 0,01 мг/мл, 0,0125 мг/мл, 0,025 мг/мл, 0,05 мг/мл или 0,1 мг/мл. В конкретных вариантах осуществления предварительно определенный пороговый уровень активности матриксной металлопротеиназы, такой как ММР2, ММР8 и/или ММР9, находится в диапазоне 0,0007-0,025 мг/мл. В конкретных вариантах осуществления предварительно определенный пороговый уровень активности матриксной металлопротеиназы, такой как ММР2, ММР8 и/или ММР9, составляет 0,00076 мг/мл или выше. В других вариантах осуществления предварительно определенный пороговый уровень активности матриксной металлопротеиназы, такой как ММР2, ММР8 и/или ММР9, составляет 0,0228 мг/мл или выше. Пороговые значения можно применять к общей протеазной активности, обнаруживаемой в образце. В конкретных вариантах осуществления предварительно определенный пороговый уровень активности нейтрофильной эластазы (необязательно человеческой нейтрофильной эластазы) находится в диапазоне 0,0059-0,344 мг/мл. В конкретных вариантах осуществления предварительно определенный пороговый уровень активности нейтрофильной эластазы (необязательно человеческой нейтрофильной эластазы) составляет 0,0995 мг/мл или выше. Пороговые значения можно применять к общей активности нейтрофильной эластазы, обнаруживаемой в образце. В конкретных вариантах осуществления предварительно определенный пороговый уровень активности протеазы катепсина, такого как катепсин G, находится в диапазоне 0,005-0,05 мг/мл. Пороговые значения можно применять к общей активности протеазы катепсина, обнаруживаемой в образце.

Желатин является особенно подходящим материалом для использования в зонах реакции согласно настоящему изобретению и предоставляет индикатор физиологически релевантной протеазной активности в раневой текучей среде. Таким образом, в изобретении также предоставлено изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из матрицы, которая абсорбирует раневую текучую среду, при этом матрица содержит, состоит по существу или состоит из:

a. сшитого желатина, образующего зону реакции на/в матрице; и

b. окрашенных (предпочтительно полистирольных) микрочастиц;

при этом сшивки содержат, состоят по существу или состоят из: (i) метакрилата или его производных, или (ii) глутаральдегида или его производных; и

при этом расположение полимеров и окрашенных частиц такое, что расщепление полимеров вследствие активности желатиназы, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к транспорту окрашенных частиц вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию активности желатиназы в раневой текучей среде. Все отличительные признаки и варианты осуществления, описанные выше, релевантны к этому изделию mutatis mutandis и не повторяются здесь просто для краткости.

Подобным образом, в изобретении также предоставлено изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из:

a. зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду

b. зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, содержащей, состоящей по существу или состоящей из молекул сшитого желатина, при этом окрашенные (предпочтительно полистирольные) микрочастиц заключены в молекулы желатина; и необязательно

c. зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца и зоны реакции;

при этом сшивки содержат, состоят по существу или состоят из: (i) метакрилата или его производных, или (ii) глутаральдегида или его производных; и

зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны реакции (и зоны просмотра при наличии), и при этом расщепление молекул желатина вследствие активности желатиназы, присутствующей в раневой текучей среде, необязательно выше порогового уровня, приводит к переносу окрашенных (полистирольных) микрочастиц с раневой текучей средой вдоль/через матрицу, тем самым обеспечивая визуальную индикацию активности желатиназы (которую можно наблюдать в зоне просмотра при наличии). Все отличительные признаки и варианты осуществления, описанные выше, релевантны к этому изделию mutatis mutandis и не повторяются здесь просто для краткости.

Подобным образом, в изобретении также предоставлено изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из:

a. зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду

b. зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, содержащей, состоящей по существу или состоящей из сшитых молекул желатина;

c. зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, расположенной вниз по потоку зоны реакции; и необязательно

d. зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца и зоны реакции;

при этом сшивки содержат, состоят по существу или состоят из: (i) метакрилата или его производных, или (ii) глутаральдегида или его производных; и

зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны реакции и зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных (полистирольных) микрочастиц (и зоны просмотра при наличии), и при этом молекулы желатина в зоне реакции образуют барьер, который предотвращает попадание раневой текучей среды в зону, содержащую, состоящую по существу или состоящую из окрашенных (полистирольных) микрочастиц (и зону просмотра при наличии). Расщепление молекул желатина вследствие активности желатиназы, присутствующей в раневой текучей среде, необязательно выше порогового уровня, разрушает барьер и приводит к переносу окрашенных полистирольных микрочастиц с раневой текучей средой вдоль/через матрицу, тем самым обеспечивая визуальную индикацию активности желатиназы (которую можно наблюдать в зоне просмотра при наличии). Все отличительные признаки и варианты осуществления, описанные выше, релевантны к этому изделию mutatis mutandis и не повторяются здесь просто для краткости.

Все вышеупомянутые изделия и варианты осуществления могут дополнительно содержать корпус для размещения матрицы. Если предоставлен корпус, он может содержать, состоять по существу или состоять из одного или более, необязательно двух, смотровых окон, которые определяют одну или несколько зон просмотра на матрице для осмотра окрашенных частиц. Эти смотровые окна можно расположить вдоль корпуса таким образом, что до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности окрашенные частицы видно в первом смотровом окне, но не видно во втором смотровом окне. Для тех вариантов осуществления, которые содержат, состоят по существу или состоят из одной или более зон просмотра, одно или несколько окон просмотра можно выровнять так, чтобы зоны просмотра были видны (и определялись) через смотровые окна. В качестве альтернативы части матрицы, которые не содержат, по существу не состоят или не состоят из зоны реакции и/или зоны просмотра, можно замаскировать так, что какие-либо окрашенные частицы не будут видны потребителю. Это помогает упростить сигналы, подлежащие интерпретации.

В более широком смысле, в связанном аспекте в изобретении также предоставлена тестовая матрица, содержащая, состоящая по существу или состоящая из коллагеновых и/или желатиновых полимеров, при этом полимеры содержат метакрилатные сшивки или сшивки, производные глутаральдегида. В предпочтительных вариантах осуществления тестовая матрица пригодна для измерения протеазной активности, предпочтительно в раневой текучей среде. Тестовая матрица может содержать любой один или более отличительных признаков, которые описаны в данном документе в отношении других аспектов изобретения.

Подобным образом, в изобретении также предоставлены сшитые метакрилатом полимеры желатина для использования при измерении протеазной активности в раневой текучей среде.

В дополнительном аспекте в изобретении раскрыто использование сшитых и чувствительных к протеазам полимеров в качестве субстрата для измерения протеазной активности в раневой текучей среде. В предпочтительных вариантах осуществления используемые полимеры содержат, состоят по существу или состоят из полимеров коллагена, желатина и/или эластина. Наиболее предпочтительным является желатин. В дополнительных вариантах осуществления сшивки содержат, состоят по существу или состоят из метакрилата и/или являются производными глутаральдегида.

В другом аспекте в изобретении предоставлен способ мониторинга состояния раны (субъекта), предусматривающий, состоящий по существу или состоящий из:

a. нанесения образца раневой текучей среды на изделие, как определено в данном документе; и

b. определения визуальной индикации протеазной активности, обеспеченной окрашенными частицами.

В конкретных вариантах осуществления способа окрашенные частицы оценивают в области матрицы, чтобы обеспечить количественное определение протеазной активности в раневой текучей среде. В родственных вариантах осуществления область содержит, состоит по существу или состоит из зоны просмотра, как определено в другом месте данного документа. В некоторых вариантах осуществления изделие, используемое в способах, содержит, состоит по существу или состоит из двух зон просмотра, и исчезновение окрашенных частиц в одной зоне сравнивают с увеличением количества окрашенных частиц во второй зоне. Например, до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности первая зона просмотра может содержать, состоять по существу или состоять из окрашенных частиц, тогда как вторая зона просмотра не содержит, по существу не состоит или не состоит из них. При воздействии раневой текучей среды расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к высвобождению окрашенных частиц вдоль/через матрицу. Как следствие, окрашенные частицы движутся из первой зоны просмотра вдоль/через матрицу по направлению тока раневой текучей среды ко второй зоне просмотра. В предпочтительных вариантах осуществления изменение цвета в каждой зоне просмотра видно невооруженным глазом. В качестве альтернативы или в дополнение к наблюдению невооруженным глазом, изменение цвета можно определить и/или оценить количественно, используя спектрофотометр или другое такое оборудование, подходящее для этой цели, которое хорошо известно специалисту в данной области.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает, состоит по существу или состоит из нанесения дополнительной жидкости на изделие для облегчения протекания раневой текучей среды. Это можно назвать «выгонять текучую среду». Дополнительная жидкость может содержать, состоять по существу или состоять из буфера. Буфер можно подобрать в соответствии со свойствами раневой текучей среды и/или других материалов, используемых в способе. Например, «выгонять текучую среду» можно для того, чтобы проводить раневую текучую среду через поры тест-полоски. Использование дополнительной жидкости может улучшить перенос высвобожденных окрашенных частиц вдоль/через матрицу. Дополнительная жидкость может содержать, состоять по существу или состоять из поверхностно-активного вещества для предотвращения нежелательной адгезии окрашенных частиц к матрице.

В другом аспекте изобретения способы, описанные в данном документе, повторяют с интервалами, чтобы облегчить длительный мониторинг состояния раны путем повторного отбора проб и анализа раневой текучей среды. Указанные интервалы могут составлять каждые 1/2, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней, еженедельно или ежемесячно или их комбинацию. Накопление данных, относящихся к состоянию раны на протяжении времени, позволяет врачу-клиницисту лучше понимать динамику состояния раны и/или эффективность лечения (видов лечения). Например, длительный мониторинг раневой текучей среды, как описано, может указать врачу-клиницисту более быстрым и/или количественным образом, чем текущие процедуры, что состояние раны с течением временем ухудшается и, следовательно, настоящее лечение неэффективно. Вследствие этого врач-клиницист может быстрее выбрать альтернативные методы лечения, чтобы способствовать заживлению раны. В качестве альтернативы, данные могут указывать врачу-клиницисту, что необходимы дополнительные исследования раневой текучей среды и/или раневой среды.

В дополнительном варианте осуществления отсутствие чрезмерной протеазной активности указывает на то, что любое существующее лечение раны следует продолжить (т.е. не следует изменять).

В другом аспекте в изобретении предоставлен способ получения матрицы для измерения протеазной активности в раневой текучей среде, предусматривающий, состоящий по существу или состоящий из:

a. Нанесения раствора, содержащего модифицированные метакрилатом полимеры, на матрицу, способную абсорбировать раневую текучую среду; и

b. Облучения полимеров УФ-излучением, тем самым сшивая полимеры.

Таким образом, в способе получают матрицу, содержащую, состоящую по существу или состоящую из зоны реакции. Зона реакции обычно покрывает дискретную часть видимой поверхности матрицы и, таким образом, не насыщает матрицу.

Модифицированные метакрилатом полимеры можно получить, используя любую подходящую методику/протокол, известные в данной области. Например, когда полимер содержит, состоит по существу или состоит из аминогрупп, таких как s-аминогруппы лизина в белке/полипептиде, полимер может реагировать с метакриловым ангидридом, который может быть в (большом) избытке. Согласно методу Be Hoon Lee et al. (RSC Adv., 2015, 5, 106094-106097), эту реакцию можно проводить при приблизительно 50°С в течение приблизительно 3 часов в карбонатном буфере, чтобы поддерживать рН приблизительно при рН 7,0-9,0, регулируя метакриловым ангидридом и гидроксидом натрия по мере необходимости. Этот способ позволяет эффективно модифицировать ε-аминогруппы лизина в белке/полипептиде, при этом ограничивая нежелательные побочные реакции. Полученные модифицированные метакрилатом полимеры можно очистить с использованием подходящих способов, известных в данной области, таких как фильтрация тангенциальным потоком или диализ.

В конкретных вариантах осуществления раствор этапа а) также содержит окрашенные частицы, а этап b) приводит к заключению окрашенных частиц в сшитые полимеры.

В дополнительных вариантах осуществления раствор этапа а), кроме того, содержит пригодный фотоинициатор (чтобы начать/катализировать реакцию сшивания при воздействии УФ-излучения на этапе (b)). В конкретных вариантах осуществления итоговые концентрации фото инициатор а, модифицированных метакрилатом полимеров и окрашенных частиц в растворе этапа (а) находятся в диапазоне: 0,01-10% (м/о) фотоинициатора, 0,01-50% (м/о) модифицированных метакрилатом полимеров и 0,01-40% (м/о) окрашенных частиц. В некоторых вариантах осуществления итоговые концентрации фотоинициатора, модифицированных метакрилатом полимеров и окрашенных частиц в растворе этапа (а) находятся в диапазоне: 0,1-1% (м/о) фотоинициатора, 1-10% (м/о) модифицированных метакрилатом полимеров и 0,05-5% (м/о) окрашенных частиц. В предпочтительных вариантах осуществления итоговые концентрации фотоинициатора, модифицированных метакрилатом полимеров и окрашенных частиц в растворе этапа (а) составляют: 0,45% фотоинициатора, 8,1% модифицированных метакрилатом полимеров и 0,25% окрашенных частиц.

В дополнительных вариантах осуществления раствор наносят при температуре по меньшей мере 30°С. Это помогает предотвращать затвердевание модифицированных метакрилатом полимеров до тех пор, пока оно не потребуется. В некоторых вариантах к раствору для увеличения его вязкости можно добавить загуститель (такой как карбоксиметилцеллюлоза или желатин), чтобы облегчить манипулирование раствором на матрице перед УФ-облучением.

В конкретных вариантах осуществления объем раствора, содержащего модифицированные метакрилатом полимеры, который наносят на матрицу, находится в диапазоне 1-10 мкл, 1-20 мкл, 1-50 мкл, 1-100 мкл или 1-1000 мкл. В конкретных вариантах осуществления этот объем равен 5 мкл. В других вариантах осуществления этот объем равен 1 мкл.

В конкретных вариантах осуществления полимеры облучают УФ-светом в течение приблизительно 15-30 секунд, необязательно в присутствии фотоинициатора. В некоторых вариантах осуществления сшитые полимеры затем высушивают на/в матрице. Это может быть, например, воздушная сушка, необязательно в течение 1-5 часов (предпочтительно 3 часа).

В предпочтительных вариантах осуществления модифицированные метакрилатом полимеры содержат, состоят по существу или состоят из полимеров желатина, коллагена и/или эластина.

В дополнительных вариантах осуществления матрица содержит визуальный символ, и на этапе а) раствор наносят так, чтобы он покрывал визуальный символ. Визуальный символ можно напечатать на матрице с использованием любых подходящих средств (например, несмываемых чернил).

Как должно быть понятно специалисту, вышеупомянутые способы можно использовать для получения матрицы для использования в изделии, как определено в данном документе.

В дополнительном аспекте в изобретении предоставлен набор для получения изделия в рамках изобретения, содержащий, состоящий по существу или состоящий из:

a. сшитых и чувствительных к протеазам полимеров (предпочтительно полимеров желатина, коллагена и/или эластина); и

b. окрашенных частиц.

В конкретных вариантах осуществления набор дополнительно содержит матрицу, которая описана в данном документе. Набор также может содержать корпус, чтобы содержать матрицу, которая описана в данном документе. При предоставлении корпуса он может содержать, состоять по существу или состоять из одного или более, необязательно двух, смотровых окон для осмотра окрашенных частиц. Эти смотровые окна можно расположить вдоль корпуса таким образом, чтобы до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности окрашенные частицы были видны в первом смотровом окне, но не были видны во втором смотровом окне.

Хотя и предполагается, что наиболее предпочтительное применение in situ изделий согласно настоящему изобретению представляет собой отдельное изделие, упакованное полностью отдельно от повязки на рану, изделия согласно настоящему изобретению также можно интегрировать в повязку на рану. Таким образом, в изобретении также предоставлена повязка на рану, содержащая изделие согласно настоящему изобретению, как определено в данном документе. Повязка на рану и изделие могут быть предоставлены в виде набора компонентов. Таким образом, повязка на рану содержит изделие согласно настоящему изобретению при наложении повязки на рану, как более подробно описано в данном документе.

Для специалистов в данной области должно быть очевидно, что изделия, описанные в данном документе, можно разработать или использовать таким образом, чтобы абсорбировать достаточное количество раневой текучей среды, чтобы иметь возможность визуальной индикации протеазной активности в раневой текучей среде без обязательной абсорбции, или чтобы они были способны абсорбировать достаточное количество раневой текучей среды для дальнейшей последующей обработки, как описано в данном документе. Таким образом, в определенных вариантах осуществления изделие функционирует исключительно как детектор протеазной активности в ране. Эти варианты осуществления являются предпочтительными, поскольку они чрезвычайно просты в работе и интерпретации.

Однако из настоящего раскрытия специалистам в данной области техники также должно быть очевидно, что ключевым аспектом многих вариантов осуществления изделия согласно настоящему изобретению для применения in situ является способность абсорбировать достаточное количество раневой текучей среды, чтобы обеспечить возможность дальнейшего лабораторного тестирования текучей среды при удаленном от субъекта применении. После удаления из раны изделие необходимо безопасно доставить в лабораторию таким образом, чтобы текучая среда оставалась пригодной для диагностики. Таким образом, в изобретении также предоставлен набор, содержащий, состоящий по существу или состоящий из изделия, которое описано в данном документе, и сосуда (пригодного) для безопасного содержания без возможности утечки и транспортировки изделия. После контакта изделия с раной и абсорбции раневой текучей среды изделие можно извлечь из раны и поместить в сосуд, чтобы обеспечить безопасную транспортировку в лабораторию для дальнейшего анализа раневой текучей среды, как дополнительно описано в данном документе.

В вариантах осуществления изделия, в которых матрица содержит, состоит по существу или состоит из первой и второй части, как описано в данном документе, первую и вторую часть можно предоставить в виде двух отдельных компонентов в наборах, описанных в данном документе. В конкретных вариантах осуществления эти два компонента могут быть соединяемыми друг с другом, так что потребитель в момент ухода может собрать два компонента в единый блок для размещения в контакте с раной (текучей средой). Повязка на рану может удерживать блок на месте. В определенных вариантах осуществления, где вторая часть способна абсорбировать и абсорбирует раневую текучую среду в количестве, достаточном для последующего анализа раневой текучей среды, как дополнительно описано в данном документе, в лабораторию необходимо безопасно доставить только эту вторую часть, как описано в данном документе. Таким образом, вторая часть может быть отсоединяемой от первой. В качестве альтернативы, для дальнейшего тестирования можно отправить весь блок. Результат теста в первой части предоставляет полезную диагностическую информацию, поэтому может быть также выгодно передать ее.

В определенных вариантах осуществления по меньшей мере внутренняя поверхность (поверхности) и в целом все поверхности, включая внешние поверхности, содержащего сосуда являются биологически инертными.

В дополнительных вариантах осуществления контакт матрицы с внутренней поверхностью или поверхностями содержащего сосуда.

Сосуд должен быть герметичным, чтобы обеспечить безопасную транспортировку без риска утечки текучей среды. Уплотнение может быть обратимым или может потребоваться разрушить его в лаборатории, чтобы получить доступ к текучей среде. Как правило, сосуд является расходным предметом однократного применения. В некоторых вариантах осуществления он может быть изготовлен из пластмассы. Однако его можно использовать повторно после подходящей стерилизации, напр., посредством автоклавирования в некоторых вариантах осуществления.

В другом аспекте в изобретении предоставлен способ мониторинга состояния раны у субъекта, предусматривающий, состоящий по существу или состоящий из:

(a) размещения изделия согласно настоящему изобретению, как описано в данном документе, в контакте с раной под повязкой на рану;

(b) оставления изделия в контакте с раной в течение предварительно определенного времени;

(c) определения наличия или отсутствия визуальной индикации протеазной активности в ране с помощью изделия;

при этом наличие визуальной индикации сигнализирует о необходимости дальнейшего анализа раневой текучей среды.

В вариантах осуществления изделия, в которых матрица содержит, состоит по существу или состоит из первой и второй части, как описано в данном документе, первая и вторая части могут быть отдельными компонентами, не соединенными друг с другом и независимо помещенными в контакт с раной в течение предварительно определенного времени. В других вариантах осуществления первая и вторая части могут быть предоставлены в виде отдельных компонентов, которые могут быть соединены друг с другом и собраны потребителем в единый блок в момент ухода. Этот единый блок затем помещают в контакт с раной в течение предварительно определенного времени. Таким образом, вторая часть может быть отсоединяемой от первой. В качестве альтернативы, для дальнейшего тестирования можно отправлять весь блок. Результат теста в первой части предоставляет полезную диагностическую информацию, поэтому передать ее также может быть полезно. В конкретных вариантах осуществления первая часть содержит, состоит по существу или состоит из сшитых и чувствительных к протеазам полимеров, описанных в данном документе, на той части матрицы или в ней. Первая часть способна абсорбировать достаточное количество раневой текучей среды, чтобы воздействовать на сшитые и чувствительные к протеазам полимеры, содержащиеся на первой части или в ней, раневой текучей средой и, следовательно, на протеазную активность, которая может в ней содержаться. Таким образом, эта первая часть предоставляет визуальную индикацию протеазной активности в ране с помощью изделия, которое описано в данном документе. Вторая часть способна абсорбировать раневую текучую среду в количестве, достаточном для последующего анализа раневой текучей среды, как дополнительно описано в данном документе.

В определенных вариантах осуществления, однако, визуальную индикацию комбинируют с одним или более показателями, выбранными из:

(i) запаха из раны

(ii) общего объема текучей среды

(iii) внешнего вида раны

(iv) общего состояния субъекта

для того, чтобы определить необходимость дальнейшего анализа раневой текучей среды.

Отсутствие визуальной индикации изделия можно компенсировать наличием одного или нескольких других перечисленных выше показателей, которые при общей оценке определяют необходимость дальнейшего анализа раневой текучей среды. Такую оценку может сделать лицо, осуществляющее уход, такое как участковая медсестра, в момент ухода, или врач-клиницист.

В дополнительном варианте осуществления способ дополнительно предусматривает, состоит по существу или состоит из:

(d) удаления изделия из контакта с раной;

(e) извлечения текучей среды, абсорбируемой изделием;

(f) анализа извлеченной текучей среды для определения состояния раны.

Для удаления изделия можно использовать пинцет или другой инструмент для предотвращения прямого контакта человека с матрицей.

В конкретных вариантах осуществления, в которых изделие содержит, состоит по существу или состоит из матрицы, содержащей, состоящей по существу или состоящей из первой и второй части, как описано в данном документе, раневую текучую среду извлекают из второй части матрицы, которая абсорбировала количество раневой текучей среды, достаточное для последующего анализа раневой текучей среды, как дополнительно описано в данном документе.

В определенных вариантах осуществления этап (d) дополнительно предусматривает, состоит по существу или состоит из хранения и транспортировки изделия в лабораторию перед выполнением этапа (е). Для вариантов осуществления изделия, в которых матрица содержит, состоит по существу или состоит из первой и второй части, как описано в данном документе, в определенных вариантах осуществления сохраняют и транспортируют в лабораторию только вторую часть матрицы, поскольку это та часть, которая абсорбирует количество раневой текучей среды, достаточное для последующего анализа раневой текучей среды, как дополнительно описано в данном документе. В других вариантах осуществления и первую, и вторую части матрицы сохраняют и транспортируют в лабораторию, так что, например, степень деградации одного или нескольких маркеров, присутствующих в первой части матрицы, можно оценить в лаборатории. Таким образом, вторая часть может быть отсоединяемой от первой. В качестве альтернативы для дальнейшего тестирования можно отправлять весь блок. Результат теста первой части предоставляет полезную диагностическую информацию, поэтому передать ее также может быть полезно. Хранение изделия можно осуществлять в сосуде, как описано в данном документе, пригодном для безопасного содержания и транспортировки до этапов (е) и (f). В определенных вариантах осуществления внутренняя и наружная поверхности содержащего сосуда являются биологически инертными. В дополнительных вариантах осуществления контакт матрицы с внутренней поверхностью содержащего сосуда не изменяет существенно состояние текучей среды или ее компонентов.

В дополнительном варианте осуществления сосуд, содержащий изделие, удаленное из раны, транспортируют в лабораторию для дополнительного анализа абсорбированной раневой текучей среды.

Извлечение жидкости можно осуществлять любыми подходящими средствами. Например, матрицу можно сжать для высвобождения текучей среды или можно центрифугировать

Анализ извлеченной текучей среды предусматривает, состоит по существу или состоит из одного или более тестов для характеристики состояния раны. Такие тесты могут облегчить лечение и выбор терапевтических и других клинических вмешательств. Можно использовать любой подходящий тест, который легко понятен специалисту в данной области. В определенных вариантах осуществления анализ текучей среды предусматривает, состоит по существу или состоит из измерения уровней и/или активности одного или более из:

(i) N-терминального сывороточного проколлагена 1 типа (P1NP)

(ii) N-ацетил-пролин-глицин-пролина (acPGP)

(iii) биомаркера нейтрофильной инфильтрации

N-терминальный сывороточный проколлаген 1 типа (P1NP) является индикаторной молекулой синтеза коллагена. N-ацетил-пролин-глицин-пролин (acPGP) является проуктом деградации коллагена, образующегося в результате протеолитического расщепления коллагена матриксными металлопротеиназами, в частности коллагеназой. Следовательно, в дополнительном варианте осуществления уровни P1NP и acPGP используют для определения индекса скорости заживления, при этом:

(i) равные уровни P1NP и acPGP указывают на заживление и/или успешное лечение раны, потому что скорости синтеза и деградации коллагена приблизительно сбалансированы;

(ii) более высокие уровни acPGP относительно P1NP указывают на воспаление и/или повышенный риск инфекции в ране, поскольку разрушается больше коллагена, чем синтезируется;

(iii) умеренно более высокие уровни P1NP относительно acPGP указывают на траекторию эффективного заживления, поскольку коллагена синтезируется больше, чем разрушается;

(iv) значительно более высокие уровни P1NP относительно cPGP указывают на повышенный риск гипергрануляции в ране, поскольку синтезируется избыточное количество коллагена относительно скорости деградации коллагена.

«Гипергрануляцию» следует понимать как чрезмерное увеличение грануляционной ткани, которая может распространяться выше края раны и содержит, состоит по существу или состоит из вновь образованных коллагеновых, эластиновых и капиллярных сетей.

Во время заживления ран инфильтрирующие нейтрофилы рекрутируются к участку раны и участвуют в деградации ткани и формировании ткани. Как таковая, чрезмерная или уменьшенная миграция или активация инфильтрирующих нейтрофилов в поврежденную ткань может оказывать глубокое влияние на последующую миграцию, пролиферацию, дифференцировку клеток и, в конечном счете, на качество реакции заживления. В частности, кальпротектин представляет собой белок, продуцируемый нейтрофилами, о которых известно, что он присутствует в плазме и заметно повышен при воспалительных состояниях. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления биомаркером инфильтрации нейтрофилов является кальпротектин.

В дополнительных вариантах осуществления анализ извлеченной текучей среды дополнительно или в качестве альтернативы предусматривает, состоит по существу или состоит из измерения уровней одного более из:

(i) Гидроксилирования остатков лизина и пролина в раневой текучей среде;

(ii) биомаркеров ангиогенеза; и/или

(iii) биомаркеров дифференцировки кровеносных сосудов

В определенных вариантах осуществления низкие уровни гидроксилирования свободных остатков лизина и пролина в раневой текучей среде указывают на необходимость лечения, способствующего усилению кровотока и доступу кислорода к ране.

В определенных вариантах осуществления биомаркеры ангиогенеза включают, состоят по существу или состоят из фактора роста эндотелия сосудов.

В определенных вариантах осуществления биомаркеры дифференцировки кровеносных сосудов включают, состоят по существу или состоят из молекул межклеточной адгезии.

В определенных вариантах осуществления низкие уровни фактора роста эндотелия сосудов и/или молекул межклеточной адгезии указывают на необходимость обработки раны с помощью наносимых добавок фактора роста эндотелия сосудов.

В дополнительных вариантах осуществления анализ извлеченной текучей среды дополнительно или в качестве альтернативы предусматривает, состоит по существу или состоит из определения содержания оксида азота (NO) в ране посредством измерения уровней и/или активности одного или более из:

(i) индуцибельной синтазы оксида азота

(ii) карбоксиметиллизина

(iii) аргиназы

Как понятно в данной области техники, отсутствие индуцибельной синтазы оксида азота приведет к невозможности NO-ответов, обычно необходимых в физиологическом гомеостазе. Точно так же накопление карбоксиметиллизина указывает на то, что участок раны находится в состоянии дефицита NO. Также следует понимать, что аргиназа потребляет аргинин в метаболическом пути, который не продуцирует NO и является конкурентом NO-синтазы.

Низкое содержание оксида азота указывает на необходимость лечения субъекта, имеющего рану, с помощью терапии оксидом азота или аргинина в виде пищевой добавки.

В дополнительных вариантах осуществления анализ извлеченной текучей среды дополнительно предусматривает, состоит по существу или состоит из измерения уровней одного или более из следующих маркеров:

(i) десмозина

(ii) матриксной металлопротеиназы (ММР8)

(iii) кальпротектина

(iv) TIMP1

(v) TIMP2

(vi) A1AT

(vii) интерлейкина-6

Под уровнями маркера подразумевается уровень экспрессии и/или активности, и/или количества, и/или концентрации маркера в раневой текучей среде. Уровни экспрессии могут коррелировать с активностью и, таким образом, их можно использовать в качестве суррогата активности и наоборот.

Специалист в данной области должен быть знаком с методиками и способами определения уровня P1NP, acPGP, гидроксилирования остатков лизина и пролина, ангиогенеза, фактора роста эндотелия сосудов, дифференцировки кровеносных сосудов, молекул межклеточной адгезии, индуцибельной синтазы оксида азота, карбоксиметиллизина, аргиназы, десмосина, ММР8, кальпротектина, TIMP1, TIMP2, А1АТ или интерлейкина-6.

Уровни экспрессии можно измерить на уровне белка или мРНК в соответствии с любым подходящим способом. Модификация белка, такая как гликозилирование, также может иметь значение и ее можно измерить любым подходящим способом. Многие такие способы хорошо известны в данной области и предусматривают использование масс-спектрометрии (напр., MALDI-TOF масс-спектрометрия).

Уровни экспрессии и/или количество и/или концентрация маркера (напр., белка) могут зависеть от связывающего реагента, такого как антитело или аптамер, который специфически связывается с представляющим интерес маркером (напр., белком). Антитело может иметь моноклональное или поликлональное происхождение. Также можно использовать фрагменты и производные антител, включая, без ограничения, Fab-фрагменты, ScFv, однодоменные антитела, наноантитела, антитела с тяжелой цепью, аптамеры и т.д., которые сохраняют функцию специфического связывания, и они включены в определение «антитела». Такие антитела полезны в способах изобретения. Их можно использовать для измерения уровня конкретного маркера (напр., белка или, в некоторых случаях, одной или нескольких специфических изоформ белка. Специалист в данной области техники способен идентифицировать эпитопы, которые позволяют отличать конкретные изоформы друг от друга).

Способы получения специфических антител известны специалистам в данной области. Антитела могут быть человеческого или нечеловеческого происхождения (напр., грызунов, таких как крыса или мышь) и могут быть гуманизированы и т.д. в соответствии с известными методиками (Jones et al., Nature (1986) May 29-Jun. 4;321(6069):522-5; Roguska et al., Protein Engineering, 1996, 9(10):895-904; и Studnicka et al., Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure. Protein Engineering, 1994, Vol. 7, pg 805).

В определенных вариантах осуществления уровень экспрессии и/или количество и/или концентрацию маркера определяют с использованием антитела или аптамера, конъюгированного с меткой. Под меткой подразумевается компонент, который делает возможным обнаружение, прямое или опосредованное. Например, метка может представлять собой фермент, необязательно пероксидазу или флуорофор.

Метка является примером детектирующего агента. Под детектирующим агентом подразумевается агент, который можно использовать для помощи в обнаружении комплекса антитело-маркер (например, белок). Когда антитело конъюгировано с ферментом, детектирующий агент может содержать, состоять по существу или состоять из химической композиции, так что фермент катализирует химическую реакцию с образованием детектируемого изделия. Изделия реакций, катализируемые соответствующими ферментами, могут быть, без ограничения, флуоресцентными, люминесцентными или радиоактивными, или они могут поглощать или отражать видимый или ультрафиолетовый свет. Примеры детекторов, подходящих для обнаружения таких детектируемых меток, включают, без ограничения, рентгеновскую пленку, измерители радиоактивности, сцинтилляционные счетчики, спектрофотометры, колориметры, флуорометры, люминометры, фотодетекторы и денситометры. В определенных вариантах осуществления детектирующий агент может содержать, состоять по существу или состоять из вторичного антитела. Затем уровень экспрессии определяют с использованием немеченого первичного антитела, которое связывается с целевым белком, и вторичного антитела, конъюгированного с меткой, при этом вторичное антитело связывается с первичным антителом.

Дополнительные методики определения уровня экспрессии на уровне белка и/или количества и/или концентрации маркера включают, например, вестерн-блот, иммунопреципитацию, иммуноцитохимию, масс-спектрометрию, ELISA и другие (см. ImmunoAssay: A Practical Guide, edited by Brian Law, published by Taylor & Francis, Ltd., 2005 edition). Для улучшения специфичности и чувствительности метода анализа, основанного на иммунореактивности, часто используют моноклональные антитела вследствие их специфического распознавания эпитопов. Поликлональные антитела также успешно используют в различных иммуно анализах благодаря их повышенной аффинности к мишени по сравнению с моноклональными антителами. Уровни белка можно обнаружить, используя латеральный проточный анализ в некоторых вариантах осуществления.

Измерение мРНК в биологическом образце можно использовать в качестве суррогата для определения уровня соответствующего белка в раневой текучей среде. Таким образом, уровень экспрессии любого из релевантных маркеров, описанных в настоящем документе, также можно определить путем определения соответствующей РНК.

Соответственно, в конкретных вариантах осуществления экспрессии уровень определяют с помощью микроматрицы, нозерн-блоттинга, секвенирования (включая секвенирование следующего поколения, такое как RNAseq) или амплификации нуклеиновых кислот. Амплификация нуклеиновых кислот включает ПЦР и все ее разновидности, такие как ПЦР в реальном времени и с детекцией по конечной точке, а также количественную ПЦР. Другие методики амплификации нуклеиновых кислот хорошо известны в данной области и включают такие методы, как NASBA, 3SR и транскрипционно-опосредованная амплификация (ТМА). Другие подходящие способы амплификации предусматривают лигазную цепную реакцию (LCR), селективную амплификацию целевых полинуклеотидных последовательностей (патент США №6410276), полимеразную цепную реакцию с праймированием на основе консенсусной последовательности (патент США №4437975), произвольно праймированную полимеразную цепную реакцию (WO 90/06995), методику Invader, методику с замещением цепей, рекомбиназную полимеразную амплификацию (RPA), реакции амплификации с использованием никующей эндонуклеазы (NEAR) и амплификации с вытеснением цепей (WO 2004/067726). Этот список не является исчерпывающим; можно использовать любую методику амплификации нуклеиновой кислоты при условии, что соответствующий продукт нуклеиновой кислоты специфически амплифицирован. Разработка подходящих праймеров и/или зондов находится в компетенции специалиста в данной области. Для оказания помощи в этом процессе свободно доступны различные инструменты для разработки праймеров, такие как инструмент NCBI Primer-BLAST. Праймеры и/или зонды могут иметь длину по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 (или более) нуклеотидов. Уровни экспрессии мРНК можно измерить с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR с последующей qPCR). кДНК можно использовать в анализе qPCR для получения флуоресценции по мере прохождения амплификации ДНК. По сравнению со стандартной кривой qPCR может дать абсолютное измерение, такое как количество копий мРНК на клетку. Для измерения уровней экспрессии мРНК в образце использовали нозерн-блоты, микрочипы, анализы Invader и RT-PCR в сочетании с капиллярным электрофорезом. См. Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004.

Экспрессию РНК можно определить путем гибридизации РНК с набором зондов. Зонды могут быть расположены в виде массива. Платформы с микрочипами включают платформы с микрочипами, выпускаемые компаниями, такими как Affymetrix, Illumina и Agilent. Осуществлять мониторинг экспрессии РНК также можно, используя методики секвенирования следующего поколения, такие как RNA-seq.

Подобным образом, активность одного или нескольких маркеров (напр., ферментативную активность) можно измерить в раневой текучей среде. Ферментативную активность можно измерить, например, путем обнаружения обработки субстрата, который может быть меченным. Например, анализ может представлять собой анализ флуорогенного субстрата. Ферментативную активность можно определить с использованием подходящего латерального проточного анализа. Примеры подходящих форматов анализа включают анализы, изложенные в международных патентных заявках WO 2009/024805, WO 2009/063208, WO 2007/128980, WO 2007/096642, WO 2007/096637, WO 2013/156794 и WO 2013/156795 (содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки).

В другом аспекте изобретения способы, описанные в данном документе, повторяют с интервалами, чтобы облегчить длительный мониторинг состояния раны посредством взятия образцов и анализа раневой текучей среды. Таким образом, например, после удаления изделия, которое описано в данном документе, которое было в контакте с раной в течение предварительно определенного периода времени и которое абсорбировало раневую текучую среду, и перед повторной перевязкой раны новое стерильное изделие, которое описано в данном документе, помещают в контакт с раной под новой повязкой на рану и способ повторяют в отношении нового изделия, которое теперь находится в контакте с раной. Указанные интервалы могут составлять каждые 1/2, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней, еженедельно или ежемесячно или их комбинацию. Указанные интервалы также могут составлять 24 часа, 48 часов, 120 часов или 144 часа или любую их комбинацию. Как обсуждалось в данном документе, изделие можно отправить в лабораторию для дальнейшего тестирования, только если предоставлена визуальная индикация протеазной активности в раневой текучей среде (т.е. изменение состояния раны). Тем не менее, посредством использования нового изделия каждый раз, когда рану перевязывают повторно, первоначальное тестирование маркеров проводят на регулярной основе и с последующим преимуществом в том, что образец для последующего тестирования получают в каждом случае.

Длительный мониторинг раневой текучей среды таким способом можно также выполнять даже при отсутствии визуальной индикации посредством изделия после контакта с раной в течение предварительно определенного периода времени («предварительно определенного времени контакта»). Например, изделие все-таки можно выводить из контакта с раной (и заменять новым, стерильным изделием), а абсорбированную раневую текучую среду подвергнуть анализу, как описано в данном документе, если прошел предварительно определенный период времени с момента взятия образца текучей среды из раны («предварительно определенное время взятия образца»). Предварительно определенное время взятия образца может составлять каждые 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней, еженедельно или ежемесячно или их комбинацию. Предварительно определенное время взятия образца может составлять 24 часа, 48 часов, 120 часов или 144 часа или любую их комбинацию. В предпочтительном варианте осуществления предварительно определенное время взятия образца составляет 4 недели после взятия предыдущего образца (при отсутствии визуальной индикации из изделия в промежуточный период). Таким образом, например, изделие можно заменять каждый раз при перевязке раны с интервалами, составляющими или приблизительно 3-4 дня. Изделие можно отправить в лабораторию в обычном порядке один раз в месяц, даже если ни одно из изделий не продемонстрировало визуальную индикацию за прошедший период.

Накопление данных, относящихся к состоянию раны с течением времени посредством сбора образцов и анализа раневой текучей среды с течением времени, позволяет врачу-клиницисту лучше понимать динамику состояния раны и/или эффективность лечения (видов лечения). Например, длительный мониторинг раневой текучей среды, как описано, может указать врачу-клиницисту более быстрым и/или количественным образом, чем текущие процедуры, что состояние раны с течением временем ухудшается и, следовательно, настоящее лечение неэффективно. Вследствие этого врач-клиницист может быстрее выбрать альтернативные методы лечения, чтобы способствовать заживлению раны. В качестве альтернативы, данные могут указывать врачу-клиницисту, что необходимы дополнительные исследования раневой текучей среды и/или раневой среды. Кроме того, накопленные данные позволяют врачу-клиницисту составить график посещений в связи с дальнейшим взятием образцов раневой текучей среды и повторной перевязкой раны лицом, осуществляющим уход, таким как участковая медсестра или член семьи, в зависимости от степени и направленности изменения в состоянии раны с течением времени.

В дополнительном варианте осуществления отсутствие избыточной протеазной активности в раневой текучей среде указывает на то, что существующее лечение раны следует продолжить (т.е. не следует изменять).

В другом связанном аспекте изобретения предоставлено изделие, содержащее (необязательно сшитые) чувствительные к протеазам полимеры для мониторинга ex situ состояния раны. Изделие делает возможным определение протеазной активности на основе латерального потока, необязательно на (предварительно определенном) пороговом уровне или выше него, в раневой текучей среде. Изделие делает возможным быстрое, чувствительное определение ex situ в момент ухода. Как следствие, воздействие на чувствительные к протеазам полимеры раневой текучей средой происходит, как правило, в течение меньшего количества времени.

Таким образом, согласно данному аспекту изобретения предоставлено изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из:

a. зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду;

b. зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, содержащей, состоящей по существу или состоящей из (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров;

c. зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца;

d. зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, зоны реакции и зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц;

при этом зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны просмотра (и при этом расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к переносу окрашенных частиц с раневой текучей средой к зоне просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в первой зоне просмотра). До воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности зона просмотра не содержит окрашенных частиц. Следовательно, преимущественно перенос окрашенных частиц в зону просмотра при наличии протеазной активности в раневой текучей среде предоставляет пользователю положительную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде. В предпочтительных вариантах осуществления изменение и/или усиление цвета в зоне просмотра видно невооруженным глазом. В качестве альтернативы или кроме того, наблюдаемое невооруженным глазом снижение интенсивности цвета можно определить и/или количественно оценить с использованием спектрофотометра или другого такого оборудования, подходящего для этой цели, которое хорошо известно специалисту в данной области.

Перенос раневой текучей среды между зонами может осуществляться любым подходящим способом, например, посредством капиллярного воздействия. Следует отметить, что на протяжении всего раскрытия зоны определяют с помощью изделия в состоянии до воздействия раневой текучей среды. Таким образом, изделия основаны на направленном потоке раневой текучей среды из зоны нанесения образца, через зону реакции и зону, содержащую, состоящую по существу или состоящую из окрашенных частиц, в зону просмотра. Таким образом, изделие обеспечивает твердую подложку, на которой расположены зона нанесения образца, зона реакции, зона, содержащая, состоящая по существу или состоящая из окрашенных частиц, и зона просмотра. Можно использовать любую подходящую твердую подложку. Например, изделие может содержать, состоять по существу или состоять из тест-полоски или устройства с капиллярным потоком в качестве твердой подложки. Твердая подложка может содержать, состоять по существу или состоять из хроматографической среды. Твердую подложку можно изготовить из любого материала, через который может проходить текучая среда, такого как флюидный канал или пористая мембрана. В определенных вариантах осуществления согласно настоящему изобретению хроматографическая среда содержит, состоит по существу или состоит из полоски или мембраны, например полоски или мембраны из нитроцеллюлозы. В случае устройства с капиллярным потоком одна или более из зоны нанесения образца, зоны реакции, зоны окрашенных частиц и зоны просмотра расположены в отдельных камерах, соединенных капиллярными каналами. Изделия согласно настоящему изобретению могут быть основаны на комбинациях тест-полосок и каналов капиллярного тока в некоторых вариантах осуществления. Например, зона нанесения образца может содержать, состоять по существу или состоять из абсорбирующего материала, и раневая текучая среда затем проходит вдоль зоны реакции. Находящаяся вниз по потоку зоны реакции твердая подложка может образовывать узкий (по сравнению с зоной нанесения образца и/или зоной реакции) капиллярный канал, чтобы способствовать концентрированию окрашенных частиц в зоне просмотра. В некоторых вариантах осуществления изделие содержит, состоит по существу или состоит из матрицы, которая описана в данном документе, на которой расположены зона нанесения образца, зона реакции, зона, содержащая, состоящая по существу или состоящая из окрашенных частиц, и зона просмотра.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения тест-полоска или капиллярное устройство может содержать один или более тисненых каналов капиллярного тока. Например, тест-полоска или капиллярное устройство, содержащее один или более тисненых каналов капиллярного тока, может быть образовано из двух (необязательно пластмассовых) фрагментов, причем каждый фрагмент содержит поверхность с одним или более тисненых участков/полостей, при этом два фрагмента соединены вместе (например, посредством ультразвуковой сварки или клея) и расположены таким образом, что тисненые участки/полости на каждой лицевой поверхности образуют один или более каналов капиллярного тока. В качестве альтернативы тест-полоска или капиллярное устройство может содержать единственный (необязательно пластмассовый) фрагмент, содержащий поверхность с одним или более тисненых участков/полостей. Над указанным одним или более тисненых участков/полостей укладывают клеевой слой, который присоединен к указанной поверхности, содержащей один или более тисненых участков/полостей, образуя таким образом один или более каналов капиллярного тока. Слой может представлять собой, например, плоский слой фольги или пленки. Его можно соединить с поверхностью, содержащей один или более тисненых участков/полостей любым подходящим способом, например посредством клея или ультразвуковой сварки.

В конкретных вариантах осуществления окрашенные частицы содержатся в зоне реакции. Таким образом, зона, содержащая, состоящая по существу или состоящая из окрашенных частиц, включена в зону реакции (т.е. они представляют собой одну и ту же общую «зону»).

В дополнительных вариантах осуществления окрашенные частицы заключены в полимеры. Этого можно достигнуть путем высушивания полимеров с окрашенными частицами. Как следствие, полимеры принимают окраску заключенных частиц. Окрашенные частицы остаются заключенными в полимеры до тех пор, пока полимеры не будут расщеплены вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде. После добавления раневой текучей среды в зону нанесения образца раневая текучая среда переносится в зону реакции. Расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к высвобождению окрашенных частиц в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде через зону просмотра.

Для тех вариантов осуществления, в которых окрашенные частицы заключены в сшитые, чувствительные к протеазам полимеры, этого можно достигнуть путем высушивания полимеров с окрашенными частицами. Как следствие, полимеры принимают окраску заключенных частиц. Окрашенные частицы остаются заключенными в полимеры до тех пор, пока полимеры не будут расщеплены вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде. После расщепления полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, окрашенные частицы транспортируются вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде. Как описано в другом месте данного документа, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления сшивающим агентом является метакрилат или его производные. Молекулы полимеров (как правило, желатина, коллагена и/или эластина) модифицируют метакрилатом, метакриловым ангидридом или их производными, после чего метакрилат, метакриловый ангидрид или их производные связываются вместе при подходящих условиях, известных специалистам в данной области. Таким образом, для этих вариантов осуществления сшивки между полимерами содержат, состоят по существу или состоят из метакрилата или его производных. В других вариантах осуществления в качестве сшивающего агента можно использовать глутаральдегид или его производные. Сшивания можно достигнуть при любых подходящих условиях, которые известны специалистам в данной области. Молекулы полимеров, содержащие, состоящие по существу или состоящие из желатина, являются наиболее предпочтительными.

Таким образом, в изобретении также предоставлено изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из:

a. зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду;

b. зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, заключенных в (необязательно сшитые) чувствительные к протеазам полимеры; и

c. зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца и зоны реакции;

при этом зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны просмотра, и при этом расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к переносу окрашенных частиц с раневой текучей средой в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в первой зоне просмотра.

В альтернативных вариантах осуществления зона, содержащая, состоящая по существу или состоящая из окрашенных частиц, находится вниз по потоку зоны реакции, т.е. она обособлена от зоны реакции и расположена между зоной реакции и зоной просмотра.

Таким образом, в изобретении также предоставлено изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из:

а. зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду;

b. зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца содержащей, состоящей по существу или состоящей из (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров;

c. зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, расположенной вниз по потоку зоны реакции;

d. зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, зоны реакции и зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц;

при этом зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны просмотра, и при этом расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к переносу окрашенных частиц с раневой текучей средой в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в первой зоне просмотра.

В конкретных вариантах осуществления зона реакции и/или (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров, содержащая, состоящая по существу или состоящая из них, образует барьер, который предотвращает (при отсутствии содержащихся в нем достаточной протеазной активности) прохождение раневой текучей среды, более конкретно, предотвращает попадание раневой текучей среды в зоны, находящиеся вниз по потоку зоны реакции (т.е. зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, и зоны просмотра). При воздействии раневой текучей среды расщепление полимеров вследствие (достаточной) протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, необязательно выше порогового уровня, разрушает барьер и приводит к переносу окрашенных частиц в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде через зону просмотра. Таким образом, для тех вариантов осуществления, в которых зона, содержащая, состоящая по существу или состоящая из окрашенных частиц, находится вниз по потоку зоны реакции, предотвращается контакт окрашенных частиц с раневой текучей средой до тех пор, пока полимеры не будут расщеплены вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, необязательно выше порогового уровня, и барьер не разрушится.

В некоторых вариантах осуществления изделие включает визуальный символ, который до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности маскируется окрашенными частицами. Например, визуальный символ можно напечатать на матрице с использованием любых подходящих средств (например, несмываемых чернил), поверх которого изначально осаждают окрашенные частицы. После воздействия раневой текучей среды расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к транспорту окрашенных частиц в направлении зоны просмотра, тем самым выявляя визуальный символ.

В дополнительных вариантах осуществления изделие дополнительно содержит вторую зону просмотра, выровненную (напр., выше и/или образованную) зоной, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, так что окрашенные частицы видно во второй зоне просмотра до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности. Эта дополнительная зона просмотра называется в данном документе «второй зоной просмотра». Для таких вариантов осуществления остаток изделия может быть замаскирован, так что только зоны просмотра могут предоставить пользователю четкую визуальную индикацию.

В дополнительных вариантах осуществления зона просмотра, находящаяся вниз по потоку зоны нанесения образца, зоны реакции и зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, содержит, состоит по существу или состоит из молекул захвата для захвата окрашенных частиц в зоне просмотра. Это может помочь генерации легко интерпретируемого сигнала. Молекулы захвата могут быть расположены так, чтобы создать видимую линию или другой символ, который может сделать возможным некоторый уровень количественного определения сигнала (и, следовательно, протеазной активности). Молекулами захвата являются любые молекулы, способные связываться с окрашенными частицами. Они могут включать, состоять по существу или состоять, например, из антитела или аптамера, который специфически связывается с окрашенными частицами. В конкретных вариантах осуществления молекулы захвата представляют собой антитела, которые специфически связываются с окрашенными частицами. Антитела могут быть моноклонального или поликлонального происхождения. Также можно использовать фрагменты и производные антитела, включая, без ограничения, Fab-фрагменты, ScFv, однодоменные антитела, наноантитела, антитела с тяжелой цепью, аптамеры и т.д., которые сохраняют функцию специфического связывания, и они включены в определение «антитела». Способы получения специфических антител и аптамеров хорошо известны специалистам в данной области. Антитела могут быть человеческого или нечеловеческого происхождения (например, грызунов, таких как крыса или мышь) и быть гуманизированными и т.д. в соответствии с известными методиками (Jones et al., Nature (1986) May 29-Jun. 4;321(6069):522-5; Roguska et al., Protein Engineering, 1996, 9(10):895-904; and Studnicka et al., Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure. Protein Engineering, 1994, Vol. 7, pg 805).

В дополнительных вариантах осуществления изделие содержит барьер на находящемся вниз по потоку конце зоны просмотра, которая находится вниз по потоку зоны нанесения образца, зоны реакции и зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц. Другими словами, зона просмотра расположена между зоной, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, и барьером, а барьер расположен относительно зоны просмотра таким образом, что окрашенные частицы накапливаются в зоне просмотра после высвобождения окрашенных частиц по направлению к зоне просмотра и в нее после расщепления полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде. Таким образом, барьер препятствует выходу окрашенных частиц за пределы зоны просмотра. Например, барьер может содержать, состоять по существу или состоять из пористого материала, при этом поры имеют размер, который позволяет жидкости и молекулам с молекулярной массой ниже порогового значения проходить через барьер, но не являются достаточно большими, чтобы позволить проходить через барьер окрашенным частицам. Специалист в данной области техники способен выбрать подходящие материалы с подходящим пороговым значением по молекулярной массе в зависимости от используемых окрашенных частиц. В качестве альтернативы, для вариантов осуществления, в которых твердая подложка содержит, состоит по существу или состоит из хроматографической среды (такой как мембрана из нитроцеллюлозы) или другую пористую мембрану, барьер может содержать область самой твердой подложки, при этом область содержит поры с размером пор, меньшим, чем диаметр окрашенных частиц (в то же время позволяя проходить текучей среде). Такую область можно создать, например, путем раздавливания или иного сжатия этой области матрицы. Сжатие в достаточной степени уменьшает размер пор, так что он становится меньше диаметра окрашенных частиц. Таким образом, окрашенные частицы не могут проходить через раздавленную/сжатую область (барьер) и, следовательно, накапливаются в зоне просмотра после высвобождения окрашенных частиц по направлению к зоне просмотра и в зону просмотра после расщепления полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде.

В конкретных вариантах осуществления (необязательно сшитый) чувствительный к протеазам полимер содержит, состоит по существу или состоит из коллагена, необязательно образуя коллагеновую бляшку. В предпочтительных вариантах осуществления коллаген полностью, в значительной степени или частично денатурируют перед использованием в изобретении. Когда это происходит в результате частичного гидролиза коллагена, его называют «желатином», что хорошо известно специалисту в данной области. Таким образом, в этих предпочтительных вариантах осуществления полимер содержит, состоит по существу или состоит из желатина. В других вариантах осуществления полимер содержит, состоит по существу или состоит из эластина.

В конкретных вариантах осуществления зона нанесения образца и зона реакции по меньшей мере частично перекрывают друг друга. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления раневую текучую среду можно добавлять непосредственно в зону реакции. Это происходит в ее части, расположенной выше, чтобы предотвратить перенос раневой текучей среды через изделие при отсутствии протеазной активности.

Таким образом, в изобретении также предоставлено изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из:

a. зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду;

b. зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных (предпочтительно полистирольных) микрочастиц, заключенных в (необязательно сшитый) желатин; и

c. зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца и зоны реакции;

при этом зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны просмотра, и при этом расщепление желатина вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к переносу окрашенных (полистирольных) микрочастиц с раневой текучей средой в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в первой зоне просмотра.

В изобретении также предоставлено изделие для мониторинга состояния раны, содержащее, состоящее по существу или состоящее из:

a. зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду;

b. зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца содержащей, состоящей по существу или состоящей из (необязательно сшитого) желатина;

c. зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных (предпочтительно полистирольных) микрочастиц, расположенной вниз по потоку зоны реакции;

d. зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, зоны реакции и зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных полистирольных микрочастиц;

при этом зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны просмотра, и при этом расщепление желатина вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к переносу окрашенных (полистирольных) микрочастиц с раневой текучей средой в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в первой зоне просмотра.

Все вышеупомянутые изделия и варианты осуществления могут дополнительно содержать корпус для размещения изделия. Если корпус предоставлен, он может содержать, состоять по существу или состоять из одного или более, необязательно двух, смотровых окон для осмотра окрашенных частиц. Эти смотровые окна можно расположить вдоль корпуса таким образом, что до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности окрашенные частицы видно в первом смотровом окне, но не видно во втором смотровом окне. Смотровые окна служат для обозначения зон просмотра изделия. Таким образом, для тех вариантов осуществления, которые содержат одну или более зон просмотра, одно или более смотровых окон можно выровнять так, чтобы зоны просмотра было видно через смотровые окна.

В некоторых вариантах осуществления до воздействия раневой текучей среды чувствительные к протеазам полимеры, окрашенные частицы и необязательно один или более сшивающих агентов можно смешать вместе и добавить в виде смеси в зону реакции (которая может перекрывать зону нанесения образца, как описано в другом месте данного документа). Еще до воздействия раневой текучей среды смесь можно высушить или отвердить (напр., используя УФ-освещение) для ускорения образования сшивок, если присутствует один или более поперечно-сшивающих агентов, и/или для фиксации в зоне реакции (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров, в которых окрашенные частицы таким образом заключены. Эту процедуру можно сделать в момент ухода. Вследствие этого, в изобретении также предоставлено набор частей, содержащий:

(i) изделие, содержащее зону нанесения образца, зону реакции (с отсутствием (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров и окрашенных частиц) и зону просмотра, как определено в данном документе;

(ii) чувствительные к протеазам полимеры;

(iii) окрашенные частицы; и

(iv) необязательно один или более сшивающих агентов (предпочтительно метакрилат, метакриловый ангидрид или их производное).

В некоторых вариантах осуществления чувствительные к протеазам полимеры и окрашенные частицы предоставлены в виде предварительно сформированной смеси.

Изделие набора частей (см. признак (i) выше) может дополнительно содержать один или более отличительных признаков, описанных в данном документе, таких как корпус, вторая зона просмотра и/или барьер. Эти признаки не повторяются здесь просто для краткости.

В альтернативных вариантах осуществления до воздействия раневой текучей среды чувствительные к протеазам полимеры и необязательно один или более сшивающих агентов можно смешать вместе и добавить в виде смеси в зону реакции (которая может перекрывать зону нанесения образца, как описано в другом месте данного документа). Окрашенные частицы наносят на отдельную зону, расположенную между зоной реакции и зоной просмотра. Еще до воздействия раневой текучей среды смесь можно высушить или отвердить (напр., используя УФ-свет) для ускорения образования сшивок, если присутствует один или более поперечно-сшивающих агентов, и/или для фиксации в зоне реакции (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров. Эту процедуру можно сделать в момент ухода. Вследствие этого, в изобретении также предоставлено набор частей, содержащий:

(i) изделие, содержащее зону нанесения образца, зону реакции (с отсутствием (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров), зону просмотра и зону, расположенную между зоной реакции и зоной просмотра, для приема окрашенных частиц, как определено в данном документе;

(ii) чувствительные к протеазам полимеры;

(iii) окрашенные частицы; и

(iv) необязательно один или более сшивающих агентов (предпочтительно метакрилат, метакр иловый ангидрид или их производное).

В некоторых вариантах осуществления чувствительные к протеазам полимеры и окрашенные частицы предоставлены в виде предварительно образованной смеси.

Изделие набора частей (см. признак (i) выше) может дополнительно содержать один или более из отличительных признаков, описанных в данном документе, таких как корпус, вторая зона просмотра и/или барьер. Эти признаки не повторяются здесь просто для краткости.

В конкретных вариантах осуществления матрица содержит, состоит по существу или состоит из хроматографической среды. В некоторых вариантах осуществления матрица содержит, состоит по существу или состоит из одного или более каналов капиллярного тока, вдоль/через которые раневая текучая среда может перемещаться. Кроме того, матрицу можно выгравировать так, что раневая текучая среда после нанесения на зону нанесения образца (или аналогично тому, как описано в данном документе) концентрируется, когда она движется вдоль/через матрицу. Таким образом, преимущественно, количество раневой текучей среды, необходимое для определения протеазной активности с использованием изделия, уменьшается.

В качестве альтернативы, части изделия, которые не содержат, не состоят по существу или не состоят из зоны реакции и/или зоны (зон) просмотра, можно замаскировать так, чтобы любые окрашенные частицы не были видны пользователю. Это помогает упростить сигналы, подлежащие интерпретации.

В связанном аспекте в изобретении также предоставлен способ мониторинга состояния раны, предусматривающий, состоящий по существу или состоящий из:

i. нанесения образца раневой текучей среды в зону нанесения образца изделия, содержащую, состоящую по существу или состоящую из:

a. зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду;

b. зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, содержащей, состоящей по существу или состоящей из (необязательно сшитых) чувствительных к протеазам полимеров;

c. зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца; и

d. зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, зоны реакции и зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц;

при этом зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны просмотра (которая до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности не содержит окрашенных частиц), и при этом расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к переносу окрашенных частиц с раневой текучей средой в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в первой зоне просмотра; и

ii. определения визуальной индикации протеазной активности, обеспеченной окрашенными частицами в зоне просмотра.

В некоторых вариантах осуществления окрашенные частицы могут быть заключены в чувствительные к протеазам полимеры в зоне реакции до воздействия раневой текучей среды. Таким образом, в изобретении также предоставлен способ мониторинга состояния раны, предусматривающий, состоящий по существу или состоящий из:

i. нанесения образца раневой текучей среды в зону нанесения образца изделия, содержащую, состоящую по существу или состоящую из:

a. зоны нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду;

b. зоны реакции, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, заключенных в (необязательно сшитые) чувствительные к протеазам полимеры; и

с. зоны просмотра, расположенной вниз по потоку зоны нанесения образца и зоны реакции;

при этом зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны просмотра (которая до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности не содержит окрашенные частицы), и при этом расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к переносу окрашенных частиц с раневой текучей средой в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в первой зоне просмотра; и

ii. определения визуальной индикации протеазной активности, обеспеченной окрашенными частицами в зоне просмотра.

Изделие, используемое в этих способах, может содержать один или более признаков, описанных выше. Эти признаки не повторяются здесь просто для краткости.

В конкретных вариантах осуществления способа окрашенные частицы, оцениваемые в зоне просмотра, обеспечивают количественное определение протеазной активности в раневой текучей среде. В некоторых вариантах осуществления изделие, задействованное в способах, содержит две зоны просмотра (как описано в другом месте данного документа), и исчезновение окрашенных частиц во второй зоне просмотра, расположенной выше (т.е. вертикально выровненной) с зоной, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц (в отсутствие раневой текучей среды и протеазной активности), сравнивают и/или количественно определяют с увеличением окрашенных частиц в зоне просмотра, расположенной вниз по потоку зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц, после воздействия раневой текучей среды и протеазной активности. В предпочтительных вариантах осуществления изменение цвета в каждой зоне просмотра видно невооруженным глазом. В качестве альтернативы или кроме того, при наблюдении невооруженным глазом изменение цвета можно обнаружить и/или определить количественно, используя спектрофотометр или другое такое оборудование, подходящее для этой цели, которое хорошо известно специалисту в данной области.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает нанесение дополнительной жидкости на изделие для облегчения протекания раневой текучей среды. Это можно назвать «выгонять текучую среду». Дополнительная жидкость может содержать, состоять по существу или состоять из буфера. Буфер можно подобрать в соответствии со свойствами раневой текучей среды и/или других материалов, используемых в способе. Например, «выгонять текучую среду» можно для того, чтобы проводить раневую текучую среду через поры тест-полоски. Использование дополнительной жидкости может улучшить перенос высвобожденных окрашенных частиц вдоль/через матрицу. Дополнительная жидкость может содержать, состоять по существу или состоять из поверхностно-активного вещества для предотвращения нежелательной адгезии окрашенных частиц к матрице.

В другом аспекте изобретения способы, описанные в данном документе, повторяют с интервалами, чтобы облегчить длительный мониторинг состояния раны путем повторного отбора проб и анализа раневой текучей среды. Указанные интервалы могут составлять каждые 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней, еженедельно или ежемесячно или их комбинацию. Накопление данных, относящихся к состоянию раны на протяжении времени, позволяет врачу-клиницисту лучше понимать динамику состояния раны и/или эффективность лечения (видов лечения). Например, длительный мониторинг раневой текучей среды, как описано, может указать врачу-клиницисту более быстрым и/или количественным образом, чем текущие процедуры, что состояние раны с течением временем ухудшается и, следовательно, настоящее лечение неэффективно. Вследствие этого врач-клиницист может быстрее выбрать альтернативные методы лечения, чтобы способствовать заживлению раны. В качестве альтернативы, данные могут указывать врачу-клиницисту, что необходимы дополнительные исследования раневой текучей среды и/или раневой среды.

В дополнительном варианте осуществления отсутствие чрезмерной протеазной активности указывает на то, что любое существующее лечение раны следует продолжить (т.е. не следует изменять).

В определенных вариантах осуществления согласно всем аспектам изобретения, рана представляет собой хроническую рану. Под «хронической раной» следует понимать рану, в которой нормальный процесс заживления раны нарушается в одной или нескольких точках в фазах заживления раны. Например, остановка раны в конкретной фазе заживления, такой как воспаление или пролиферация. Хроническую рану можно характеризовать наличием приподнятого, гиперпролиферативного, но невыступающего края раны, и/или местной раневой среды, богатой продуктами воспаления и провоспалительными цитокинами, содержащей, состоящей по существу или состоящей из несбалансированной ферментативной среды, состоящей из избыточного количества матриксных металлопротеиназ и пониженнного количества их ингибиторов, что приводит к разрушению внеклеточного матрикса. Обычные хронические раны включают диабетические язвы, язвы сосудистого происхождения и пролежни.

В определенных вариантах осуществления согласно всем аспектам изобретения, субъектом, от которого получают раневую текучую среду, является животное. В конкретных вариантах осуществления животным является человек.

В конкретных вариантах осуществления изделие, которое описано в данном документе, используют в способе, который описан в данном документе.

Варианты осуществления настоящего изобретения также можно определить следующими пунктами:

1. Изделие для мониторинга состояния раны, содержащее матрицу, которая абсорбирует раневую текучую среду, при этом матрица содержит:

a. сшитые и чувствительные к протеазам полимеры, образующие зону реакции на/в матрице

b. окрашенные частицы;

при этом расположение полимеров и окрашенных частиц такое, что расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к транспорту окрашенных частиц вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде.

2. Изделие по п. 1, в котором окрашенные частицы заключены в полимеры, и расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к высвобождению окрашенных частиц вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде.

3. Изделие по п. 2, в котором визуальная индикация содержит рассеянные окрашенные частицы.

4. Изделие по п. 2 или 3, в котором матрица содержит визуальный символ, который до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности маскируется окрашенными частицами, заключенными в полимеры, и в котором визуальная индикация протеазной активности в раневой текучей среде включает раскрытие визуального символа по мере расщепления полимеров и высвобождения окрашенных частиц.

5. Изделие по любому одному из пп. 2-4, в котором матрица содержит зону просмотра, которая до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности не содержит окрашенных частиц, и в котором расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к высвобождению окрашенных частиц вдоль/через матрицу, предоставляя визуальную индикацию протеазной активности в зоне просмотра.

6. Изделие по п. 5, в котором матрица, видимая в зоне просмотра, содержит молекулы захвата для захвата окрашенных частиц.

7. Изделие по п. 5, в котором матрица содержит барьер, выровненный с (расположенным вниз по потоку) концом зоны просмотра, так что окрашенные частицы накапливаются в зоне просмотра.

8. Изделие по любому одному из пп. 1-7, в котором окрашенные частицы включают полистирольные микрочастицы.

9. Изделие по любому одному из пп. 1-8, в котором сшитые и чувствительные к протеазам полимеры образуют барьер, который при отсутствии протеазной активности, необязательно выше порогового уровня, в раневой текучей среде предотвращает контакт раневой текучей среды с окрашенными частицами, в котором расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, необязательно выше порогового уровня, разрушает барьер и приводит к току окрашенных частиц вдоль/через матрицу, обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде.

10. Изделие по п. 9, в котором матрица содержит зону просмотра, которая до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности не содержит окрашенных частиц, и в котором расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, разрушает барьер и приводит к току окрашенных частиц вдоль/через матрицу, предоставляя визуальную индикацию протеазной активности в зоне просмотра.

11. Изделие по п. 10, в котором матрица, видимая в зоне просмотра, содержит молекулы захвата для захвата окрашенных частиц.

12. Изделие по пп. 10 или 11, в котором матрица содержит барьер, выровненный с (расположенным вниз по потоку) концом зоны просмотра, так что окрашенные частицы накапливаются в зоне просмотра.

13. Изделие по любому одному из пп. 9-12, в котором матрица содержит визуальный символ, который до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности маскируется окрашенными частицами, и в котором визуальная индикация протеазной активности в раневой текучей среде содержит раскрытие визуального символа по мере расщепления полимеров, разрушения барьера и тока окрашенных частиц вдоль/через матрицу.

14. Изделие по любому одному из пп. 1-13, в котором полимеры включают полимеры коллагена.

15. Изделие по любому одному из пп. 1-14, в котором полимеры включают полимеры желатина.

16. Изделие по любому одному из пп. 1-15, в котором полимеры включают полимеры эластина.

17. Изделие по любому одному из пп. 1-16, в котором сшивки включают метакрилат или его производные.

18. Изделие по любому одному из пп. 1-17, в котором сшивки являются производными глутаральдегида или его производных.

19. Изделие по любому одному из пп. 1-18, в котором протеаза представляет собой сериновую протеазу, цистеиновую протеазу, аспарагиновую протеазу, треониновую протеазу и/или глутаминовую протеазу.

20. Тестовая матрица, содержащая полимеры коллагена и/или желатина, полимеры, содержащие метакрилатные сшивки или сшивки, производные глутаральдегида.

21. Сшитые метакрилатом полимеры желатина для использования при измерении протеазной активности в раневой текучей среде.

22. Использование сшитых и чувствительных к протеазам полимеров в качестве субстрата для измерения протеазной активности в раневой текучей среде.

23. Использование по п. 22, в котором полимеры включают полимеры коллагена, желатина и/или эластина.

24. Использование по п. 22 или 23, в котором сшивки включают метакрилат и/или являются производными глутаральдегида.

25. Способ мониторинга состояния раны, предусматривающий:

a. нанесение образца раневой текучей среды на изделие, как определено в любой одной из статей 1-19

b. определение визуальной индикации протеазной активности, обеспеченной окрашенными частицами.

26. Способ по п. 25, в котором окрашенные частицы оценивают в области матрицы, чтобы обеспечить количественное определение протеазной активности в раневой текучей среде.

27. Способ по п. 26, в котором область содержит зону просмотра.

28. Способ по п. 26 или 27, в котором имеются зоны просмотра, и исчезновение окрашенных частиц в одной зоне сравнивают с увеличением количества окрашенных частиц во второй зоне.

29. Способ получения матрицы для измерения протеазной активности в раневой текучей среде, включающий:

a. Нанесение раствора, содержащего модифицированные метакрилатом полимеры на матрицу, способную абсорбировать раневую текучую среду

b. Облучение полимеров УФ-светом, тем самым сшивая полимеры.

30. Процесс по п. 29, в котором раствор этапа а) также содержит окрашенные частицы, а этап b) приводит к заключению окрашенных частиц в сшитые полимеры.

31. Процесс по п. 29 или 30, в котором раствор наносят при температуре, составляющей по меньшей мере 30°С.

32. Процесс по любому одному из пп. 29-31, в котором полимеры включают полимеры желатина, коллагена и/или эластина.

33. Процесс по любому одному из пп. 29-31, в котором матрица содержит визуальный символ, и на этапе а) раствор наносят так, чтобы он покрывал визуальный символ.

34. Набор для получения изделия, как определено в любой одной из статей 1-19, содержащий:

a. сшитые и чувствительные к протеазам полимеры

b. окрашенные частицы.

35. Набор по п. 32, дополнительно содержащий матрицу.

36. Набор по п. 33, дополнительно содержащий корпус, чтобы содержать матрицу.

37. Набор по п. 34, в котором корпус содержит одно или более, необязательно два, смотровых окна для осмотра окрашенных частиц.

38. Изделие для мониторинга состояния раны, содержащее:

a. зону нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду

b. зону реакции, находящуюся вниз по потоку зоны нанесения образца, содержащую чувствительные к протеазам полимеры;

c. зону, содержащую окрашенные частицы, находящуюся вниз по потоку зоны нанесения образца;

d. зону просмотра, находящуюся вниз по потоку зоны нанесения образца, зоны реакции и зоны, содержащей окрашенные частицы;

при этом зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны просмотра, и при этом расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к переносу окрашенных частиц с раневой текучей средой в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в первой зоне просмотра.

39. Изделие по п. 38, в котором окрашенные частицы содержатся в зоне реакции.

40. Изделие по п. 38 или 39, в котором окрашенные частицы заключены в полимеры, и расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к высвобождению окрашенных частиц в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде через зону просмотра.

41. Изделие по п. 38, в котором зона, содержащая окрашенные частицы, находится вниз по потоку зоны реакции.

42. Изделие по любому одному из пп. 38-41, в котором зона реакции образует барьер, который предотвращает попадание раневой текучей среды в зону просмотра, и в котором расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, необязательно выше порогового уровня, разрушает барьер и приводит к переносу окрашенных частиц в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде через зону просмотра.

43. Изделие по любому одному из пп. 38-42, при этом изделие включает визуальный символ, который до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности маскируется окрашенными частицами, и в котором визуальная индикация протеазной активности в раневой текучей среде содержит раскрытие визуального символа.

44. Изделие по п. 43, которое определяет вторую зону просмотра, расположенную выше зоны, содержащей окрашенные частицы, до воздействия раневой текучей среды и при отсутствии протеазной активности.

45. Изделие по любому одному из пп. 38-44, в котором зона просмотра содержит молекулы захвата для захвата окрашенных частиц в зоне просмотра.

46. Изделие по любому одному из пп. 38-45, содержащее барьер на находящемся вниз по потоку конце зоны просмотра, так что окрашенные частицы накапливаются в первой зоне просмотра.

47. Изделие по любому одному из пп. 38-46, в котором полимеры включают полимеры коллагена.

48. Изделие по любому одному из пп. 38-47, в котором полимеры включают полимеры желатина.

49. Изделие по любому одному из пп. 38-48, в котором полимеры включают полимеры эластина.

50. Изделие по любому одному из пп. 38-49, в котором зона нанесения образца и зона реакции по меньшей мере частично перекрывают друг друга.

51. Способ мониторинга состояния раны, предусматривающий:

a. нанесение образца раневой текучей среды в зону нанесения образца изделия, как определено в любой одной из статей 38-50

b. определения визуальной индикации протеазной активности, обеспеченной окрашенными частицами в зоне просмотра.

52. Способ по п. 51, в котором оцениваемые окрашенные частицы в зоне просмотра обеспечивают количественное определение протеазной активности в раневой текучей среде.

53. Способ по п. 51 или 52, в котором изделие дополнительно содержит вторую зону просмотра, и исчезновение окрашенных частиц во второй зоне сравнивают с увеличением количества окрашенных частиц в первой зоне.

Краткое описание фигур

На фигуре 1А схематично проиллюстрирован один вариант осуществления изобретения, при этом изделие, которое описано в данном документе, помещают в контакт с раной под повязкой на рану.

На фигуре 1В схематично проиллюстрировано воспроизведение визуальной индикации изделием, как описано в данном документе, после абсорбции раневой текучей среды, и расщепление сшитых чувствительных к протеазам полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде.

На фигуре 2 схематично проиллюстрирован вариант осуществления изделия, которое описано в данном документе, на основании латерального потока.

На фигуре 3 схематично проиллюстрирован дополнительный вариант осуществления изделия, которое описано в данном документе, на основании латерального потока.

На фигуре 4 показан ЯМР-спектр немодифицированного желатина до модифицирования метакрилатом.

На фигуре 5 показан ЯМР-спектр полностью модифицированного метакрилатом желатина (GELMA).

На фигуре 6 показан вид сверху (А) и развернутый вид сбоку (В) иллюстративного изделия в соответствии с изобретением, предпочтительно для использования in situ в ране.

На фигуре 7 продемонстрировано изделие, которое описано в данном документе, при использовании (время = 0 часов).

На фигуре 8 показаны результаты использования изделия, показанного на фигуре 7, в присутствии и отсутствии папаина после 24, 48 и 72 ч.

На фигуре 9 продемонстрировано дополнительное изделие, которое описано в данном документе, при использовании (время = 0 часов).

На фигуре 10 показаны результаты использования изделия, показанного на фигуре 9, в присутствии и отсутствии матриксной металлопротеиназы 9 (ММР9) и человеческой нейтрофильной эластазы (HNE) после 24 и 48 ч.

На фигуре 11 показаны результаты использования изделия, показанного на фигуре 9, в присутствии и отсутствии матриксной металлопротеиназы 9 (ММР9) и человеческой нейтрофильной эластазы (HNE) после 120 и 144 ч.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Далее изобретение будет описано без ограничений, но исключительно для облегчения понимания изобретения со ссылкой на фигуры.

Изделие (1), которое описано в данном документе, схематично показано на фигуре 1А. Изделие (1) содержит, состоит по существу или состоит из матрицы (2), предпочтительно биологически инертной для использования in situ, которая может абсорбировать раневую текучую среду и окрашенные частицы, заключенные в сшитые и чувствительные к протеазам полимеры (3), в данном случае окрашенные полистирольные микросферы (PSM), заключенные в сшитый желатин, на матрице или в ней (2). Окрашенные частицы, заключенные в сшитый желатин (3), можно высушить в виде или конъюгировать с матрицей (2), и в случае подходящим образом окрашенных PSM сделать всю или существенную часть матрицы черного цвета, образуя тестовую единицу или зону реакции. Окрашенные частицы, заключенные в сшитый желатин (3), используют для измерения активности протеаз (желатиназ) в текучей среде, выделяемой раной. Сшитый желатин (3) разлагается желатиназами, присутствующими (необязательно в пороговой концентрации или выше нее) в раневой текучей среде.

Когда изделие (1) помещают в контакт с раной (4), которая может представлять собой хроническую рану, у субъекта (5) под повязкой на рану (6) матрица (2) абсорбирует раневую текучую среду. Если раневая текучая среда содержит достаточную активность желатиназ, сшитый желатин (3) на матрице или в ней (2) разлагается на фрагменты, в частности если активность желатиназ присутствует на пороговом уровне или выше него. После деградации PSM больше не заключены и свободно распределяются через/вдоль матрицы. В этом случае, как показано на фигуре 1 В, распределение PSM через/вдоль матрицу устраняет черное окрашивание, придаваемое зоне реакции матрицы PSM до воздействия раневой текучей среды, и выявляет визуальный символ, напечатанный на изделии, такой как крест (7). Раскрытие визуального символа указывает на наличие аберрантной протеазной активности в ране.

При том, что крест (7) предоставляет положительный результат теста и, следовательно, является преимуществом, оно не является существенным. Вместо этого рассеивание окрашивания можно использовать в качестве результата теста без выявления дополнительного символа.

На фигуре 2 схематично проиллюстрирован вариант осуществления изделия, основанный на принципе растекания жидкости в радиальном направлении, как описано в данном документе. Показана зона нанесения образца (21), на которую наносят раневую текучую среду (представленную прямыми серыми стрелками (22)). В этом конкретном случае зона нанесения образца представляет собой гибкий фитиль, который действует как тампон для сбора раневой текучей среды (22). Этот фитиль (21) находится в жидкостном соединении с твердой подложкой (23), которая в этом случае представляет собой пористую тест-полоску, в которой текучие среды текут под действием капиллярного эффекта (аналогичному таковому при латеральном проточном иммуноанализе). Сшитый метакрилатом желатин (GELMA), в котором заключены окрашенные PSM, образуют зону реакции (24) на твердой подложке. Раневая текучая среда переносится в зону реакции (24) посредством капиллярного действия. Протеазная активность, присутствующая в раневой текучей среде, расщепляет GELMA и высвобождает PSM. Напряжение сдвига текучей среды захватывает высвобожденные PSM, и они переносятся вниз по потоку с текучей средой в зону просмотра (25), тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде.

В альтернативных вариантах осуществления желатин можно сшить, используя вместо метакрилата глутаральдегид или его производное. До воздействия раневой текучей среды желатин, окрашенные PSM и глутаральдегид можно смешать вместе и добавить в виде смеси для образования зоны реакции (24) на твердой подложке. Еще до воздействия раневой текучей среды смесь можно высушить, чтобы способствовать образованию сшивок и фиксировать сшитый глутаральдегидом желатин, в котором таким образом заключены окрашенные PSM, к твердой подложке (23), тем самым образуя зону реакции (24).

В дополнительных вариантах осуществления изделие, содержащее по меньшей мере твердую подложку (23), и необязательно фитиль (21), можно разместить в оболочке со смотровым окном, расположенным вниз по потоку (в направлении перемещения текучей среды) от зоны реакции (24). В таких вариантах осуществления смотровое окно определяет зону просмотра (25). Таким образом, PSM, высвободившиеся после расщепления GELMA или сшитого глутаральдегидом желатина вследствие протеазной активности в раневой текучей среде, можно наблюдать в смотровом окне. Необязательно, второе смотровое окно можно разместить выше зоны реакции (24). Таким образом, через это дополнительное смотровое окно можно наблюдать исчезновение цвета, если PSM высвобождаются вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде.

В дополнительных вариантах осуществления зона просмотра (25) может содержать, состоять по существу или состоять из молекул захвата, способных специфически связываться с PSM. Таким образом, высвобожденные PSM фиксируют в положении и концентрируют, чтобы способствовать наблюдению и потенциально количественному определению. Молекулы захвата могут содержать, состоять по существу или состоять из антител, которые специфически распознают антигены, связанные на поверхности PSM, или они могут содержать, состоять по существу или состоять из некоторых других видов молекул, с которыми PSM могут связываться, включая заряженные молекулы, чтобы вызвать ионообменные взаимодействия.

В дополнительных вариантах осуществления устройство можно соединить с источником подобранного буферного раствора, такого как забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,2 (с поверхностно-активным веществом для предотвращения нежелательной адгезии PSM к тест-полоске), чтобы действовать в качестве «выгоняющей текучей среды» с целью нести раневую текучую среду через поры тест-полоски и максимально повысить экстракцию PSM из матрицы (когда начался протеолиз) и эффективно транспортировать их в зону просмотра (24).

На фигуре 3 схематично проиллюстрирован дополнительный основанный на принципе растекания жидкости в радиальном направлении вариант осуществления изделия, которое описано в данном документе.

Изделие содержит, состоит по существу или состоит из твердой подложки, (30) содержащей, состоящей по существу или состоящей из зоны нанесения образца, содержащей, состоящей по существу или состоящей из абсорбирующего материала (31), барьера (зоны реакции), образованного из чувствительных к протеазам молекул полимеров, в данном случае желатина (32), зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц (34), в данном случае молекул красителя Monastral blue (MBDM), и зоны просмотра (35). Изделие необязательно также содержит гравировку (33), чтобы направлять и концентрировать любую текучую среду вдоль/через матрицу.

В ходе работы образец раневой текучей среды добавляют в зону нанесения образца (31) и перемещают посредством капиллярного действия в направлении, обозначенном большой стрелкой (показанном на фигуре 3 параллельно схеме изделия), пока он не достигнет барьера (32) из желатина. В отсутствие протеазной активности в раневой текучей среде желатиновая бляшка остается интактной и предотвращает прохождение раневой текучей среды за ее пределы. Таким образом, MBDM остаются высушенными до матрицы и не переносятся по направлению к зоне просмотра и в нее. Следовательно, визуальная индикация протеазной активности в зоне просмотра не предоставляется. Однако в присутствии протеазной (желатиназной) активности в раневой текучей среде желатиновая бляшка расщепляется, и теперь раневая текучая среда может перемещаться посредством капиллярного действия по направлению к зоне просмотра и в нее. При этом раневая текучая среда несет с собой MBDM в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде.

В дополнительных вариантах осуществления твердую подложку (30) можно разместить в оболочке со смотровым окном, расположенным вниз по потоку (в направлении перемещения текучей среды) от зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц (34), и которая включает и может определять зону просмотра (35). Таким образом, окрашенные частицы (напр., MBDM), высвобождаемые после расщепления и разрушения барьера из желатина вследствие протеазной активности в раневой текучей среде, можно наблюдать в смотровом окне. Необязательно, второе смотровое окно можно разместить выше зоны, содержащей, состоящей по существу или состоящей из окрашенных частиц (34). Таким образом, через это дополнительное смотровое окно можно наблюдать исчезновение цвета, если MBDM высвобождаются вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Пример 1: Получение GELMA из желатина и метакрилата

Желатин модифицировали путем эндкеппинга метакриловым ангидридом с получением терминированного метакриламидом желатина, называемого в данном документе «GELMA» (общая схема показана ниже).

В литературе имеется много ссылок, в которых используются различные методы и условия для производства этого материала, но для этой цели был принят способ, используемый Вае Ноon Lee et al. (RSC adv., 2015, 5, 106094), заключающийся в следующем.

Использовали желатин типа А, полученный посредством обработкой кислотой при рН 1-2 (изоэлектрическая точка рН 7-9). Чтобы получить эффективное замещение (эндкеппинг), потребовался большой избыток метакрилового ангидрида. Поскольку побочным изделием реакции является метакриловая кислота, рН реакции постепенно снижался до диапазона ниже изоэлектрической точки, что привело к уменьшению эндкеппинга. Чтобы обойти это, Bae Hoon Lee et al. использовали карбонатный буфер для поддержания реакционной смеси между рН 7 и 9 и альтернатного добавления метакрилового ангидрида и гидроксида натрия для контроля рН. Этот метод сделал возможным эффективный эндкеппинг с наименьшим количеством побочных реакций (терминирование гидроксильных групп метакриловым эфиром). Он также снизил количество используемых реагентов и свел к минимуму количество неорганических солей, подлежащих удалению на стадии очистки. Продукт реакции очищали фильтрацией в тангенциальном потоке (TFF), хотя также можно использовать простой диализ.

Подробное описание способа

Желатин типа А [175 bloom] (10 г) и 100 мл карбонатного буфера 0,1 М (100 мл) [3,18 г NaCO₃, 5,86 г NaHCO₃] смешивали в круглодонной колбе, снабженной верхнеприводной мешалкой, датчиком температуры и рН-метром. Смесь нагревали до 60°С до растворения твердого вещества. Температуру реакции затем снижали до 50°С, а рН проверяли и доводили до 9,0.

К этому раствору по каплям добавляли метакр иловую кислоту (167 мкл), в результате чего рН снижался до ~8,5, и реакционную смесь перемешивали в течение 25 минут. После этого рН вновь доводили до рН 9,0 с помощью 20% раствора NaOH и перемешивали в течение еще 5 минут.

Дальнейшие засыпки метакриловой кислоты и корректировку рН повторяли еще 5 раз, пока не добавили всего 1 мл метакриловой кислоты в течение всего 3-часового времени реакции.

В итоге рН доводили до 7,4 с помощью 50% уксусной кислоты. Полученную смесь фильтровали через фильтрующую PTFE-мембрану 0,2 микрон в емкость для фильтрации с тангенциальным потоком. Затем смесь очищали посредством диафильтрации против воды (воды для орошения), используя TFF-мембрану Midi-Kros MPEs 3 кДа с трансмембранным давлением ~15. Для получения проводимости пермеата <10 мкСм диафильтрации подвергали всего 6 л. Полученный бледно-желтый раствор переносили во флорентийскую колбу и лиофилизировали в течение 2 дней. Это позволило получить белый 8,7 г полистиролоподобного материала, готового для использования при приготовлении изделия, которое описано в данном документе.

Степень замещения метакрилата в изделии определяли методом протонного ЯМР. Результаты показаны на фигурах 4 и 5. Следует отметить потерю или истончение пиков на фигуре 4 (напр., пик лизина метилена при ~3 м.д.) и появление новых пиков на фигуре 5 (напр., при 4,8, 5,7 и 5,9 м.д.), указывающих на включение метакрилатных групп в продукт GELMA. Эти результаты подтверждают, что реакция прошла хорошо с потерей пика при ~2,95-3,1 м.д.

Элементный Анализ (CHN и Na)

Эти данные показывают, что натрий еще присутствует, но проблем это не вызвало.

Обсуждение

Этот метод использовали дважды в пилотной шкале 2 г. Один изделие реакции очищали посредством диализа (отсечка 12-14 кДа), другой посредством TFF (отсечка 3 кДа). Оба материала действуют одинаково хорошо для получения изделия, которое описано в данном документе. Благодаря легкости и эффективности TFF-очистки решили использовать этот метод для очистки более крупной партии 10 г. Метод был воспроизводимым, простым и эффективным.

Заключение

Метод, используемый для получения желатин-метакрилата (GELMA), подходит для этой цели. При необходимости специалист может дополнительно оптимизировать составы с помощью известных способов и подходов, таких как постоянный контроль рН с автоматическим добавлением основания. Масштабирование для коммерческого применения можно легко достигнуть известными способами и процедурами.

Пример 2: Производство изделия в соответствии с настоящим изобретением

Процесс производства включает все или некоторые из следующих операций, детали которых можно оптимизировать в соответствии с потребностями потребителя и ограничениями производственного предприятия.

Конкретный неограничивающий формат, который, как было установлено, является полезным в качестве практичного и легко изготавливаемого изделия, заключается в следующем:

- Диск из абсорбирующего медицинского материала, изготовленного из медицинской пены с измеренными глубиной 2,5 мм и диаметром 15 мм.

- Символ «+» напечатан перманентными чернилами на верхней стороне диска в центральном положении. Напечатанный «+» имеет ширину 4 мм.

- «+» покрыт (поэтому скрыт от глаз) окрашенным реагентом, содержащим, состоящим по существу или состоящим из сшитого модифицированного метакрилатом желатина (GELMA)

- Изделие имеет эластичный, тонкий, прозрачный покрывающий материал, прилипший к верхней поверхности. Предпочтительным покрытием является полиуретан медицинского качества.

- Отдельные диски 15 мм упаковывают в виде единого блока и стерилизуют.

Схематически такое изделие показано на фигуре 6. На фигуре 6А показан вид сверху изделия. Диск, помеченный перманентным крестиком, покрыт и закрыт нанесением окрашенного реагента, содержащего, состоящего по существу или состоящего из сшитого модифицированного метакрилатом желатина (GELMA). На фигуре 6В показан развернутый вид сбоку изделия, содержащего, состоящего по существу или состоящего из полиуретановой пленки (61), окрашенного реагента, содержащего, состоящего по существу или состоящего из сшитого модифицированного метакрилатом желатина (GELMA) (62) и абсорбирующей матрицы (63).

Пример 3: Производство - Влажное осаждение реагента GELMA и сборка

Исходные материалы, необходимые для изделия:

- Рулонная заготовка абсорбирующего материала

- Рулонная заготовка полиуретана (с уже нанесенным адгезивом)

- Модифицированный желатин (GELMA)

- Окрашенные полистирольные микрочастицы

- Перманентные чернила

- Влагонепроницаемая упаковка (вероятно, ламинированная пленка) Производственный процесс составляют следующие шаги:

Этап 4:

Окрашенный реагент необходимо хранить при повышенной температуре во время хранения и осаждения. Это необходимо для предотвращения затвердевания реагента.

Подлежащий осаждению объем очень мал (5 микролитров на диск). Вязкость подогретого модифицированного желатина невысокая, хотя она выше, чем у воды. Если необходимо, вязкость можно улучшить путем добавления загустителя (например, карбоксиметилцеллюлозы или просто большего количества немодифицированного желатина).

Окрашенный реагент не должен впитываться в абсорбирующий материал, иначе матрица индикатора не будет равномерно сшитой, а глубина матрицы, которую он образует, будет нарушена. Это влияет на выбор абсорбирующего материала и/или свойства предварительно сшитого реагента GELMA.

Осаждение окрашенного реагента необходимо выровнять с напечатанным символом «+». При представлении окрашенный реагент может быть круглым, если он покрывает (закрывает) весь предварительно напечатанный символ «+». Вследствие этого важна регистрация.

Этап 5:

УФ-лампа используется для фиксации окрашенного реагента на месте. Время экспозиции составляет 15-30 секунд, в зависимости от выходной мощности лампы. До настоящего времени были признаны эффективными лампы, которые излучали ~300 нм и УФ-лампы ~380 нм при уровнях энергии в диапазоне 1-100 мВт/см².

Этап 6:

Перед упаковыванием фиксированный окрашенный реагент сушат. Для сушки окрашенной матриксной протеазы можно использовать туннель с горячим воздухом. Можно рассмотреть другие варианты.

Возникающие проблемы, которые преодолевают с помощью иллюстративного изделия для использования in situ

Возникающие проблемы:

1) Модифицирование свойств высушенного желатина, чтобы сделать его более подходящим для испытаний, в которых матрицу подвергают воздействию раневой текучей среды в течение продолжительных периодов. Желатин (денатурированный коллаген) в своем нормальном состоянии (в виде приобретенного или полученного из коллагена) можно высушить с образованием подходящих матричных структур, но он постепенно растворяется под действием водных текучих сред, содержащих растворенные белки, таких как раневые текучие среды при обычных температурах в ране, даже в отсутствие протеазы. С другой стороны, чрезмерно модифицированный желатин может стать слишком устойчивым к расщеплению протеазой. Хотя немодифицированный желатин может работать при определенных условиях, сшитая версия является более надежной и способной работать в течение более длительных периодов времени.

2) При изготовлении осажденный раствор желатина должен быть очень быстро зафиксирован на месте, чтобы он плотно прилипал к материалу-носителю, в противном случае он будет смазан или смещен. В качестве альтернативы следует использовать очень медленную, неэкономичную обработку.

3) Модифицированный красителем желатин может не образовывать достаточно интенсивного цвета при осаждении на подходящую поверхность носителя на глубине достаточно тонкой, чтобы сделать возможным разрушение клинически значимыми уровнями протеазы.

4) Простота работы, требуемая для этого применения, не допускает сложных процессов, таких как иммуноанализы или другие процедуры, которые требуют более одного рабочего этапа.

5) Поскольку устройство должно находиться в физическом контакте с раной, невозможно использовать реактивные ингредиенты, которые не были одобрены для использования в ранах или не имеют информации о применении в ранах.

6) Некоторые аспекты работы, планируемой для устройства, требуют, чтобы его можно было оставлять in situ на поверхности раны, под повязкой в течение по меньшей мере одного дня и, возможно, на несколько дней.

Изделие может быть в форме очень тонкой структуры с малой способностью собирать текучую среду или без нее. Оно может быть представлено в качестве тестовой единицы in situ, встроенной в нетканый носитель, который просто «смачивается» раневой текучей средой. Таким способом он может находиться на раневой поверхности, где он может функционировать просто как недорогой, чрезвычайно простой в использовании индикатор протеазной активности, под повязкой, если это требуется в течение продолжительного времени. В наиболее простом варианте его можно использовать даже без носителя, представленного только в виде окрашенного сшитого фрагмента желатиновой пленки, хотя с ним будет сложнее обращаться и наблюдать. В качестве альтернативы, индикаторная матрица может быть частью составного блока с размерами 15 мм × 2,5 мм, в котором имеется прозрачная покрышка, нетканый несущий слой и пенный слой для сбора образца.

Пример 4: Демонстрация изделия в соответствии с настоящим изобретением при использовании сшитого желатина на основе метакрилата

Используемые материалы

GELMA: модифицированный желатин с метакриловым ангидридом. (Метакриловый ангидрид получен от Sigma-Aldrich (номер изделия 276685). Желатин получен от Sigma Aldrich, Porcine Type A, 300 bloom (номер изделия G2500))

Фотоинициатор «Daracure», 2-гидрокси-4'-(2гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенон получен от Sigma Aldrich (номер изделия 410896)

Полистирольные окрашенные Blur микросферы Polybead® (диаметр 0,5 микрон, 2,5% твердых веществ) получены от Polysciences, Inc. (номер изделия 15709)

Полиуретановая пленка получена от Coveris Advanced Coatings (Wrexham, UK), (Inspire 2331)

Полиуретановая пена, полученная из пены Freudenberg, ранее Polymer Health Technologies; (Ebbw Vale, UK), (бесплатный образец)

Способ

0,5% раствор м/о фотоинициатора (PI) готовили путем добавления 2,5 мг порошка Daracure к 500 мкл 1х концентрации забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Смесь нагревали до 60°С с периодическим вихревым перемешиванием, пока все твердые вещества не растворились. После того, как фотоинициатор полностью растворился, к раствору добавляли 50 мг порошка GELMA, который осторожно перемешали, чтобы позволить GELMA раствориться. Во время этого процесса растворения температуру раствора GelMA/PI/PBS снижали до 40°С с периодическим вихревым перемешиванием. Температуру раствора поддерживали при 40°С, чтобы предотвратить затвердевание GELMA в гель. В конце добавляли синие полистирольные микросферы в соотношении 9 частей GELMA/PI/PBS к 1 части исходного раствора микрочастиц. Раствор тщательно перемешивали для обеспечения гомогенного раствора. Итоговые концентрации в смеси составляли: 0,45% фотоинициатора, 8,1% GELMA и 0,25% микрочастиц.

Отбирали 5 мкл аликвот смеси GELMA/микросфер/фотоинициатора и осаждали центрально на адгезивную поверхность 30 мкм прозрачной полиуретановой пленки (покрытия Coveris advanced, Inspire 2331) из расчета одно пятно 5 мкл на квадрат 10×10 мм пленки. Каждую каплю осторожно перемешивали, чтобы диспергировать каплю синей смеси в синий круг диаметром 4-5 мм. Квадраты полиуретановой (PU) пленки затем помещали под лампу UV широкого спектра (Dr. Honle, Germany; мощность с. 100 мВт/см²) на 15 секунд, чтобы инициировать сшивание и полимеризацию GELMA. Наконец, полимеризованные пятна на квадратах из PU сушили на воздухе при температуре окружающей среды в течение 3 часов.

После того, как пятна высохли, каждый квадрат PU (со своим собственным единственным синим индикаторным пятном) прикрепляли посредством воздействия клея на кусочек PU пены аналогичного размера (толщиной 5 мм), чтобы создать набор составных квадратов. Таким образом, каждый квадрат состоял из слоя PU пены, покрытого фрагментом тонкой прозрачной PU пленки, удерживаемого на месте слоем адгезива, с сухим синим пятном сшитого GELMA, удерживаемого между двумя слоями. Синее пятно GELMA располагалось так, чтобы его верхняя поверхность находилась в контакте с адгезивом, а его нижняя поверхность была в прямом контакте с PU. Используя перманентный маркер, на самой верхней поверхности каждого составного квадрата (на верхней поверхности слоя прозрачной PU пленки) рисовали синий крест 4 мм (по высоте и ширине) так, чтобы крест располагался над синим пятном GELMA, так чтобы никакая часть нарисованного креста не вышла за пределы внешнего края синего индикатора. При таком расположении синий крест был визуально скрыт ярко-синим пятном под ним. Когда это было завершено, квадраты были готовы для использования в качестве индикаторов протеазной активности.

Для тестирования чувствительности собранных индикаторов приготовили три тестовых раствора, каждый на основе стандартного буфера активации папаина со следующей композицией: - 4,22 мМ 1-цистеина HCL, 3,6 мМ EDTA, 0,2 М NaCl в деионизированной воде, рН 7. Тестовый раствор 1 содержал 0,1 мг/мл папаина (приблизительно 1000 единиц/г), тестовый раствор 2 содержал 0,001 мг/мл папаина, и тестовый раствор 3 содержал 0 мг/мл папаина. Два из подготовленных индикаторных квадратов помещали в чашку Петри, содержащую раствор 1, так чтобы абсорбирующая PU пена насыщалась раствором. В этой ситуации раствор оказывался в непосредственном контакте с синим пятном. Два квадрата аналогичным образом помещали в раствор 2, и еще два квадрата помещали в раствор 3. Квадраты фотографировали до того приведения их в контакт с тестируемыми растворами (т.е. в сухом состоянии), и вновь при первоначальном увлажнении тестовыми растворами, и еще раз по истечении 24, 48 и 72 часов при 37°С после первого контакта с тестируемыми растворами.

Результаты

Состояние синих пятен GELMA в предварительно определенные моменты времени эксперимента показано на фигурах 7 и 8. В сухом состоянии и при первом смачивании (т.е. время = 0 ч) любым из тестируемых растворов можно видеть, что синие пятна GELMA полностью интактны (Фигура 7). В этом состоянии синий крест не проявлялся ни на одном из квадратов. В каждый из последующих моментов времени наблюдали почти полное расщепление GELMA в присутствии обеих концентраций папаина (Фигура 8). Это видно по изменению представления, когда синее пятно менялось на синий цвет креста. Это связано с тем, что желатиновый компонент GELMA расщепляется активным ферментом протеазой, который, в свою очередь, высвобождает заключенные и иммобилизованные микросферы. Затем окрашенные микросферы рассеиваются, равномерно распределяясь по всей пене, обнаруживая несмываемый крест в верхней части PU. Напротив, синие пятна GELMA, подвергшиеся воздействию раствора с нулевым содержанием папаина (отрицательный контроль), оставались интактными на протяжении всего времени, без видимых признаков потери структурной целостности (Фигуры 7 и 8). На этих квадратах оставалось круглое пятно синего цвета, а синий крест, помеченный поверх PU пленки, не проявлялся.

Заключение

Из этих результатов очевидно, что сшитый GELMA, смешанный с синими полистирольными микросферами, остается интактным при воздействии водных растворов, в которых отсутствует протеазная активность. Когда протеазную активность вводят в раствор образца, GELMA легко расщепляется папаином (в качестве типичной протеазы), освобождая синие микросферы, позволяя им диспергироваться по всему подлежащему слою пены. Это изменение состояния указывает на протеазную активность, и его можно наблюдать либо в виде простой дисперсии цвета, либо в виде проявления нанесенного стойкой краской креста (или другого символа).

Этот результат также наблюдали с нейтрофильной эластазой и матриксной металлопротеазой 9, обе из которых, как ожидается, присутствуют в инфицированных или воспалительных раневых текучих средах, как показано в примере 5.

Пример 5: Демонстрация изделия в соответствии с настоящим изобретением при использовании сшитого желатина на основе метакрилата

Используемые материалы

GELMA: модифицированный желатин с метакриловым ангидридом. (Метакриловый ангидрид получен от Sigma-Aldrich (номер изделия 276685). Желатин получен от Sigma Aldrich, Porcine Type A, 300 bloom (номер изделия G2500))

Фотоинициатор «Daracure», 2-гидрокси-4'-(2гидроксиэтокси)-2-метилпропиофенон получен от Sigma Aldrich (номер изделия 410896)

Полистирольные окрашенные Blur микросферы Polybead® (диаметр 0,5 микрон, 2,5% твердых веществ) получен от Polysciences, Inc. (номер изделия 15709)

Нетканое полотно Orion (4 унций веса на квадратный ярд), полученное от Anowo Ltd.

Способ

0,5% раствор м/о фотоинициатора (PI) готовили путем добавления 2,5 мг порошка Daracure к 500 мкл 1х концентрации забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Смесь нагревали до 60°С с периодическим вихревым перемешиванием, пока все твердые вещества не растворились. После того, как фотоинициатор полностью растворился, к раствору добавляли 50 мг порошка GELMA, который осторожно перемешали, чтобы позволить GELMA раствориться. Во время этого процесса растворения температуру раствора GelMA/PI/PBS снижали до 40°С с периодическим вихревым перемешиванием. Температуру раствора поддерживали при 40°С, чтобы предотвратить затвердевание GELMA в гель. В конце добавляли синие полистирольные микросферы в соотношении 9 частей GELMA/PI/PBS к 1 части исходного раствора микрочастиц. Раствор тщательно перемешивали для обеспечения гомогенного раствора. Итоговые концентрации в смеси составляли: 0,45% фотоинициатора, 8,1% GELMA и 0,25% микрочастиц.

Отбирали 1 мкл аликвот смеси GELMA/микросфер/фотоинициатора и осаждали центрально на квадраты 5×5 мм из нетканого полотна Orion. Делали серию повторных осаждений. Капле позволяли диффундировать в прокладку Orion, перед помещением под лампу UV широкого спектра (Dr. Honle, Germany; мощность с. 100 мВт/см²) на 15 секунд, чтобы инициировать сшивание и полимеризацию GELMA. Наконец, полимеризованные пятна на квадратах из Orion сушили на воздухе при температуре окружающей среды в течение 3 часов.

Для тестирования чувствительности собранных индикаторов получили серию тестовых растворов. Ферменты матриксную металлопротеиназу 9 (ММР9) и человеческую нейтрофильную эластазу (HNE) разбавляли в активационном буфере со следующей композицией: - 50 мМ Трис-буфера, 10 мМ дигидрата хлорида кальция, 100 мМ хлорида натрия, 50 мкМ хлорида цинка, 0,025% м/м Brij 35, 0,05% азида натрия в деионизированной воде. Каждый фермент разбавляли в активационном буфере с получением следующих концентраций фермента: 0, 0,15, 0,31, 0,62, 1,25, 2,5, 5 и 10 мкг/мл. Два из полученных индикаторных квадратов для каждого разведения фермента помещали в чашку Петри, предоставляя серию квадратов материала в формате 8×2. К каждой паре добавляли 25 мкл соответствующего разведения фермента на квадрат. Квадраты фотографировали перед тем, как их помещали в контакт с тестируемыми растворами (т.е. в сухом состоянии) и вновь, когда их первоначально увлажняли тестовыми растворами, и еще раз, когда после первого контакта с тестовыми растворами прошло 24, 48, 120 и 144 часа, при 37°С.

Результаты

Результаты эксперимента показаны на фигурах 9-11. В сухом состоянии и при первом смачивании (т.е. время = 0 ч) любым из тестируемых растворов можно видеть, что синие пятна GELMA полностью интактны (Фигура 9). В каждый из последующих моментов времени в присутствии ММР9 и HNE наблюдалось расщепление GELMA (Фигуры 10 и 11). На это указывает рассеивание (и ослабление) цвета нетканого полотна Orion. Это происходит потому, что желатиновый компонент GELMA расщепляется активным ферментами протеазами, что в свою очередь высвобождает захваченные и иммобилизованные микросферы. Затем окрашенные микросферы рассеиваются, равномерно распределяясь по нетканому полотну Orion. Напротив, синие пятна GELMA, подвергавшиеся воздействию раствора, который не содержал ММР9 или HNE (0 мкг/мл; отрицательный контроль), оставались интактными в течение всего периода времени без видимых признаков потери структурной целостности (Фигуры 9-11). Таким образом, результаты демонстрируют видимое ослабление/потерю цвета, когда GELMA подвергается действию протеазной активности ММР9 и HNE. Через 24 часа более высокая концентрация обоих ферментов расщепила GELMA, и цветное пятно (присутствующее в момент времени = 0 ч) с окрашенными микросферами, рассеявшимися по всему нетканому полотну Orion, исчезло. По мере увеличения времени инкубации более низкие концентрации активного фермента могли расщеплять GELMA и высвобождать окрашенные микросферы, что приводило к ослаблению/потере цвета (Фигуры 10 и 11). Эта динамика ясно демонстрирует, что GELMA расщепляется ферментами как ММР9, так и HNE. Контрольные пятна с нулевым содержанием ферментом оставались интактными на протяжении всего теста, подтверждая, что сшитый GELMA не диффундирует и не растворяется при 37°С в течение длительного периода инкубации (144 часа).

Заключение

Из этих результатов очевидно, что сшитый GELMA, смешанный с синими полистирольными микросферами, остается интактным при воздействии водных растворов, в которых отсутствует протеазная активность. При наличии протеазной активности GELMA легко разрушается ММР9 и HNE (представителями биологически значимых ферментов в ране), таким образом высвобождая синие микросферы, позволяя им рассеиваться по всему подлежащему абсорбирующему слою. Это изменение в состоянии указывает на протеазную активность, и ее можно наблюдать либо в виде простого рассеивания цвета, либо, в некоторых вариантах осуществления, посредством последующего проявления символа (например, креста), нанесенного или лежащего ниже исходного цветного пятна.

Настоящее изобретение не должно ограничиваться в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в данном документе. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к описанным в данном документе будут очевидными для специалистов в данной области техники из предшествующего описания и сопровождающих фигур. Предполагается, что такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, все аспекты и варианты осуществления изобретения, описанные в данном документе, считаются широко применимыми и их можно комбинировать с любыми и всеми другими последующими вариантами осуществления, включая те, которые взяты из других аспектов изобретения (в том числе отдельно), по мере целесообразности. В данном документе цитируются различные публикации, раскрытия которых включены в качестве ссылки во всей их полноте.

Реферат

Изобретение относится к изделиям и связанным с ними способам определения состояния раны, которая может представлять собой хроническую рану. Изделие для мониторинга состояния раны содержит: a) зону нанесения образца, в которую добавляют раневую текучую среду; b) зону реакции, находящуюся внизу по потоку от зоны нанесения образца, содержащую чувствительные к протеазам полимеры; c) зону, содержащую окрашенные частицы, находящиеся внизу по потоку зоны нанесения образца; d) зону просмотра, находящуюся внизу по потоку от зоны нанесения образца, зоны реакции и зоны, содержащей окрашенные частицы. Зона нанесения образца переносит текучую среду в направлении зоны просмотра, и при этом расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к переносу окрашенных частиц с раневой текучей средой в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в зоне просмотра. Окрашенные частицы заключены в полимеры, и расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, приводит к высвобождению окрашенных частиц в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде через зону просмотра; или зона реакции образует барьер, который предотвращает попадание раневой текучей среды в зону просмотра, и при этом расщепление полимеров вследствие протеазной активности, присутствующей в раневой текучей среде, необязательно выше порогового уровня, разрушает барьер и приводит к переносу окрашенных частиц в зону просмотра, тем самым обеспечивая визуальную индикацию протеазной активности в раневой текучей среде через зону просмотра. Также предоставлены способы мониторинга состояния раны. Технический результат – получение чувствительных и недорогих средств для мониторинга состояния раны. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 3 пр., 11 ил.

Формула