Пептиды nd2 и способы лечения неврологического заболевания - RU2607033C2

Чертежи

Показать все 44 чертежа(ей)

Описание

Ссылки на родственные заявки

Настоящая заявка не является предварительной, и согласно ей испрашивается приоритет в соответствии с заявкой №61/387439, которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме во всех отношениях.

Уровень техники

Комплекс рецептора N-метил-D-аспарагиновой кислоты (NMDAR) включает в себя более чем 60 белков [4]. Комплекс NMDAR, как сообщали, связан с несколькими неврологическими заболеваниями и нарушениями, включая инсульт, травматические повреждения нервной системы, нейродегенеративные заболевания, нарушение памяти и долговременную потенциацию синаптической передачи, оптические и слуховые невропатии, боль и другие. Тем не менее, несколько попыток напрямую ингибировать комплекс NMDAR потерпели неудачу в клинике вследствие чрезмерных побочных эффектов.

Белок постсинаптического уплотнения 95 кДа (PSD95) связывается непосредственно с С-концевой субъединицей NR2 в NMDAR [11] через его первые два домена PDZ, PDZ1 и PDZ2 [12]. Сообщалось, что блокирование взаимодействия между PSD95 и NMDAR способно защищать животных от вредных воздействий инсульта без блокады электрической активности и активности потока кальция NMDAR [13].

Субъединица 2 NADH-дегидрогеназы (ND2), как сообщали, связана с тирозинкиназой Src (смотри фиг.1А). Src представляет собой одну из нескольких киназ семейства Src (SFK) в комплексе NMDAR (то есть Src, Fyn, Lyn и Yes) [5-7]. Src вовлечена в регуляцию множества функций, включая клеточную адгезию, рост, миграцию и дифференцировку. Src широко экспрессируется во множестве типов клеток и может иметь различные локализации внутри клетки. По-видимому, субклеточная локализация Src может влиять на ее функцию. Src может связываться с клеточными мембранами, такими как цитоплазматическая мембрана, перинуклеарная мембрана и эндосомальная мембрана. В цитоплазматической мембране Src может преобразовать сигналы от множества рецепторов к внутренним сигнальным путям, которые передают данные сигналы в ядро, цитоскелет и другие клеточные компоненты. Например, Src может действовать через рецепторы факторов роста, чтобы влиять на клеточный рост и пролиферацию.

Предполагаемая молекулярная конфигурация NMDAR, Src и ND2 была представлена в Liu et al., Nat Med 2008, в которой Src, как предполагают, взаимодействует с NMDAR через ND2, который действует в качестве адаптерного белка. ND2 фиксирует Src в рецепторном комплексе ^метил-с1-аспартата (NMDA) в постсинаптических уплотнениях (PSD) для регуляции активности рецептора NMDA. Как сообщалось, фрагмент Src, называемый Src 40-49-Tat, может ингибировать взаимодействия между Src и ND2 в возбуждающих синапсах в головном мозге, уменьшая фосфорилирование субъединиц NR2B и модулируя боль [1, 2, 3].

Сущность изобретения

Изобретение относится к пептиду ND2, характеризующемуся аминокислотной последовательностью, содержащей аминокислоты от 310 до 321 в SEQ ID NO:60, при условии, что до шести аминокислот можно удалить, вставить или консервативно заменить. Пептид ND2, включающий в себя любой из упомянутых выше пептидов, может характеризоваться аминокислотной последовательностью, состоящей из 4-12 смежных остатков среди аминокислот 310-321 в SEQ ID NO:60. Необязательно, пептид ND2 характеризуется аминокислотной последовательностью, состоящей из 4-10 смежных остатков среди аминокислот 310-321 в SEQ ID NO:60. Необязательно, пептид ND2 состоит из аминокислот 310-321. Любой из данных пептидов ND2 может быть липидирован, например, будучи связан с жирной кислотой. Предпочтительно, пептид ND2 является миристоилированным. Любой из данных пептидов ND2 может быть связан с участвующим в интернализации пептидом на N-конце или С-конце пептида ND2, например, в качестве слитого белка. Участвующий в интернализации пептид может включать в себя, по меньшей мере, 5 остатков аргинина или лизина, и его общая длина составляет до 15 аминокислот. Участвующий в интернализации пептид может представлять собой пептид Tat.

Изобретение относится к химерному пептиду длиной вплоть до 50 аминокислот. Пептид содержит пептид ND2, содержащий, по меньшей мере, 3 смежных аминокислоты, расположенных между аминокислотами 289 и 321 в SEQ ID NO:60. Пептид ND2 связан с участвующим в интернализации пептидом и/или пептид ND2 является липидированным. Необязательно, химерный пептид составляет вплоть до 25 аминокислот в длину. Необязательно, пептид ND2 характеризуется аминокислотной последовательностью, состоящей из 4-20 смежных остатков среди аминокислот 289 и 321 в SEQ ID NO:60. Необязательно, пептид ND2 характеризуется аминокислотной последовательностью, состоящей из 4-12 смежных остатков среди аминокислот 310- 321 в SEQ ID NO:60. Необязательно, пептид ND2 характеризуется аминокислотной последовательностью, состоящей из 4-10 смежных остатков среди аминокислот 310-321 в SEQ ID NO:60. Необязательно, пептид ND2 состоит из аминокислот 310-321 в SEQ ID NO:60, при условии, что до шести аминокислот можно удалить, вставить или заменить. Необязательно, пептид ND2 характеризуется аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислот 310 до 321 в SEQ ID NO:60. Необязательно, участвующий в интернализации пептид связан с N-концом пептида ND2. Необязательно, участвующий в интернализации пептид связан с С-концом пептида ND2. Необязательно, участвующий в интернализации пептид и пептид ND2 связаны как слитый пептид. Необязательно, участвующий в интернализации пептид включает в себя, по меньшей мере, 5 остатков аргинина или лизина и имеет общую длину до 15 аминокислот.Необязательно, участвующий в интернализации пептид представляет собой пептид Tat. Изобретение дополнительно относится к пептиду ND2, содержащему 4-40 остатков, идентичных остаткам SEQ ID NO:60, из которых, по меньшей мере, 4 остатка являются смежными остатками среди аминокислот 289-321 в SEQ ID NO:60.

Изобретение дополнительно относится к пептидомиметику химерного пептида или пептида ND2, как описано выше. Необязательно, пептидомиметик представляет собой ретро-инверсо-пептидомиметик.

Изобретение дополнительно относится к способу лечения или осуществления профилактики неврологического заболевания или нарушения, предусматривающему введение эффективной схемы химерного пептида, пептида ND2 или пептидомиметика по любому предшествующему притязанию пациенту, страдающему от или находящемуся в группе риска развития неврологического нарушения. Необязательно, неврологическое заболевание или нарушение представляет собой инсульт, травматическое повреждение ЦНС, эпилепсию, тревожность или нейродегенеративное заболевание.

Изобретение дополнительно относится к способу лечения или осуществления профилактики боли, предусматривающему введение эффективной схемы химерного пептида, пептида ND2 или пептидомиметика, как описано выше, пациенту, страдающему от или находящемуся в группе риска возникновения боли. Необязательно, боль представляет собой невропатическую или воспалительную боль.

Изобретение дополнительно относится к способу лечения или осуществления профилактики злокачественного новообразования, предусматривающему введение эффективной схемы химерного пептида, пептида ND2 или пептидомиметика, как описано выше, пациенту, страдающему от или находящемуся в группе риска возникновения злокачественного новообразования.

Изобретение дополнительно относится к способу выявления средства, которое ингибирует взаимодействие ND 2-Src, предусматривающему взаимодействие пептида Src и пептида ND2 со средством; и определение связывания между пептидом Src и пептидом ND2, где уменьшение связывания в присутствие средства по сравнению с контрольным исследованием в отсутствие средства, указывает на то, что средство является ингибитором взаимодействия Src-ND2; где средство является химерным пептидом или пептидом ND2 или их пептидомиметиком, как определено выше или где-нибудь в настоящем документе.

Изобретение дополнительно относится к способу выявления средства, которое ингибирует в заимодействие Src -ND2, предусматривающему взаимодействие пептида Src и пептида ND2, как определено выше, со средством; и определение связывания между пептидом Src и пептидом ND2, где уменьшение связывания в присутствие средства по сравнению с контрольным исследованием в отсутствие средства, указывает на то, что средство является ингибитором взаимодействия Src-ND2. Такой способ может также включать в себя тестирование средства относительно фармакологической активности в отношении неврологического заболевания, боли или злокачественного новообразования в модели одного из неврологического заболевания, боли или злокачественного новообразования на животном.

Краткое описание чертежей

Фигуры 1А, В, С: ND2 взаимодействует с Src. А. Рисунок, изображающий взаимодействие в комплексе Src-ND2-NMDAR. В. Структура различных последовательностей ND2, сконструированных для выявления взаимодействующего с Src домена. С: Дот-блоттинг, демонстрирующий, что взаимодействующие с Src последовательности ND2 расположены между аминокислотами 239 и 321.

Фигуры 2А, В, С: А. Структура фрагментов ND2, используемых в эксперименте, с цифрами, представляющими аминокислоты относительно полноразмерного ND2. В. Дот-блоттинг, демонстрирующий, что биотинилированный Src 40-58, но не скремблированный sSRC 40-58, может связываться с ND2, ND2.1 и ND 2.1.4 лучше, чем с ND2.1.3. С. ELISA, демонстрирующий, что все из ND2, ND2.1 и ND2.1.4 могут связываться с биотинилированным Src 40-58.

Фигуры 3А-С: А. Последовательность конструкций ND2, оцениваемые в отношении связывания с Src 40-58. В. Дот-блоттинг, демонстрирующий связывание последовательностей ND2 с Src 40-58. С. ELISA, демонстрирующий связывание конструкций ND2 с Src 40-58, но не со скремблированным контролем.

Фигуры 4А, В: Дот-блоттинг фрагментов ND2, демонстрирующих связывание с Src 40-58, с сильным связыванием от ND2 310-321, ND2 307-318 и ND2 310-318. В. ELISA, демонстрирующий связывание конструкций ND2 с Src 40-58.

Фигуры 5А-Е: А. Дот-блоттинг, демонстрирующий, что ND2 310-321 может связываться с Src 40-49 и вариантами Src 40-49 с Tat на амино- или карбоксиконцевом участке. В. ELISA, демонстрирующий то же самое, включая связывание с Src 40-58. С. Анализ ELISA, демонстрирующий что Src 40-49 может связываться с Tat-ND2 310-321. D-E. Анализы ELISA, демонстрирующие, что Src 40-49 и Src 40-49 с Tat могут конкурировать за связывание с ND2 310-321 или Tat-ND2 310-321.

Фигура 6: анализ ELISA, демонстрирующий, что Src 40-58 способен связываться с Tat-ND2 310-321 более сильно, чем с ND2 310-321.

Фигура 7: ELISA, демонстрирующий, что Tat-ND2 310-321 способен конкурировать за связывание с Src 40-49, связанным с ND2 310-321.

Фигуры 8А, В: Количественное определение совместной локализации ND2 с Src в гиппокампальных нейронах 14DIV при обработке и без обработки с использованием Tat-ND2 310-321 или Src 40-49-Tat.

Фигуры 9A-F: Количественное определение совместной локализации белков в комплексе NMDAR в гиппокампальных нейронах 14DIV при обработке и без обработки с использованием Tat-ND2 310-321 или Src 40-49-Tat. А. ND2 с NR2B. В. NR2B с ND2. С. ND2 с PSD95. D. PSD95 с ND2. Е. NR2B с PSD95. F. PSD95 с NR2B.

Фигура 10: Количественное определение совместной локализации Src и NMDAR 2 В в гиппокампальных нейронах 14DIV при обработке и без обработки с использованием Tat-ND2 310-321 или Src 40-49-Tat.

Фигура 11: Количественное определение колокализации Src и PSD95 в гиппокампальных нейронах 14DIV при обработке и без обработки с использованием Tat-ND2 310-321 или Src 40-49-Tat.

Фигуры 12А-Е. Эксперименты по иммунопреципитации из лизатов головного мозга крысы, показывающие, что все из антител против ND2, Src, PSD95, NR2B и NR1 могут образовывать иммунопреципитат с комплексом, содержащим другие белки.

Фигуры 13A-D. А. Иммунопреципитация с использованием антитела против NR2B из гиппокампальных нейронов 14DIV, которые обрабатывали контролем, Tat-ND2 310-321 или Src 40-49-Tat в концентрации 1 мкМ в течение 1 часа. В. То же самое, обработанное при концентрации 3 мкМ в течение 2 часов. С. Повтор А с использованием указанного антитела для IP. D. Схожим образом с А с использованием антитела против PSD95 для иммунопреципитации.

Фигуры 14А, В: ND2 310-321 ингибирует усиленный РАСАР вызванный NMDA ток, а Src 40-49 не ингибирует.

Фигура 15: Коиммунопреципитация с использованием антител против NR2B из головного мозга крыс, подвергшихся воздействию 3PVO или 3PVO и обработке Tat-ND2 310-321 в концентрации 3 мкМ. С - экстракт контралатерального полушария головного мозга; I - экстракт ипсилатерального полушария головного мозга. Метки указывают на идентифицирующее антитело, и P-Tys обозначает антитело против фосфорилированного тирозина 100 в Src.

Фигуры 16А, В: Коиммунопреципитации с использованием антител либо против PSD95, либо против NR2B, демонстрирующие состояние белков в комплексе NR2B в присутствии или в отсутствие Src-Tat или Tat-ND2.

Фигура 17: Обработка с использованием Tat-ND2 310-321 снижает повышенную чувствительность к боли в модели, вызванной CFA боли.

Фигура 18: Размеры инфаркта у крыс, подвергавшихся воздействию 3PVO в присутствии Tat-NR2B9c, src40-49-Tat или Tat-ND2 310-321.

Фигура 19: Последовательность ND2 с предсказанной мембранной топологией. Локализация 310-321 выделена и, как предсказано, является внутриклеточной.

Фигура 20: Влияние Tat-ND2, миристоилированного ND2 и NA-1 (также известного как Tat-NR2B9c) на кровяное давление при внутривенном введении крысам в высокой концентрации.

Фигура 21: График, изображающий минимальное кровяное давление (максимальное снижение кровяного давления), наблюдаемое после внутривенной инъекции NA-1, Tat-ND2 или myr-ND2.

Фигура 22: График, изображающий эффекты Tat-ND2, myr-ND2 и myr2-ND2 при защите головного мозга крысы от инсульта, который вызван в модели 3PVO при внутривенном введении через 1 час после начала развития инсульта.

Фигура 23: График, изображающий, что две различные концентрации myr-ND2 способны значительно уменьшить боль при измерении аллодинии по порогу отдергивания лапы у животных, подвергшихся повреждению периферического нерва.

Определения

«Химерный пептид» означает пептид, содержащий два составляющих пептида, связанные неестественным образом с друг с другом, соединенные друг с другом как слитый белок или посредством химической связи.

«Слитый» белок или полипептид относится к составному полипептиду, то есть, одной непрерывной аминокислотной последовательности, полученной из последовательностей из двух разных гетерологичных полипептидов, которые в норме не сливаются друг с другом в одну последовательность полипептида.

Средства обычно предлагаются в выделенной форме. Выделенный означает, что разновидность объекта (например, пептид) была, по меньшей мере, частично отделена от загрязняющих примесей, с которыми связана в природе или которые применялись при ее производстве, но не обязательно исключает присутствие других компонентов, предназначенных для того, чтобы действовать в сочетании с выделенной разновидностью, таких как участвующий в интернализации пептид или фармацевтический наполнитель. Предпочтительно, средство представляет собой преобладающие макромолекулярные разновидности (например, полипептид), присутствующие в образце (то есть, в пересчете на моли в композиции и, как правило, содержит, по меньшей мере, приблизительно 50 процентов (в пересчете на моли) из всех присутствующих макромолекулярных типов. Как правило, выделенный фармакологический агент содержит более от 80 до 90 процентов от всех макромолекулярных разновидностей, присутствующих в композиции. Наиболее предпочтительно, фармакологическое средство очищают до существенной однородности (то есть, разновидности загрязняющих примесей невозможно определить в композиции обычными способами детекции), так что композиция по существу состоит из одной макромолекулярной разновидности.

Термин «специфическое связывание» относится к связыванию между двумя молекулами, например, лигандом и рецептором, характеризующемуся способностью молекулы (лиганда) связываться с другой специфической молекулой (рецептором) даже в присутствие множества других различных молекул, то есть, показать предпочтительное связывание одной молекулы с другой в гетерогенной смеси молекул. Специфическое связывание лиганда с рецептором также подтверждается снижением связывания пригодного для детекции меченного лиганда к рецептору в присутствии избытка немеченого лиганда (то есть, анализом конкурентного связывания). Специфическое связывание может являться результатом образования связей между определенными функциональными группами или определенного пространственного совпадения (например, тип ключ-замок), тогда как неспецифическое связывание обычно является результатом действия сил Ван-дер-Ваальса.

Эксайтотоксичность представляет собой патологический процесс, при котором нейроны повреждаются и гибнут при чрезмерной активации глутаматных рецепторов, таких как рецепторы NMDA.

Термин «пациент» или «субъект» включает в себя людей и других млекопитающих, в частности, грызунов, кошек, собак, копытных животных, свиней и не являющихся человеком приматов.

Термин « средство» включает в себя любой элемент, соединение или группу, которая характеризуется или может характеризоваться фармакологической активностью. Средства среди прочего могут представлять собой биологический препарат (например, пептиды, пептидомиметики или антитела) или органические низкомолекулярные соединения (обычно менее чем 500 Да). Средства могут представлять собой продукты из природного или синтетического соединения. Средства включают в себя соединения, которые являются известными (то есть, одобренными FDA или схожей организацией в других странах) лекарственными средствами, соединения, для которых была показана фармакологическая активность, но которые подвергаются дополнительному анализу, или соединения, которые отбирались при скрининге в отношении фармакологической активности.

Средство можно описать в качестве характеризующегося фармакологической активностью, если оно проявляет активность в системе скрининга, которая указывает на то, что активное средство применимо или может быть применимо для профилактики или лечения заболевания. Система скрининга может представлять собой систему in vitro, клеточную систему, животное или человека. Средства можно описать в качестве характеризующихся фармакологической активностью, несмотря на то, что может потребоваться дальнейшее тестирование, чтобы устанавливать фактическую профилактическую или терапевтическую применимость при лечении заболевания.

Если иначе не очевидно из контекста, упоминание о средстве обозначает средство или фармакологическое средство либо само по себе, либо связанное с участвующим в интернализации пептидом.

Пептид Tat (или ТАТ или tat) означает пептид, содержащий или состоящий из GRKKRRQRRR (SEQ ID NO:60), в которой не более чем 5 остатков удалены, заменены или встроены в последовательность, который сохраняет способность облегчить захват связанного пептида или другого средства в клетку. Предпочтительно, любые аминокислотные замены представляют собой консервативные замены. Предпочтительно, любые замены, делеции или внутренние вставки в комплекс сохраняют у пептида суммарный катионный заряд предпочтительно схожий с зарядом указанной выше последовательности. Аминокислоты пептида Tat можно дериватизировать при помощи биотина или схожей молекулы, чтобы уменьшить воспалительную реакцию.

Статистически значимый относится к р-значению, которое составляет <0,05, предпочтительно, <0,01 и, наиболее предпочтительно, <0,001.

Когда пептид или аминокислотная последовательность, как говорят, находится внутри диапазона или аминокислот, пептид может включать в себя начальную и конечную точку, определяющую диапазон, а также аминокислоты внутри диапазона.

С целью классификации замен аминокислот на консервативные или неконсервативные, аминокислоты можно сгруппировать, как следует ниже: группа I (гидрофобные боковые цепи); met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr; группа III (кислые боковые цепи): asp, glu; группа IV (основные боковые цепи): asn, gln, his, lys, arg; группа V (остатки, влияющие на конформацию цепи): gly, pro; и группа VI (ароматические боковые цепи): trp, tyr, phe. Консервативные замены включают замены среди аминокислот в одной и той же группе. Неконсервативные замены представляют замен у элем ента одной из данны х групп на элемент другой.

Пептид максимально выровнен с последовательностью сравнения, когда количество точных совпадений между пептидом и последовательностью сравнения максимально увеличено. Выравнивание можно проводить на глаз. Альтернативно, программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно через National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Как правило, можно использовать параметры программы по умолчанию. Для аминокислотных последовательностей, программа BLASTP использует по умолчанию длину слова (W) 3, ожидание (Е) 10, и матрицу замен BLOSUM62 (смотри Henikoff&Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA 10915 (1989)).

Пептид, находящийся в определенном диапазоне аминокислот, может включать в себя любую из двух или обе вместе аминокислот, определяющих границы диапазона, а также пептид, включающий в себя только аминокислоты между аминокислотами, определяющими диапазон.

Подробное описание изобретения

I. Основное

Изобретение частично основано на выявлении ключевой области ND2, ответственной за взаимодействие с Src, в пределах остатков 289-321 в ND2 и, более подробно, остатков 310-321 из ND2. Пептиды, включающие в себя, перекрывающие данную область или происходящие из данной области, можно использовать для ингибирования взаимодействия ND2 с Src. Ингибирование такого взаимодействия применимо для лечения или профилактики неврологических заболеваний и нарушений, боли и злокачественного новообразования.

II. Белки

Если иначе не очевидно из контекста, белок ND2 относится к природной человеческой форме ND2, для которой иллюстративная последовательность приписана Р03891 в Swiss Prot и воспроизведена ниже и на фиг.19. Первый остаток М может быть отщеплен. Приблизительно 20 единичных аминокислотных природных вариантов последовательности перечислены в базе данных Swiss-Prot.

Точно так же, если не указано иначе, Src означает природную человеческую последовательность Src, такую как предложена в Swiss-Prot. P12931 с или без первого остатка Met.

III. Средства

Средства согласно изобретению включают в себя пептиды ND2, включающие в себя, перекрывающие, состоящие из или находящиеся среди остатков 289-321, и, предпочтительно, включающие в себя, перекрывающие, состоящие из или находящиеся среди остатков 310-321 белка ND2 (SEQ ID NO:60). Пептид ND2 обычно содержит, по меньшей мере, три смежных остатка среди остатков 289-321 ND2. Пептид ND2 предпочтительно связывается с белком Src в уникальном домене в участке, приблизительно включающем в себя или находящемся среди аминокислот 40-49 Src, и конкурентно ингибирует взаимодействия с белком ND2 и белком Src. Пептиды ND2, как правило, содержат до 10, 11, 12, 15, 20, 30 или 40 остатков SEQ ID NO:60, означая, что указанный номер остатка в пептиде ND2 идентичен соответствующим остаткам в полноразмерной последовательности ND2 при максимальном выравнивании с ним. Предпочтительно, по меньшей мере, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 из данных остатков являются смежными остатками среди остатков 289-321, и предпочтительно, среди остатков 310-321 ND2. Предпочтительно, пептиды содержат 4-20 аминокислот, идентичных соответствующим остаткам из последовательности ND2 при максимальном выравнивании с ним, и, более предпочтительно, 4-12 или 5-10 таких остатков. Некоторые пептиды ND2 содержат аминокислотную последовательность, состоящую из 4-20 смежных остатков среди аминокислот 289 и 321 в SEQ ID NO:60. Некоторые пептиды ND2 содержат аминокислотную последовательность, состоящую из 3-12 смежных остатков среди аминокислот 310-321 в SEQ ID NO:60. Некий пептид ND2 содержит аминокислотную последовательность, состоящую, по меньшей мере, из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 остатков аминокислот 310-321 в SEQ ID NO:60. Некоторые пептиды ND2 состоят из остатков 310-321 SEQ ID NO:60.

Фланкирующие аминокислоты, не относящиеся к SEQ ID NO:60, могут представлять собой связанный с пептидом ND2, для примеров, участвующий в интернализации пептид, как обсуждается ниже, для того, чтобы облегчить прохождение через мембрану, также как может метка, такая как биотин или GST, способствовать очистке, идентификации или скринингу. За исключением неродственной фланкирующей последовательности аминокислот, любые аминокислоты в пептиде ND2, отличающиеся от SEQ ID NO:60, предпочтительно представляют собой консервативную замену относительно соответствующего остатка в SEQ ID NO:60. Пептиды ND2, содержащие последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO:60 (не включая неродственные фланкирующие последовательности), предпочтительно содержат не более, чем 6, 5, 4, 3, 2 или 1 делецию или замену относительно SEQ ID NO:60. Пептиды ND2 предпочтительно содержат в целом не более, чем 40, 30, 20, 15 или 12 аминокислот (не включая неродственные фланкирующие последовательности, такие как участвующий в интернализации пептид).

Средства согласно изобретению также включают в себя пептидомиметики пептидов ND2. Пептидомиметик представляет собой синтетическое химическое соединение, которое характеризуется по существу такими же структурными и/или функциональными характеристиками как пептид ND2, состоящий из природных аминокислот, но содержит, по меньшей мере, одну непептидную связь или, по меньшей мере, одну неприродную аминокислоту.

Пептидомиметик может содержать полностью синтетические, неприродные аналоги аминокислот или может представлять собой химерную молекулу частично из природных аминокислот пептида и частично из неприродных аналогов аминокислот. Пептидомиметик может также включать любое количество консервативных замен природных аминокислот при условии, что такие замены также по существу не меняют структуру миметика и/или ингибирующую или связывающую активность. В пептидомиметике химерного пептида, содержащего пептид ND2 и участвующий в интернализации пептид, либо активная часть, либо участвующая в интернализации часть, либо обе могут представлять собой Пептидомиметик.

Пептиды и пептидомиметики согласно изобретению могут содержать модифицированные аминокислотные остатки, например, остатки, которые являются N-алкилированными. N-концевые алкильные модификации могут включать в себя, например, N-метил, N-этил, N-пропил, N-бутил, N-циклогексилметил, N-циклогексилэтил, N-бензил, N-фенилэтил, N-фенилпропил, N-(3,4-дихлорфенил)пропил, N-(3,4-дифторфенил)пропил и N-(нафталин-2-ил)этил). Пептиды или пептидомиметики также могут быть ацетилированы, фосфорилированы и/или гликозилированы.

В некоторых пептидомиметиках любую аминокислоту, встречающуюся в природе в L-конфигурации (которая может также обозначаться как R или S, в зависимости от структуры химической группы), можно заменить на аминокислоту такого же структурного химического типа или пептидомиметик, но противоположной хиральности, как правило, обозначаемую как D-аминокислоту, но которая может дополнительно обозначаться как R- или S-форма. Таким образом, пептидомиметик может включать в себя 1, 2, 3, 4, 5, по меньшей мере, 50% или все остатки D-аминокислот. Пептидомиметик, содержащий некоторые или все D-остатки, иногда обозначается как «инверсо»-пептид.

Пептидомиметики также включают в себя ретро-пептиды. Ретро-пептид содержит обратную аминокислотную последовательность. Пептидомиметики также включают в себя ретро-инверсо- пептиды, в которых порядок аминокислот изменен на обратный так, что первоначально С-концевая аминокислота появляется на N-конце, и D-аминокислоты используются вместо L-аминокислот.

Отдельные остатки пептидомиметика могут соединяться пептидными связями, другими химическими связями или средствами для связывания, такими как, например, глутаральдегид, сложные эфиры N-гидроксисукцинимида, бифункциональные малеимиды, "М,"М-дициклогексилкарбодиимид (DCC) или N,N-диизопропилкарбодиимид (DIC). Связывающие группы, которые могут быть альтернативными традиционным амидным связям («пептидным связям»), включают в себя, например, кетометилен (например, -С(=O)-СН2- для -C(=O)-NH-), аминометилен (CH2-NH), этилен, олефин (СН=СН), простой эфир (СН2-O), простой тиоэфир (CH2-S), тетразол (CN4-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (смотри, например, Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Ammo Acids, Peptides and Proteins, Vol.7, pp 267-357, A Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NY).

Миметики ароматических аминокислот можно получить посредством замены, например, на D- или L-нафтилаланин; D- или L-фенилглицин; D- или L-2-тиенилаланин; D- или L-1, -2, 3- или 4-пиренилаланин; D- или L-3-тиенилаланин; D- или L-(2-пиридинил)аланин; D- или L-(3-пиридинил)аланин; D- или L-(2-пиразинил)аланин; D- или L-(4-изопропил)фенилглицин; D-(трифторметил)фенилглицин; D-(трифторметил)фенилаланин; D-p-фторфенилаланин; D- или L-p-бифенилфенилаланин; K- или L-p-метоксибифенилфенилаланин; D- или L-2-индол(алкил)аланины; и D- или L-алкилаланины, где алкил может представлять собой замещенный или незамещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, втор-изотил, изопентил или некислые аминокислоты. Ароматические кольца неприродной аминокислоты включают в себя, например, тиазолиловые, тиофенильные, пиразолиловые, бензимидазолиловые, нафтиловые, фураниловые, пирролильные и пиридильные ароматические кольца.

Миметики кислых аминокислот можно получить при замене, например, на не являющиеся карбоксилатами аминокислоты, сохраняя при этом отрицательный заряд; (фосфоно)аланин; сульфатированный треонин. Карбоксильные боковые группы {например, аспартил или глутамил) можно также избирательно модифицировать в реакции с карбодиимидами (R-N-C-N-R=), такими как, например, 1-циклогексил-3(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3(4-азония-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Аспартил или глутамил можно также превратить в аспарагинильный и глутаминильный остатки посредством реакции с ионами аммония.

Миметики основных аминокислот можно получить при замене, например, (в дополнение к лизину и аргинину) на аминокислоты орнитин, цитруллин или (гуанидино)уксусную кислоту или (гуанидино)алкилуксусную кислоту, где алкил определен выше. Нитрильные производные (например, содержащие CN-группу вместо СООН) можно заместить на аспарагин или глутамин. Аспарагинильный и глутаминильный остатки можно дезаминировать до соответствующих аспартильного или глутамильного остатков.

Миметики аргининовых остатков можно получить посредством реакции аргинила, например, с одним или несколькими общепринятыми реагентами, включающими в себя, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, предпочтительно, в щелочных условиях.

Миметики тирозиновых остатков можно получить посредством реакции тирозила, например, с ароматическими диазониевыми соединениями или тетранитрометаном. N-ацетилимидазол и тетранитрометан можно использовать для образования 0-ацетилтирозильных фрагментов и 3-нитропроизводных, соответственно.

Миметики цистеиновых остатков можно получить посредством реакции цистеинильных остатков, например, с альфа-галоацетатами, такими как 2-хлоруксусная кислота или хлорацетамид и соответствующими аминами, чтобы получить карбоксиметильные или карбоксиамидометильные производные. Миметики цистеиновых остатков можно также получить посредством реакции цистеинильных остатков, например, с бромтрифторацетоном, альфа-бром-бета-(5-имидозоил)пропионовой кислоты; хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидами; метил 2- пиридилдисульфидами; р-хлорртутьбензоатом; 2-хлорртуть-4-нитрофенолом; или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазол.

Миметики лизина можно получить (и аминоконцевые остатки можно изменить) посредством реакции лизинила, например, с ангидридами янтарной или других карбоновых кислот.Миметики лизина и других альфа-аминосодержащих остатков можно также получить посредством реакции с имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборогидрид, тринитробензолсульфокислота, O-метилизомочевина, 2,4-пентандион и катализируемой трансаминазой реакцией с глиоксилатом.

Миметики метионина можно получить посредством реакции, например, метионинсульфоксидом. Миметики пролина включают в себя, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4-метилпролин или 3,3-диметилпролин. Миметики остатка гистидина можно получить посредством реакции гистидила, например, с диэтилпрокарбонатом или пара-бромфенацилбромидом.

Другие миметики включают в себя, например, миметики, полученные при гидроксилировании пролина и лизина; фосфорилировании гидроксильных группх остатков серила или треонила; метилировании альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилировании N-концевого амина; метилировании основной цепи амидных остатков или при замене с N-метиламинокислотами; или амидировании С-концевых карбоксильных групп.

Линкер, например, полиэтиленгликолевый линкер, можно использовать для димеризации пептида ND2 или его пептидомиметика, чтобы увеличить его аффинность и селективность в отношении Src. Необязательно, приблизительно 2-10 копий РЕ G можно присоединить в тандем в качестве линкера.

Соответствующую фармакологическую активность пептидов, пептидомиметиков или другого средства можно подтвердить, при желании, показав ингибирование взаимодействия Src-ND2 in vitro или в модели на животном, как описано ниже. Применимые пептиды или пептидомиметики, как правило, характеризуются величинами IC50 менее чем 50 мкМ, 25 мкМ, 10 мкМ, 0,1 мкМ или 0,01 мкМ в таком анализе. Предпочтительные пептиды, как правило, характеризуются величиной IC50 в диапазоне от 0,001 до 1 мкМ и, более предпочтительно, от 0,05 до 0,5 или от 0,05 до 0,1 мкМ.

IV. Участвующие в интернализации пептиды и липидирование

Участвующие в интернализации пептиды, также известные как пептиды переноса через клеточную мембрану или проникающие пептиды, представляют собой хорошо известный класс относительно коротких {например, 5-30 или 7-20 или 9-15 аминокислот) пептидов, которые позволяют множеству клеточных или вирусных белков перемещаться через мембраны. Такие пептиды, как правило, характеризуются катионным зарядом из-за указанной выше нормальной представленности (относительно белка в большинстве случаев) остатков аргинина и/или лизина, которые, как полагают, облегчают их прохождение через мембраны. Некоторые такие пептиды содержат, по меньшей мере, 5, 6, 7 или 8 остатков аргинина и/или лизина. Примеры включают в себя белок антеннопедии (Bonfanti, Злокачественное новообразование Res. 57, 1442-6 (1997)) (и его варианты), белок Tat вируса иммунодефицита человека, белок VP22, продукт гена UL49 вируса простого герпеса 1 типа, пенетратин, SynB1 и 3, транспортан, амфипатик, gp41NLS, nonnArg и несколько растительных и бактериальных белковых токсинов, таких как рицин, абрин, модессин, дифтерийный токсин, холерный экзотоксин, сибиреязвенный токсин, термолабильный токсины и экзотоксин A Pseudomonas aeruginosa (ETA). Другие примеры описаны в следующих ниже ссылках (Temsamani, Drug Discovery Today, 9(23): 1012-1019, 2004; De Coupade, Biochem J., 390:407-418, 2005; SaalikBioconjugate Chem. 15: 1246-1253, 2004; Zhao, Medicinal Research Reviews 24(1): 1-12, 2004; Deshayes, Cellular and Molecular Life Sciences 62:1839-49, 2005) (все включены в качестве ссылки).

Предпочтительный участвующий в интернализации пептид представляет собой Tat из вируса HIV. Пептид Tat, о котором сообщалось в предыдущей работе, содержит или состоит из стандартной аминокислотной последовательности YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2), обнаруженной в белке Tat HIV. SEQ ID NO:2 обозначается как стандартный пептид Tat. Если присутствуют дополнительные остатки, фланкирующие такой мотив Tat (вдобавок к фармакологическому средству), остатки могут представлять собой, например, природные аминокислоты, фланкирующие данный сегмент из белка Tat, спейсерные или линкерные аминокислоты, обычно применяемого типа для соединения двух белковых доменов, например, gly (ser)4 (SEQ ID NO:44), TGEKP (SEQ I D NO:45), GGRRGGGS (SEQ ID NO:46) или LRQRDGERP (SEQ ID NO:47) (смотри, например. Tang et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686; Henneckeet al. (1998), Protein Eng. 11, 405-410)), или могут представлять собой любые другие аминокислоты, которые не снижают в значительной степени способности сообщать свойство по захвату варианта без фланкирующих остатков. Предпочтительно, количество фланкирующих аминокислот, помимо активного пептида, не превышает десяти по обе стороны от YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2). Один подходящий пептид Tat, содержащий дополнительные аминокислотные остатки, фланкирующие С-конец YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2) представляет собой YGRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO:48). Однако, предпочтительно, не присутствует никаких фланкирующих аминокислот.

Варианты указанного выше пептида Tat, характеризующегося сниженной способностью связываться с кальциевыми каналами N-типа, описаны в WO/2008/109010. Такие варианты могут содержать или состоять из аминокислотной последовательности XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:49), в которой Х представляет собой аминокислоту за исключением Y или отсутствует (в случае чего, G представляет собой свободный N-концевой остаток). Предпочтительный пептид Tat содержит N-концевой остаток Y, замененный на F. Таким образом, пептид tat, содержащий или состоящий из FGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:3), является предпочтительным. Другой предпочтительный вариант пептида tat состоит из GRKKRRQRRR (SEQ ID NO:1). Другие пептиды tat, которые можно использовать, включают в себя GRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO:4) и GRKKRRQRRRP (SEQ ID NO:59). Другие пептиды Tat содержат, по меньшей мере, восемь смежных аминокислот из последовательности GRKKRRQRRR. Другие пептиды tat, которые облегчают прохождение средства, не ингибируя кальциевые каналы N-типа, включают в себя пептиды, представленные выше. Другой предпочтительный пептид Tat обозначается как rv-Tat или RRRQRRKKRGY (SEQ ID NO:58).

X может представлять собой свободный аминоконец, одну или несколько аминокислот или сопряженный фрагмент.Участвующие в интернализации пептиды можно использовать в инверсо- или ретро- или инверсо-ретро-форме с или без связанного пептида или пептидомиметика, находящегося в такой форме.

Участвующие в интернализации пептиды можно присоединять к средству общепринятыми способами. Например, средства можно присоединять к участвующим в интернализации пептидам химической связью, например посредством связующего или конъюгирующего средства. Множество таких средств является коммерчески доступным и рассмотрены у Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991). Некоторые примеры перекрестносвязывающих реагентов включают в себя N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат или N,N’-(1,3-фенилен)бисмалеимид; N,N’-этилен-бис-(йодацетамид) или другой такой реагент, содержащий от 6 до 11 атомов углерода в метиленовых мостиках (которые относительно специфичны в отношении сульфгидрильных групп); и 1,5-дифтор-2,4-динитробензол (который образует необратимые связи с аминогруппами и тирозиновыми группами). Другие перекрестносвязывающие реагенты включают в себя р,р’-дифтор-m,m’-динитродифенилсульфон (который образует необратимые связи с аминогруппами и фенольными группами); диметиладипимидат (который специфичен для аминогрупп); фенол-1,4-дисульфонилхлорид (который вступает в реакцию в основном с аминогруппами); гексаметилендиизоцианат или диизотиоцианат или азофенил-р-диизоцианат (который вступает в реакцию в основном с аминогруппами); глутаральдегид (который вступает в реакцию с несколькими различными боковыми цепями) и дисдиазобензидин (который вступает в реакцию прежде всего с тирозином и гистидином).

В отношении средств, которые представляют собой пептиды, присоединенные к участвующему в интернализации пептиду, их можно получить, создавая слитый белок, содержащий последовательность пептида, слитую, предпочтительно с его N-конца, с участвующим в интернализации пептидом.

Пептиды, необязательно слитые с пептидами Tat, можно синтезировать при твердофазном синтезе или рекомбинантными способами. Пептидомиметики можно синтезировать, применяя множество способов и технологий, описанных в научной и патентной литературе, например. Organic Syntheses Collective Volumes, Oilman et al. (Eds.) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234. Пептиды или пептидомиметики, связанные с участвующими в интернализации пептидами в качестве слитых пептидов или другим образом, предпочтительно включают в себя в целом не более, чем 50 аминокислот, и более предпочтительно не более, чем 25 или 20 аминокислот.

Вместо связывания или заодно со связыванием пептида ND2 с участвующим в интернализации пептидом, пептид ND2 можно связывать с липидом (липидирование) для того, чтобы увеличить гидрофобность конъюгата относительно отдельного пептида и тем самым облегчить прохождение связанного пептида ND2 через клеточные мембраны и/или через гематоэнцефалический барьер. Липидирование предпочтительно выполняют на N-концевой или С-концевой аминокислоте, но можно также выполнять на внутренних аминокислотах, при условии, что связь постоянного пептида ND2 с Src не снижается более чем на 50%. Липиды представляют собой органические молекулы, более разрешимые в эфире, чем в воде и включают в себя жирные кислоты, глицериды и стеролы. Подходящие виды липидирования включают в себя миристиолирование, пальмитоилирование или присоединение других жирных кислот предпочтительно с длиной цепи 10-20 атомов углерода, таких как лауриновая кислота и стеариновая кислота, а также геранилирование, геранил-геранилирование и изопренилирование. Липидирование типа, встречающегося при посттрансляционной модификации природных белков, являются предпочтительными. Липидирование жирными кислотами посредством образования амидной связи с альфа-аминогруппой N-концевой аминокислоты пептида также является предпочтительной. Липидирование может происходить при пептидном синтезе, включающем предварительно липидированную аминокислоту, может осуществляться ферментативно in vitro или при рекомбинантной экспрессии, при химическом образовании поперечных связей или химической дериватизации пептида. Аминокислоты, модифицируемые при миристиолировании и других липидных модификациях, коммерчески доступны.

Липидирование предпочтительно облегчает прохождение связанного пептида ND2 через клеточную мембрану и/или гематоэнцефалитический барьер, не вызывая временного снижения кровяного давления, как это было обнаружено, когда вводили стандартный пептид Tat в высокой дозировке (например, при 3 мг/кг или больше, чем 3 мг/кг), или, по меньшей мере, с меньшим снижением, чем снижение с таким же пептидом ND2, связанным со стандартным пептидом Tat.

Если временное снижение кровяного давления происходит при введении пептида ND2 {например, когда он связан со стандартным пептидом Tat и вводится в высокой дозировке), его можно подавлять при совместном введении с противовоспалительным средством, предпочтительно, ингибитором дегрануляции тучных клеток (смотри, например, WO/2009/07610)).

V. Пациенты, поддающиеся лечению или профилатике

Средства согласно настоящему изобретению применимы для лечения или осуществления профилактики неврологического заболевания или нарушений, боли и злокачественных новообразований. Данные классы, конечно же, не являются взаимоисключающими. Например, рак мозга может подпадать под все три класса.

Множество неврологических заболеваний и нарушений поддаются лечению или профилактике. Такие заболевания и нарушения включают в себя тревожность, эпилепсию, оптические и слуховые невропатии, инсульт {например, спонтанный острый ишемический, геморрагический, вызванный определенными процедурами), эпилепсию, гипоксию, травматические повреждения ЦНС, не связанные с инсультом, такие как, травматическое повреждение нервной системы, травматическое повреждение головного мозга и повреждение спинного мозга, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, другие деменции, связанные с тельцами Леви, болезнь Хантингтона, ALS, синдром коровьего бешенства, болезнь Крейцфельда-Якоба, рассеянный склероз, дегенерацию спинного мозга, спинально-церебеллярную атаксию, болезнь Тея - Сакса и трансмиссивную губчатую энцефалопатию. Такие нарушения также встречаются у пациентов, переносящих хирургическую операцию, которая затрагивает или может затрагивать сосуды {например, яремную вену или сонную артерию), поставляющие или выносящие кровь от или к головному мозгу, особенно у пациентов, подвергающихся нейрохирургической операции, такой как эндоваскулярная хирургическая операция для восстановления аневризмы или эндоваскулярная хирургическая операция сосуда, поставляющего кровь к конечности, спинному мозгу, сетчатке или почке. Такое восстановление хирургическим путем может осуществить, например, встраивая стент или катушку в кровеносный сосуд, пораженный аневризмой. Неврологические заболевания и нарушения, связанные, по меньшей мере, частично с эксайтотоксичностью, особенно поддаются лечению способом согласно изобретению.

Инсульт представляет собой состояние, появляющееся в результате нарушения кровообращения в ЦНС независимо от причины. Возможные причины включают в себя эмболию, кровоизлияние, тромбоз и хирургическое вмешательство. Некоторые нервные клетки сразу же погибают в результате нарушенного кровообращения. Такие клетки высвобождают свои составляющие их молекулы, включая глутамат, который в свою очередь активирует рецепторы NMDA, которые приводят к повышению внутриклеточных уровней кальция и внутриклеточных уровней ферментов, приводящих к дальнейшей гибели нервной клетки (каскад эксайтотоксичности). Гибель ткани от потери кислорода обозначается как инфаркт.Объем инфаркта (то есть, объем мертвых нервных клеток, являющихся следствием инсульта в головном мозге) можно использовать в качестве показателя степени патологического повреждения, являющегося следствием инсульта. Симптоматический эффект зависит как от объема инфаркта, так от его локализации в головном мозге. Индекс инвалидизации можно использовать в качестве меры симптоматического повреждения, такой как шкала Ранкина для последствий инсульта (Rankin, Scott Med J;2:200-15 (1957)), шкала инсульта NIH и индекс Бартеля. Шкала Ранкина основана на прямой оценке общего состояний пациента, как следует ниже.

Индекс Бартеля основан на ряде вопросов о способности пациента осуществлять 10 основных действий повседневной жизни, приводящих к появлению оценки от 0 до 100, причем меньшая оценка указывает на большее нарушение жизнедеятельности (Mahoney et al., Maryland State Medical Journal 14:56-61 (1965)).

Альтернативно тяжесть инсульта/последствий можно определить, применяя шкалу инсульта NIH, доступную во всемирной компьютерной сети ninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf.

Шкала основана на способности пациента выполнять 11 групп действий, которые включают в себя оценки уровня сознания, моторных, чувствительных и языковых функций пациента.

Ишемический инсульт относится, более конкретно, к типу инсульта, который вызван блокадой кровообращения в головном мозге. Причиной для такого типа блокады является обычно развитие жировых отложений, выстилающих стенки сосуда. Такое состояние называют атеросклерозом. Данное жировое отложение может вызывать два типа закупоривания. Тромбоз сосудов головного мозга относится к тромбу (сгустку крови), который образуется месте закупорки сосуда. «Эмболия сосудов мозга» относится вообще к сгустку крови, который образуется в другом месте сердечно-сосудистой системы, обычно сердечных артериях и больших артериях верхнего отдела груди и шеи. Часть кровяного сгустка затем отрывается, входит в кровоток и проходит через кровеносные сосуды мозга, пока он не достигает сосудов, слишком маленьких, чтобы позволить ему пройти. Второй важной причиной эмболии является нерегулярное сердцебиение, известное как фибрилляция при повышенном артериальном давлении. Это создает условия, при которых сгусток может образоваться в сердце, отделиться и перемеситься в головной мозг.Дополнительными возможными причинами ишемического инсульта являются кровоизлияние, тромбоз, расслоение артерии или вены, остановка сердца, шок любой причины, включая кровоизлияние, и ятрогенные причины, такие как прямое хирургическое повреждение кровеносных сосудов мозга или сосудов, ведущих к мозгу, или при хирургической операции на сердце или легких. Ишемический инсульт составляет приблизительно 83 процента всех случаев инсульта.

Транзиторные ишемические атаки (TIA) представляют собой малые или предупреждающие инсульты. При TIA присутствуют состояния, характерные для ишемического инсульта, и развиваются типичные предупреждающие признаки инсульта. Однако, закупорка (кровяной сгусток) имеет место в течение короткого промежутка времени и имеет тенденцию устраниться самостоятельно посредством нормальных механизмов. Пациенты, подвергающиеся хирургической операции на сердце, легких или нейрохирургической операции находятся в особой группе риска возникновения транзиторной церебральной ишемической атаки.

Геморрагический инсульт составляет приблизительно 17 процентов случаев инсультов. Он происходит вследствие слабости сосуда, который разрывается и кровоточит в окружающие ткани головного мозга. Кровь накапливается и давит на окружающую ткань головного мозга. Два основных типа геморрагических инсультов представляют собой внутримозговое кровоизлияние и субарахноидальное кровоизлияние. Геморрагический инсульт является результатом разрыва ослабленного кровеносного сосуда. Возможные причины разрыва ослабленного кровеносного сосуда включают в себя гипертоническое кровоизлияние, при котором высокое кровяное давление вызывает разрыв кровеносного сосуда, или другую первопричину появления ослабленных кровеносных сосудов, такую как приводящая к разрывам сосудистая патология головного мозга, включающая в себя аневризму сосудов головного мозга, артериовенозную мальформацию (AVM) или кавернозную мальформацию. Геморрагические инсульты могут также возникать при геморрагических трансформациях ишемического инсульта, которые ослабляют кровеносные сосуды в месте инфаркта, или кровоизлияниях из первичных или метастазирующих опухолей в ЦНС, которые содержат аномально слабые кровеносные сосуды. Геморрагический инсульт может возникать из-за ятрогенных причин, таких как прямое хирургическое повреждение кровеносного сосуда головного мозга. Аневризма представляет собой раздувание ослабленного участка кровеносного сосуда. Если оставить невылеченной, аневризма продолжает истончаться пока не разорвется и не образуется кровотечения в головной мозг. Артериовенозная мальформация (AVM) представляет собой кластер аномально образующихся кровеносных сосудов. Кавернозная мальформация представляет собой венозную аномалию, которая может вызвать кровоизлияние из ослабленных венозных структур. Любой из таких сосудов может разорваться, также приводя к кровоизлиянию в головной мозг. Геморрагический инсульт может также являться результатом физической травмы. Геморрагический инсульт в одной части головного мозга может привести к ишемическому инсульту в другой вследствие нехватки крови, потерянной при геморрагическом инсульте.

Настоящие средства также применимы для лечения или профилактики боли. Боль представляет собой эмпирическое явление, которое субъективно для человека, испытывающего ее, и на нее оказывает влияние психическое состояние человека, включая окружающую среду и культурный уровень. «Физическую» боль можно иногда связать со стимулом, заметным третьему лицу, который вызван фактическим или вероятным повреждением ткани. В этом смысле боль можно расценивать как «сенсорный и эмоциональный опыт, связанный с фактическим или вероятным повреждением ткани или описываемый с точки зрения такого повреждения», согласно Международной ассоциации по изучению боли (IASP). Однако, в некоторых случаях боли отсутствует заметная причина. Например, психогенная боль, включающая усиление ранее существующей физической боли психогенными факторами или синдромами, иногда постоянная, ощущаемая боль у людей с психологическими нарушениями без каких-либо доказательств заметной причины боли.

Боль, как правило, разделяют на три основные категории: физиологическая, воспалительная и невропатическая. Однако, множественные механизмы участвуют в каждой из них с некоторым перекрыванием, поскольку каждая подвержена или является выражением пластичности нервной системы. Пластичность нервной системы, как правило, разделяют на активацию, модуляцию и модификацию, и каждая может способствовать изменению порога чувствительности, таким образом, что в результате появляется повышенная чувствительность к болевым стимулам. Боль не является пассивным следствием передачи определенного периферического стимула в центр боли в коре, а скорее активным процессом, частично появляющимся в периферической и частично в центральной нервной системе при изменениях в пластичности.

Физиологическая боль вызывается в качестве реакции на болевые раздражители (укол иглы, крайние значения температуры, химические вещества), воспалительная боль вызывается повреждением ткани/воспалением, и невропатическая боль - повреждениями нервной системы. Каждая характеризуется повышенной чувствительностью в месте повреждения и в окружающих нормальных тканях. В таких случаях стимулы, которые в нормальной ситуации и не могут вызывать боль, ее вызывают (аллодиния) и болевые раздражители (острые объекты, высокая температура, химические вещества) вызывают большую и более продолжительную боль (гипералгезия). Повышенная чувствительность при воспалительной и физиологической боли, как правило, возвращается к нормальной, как только патологический процесс или патология возвращается к норме. Невропатическая боль сохранится после того, как инициирующее событие зажило, и она является результатом ненормального функционирования нервной системы, а не реакции на патологию.

Боль можно также обозначить как острую или хроническую. Острая боль представляет собой резкую боль, которая в природе является временной, такой как боль, вызванная булавочным уколом. Хроническая боль представляет собой боль или болевую чувствительность, которая сохраняется в течение боле длительного периода, обычно день или более. Крысиные модели хронической боли могут включать в себя инъекцию формалина в подушечку стопы, инъекцию полного адъюванта Фрейнда в подушечку стопы, модели компрессионного повреждения нерва (спинномозгового/седалищного) и все модели невропатической боли.

Боль включает в себя ноцицептивную боль (включая соматическую и висцеральную), невропатическую/нейрогенную боль (среди прочего дегенеративную, вызванную высоким давлением, воспалительную, вызванную инфекцией), симпатическую боль, воспалительную боль, ишемическую боль и боль при приступе неконтролируемой боли, аллодинию, гипералгезию, гиперестезию, дизестезию, парестезия, гиперпатия, фантомную боль в ампутированной конечности, психогенную боль, болезненную анестезию, невралгию, неврит, боль при злокачественной опухоли, ангинальную боль и/или идиопатическую боль, и комплексные региональные болевые синдромы I, II, комплексный региональный болевой синдром II. Данные термины определены Международной ассоциацией по изучению боли и не являются взаимоисключающими.

Ноцицептивная боль вызывается специализированными сенсорными ноцицепторами в периферических нервах в ответ на болевые раздражители, переводя болевые раздражители в потенциалы действия. Ноцицепторы, как правило, на А-5 и С волокнах, находятся на свободных нервных окончаниях, которые заканчиваются непосредственно под кожей, в сухожилиях, суставах и в органах организма. Нейроны задних корешков спинного мозга (DRG) обеспечивают соединения между периферией и спинным мозгом. Сигнал переводится через спинной мозг к стволу мозга и таламическим участкам и, наконец, к коре головного мозга, где он обычно (но не всегда) вызывает чувство боли. Ноцицептивная боль может происходить вследствие множества химических, температурных, биологических (например, воспалительных) или механических факторов, которые характеризуются потенциалом раздражать или повреждать ткань организма, которые, как правило, выше определенного минимального порога по интенсивности, необходимой для того, чтобы вызвать ноцицептивную активность в ноцицепторах.

Воспалительная боль означает боль, связанную с воспалением. Воспаление является иммунным ответом организма на инфекцию, раздражение и/или повреждение. Воспаление характеризуется покраснением, отеком и повышением температуры. Вызывающий боль стимул часто вызывает воспалительную реакцию, которая сама по себе может способствовать ощущению боли.

Невропатическая боль, как правило, происходит вследствие ненормального функционирования периферической или центральной нервной системы, приводящей к возникновению периферической или связанной с ЦНС невропатической болью, соответственно. Невропатическая боль определена Международной ассоциацией по изучению боли как боль, инициированная или вызванная первичным поражением или дисфункцией нервной системы. Невропатическая боль часто подразумевает реальное повреждение нервной системы, особенно при хронических случаях. Воспалительная ноцицептивная боль, как правило, происходит вследствие повреждения ткани и вытекающего из этого воспалительного процесса. Невропатическая боль может сохраняться намного дольше (например, месяцы или годы) после очевидного заживлению любого наблюдаемого повреждения тканей.

При невропатической боли чувствительность, передающаяся от области воздействия, может стать аномальными и нейтральными раздражителями (например, температурный, прикосновение/давление), которые не могли бы вызвать боль в норме, но вызывают ее (то есть, аллодиния) или болевые раздражители могут вызывать ненормально увеличенное восприятие боли (то есть, гипералгезия) в ответ на нормальный раздражитель, вызывающий боль. Кроме того, ощущения, схожие с покалыванием при воздействии электричества или при ударе током или «покалыванием в конечностях при онемении» (то есть, парестезии) и/или ощущения, характеризующиеся неприятными свойствами (то есть, дизестезии) могут вызваться нормальными раздражителями. Приступ неконтролируемой боли представляет собой аггравацию уже существующей хронической боли. Гиперпатия представляет собой болевой синдром, являющийся следствием ненормальной болевой реакции на раздражитель. Раздражитель в большинстве случаев является повторяющимся с повышенным порогом болевой чувствительности, который можно расценить как наименьшее ощущение боли, которую пациент может признать в качестве боли.

Примеры невропатической боли включают в себя тактильную аллодинию (например, вызванную после повреждения нерва), невралгию (например, постгерпетическую (или после опоясывающего лишая) невралгию, невралгию тройничного нерва), симпатическую рефлекторную дистрофию/каузалгию (травматическое повреждение нерва), компоненты боли при злокачественным новообразованиях (например, боль вследствие самого злокачественного новообразования или связанных в ним состояний, таких как воспаление, или вследствие лечения, такого как химиотерапия, хирургического вмешательства или лучевой терапии), фантомную боль в ампутированной конечности, нейропатию сдавления (например, синдром запястного канала) и нейропатии, такие как периферические нейропатии (например, вследствие диабета, HIV, хронического приема алкоголя, воздействия других токсинов (включая множество химиотерапии), витаминные недостаточности и большое множество других медицинских состояний). Невропатическая боль включает в себя боль, вызванную проявлением патологического функционирования нервной системы после повреждения нерва из-за различных причин, например, хирургической операции, ранения, опоясывающего лишая, диабетической нейропатии, ампутации ног или рук, злокачественного новообразования и тому подобного. Медицинские состояния, связанные с невропатической болью, включают в себя травматическое повреждение нерва, инсульт, рас сеянный склероз, сирингомиелию, повреждение спинного мозга и злокачественное новообразование.

При некоторых состояниях боль, по-видимому, вызвана сложной совокупностью ноцицептивных и невропатических факторов. Например, хроническая боль часто включает в себя воспалительную ноцицептивную боль или невропатическую боль или смесь обеих. Исходная дисфункция нервной системы или повреждение могут запустить невральное высвобождение воспалительных медиаторов и последующее невропатическое воспаление. Например, мигрени могут представлять собой совокупность невропатической и ноцицептивная боли. Кроме того, миофасциальная боль, вероятно, вторична в отношении ноцицептивного импульса от мышц, но ненормальная мышечная активность может быть результатом невропатических состояний.

Симптомы боли, испытываемые пациентом, могут сопровождаться или не сопровождаться признаками боли, распознаваемыми клиницистами. С другой стороны боль может проявляться клиническими признаками, не осознаваемыми пациентом как симптомы. Симптомы боли могут включать в себя реакцию на боль, например, в виде изменения в поведении. Иллюстративные реакции на боль могут включать в себя сознательное избегание болезненного раздражителя, защитную реакцию, направленную на защиту организма или части организма от болезненного раздражителя, реакции, направленные на минимизацию боли и способствующие излечению, передачу информации о боли и физиологические реакции. Коммуникативные реакции могут включать озвучивание боли или изменения выражения лица или позы. Физиологические реакции включают в себя реакции, опосредованные вегетативной нервной системой или эндокринной системой, например, повышенным выбросом адреналина и норадреналина, повышенной выработкой глюкагона и/или гормонов и/или кортикостероидов. Физиологические изменения, которые можно отслеживать, включают в себя двигательные эффекты, такие как подергивание, судороги, паралич, расширенные зрачки, тремор, гиперестезию и/или измененные рефлексы. Физиологические сердечно-сосудистые реакции на боль могут включать в себя изменения кровяного давления, изменения частоты и качества пульса, сниженное периферическое кровообращение, цианоз и гиперемию. Повышенная напряженность мышц (тонус) также является клиническим проявлением боли. Изменения в функционировании мозга в ответ на боль можно наблюдать посредством различных техник, таких как электроэнцефалография (ЭЭГ), электромиография лобных мышц (FEMG) или позитронно-эмиссионная томография (PET).

Другой симптом боли может представлять собой отраженную боль, которая является ощущением боли, сосредоточенной в месте, соседнем или на удалении от действительного места вызывающего боль раздражителя. Часто отраженная боль возникает, когда нерв сдавлен или поврежден в месте или поблизости от места ее возникновения. При таком обстоятельстве, чувство боли будет, как правило, ощущаться в области, в которой функционирует нерв, даже при том, что повреждение возникает в другом месте. Типичный пример имеет место при образовании грыжи в межпозвоночном диске, в котором корень нерва, являющийся продолжением спинного мозга, сжат соседним веществом диска. Хотя боль может возникнуть в результате повреждения самого диска, боль также будет чувствоваться в области, иннервируемой сдавленным нервом (например, бедро, колено или стопа).

Ноцицептиная активность является симптомом ноцицептивной боли. Ноцицептиная активность, даже в отсутствие сознательно воспринимаемой боли, может вызвать сгибательные рефлексы и множество вегетативных реакций, таких как бледность, обильное потоотделение, брадикардия, гипотония, дурнота, тошнота и слабость.

Средства согласно изобретению также применимы для лечения или осуществления профилактики злокачественных новообразований. Src является онкогеном, присутствующим в организме человека, и множество злокачественных новообразований ассоциированы с его повышенной экспрессией, мутацией или активностью. Злокачественные новообразования включают в себя солидные опухоли, такие как рак молочной железы, толстой кишки, легких, простаты, поджелудочной железы, головы и шеи, среди прочего. Src также может стать ненормально активным вследствие мутаций в других белках, которые его регулируют. Настоящие способы особенно пригодны для типов злокачественных новообразований, ассоциированных с повышенной экспрессией Src на уровне мРНК или белка, и, в особенности, злокачественных новообразований, в которых экспрессия Src увеличена относительно сопоставимых с тканью нераковых тканей у того же самого пациента. В некоторых способах, проверяют экспрессию Src в злокачественном новообразовании, необязательно, в сравнении с экспрессией в ткани, сопоставимой с нераковым образцом от того же самого пациента. Однако, проверка уровня экспрессии не требуется. Детектируемая активность киназы Src и, в особенности, повышенная активность относительно ткани, сопоставимой с нераковым контым образцом, дает представление о том, что злокачественное новообразование поддается лечению способами согласно изобретению. Увеличенное количество копий гена Src в злокачественной клетке может дать альтернативное или дополнительное представление о том, что can злокачественное новообразование поддается лечению. Увеличение количества копий можно определить, применяя, например, блоттинг по Саузерну, количественную ПЦР, флуоресцентную гибридизацию in situ распределения метафазной хромосомы и другие цитогенетические методики. Наличие мутаций в Src, ассоциированные с онкогенностью, также являются признаком злокачественного новообразования, поддающегося лечению способами согласно изобретению.

IX. Способы лечения/профилактики

а) Способы лечения

Средства, необязательно присоединенные к участвующим в интернализации пептидам, вводят пациенту, с признаком(ами) и/или симптомом(ами) заболевания или нарушения, описанного выше, по терапевтически эффективной схеме. Такая схема означает количество, частоту и способ введения, эффективный для лечения, уменьшения или ингибирования дальнейшего ухудшения, по меньшей мере, одного признака или симптома заболевания в группе пациентов (или моделях на животных), страдающей от заболевания или состояния, подвергающегося лечению, относительно контрольной группы пациентов (или моделей на животных), страдающей от того же самого заболевания или состояния, которое не подвергают лечению средством согласно изобретению. Схему также считают терапевтически эффективной, если у отдельного получавшего лечение пациента достигается результат, более благоприятный, чем средний результат в контрольной группе сопоставимых пациентов, не получавших лечения способами согласно изобретению. Количество доз зависит от заболевания или нарушения, которое необходимо лечить. Для острых или эпизодических состояний, таких как инсульт, травматическое повреждение, тревожность, острая боль или эпилепсия, часто достаточно однократной дозы, по меньшей мере, за один эпизод заболевания. Для хронических состояний, таких как нейродегенеративные заболевания, например, болезнь Альцгеймера или болезнь Паркинсона, злокачественное новообразование или хроническая боль, предписаны многократные дозы, и иногда пожизненное лечение.

Для пациентов, страдающих от инсульта или другого ишемического состояния в ЦНС, средство вводят по схеме, включающей количество, частоту и способ введения, эффективные для снижения повреждающего воздействия инсульта или другого ишемического состояния. Когда состояние, требующее лечение, представляет собой инсульт, исход можно определить по объему инфаркта или индексу инвалидизации, и дозировку считают терапевтически эффективной, если отдельный получающий лечение пациент демонстрирует нарушение жизнедеятельности два или менее по шкале Ранкина и 75 или более по шкале Бартеля, или если группа получающих лечение пациентов демонстрирует значительно улучшенное (то есть, меньшее нарушение жизнедеятельности) распределение оценок по шкале инвалидизации, чем сравниваемая не получавшая лечения группа, смотри Lees et al., N Engl J Med 2006; 354:588-600. Однократной дозы средства часто достаточно для лечения инсульта,

Средства согласно изобретению также применимы для увеличения окон эффективности и безопасности реперфузии, или увеличить безопасность или эффективность реперфузии в данное время. Это особенно применимо при лечении ишемического инсульта в сочетании с другим средством, которое разрушает сгусток, таким как тканевой активатор плазминогена, где применимое окно для введения составляет только 0-4,5 часа после инсульта из-за увеличения частоты геморрагических событий со временем. Средство согласно изобретению можно вводить, чтобы улучшить безопасность и/или эффективность средств, которые разрушают сгустки в головном мозге.

Обычно от 1 до 8 доз средства вводят для лечения злокачественного новообразования, но можно давать большее количество доз. Средство можно вводить ежедневно, дважды в неделю, еженедельно, раз в две недели, ежемесячно или через некоторые другие интервалы, в зависимости, например, от периода полувыведения средства в течение 1 недели, 2 недель, 4 недель, 8 недель, 3-6 месяцев или дольше. Повторные курсы также возможны как хроническое введение.

Лечение злокачественного новообразования средством можно сочетать с общепринятыми способами лечения, например, таксолом (паклитакселом) или его производными, соединениями платины, такими как карбоплатин или цисплатин, антрациклинами, такими как доксорубицин, алкилирующими средствами, такими как циклофосфамид, антиметаболитами, такими как 5-фторурацил, или этопозидом. Средство согласно изобретению можно вводить в сочетании с двумя, тремя или более из данных средств по стандартной химиотерапевтической схеме лечения, например, таксол и карбоплатин, например, рака молочной железы и яичников. Другие средства для комбинации включают в себя биологические вещества, такие как моноклональные антитела, включая герцептин™ против антигена HER2, авастин™ против VEGF или антитела к рецетору EGF, а также низкомолекулярные соединение анти-ангиогенные лекарственные средства или лекарственные средства антагонисты рецептора EGF. Кроме того, средства можно использовать совместно с лучевой терапией или хирургическими операциями.

Лечение средством согласно изобретению период времени медианной выживаемости без прогрессирования или общей выживаемости пациентов с злокачественным новообразованием, по меньшей мере, на 30% или 40%, но предпочтительно 50%, от 60% до 70% или даже 100% или дольше, по сравнению с сопоставимыми схемами лечения, но без средства. Дополнительно или альтернативно, лечение, включающей в себя средство, может увеличивать процент полной ремиссии, процент частичной ремиссии или процент объективного ответа (полный+частичный) у пациента со злокачественным новообразованием, особенно, при рецидивирующем или не поддающемся лечению, по меньшей мере, на 30% или 40%, но, предпочтительно, на предпочтительно 50%, от 60% до 70% или даже 100% по сравнению с такой же схемой лечения без синтетического антитела synbody. Необязательно, лечение может ингибировать рост опухоли, инвазию, метастазирование или ангиогенез.

Типично, при клинических испытаниях {например, испытание II фазы, II/III фазы или III фазы), увеличение медианной выживаемости без прогрессирования и/или процент ответа у пациентов, получавших химиотерапию плюс средство согласно изобретению относительно контрольной группы пациентов, получавших только химиотерапия (или плюс плацебо) является статистически значимым при уровне р=0,05 или 0,01. Процент полной и частичной ремиссии определяют по объективным критериям, общеупотребительными в клинических исследованиях в отношении злокачественного новообразования, например, как перечислено или одобрено National Злокачественное новообразование Institute и/или Food and Drug Administration.

Воздействия средства на боль у людей можно оценить, применяя множество тестов. Большое количество опросных листов и шкал было разработано, чтобы оценить боль у пациента, применяя различные способы. Боль можно оценить по одному показателю (только интенсивность), или применяя несколько показателей (продолжительность и интенсивность). Применимые шкалы для оценки выраженности боли включают в себя: визуально-аналоговую шкала, опросный лист по Мак-Гиллу и дескрипторная дифференциальная шкала (смотри J. Rheumatol. 9 (5): 768-9. PMID 6184474. Melzack. (1975) Pain 1 (3): 277-99, Gracely (1988), Pain 35 (3): 279-88).

Чувствительность пациента к боли (болевой порог) можно измерить, применяя алгезиметр, такой как звуковой пальпометр, пальпометр по давлению, лазерный измеритель-алгезиметр нечувствительности к боли (IITC Life Sciences), алгезиметр исходного уровня (K-omKare Company), алгезиметр Björnström, который определяет чувствительность кожи к боли, или алгезиметр Боаса, который определяет чувствительность выше эпигастральной области. Примеры лекарственных средств, которые можно совместно вводить для лечения боли, включают в себя НСПВП, ингибиторы СОХ 2, ингибиторы СОХ-3, ингибиторы iNOS, антагонисты рецептора PAR2, нейролептические средства, опиоиды, агонисты N-ацетилхолинового рецептора, глициновые антагонисты, антагонисты ванилоидного рецептора, нейрокининовые антагонисты, антагонисты генетически родственного кальцитонину пептида и ингибирующие циклооскигеназу (СОХ) доноры оксида азота (CINOD). Другие снимающие боль лекарственные средства включают в себя кодеин, викодин, морфин, демерол, перкоцет, дарвон и дарвоцет, конотоксины и симлин.

b) Способы профилактики

Изобретение также относится к способам и композициям для профилактики нарушения у субъекта, находящегося в группе риска возникновения такого нарушения. Обычно такой субъект характеризуется повышенным риском возникновения нарушения (например, состояния, расстройства, нарушения или заболевания), относительно контрольной группы. Контрольная группа, например, может содержать одного или нескольких индивидуумов, случайно выбранных из общей популяции (например, сопоставимых по возрасту, полу, расовой принадлежности и/или этнической принадлежности), у которой не диагностировали или не наблюдали в семейном анамнезе нарушения. Субъекта можно рассматривать как находящего в группе риска возникновения нарушения, если фактор риска, ассоциированный с данным нарушением, как обнаружено, связан с данным субъектом. Фактор риска может включать в себя любую активность, признак, случай или свойство, связанное с данным нарушением, например, при статистических или эпидемиологических исследованиях популяции субъектов. Субъекта можно, таким образом, отнести к группе риска возникновения нарушения, даже если исследования, определяющие лежащие в основе факторы риска специальным образом не включали субъекта. Например, субъект, подвергающийся хирургической операции на сердце, находится в группе риска возникновения инсульта, поскольку частота возникновения транзиторной церебральной ишемической атаки увеличена в группе субъектов, которые подвергались хирургической операции на сердце по сравнению с группой, которая не подвергалась операции на сердце.

Другие обычные факторы риска возникновения инсульта включают в себя возраст, семейный анамнез, пол, предшествующее число случаев инсульта, транзиторный ишемический приступ или сердечный приступ, высокое кровяное давление, курение, диабет, заболевание сонной или другой артерии, фибрилляция предсердий, другие заболевания сердца, такие как заболевание сердца, сердечная недостаточность, дилятационная кардиомиопатия, заболевание клапана сердца и/или врожденные пороки сердца; высокие уровни холестерина в крови и диеты с высоким содержанием насыщенных жиров, транс-жиров или холестерина.

Факторы риска развития злокачественного новообразования включают в себя генетическую предрасположенность к раку, пациентов, которые подвергались воздействию канцерогенов, таких как радиация или токсины, и пациентов, которые подвергались ранее лечению от рака и находятся в группе риска рецидива.

Факторы риска возникновения боли включают в себя перенесенную хирургическую операцию, участие в боевых действиях или других аварийных ситуациях или подверженность заболеваниям, ассоциированным с тяжелой или хронической болью, таких как диабет и злокачественное новообразование.

Средства, необязательно связанные с участвующим в интернализации пептидом, вводят пациентам в группе риска возникновения заболевания, но еще не страдающим от заболевания по профилактически эффективной схеме, означающей количество, частоту и способ введения, достаточный для предотвращения, замедления или ингибирования развития, по меньшей мере, одного признака или симптома заболевания в группе пациентов (или моделях на животных), находящихся в группе риска возникновения заболевания относительно подвергавшихся лечению средством по сравнению с контрольной группы пациентов (или моделей на животных), находящихся в группе риска возникновения заболевания, которые не подвергались лечению химерным средством согласно изобретению. Количество также считают профилактически эффективным, если отдельный получающий лечение пациент достигает боле благоприятного результата, чем среднее значение результата в контрольной группе сопоставимых пациентов, но не получавших лечение способами согласно изобретению. Профилактически эффективная схема лечения включает в себя введение профилактически эффективной дозы с частотой и способом введения, необходимыми для достижения заданной цели. Для профилактики инсульта или другого острого начала заболевания и нарушения у пациента с предстоящим риском развития заболевания (например, пациент, подвергающийся хирургической операции на сердце), однократной дозы средства обычно достаточно. Для пациентов более длительно находящихся в группе риска, например, риск возникновения злокачественного новообразования после воздействия канцерогена, может быть предписано многократное дозирование.

X. Фармацевтические композиции, дозировки и способы введения

Средства согласно изобретению, необязательно связанные с участвующими в интернализации пептидами, можно вводить в виде фармацевтической композиции. Фармацевтические композиции, как правило, производят в условиях GMP. Фармацевтические композиции можно предоставить в стандартной лекарственной форме (то есть, доза для однократного введения). Фармацевтические композиции можно производить посредством общепринятых способов смешивания, растворения, гранулирования, получения в виде драже, растирания в порошок, превращения в эмульсию, инкапсулирования, захватывания или лиофилизирования. Например, лиофилизированные средства можно использовать в препаратах и композициях, описанных ниже.

Фармацевтические композиции можно приготовить общепринятым способом, применяя один или несколько физиологически приемлемые носителей, растворителей, наполнителей или вспомогательных средств, которые облегчают превращение химерных средств в препараты, которые можно использовать фармацевтически. Соответствующий препарат зависит от выбранного способа введения.

Введение может быть парентеральным, внутривенным, пероральным, подкожным, внутриартериальным, внутричерепным, внутриоболочечным, интраперитонеальным, местным, интраназальным, введением ингаляцией, трансдермальным, например, через пластырь, или внутримышечным. Предпочтительным является внутривенное введение.

Фармацевтические композиции для парентеральное введения предпочтительно являются стерильными и по существу изотоничными. Для инъекций средства можно приготовить в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический раствор, или ацетатном буфере (чтобы уменьшить дискомфорт в месте инъекции, раствор может содержать составляющие средства, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства.

Альтернативно, средства могут находиться в виде порошка для разбавления подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед применением.

Средства согласно изобретению можно также вводить в сочетании с другими средствами, которые увеличивают проходимость средств согласно изобретению через гематоэнцефалитический барьер, такими как маннит, Tween® или DMSO.

Для чрезслизистого введения, смачивающие вещества, подходящие для барьера, через который необходимо проникнуть, применяют в препарате. Данные способ введения можно использовать для доставки соединений в полость носа или для подъязычного введения.

Для перорального введения средства можно приготовить с фармацевтически приемлемыми носителями в виде таблеток, пилюлей, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п., для перорального приема внутрь пациентом, которого необходимо лечить. Для твердых препаратов для перорального введения, таких как, например, порошки, капсулы и таблетки, подходящие наполнители включают в себя наполнители, такие как сахара, такие как лактоза, сахароза, маннит и сорбит; препараты целлюлозы, такие как кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия и/или поливинилпирролидон (PVP); гранулирующие средства; и связывающие средства. При желании, можно добавлять разрыхлитель, такой как перекрестносшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту или ее соль, такую как альгинат натрия. При желании, твердые лекарственные формы можно покрыть сахарной оболочкой или кишечнорастворимой оболочкой, применяя стандартные методики. Для жидких препаратов для перорального введения, таких как, например, суспензии, эликсиры и растворы, подходящие носители, наполнители или растворители включают в себя воду, гликоли, масла, спирты. Дополнительно можно добавлять ароматизаторы, консерванты, красители и т.п.

В дополнение к ранее описанным препаратам средства можно также приготовить в виде депо-препаратов. Такие препараты длительного действия можно вводить имплантацией(например подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекцией. Таким образом, например, соединения можно приготовить с подходящим полимерными или гидрофобными веществами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами или в виде умеренно растворимых производных, например, умеренно растворимых солей.

Альтернативно можно применять другие фармацевтические системы доставки. Можно использовать липосомы и эмульсии для доставки химерных средств. Определенные органические растворители, такие как диметилсульфоксид, также можно применять, хотя обычно, за счет большей токсичности. Дополнительно соединения можно доставлять, применяя систему замедленного высвобождения, такую как полупроницаемые матриксы твердых полимеров, содержащие терапевтическое средство.

Капсулы замедленного высвобождения в зависимости от их химической природы могут высвобождать химерные средства в течение нескольких недель вплоть до более 100 дней. В зависимости от химической природы и биологической стабильности терапевтического реагента, можно применять дополнительные стратегии для стабилизации белка.

Поскольку средства согласно изобретению могут содержать заряженные боковые цепи или концы, их можно включать в состав любых описанных выше препаратов в качестве свободных кислот или оснований или в виде фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемые соли представляют собой такие соли, которые по существу сохраняют биологическую активность свободных оснований и которые получают при реакции с неорганическими кислотами. Фармацевтические соли имеют склонность быть более растворимыми в водных и других протонных растворителях, чем соответствующие формы свободных оснований.

Количество средства, которое необходимо вводить, зависит от пациента, получающего лечение, заболевания или нарушения, является ли лечение терапевтическим или профилактическим по природе, от веса пациента, тяжести заболевания, способа введения и решения лечащего врача. Лечение можно периодически повторять, по мере того как определяются симптомы или даже когда они не определяются. Лечение можно провести в отдельности или в сочетании с другими лекарственными средствами.

Эффективная доза настоящих средств может оказать благотворное действие не вызывая существенной токсичности. Токсичность средств можно определить стандартными фармацевтическими способами в культурах клеток или экспериментальных животных, например, определяя LD50 (дозу, летальную для 50% выборки) или LD100 (дозу, летальную для 100% выборки). Соотношение доз между токсичностью и терапевтическим эффектом представляет собой терапевтический индекс. Средства, например, пептиды или пептидомиметики, проявляющие высокие терапевтические индексы являются предпочтительными (смотри, например, Fingi et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1).

Химерные средства, содержащие участвующий в интернализации пептид, связанный со средством, можно использовать в той же самой или в меньшей дозировке в пересчете на моли, как и средство в отдельности, и их можно вводить таким же самым способом, что и фармакологическое средство в отдельности, и для лечения того же самого заболевания(ий), что и фармакологическое средство в отдельности.

Подходящие дозировки средств, необязательно связанных с участвующим в интернализации пептидом, обычно составляют менее чем 25 мг/кг. Дозировки иногда находятся в диапазоне от 10-4 мг/кг до 25 мг/кг, например, от 0,1 или 0,5 мг/кг до 1, 50 или 10 мг/кг. Общую дозу для пациента можно рассчитать, умножая дозу на кг массы тела пациента в кг. Например, общая доза для пациента весом 75 кг можно рассчитать, умножая указанные выше дозы на 75.

XII. Способы скрининга

1. Средства для проведения скрининга

Средства можно первоначально проверять при скрининге in vitro в отношении требуемой связывающей или ингибирующей активности. Средства могут включать в себя пептиды ND2 или их пептидомиметики, как описано выше. Средства, которые будут участвовать в скрининге, можно также получать из природных источников, таких как, например, морские микроорганизмы, водоросли, растения, грибы, или из библиотек синтетических пептидов или других соединений. Комбинаторные библиотеки можно создать для множества типов соединений, которые можно синтезировать пошаговым способом. Такие соединения включают в себя полипептиды, миметики с бета-изгибом, полисахариды, фосфолипиды, гормоны, простагландины, стероиды, ароматические соединения, гетероциклические соединения, бензодиазепины, олигомерные N-замещенные глицины и олигокарбаматы. Большие комбинаторные библиотеки соединений можно сконструировать способом кодируемых синтетических библиотек (ESL), описанным в Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 и Scripps, WO 95/30642 (каждая из включена в качестве ссылки во всех отношениях). Пептидные библиотеки можно также получить способами фагового дисплея. Смотри, например, Devlin, WO 91/18980.

2. In vitro анализы

Средства можно первоначально проверять при скрининге в отношении требуемой связывающей активности, например, способности связываться с Src, или пептидом Src, включающим в себя остатки 40-49 Src. Альтернативно или дополнительно, средство можно проверить при скрининге на способность конкурировать с ND2 или пептидом ND2, как описано выше (например, пептидом, состоящим из остатков 310-321 ND2) за способность в отношении связывания с Src или пептидом, включающим в себя его остатки 40-49 или 40-58. Связывание можно оценить способами.ELISA, флуоресцентной поляризацией или Вестерн-блоттингом среди прочего. В некоторых форматах од ин компонент такого анализы связывания иммобилизируется. Возможно несколько форматов, как описано в примерах. Способность средства связываться с Src и/или ингибировать связывание ND2 или и пептида ND2 с Src является показателем того, что средство характеризуется фармакологической активностью, применимой при лечении неврологического заболевания, боли или злокачественного новообразования. Средства можно затем дополнительно проверять при скрининге во множестве моделей на животных, как дополнительно описано ниже.

Средства можно проверять при скрининге в отношении ингибирующей активности против киназы Src. Наборы для проведения киназного анализа являются коммерчески доступными. Src, как правило, в рекомбинантно экспрессированном виде, смешивают с пептидом, содержащим пригодный для фосфорилирования остаток и метку позволяющую осуществить иммобилизацию в присутствие АТФ, и киназным буфером. Количество фосфорилированного пептида, которое является показателем киназной активности, можно определить, применяя антитело, специфичное для фосфорилированного пептида. Такой анализ проводят в присутствии и в отсутствие тестируемого средства, чтобы определить, средство ли снижает фосфорилирование и при проявлении активности Src.

3. Модели инсульта на животных

Средства можно тестировать с различных моделях инсульта на животных. В одной такой модели взрослых самцов крыс Sprague-Dawley подвергают временной окклюзии средней мозговой артерии (МСАО) в течение 90 минут способом интралюминального сшивания. Животные голодают в течение ночи и получают инъекцию сульфата атропина (0,5 мг/кг IP). Через 10 минут делают анестезию. Крыс перорально интубируют, механически создают обмен воздуха и вызывают паралич при помощи панкурония бромида (0,6 мг/кг IV). Температуру тела поддерживают при 36,5-37,5°С с использованием нагревательной лампы. Полиэтиленовые катетеры в бедренной артерии и вене применяют для постоянной регистрации кровяного давления и для измерений газа и рН в образцах крови. Временной МСАО добиваются в течение 90 мин введением покрытой поли-L-лизином моноволоконной нейлоновой нити для сшивания 3-0 (Harvard Apparatus) в вилизиев круг через внутреннюю сонную артерию, эффективно перекрывая среднюю мозговую артерию. Это приводит к обширному инфаркту, охватывающему кору головного мозга и базальные ядра. Животные получают либо тестируемое средство, либо отрицательный или положительный контроль. Введение может происходить или до, или вплоть до часа после появления ишемии. Отрицательный контроль может представлять собой носитель. Положительный контроль может представлять собой пептид Tat-NR2B9c, YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO:6), который, как ранее было показано, является эффективным. После введения средства животным определяют объем инфаркта и/или индекс инвалидизации. Объемы инфаркта обычно определяют через 24 ч после введения средства, но можно определять в более поздний период времени, такой как 3, 7, 14 или 60 дней. Индекс инвалидизации можно отслеживать в динамике, например, через 2 ч после обработки, 24 ч после введения средства, одну неделю и один месяц после введения средства. Средства, проявляющие статистически значимое снижение объема инфаркта и/или индекса инвалидизации по сравнению с контрольными животными, не получавшими средства, определяют в качестве характеризующихся активностью, применимой для осуществления на практике способов согласно изобретению.

Схожие эксперименты можно проводить на животных, подверженных постоянной ишемии. Постоянную ишемию пиального сосуда средней мозговой артерии можно провести, как описано у Forder et al., Am J Physiol Heart CircPhysiol 288:H1989-H1996 (2005). Вкратце, правую ЕСА канюлируют при помощи полиэтиленовой системы РЕ 10 для внутривенных инфузий. Череп раскрывают посредством срединного разреза и краниальное окошко размером от 6- до 8- мм делают над правой соматосенсорной корой (2 мм сзади и 5 мм сбоку от темени). Пиальные артерии визуализируют, вводя маленькие болюсы (10-20 мкл) патентованного сине-фиолетового красителя для прижизненной окраски (10 ммоль/л; Sigma) в нормальном физиологическом растворе в ЕСА. Одинаковые три пиальные артериолярные ответвления МСА электрически прижигают и инъекцию красителя повторяют, чтобы убедиться в прекращение потока через прижженные артериолы. Затем разрез зашивают и животное возвращают в его клетку и предоставляют свободный доступ к пище и воде. Данная модель постоянной ишемии приводит к высоко воспроизводимым небольшим инфарктам, ограниченным корой, находящейся под концевыми пиальными артериями.

4. Модели боли на животных

Ноцицептивные тесты у млекопитающих (например, грызунов) в отношении боли включают в себя тест подергивания хвостом (опосредованный спинным мозгом ноцицептивный рефлекс) (D’Amour et al. (1941), J. Pharmacol. Exp. Ther. 72: 74-79), тест горячей пластинки, тест Рандал-Селито (Swingled al. (1971), Proc. Soc. exp. Biol. Med. 137: 536-538) и тест сдавливания хвоста. Такие тесты можно использовать, чтобы оценить ноцицептивный порог различных типов болевы х раздражителей, так ой как температурный порог (тест отдергивания хвоста, тест горячей пластинки, тест отдергивания лапы Харгрейвса и при кратковременном погружении хвоста или задней лапы в горячую воду); или тактильный порог для точечных раздражителей, например, при тесте фон Фрея для теста на аллодинию, J Neurosci Способы. 1999 Mar 1; 87(2): 185-93. Динамическую аллодинию можно оценить при помощи легкого поглаживания по поверхности подошвы задней лапы ватной палочкой, где динамическая аллодиния, как считают, присутствует, если животные реагируют на ватный раздражитель через 8 сек от начала поглаживания. Болевую реакцию на вредные химические средства можно определить, например, отслеживая брюшные корчи после интраперитонеальной инъекции разбавленной уксусной кислоты и тест вызывающего отвращения питья при добавлении капсаицина в питьевую воду (который можно использовать для оценки тригеминальной ноцицепции).

Тесты в отношении воспалительной боли и повышенной чувствительности включают в себя тест введения формалина в лапу (Tjolsenet al. (1992), Pain 51: 5-17), тест введения полного адъюванта Фрейнда в лапу (CFA), тест вызванной формалином лицевой боли (Claveloue/ al. (1989), Neurosci. Lett. 103: 349-353) и тест при введении в лапу веществ, таких как каррагинана, капсаицина или брадикинина. Относящиеся к артриту состояния можно симулировать различными моделями, включая инъекцию средств, таких как каррагинан, мочевая кислота или горчичное масло, или адъюванта в различные суставы. Висцеральную боль можно моделировать посредством интраперитонеальной инъекции веществ, таких как брадикинин, ацетилхолин, уксусная кислота или фенилхинин. Модель индуцированной стрептозоцином (STZ) диабетической невропатии вызывает воспроизводимую механическую аллодинию через 3 недели (Chen и Pan, J Newophysiol 87: 2726-2733, 2002).

Тесты в отношении невропатической боли, являющейся результатом повреждения периферического нерва, включают в себя хроническую компрессию (например, модель лигирования седалищного нерва Bennet и Xie, Pain 33: 87-107); частичное лигирование нерва (Seltzer et al., J Basic Clin. Physiol. Pharmacol. 1991), перерезание или лигирование спинномозгового нерва (Lombard et al.. Pain. 1979 6:163-74; Kirn & Chung, Pain. 1992;50:355-63), крионейролизис (Deleoet al., Pain. 1994; 56:9-16), ишемию седалищного нерва (Kuperset al., Pain. 1998; 76:45-59). Общепринятый тест представляет собой тактильный тест на аллодинию (Chaplanet al. (1994) J. Neurosci. Meth. 53: 55-63). Индуцируемая таксолом невропатическая боль не содержит воспалительный компонент.Модели, которые являются специфичными для определенных периферических невропатических состояний, включают в себя модели невралгии тройничного нерва на животных (Vos and Maciewicz, J Neurosci. 1994; 14:2708-23), диабетической невропатии (Bwchiekr al., Диабет. 1985; 34:1210-3) и винкристиновой невропатии (Aleyet al., Neuroscience. 1996; 73:259-65). Модель невромы (Wall et al., Pain. 1979 Oct; 7:103-ll) может отражать фантомную боль, являющуюся результатом ампутации конечности.

Модели боли на животных, являющейся результатом поражения спинного мозга, включают в себя перерезание или частичное перерезание спинного мозга (Levitt & Levitt, Pain. 1981; 10:129-47), модель вызванной облучением ишемии (Нао et al. NeurosciLett. 1991 8; 128:105-8.), модель эксайтотоксичности, применяющая инъекцию квисквалата в спинномозговой канал (Yezeierski& Park, NeurosciLett. 1993 9; 1571):115-9) и модель контузии (Siddall et al., Neuroreport 1995; 6:1241-4).

5. Модели эпилепсии на животных

Большое количество моделей на животных для различных эпилептических состояний хорошо охарактеризовано. Смотри, например. Models of Seizures and Epilepsy (ed. Pitkänenet al., ISBN: 978-0-12-088554-1; Elsevier Inc., 2006), включенную в качестве ссылки в полном объеме. Животные могут меняться от дрозофилы до приматов, у которых эпилепсию вызывают множеством способов, включающих в себя введение химических веществ или генетический скрининг видов, у которых спонтанно возникли конвульсии и/или эпилепсия. Примеры моделей на животных включают в себя вызванные повышенной температурой конвульсии у крыс, которые имитируют фебрильные судороги, мыши-мутанты, такие как totterer, stargazer, lethargic, и мыши с медленноволновой эпилепсией (SWE), которые обладают характеристиками, схожими с абсансными эпилепсиями человека, такими как кратковременная приостановка деятельности (то есть фиксация взгляда или пристальный взгляд).

Хорошо охарактеризованные модели на животных также были описаны для сложных парциальных припадков, наблюдаемых у пациентов с эпилепсией височной доли (TLE). Модели судорог от каиновой кислоты и пилокарпина (PILO) являются, вероятно, чаще всего изучаемыми моделями индуцируемой химическими веществами TLE на животных. Киндлинг, явление, посредством которого повторное, очаговое применение первоначально субконвульсивной электрической стимуляции, в конечном счете, приводит к парциальным и генерализованным конвульсивным судорогам, остается информативной моделью для TLE.

Кроме того, несколько генетически склонных к эпилепсии видов было описано в качестве моделей на животных для изучения светочувствительных и аудиогенных рефлекторных эпилепсии. Они включают в себя бабуина Papio papio, линию цыплят Fayoumi epileptic (FEpi), генетически склонную к эпилепсии крысу (GEPR) и мышей DBA/2.

Доступно множество способов для получения генерализованных тонических-клонических судорог или малого эпилептического припадка у животных, как некоторые генетические модели животных, которые или являются сильно склонными к судорогам, или страдают от спонтанных судорог. Ниже приводится несколько традиционных способов индукции таких типов судорог.

Конвульсивные судороги, характеризуемые тоническим разгибанием/сгибанием задней конечности, сопровождаемым клонической активностью, достоверно вызывают электрошоком максимальной силы, который остается популярным способом для быстрого скрининга нового противосудорожного лекарственные средства.

Пентилентетразол (PTZ), вероятно, является наиболее широко применяемым системно вводимым конвульсантом. Повторные инъекции PTZ можно вводить, чтобы получить тип химического киндлинга, который напоминает электрический киндлинг.В высокой дозе PTZ (обычно вводимый подкожно или внутривенно) гарантированно вызывает тонические-клонические конвульсии у крыс или мышей и представляет собой быстрый и эффективный показатель как предрасположенности к судорогам, так и при скрининге новых лекарственных средств. Вводимый системно в низкой дозе PTZ также можно использовать, чтобы вызвать подобные абсансу судороги.

Флуротил, шестифтористный простой эфир, представляет собой химическое средство для ингаляции, применяемое для индукции воспроизводимого паттерна конвульсивных судорог у грызунов. В данном способе, крыс или мышей помещают в воздухонепроницаемую камеру, в которой распространяется центрально вводимый флуротил; через 10-20 мин флуротил первоначально вызывает резкие мышечные движения, за которыми следуют клонические-тонические конвульсии. Наконец, другие экспериментальные модели на животных для генерализованного малого эпилептического припадка включают в себя таламическую стимуляцию, системное введение пенициллина кошке, обработку g-гидроксибутиратом (GHB) и интрацеребровентрикулярными опиатами, а также множество уже описанных генетических моделей на крысах (GAERS, WAG/Rij, SER) и мышах (stargazer, tottering, lethargic, мыши с медленноволновой эпилепсией, mocha и ducky).

Модели на животных, такие как модели, описанные выше как in vivo, так и т vitro, были чрезвычайно полезны для понимания основных механизмов явлений, связанных с парциальными или генерализованными судорогами, и являются стандартной методикой для оценки новых терапевтических средств. Sarkisian, Epilepsy & Behavior 2, 201-216 (2001), включенный в качестве ссылки в полном объеме.

6. Модели тревожности на животных

Тревожность можно вызвать, помещая животное, такое как крысу, в незнакомую окружающую среду и наблюдая за реакцией (например, пересечение линий координатной сетки или выбор открытых или закрытых проходов). Например, крыс можно тестировать на неогороженной арене, чтобы определить как состояние пробуждения, так и способность привыкать к новой окружающей среде, и оценивать по пересечению линий координатной сетки. Снижение пересечения указывает на пониженную тревожность Крыс можно также тестировать в лабиринте, чтобы оценить тревожность/эмоциональность у крыс.Подходящий лабиринт имеет 4 ответвления (два отрытых, два закрытых: 15 см шириной и 60 см длиной), отходящих от центральной платформы и поднятой на 1,5 м от пола. Крысы помещают в центр лабиринта и предоставляют свободу выбора войти в любое ответвление; оперативно определяемого как размещение головы и передних лап в ответвлении. Время, проведенное или в открытых, или в закрытых ответвлениях, регистрируют и оценивают по видеозаписям, сделанным одновременно с двух направлений (сверху и горизонтально). Увеличенное время, проведенное в открытых ответвлениях, указывает на пониженную тревожность, поскольку естественная склонность у крысы заключается в том, чтобы избегать открытых пространств.

7. Модели злокачественного новообразования на животных

Активность средств в отношении злокачественного новообразования можно проверить на иммунодефицитных мышах или крысах с пересаженными опухолями человека. Примерами иммунодефицитных линий мышей, которые можно использовать, являются безтимусные мыши, такие как CD-1 nude, Nu/Nu, Balb/c nude, NIH-III (NIH-bg-nu-xid BR); мыши с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью, такие как Fox Chase SCID (С.В-17 SCID), аутбредные Fox Chase SCID и SCID Beige; мыши с недостаточностью фермента RAG; а также безтимусные крысы. Эксперименты проводят, как описано, например, у Kim et al., Nature 362:841 (1992). Опухолевые клетки человека, как правило, растущие в полной среде DMEM, как правило, собирают в HBSS. Самкам иммунодефицитных, например, бестимусных мышей nude (в возрасте 4-6 недель) вводят п/к инъекцию, как правило, с 5×10⁶ клеток в 0,2 мл HBSS в область спины. Когда размер опухоли достигает 50-100 мм³, мышей случайным образом разбивают на группы и соответствующую схему средства вводят параллельно с контрольной схемой без средства. Размеры опухолей, как правило, определяют два раза в неделю, измеряя в двух направлениях [длина (а) и ширина (b)]. Объем опухоли вычисляют по формуле V=ab2/2 и выражают в качестве среднего значения объема опухоли ±SEM. Эффект средства можно определить по росту опухоли с течением времени, увеличению срока выживаемости мышей или увеличению процента мышей, выживших в течение заданного времени или неопределенного периода времени. Статистический анализ относительно контрольной группы можно провести, применяя, например, критерий Стьюдента.

8. Участвующие в интернализации пептиды

Пептид или другое средство можно проверить в отношении интернализации или транспортной активности на животном. Средство (такое как пептид Tat) можно, например, пометить и ввести инъекцией животному, такому как мышь. Например, подходящей является интраперитонеальная или внутривенная инъекция. Приблизительно через час после инъекции мышей умерщвляют, перфузируют фиксирующим раствором (3% параформальдегид, 0,25% глутаральдегид, 10% сахароза, 10 Ед./мл гепарина в физиологическом растворе). Затем удаляют головной мозг, замораживают и делают срезы. Срезы анализируют по флуоресценции, применяя конфокальный микроскоп.Активность интернализации определяют по флуоресценции, необязательно, по сравнению с положительным и отрицательным контролем. Подходящим положительным контролем является средство, содержащее стандартный пептид Tat. Подходящим отрицательным контролем является флуоресцентно меченное активное средство без Tat. Немеченый носитель также можно использовать в качестве отрицательного контроля.

Схожие эксперименты можно провести в клеточной культуре, чтобы проверить интернализацию пептидов или других средств (смотри US 20030050243). Вариант флуоресцентно меченного пептида Tat, необязательно связанного с активным пептидом, как применяют в культуре кортикальных нейронов. Захват определяют, применяя флуоресцентную микроскопию через несколько минут после применения. Увеличенный захват можно определить в сравнении с положительным и отрицательным контролями, как описано для экспериментов по захвату на животном.

Примеры

Пример №1: Идентификация последовательности ND2, ответственной за связывание с киназой Src

GST-слитые белки конструировали, применяя различные фрагменты ND2, и экспрессировали и очищали, применяя стандартные протоколы. Данные очищенные белки наносили в виде пятен на мембраны для исследования с биотинилированным пептидом Src 40-58 или скремблированным контрольным пептидом (sSrc 40-58). В основном, 1-10 мкг пептида или рекомбинантного белка наносили в виде пятен на нитроцеллюлозу и высушивали в течение ночи. Мембраны блокировали при помощи 5% молока в течение 1 ч при комнатной температуре, затем инкубировали с биотинилированными пептидами (~15 мкг/мл) в течение 2 часов, отмывали, применяя стандартные промывочные буферы. Связанную пробу определяли, применяя кратковременную инкубацию со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (SA-HRP), и стандартные детектирующие реагенты, преимущественно наборы для хемилюминесценции. На фигуре 1 В показан первый ряд конструкций, и фигура 1C представляет собой дот-блоттинг, который демонстрирует, что полноразмерный ND2 может связываться с Src 40-58, и что субфрагмент, называемый ND2.1 (АА239-321) может также связываться с Src 40-58. Дополнительные конструкции с GST изготовили, чтобы сузить важные области, связывающие Src (фигура 2А). Дот-блоттинг проводили с данными конструкциями и проверяли их способность связывать биотинилированный Src 40-58 (фигура 2В). ND2.1.4 (АА 289-321) был наиболее эффективным субфрагментом для связывания с Src 40-58, в то время как ни один из тестируемых фрагментов не связывался со скремблированным отрицательным контролем (B-sSRC 40-58), демонстрируя специфичность взаимодействия.

В качестве подтверждения проводили анализы ELISA, чтобы продемонстрировать данное связывание в другом формате исследования. GST-ND2, GST-ND2.1 или GST-ND2.1.4 наносили в лунки для ELISA, инкубируя при указанной концентрации в стандартных условиях. Лунки блокировали, применяя 5% молоко, и либо биотин-Src 40-58 (фигура 2С сверху), либо биотин-sSrc 40-58 (снизу) инкубировали в концентрации 6 мкМ. SA-HRP и стандартные детектирующие реагенты демонстрировали, что Src 40-58 может связываться с каждой из данных конструкций ND2 зависимым от концентрации способом.

Дополнительные конструкции GST изготовили, чтобы выявить аминокислотные последовательности в ND2.1.4, ответственные за связывание с Src 40-58 (фигура 3А). Хотя данные последовательности минимально ответственны за связывание, последовательности, соответствующие данным последовательностям ND2, а также фланкирующим их последовательностям, могли использоваться для ингибирования взаимодействия Src-ND2. Дот-блоттинг с использованием данных белков GST и исследование снова с биотин-Src 40-58, показали связывание ND2 310-321 с высокой относительной аффинностью. Кроме того, связывание наблюдали с ND2, ND2 289-309, 299-318, 302-321 и 307-321 (фигура 3 В). Как прежде, взаимодействия со всеми фрагментами подтверждали при анализе ELISA (фигура ЗС) и наилучшие связывающие фрагменты представляли собой ND2 310-321, ND2 289-309, ND2 299-318, ND2 307-321 и полноразмерный ND2. Все данные четыре фрагмента обеспечили превосходящее связывание с Src 40-58, чем для полноразмерного ND2. Все тестируемые фрагменты были способны связывать Src40-58 более сильно, чем пептид отрицательного контроля sSrc 40-58.

Авторы изобретения затем проверяли способность конструкций ND2 связываться с более короткой версией домена, связывающего Src, - Src 40-49 (фигуры 4А, В). ND2 310-321, ND2 307-318 и ND2 310-318 представляли собой наилучшие связывающие фрагменты для Src 40-49 по анализу дот-блоттинг (фигура 4А). Данные взаимодействия подтверждали ELISA, причем ND2 310-321 проявлял наиболее сильное связывание.

Далее авторы изобретения подтвердили взаимодействие между ND2 310-321 и Src 40-49 в других форматах анализа с различными конструкциями. На фигуре 5А показан дот-блоттинг, в котором указанные фрагменты Src исследовали с биотинилированным ND2 310-321 (Bio-ND2 310-321) или скремблированным биотинилированным ND2 310-321 (Bio-sND2 310-321). Src 40-49-Tat означает слитый пептид, в котором домен переноса белка tat HIV-1 человека [YGRKKRRQRRR] был слит с С-концом последовательности Src40-49, чтобы получить пептид с последовательностью KPASADGHRGYGRKKRRQRRR, где Tat-Src40-49 означает слитый пептид, в котором домен Tat был слит с N-концом Src 40-49, чтобы получить пептид, содержащий последовательность YGRKKRRQRRRKPASADGHRG. Дот-блоттинг указывает на то, что оба пептида Src40-49, слитых с Tat, связывались с ND2 310-321, как связывался пептид Src40-49 сам по себе. Связывание биотинилированного ND2 310-321 с указанными закрепленными на плашках пептидами Src также оценивали в анализе ELISA, и каждая из 4 конструкций Src была способна связывать 6noTHH-ND2 310-321 (фигура 5В). Пептиды закрепляли в концентрация ~5 мкМ. Схожим образом, когда на плашки для ELISA наносили Tat-ND2 310-321 в стандартных условиях, био-Src 40-49 был способен связываться зависимым от концентрации образом, в то время как никакого связывания не наблюдали с биотинилированным скремблированным контрольным пептидом (фигура 5С; Bio-sSrc 40-49).

Конкурентные ELISA также проводили. На фигуре 5D показан конкурентный анализ ELISA, проверяющий способность tatSrc40-49 ингибировать связывание биотинилированного Src40-49 с ND2 310-321. Результаты указывают на то, что связывание биотинилированного Src40-49 с ND2 310-321 ингибировалось пептидом tat Src 40-49 peptide. На фигуре 5Е показана способность Src40-49-Tat ингибировать связывание биотинилированного Src40-49 с Tat-ND2 310-321, который предварительно наносили на планшет для ELISA.. Результаты указывают на то, что связывание биотинилированного Src40-49 с Tat-ND2 310-321 ингибировалось пептидом Src 40-49-Tat. Схожим образом, конструкции ND2, содержащие аминокислотные последовательности из области 300-3 21 способны действовать в качестве ингибиторов взаимодействия между ND2 и Src.

На фигуре 6 опять же показано, что Tat-ND2 310-321 способен связываться с Src 40-58 лучше, чем GST-ND2. На фигуре 7 показано, что увеличивающиеся концентрации Tat-ND2 310-321 могут конкурировать за связывание Bio-Src40-49 с нанесенным на планшет пептидом ND2 310-321 при конкурентном ELISA.

Взятые вместе, важные последовательности ND2 для опосредования связывания между ND2 и Src, вероятно, находятся в диапазоне аминокислот от 310 до 321 в ND2, и аминокислотные последовательности от 289 до 321, вероятно, участвуют или влияют на связывание ND2 и Src.

Пример №2: Ингибиторы взаимодействия SRC-ND2 снижают колокализацию SRC-ND2 in vivo, но не ND2 и NMDAR

Ряд экспериментов проводили для того, чтобы проверить локализацию ND2, Src, субъединиц NMDAR и PSD95 в гиппокампальных нейронах посредством иммуноцитохимии в присутствие Tat, Tat-ND2 310-321 или Src 40-49-Tat. В кратком изложении, гиппокампальные нейроны выделяли из эмбрионов крыс Wistar E18 в возрасте 17 дней и культивировали в нейробазальных средах, содержащихся на покровных стеклах с В27 и глутамаксом. Клетки затем обрабатывали в течение 1 ч пептидом в концентрации 1 мкМ до фиксации стандартными способами. Белки визуализировали, применяя специфические антитела и вторичные антитела, связанные с флуоресцентными молекулами. Колокализацию флуоресценции вычисляют, объединяя изображения в Photoshop и вычисляя % колокализованных молекул среди пар как общее количество колокализованных кластеров флуоресценции, деленные на общее количество кластеров (например, % колокализованных ND2 с Src=(общее количество колокализованных молекул)/(общее количество кластеров ND2); % колокализованных Src с ND2=(общее количество колокализованных молекул)/(общее количество кластеров Src)).

На фигурах 8А и 8В показано, что инкубация либо с Tat-ND2 310-321, либо с Src 40-49-Tat способна снизить степень колокализации Src и ND2, тогда как контрольный транспортер Tat ее не снижает.Таким образом, данные пептиды способны проходить через клеточные мембраны и разрушать комплексы, которые предварительно образуются внутри клеток, и их можно использовать в качестве терапевтических средств.

Далее, проверяли локализацию ND2 с субъединицей 2 В (NR2B) рецептора NMDA и PSD95 в присутствие данных ингибиторов. Как Tat-ND2 310-321, так и Src 40-49-Tat не влияли значительно на связь между ND2 и NR2B, несмотря на нарушение взаимодействия между ND2 и Src (фигуры 9А, В по сравнению с фигурами 8А, В). К удивлению, нарушение взаимодействия между Src и ND2 снижало колокализацию ND2 с PSD95 (фигуры 9С, D). Поскольку PSD95, как известно, связан с NR2B посредством взаимодействия между С-концом NR2B и первым двумя доменами PDZ в PSD95 (Aarts et al. Science, 2002), данные лекарственные средства обеспечивают получение дополнительных композиций и способов для достижения благоприятных воздействий от разрушения взаимодействия NMDAR-PSD95. Они включают в себя лечение инсульта, нарушений, связанных с эксайтотоксичностью, боль, нейродегенеративные нарушения, тревожность, эпилепсию, оптические невропатии и более. В соответствии с таким разрушением колокализации PSD95, на фигурах 9Е и F показано, что колокализация между PSD95 и NR2B схожим образом нарушена. Схожим образом, Tat-ND2 310-321 и Src 40-49-Tat способны снижать колокализацию между NR2B и Src (фигура 10) и PSD95 и Src (фигура 11).

Таким образом, соединения, которые содержат последовательности ND2, ингибирующие связывание между Src и ND2, могут модулировать комплекс рецептора NMDA, особенно, связи между NR2B и Src и NR2B и PSD95.

Антитела

Следующие ниже первичные антитела применяли в данном исследовании: мышиное mAb к NR2B (Cat#: ab 28373), мышиное mAb к PSD95 (клон 7Е3-1 В8, Cat#: abl3552) и мышиное mAb к 8 гс(клон 327, Cat#: abl6885) получали из Abeam (Cambridge, МА); кроличье антитело против NR2B (Cat#: 06-600) получено из Millipore (Temecula, CA); козлиное антитело против ND2 (М-16, Cat#: sc-20496) и кроличье антитело против GST (Z-5, Cat#: sc-459) получали из Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); фосфотирозиновое мышиное mAb (P-Tyr-100, Cat#: 9411), Фосфо-МК2 В (Tyrl472, Cat#: 4208) и кроличье антитело против PSD 95 (D27E11, Cat#: 3450) получали из Cell Signaling Technology(Danvers, МА).

Все вторичные антитела, используемые в данном исследовании получали из Jackson ImmunoResearch Laboratory (Weat Grove, PA): антикроличьи антитела осла, конъюгированные с техасским красным (711-075-152), антимышиные антитела осла, конъюгированные с техасским красным (711-075-150), антикозьи антитела осла, конъюгированные с техасским красным (705-075-003), антикроличьи антитела осла, конъюгированные с FITC (711-095-152), антимышиные антитела осла, конъюгированные с FITC (715-095-150), антикозьи антитела осла, конъюгированные с FITC (705-095-003), антимышиные козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой (115-036-006), антикроличьи козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой (111-036-047) и антикозьи антитела кролика, конъюгированные с пероксидазой (305-036-003)

Иммуноцитохимия

Гиппокампальные нейроны, культивируемые на покровных стеклах, обрабатывали 1 мкМ Src 40-49-Tat, Tat-ND2 310-321 иди Tat в течение 1 ч на 14 день. Затем нейроны инкубировали в 4% параформальдегиде и 4% сахарозе в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 10 мину, после чего следовала инкубация в течение 5 минут в 20% метаноле при комнатной температуре (RT). Клетки пермеабилизировали при помощи 0,25% Triton Х-100 в PBS в течение 5 минут и посредством обработки 5% ослиной сывороткой в PBS в течение 30 минут при RT. Культуры инкубировали со смесью первичного антитела, индуцированного в разных видах, в 0,25% Triton X-100 PBS в течение 2 часов при RT, промывали и инкубировали в течение 1 часа при RT со смесью видоспецифичных вторичных антител, всех индуцированных в осле и конъюгированных с флуорофорами либо с техасским красным, либо с FITC (разведение 1:200 в 0,25% Triton X-100 PBS). Покровные стекла промывали PBS и приготавливали препарат для исследования, применяя реагент ProLong Gold antifade reagent (Invitrogen). Изображения сохраняли, применяя объектив pan-fluor с увеличением 60×на микроскопе Nikon Eclipse ТЕ 200. Изображения анализировали в PhotoShop 7 (Adobe, San Jose, CA). Яркость и контраст регулировали, усиливали, используя фильтр «нерезкое маскирование» и изображения объединяли для цветной колокализации.

Для количественной оценки колокализации нормализовали максимальные интенсивности флуорофорных каналов и фоновую флуоресценцию каждого канала, наблюдаемую в дендритах, вычитали, цветные изображения объединяли. Два кластера в двух разных каналах считали колокализоваными, когда, по меньшей мере, 66% поверхности одного кластера в одном из этих двух каналов перекрывалось с кластером в другом канале. Для каждой комбинации антител проводили три независимых иммунофлуоресцентных эксперимента. Каждое измерение брали из дендритного сегмента 50-м-длиной (со средней шириной 2 м). Колокализацию выражали как процент от общего количества анализируемых кластеров.

Пример №3: Ингибиторы взаимодействия ND2-SRC воздействуют на состав NMDA-рецепторного комплекса

Эксперименты по коиммунопреципитации использовали, чтобы проверить состояние выбранных белков в NMDA-рецепторном комплексе в нейронах. Белки проверяли как в гиппокампальных нейронах, так и головном мозге крыс, подвергшихся инсульту, применяя модель окклюзии 3 пиальных сосудов (3PVO), и в присутствии или в отсутствие ингибиторов взаимодействия Src-ND2. На фигурах 12А-Е демонстрируется состояние NMDAR на 14 день в гиппокампальных нейронах. Антитела против ND2, Src, PSD95, NR2B и IgG по отдельности добавляли к лизатам, как описано ниже, и использовали для того, чтобы получить чистые от примесей иммунопреципитаты (антитела перечислены сверху пятен). Каждое пятно затем исследовали с идентифицирующим антителом, применяя стандартные методики вестерн-блоттинга, используя антитело, приведенное ниже каждого пятна. Данная фигура демонстрирует, что каждое из иммунопреципитатирующих антител способно разрушить комплекс, содержащий ND2, Src, PSD95 и NR2B.

Авторы изобретения далее проверили воздействие Tat-ND2 310-321 и Src40-49-Tat на связь белков в сигнальном комплексе NMDAR в культивируемых гиппокампальных нейронах 14DIV. Нейроны обрабатывали Tat-ND2 310-321 или Src40-49 в концентрации 1 мкМ в течение 1 часа (фигура 13А) или в концентрации 3 мкМ в течение 2 часов (фигура 13 В). Клеточные лизаты очищали и получали иммунопреципитаты с антителами против NR2B (слева) и затем окрашивали при с использованием антител против NR2B, против PSD95, против Src и против ND2. Данные исследования иллюстрируют, что обработка нейронов обоими Tat-пептидами снижает связывание NR2B с Src. При используемых концентрациях и времени воздействия, по-видимому, имело место небольшое снижение связи PSD95 и NR2B, когда предварительно обрабатывали с Tat-ND2 310-321. Данный эксперимент повторяли и ясно показали, что обработка Tat-ND2 310-321 значительно снижала количество PSD-95 и Src в комплексе NMDAR по сравнению с Src 40-49-Tat после иммунопреципитации с антителами против NR2B (фигура 13С, слева). Когда лизаты, обработанные одинаковыми пептидами, применяли для иммунопреципитации с антителами npOTHB-PSD95, обработка при помощи Tat ND2 310-321 значительно снижала количество NR2B в обычной ситуации связанного с PSD95. Дополнительно, в другой серии экспериментов по иммунопреципитации с применением антител против PSD95 на обработанных пептидом лизатах гиппокампальных нейронов Tat-ND2 310-321 смог почти убрать связь между NR2B и PSD-95 и снизить количество фосфорилированного NR2B, ассоциированного с PSD95 (фигура 13D).

Состояние данных белков затем проверяли в головном мозге крыс, которых подвергли инсульту при 3PVO. После ишемии при 3PVO, грызуны получали либо Tat-ND2 310-321, либо физиологический раствор посредством инъекции в хвостовую вену. Через один час после хирургической операции головной мозг быстро забирали и лизировали. После IP с антителами против NR2B, мембраны инкубировали с анти-фосфотирозиновыми антителами, проявляли и впоследствии исследовали с антителами против Src, фосфорилированного Src (pTys) и против PSD95. В качестве внутреннего контроля, получали ипсилатеральные и контралатеральные полушария (I и С, соответственно). На фигуре 15 показано, что у получавших Tat-ND2 310-321 животных, намного меньше PSD95 иммунопреципитировалось наряду с субъединицей NR2B, и также снижалось количество Src. Такое изменение в составе NR2B, по-видимому, имеет место только в полушарии с инсультом, поскольку PSD95, по видимому, остается связанным с NR2B в полушарии, неподверженного инсульту. Это существенно, поскольку снижение связи PSD95:NR2B в инсультных тканях является защитным, но комплекс NMDAR необходим для осуществления функций в других тканях, таких как нейрональная передача сигнала и долговременная потенциация. Таким образом, Tat-ND2 310-321 демонстрирует возможность селективно защищать области головного мозга, затронутые инсультом, не разрушая комплекс в неповрежденных областях, вероятно, приводя к снижению побочных эффектов при сравнении с общими ингибиторами PSD95:NMDAR.

Второй ряд экспериментов выполняли на животных, подвергавшихся 3PVO, модифицированной так, что физиологический раствор, Src 40-49-Tat или Tat-ND2 310-321 вводили посредством инъекции в хвостовую вену через 1 час после хирургической операции и головной мозг собирали и лизировали через 2 часа после хирургической операции. На фигурах 16А, В показаны результаты иммунопреципитаций из данных образцов головного мозга, используя в качестве IP-антител или PSD95 (фигура 16А), или NR2B (фигура 16В). В А, Tat-ND2 310-321 значительно снизил NR2B, фосфорилированный NR2B и Src, связанный с PSD95. С другой стороны, в В после иммунопреципитаций с антителами против NR2B, очень мало PSD95 связано с комплексом, и также с меньшим количеством Src и Фосфо-Src (pSrc). Конструкция Src 40-49-Tat не была почти также эффективна при высвобождении PSD95 и Src из рецептора NMDA.

Способы коиммунопреципитации

NMDAR и связанные с ним белки получали из культивируемых гиппокампальных (HP) нейронов или из головного мозга крыс.Для конкурентных экспериментов in vitro HP нейроны через две недели собирали после обработки пептидами Src 40-49-Tat, Tat-ND2 310-321 или Tat в течение 1 ч при концентрации 1 мкМ конце нтрация или в течение 2 часов при концентрации 3 мкМ, затем клетки быстро собирали и гомогенизировали. Для экспериментов in vivo, через один час после ишемии при 3PVO крысам вводили пептиды или физиологический раствор внутривенно в хвостовую вену. Через два часа после хирургической операции (через один час после введения соединений), выбранную кору головного мозга быстро собирали и гомогенизировали.

Лизаты инкубировали с Dynabeads protein G (Invitrogen) и выбранными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре. Выделенные иммунопреципитаты разделяли, применяя SDS-PAGE, и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны исследовали с выбранными идентифицирующими антителами, затем разрезали на полоски и повторно исследовали с другими идентифицирующими антителами.

Пример №4: Ингибиторы ингибируют увеличенный РАСАР вызванный NMDA ток в нейронах СА1.

Полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза (РАСАР), избирательно увеличивает опосредованные рецептором NMDA реакции в нейронах крыс, и считается, что данный пептид вовлечен в регулирование синаптической пластичности, а также и долговременную потенциацию синаптической передачи и депрессию. Для того чтобы исследовать воздействие ND2 310-321 и Src 40-49 на увеличенный РАСАР вызванный NMDA ток, выделенные нейроны СА1 подвергали ряду экспериментов с фиксацией потенциала в присутствии или в отсутствие данных пептидов. На фигуре 14А показаны нормализованные пики тока с РАСАР (1 нМ) в пэтч-пипетке или РАСАР+ND2 310-321 (6 мМ). ND2 310-321 может предотвратить вызванную РАСАР потенциацию. Схожие эксперименты также проводили, используя селективный для Src ингибирующий пептид, Src (40-58) (14 мМ), или укороченный пептид, Src (40-49) (6 мМ). Реакции до применения РАСАР нормализовали с реакциями через от 25 до 30 минут после применения РАСАР. На столбчатой диаграмме указаны три группы записей с нейронов и указаны относительные изменения пиков тока NMDAR в трех состояниях. ND2 310-321, но не Src 40-49, ингибирует увеличенный РАСАР вызванный NMDA ток. Таким образом, ND2 310-321 можно использовать для того, чтобы блокировать увеличенную РАСАР вызванную NMDA передачу сигнала и можно, следовательно, применять при множестве неврологических заболеваний и нарушений, ассоциированных с нарушенной долговременной потенциацией (например, старение, болезнь Альцгеймера, нейродегенеративные заболевания и нейрональные нарушения, затрагивающие память).

Пример №5: Ингибиторы ND2 снижают повышенную чувствительность к боли у грызунов

Для того чтобы продемонстрировать, что Tat-ND2 310-321 эффективен при снижении повышенной чувствительности к боли, 10 пмоль/г Tat ND2 310-321 или скремблированные пептиды ND2 ил и Src отрицательного контроля вводили посредством инъекции в хвостовую вену крысам с ранее вызванным воспалением в их задних лапах при подкожной инъекции полного адъюванта Фрейнда (CFA). Определение повышенной чувствительности к боли проводили, применяя волокна различной жесткости, как описано в способах либо через 1 час, либо через 2 часа после инъекции пептидов. Животные, получавшие Tat-ND2 310-321, были значительно менее чувствительны к боли, чем животные, получавшие скремблированные контрольные пептиды. Дополнительно, пептиды, содержащие область ND2 310-321, такую как tat-ND2 310-321, действовали значительно лучше, чем Src40-49-Tat в данных экспериментах. Такое различие наблюдали в большей степени через 1 час после введения дозы, чем через два часа при таких условиях (фигура 17).

Src 40-49-Tat, как сообщали, нарушает связь Src и ND2 в нейрональных лизатах (Liu, X-J et al., (2008) Nature Medicine, ссылка 3). Такое нарушение также снижает связь между Src и субъединицей R2 NMDA, которая в свою очередь снижает ток NMDA и характеризуется положительным воздействием и на воспалительную боль (модели с введением формалина и CFA), и на невропатическую боль (компрессию периферического нерва). Настоящие результаты показывают, что ND2 310-321 характеризуется превосходящей способностью обеспечивать купирование боли в модели CFA (фигура 17), лучше разрушать связь между Src и субъединицей R2 NMDA (фигура 13С - IP NR2B в присутствии Tat-ND2 или Src 40-49-Tat, исследованные с антителом против Src), и снижать ток NMDA (фигура 14 В). Авторы изобретения интерпретируют данные результаты как доказательство того, что соединения ND2, содержащие участок 310-321 ND2, такие как Tat-ND2 310-321, действую лучше, чем Src 40-49-Tat в различных моделях боли на животных (например, с CFA, формалином и при компрессии периферического нерва) и обладают потенциалом стать эффективными терапевтическими средствами для лечения воспалительной и невропатической боли, хронической боли и боли, ассоциированной с повышенной чувствительностью.

Способы

Модели с CFA:

Животные: Эксперименты проводили на мышах Sprague-Dawley (самцы, 250-300 г) из Charles River Laboratories (St. Constant, Quebec). Их помещали в пластиковые клетки, содержащие 1/8" кукурузную подстилку, и содержали при 12-часовом цикле свет/темнота. Их расселяли парами и обеспечивали доступ к пище и воде ad libitum. Использование таких животных находилось в соответствии с Канадским советом по уходу за животными и одобрено Комитетом по уходу за животными в Toronto Western Hospital.

Индукция воспаления: В кратком изложении, полный адъювант Фрейнда (CFA; Sigma Chemical Company, St. Louis) вводили подкожно в подошвенную поверхность задней лапы (100 мкл, игла 27G½, при анестезии изофлураном). Животных возвращали в их клетки, в течение 8 часов позволяли развиться воспалению и сенсибилизации.

Инъекция в хвостовую вену: Для внутривенного введения пептида после индукции воспаления животных помещали в прозрачную камеру для вводного наркоза и обезболивали смесью 2,5% изофлурана в кислороде, пока животное полностью не обезболивали (приблизительно через 1 мин). Затем помещали маску на нос и рот животного и концентрацию изофлурана снижали до 1,5-2,0% на время инъекции. Пептиды растворяли в стерильном физиологическом растворе с концентрацией 1 мкл/г и инъекции проводили при помощи иглы-бабочки 25G½ (Fisher Scientific). Затем животное возвращали в его клетку.

Определение порога отдергивания лапы: Основываясь на способе, описанном у Pitcher et al. (Journal of Neuroscience Способы, 1999), животных помещали на платформу, содержащую отверстие диаметром 1,5 мм в прозрачной плексигласовой камере для наблюдений (30×30×30 см). Серию возрастающих калиброванных волокон фон Фрея (Stoelting, USA) (.008 г-15 г) прикладывали к подошвенной поверхности задней лапы, чтобы определить минимальный раздражитель, необходимый для того, чтобы вызвать отдергивание лапы. Каждое волокно прикладывали перпендикулярно на 2 секунды или до тех пор, пока не произойдет отдергивание лапы. Каждое последующее волокно прикладывали 5 раз через интервалы в 5 секунд. Порог определяли по волокну, которое вызывало 3 положительных реакции из 5 прикладываний. Волокна более чем 15 г не применяли, чтобы избежать повреждения ткани. Порог отдергивания лапы измеряли до инъекции CFA, через 8 часов после инъекции CFA, через 60 минут после введения пептида и через 120 после введения пептида.

Пример №6: Ингибиторы ND2 эффективны для уменьшения повреждения головного мозга после инсульта

Эффективность ингибиторов ND2 при лечении инсульта проверяли, применяя модель инсульта при окклюзии трех пиальных сосудов (3PVO). Такая модель является постоянной моделью инсульта, которая создает маленькие, но устойчивые инфаркты за 24 часа.

Самцов мышей Sprague Dawley (n=10 в каждой группе) хирургически подвергали постоянной окклюзии пиальных сосудов. Через один час после хирургической операции, животные получали внутривенную инъекцию физиологического раствора, Tat-NR2B9c (Aarts et al, Science, 2002), Src 40-49-Tat или Tat-ND2 310-321 и им позволяли далее прийти в себя в их клетках. Через 24 часа после хирургической операции головной мозг получали, разрезали на тонкие слои и инкубировали с ТТС для визуализации площадей инфарктов. Определяли объем инфаркта у каждого животного, а также средний объем для каждой группы из десяти животных. На фигуре 18 показаны результаты одного такого эксперимента. Оба Tat-ND2 310-321 и Tat-NR2B9c проявили приблизительно 40% снижение объема инфаркта, тогда как Src 40-49-Tat не был статистически эффективным в снижении объема инфаркта в данной модели. Это позволяет предположить, что ND2-ингибиторы взаимодействия Src-ND2, и Tat-ND2 310-321 в особенности, могут быть эффективными лекарственными средствами для лечения инсульта.

Во втором эксперименте эффективность миристоилированных вариантов двух пептидов ND2 оценивали относительно Tat-ND2. Последовательности приведены ниже в примерах. Оба пептида миристоилировали через амидную связь с альфа-аминогруппой N-концевой аминокислоты пептида. Myr-ND2 обеспечивал равнозначную или превосходящую защиту от повреждения от инсульта в данной модели, и myr2-ND2 был менее эффективен (фигура 22). Таким образом, как Tat-ND2, так и myr-ND2 являются эффективными лекарственными средствами для лечения инсульта, когда вводятся после инсульта. Авторы изобретения также обнаружили, что данные ингибиторы эффективны, когда их вводят до инсульта.

Модель ишемии при окклюзии трех пиальных сосудов

Самцов крыс Sprague Dawley (n=10 в каждой группе) с весом в диапазоне от 230 до 290 г использовали для данного исследования. Эксперименты проводили на голодавших крысах (свободный доступ в течение ночи к воде, но не к пище). Постоянную окклюзию трех пиальных сосудов (3PVO) проводили, как описано ранее (Forder J et al., 2005, выше). Вкратце, крыс обезболивали внутримышечной инъекцией при концентрации 0,5 мл/кг кетамина (100 мг/кг), ацепромазина (2 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг), дополненных одной третью от исходной дозировки, как требуется. Вставляли анальный термометр и животное помещали на подогреваемую подкладку с поддерживаемой температурой при 37°С. Череп раскрывали посредством срединного разреза и очищали от ткани. Применяя препаровальную лупу и пневматическую бормашину делали краниальное окошко размером от 6- до 8-мм над правой соматосенсорной корой (2 мм сзади и 5 мм сбоку от темени), просверливая прямоугольник через череп и убирая кусочки черепа, сохраняя твердую мозговую оболочку в целости. 3 пиальные артериолярные ответвления средней мозговой артерии вокруг колончатого кора отбирают и электрически прижигают через твердую мозговую оболочку. После прижиганий скальп зашивали. Каждую крысу возвращали в ее отдельную клетку под лампой нагревания, чтобы поддержать температуру тела пока крыса полностью не придет в себя. Через один час после ишемии при 3PVO, крысам вводили указанное лекарственное средство (3 нмоль/г) или физиологический раствор посредством внутривенной инъекции в хвостовую вену. Предоставляли пищу и воду. Через двадцать четыре часа после хирургической операции, головной мозг быстро собирали. Корональные срезы (2 мм) брали из головного мозга и инкубировали в 2% трифенилтетразолиумхлориде (ТТС) (Sigma) в течение 15 мин при 37°С. Изображения сканировали (Canon 4200F).

Пример №7: Ингибиторы ND2 снижают повышенную чувствительность к боли в моделях невропатической боли на грызунах

Авторы изобретения затем проверяли воздействие Tat-ND2 310-321 в сравнении с отрицательным контролем скремблированного ND2 (sTat-ND2 310-321) на поведение при невропатической и воспалительной боли, применяя модель повреждения периферического нерва (PNI) у крыс и модель полного адъюванта Фрейнда (CFA), обе характеризующиеся снижением механического порога отдергивания лапы. Воздействие Tat-ND2 310-321 на механический порог отдергивания оценивали через 8-15 дней после PNI. Авторы изобретения обнаружили, что Tat-ND2 310-321, но не sTat-ND2 310-321, вызывают значительное снижение порога отдергивания лапы ипсилатерально относительно области повреждения нерва при внутривенном введении. Схожие результаты наблюдали в модели CFA (фигура 17), где увеличение порога отдергивания лапы происходило через первые 45 минут и продолжалось в течение 3 часов тестируемого периода времени.

Таким образом, Tat-ND2 310-321 и пептиды или пептидомиметики, содержащие данный участок ND2, могут обеспечить купирование невропатической боли.

Способы

Модель хронической компрессии седалищного нерва: Животные: для того чтобы получить повреждение периферического нерва (PNI), полиэтиленовую манжету размером 2 мм хирургически имплантировали вокруг седалищного нерва крыс или мышей при изофлурановой анестезии. Животным позволяли привыкнуть в течение 7 дней до тестирования.

Введение лекарственного средства. Tat-ND2 310-321 или sTat-ND2 310-321 вводили в диапазоне от 8 до 15 дней после хирургической имплантации манжеты на нерв внутривенно через хвостовую вену в концентрации 1 ноль/г. После инъекции животных возвращали в их клетки.

Определение порога отдергивания лапы. Основываясь на способе, описанном у Pitcher et al. (Journal of Neuroscience Способы, 1999), животных помещали на платформу, содержащую отверстие диаметром 1,5 мм в прозрачной плексигласовой камере для наблюдений (30×30×30 см). Серию возрастающих калиброванных волокон фон Фрея (Stocking, USA) (.008 г-15 г) прикладывали к подошвенной поверхности задней лапы, чтобы определить минимальный раздражитель, необходимый для того, чтобы вызвать отдергивание лапы. Каждое волокно прикладывали перпендикулярно на 2 секунды или до тех пор, пока не произойдет отдергивание лапы. Каждое последующее волокно прикладывали 5 раз через интервалы в 5 секунд. Порог определяли по волокну, которое вызывало 3 положительных реакции из 5 прикладываний. Волокна более чем 15 г не применяли, чтобы избежать повреждения ткани. Порог отдергивания лапы измеряли до компрессии нерва, через 7 дней после компрессии седалищного нерва и через 45 мин, 90 мин, 135 мин и 180 мин после инъекции пептидов или контролей.

Пример №8: Ингибиторы ND2 эффективны для уменьшения боли

Повреждение периферического нерва (PNI) посредством модели компрессии седалищного нерва вызывали у грызунов при хирургической имплантации полиэтиленовой манжеты (длиной 2 мм) вокруг седалищного нерва крыс или мышей при изофлурановой анестезии. Авторы изобретения затем определяли механический порог отдергивания лап (PWT) с использованием волокон фон Фрея, как описано ранее (Liu et al, 2008), как до хирургической операции для определения исходного значения, так и через 8-14 дней после хирургической операции. Авторы изобретения приготовили myr-ND2 (100 микромоль/л) в 20% уксусной кислоте в качестве маточного раствора и разводили маточный раствор до действующей концентрация перед тестированием. Авторы изобретения вводили либо 10 пмоль, либо 100 пмоль myr-ND2 и носителя в поясничный отдел спинного мозга и проверяли PWT через 45 мин, 90 мин, 135 мин и 180 мин после инъекции. Обе тестируемые концентрации myr-ND2 проявили пониженную чувствительность к боли во все тестируемые периоды времени (фигура 23). Таким образом, пептиды ND2, включая myr-ND2, являются эффективными ингибиторами боли.

Пример №9: Миристоилирование сохраняет эффекивность в моделях боли и инсульта, не снижая кровяное давление при высоких уровнях дозировки

Пептиды ND2, как было показано в настоящем документе, эффективны при уменьшении боли и повреждения после инсульта. Пептиды Tat, как было ранее показано, вызывают снижение кровяного давления при быстром введении в высоких дозах. Авторы изобретения проверили эффективность, применяя быстрый болюс с высокой концентрацией пептида myr-ND2 в сравнении с Tat-ND2 и NA-1 (Tat-NR2B9c). Крысам, с хирургически внедренными устройствами для измерения артериального давления, вводили дозы ~25 мг/кг соответствующих пептидов виде инъекции болюса в хвостовую вену через 10 после отслеживания. Оба пептида, содержащие последовательности Tat, привели к снижению артериального кровяного давления до уровней приблизительно половинных от нормальных значений.. Такое снижение давление восстанавливалось само по себе приблизительно через 10-15 без внешнего вмешательства. Пептид myr-ND2, однако, не проявлял никакого снижения кровяного давления в схожих концентрациях у любых тестируемых животных (фигура 20). На фигуре 21 показаны наименьшие значения кровяного давления, дополнительно демонстрирующие, что myr-ND2 не влиял на кровяное давление в данной модели. Таким образом, myr-ND2 можно вводить при более высоком уровне дозировки, чем Tat-ND2, не наблюдая или с меньшей вероятностью наблюдая побочные эффекты в отношении кровяного давления у людей.

Ссылки:

1. Liu, X.J., et al., Treatment of inflammatory and neuropathic pain by uncoupling Src from the NMDA receptor complex. Nat. Med., 2008. 14(12): p.1325-1332.

2. Gingrich, J.R., et al., Unique domain anchoring of Src to synoptic NMDA receptors via the mitochondrial protein NADH dehydrogenase subunit 2. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2004. 101(16): p.6237-6242.

3. Liu, X.J., et al., Treatment of inflammatory and neuropathic pain by uncoupling Src from the NMDA receptor complex. Nature Medicine, 2008. 14(12): p.1325-1332.

4. Husi, H., et al., Proteomic analysis ofNMDA receptor-adhesion protein signaling complexes. Nat. Newosci., 2000. 3(7): p.661-669.

5. Kalia, L. and M. Salter, Interactions between Src family protein tyrosine kinases and PSD-95. Neuropharmacology, 2003. 45(6): р.720-728.

6. Yaka, R., et al., NMDA receptor function is regulated by the inhibitory scaffolding protein, RACK1. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002. 99(8): p.5710-5715.

7. Yu, X., et al., NMDA channel regulation by channel-associated protein tyrosine kinase Src. Science, 1997. 275(5300): p.674-678.

8. Lu, Y., et al., Src activation in the induction of long-term potentiation in CA1 hippocampal neurons. Science, 1998. 279(5355): p.1363-1367.

9. Superti-Furga, G., et al., Csk inhibition ofc-Src activity requires both the SH2 and SH3 domains of Src. The EMBO Journal, 1993. 12(7); p.2625-2634.

10. O’Dell, Т., E. Kandel, and S. Grant, Long-term potentiation in the hippocampus is blocked by tyrosine kinase inhibitors. Nature, 1991. 353(6344): p.558-563.

11. Husi, H., et al., Proteomic analysis ofNMDA receptor-adhesion protein signaling complexes. Nature Neurocience, 2000. 3(7): p.661-669.

12. Niethammer, M., E. Kim, and M. Sheng, Interaction between the С terminus of NMDA receptor subunits and multiple members of the PSD-95 family of membrane-associated guanylate kinases. The Journal ofNeuroscience, 1996. 16(7): p.2157-2163.

13. Aarts, M., et al., Treatment ofischemic brain damage by perturbing NMDA receptor-PSD-95 protein interactions. Science, 2002. 298(5594): p.846-850.

14. Wheeler-Aceto, H., F. Porreca, and A. Cowan, The rat paw formalin test: comparison of noxious agents. Pain, 1990. 40(2): p.229-238.

Хотя изобретение было описано подробно с целью прояснить понимание, определенные модификации можно осуществить в рамках прилагаемой формулы изобретения. Все публикации (включая, например, статьи в журналах, номера доступа, веб-сайты и т.п.) и патентные документы, цитируемые в данной заявке, включены, таким образом, в качестве ссылки в полном объеме во всех отношениях до той же самой степени, как будто каждый был, таким образом, отдельно обозначен.. В тех случаях, когда последовательности могут быть ассоциированы с одним и тем же номером доступа в разное время, имеется в виду последовательность, связанная с номером доступа при действительной дате подачи заявки. Действительная дата подачи заявки означает самую раннюю дату приоритета, в которой описан спорный номер доступа. Если иное не очевидно из контекста, любой элемент, вариант осуществления, стадия, особенность или аспект согласно изобретению можно выполнить в сочетании с любым другим.

Перечень последовательностей

Последовательности пептида ND2

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к идентификации ключевой области ND2, ответственной за взаимодействие с Src, и может быть использовано в медицине. Получают пептиды, не более чем из 20 аминокислотных остатков области ND2, включающих остатки 310-321. Изобретение позволяет получить пептиды, ингибирующие взаимодействие ND2 с Src, что может быть использовано для эффективной терапии инсульта и боли. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 23 ил., 9 пр.

Формула