Способ получения композиции igg посредством тепловой обработки - RU2636049C2

Описание

Данное изобретение относится к новому способу получения композиции IgG из частично очищенного раствора IgG из человеческой плазмы, в котором за счет применения промежуточной стадии тепловой обработки и без использования реагентов для осаждения агрегатов/полимеров и/или белков с высокой молекулярной массой, достигается почти полное устранение полимеров IgG, создаваемых во время процесса. В дополнение к этому, способ предлагает высокую производительность, более низкие производственные затраты и более легкое осуществление по сравнению со способами предыдущего уровня техники. Также за счет использования данного способа конечному продукту в жидкости придается стабильность.

Иммуноглобулин G (IgG) представляет собой изотип наиболее распространенного иммуноглобулина в человеческой сыворотке (8-16 мг/мл), содержащей приблизительно 80% всех иммуноглобулинов. IgG показан для лечения различных заболеваний, таких как первичный иммунодефицит, в частности врожденная агаммаглобулинемия и гипогаммаглобулинемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, в качестве адъюванта при лечении болезни Кавасаки и при трансплантации костного мозга, гипогаммаглобулинемии, ассоциированной с хроническим лимфоцитарным лейкозом, в качестве компонента лечения ВИЧ-инфекции у пациентов-детей среди прочих.

В настоящее время имеется большая потребность в иммуноглобулине G (IgG), который является поливалентным с широким спектром человеческих антител и имеет общую функциональность (нейтрализующая способность, опсонизация, сохраненная средняя долговечность), с интактными молекулами (целостность кристаллизуемого Fc-фрагмента) и нормальным распределением подклассов IgG, идентичным или эквивалентным природной плазме, особенности для редких подклассов (IgG3 и IgG4).

Путями терапевтического введения IgG может быть внутривенный, подкожный и внутримышечный, а в дополнение к этому его можно вводить посредством других менее общепринятых путей, таких как пероральный, ингаляционный или топический пути.

Тем не менее, внутривенное введение предлагает наиболее используемые показания к применению, для лечения либо первичных иммунодефицитов или для общего вариабельного иммунодефицита (дефицита подклассов IgG и IgA) (Espanol, T. "Primary immunodeficiencies". Pharmaceutical Policy and Law 2009; 11(4): 277-283), либо вторичных или приобретенных иммунодефицитов (например, инфицирования вирусами, такими как цитомегаловирус, опоясывающий лишай, иммунодефицит человека) и заболеваний аутоиммунного происхождения (например, тромбоцитопенической пурпуры, синдрома Кавасаки) (Koski, C. "Immunoglobulin use in management of inflammatory neuropathy". Pharmaceutical Policy and Law 2009; 11(4): 307-315).

В идеале IgG для внутривенного применения (IGIV) должен быть получен в виде готовой формы с высокой концентрацией в жидкости и предпочтительно должен допускать хранение приблизительно до 30°C для того, чтобы облегчить консервацию продукта и непосредственную инфузию.

Было описано, что для того, чтобы уменьшить возможные реакции непереносимости IgG, необходимо, чтобы иммуноглобулин A (IgA) и иммуноглобулин M (IgM), а также агглютинины групп крови, должны отсутствовать или находиться в невыявляемом количестве. Существенно также, что продукт фактически не должен обладать какой-либо ферментативной активностью, за счет наличия как плазмина, так и плазминогена, или прекалликреина, или его активаторов, кининов или кининогена или факторов свертывания крови, таких как среди прочего фактор XI/фактор XIa.

С другой стороны, человеческое происхождение первоначальной плазмы для получения поливалентного IgG делает необходимым снижение до минимума риска инфицирования через передачу вирусов или патогенов. Как описано у Fernandes et al. (ES 500121) и Hirao, Y. et al. (EP 196761 и EP 253313), тепловую обработку IgG в растворе (жидкости) или пастеризацию можно эффективно проводить в присутствии средств защиты от денатурации IgG (например, сахарозы, сорбитола, аминокислот). Для этой цели температуру раствора повышают приблизительно до 60°C в течение по меньшей мере примерно 10 часов, активируя или аттенуируя большинство опасных патогенов. Среди прочего, данные патогены могут иметь липидное покрытие, например, вирус иммунодефицита человека (HIV), вирус гепатита C (HCV) и вирус гепатита B (HBV) или быть незащищенными, например, полиовирус, вирус гепатита A (HAV) и парвовирус (Uemura Y. et al. "Inactivation and elimination of viruses during the fractionation of an intravenous immunoglobulin preparation". Vox Sang. 1989; 56: 155-161).

Тем не менее, пастеризация, даже в присутствии стабилизаторов и в наилучших условиях обработки, неминуемо приводит к образованию необратимых белковых агрегатов с высокой молекулярной массой, таких как полимеры IgG и/или полимеры других сопутствующих белков, в большей или меньшей пропорции в зависимости от чистоты первоначального IgG (Hirao, Y. et al. выше; and Ristol, P. et al. EP 1225180 and ES 2091161).

На протяжении десятилетия 1960-1970 наличие необратимых агрегатов с высокой молекулярной массой, известных как полимеры IgG, связывали с фиксацией комплемента для его активации (антикомплементная активность, ACA) в процессе внутривенного введения IgG, и данное явление связывали с наблюдаемой сильной непереносимостью или анафилактическими реакциями (Barandum, S. et al. Vox Sang. 7: 157-174, 1962). Вследствие этого, службы здравоохранения регламентировали максимальное содержание полимеров в IGIV, или молекулярных форм, выше, чем димеров, с лимитом, составляющим 3% (Eur. Ph. Monograph 6.3; and CMP Core SPC for normal immunoglobulin for intravenous administration: CPMP/BPWG/859/95 rev.2). Данное соображение является особенно важным для жидкой готовой формы, потому что 3% лимит также должен сохраняться до даты истечения срока годности продукта. Фактически полное отсутствие данных полимеров IgG, вследствие этого, должно достигаться, как после пастеризации, так и в полученном конечном продукте, для обеспечения, чтобы продукт не портился в течение долгого времени, и для обеспечения максимально возможной температуры хранения.

В настоящее время большая часть жидкого IgG, имеющегося на рынке и полученного в виде готовой формы с аминокислотами, должна сохранять кислый pH во избежание агрегации (Uemura, Y. "Dissociation of aggregated IgG and denaturation of monomeric IgG by acid treatment". Tohoku J. Exp. Med. 1983; 141: 337-349), предпочтительно c pH между 4,0-5,0 (Tenold, R. et al. US-4396608) и при температуре, равной 2-8°C, если они стабилизированы 0,2 M или 0,25 M глицином, например, известным под торговыми названиями Liquid Gamunex® (Grifols SA, Испания), Kiovig® или Gammagard® (и тот и другой от Baxter, Соединенные Штаты), или до 25°C, если стабилизированы 0,25 M пролином, таким как Privigen® (CSL Behring, Германия), для того, чтобы минимизировать молекулярную агрегацию в процессе хранения (Jolles, S. et al. "Clinical uses of intravenous immunoglobulin". Clin. Exp. Immunol. 2005 October; 142(1): 1-11; Hooper, J.A. "Intravenous immunoglobulins: evolution of commercial IVIG preparations". Immunol Allergy Clin. North Am. 2008; 28(4): 765-778).

Было продемонстрировано, что излишне кислый pH в течение длительного периода воздействия способствует фрагментированию IgG, например, при pH, равном 4,5 или ниже и при относительно высокой температуре, например, при 30°C (Vermeer, A. et al. "Thermal stability of immunoglobulin: Unfolding and aggregation of a multi-domain protein". Biophys. J. 2000; 78: 394-404; Shukla, A. et al. "Strategies to address aggregation during protein A chromatography". Bioprocess International, May 2005). Соответственно, например, в литературе сообщалось, что 10% IGIV композиции, полученные в виде готовой формы с L-пролином при pH, равном 4,8±0,2, являются достаточно стабильными в отношении молекулярной агрегации, но при продолжительности воздействия наблюдается тенденция к фрагментированию. Соответственно при температуре, равной 25°C, количество фрагментов составляет в среднем до 3,9% спустя 36 месяцев (Cramer, M. et al. "Stability over 36 months of a new liquid 10% polyclonal immunoglobulin product (IgProlO, Privigen®) stabilized with L-proline”, Vox Sang. 2009. DOI: 10.1111/j.1423-0410.2008.01143.x).

Было описано, что готовая форма IgG с полиолами или полиспиртами, например, с мальтозой и сорбитолом, предотвращает агрегацию (Katakam, M. et al.: Aggregation of proteins and its prevention by carbohydrate excipients: Albumins and globulin. J. Pharm. Pharmacol. 1995; 47: 103-107) и вследствие этого свойства растворы IgG, которые являются стабильными до 25°C (с 10% мальтозой, торговое название Octagam®) и до 30° (с 5% сорбитолом, торговое название Flebogamma® DIF) были получены в виде готовой формы в слабокислом диапазоне pH между 5,0 и 6,0 (Hirao, Y. et al. Патент EP-278422).

Однако, в последние годы наличие некоторых сахаров или производных в готовых формах IgG было поставлено под сомнение (Szenczi, A. et al.: The effect of solvent environment on formation and stability of human polyclonal in solution. Biologicals, 2006; 34(1): 5-14), так как некоторые случаи серьезной почечной недостаточности были связаны с инфузией препаратов IgG, имеющих в своем составе сахарозу. Другими недостатками, которые могут проявляться некоторыми иммуноглобулиновыми композициями с отдельными сахарами (сахарозой) и некоторыми высокими концентрациями полиолов (10% мальтозой), является относительная способность повышать вязкость крови при вливании растворов, причем это связано с некоторыми очень серьезными случаями внутрисосудистого тромбоза и острого инфаркта миокарда, когда имеется предшествующее заболевание, или пациент находится в зоне риска (Radosevich, M. and Burnouf, T. "Intravenous immunoglobulin G: Trends in production methods, quality control and quality assurance. Vox Sang. 2009; 1-17; Katz, U. and Shoenfeld, Y.: Review: Intravenous immunoglobulin therapy and thromboembolic complications. Lupus, 2005; 14(10): 802-808).

Было также установлено, что некоторые коммерческие IGIV продукты заключают в себе активные прокоагулирующие ферменты, остатки от процесса их очистки, которые имеют выраженный тромбоэмболический эффект (TEE), и была доказана связь между TEE и наличием факторов XI/XIa и/или других прокоагулирующих факторов (например, калликреина и тому подобное). Устранение тромбоэмболической способности является требованием, которое должно быть выполнено для инфузий IGIV с максимальными гарантиями иммунологической толерантности и безопасности.

Не связывая себя какой-либо конкретной теорией, авторы представленного изобретения полагают, что основные отличия между продаваемыми в настоящее время IGIV могут быть присущи не только готовой форме (аминокислоты, сахара и полиолы, и pH), но также способу получения IgG, который среди прочих характеристик будет влиять на итоговые условия консервации продукта в жидкости (температура-время), например, для предотвращения агрегации и фрагментирования в процессе хранения. Данная зависимость между стабильностью жидких готовых форм IgG и способом их очистки наблюдалась другими авторами (Cramer, M. et al. выше).

Вследствие этого, данное изобретение предоставляет способ получения препарата IgG, который решает упомянутые ранее проблемы состояния уровня техники. Способ, согласно данному изобретению, начинается с материала, имеющего в своем составе IgG, очищенный с помощью общепризнанных способов, который дополнительно очищают посредством тепловой обработки, также известной как пастеризация, в специальных условиях стабилизирующих агентов, концентрации белков, электропроводности, pH и остаточных концентраций реагентов из предшествующих стадий осаждения, что делает возможным уменьшение примесей белков и протеолитических ферментов. Данное уменьшение примесей и ферментов происходит в процессе данной обработки и/или в процессе последующей стадии избирательной адсорбции агрегированных белков, но в любом случае данные две стадии используют исключительно в качестве итоговой очистки без внедрения методов разделения, использующих осаждение.

Предыдущий уровень техники включает применение в промышленных масштабах комбинации осаждения и хроматографического отделения агрегатов/полимеров, например, как описано у Coval, L. (Патенты US-4093606 и US-4165370) и Uemura, Y. et al. (Патенты ES-506679 и EP-246579), которые описывают способы осаждения, использующие полиэтиленгликоль (PEG), недостаточно селективный метод, который вызывает сильные потери в извлечении мономеров/димеров IgG (совместное осаждение), которые сильно варьируют согласно используемому способу. Например, если тепловую обработку проводят в растворе IgG, который не был очищен в достаточной степени, извлечение IgG (мономеров/димеров), как правило, будет составлять между 70 и 80% (Uemura, Y. et al. выше). В случае очищенных растворов IgG могут быть получены более хорошие результаты извлечения, с 80-90%, но для этого необходимо использовать комплексные методы разделения, такие как микрофильтрация в тангенциальном потоке (TFF), которая описана в предыдущем уровне техники (Ristol, P. et al. выше). Однако способ TFF связан с высоким расходованием осаждающих реагентов (PEG), стабилизатора (сорбитола) и воды для инъекций, и ряда моющих и дезинфицирующих операций, которые необходимо принимать во внимание, когда необходимо повторно использовать оборудование. Кроме того, он связан с длительной продолжительностью процесса, может быть трудным для управления, высокими являются связанные с ним затраты на расходные материалы и/или энергию, и извлечение мономеров/димеров IgG составляет всегда менее чем 90%.

Авторы представленного изобретения разработали способ, с помощью которого обходятся без применения реагентов для осаждения агрегатов/полимеров и/или белков с высокой молекулярной массой, которое описано в предыдущем уровне техники, и неожиданно достигается фактически полное устранение создаваемых полимеров, с высокой производительностью, более низкими производственными затратами и легким осуществлением по сравнению со способами в предыдущем уровне техники. Кроме того, за счет применения данного способа достигается стабильность конечного продукта в жидкости, предпочтительно полученного в виде готовой формы в присутствии аминокислот или полиспиртов, и его можно хранить в жидкости в течение по меньшей мере 1 года при температуре между 2 и 30°C и pH, равным 4,6 или выше и до 5,8.

Вследствие этого, данное изобретение относится к способу получения композиции IgG из частично очищенного раствора IgG из человеческой плазмы, который включает стадии:

а) диафильтрации частично очищенного раствора IgG;

b) стабилизации раствора, полученного на стадии a);

c) тепловой обработки раствора, полученного на стадии b);

d) избирательной адсорбции агрегатов и/или полимеров с высокой молекулярной массой из подвергнутого тепловой обработке раствора на стадии c) посредством катионной хроматографии; и

e) диафильтрации и получения в виде готовой формы раствора, полученного на стадии d).

За счет применения данного способа достигается значительное уменьшение содержания агрегатов/полимеров с высокой молекулярной массой, иначе говоря, с молекулярной массой выше, чем у димера IgG и других нестабильных белков, приводя к раствору, который по существу имеет в своем составе мономеры/димеры IgG, которые могут быть получены в виде готовой формы в слабокислой среде, и могут сохраняться в жидкости при окружающей температуре без заметных признаков нестабильности, соответствуя спецификациям, установленным для его предпочтительно внутривенного или подкожного, или внутримышечного применения.

Предпочтительно способ согласно данному изобретению осуществляют, начиная с очищенного раствора IgG человеческой плазмы, имеющей содержание IgG более чем 95% относительно суммы белков, а более предпочтительно более чем 97%, что определяют с помощью электрофореза в ацетатцеллюлозе, черного окрашивания крахмала, и количественно оценивают денситометрически, в соответствии со способом, описанным в Европейской Фармакопее.

В качестве первоначальных материалов, для запуска способа согласно изобретению данный патент рассматривает применение богатых IgG фракций (выделенных при фракционировании человеческой плазмы для получения альбумина с помощью общепризнанных способов, известных в данной области), с последующей должной их очисткой.

До сих пор, продолжается использование главным образом и в промышленном масштабе холодного фракционирования плазмы с этанолом, на основании способа 6 по Cohn (Cohn, E.J. et al. Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components. J. Am. Chem. Soc. 1946; 68: 459-475) для выделения богатой IgG фракции. Данную фракцию (Fr-II+III) или эквивалентную (Fr-I+II+III), которая имеет в своем составе большую часть (≥90%) IgG, и плазму, переменной чистоты (как правило, между 35 и 65% IgG по отношению к другим белкам), необходимо очищать более тщательно посредством осаждения этанолом, известным как метод 9 по Cohn-Oncley (Oncley, J.L. et al.: The Separation of the antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and beta-1 Lipoprotein into subfractions of human plasma. J. Am. Soc. 1949; 71: 541-550) до тех пор, пока не получат фракцию концентрированного иммуноглобулина (Fr-II, или супернатант концентрированного Fr-III). Еще одним практически осуществимым вариантом является применение способа по Kistler-Nistchmann (Kistler, P. and Nitschmann, Hs. Large Scale Production of Human Plasma Fractions. Vox Sang. 1962; 7: 414-424) до выпадения в осадок A (или эквивалентного выпадения в осадок A+I), а затем их очистки для получения преципитата GG или до концентрированного супернатанта (ультрафильтрата) преципитата B.

Применяя оба метода осаждения этанолом, возможно получить раствор IgG (из супернатанта Fr-III, Fr-I+III, Fr-II, осажденного GG или супернатанта преципитата B), который соответствует минимальным характеристикам чистоты ≥95% IgG (посредством электрофореза на ацетатцеллюлозе), а предпочтительно ≥97% IgG, что требуется для того, чтобы его можно было использовать в качестве первоначального материала в способе согласно изобретению. Это преобразует IgG, который подходит для внутримышечного или подкожного пути, в препарат, который является допустимым для внутривенного пути.

В любом случае, в настоящее время используются другие предпочтительные комбинации для повышения чистоты первоначального материала (например, Fr-II+III или преципитата A), например, за счет осаждения большей части загрязняющих примесей и/или их адсорбции на анионных смолах и/или неорганических адсорбентах (полиэтиленгликоле, октановой кислоте, ионообменной хроматографии, бентоните, перлите). Документы Ristol, P. et al. EP-1225180; Lebing, W. et al. EP-0893450; Teschner, W. et al.: A New liquid, intravenous immunoglobulib product (10% IGIV) highly purified by a state-of-the-art process. Vox sang. 2007; 92(1): 42-55 относятся к действующим способам очистки посредством осаждения этанолом, PEG или октановой кислотой, в сочетании с ионообменной хроматографией для повышения чистоты промежуточной фракции IgG (например, Fr-II+III) до ≥95% IgG, а предпочтительно ≥97% IgG, прежде чем перейти к очистительной обработке в патенте.

Диафильтрацию на стадии способа согласно данному изобретению, осуществляют с целью понижения концентрации нежелательных компонентов, получающихся в стандартном способе очистки IgG, ниже значений концентрации, которые могут воздействовать на способ согласно данному изобретению. Например, одним нежелательным компонентом является этанол, и посредством данной стадии (a) диафильтрации его необходимо уменьшить до концентрации меньше, чем 0,5% (масса/объем), предпочтительно меньше, чем 0,1%. Если присутствуют другие неденатурированные осаждающие реагенты, такие как PEG, октановые кислоты, совместимые неионные детергенты или любая их смесь, их концентрация также должна быть понижена до менее чем 2% (масса/объем), и в любом случае до того, чтобы они не приводили к более, чем 3% полимеров после стадии c).

Кроме того, на данной стадии диафильтрации первоначальный раствор IgG может быть отрегулирован до ионной силы, электропроводность которой составляет менее чем 1 мС/см, а pH отрегулирован до между 4,0 и 5,5, предпочтительно в обоих случаях. Диафильтрацию можно проводить с водой для инъекций или предпочтительно с буферным раствором низкой ионной силы, таким как раствор ≤5 мМ уксусной кислоты или раствор ацетата натрия, доведенный щелочью или разбавленной кислотой до pH 4,0-5,0.

Стадию (a) диафильтрации предпочтительно проводят в режиме тангенциального потока через ультрафильтрационные мембраны, например, из полиэфирсульфона или аналогов, с использованием отсечения по молекулярной массе между 10 кДа и 100 кДа. Предпочтительно в способе согласно данному изобретению, стадия (a) диафильтрации также служит для концентрирования белков до концентрации не более чем 5% (масса/объем), предпочтительно между 2% и 4% (масса/объем).

После того, как был получен раствор на стадии (a), его стабилизируют, например, посредством добавления сорбитола в качестве стабилизирующего агента до максимальной концентрации, составляющей 50% (масса/масса), предпочтительно между 30% и 35% по массе. В дополнение к этому pH доводят до между 4,2 и 6,0, предпочтительно между pH 4,6 и 5,2 посредством добавления кислоты (например, соляной кислоты или уксусной кислоты) или щелочи (например, гидроксида натрия) способом, который известен в данной области.

Тепловая обработка или нагревание раствора на стадии (c) способа согласно данному изобретению представляет собой специальную процедуру, также известную, как пастеризация, которая осуществляется при температуре между 55°C и 63°C в течение периода времени между 1 и 24 часами. Хотя раствор может быть подвергнут тепловой обработке при любой температуре и в течение любого времени в пределах диапазонов, упомянутых выше, тепловую обработку предпочтительно проводят при 60±1°C в течение 10-11 часов. В любом случае должны получаться не более чем 3% полимеров/агрегатов с высокой молекулярной массой, и предпочтительно между 1% и 2%. Также как протеолитическая активность вследствие возможного наличия прокоагулирующих факторов, например, фактора XI/XIa или других протеаз, измеренных хромогенно для различных субстратов (S-2302, S-2288 и S-2238), как описано в данной области (см. Пример 3), уменьшается по меньшей мере в 5 раз по сравнению с ее первоначальным содержанием.

Впоследствии раствор охлаждают, предпочтительно между 18°C-30°C, и разбавляют, предпочтительно по меньшей мере 33% (по массе) водой для инъекций или, более предпочтительно, буферным раствором, имеющим в своем составе совместимую соль (например, натрия ацетат, фосфат, цитрат и тому подобное) в концентрации, составляющей предпочтительно ≤20 мМ. После разбавления раствор содержит концентрацию сорбитола ≥5% масс., и концентрацию белков ≥5 мг/мл. Полностью ионизируемую совместимую соль, предпочтительно хлорид натрия, в виде твердого вещества или в концентрированном растворе, например, 3 M (моль/литр), добавляют к данному раствору до тех пор, пока не получают раствор хлорида натрия между 0,20 M (моль/литр) и 0,50 M (моль/литр), предпочтительно между 0,25 M (моль/литр) и 0,40 M (моль/литр). При необходимости pH можно снова довести до между 4,2 и 5,5, а предпочтительно между 4,5 и 5,0 посредством добавления предпочтительно разбавленной соляной или уксусной кислоты и/или гидроксида натрия.

Раствор, приведенный в надлежащее состояние способом, описанным выше, иначе говоря, после разбавления, регулирования концентрации соли и pH, который имеет в своем составе максимальное количество, равное 5%, димеров, инжектируют в хроматографическую колонку, содержащую сильные катионообменные перфузионные смолы, имеющие по меньшей мере одну из катионных сульфоновых групп (сульфониловую, сульфоновую или сульфопропиловую: S-, HS-, SP-группы), ковалентно соединенную с синтетической нерастворимой и фактически несжимаемой перфузионной матрицей, содержащей жесткие частицы полиметакрилата или полистирола и предпочтительно содержащей матрицу или подложку из частиц полистирола, поливинилбензена между 20-100 мкм. Смола может быть заложена в цилиндрическую колонку с осевым потоком подходящего диаметра для заполнения, предпочтительно занимая смолой приблизительно между 5-20 см высоты, или заложена в колонку с радиальным потоком с проходом, составляющим между предпочтительно 10-15 см. В обоих случаях по меньшей мере 1 литр, а предпочтительно между 1 и 10 литров данной смолы используют для каждого кг (сухого) IgG, который должен быть очищен, что эквивалентно загрузке между 100 и 1000 мг IgG/мл геля. Предпочтительно количество смолы, заложенной в используемую колонку, составляет между 2 и 5 литров на кг IgG (эквивалентно загрузке 200-500 мг IgG/мл геля). Перед инжектированием продукта колонку уравновешивают буферным раствором, имеющим в своем составе предпочтительно ацетат натрия между приблизительно 5 и 50 мМ (миллимолярным), а более предпочтительно 10 мМ (миллимоль/литр), и концентрацией хлорида натрия (если именно эту соль выбирают для добавления в продукт), которая приблизительно равна или эквивалентна концентрации продукта. Предпочтительный инжектируемый поток составляет не более чем 50 объемов колонки/час, а более предпочтительно между 5-30 объемов колонки/час, предпочтительная температура составляет 18°C-30°C. Мономеры/димеры IgG свободно проходят через колонку, при этом более чем 90% всех мономеров плюс применяемые димеры извлекаются в элюат (адсорбция составляет <10% мономеров/димеров), и предпочтительно достигается извлечение, составляющее ≥93%, причем данный элюат извлекают в пуле до надлежащего объема.

Одновременно агрегаты/полимеры улавливаются смолами в количестве, составляющем ≥85% от их первоначального содержания, что эквивалентно более чем 5-кратному уменьшению, предпочтительно уменьшению ≥95% (≥20 раз) первоначального содержания в материале, получаемом в результате тепловой обработки, при этом в пуле элюата колонки обнаруживается (неадсорбированными) ≤0,3% полимеров, а предпочтительно ≤0,1% или ≤0,06%. Также как за счет подходящего увеличения загрузки в колонку и применения последующего промывания, например, по меньшей мере двумя объемами колонки раствора, равными или эквивалентными объему, используемому для уравновешивания колонки, извлечение мономеров/димеров может быть даже увеличено наиболее предпочтительно до ≥95%. Соответственно при повторном инжектировании в ту же самую колонку регенерируемой фракции, должным образом разбавленной и отрегулированной до условий, используемых при первоначальной загрузке или с меньшей ионной силой, может быть достигнуто извлечение ≥95%. Инжектирование за счет уменьшающегося градиента, как уже показано, также стимулирует извлечение мономеров/димеров IgG, и таким образом или при использовании аналогичного способа квалифицированный специалист в данной области может легко добиться извлечения продукта ≥95%. Для осуществления этого загрузку начинают с максимальной концентрации соли в соответствии с pH для того, чтобы минимизировать эффекты суперадсорбции в первых применяемых объемах, постепенно увеличивая емкость смолы по мере уменьшения ионной силы до тех пор, пока не закончится объем загрузки. Например, предпочтительно может быть использован уменьшающийся градиент до 15% между концентрацией соли выбранного продукта в начале загрузки по сравнению с концентрацией соли в ее конце.

Необязательно, способ согласно данному изобретению может включать одну или более инактивирующих/уничтожающих вирусы обработок, дополняющих тепловую обработку раствора. Среди инактивирующих вирусы обработок, которые могут быть использованы в способе согласно изобретению, имеется инкубирование при кислом рН (например, рН 3,8-4,2 при 37±2°C в течение между 4-24 часами в присутствии или отсутствии пепсина или нетоксичных детергентов, таких как Plironic, Triton, Tween и тому подобное); обработка алкилфосфатным органическим растворителем (0,3% три-n-бутил фосфатом или TNBP); детергентами (1% Triton X-100 или Triton X-45) (Neurath et al. Патент US-514375), предпочтительно за счет доведения рН раствора IgG до 4,2-6, а температуры до 4-30°C, инкубирования в течение 1-12 часов, а более предпочтительно приблизительно 6 часов при 25±2°C; и удерживающая вирусы наномембранная фильтрация (регенерированная целлюлоза, полиэфирсульфон, поливинилиденфторид) посредством либо тангенциального, либо терминального потока, в виде кассеты или многослойной конструкции (плоская поверхность), картриджа (складчатого, листового, с дисками) или полого волокна, предпочтительно сквозь поры с размером ≤50 нм, приблизительно между 10-50 нм и приблизительно между 15-35 нм и предпочтительно сквозь поры с размером 20±2 нм, с завершающей нанофильтрацией. Данные стадии инактивации/уничтожения можно проводить перед стадией тепловой обработки или после нее, за исключением применения нанофильтрации, когда предпочтительно, чтобы ее надо было применять перед тепловой обработкой.

После того, как стадию (d) способа согласно данному изобретению завершают, полученный раствор диафильтруют водой для инъекций или предпочтительно буферным раствором низкой ионной силы, который может, например, содержать ≤5 мМ уксусной кислоты при рН, составляющем 4,0-5,5, и необязательно стабилизаторами или эксципиентами для приготовления итоговой готовой формы. Итоговую диафильтрацию осуществляют посредством тангенциального потока через ультрафильтрационные мембраны полиэфирсульфона или эквивалента, используя отсечение по молекулярной массе предпочтительно между 10 кДа и 100 кДа, а более предпочтительно между 30 кДа и 50 кДа. После соответствующего количества объемов диафильтрации для уменьшения концентрации соли, предпочтительно до электропроводности, составляющей ≤2 мС/см, белок предпочтительно содержится в номинальных концентрациях, равных 5%, 10%, 16% или 20%, или в любой другой промежуточной концентрации между приблизительно 5% и 22% (м/о). Раствор предпочтительно стабилизируют посредством добавления полиспирта (полиола) или аминокислот. В любом случае осмоляльность полученного в результате раствора будет ≥240 мОсм/кг, и приблизительно изотонической. Предпочтительно pH доводят до 5,2±0,6 и проводят проверку, обеспечивая, чтобы он находился между 4,6 и 5,8, корректируя, при необходимости, разбавленной кислотой или щелочью.

Скорректированный раствор стерильно фильтруют через чистую мембрану с размером пор, равным 0,2 мкм, способом, известным в данной области. Полученный жидкий раствор стерильно дозируют в подходящие контейнеры и подвергают инкубированию (карантину) не меньше, чем 14 дней при 25±5°C, предпочтительно для того, чтобы наблюдать всякий признак нестабильности или заражения в каждом отдельном отмеренном объекте. Содержащийся продукт хранят в тех же самых условиях, что и для карантина (окружающая температура 25±5°C) или в холодной камере (5±3°C). Продукт, полученный посредством способа согласно данному изобретению, остается стабильным (по существу неизменным) в течение по меньшей мере 1 года при температуре между 2-30°C, не проявляя каких-либо признаков выявляемого ухудшения либо своих физических характеристик (внешний вид, цвет, мутность, отложения, частицы или волокна) или своих требуемых аналитических параметров согласно, например, Европейской Фармакопее (агрегаты с высокой молекулярной массой, фрагменты, антикомплементная активность или ACA, прекалликреиновый активатор или PKA, подклассы IgG и т.д.).

Данное изобретение описано более подробно ниже со ссылкой на примеры. Однако, данные примеры не предназначены для ограничения технических рамок данного изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Начиная со смеси замороженной человеческой плазмы, подходящей для фракционирования, ее криопреципитировали при температуре между 0 и 4°C. Криопреципитат сепарировали с помощью центрифугирования в непрерывном потоке (центрифуга Westfalia) при одной и той же температуре криопреципитации. Супернатант подвергали обработке в соответствии со способом 6 фракционирования по Cohn (Cohn et al. выше) с использованием холодного этанола до тех пор, пока не получали Fr-II+III. Полученную или осажденную (Fr-II+III) массу сепарировали посредством фильтрации под давлением и замораживали при ≤20°C. Впоследствии Fr-II+III подвергали обработке посредством способа 9 фракционирования по Cohn-Oncley (Oncley, J. et al. выше) до тех пор, пока не получали Fr-II. Полученный Fr-II хранили при ≤20°C.

Fr-II суспендировали в изотоническом растворе глицина и натрия хлорида и доводили приблизительно до нейтрального pH. Раствор обрабатывали неорганическими адсорбентами, сепарировали посредством центрифугирования (центрифуга RINA), а затем очищали на фильтре с глубиной пор ≤0,5 мкм.

Фильтрат доводили до pH между 5,5 и 6,0, используя 0,5 M HCl и ультрафильтровали через полисульфоновые мембраны, имеющие номинальное отсечение по молекулярной массе 10 кДа. Объем сначала уменьшали, а затем запускали диафильтрацию с постоянным объемом водой для инъекций при 2-8°C. При завершении данной ультрафильтрации, оборудование дополнительно промывали, а раствор доводили до оптической плотности (при 280 нм), равной 60±5 оптических единиц белка. Добавляли твердый сорбитол в количестве 0,5 кг на каждый кг имеющегося раствора, а после растворения, pH раствора доводили до 5,5±0,5, используя 0,5 M HCl.

Затем проводили тепловую обработку раствора в термостатическом контейнере с рециркуляцией нагревающей текучей среды через кожух таким образом, чтобы температура продукта поднималась между 60 и 61°C и удерживалась там в течение 10-11 часов. Затем раствор охлаждали до 2-8°C.

Результаты, полученные для усреднения 3 отдельных партий, показаны в Таблице 1.

Результаты выше показывают воздействие предшествующей очистки Fr-II+III (суспензия FrII ≥97% посредством электрофореза) и уменьшения денатурирующих агентов (этанола) на агрегацию в процессе тепловой обработки, только с 1,58% полимеров, делающих возможной последующую адсорбцию синтетическими катионными смолами.

Пример 2

Начиная с пула человеческой плазмы, процесс был таким же, как описано для Примера 1, до тех пор, пока не получали Fr-II+III (тест a) и продолжался до Fr-II (тест b). Для того, чтобы установить воздействие очистки, а также наличия денатурирующих агентов на полимеризацию в процессе тепловой обработки, процедуру проводили следующим образом:

а) Fr-II+III суспендировали в воде для инъекций при 2-8°C в пропорции, равной 1:3,5 по массе, а после того, как была получена гомогенная суспензия, pH поднимали до 5,25±0,25 с 0,5 M HCl. Впоследствии ее центрифугировали в декантаторе (центробежная сила между 200 g - 1000 g) с образованием очищенной суспензии.

b) Fr-II подвергали обработке, как в примере 1 до тех пор, пока не получали раствор, очищенный с помощью глубокого фильтра.

Каждый из растворов выше стабилизировали посредством добавления твердого сорбитола в количестве, равном 0,5 кг на кг первоначального супернатанта. После того, как сорбитол растворялся, pH, при необходимости, доводили до 5,5±0,5. Каждый раствор нагревали до 60-61°C в течение 10-11 часов. Затем его охлаждали до 2-8°C.

В Таблице 2 показаны результаты, полученные для пастеризованного продукта в тестах a) и b), по сравнению с Примером 1.

Результаты тестов a) и b) демонстрируют воздействие чистоты первоначального IgG и необходимость достижения значений ≥97%. С другой стороны, сравнивая тест b) со способом в примере 1, очевидно воздействие остаточного этанола, возникающего при фракционировании этанола и необходимость его устранения. Вследствие этого необходимо сделать вывод, что только условия в примере 1 будут приемлемы для способа согласно изобретению.

Пример 3

Плазму фракционировали таким же образом, как в примере 1 в отношении Fr-II+III, и данный материал очищали PEG или анионообменными смолами до тех пор, пока не получали достаточно чистый продукт.

Для данной первоначальной очистки Fr-II+III применяли такие же условия обработки, как описано в описании патента EP 1225180. Более подробно, в данном примере Fr-II+III суспендировали в водном растворе, имеющем в своем составе сорбитол, динатрийфосфат и уксусную кислоту, до тех пор, пока весь IgG эффективно не растворялся. Основные сопутствующие белки осаждали посредством добавления до 4% PEG. После этого добавляли неорганические адсорбенты и фильтрующий коадъювант. Перед отделением от преципитата посредством фильтрации под давлением (целлюлозные пресс фильтры) pH повторно доводили до 5,0±0,5. Массу сепарировали и собирали слой фильтрата. Проводили инжектирование в хроматографическую колонку, заключающую в себе анионообменные смолы типа DEAE-Sepharose® (Amersham Biosciences, Швеция) вслед за регулированием pH и очищающего градиента фильтрации до ≤0,5 мкм непосредственно перед поступлением в колонку. Собирали весь элюат, полученный в процессе загрузки продукта, имеющего в своем составе очищенный IgG. Элюат выше доводили до pH 4,4±0,2 с помощью 0,5 M HCl и ультрафильтровали через полисульфоновые мембраны, имеющие номинальное отсечение по молекулярной массе 100 кДа. Первоначально объем понижали приблизительно в 4 раза для получения концентрации, равной 2% белка, а затем при 2-8°C инициировали диафильтрацию при постоянном объеме 4 объемами воды для инъекций с 4 мМ уксусной кислоты (миллимоль/литр) и 5% сорбитола, доведенного до pH 4,2±0,2, с 0,5 M NaOH. При завершении этого, оборудование для ультрафильтрации дополнительно промывали с образованием раствора оптической плотности (при 280 нм), равной 55±5 оптических единиц белка. Впоследствии 0,5 M HCl добавляли до pH 4,0±0,1 с последующим инкубированием при 37±1°C в течение 4 часов.

Затем добавляли твердый сорбитол в количестве 0,43 кг на каждый кг имеющегося раствора (33% масса/масса), а после того, как он растворялся, pH раствора доводили до 4,9±0,1 с помощью 0,5 M NaOH.

Тепловую обработку проводили в термостатическом сосуде с рециркуляцией нагревающей текучей среды через кожух для того, чтобы поднять температуру продукта до 60-61°C и удерживать там в течение 10-11 часов. Затем раствор охлаждали до 2-8°C. В Таблице 3 показаны результаты анализа состава для мониторинга способа.

Результаты в Таблице 3 показывают, что остаточное содержание PEG, равное 0,8%, не влияет на степень полимеризации в процессе тепловой обработки (1,5% полимеров). Также как на данную полимеризацию не влияет ранее использованный способ очистки, при использовании только ли этанола или этанола+PEG+анионной хроматографии (см. Примеры 1 и 2), при условии, что достигается чистота того же порядка (≥97% IgG).

Аналогичным образом определения аналитическим путем различных хромогенных субстратов проводили на других препаративных партиях, обработанных таким же образом, как описано ранее в данном Примере 3 для того, чтобы оценить стадии, имеющие способность инактивировать протеолитические ферменты, главным образом прокоагулянты. Субстраты S-2302, S-2288 и S-2238 (специфические для факторов свертывания крови для протромбинового комплекса, тромбина, плазминогена/плазмина, FXI/FXIa, FXII, PKA и т.д.) использовали на основе методики, описанной согласно состоянию уровня техники, рассчитывая градиент кинетики хромогенной реакции в оптической плотности (O.D.) единиц абсорбции в минуту (мин) по отношению к применяемой концентрации белков (г/мл). Соотношение (оптическая плотность/мин)/(г/мл) на стадиях перед пастеризацией и после нее показано в Таблице 4.

Из результатов в Таблице 4 должно быть видно, что в специальных условиях способа пастеризации, протеолитическая активность (главным образом прокоагулирующие факторы) может быть понижена более чем в 5 раз по сравнению с первоначальным содержанием (ультрафильтрованный раствор) согласно значениям, полученным с тремя различными используемыми хромогенными субстратами.

Пример 4

Были доступны 3 различные партии продуктов, обработанных таким же образом, как в Примере 3, до тех пор, пока для каждой не получали пастеризованный раствор. Каждый раствор разбавляли приблизительно в 4 раза 10 мМ (миллимоль/литр) раствором ацетата натрия приблизительно при 20-25°C для достижения оптической плотности, равной приблизительно 10 оптических единиц (при 280 нм), и концентрации сорбитола, равной приблизительно 8% по массе, добавляя количество NaCl, необходимое для приведения продукта к итоговой концентрации, равной 0,4 M (моль/литр). Раствор доводили до pH 4,5 посредством добавления разбавленной HCl (0,1 M-0,5 M).

Раствор инжектировали в хроматографическую колонку с сильными полистироловыми катионитами (POROS HS® 50 µm, Applied Biosystems, Соединенные Штаты), c объемом приблизительно 8 мл (высота 10 см × поперечное сечение 0,8 см²). Колонку уравновешивали приблизительно 10 объемами колонки 10 мМ буферного раствора ацетата натрия с pH и концентрацией NaCl, равными pH и концентрации загружаемого продукта. Продукт инжектировали в потоке, равном приблизительно 20 объемов колонки/час, при этом собирали весь элюат из колонки с начала инжектирования. Получали образец элюата с фиксированным объемом, равным 16 объемам колонки, соответствующим загрузке приблизительно 155 мг IgG/мл геля, при этом определяли белок посредством оптической плотности (280 нм) и содержание полимеров посредством HPLC для того, чтобы рассчитать % извлечения IgG (мономеров/димеров) и достигнутый % уменьшения полимеров. Таблица 5 показывает полученные результаты.

В соответствии с предшествующими результатами, было получено очень значительное и достоверное уменьшение содержания полимеров между 94% и 95%, и было получено итоговое содержание между 0,09 и 0,15 для первоначального содержания полимеров между 1,8% и 2,5%. С другой стороны, необходимо отметить извлечение IgG (мономеров/димеров), составляющее 96%, вместе с емкостью загрузки, превышающей 100 мг IgG/мл геля, и продолжительностью процесса меньше, чем 2 часа (уравновешивание и загрузка).

Пример 5

Использованный способ был таким же, как в примере 4, но исследовали емкость загрузки с различными инжектируемыми объемами в условиях, установленных в примере 4. Брали образцы элюата для различных используемых объемов, определяя белок посредством оптической плотности (280 нм) и содержание полимеров посредством HPLC для расчета % извлечения IgG (мономеров/димеров) и % уменьшения полимеров, достигнутых для различных значений загрузки (мг IgG/мл геля). Результаты показаны в Таблице 6.

Результаты демонстрируют в очень значительной степени, что значения загрузки, равные 360 мг IgG/мл геля, могут быть достигнуты в условиях нормального потока до 20 объемов колонки в час с максимальным извлечением IgG, сохраняя способность к уменьшению полимеров ниже предела 0,3% до 50 используемых объемов колонки на постоянной основе. Продолжительность процесса для используемой загрузки не превышает 3 часов.

Пример 6

Для того, чтобы узнать рабочий диапазон концентрации NaCl в установленном pH, равном 4,5, и для оптимизации устранения полимеров за счет осуществления максимального извлечения IgG, процедуру проводили, как в примере 4, но изучали различные концентрации NaCl между 0,35 и 0,425 M, беря образец элюата колонки при 2 CV, 25 CV и 50 CV для определения белка посредством оптической плотности (280 нм) и полимеров посредством HPLC, для расчета % извлечения белка и уменьшения полимеров. Полученные результаты показаны в Таблице 7.

Таблица 8 показывает результаты извлечения IgG и уменьшения полимеров в элюате для итогового максимального используемого значения загрузки (50 CV).

Результаты выше демонстрируют, что в наилучших условиях концентрации NaCl снижение полимера не уменьшается за счет увеличения используемой загрузки до 50 CV (или 360 мг IgG/мл геля). Также как было установлено, что для получения максимальной емкости загрузки с минимальным содержанием полимеров (≤0,06%-0,31%) и извлечением IgG (мономеров/димеров) между 90,8% и 94,2% может быть использован диапазон от 0,40 M до 0,35 M NaCl.

Наилучшие результаты получаются при pH, равном 4,5, концентрации NaCl, равной 0,375 M, с концентрацией, равной 10 оптических единиц посредством оптической плотности (280 нм), и инжектируемым потоком, равным 20 CV/час. Было показано, что остаточный полимер составляет ≤0,06% (двойное повторение теста) при 50 CV (360 нм IgG/мл геля) с извлечением IgG, составляющим 93,2%-94,2%. Продолжительность процесса не превышала 3 часов.

Пример 7

Для того, чтобы узнать диапазон pH, в котором может быть использована стабильная концентрация NaCl, равная 0,35 M, и для оптимизации устранения полимеров посредством минимизации извлечения IgG, использовали процедуру, как в примере 4, изучая диапазон pH между 4,5 и 5,0, при этом для определения белка посредством оптической плотности (280 нм) и полимеров посредством HPLC и для расчета % извлечения белка и уменьшения полимеров образцы элюата колонки получали в конце 2 CV, 21-25 CV и 50 CV. Результаты показаны в Таблице 9.

Таблица 10 показывает результаты расчета извлечения IgG и уменьшения полимеров в элюате при итоговом максимальном используемом объеме загрузки (50 CV), и уменьшение полимеров в элюате при половине максимальной загрузки (приблизительно 25 CV).

Результаты выше демонстрируют сильную зависимость между pH и NaCl для эффективного уменьшения полимеров с минимальной потерей IgG. Было обнаружено, что при концентрации NaCl, равной 0,35 M, наиболее подходящий pH в пределах тестируемого диапазона составляет приблизительно между 4,76 и 4,50 так, что остаточный полимер находится между ≤0,06%-0,24% (при использовании 21-50 CV), а извлечение IgG находится между 90,8% и 94,3%. Продолжительность процесса составляла между 2 и 4 часами.

Пример 8

Процедура была такой же, как в примере 6, но для того, чтобы исследовать наилучшие условия концентрации NaCl между 0,1 M и 0,4 M, pH установили между 4,85 и 4,88. Результаты показаны в Таблице 11.

Таблица 12 показывает результаты расчета извлечения IgG и уменьшения полимеров в элюате при итоговом максимальном используемом значении загрузки (50 CV).

Результаты выше показывают, что способ является целесообразным при pH 4,85-4,88 в пределах диапазона от 0,325 M до 0,275 M NaCl для максимальной емкости загрузки (50 CV, или 360 мг IgG/мл геля), с минимальным остаточным содержанием полимеров (≤0,06%-0,17%) и извлечением IgG (мономеров/димеров), составляющим между 92,5% и 94,9%. Наилучшие результаты были получены при концентрации NaCl, равной 0,3 M, при которой достигали извлечения, равного 93,7%, и максимального остаточного полимера в элюате, равного 0,13%. При более низкой концентрации NaCl, равной 0,1 M, полимеры исчезали полностью, но извлечение IgG составляло менее, чем 90%.

При сравнении результатов в данном примере 8 и результатов в примере 6 очевидна сильная зависимость между pH и NaCl, и данные параметры следует регулировать в пределах соответствующего диапазона для достижения оптимальных значений уменьшения полимеров и извлечения IgG. Примеры выше демонстрируют, что требуемые результаты в отношении остаточного полимера ≤0,3% и уменьшения ≥85%, и извлечения IgG (мономеров/димеров) ≥90% получаются между pH 4,5 и pH 4,9 с концентрацией NaCl от 0,275 M до 0,4 M.

Пример 9

Цель данного теста состояла в оценке емкости загрузки смол POROS HS® (Applied Biosystems, Соединенные Штаты) при использовании общепризнанного способа хроматографии, который предполагает адсорбцию всего IgG для последующего элюирования с последующим сравнением результатов, полученных в предшествующих вариантах осуществления изобретения. Общепризнанный способ хроматография осуществляли в условиях для полной адсорбции IgG для насыщения смол при различных инжектируемых потоках.

Начиная с партии продукта, обработанного таким же образом, как в примере 3, когда речь идет о получении пастеризованного раствора, раствор разбавляли приблизительно в 4 раза 10 мМ (миллимоль/литр) раствором ацетата натрия приблизительно при 20-25°C для того, чтобы обеспечить приблизительно 10 оптических единиц оптической плотности (при 280 нм) приблизительно с 8% (м/м) сорбитола. Раствор доводили до pH 4,5 посредством добавления разбавленной HCl (0,1 M-0,5 M).

Инжектирование проводили в катионную хроматографическую колонку с сильной полистироловой синтетической смолой (POROS HS® 50 мкм, Applied Biosystems, Соединенные Штаты) с объемом приблизительно 4 мл (высота 4 см и поперечное сечение 1 см². Колонку уравновешивали приблизительно 10 объемами колонки 10 мМ буферным раствором натрия ацетата при pH, равном 4,5. Продукт инжектировали при различных потоках загрузки между 5 и 20 объемов колонки/час. Образцы элюата колонки брали из первоначального инжектирования в различные объемы колонки с определением белка посредством оптической плотности (280 нм) для того, чтобы рассчитать максимальную емкость загрузки в динамических условиях потока с приблизительным значением белка в инжектируемом растворе, равным 5%. Полученные результаты показаны в Таблице 13.

Из результатов следует вывод, что максимальная емкость смолы, используемой для общей адсорбции IgG в наилучших условиях динамики потока в общепризнанном способе хроматографии, обнаруживается приблизительно при 60 мг IgG на мл смолы, и остается фактически неизменной в изучаемых инжектируемых потоках 5-20 CV/час. Принимая во внимание, что данный результат очень далек, приблизительно в 6 раз ниже, чем >360 мг IgG/мл геля, полученного в примерах 6 и 8 с применением условий процесса согласно данному изобретению, это демонстрирует, что производительность способа согласно данному изобретению очень сильно превосходит производительность общепризнанной хроматографии, описанной в предыдущем уровне техники.

Пример 10

В данном примере тест был разработан для того, чтобы определить хроматографическое разрешение (отделение полимеров) и извлечение IgG в условиях полного хроматографического цикла (загрузка, промывание и элюирование) с полной адсорбцией IgG (общепризнанная хроматография), и для сравнения результатов, полученных в предшествующих примерах способа согласно изобретению.

Процедура была такой же, как в примере 9, но в колонку инжектировали первоначальное количество раствора IgG, эквивалентное 80% ее максимальной емкости (приблизительно 50 мг IgG/мл геля) при потоке, равном приблизительно 5 CV/час. После того, как весь продукт загружали, проводили последующее промывание буферным раствором приблизительно в 8 CV, равным первоначальному уравновешенному раствору, содержащему 10 нм натрия ацетата при pH 4,5. IgG впоследствии элюировали, используя градиент концентрации NaCl от 0 до 1 M (моль/литр) с содержанием 0,5 M глицина при pH 4,5 всего приблизительно в 25 CV. Элюированный IgG собирали во фракции для последующего анализа белка (оптическая плотность при 280 нм) и анализа молекулярного распределения (HPLC). Результаты показаны в Таблице 14.

В соответствии с результатами выше было продемонстрировано, что для загрузки 50 м IgG/мл геля получают максимальное извлечение, равное 64% IgG (мономеров/димеров) для содержания полимеров ≤0,06%, большая часть IgG, смешанного с неизвлекаемым полимером, обнаруживается в хвостовой фракции и 2-ом пике элюирования. Данное значение извлечения не сравнимо со значениями, полученными в предшествующих примерах, в которых применяется способ согласно данному изобретению, в которых демонстрируется удовлетворительное устранение полимера и извлечение более чем 90% IgG.

Пример 11

Дополнительный тест разработали для изучения пределов pH и ионной силы (NaCl), которые могут быть использованы, и чтобы узнать влияние концентрации IgG на загрузку.

Различные тесты проводили с пастеризованным IgG, происходящим из различных партий продуктов, обработанных таким же образом, как в примере 3. Тем не менее, в одном из тестов использовали 4-кратное разбавление (до оптической плотности 280 нм = 10 оптических единиц), а остальные с приблизительно 1,5-2 кратными разбавлениями (до оптической плотности 280 нм = 20-23 оптических единиц), используя 10 мМ раствор ацетата натрия, и в каждый из них добавляли NaCl, необходимый для достижения требуемой итоговой концентрации между 0,275 M и 0,45 M, доводя до итогового pH, равного 4,2 и 5,5, соответственно. Данные регулировки pH осуществляли, используя разбавленную уксусную кислоту. Отрегулированные растворы инжектировали в колонку POROS® HS 50 (Applied Biosystems, Соединенные Штаты) в независимых циклах, как описано в примере 4, но в данном случае используя между приблизительно 150 и 750 мг IgG/мл геля в проведенных тестах.

Содержание (%) полимера и димера определяли посредством HPLC, а извлечение IgG (%) определяли для различных значений загрузки. Полученные значения показаны в Таблице 15.

На основе различных пастеризованных партий, имеющих первоначальное содержание полимеров, эквивалентное и менее, чем 3%, было продемонстрировано, что для любого отрегулированного значения в исследованных пределах в данном Примере (pH 4,2-5,5 и NaCl 0,20-0,45 M) имеется возможность избирательной адсорбции полимеров до значений между ≤0,06%-0,12%, эквивалентных уменьшению между 93% и ≥98%, и извлечению избытка IgG, равному 80% (91,0-99,5% достигалось между pH 4,2 и 5,0). Также как следует указать, что емкость загрузки и эффективность колонки не снижаются, когда концентрация белков в растворе продукта увеличивается до значения оптической плотности при 280 нм, равной 23 оптических единиц, эквивалентной 14,7-16,5 мг IgG/мл, при этом достигаются загрузки, равные 580-590 мг IgG/мл геля. Однако, на верхнем конце диапазона pH (pH 5,5) солевой раствор необходимо значительно уменьшить (с 0,45 M до 0,2 M) для того, чтобы добиться значительного уменьшения полимера. Также как наблюдается более низкая емкость загрузки, чем при более низких значениях pH, потому что когда используют 403 мг IgG/мл геля, определяют более большое содержание полимеров, причем их уменьшение составляет только 86%. Данный эффект может быть приписан наличию большего количества димерных молекул, имеющихся при pH 5,5, доля которых увеличивается с pH, по сравнению с pH 4,2.

Пример 12

Из предшествующих Примеров 6, 8 и 11 была определена эмпирическая формула (1) для полистироловой перфузионной смолы POROS®-HS 50, из которой возможно установить с большей точностью концентрацию NaCl, необходимую для того, чтобы получить желательные результаты для итогового полимера и извлечения в качестве функции используемого pH. Выражение: (1) [NaCl] = 0,24+(5,2-pH)/5=1,28=0,2 × pH обеспечивает приблизительно желательные значения в пределах диапазона pH, установленного (pH 4,2-5,5) для изучаемой смолы. На основе данных в примерах, в Таблице 16 показаны концентрации NaCl, необходимые при различных pH (наблюдаемое значение и значение, рассчитанное согласно формуле) для итогового полимера, предпочтительно ≤0,1%, и извлечения не меньше, чем 90%.

Результаты в Таблице 16 показывают хорошую прямолинейную корреляцию между наблюдаемыми значениями и значениями, рассчитанными согласно формуле, включая крайние значения pH.

Пример 13

Плазму подвергали обработке таким же образом, как в примере 1, для получения очищенного раствора поливалентного IgG (чистота ≥97% IgG) посредством фракционирования этанола (согласно методу по Cohn-Oncley). Полученную Fr-II диафильтровали через 10 кДа мембраны до 60 оптических единиц и впоследствии пастеризовали (10-11 часов при 60-61°C) в присутствии 33% d-сорбитола (масса/масса) и при pH, равном 5,5±0,5. Пастеризованный раствор разбавляли приблизительно в 4 раза 10 мМ раствором ацетата натрия при pH 4,85 для того, чтобы оптическая плотность при 280 нм изменялась с 42,8 оптических единиц до 10,7 оптических единиц, и добавляли NaCl до тех пор, пока не получали итоговую концентрацию, равную 0,275 моль на литр раствора, доводя pH до 4,85 с использованием 0,1 M HCl. Доля полимера, определенного посредством HPLC, составляла 0,88%. Непосредственно после этого его инжектировали в колонку с полистироловыми катионообменными смолами (50 мкм POROS-HS®) и объемом, равным 8,0 мл (поперечное сечение 0,8 см² × высота 10 см) с потоком, равным приблизительно 20 CV/час. Получали образцы элюата колонки при различных применяемых объемах загрузки (CV) и для итогового пула, определяя молекулярное распределение (полимеры с высокой молекулярной массой) посредством HPLC и полученное уменьшение. Найденные значения показаны в Таблице 17.

Полученные результаты показывают, что с наилучшими условиями для процесса адсорбции возможно задерживать все полимеры (до ≤0,06%), образовавшиеся при пастеризации IgG, ранее очищенного посредством фракционирования этанола с высокой инжекционной загрузкой (385 мг IgG/мл смолы).

Пример 14

Данный тест разработали для определения целесообразности способа, когда различные стадии очистки включают в единственную стадию. Было решено определить, можно ли объединить адсорбцию полимера с предшествующей необязательной стадией обработки растворителем-детергентом и последующей адсорбцией этих реагентов.

Для того, чтобы это сделать, первоначальным материалом был Fr-II+III, который подвергали обработке таким же образом, как в примере 3 для получения основного объема пастеризованного раствора. Данный раствор разбавляли до оптической плотности при 280 нм, равной 28±1 оптических единиц (приблизительно 2% белка), и добавляли концентрированный раствор (x 10 раз) раствора растворителя-детергента, содержащего три-n-бутил фосфат и Triton X-100 для достижения итоговых концентраций 0,3±0,1% и 1,0±0,3%, соответственно. Температуру раствора повышали до 25±2°C и гомогенизировали в течение приблизительно 30 минут. Затем его переносили в еще один подходящий сосуд для того, чтобы инкубировать в течение приблизительно 6 часов при 25±2°C. После обработки раствор разбавляли приблизительно на 10% 100 мМ натрия ацетата и 2,75 M раствора NaCl для того, чтобы итоговые концентрации составляли 1/10 части добавленных, и концентрация белка составляла 16,5 мг/мл. pH раствора при необходимости доводили до 4,85±0,05 0,1 M HCl, с получением объема, равного 167 мл.

Перед этим кондиционировали колонку с объемом 17,5 мл и высотой 10 см с гидрофобными смолами (C8 углеводород) и матрицей с силаноловыми группами (SDR-HyperD® by Pall, Соединенные Штаты) и еще одну колонку POROS-HS® с катионными смолами (50 мкм, Applied Biosystems, Соединенные Штаты) объема 8,0 мл. Две колонки последовательно соединяли таким образом, чтобы первая (SDR-HyperD®) снабжала вторую (POROS-HS®), и их кондиционировали посредством пропускания через них уравновешивающего раствора, содержащего 10 мМ натрия ацетата, 0,275 M NaCl при pH, равном 4,85±0,05, в потоке, эквивалентном 6 CV/час и 13 CV/час для первой и второй колонки, соответственно.

В первую колонку SDR-HyperD® инжектировали предварительно приготовленный раствор IgG (167 мл), и элюат из последней подавали во вторую колонку POROS-HS®. Значения загрузки, рассчитанные для каждой колонки, составляли: 1) 167 мл/17,5 мл = 9,5 CV для колонки SDR-HyperD®; 2) 167 мл/8,0 мл = 21 CV для колонки POROS-HS®. Инжектируемый поток в течение всего способа составлял 6 и 13 CV/час для первой и второй колонок, соответственно. В конце загрузки проводили последующее промывание приблизительно 2 CV уравновешивающего раствора, собирая весь элюат из колонок в пул.

Результаты молекулярного распределения (HPLC) и белка (посредством 280 нм оптической плотности) для каждой стадии подытожены в Таблице 18.

Результаты выше показывают, что процесс адсорбции полимера мог быть полностью включен и проводиться одновременно с другими стадиями способа, в результате чего уменьшается общее время, вместе с расходованием реагентов в предшествующем кондиционировании и последующем промывании.

Пример 15

Тестировали способность удерживания полимера различных коммерчески доступных катионных смол для достижения наилучшего возможного отделения в отношении мономеров/димеров IgG. Для того, чтобы это сделать сравнивали матрицы смолы различного происхождения, особенно акриловые (Toyopearl®) против агарозной (Sepharose®). Смолы закладывали в колонки с поперечным сечением, равным 1,75 см²,с высотой закладки каждой, равной 100 мм (XK16® от GE-Healthcare) со смолами GigaCap Toyopearl-S 650® и SP-Sepharose XL®.

Первоначальным материалом была смесь различных партий пастеризованного раствора IgG, обработанного, как в примере 3, в который добавляли NaCl до 0,275 M и 0,20 M, доводя при необходимости pH до 4,85±0,05 с помощью 0,1 M HCl. Растворы имели концентрацию белков приблизительно 22 оптические единицы и до 50 CV инжектировали при потоке, равном приблизительно 15 CV/час в колонки, которые были приготовлены и кондиционированы теми же концентрациями NaCl и с pH, как раствор IgG в тесте.

Результаты извлечения полимера, полученные для различных используемых объемов колонки, по сравнению с первоначальным, показаны в Таблице 19.

Общее извлечение белка, варьирующее от 98% до 100% для смолы SP-Sepharose XI, и от 90 до 100% для GigaCap-S 650M (приблизительно 98% при 10 CV и 0,2M NaCl).

Результаты выше показывают, что акриловые катионные смолы (типа GigaCap-S® 650M), как POROS-HS® (катионный полистирол), способны избирательно удерживать полимер, образованный посредством пастеризации IgG с возможностью уменьшения имеющегося полимера до 85% (15% извлечение) для загрузки белка, равной 158 мг/мл геля и извлечения общего белка, равного 98%. Очевидно, полученный результат может быть оптимизирован по отношению к pH (уменьшая его), улучшая емкость загрузки для достижения, например, приблизительно 25 CV (396 мг белка/мл геля).

Было обнаружено, что смолы из несинтетических матриц агарозного типа (Sepharose XI) не обладают достаточной разрешающей способностью для отделения полимеров от мономеров/димеров IgG в заданных условиях для избирательной адсорбции первых в загружаемом элюате.

Также как должно быть видно, что наиболее подходящие условия pH и концентрации NaCl являются специфичными для типа используемой синтетической перфузионной смолы. Соответственно для акриловой смолы типа GigaCap-S® 650M при pH 4,85 необходимо не более, чем 0,2 M NaCl, тогда как для POROS-HS® 50 мкм смолы будет необходимо 0,3 M NaCl.

Ясно, что квалифицированный специалист в данной области может найти наиболее подходящее соотношение между pH и концентрацией NaCl для каждого типа синтетической перфузионной смолы.

Пример 16

Затем проверяли масштабируемость способа в стадиях до конечного продукта, полученного в виде готовой формы и концентрированного в виде IGIV с 10% белка, исследуя композиционные характеристики продукта.

Пул плазмы более, чем 1000 литров фракционировали с этанолом для получения Fr-II+III, и очистку продолжали до тех пор, пока не получали основную массу пастеризованного раствора, как описано в примере 3.

6,34 кг пастеризованного ранее раствора (эквивалентно приблизительно 26,2 литрам первоначальной плазмы), брали после разбавления водой для инъекций до оптической плотности, равной 27,98 оптических единиц (при 280 нм), и электропроводности, равной 0,26 мС/см, проверяя, чтобы его pH составлял 4,65. Приблизительно 0,70 кг концентрированного раствора (x 10 раз) 3% три-n-бутилфосфата и 10% Triton X-100 добавляли в течение приблизительно 5-10 мин с жестким встряхиванием. pH доводили до 4,79 посредством добавления 0,1 M NaOH. 7,04 кг раствора получали и инкубировали при окружающей температуре (18-25°C) в течение до 6 часов. Содержание три-n-бутилфосфата определяли посредством газовой хроматографии, чтобы оно составляло 0,28% (2800 м.д.).

Впоследствии добавляли 1,5 M раствора NaCl, имеющего в своем составе 10 мм натрия ацетата при pH 4,85 для достижения итоговой концентрации NaCl, равной 0,275 M. Полученный в результате pH составлял 4,81. Впоследствии 6930,9 г раствора получали и инжектировали в колонку с диаметром 140 мм, заключающую в себе 770 мл смол SDR-HyperD® (от Pall), причем высота смолы составляла 50 мм. Инжектирование осуществляли при окружающей температуре и при эквивалентном потоке, равном 6,1 CV/час, таким образом, чтобы весь раствор был загружен менее, чем за 2 часа. Полученное в результате общее загрузочное соотношение составляло 9 CV (6,93 кг/0,770 л = 9,0 CV). Впоследствии осуществляли последующее промывание, используя 3 CV 0,275 M NaCl и 10 мм раствора ацетата натрия при pH 4,85. Получали 6,93 кг элюата колонки, извлеченного в процессе инжектирования раствора продукта, при этом pH составлял 4,82, а электропроводность 16,75 мС/см. Содержание три-n-бутилфосфата, определяемое аналитически посредством газовой хроматографии, составляло ≤5 м.д.

5,772 кг элюата выше брали и инжектировали в 222 мл колонку со смолами POROS HS® (50 мкм), диаметр колонки составляет 50 мм, а высота слоя 113 мм. Раствор инжектировали в колонку при окружающей температуре с потоком, равным приблизительно 10 CV/час, таким образом, чтобы процесс заканчивался приблизительно через 2,5 часа. Весь элюат колонки, полученный в процессе загрузки продукта, собирали и объединяли с 1 CV дополнительного промывания раствором 0,275 M NaCl, 10 мм натрия ацетата и 17% сорбитола (масса/масса) при pH 4,85. Получали 5,776 кг пула элюата из колонки, извлекаемого в процессе инжектирования раствора продукта, при этом оптическая плотность составляет 18,508 оптических единиц (280 нм), pH составляет 4,84 и электропроводность составляет 16,95 мС/см.

Пул элюата выше очищали посредством фильтрования через 0,1 мкм, а затем последовательного нанофильтрования с градиентом пористости, равным 35 нм (Planova® 35N) + 20 нм (Planova® 2ON). При завершении нанофильтрации продукта его дополнительно промывали объемом, эквивалентным 5% извлеченного объема того же самого раствора дополнительного промывания, используемого в колонке POROS HS®, при этом общая продолжительность процесса составляет приблизительно 18 часов. Количество полученного нанофильтрата составляло 6,797 кг, pH составлял 4,83, мутность 2,71 NTU (нефелометрическая единица мутности), а электропроводность 17,1 нС/см.

Нанофильтрованный раствор ультрафильтровали через полиэфирсульфоновую мембрану, имеющую номинальное отсечение по молекулярной массе 100 кДа. Сперва продукт концентрировали в 3,3 раза, от оптической плотности, равной 14,4 оптических единиц (280 нм) до приблизительно 50±10 оптических единиц (280 нм), а затем его диафильтровали при постоянном объеме приблизительно 7 объемами раствора для диализа, содержащего 2 мМ уксусной кислоты, доведенной до pH 4,2±0,2 с помощью NaOH. После проверки электропроводности (220 мкс/см), добавляли достаточное количество концентрированного 33% раствора сорбитола для приведения итоговой концентрации сорбитола приблизительно к 5% (масса/объем). В заключение его концентрировали приблизительно в 3,5 раза для достижения оптической плотности, равной 140±5 оптических единиц (280 нм), эквивалентной приблизительно 10% белку, а pH доводили до 5,25±0,25 с помощью 0,1 M NaOH. Получали 552,1 г раствора с итоговым pH, равным 5,26, с мутностью, равной 5,45 NTU, и электропроводностью, равной 1,18 мС/см. Данный раствор фильтровали через 0,22 мкм и расфасовывали в бутылки, при этом pH составлял 5,34, осмоляльность 330 мОсм/кг, мутность 4,62 NTU, а электропроводность 1,34 мС/см. Продолжительность процесса для данной стадии составляла 9,5 часов.

Дозированные бутылки выдерживали при 5±3°C и 25±2°C в течение более, чем 15 дней без проявления каких-либо признаков загустевания или мутности или осадкообразования, изменений цвета или появления видимых волокон или частиц.

Таблица 20 показывает результаты для полимеров, димера, мономера и фракций на различных стадиях всего способа получения.

Из результатов выше понятно, что регулирование содержания димеров (≤5%), которое достигается, как проиллюстрировано ранее в предшествующих примерах за счет регулирования pH и концентрации соли в продукте перед колонкой POROS (в Пастеризованном и SDR элюате), обеспечивает возможность превосходной адсорбции имеющегося полимера (≤0,06%), минимизируя потери димера IgG (2,6% в SDR элюате и 1,9% в POROS элюате).

Можно сделать заключение, что весь способ получения IGIV, за счет включения стадии устранения агрегатов/полимеров с помощью обработки SD и их отделения, вместе с нанофильтрацией, диафильтрацией и итоговым получением готовой формы является полностью жизнеспособным и масштабируемым, при этом получаются превосходные значения конечного продукта в отношении содержания полимеров (≤0,06%) и фракций (0,1%).

Пример 17

Полученный продукт (10% IGIV) в примере 16, расфасованный в 20 мл стеклянные бутылки по 10 мл в бутылку, герметично запечатанные 20 мм Ø бутилкаучуковыми пробками, хранили при окружающей температуре (25±5°C), без доступа света, в течение 12 месяцев.

Спустя некоторое время, которое было установлено длиной приблизительно в 1 год, их визуально обследовали (физический внешний вид), и аналитически определяли параметры, наиболее показательные для стабильности. Значения, полученные в начале (t=0) и конце хранения (t=1 год), показаны в Таблице 21. Аналогичным образом также включены нормальные значения, полученные в промышленном масштабе с использованием состояния уровня техники (Патент ES-200100101).

Что касается внешнего вида, было обнаружено, что он не ухудшается в образцах ни в результате наличия частиц (волокон, сгустков или осадка) или мутности (прозрачности), или окрашивания (обесцвечивания). Можно сделать заключение, что полученный продукт сохранялся по существу неизменным (полимеры, ферменты, такие как PKA, ACA и т.д.) в течение 1 года при окружающей температуре, равной 25±5°C, при этом продукт соответствует значениям, утвержденным в Европейской Фармакопее (Eur.Ph.).

Пример 18

Одну партию подвергали обработке с подготовительным коэффициентом масштабирования, эквивалентным Примеру 16 только с одним изменением в порядке последовательности стадий инактивации вирусов таким образом, чтобы обработку SD осуществляли на первоначальном диафильтрованном материале, а затем данные реагенты адсорбировали смолами SDR-HyperD®, а затем остальные стадии способа, необходимые для получения продукта согласно изобретению, то есть пастеризацию в присутствии сорбитола и улавливание молекулярных агрегатов с использованием перфузионных смол POROS HS, проводили таким же образом, как в примере 16. В заключение, в полученном продукте, стабилизированном 5% сорбитолом, концентрацию белков IGIV поднимали до 10%, стерилизовали его посредством фильтрации и расфасовывали в 20 мл стеклянные бутылки. Бутылки, герметично запечатанные бутилкаучуковыми крышками, хранили в холодной камере при 5±3°C в течение приблизительно 1 года, а затем определяли наиболее существенные параметры для стабильности, включая визуальный осмотр. Полученные результаты в начале (t=0) и после хранение (t=приблизительно 1 год), вместе со спецификациями Eur.Ph. Показаны в Таблице 22.

Что касается внешнего вида, было обнаружено, что он не ухудшался в образцах за счет наличия частиц (волокон, сгустков или осадка) или мутности (прозрачности), или окрашивания (обесцвечивания). Полученный продукт сохранялся по существу неизменным (например, полимеры/фрагменты и протеолитические ферменты, такие как PKA) в течение более, чем приблизительно 1 года при температуре, равной 5±3°C, при этом продукт соответствует значениям, утвержденным в Европейской Фармакопее (Eur.Ph.).

Реферат

Изобретение относится к способу получения композиции IgG из раствора IgG, частично очищенного от человеческой плазмы и имеющего содержание IgG более чем 95% по отношению к сумме белков. Способ включает следующие стадии: (а) диафильтрации частично очищенного раствора IgG до достижения концентрации этанола менее чем 0,5% (масса/объем); b) стабилизации раствора, полученного на стадии а), с использованием сорбитола в качестве стабилизирующего агента при концентрации сорбитола между 30 мас.% и 35 мас.%; c) тепловой обработки раствора, полученного на стадии b), при температуре между 55ºС и 63ºС, в течение периода времени между 1 и 24 ч; d) избирательной адсорбции агрегатов и/или полимеров с высокой молекулярной массой из раствора, подвергнутого тепловой обработке на стадии с), посредством катионной хроматографии; и e) диафильтрации и получения в виде готовой формы раствора, полученного на стадии d). Изобретение обеспечивает стабильность конечного продукта. 26 з.п. ф-лы, 22 табл., 18 пр.

Формула