Способ получения раствора гамма-глобулина, предназначенного для внутривенного введения, и продукт, получаемый этим способом - RU2198668C2

Чертежи

Описание

Изобретение относится к многоэтапному коммерческому процессу получения иммунного сывороточного глобулина, предназначенного для внутривенного введения и содержащего в качестве главного ингредиента IgG (g-глобулин).

Из уровня техники известны различные процессы получения растворов g-глобулина для внутривенного введения, исходным материалом для которых служат фракции человеческой плазмы (фракции Кона). Некоторые из фракций Кона содержат более высокие титры g-глобулина, чем другие. Обычно исходным материалом для получения растворов g-глобулина являются фракция Кона II или фракция Кона II + III.

В известных из уровня техники процессах используются различные методики разделения и стерилизации, постоянно вводятся модификации с целью повышения чистоты конечного продукта, его безопасности и общего выхода.

Во многих коммерческих процессах для инактивации вирусов применяется этап обработки растворителем/детергентом или этап тепловой обработки. На сегодня не известны многостадийные процессы, для которых исходным материалом служили бы паста фракции Кона II или паста II+III и которые бы включали две различные процедуры инактивации вирусов как часть эффективного процесса производства g-глобулина с высоким выходом.

В патенте США 5151499 Kameyama et al. описан процесс получения белковых композиций, согласно которому белковую композицию подвергают инактивации оболочечных вирусов обработкой белковой композиции растворителем/детергентом и инактивации безоболочечных вирусов тепловой обработкой белковой композиции. В патенте отмечается, что этап обработки растворителем/детергентом предпочтительно осуществлять первым и в присутствии ингибитора протеаз, а уже затем проводить тепловую обработку. Когда тепловую обработку проводят в жидкой фазе, то белок выделяют из смеси растворитель/детергент адсорбцией на ионообменной колонке до тепловой обработки. Тепловая обработка в жидкой фазе может осуществляться в присутствии в качестве стабилизатора сахара, сахарного спирта или аминокислот. При том, что в патенте '644 перечислены многочисленные исходные белковые композиции, приведенные примеры получения ограничиваются Фактором IX, тромбином, фибриногеном и фибронектином. Удаление денатурированного белка, образовавшегося на этапе тепловой обработки, не рассматривается.

В некоторых известных из уровня техники процессах получения предназначенных для внутривенного введения растворов g-глобулина описывается введение тепловой обработки в жидкой фазе, проводимой в присутствии сорбитола в качестве теплового стабилизатора, как этапа многостадийной процедуры очистки, исходным материалом для которой служит паста фракций Кона II+III. В патенте США 4876088 Hirao et al. фракцию Кона II+III подвергают фракционированию полиэтиленгликолем (далее ПЭГ) (сначала 8% в/о ПЭГ, затем - 12% в/о ПЭГ), затем ионобменной хроматографии (ДЕАЭ-Сефадекс), и удаляют антитела группы крови человека до тепловой обработки в жидкой фазе в присутствии сорбитола как стабилизатора белка. С другой стороны, в примере 1 патента США 4876088 Hirao et al. описывают получение раствора g-глобулина для внутривенного введения из пасты фракции II+III. При этом пасту суспендируют в воде, рН доводят до 5,5 и центрифугируют, после чего супернатант подвергают тепловой обработке для инактивации вирусов в присутствии 33% в/о сорбитола. Затем следует фракционирование ПЭГом (6%/12%), при котором удаляется денатурированный белок, и другие этапы очистки, включая ионобменную хроматографию на ДЕАЭ-Сефадексе.

Целью настоящего изобретения явилась разработка объединяющего, многоэтапного коммерческого процесса получения высокоочищенного иммунного раствора g-глобулина на основе процесса фракционирования Кона.

Другой целью настоящего изобретения явилось получение очень чистого, предназначенного для внутривенного введения раствора g-глобулина, свободного как от оболочечных вирусов, так и безоболочечных вирусов, включая все температурочувствительные вирусы.

Другой целью настоящего изобретения было создание коммерческого процесса получения g-глобулина, который предусматривал бы удаление до второй стадии инактивации вирусов любого денатурированного белка, образовавшегося при тепловой стерилизации.

Перечисленные выше и другие цели, которые очевидны для квалифицированного специалиста, были достигнуты в настоящем изобретении, согласно которому спиртовые фракции Кона, которые могут быть частично очищены, но обогащены g-глобулином, подвергают тепловой обработке в водной среде в присутствии теплового стабилизатора для инактивации вирусов, затем проводят фракционирование ПЭГом и вторую инактивацию вирусов в присутствии растворителя или, предпочтительно, смеси растворитель/детергент для разрушения оболочечных вирусов, после чего следует удаление растворителя или смеси растворитель/детергент.

Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, тепловым стабилизатором служит сорбитол, а в качестве растворителя используется триалкилфосфат.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, денатурированные продукты, образовавшиеся в результате инактивации вирусов тепловой обработкой, удаляют фракционированием ПЭГом до второй вирусной инактивации, получая тем самым дополнительно очищенный чистый, прогретый g-глобулин.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, любые присутствующие частицы удаляются до этапа обработки растворителем /детергентом.

Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, получают стерилизованный теплом и растворителем/детергентом g-глобулин, пригодный для внутривенного введения.

В качестве исходного материала используются фракции, содержащие иммуноглобулины. Эти фракции необязательно должны быть фракциями сыворотки человека, но должны содержать иммуноглобулины. Конкретными примерами таких содержащих иммуноглобулины фракций служат фракция II+III и фракция II, получаемые при фракционировании этанолом по Кону, а также паста эквивалентных им содержащих иммуноглобулины фракций. Другими исходными материалами служат фракции I+II+III и фракция II+IIIw. Исходный материал может содержать такие примеси, как антитела группы крови человека, плазминоген, плазмин, калликреин, прекалликреин активатор, полимеры IgM, IgA, IgG (обозначаемые как "агрегаты") и т.д.

Предпочтительным исходным материалом являются фракция Кона II или фракция Кона II+III. Когда используется паста фракций II+III, рекомендуется подвергнуть ее предварительной процедуре отмывки с получением фракции II+IIIw, которая и используется в процессе согласно настоящему изобретению. Фракция II+IIIw представляет собой преципитат фракции II+III, промытый раствором динатрий фосфата.

Фракцию II+IIIw можно получить растворением преципитата фракции II+III в холодной воде для инъекций в соотношении примерно 1 кг пасты II+III на 20 объемов воды. Для солюбилизации липидов, липопротеинов и альбумина добавляют раствор фосфата натрия до конечной концентрации 0,003 М фосфата натрия. Затем добавляют холодный этанол до конечной концентрации около 20%. При добавлении спирта температуру постепенно понижают до -5±1^oС, а рН поддерживают на уровне 7,2±0,1, например, добавлением ацетатного буфера или разбавленной соляной кислоты. Образующийся преципитат фракции II+IIIw выделяют центрифугированием и/или фильтрацией при температуре -5±1^oС.

Согласно настоящему изобретению до первого этапа инактивации вирусов могут быть проведены различные предварительные этапы очистки и/или снижения количества агрегатов. Например, когда используется паста фракций II+III, содержащая около 20% спирта и более чем 70% IgG, ее можно суспендировать в от 3-х до 10-ти объемах, предпочтительно в от 3-х до 5-ти объемах холодной воды при температуре около 0-5^oС и с рН, доведенным до значений в интервале 4,5-6,0, предпочтительно в интервале 5,0-5,5, с помощью ацетатного буфера с рН 4,0 или соляной кислотой. Смесь перемешивают от двух до 15-ти часов для того, чтобы весь g-глобулин перешел в раствор. Затем такие нерастворенные белки, как альбумин и а-глобулины, можно удалить центрифугированием и/или фильтрацией.

Если в качестве исходного материала используются различные фракции Кона, то начальный этап или этапы процесса могут быть выбраны соответствущим образом, с тем, чтобы получить фракции с высоким содержанием IgG. Например, когда фракция Кона II (содержащая более 95% IgG) отделена от фракции Кона III, то первоначальная обработка фракции II может проводиться при кислом рН от 3,2 до 5,0, предпочтительно от 3,8 до 4,2, как описано Uemura et al., в патенте США 4371520, с тем чтобы разрушить агрегаты иммуноглобулинов, присутствиеющие среди мономеров и димеров иммуноглобулинов, поскольку известно, что агрегаты обладают анти-комплементарной активностью (АСА).

Альтернативно, когда в качестве исходного материала используется фракция Кона II+III, то согласно патенту США 4371520, обработка низким рН может быть осуществлена как дополнительный этап после этапа первоначальной очистки, описанного выше, и перед инактивацией вирусов тепловой обработкой.

При осуществлении этапа тепловой стерилизации белок иммуноглобулина растворяют в воде, или, если он представялет собой водную смесь, например, фильтрат, полученный после описанной выше частичной очистки, его можно использовать как есть и добавлять к нему сахар, сахарный спирт или аминокислоты в качестве теплового стабилизатора. Тепловым стабилизатором предпочтительно служит сахароза, мальтоза, сорбитол или маннитол, наиболее предпочтительно сорбитол. Сахар или сахарный спирт добавляют к раствору иммуноглобулина в виде порошка или перед добавлением смешивают с небольшим количеством воды и доводят его концентрацию в растворе до от 10 до 50 (в/о)%, до насыщения. В этот момент водный раствор иммуноглобулина содержит достаточное количество воды, так что концентрация общего белка в растворе составляет от 1 до 6%, что соответствует обычному исходному материалу фракций II+III, который содержит около 300 г белка на килограмм пасты.

После добавления теплового стабилизатора смесь нагревают до температуры 50-70^oС в течение 10-100 ч, предпочтительно до 60^oС в течение 10-20 ч для инактивации температурочувствительных вирусов. Этап тепловой обработки не только инактивирует вирусы, но, в силу своего денатурирующего воздействия, может избирательно снижать количество отдельных нежелательных белков, обычно ассоциированных с фракциями Кона II+III, таких как прекалликреин, плазмин, плазминоген и IgA.

После тепловой обработки добавляют холодную воду в таком количестве, чтобы довести концентрацию белка от 0,3 до 2,0%. Раствор охлаждают до 0-2^oС.

Затем проводят фракционирование прошедшего тепловую обработку раствора ПЭГом. Фракционирование ПЭГом является хорошо известным из уровня техники процессом, применяемым для очистки иммунологобулинов, т.е. для отделения нужных мономеров и димеров IgG от агрегатов IgG и других примесей, естественно встречающихся в исходных фракциях белков плазмы. Однако, в описываемом процессе фракционирование ПЭГом также дает возможность отделить нужные мономеры и димеры IgG от нежелательных денатурированных белковых продуктов, образовавшихся при тепловой обработке. К этим денатурированным белковым продуктам относятся денатурированный прекалликреин, плазминоген, плазмин, IgA, IgM и агрегаты.

Может быть использована любая известная из уровня техники процедура фракционирования ПЭГом. Обычно проводят двухэтапное фракционирование ПЭГом. На первом этапе фракционирования ПЭГом концентрацию ПЭГ и рН выбирают таким образом, чтобы нужные мономеры и димеры IgG оставались в растворе, а такие нежелательные белки, как агрегаты, преципитировали из раствора. После центрифугирования и/или фильтрации концентрацию ПЭГ повышают и доводят рН с тем, чтобы преципитировать нужные мономеры и димеры IgG.

Например, первый этап фракционирования ПЭГом можно проводить при рН от 5,0 до 7,5, предпочтительно в интервале значений рН от 6,5 до 7,5, если в качестве исходного материала используется паста фракций II+IIIw, и предпочтительно в интервале значений рН от 5,5 до 6,0, если в качестве исходного материала используется паста фракций II+III, и концентрация ПЭГа варьирует в пределах 4-8%, предпочтительно 4-6%, если в качестве исходного материала используется паста фракций II+IIIw, или 6-8%, если в качестве исходного материала используется паста фракций II+III. При поддержании температуры около 0-2^oС первый этап фракционирования ПЭГом занимает от 1 до 8 ч, после чего преципитат удаляют как описано выше.

Затем рН фильтрата доводят до значения 8.0-9.0, предпочтительно от 8,5 до 8,9, и добавляют еще одну порцию ПЭГ до конечной концентрации от 10 до 15%, предпочтительно около 12%. Образовавшийся преципитат, который представляет собой очищенный иммуноглобулин, удаляют фильтрацией и/или центрифугированием.

Дальнейшие детали процедур фракционирования ПЭГом, применимых для осуществления настоящего изобретения, можно найти в упоминавшихся выше патентах США 4876088 Hirao et al., и 4845199 Hirao et al.

Окончательным необходимым этапом раскрытого в настоящем изобретении процесса является этап второй инактивации вирусов с использованием растворителя или смеси растворитель/детергент. Как описано далее, последующие этапы очистки, в частности, с использованием ионообменных смол, могут осуществляться как до, так и/или после обработки растворителем/детергентом. Особые преимущества имеет процедура, сочетающая анионообменную обработку до инактивации вирусов растворителем/детергентом с катионообменной обработкой после инактивации вирусов растворителем/детергентом. В ходе этой процедуры некоторые нежелательные белковые материалы (такие как прекалликреин активатор, IgA, IgM и альбумин), обнаруживаемые в плазме человека, можно удалить из IgG при помощи анионообменника, а затем эти материалы (прекалликреин активатор, IgA, IgM, альбумин и ПЭГ), а также остатки реагентов, использованных для обработки растворителем/детергентом, можно удалить катионообменной хроматографией.

Если это не было проделано на более ранних этапах процесса, то предназначенный для обработки растворителем/детергентом раствор, должен быть освобожден от любых частиц, к которым может относиться и денатурированный белок. Поэтому предпочтительно профильтровать раствор через 1 микронный или более тонкий фильтр до добавления растворителя/детергента. Это также снизит вероятность попадания вирусов в крупные частицы, где они могли бы избежать контакта с растворителем/детергентом.

В настоящее время наиболее предпочтительным растворителем для инактивации оболочечных вирусов является триалкилфосфат. Триалкилфосфат, используемый при осуществлении настоящего изобретения, не является предметом каких-либо особых ограничений, но предпочтительно использовать три-(n-бутил)-фосфат ("TNBP"). Другими использумыми триалкилфосфатами являются три-(тер-бутил)-фосфат, три-(n-гексил)-фосфат, три-(2-этилгексил)-фосфат и т.д. Возможно применение смеси двух или более различных триалкилфосфатов.

Триалкилфосфат используют в концентрациях от 0.01 до 10 (в/о)%, предпочтительно от 0.1 до 3 (в/о)%.

Триалкилфосфат может применяться как вместе с детергентом или поверхностно активным веществом, так и без них. Предпочтительно использовать триалкилфосфат в сочетании с детергентом. Функции детергента состоят в усилении контакта содержащихся в композиции иммуноглобулина вирусов с триалкилфосфатом.

Примерами детергентов служат полиоксиэтиленовые производные жирных кислот, частичные эфиры безводного сорбитола, такие как Полисорбат 80 (Торговое название: Твин 80, и т.д.) и Полисорбат 20 (Торговое название: Твин 20, и т.д.); и такие неионные агенты, как оксиэтилированный алкилфенол (Торговое название: Тритон Х100, и т.д.), а также другие поверхностно активные вещества и такие детергенты, как цвиттерионные детергенты и т.д.

При применении детергента его не следует добавлять в критических количествах, например, его можно использовать в концентрациях от 0,001 до 10%, предпочтительно от 0,01 до 3%.

Согласно настоящему изобретению обработку иммуноглобулинсодержащей композиции триалкилфосфатом проводят при температуре от 20 до 35^oС, предпочтительно от 25 до 30^oС, на протяжении более чем одного часа, предпочтительно от 5 до 8 ч, наиболее предпочтительно от 6 до 7 ч.

Во время обработки триалкилфосфатом иммуноглобулин находится в водной среде в виде раствора с концентрацией белка от 3 до 8%.

Если анионообменная обработка не была проведена до обработки растворителем/детергентом, то ее можно осуществить с уже обработанным растворителем/детергентом иммуноглобулином. Предпочтительно хотя бы катионообенную обработку проводить с обработанным растворителем/детергентом иммуноглобулином. Ионообменную обработку проводят с иммуноглобулином, растворенным в водном растворителе, обычно с рН около 5-8, с достаточно низкой ионной силой для максимальной адсорбции IgG. Концентрация белка обычно находится в пределах 1-15 (в/о)%, более предпочтительно в пределах 3-10 (в/о)%. Ионообменник уравновешивают тем же самым водным растворителем, в котором растворяют иммуноглобулин. Можно применять как непрерывный, так и порционный (бэтч) процесс. Например, при осуществлении порционной анионообменной обработки раствор иммуноглобулина смешивают с анионообменником в количестве от 10 до 100 мл на мл предварительно обработанного анионообменника (например, 1 г смолы ДЕАЭ Сефадекс А-50 набухает приблизительно до 20 грамм влажного веса в 0,4% растворе хлорида натрия), перемешивание смеси при 0-5^oС на протяжении 0,5-5 ч, с последующим фильтрованием или центрифугированием от 6000 до 8 000 об/мин в течение 10-30 мин с получением супернатанта. При осуществлении непрерывного процесса раствор иммуноглобулина пропускают через колонку с анионообменником со скоростью от 10 до 100 мл на мл анионообменника и собирают несвязавшуюся фракцию.

Используемый анионообменник, например, содержит анионообменные группы, связанные с нерастворимым носителем. К анионообменным группам относятся диэтиламиноэтил (ДЕАЭ), группа четвертичного аминоэтила (QAE) и т.д., а к нерастворимым носителям относятся агароза, целлюлоза, декстран, полиакриламид и т.д.

К приемлемым катионообменникам относятся карбоксиметил Сефадекс (СМ-Сефадекс), СМ-целлюлоза, SP-Сефадекс, СМ-Сефароза и S-Сефароза. 1 мл предварительно обработанного катионообменника (например, 1 г смолы ДЕАЭ Сефадекс С-50 набухает приблизительно до 30-35 г влажного веса в 0,4% растворе хлорида натрия) смешивают с 0.5-5.0 мл раствора иммуноглобулина и перемешивают при 0-5^oС в течение 1 - 6 ч. Суспензию центрифугируют или фильтруют для отделения сорбировавшей IgG смолы. Может также применяться и непрерывный процесс.

При катионообменной обработке в описанных условиях IgG сорбируется и, после промывки сорбировавшей белок катионообменной смолы, IgG можно элюировать, например, 1,4 N раствором хлорида натрия.

После проведения описанных выше этапов процесса IgG осветляют, диафильтруют и концентрируют до необходимой степени. При необходимости можно добавить такой стабилизатор, как D-сорбитол и провести окончательное доведение концентраций с тем, чтобы получить раствор, содержащий около 100 мг/мл IgG и около 50 мг/мл D-сорбитола, с рН около 5,4. Этот раствор затем стерилизуют фильтрованием через стерилизованный фильтр, задерживающий бактерий, и ампулируют.

Следующие примеры приведены для иллюстрации изобретения и не ограничивают его объем.

При необходимости, с описанным выше процессом можно сочетать и другие процедуры очистки иммуноглобулинов. Например, можно использовать этап осветления бентонитом, полезный для снижения количества калликреина и прекалликреин-активатора. Иллюстрацией служит приведенный ниже пример 1.

Пример 1. g глобулин, подвергнутый тепловой обработке и обработке растворителем / детергентом
685 г пасты фракции II+IIIw суспендируют в 11,9 кг холодной воды. К суспензии добавляют раствор ацатат-тригидрата натрия до конечной концентрации около 0,04 М для избирательной солюбилизации IgG. После перемешивания в течение 15 мин рН суспензии доводят до 4,8 ацетатным буфером с рН 4,0. К суспензии добавляют холодный спирт (95%) до конечной концентрации 17%. Во время добавления спирта температуру суспензии постепенно снижают до -6^oС. К суспензии в качестве фильтрующего агента добавляют 303 г Целита 535 (Celite Corporation) до конечной концентрации около 2%. После перемешивания в течение 1 часа Целит и пасту фракции III, содержащие такие ненужные белки, как плазмин, плазминоген, IgA и IgM удаляют фильтрацией с помощью фильтровального пресса. Фильтрат затем осветляют, пропуская через фильтры 0,45 мкм и 0,2 мкм.

рН осветленного раствора фракции II+III доводят до 4.0 добавлением 0,1 N соляной кислоты и концентрируют ультрафильтрацией до объема 3,4 л (1/5 первоначального объема). К концентрированному раствору добавляют холодную воду в объеме, равном объему, удаленному при первой ультрафильтрации, и раствор опять подвергают ультрафильтрации до 1/5 первоначального объема. На этом этапе концентрация белка в растворе составляет около 2%. Раствор концентрируют до примерно 4,0% белка и подвергают диафильтрации против холодной воды до тех пор, пока проводимость раствора не падает ниже 300 мкС/см, что способствует предотвращению агрегатов и снижению денатурации при тепловой обработке. Раствор опять концентрируют до 8,8% белка. К раствору добавляют D-сорбитол до конечной концентрации около 33%. После перемешивания в течение 30 мин рН содержащего сорбитол раствора доводят до 5,5 добавленим 0,5 N гидроксида натрия. Затем раствор нагревают в течение 10 ч при 60^oС. После тепловой обработки к раствору добавляют 3 объема холодной воды и разбавленный раствор охлаждают до 0-2^oС.

рН раствора доводят до 6,9 добавленим 0,25 N гидроксида натрия и к раствору добавляют 50%-ный полиэтиленгликоль (ПЭГ) 3350 до конечной концентрации 4%. Концентрацию хлорида натрия в растворе доводят до 8 мМ для облегчения преципитации примесей и агрегатов при рН 6,9. Образовавшийся преципитат удаляют фильтрацией. рН фильтрата доводят до 4.8 добавленим 0.1 N соляной кислоты и добавляют бентонит конечной концентрации около 0,25%. рН суспензии бентонита доводят до 5,2 и суспензию фильтруют для удаления бентонита. рН фильтрата доводят до 8,5 добавленим 0,25 N гидроксида натрия и к раствору добавляют 50%-ный полиэтиленгликоль (ПЭГ) 3350 до конечной концентрации 12%. Образовавшийся преципитат (очищенный иммунный глобулин) удаляют центрифугированием.

Около 175 г пасты очищенного как описано выше иммуноглобулина суспендируют в 750 г 0,3% раствора хлорида натрия. рН суспензии доводят до 5,5 и суспензию перемешивают 2,5 ч.

К раствору добавляют 62 г предварительно уравновешенной (0,3%-ным раствором хлорида натрия с рН 5,5) смолы СМ-Сефадекс А-50 и суспензию перемешивают 2 ч. Затем суспензию фильтруют для удаления смолы. Концентрацию хлорида натрия доводят до 0.4% и к фильтрату добавляют смесь три-n-бутил фосфата (TNBP) и Полисорбата 80, так, чтобы конечная концентрация TNBP составляла 0,3%, а Полисорбата 80 -1%. После инкубации в течение ночи рН раствора доводят до 5,8 и добавляют 860 г предварительно уравновешенной (0,4%-ным раствором хлорида натрия с рН 5,8) смолы СМ-Сефадекс С-50. После перемешивания в течение 2 ч суспензию фильтруют. После трехкратной промывки смолы СМ-Сефадекс 0,3% хлоридом натрия, адсорбированный IgG элюируют 1,4 N хлоридом натрия. Элюат осветляют и подвергают диафильтрации и концентрированию. Добавляют D-сорбитол и проводят окончательное доведение концентраций с тем, чтобы получить раствор с концентрацией 100 мг/мл IgG и около 50 мг/мл D-сорбитола с рН 5,4. Затем стерилизуют фильтрованием через стерилизованный фильтр, задерживающий бактерий, и ампулируют.

Промежуточный этап обработки бентонитом, описанный в данном примере, полезен для уменьшения присутствия таких гипотензивных ферментов, как калликреин и прекалликреин активатор (см. табл.1).

Пример 2. g глобулин, подвергнутый тепловой обработке и обработке растворителем/детергентом
Один (1) кг пасты фракции II+III суспендируют в 4,5 кг холодной воды при 0-2^oС. После перемешивания в течение 1 ч рН суспензии доводят до 5,0 добавлением 1N соляной кислоты. После перемешивания в течение 3 ч при рН 5.0 преципитат удаляют центрифугированием. К центрифугату добавляют D-сорбитол до конечной концентрации 33% и смесь перемешивают 1 ч. рН суспензии доводят до 5,5 и затем ее прогревают при 60^oС в течение 10 ч. После тепловой обработки к раствору добавляют 3 объема холодной воды и разбавленный раствор охлаждают до 0-2^oС. Добавляют 50%-ный раствор ПЭГ 3350 до конечной концентрации ПЭГа 6%. рН содержащей ПЭГ суспензии доводят до 5,7 добавлением 0,5 N гидроокиси натрия и суспензию перемешивают 2 ч. Промытый кислотой Целит 535 добавляют до конечной концентрации 1,5% и суспензию перемешивают 1 ч. Преципитат вместе с целитом удаляют фильтрацией. рН фильтрата доводят до 8,8 добавлением 0,5 N гидроокиси натрия, концентрацию ПЭГа доводят до 12% добавлением 50%-ного раствора ПЭГ. рН суспензии доводят до 8,8, суспензию перемешивают 1 ч и фильтруют, собирая пасту очищенного иммуноглобулина. Было получено около 251 г пасты очищенного иммуноглобулина.

251 г пасты очищенного иммуноглобулина, полученной как описано выше, суспендируют в 1,4 кг 0,3% раствора хлорида натрия. После перемешивания в течение 1 ч рН суспензии доводят до 6,0 добавлением 5% уксусной кислоты. После полного растворения пасты добавляют 104 г предварительно уравновешенной (0,3%-ным раствором хлорида натрия с рН 6,0) смолы СМ-Сефадекс А-50 и раствор перемешивают 2 ч. Смолу удаляют фильтрацией. Затем фильтрат осветляют фильтрацией через фильтр 0,2 мкм. Концентрацию хлорида натрия в осветленном растворе доводят до 0,4%. Затем к раствору добавляют смесь три-n-бутил фосфата (TNBP) и Полисорбата 80, так, чтобы конечная концентрация TNBP составляла 0,3%, а Полисорбата 80 - 1%. Раствор инкубируют при 27^oС 1 ч и оставляют на ночь в холодильнике при 4^oС. На следующий день рН раствора доводят до 5,8 и добавляют 1,8 кг предварительно уравновешенной (0,4%-ным раствором хлорида натрия с рН 5,8) смолы СМ-Сефадекс С-50. После перемешивания в течение 2 ч смолу удаляют фильтрацией. После трехкратной промывки смолы СМ-Сефадекс 0,3% хлоридом натрия, адсорбированный IgG элюируют 1,4 N хлоридом натрия. Элюат осветляют и подвергают диафильтрации и концентрированию. Добавляют D-сорбитол и проводят окончательное доведение концентраций с тем, чтобы получить раствор с концентрацией 100 мг/мл IgG и около 50 мг/мл D-сорбитола. Раствор делят на две порции, порция А и порция В. рН порции А доводят до 5,4, а рН порции В доводят до 4,3. Затем растворы порций А и В индивидуально стерилизуют фильтрованием через стерилизованные фильтры, задерживающие бактерий, и ампулируют (см. табл.2).

Для квалифицированного специалиста очевидны возможные вариации изобретения.

Реферат

Изобретение относится к медицине, точнее к препаративной биохимии. Способ получения предназначенного для внутривенного введения раствора гамма-глобулина, по существу свободного от контаминирующих вирусов, включает этапы тепловой обработки для инактивации вирусов при температуре от 50 до 70^oС в течение 10-100 ч в присутствии стабилизатора и фракционирования полиэтиленгликолем неочищенного раствора гамма-глобулина, обработку раствора гамма-глобулина ионообменной смолой с последующей обработкой очищенного гамма-глобулина растворителем-детергентом для дальнейшей инактивации вирусов. Технический результат: разработка объединяющего многоэтапного коммерческого процесса получения гамма-глобулина, который предусматривает удаление денатурированного белка, образовавшегося при тепловой стерилизации, и повышает чистоту препарата. 2 с. и 6 з.п. ф-лы, 2 табл.

Формула