Композиции для получения глюкозных сиропов - RU2706297C2

Описание

Ссылка на перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей в машиночитаемой форме, который включен в данный документ посредством ссылки.

Предпосылки изобретения

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу. Кроме того настоящее изобретение относится к способам получения глюкозного сиропа, содержащего высокий % DX.

Описание уровня техники

Крахмал, как правило, состоит из приблизительно 80% амилопектина и 20% амилозы. Амилопектин представляет собой разветвленный полисахарид, в котором линейные цепи из остатков альфа-1,4-D-глюкозы соединены альфа-1,6-глюкозидными связями. Амилопектин частично расщепляется альфа-амилазой, которая гидролизует 1,4-альфа-глюкозидные связи, что дает разветвленные и линейные олигосахариды.

Альфа-амилазы используют в промышленных масштабах для различных целей, как, например, на начальных стадиях переработки крахмала (например, ожижении). Длительное расщепление амилопектина альфа-амилазой приводит в результате к образованию так называемых предельных альфа-декстринов, которые не подвергаются дальнейшему гидролизу альфа-амилазой. Альфа-амилазы (1,4-α-D-глюкан-глюканогидролаза, EC 3.2.1.1) составляют группу ферментов, которые катализируют гидролиз крахмала и других линейных и разветвленных олиго- и полисахаридов с 1,4-глюкозидными связями.

Разветвленные олигосахариды можно подвергать гидролизу до линейных олигосахаридов при помощи деветвящего фермента. Оставшиеся разветвленные олигосахариды можно деполимеризовать до D-глюкозы при помощи глюкоамилазы, которая гидролизует линейные олигосахариды до D-глюкозы.

Деветвящие ферменты, которые могут разрушать амилопектин, разделены на два класса: изоамилазы (E.C. 3.2.1.68) и пуллуланазы (E.C. 3.2.1.41) соответственно. Изоамилаза гидролизует альфа-1,6-D-глюкозидные ветвящиеся связи в амилопектине и предельных бета-декстринах, и ее можно отличить от пуллуланаз по неспособности изоамилазы разрушать пуллулан и по ограниченному действию на предельные альфа-декстрины.

В области техники хорошо известно добавление изоамилаз или пуллуланаз при способах превращения крахмала. Пуллуланаза является деветвящим ферментом для крахмала с пуллулан-6-глюкано-гидролазной активностью (EC3.2.1.41), который катализирует гидролиз α-1,6-глюкозидных связей в пуллулане, высвобождая мальтотриозу с восстанавливающими углеводными концами. Как правило, пуллуланазу используют в комбинации с альфа-амилазой и/или глюкоамилазой.

Пуллуланазы известны из уровня техники. В патентах US 6074854 и US 5817498 раскрыта пуллуланаза из Bacillus deramificans. В WO 2009/075682 раскрыта пуллуланаза, полученная из Bacillus acidopullulyticus.

Глюкоамилаза (1,4-альфа-D-глюкан-глюкогидролаза, EC 3.2.1.3) представляет собой фермент, который катализирует отщепление D-глюкозы от невосстанавливающих концов молекул крахмала или родственных олиго- и полисахаридов. Глюкоамилазы продуцируются несколькими видами нитчатых грибов и дрожжей, причем такие ферменты из Aspergillus, Talaromyces, Penicillium и Trametes являются особенно важными в коммерческом отношении.

В коммерческом отношении глюкоамилазы используют для превращения крахмалистого материала, который уже частично гидролизован альфа-амилазой и, например, пуллуланазой до глюкозы в виде сиропа.

Перед ферментативной обработкой размер частиц крахмального материала, такого как цельные зерна, может быть уменьшен, например, путем помола, чтобы открыть доступ к структуре и обеспечить возможность дальнейшей обработки. При сухом помоле цельные зернышки подвергают помолу и используют. Мокрый помол обеспечивает хорошее разделение зародыша и муки (гранул крахмала и белка) и его часто применяют в местах, где гидролизат крахмала используют в получении, например, сиропов. Как сухой, так и мокрый помол хорошо известны в области переработки крахмала, и их можно использовать в способе по настоящему изобретению.

После помола, как правило, крахмальный материал является ожиженным. Ожижение выполняют в присутствии альфа-амилазы, предпочтительно бактериальной альфа-амилазы и/или кислой грибной альфа-амилазы.

Во время ожижения длинноцепочечный крахмал расщепляется на более короткие разветвленные и линейные элементы (мальтодекстрины) при помощи альфа-амилазы. Ожижение можно выполнять как трехстадийный процесс с горячей суспензией. Процесс ожижения выполняют при температуре 70-95°C, например 80-90°C, например около 85°C, в течение от приблизительно 10 минут до 5 часов, как правило, в течение 1-2 часов. После такой обработки ожиженный крахмал, как правило, будет характеризоваться "декстрозным эквивалентом" (DE) 10-15.

В целом ожижение и условия ожижения хорошо известны из уровня техники.

Для получения глюкозного сиропа ожиженный крахмальный материал осахаривают. При типичном способе осахаривания мальтодекстрины, полученные во время ожижения, превращаются в декстрозу при добавлении глюкоамилазы и деветвящего фермента, такого как изоамилаза (патент США № 4335208) или пуллуланаза. Температуру понижают до 60°C перед добавлением глюкоамилазы и деветвящего фермента. Процесс осахаривания длится 24-72 часов. Перед добавлением осахаривающих ферментов pH снижают до значения ниже 4,5, в то же время поддерживая высокую температуру (выше 95°C) для инактивации ожижающей альфа-амилазы.

Для получения сиропа используемые ферментативные композиции должны по меньшей мере содержать глюкоамилазу и пуллуланазу, однако, альфа-амилазная активность часто также будет присутствовать, например при использовании глюкоамилазы из Aspergillus niger альфа-амилаза из A. niger из организма-источника также будет присутствовать в композиции. Неожиданно было обнаружено, что для достижения высоких значений % DX в сиропе, например свыше 95%, уровень альфа-амилазы, присутствующей в композиции, необходимо тщательно контролировать.

Настоящее изобретение предусматривает композиции и способы для получения высокоглюкозных сиропов с % DX около 96%.

Применениями сиропов с более высоким содержанием DX являются: получение DMH (декстрозы моногидрата), химических продуктов брожения, таких как органические кислоты (такие как лимонная кислота, молочная кислота и т. д.) или аминокислоты (такие как L-лизин, L-треонин, L-триптофан, глутамат натрия и L-цистеин), высокофруктозных кукурузных сиропов, кристаллической глюкозы и других специализированных сиропов.

Краткое описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей фермент альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г или KNU/г, составляет по меньшей мере 60.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, включающему (a) приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и необязательно альфа-амилазой, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г DS, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г DS или как KNU/г DS, составляет по меньшей мере 60, в частности, по меньшей мере 75, в частности, по меньшей мере 100, конкретнее, по меньшей мере 150, конкретнее, по меньшей мере 200, конкретнее, по меньшей мере 250, конкретнее, по меньшей мере 300, конкретнее, по меньшей мере 400, конкретнее, по меньшей мере 500, конкретнее, по меньшей мере 600, конкретнее, по меньшей мере 800 или, в случае отсутствия альфа-амилазы, пуллуланаза присутствует в дозе по меньшей мере 0,5, в частности, по меньшей мере 0,75, в частности, по меньшей мере 1,0, в частности, по меньшей мере 1,5 NPUN/г DS, и (b) осахаривание ожиженного крахмала.

Определения

Альфа-амилаза. Альфа-амилазы (1,4-альфа-D-глюкан-глюканогидролаза, E.C. 3.2.1.1) представляют собой группу ферментов, которые катализируют гидролиз крахмала и других линейных и разветвленных олиго- и полисахаридов с 1,4-глюкозидными связями. Альфа-амилазы, используемые в соответствии с настоящим изобретением, можно получать из грибных или бактериальных источников. В контексте настоящего изобретения, активность грибной альфа-амилазы можно определять как FAU(A) при помощи анализа с альфа-амилазой, описанного в разделе «Материалы и способы». Активность бактериальных альфа-амилаз можно определять как единицы Kilo Novo альфа-амилазы (KNU) в соответствии с процедурой, описанной ниже в абзаце под заголовком «Единицы Kilo Novo альфа-амилазы (KNU)».

Единицы кислой альфа-амилазы (FAU(A)). Активность кислой альфа-амилазы можно измерить в FAU(A) (единицах кислой грибной альфа-амилазы). 1 FAU(A) определяют как количество фермента, которое расщепляет 5,260 мг сухой массы крахмала за час при стандартных условиях, определенных в таблице «Первая реакция, расщепление крахмала» ниже.

Кислая альфа-амилаза, эндо-альфа-амилаза (1,4-альфа-D-глюкан-глюканогидролаза, E.C. 3.2.1.1), гидролизует альфа-1,4-глюкозидные связи во внутренних участках молекулы крахмала с образованием декстринов и олигосахаридов с различными длинами цепей. Интенсивность цвета, образуемого с йодом, прямо пропорциональна концентрации крахмала. Амилазную активность определяют с использованием обратной колориметрии как снижение концентрации крахмала при определенных аналитических условиях.

FAU(A), активность кислой альфа-амилазы определяют в соответствии со следующим описанием. Принцип реакции основан на двух стадиях. На первой стадии фермент кислая альфа-амилаза гидролизует крахмал до различных олигосахаридов. На второй стадии йод образует комплекс синего цвета с крахмалом, а не с продуктами расщепления. Интенсивность цвета тем самым прямо пропорциональна концентрации крахмала. Активность определяют с использованием обратной колориметрии как снижение концентрации крахмала при определенных аналитических условиях.

Единицы Kilo Novo альфа-амилазы (KNU)

Активность бактериальной альфа-амилазы можно определять, используя картофельный крахмал в качестве субстрата. Способ основан на разложении крахмала в растворе при помощи амилазы и того факта, что крахмал дает сине-черный цвет в присутствии йода. По мере прохождения ферментативной реакции аликвоты реакционной смеси отбирали и анализировали на содержание крахмала в них путем смешивания с раствором йода. По мере разрушения крахмала сине-черный цвет в присутствии йода тускнеет и постепенно превращается в красновато-коричневый цвет. Его сравнивают со стандартом из цветного стекла. Конечная точка достигается, когда цвет соответствует стандарту из стекла.

Одну единицу Kilo Novo альфа-амилазы (KNU) определяют как количество фермента, которое при стандартных условиях, определенных в таблице «KNU» ниже (т. е. при 37°C +/- 0,05; 0,0003 M Ca²⁺ и pH 5,6), расщепляет с образованием декстринов 5260 мг/час крахмала в виде сухого вещества; например растворимого крахмала Merck Amylum.

Пуллуланаза. Термин «пуллуланаза» означает деветвящий фермент для крахмала с пуллулан-6-глюкано-гидролазной активностью (EC3.2.1.41), который катализирует гидролиз α-1,6-глюкозидных связей в пуллулане, высвобождая мальтотриозу с восстанавливающими углеводными концами. В контексте настоящего изобретения пуллуланазную активность определяют как NPUN в соответствии с процедурой, описанной в «Материалах и способах» и в следующем абзаце.

Пуллуланазная активность (NPUN). NPUN (новая единица Novozymes пуллуланазы) представляет собой единицу эндопуллуланазной активности, измеренной при помощи следующей процедуры.

1 NPUN = одну единицу пуллуланазы (NPUN) определяют как количество фермента, которое высвобождает восстанавливающие концы, соответствующие 0,35 мкмолям глюкозы, за минуту при стандартных условиях, определенных в таблице «Первая реакция, расщепление пуллулана» ниже.

При первой реакции субстрат одинаково присутствует как в анализируемом образце, так и в холостой пробе. Однако реакцию с анализируемым образцом осуществляют при pH 5,0, в то время как реакция в холостой пробе отсутствует при pH 9,6, где ни пуллуланазы, ни амилоглюкозидазы (глюкоамилаза) не являются активными как ферменты.

При второй реакции pH доводят до примерно 9,6 и глюкоза в образце фосфорилируются до невосстанавливающего D-глюкозо-6-фосфата глюкокиназой, которая обладает наилучшей активностью и стабильностью в данном диапазоне и является специфичной по отношению к глюкозе при pH 9 (см. Goward, Biochem. J. 1986, 237, pp 415-420). Данная стадия зависит от одинакового pH в анализируемом образце и холостой пробе для удаления равных количеств глюкозы в обоих.

Глюкоамилаза. Термин глюкоамилаза (1,4-альфа-D-глюкан-глюкогидролаза, EC 3.2.1.3) определен как фермент, который катализирует отщепление D-глюкозы от невосстанавливающих концов молекул крахмала или родственных олиго- и полисахаридов. В контексте настоящего изобретения глюкоамилазную активность определяют как AGU в соответствии с процедурой, описанной в «Материалах и способах» и в следующем абзаце.

Глюкоамилазная активность (AGU). Единицу глюкоамилазы (AGU) определяют как количество фермента, которое гидролизует 1 микромоль мальтозы за минуту в 0,1 M ацетатном буфере при температуре инкубации 37°C, pH 4,3, начальной концентрации мальтозы 100 мМ и времени реакции 6 минут, образуя при этом альфа-D-глюкозу. Определение употребляется по отношению к рабочему диапазону для фермента 0,5-4,0 AGU/мл.

После инкубации реакцию можно останавливать при помощи NaOH и количеств глюкозы, измеренных при помощи следующего двухстадийного способа цветной реакции: глюкоза фосфорилируется ATP в реакции, катализируемой гексокиназой. Образованный глюкозо-6-фосфат окисляется до 6-фосфоглюконата глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназой. В этой же реакции эквимолярное количество NAD+ восстанавливается до NADH с получаемым в результате этого повышением поглощения при 340 нм.

Условия реакции определены в таблице ниже.

Степень полимеризации (DP). DP означает число (n) единиц ангидроглюкопиранозы в данном сахариде. Примерами DP1 являются моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза. DP2 являются дисахариды, такие как мальтоза и сахароза.

Клетка-хозяин. Термин «клетка-хозяин» означает любой тип клеток, который является восприимчивым к трансформации, трансфекции, трансдукции или подобным процедурам с помощью конструкции нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии, содержащих полинуклеотид по настоящему изобретению. Термин «клетка-хозяин» охватывает любого потомка исходной клетки, который не является идентичным исходной клетке вследствие мутаций, которые происходят в ходе репликации.

Зрелый полипептид. Термин «зрелый полипептид» означает полипептид в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как процессинг N-концевой части, усечение C-концевой части, гликозилирование, фосфорилирование и т. д. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления зрелый полипептид SEQ ID NO: 6 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 6, зрелый полипептид SEQ ID NO: 7 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 7, зрелый полипептид SEQ ID NO: 8 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 8, зрелый полипептид SEQ ID NO: 5 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 9, зрелый полипептид SEQ ID NO: 10 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 10, зрелый полипептид SEQ ID NO: 11 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 11, зрелый полипептид SEQ ID NO: 12 состоит, главным образом, из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 12, зрелый полипептид SEQ ID NO: 13 состоит, главным образом, из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 13, зрелый полипептид SEQ ID NO: 14 состоит, главным образом, из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 14.

В частности, зрелый полипептид SEQ ID NO: 6 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 6.

Зрелый полипептид SEQ ID NO: 7 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 7.

Зрелый полипептид SEQ ID NO: 8 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 8.

Зрелый полипептид SEQ ID NO: 9 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 9.

Зрелый полипептид SEQ ID NO: 10 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 10.

Зрелый полипептид SEQ ID NO: 11 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 11.

Зрелый полипептид SEQ ID NO: 12 может состоять из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 12.

Зрелый полипептид SEQ ID NO: 13 может состоять из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 13.

Зрелый полипептид SEQ ID NO: 14 может состоять из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 14.

В дополнительных вариантах осуществления зрелый полипептид SEQ ID NO: 6 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 6, зрелый полипептид SEQ ID NO: 7 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 7, зрелый полипептид SEQ ID NO: 8 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 8, зрелый полипептид SEQ ID NO: 9 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 9, зрелый полипептид SEQ ID NO: 10 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 10, зрелый полипептид SEQ ID NO: 11 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 11, зрелый полипептид SEQ ID NO: 12 состоит из аминокислот 18-573 из SEQ ID NO: 12, зрелый полипептид SEQ ID NO: 13 состоит из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 13, и зрелый полипептид SEQ ID NO: 14 состоит из аминокислот 18-576 из SEQ ID NO: 14.

Предсказание последовательностей зрелых полипептидов может быть основано на программе SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), с помощью которой предсказывают, что аминокислоты 1-17 из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 представляют собой сигнальный пептид. Последовательность, обозначенная аминокислотами 19-474 (в частности, 19-471) из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 или аминокислотами 19-471 из SEQ ID NO: 13 или из SEQ ID NO: 14 представляет собой каталитический домен. Последовательность, обозначенная аминокислотами 480-573 из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 или аминокислотами 483-576 из SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14 представляет собой крахмал-связывающий домен.

В соответствии с другими вариантами осуществления зрелый полипептид SEQ ID NO: 18 обозначен аминокислотами 22-450 из SEQ ID NO: 18.

В дополнительных вариантах осуществления зрелый пептид с SEQ ID NO: 19 обозначен аминокислотами 22-471 из SEQ ID NO: 19, при этом аминокислоты 1-21 представляют собой сигнальный пептид.

Идентичность последовательностей. Родство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывают параметром «тождественность последовательности».

В контексте настоящего изобретения тождественность последовательностей для двух аминокислотных последовательностей определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, обозначенные как «наиболее длинный идентичный участок» (полученные с применением опции - nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные остатки x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).

В контексте настоящего изобретения тождественность последовательности для двух последовательностей дезоксирибонуклеотидов определяют с применением алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), который реализован в программе Needle из пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 5.0.0 или более поздней. Применяемыми параметрами являются штраф за открытие гэпа, составляющий 10, штраф за продление гэпа, составляющий 0,5, и матрица замен EDNAFULL (версия NCBI NUC4.4 для EMBOSS). Выводимые данные в Needle, обозначенные как «наиболее длинный идентичный участок» (полученные с применением опции - nobrief), применяют в качестве процента идентичности и рассчитывают следующим образом:

(идентичные дезоксирибонуклеотиды x 100)/(длина выравниваемого участка - общее число гэпов в выравниваемом участке).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для получения сиропа с высоким содержанием глюкозы. В частности, глюкозные сиропы со значениями % DX (% DP1) свыше 95%.

Неожиданно было обнаружено, что для достижения высоких значений % DX в сиропе, например свыше 95%, уровень альфа-амилазы, присутствующей в композиции, необходимо тщательно контролировать.

Способы и композиции в соответствии с настоящим изобретением предусматривают глюкозные сиропы с более высоким % DX при оптимизации уровней альфа-амилазы таким образом, что при данном соотношении NPUN и AGU NPUN/FAU(A) или NPUN/KNU корректируют так, чтобы оно составляло по меньшей мере 60, в частности, по меньшей мере 80. Сиропы с высоким % DX можно получать при используемых в промышленном масштабе концентрациях субстрата - как правило, более 30% первоначального содержания твердых веществ (DS).

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, включающему (a) приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и необязательно альфа-амилазой, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г DS, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г DS или KNU/г DS, составляет по меньшей мере 60, в частности, по меньшей мере 75, в частности, по меньшей мере 100, конкретнее, по меньшей мере 150, конкретнее, по меньшей мере 200, конкретнее, по меньшей мере 250, конкретнее, по меньшей мере 300, конкретнее, по меньшей мере 400, конкретнее, по меньшей мере 500, конкретнее, по меньшей мере 600, конкретнее, по меньшей мере 800 или, в случае отсутствия альфа-амилазы, пуллуланаза присутствует в дозе по меньшей мере 0,5, в частности, по меньшей мере 0,75, в частности, по меньшей мере 1,0, в частности, по меньшей мере 1,5 NPUN/г DS, и (b) осахаривание ожиженного крахмала.

В некоторых вариантах осуществления способ включает приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и необязательно альфа-амилазой, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г DS, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г DS или KNU/г DS, находится в диапазоне 100-700, как, например, в диапазоне 200-600, как, например, в диапазоне 300-500, как, например, в диапазоне 350-500, как, например, в диапазоне 375-475 или как, например, в диапазоне 400-450.

В соответствии с другими вариантами осуществления способ включает приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и необязательно альфа-амилазой, где доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,008 FAU(A)/г DS, и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,5-1,5 NPUN/г DS.

В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,007 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,6-1,4 NPUN/г DS. В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,006 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,7-1,3 NPUN/г DS.

В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,005 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,75-1,25 NPUN/г DS.

В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,004 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,8-1,2 NPUN/г DS.

В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,003 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,9-1,1 NPUN/г DS.

В других вариантах осуществления доза альфа-амилазы находится в диапазоне 0-0,0025 FAU(A)/г DS и доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,95-1 NPUN/г DS.

Соотношение пуллуланазы, выраженной как NPUN/г DS, и глюкоамилазы, выраженной как AGU/г DS, в частности, может находиться в диапазоне 2-15, как, например в диапазоне 2-10, в диапазоне 2-5, в диапазоне 3-5 или в диапазоне 3,5-4.

В соответствии с другими вариантами осуществления способ включает приведение ожиженного крахмала в контакт с глюкоамилазой, пуллуланазой и необязательно альфа-амилазой, где доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,5-1,5 NPUN/г DS и доза глюкоамилазы находится в диапазоне 0,125-0,375 AGU/г DS.

В других вариантах осуществления доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,6-1,4 NPUN/г DS и доза глюкоамилазы находится в диапазоне 0,15-0,35 AGU/г DS.

В других вариантах осуществления доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,7-1,3 NPUN/г DS и доза глюкоамилазы находится в диапазоне 0,175-0,325 AGU/г DS.

В других вариантах осуществления доза пуллуланазы находится в диапазоне 0,8-1,2 NPUN/г DS и доза глюкоамилазы находится в диапазоне 0,2-0,3 AGU/г DS.

При низких уровнях глюкоамилазы может потребоваться более длительное время осахаривания. В одном варианте осуществления доза глюкоамилазы, выраженная как AGU/г DS, составляет по меньшей мере 0,1, в частности, по меньшей мере 0,15, в частности, по меньшей мере 0,18, в частности, по меньшей мере 0,2, конкретнее, по меньшей мере 0,22, конкретнее, по меньшей мере 0,23, конкретнее, по меньшей мере 0,25, еще конкретнее, по меньшей мере 0,28.

При помощи способа и композиций в соответствии с настоящим изобретением можно получать очень высокие значения % DX. В определенном варианте осуществления глюкозный сироп содержит DP1 (% DX) по меньшей мере 95,8%, в частности, по меньшей мере 95,9%, в частности, по меньшей мере 96%, конкретнее, по меньшей мере 96,1%.

Время осахаривания может варьировать в зависимости от дозы фермента. В одном определенном варианте осуществления время осахаривания составляет по меньшей мере 24 ч, по меньшей мере 30 ч, по меньшей мере 36 ч, по меньшей мере 48 ч, по меньшей мере 54 ч, по меньшей мере 60 ч, по меньшей мере 72 ч.

При способе в соответствии с настоящим изобретением гидролиз/осахаривание крахмала может происходить, в частности, при pH, который находится в диапазоне 3,5-5,0, как, например, при pH в диапазоне 4,0-4,5, и при температуре, которая находится в диапазоне 59-70°C, как, например, в диапазоне 59-65°C или как, например, в диапазоне 59-62°C.

Ожиженный крахмал, используемый в качестве субстрата для способа осахаривания в соответствии с настоящим изобретением, может быть крахмальной суспензией или частично гидролизованным крахмалом (в ожиженном виде или мальтодекстрином). В частности, крахмал в крахмальной суспензии или частично гидролизованный крахмал может характеризоваться декстрозным эквивалентом (DE) в диапазоне 5-42, как, например, в диапазоне 5-30, в диапазоне 8-18 или как, например, в диапазоне 9-14.

Крахмал может быть из любого источника, в частности, из кукурузы, пшеницы или маниока. Крахмальная суспензия или частично гидролизованный крахмал может характеризоваться наличием остаточной альфа-амилазной активности в результате процесса ожижения или она может быть деактивирована, как, например, путем снижения pH до значения ниже 4,5, с поддержанием в то же время высокой температуры (выше 95°C) для инактивации ожижающей альфа-амилазы.

Проводимость указанной крахмальной суспензии или частично гидролизованного крахмала, в частности, может находиться в диапазоне 0-500 микроСм/см. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления содержание кальция соответствует 0-200 ppm свободного кальция.

При способе в соответствии с настоящим изобретением гидролиз/осахаривание крахмала может происходить, в частности, при pH, который находится в диапазоне 3,5-5,0, как, например, при pH в диапазоне 4,0-4,7, и при температуре, которая находится в диапазоне 58-70°C, как, например, в диапазоне 58-65°C, как, например, в диапазоне 59-65°C или как, например, в диапазоне 59-62°C.

Композиция, содержащая ожиженный крахмал, предусмотренный в качестве исходного материала; т. е. композиция, содержащая ожиженный крахмал, предусмотренный на стадии i) способа, может содержать 25-45% сухих твердых веществ (% DS), как, например, 25-40% DS.

Способ в соответствии с настоящим изобретением применим при используемых в промышленности дозах субстрата. В одном варианте осуществления первоначальное содержание твердых веществ (DS) в ожиженном крахмальном субстрате составляет по меньшей мере 25%, в частности, по меньшей мере 30%, конкретнее, по меньшей мере 35%, еще конкретнее, по меньшей мере 40%.

Ферментативные композиции

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим глюкоамилазу, пуллуланазу и альфа-амилазу.

В определенном варианте осуществления композиция содержит фермент альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г или как KNU/г, составляет по меньшей мере 60.

Конкретнее, композиция содержит фермент альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу, где соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г или как KNU/г, составляет по меньшей мере 75, в частности, по меньшей мере 100, конкретнее, по меньшей мере 150, конкретнее, по меньшей мере 200, конкретнее, по меньшей мере 250, конкретнее, по меньшей мере 300, конкретнее, по меньшей мере 400, конкретнее, по меньшей мере 500, конкретнее, по меньшей мере 600, конкретнее, по меньшей мере 800.

В другом варианте осуществления соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г или как KNU/г, находится в диапазоне 60-1000, конкретнее, 70-800, конкретнее, 80-600, конкретнее, 90-500, конкретнее, 100-400.

Соотношение дозы пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и дозы альфа-амилазы, выраженной как FAU(A)/г или KNU/г, в частности, может находиться в пределах диапазона 100-700, как, например, в пределах диапазона 200-600, как, например, в пределах диапазона 300-500, как, например, в пределах диапазона 350-500, как, например, в пределах диапазона 375-475 или как, например, в пределах диапазона 400-450.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, в которой соотношение пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и глюкоамилазы, выраженной, как AGU/г, составляет по меньшей мере 2, в частности, по меньшей мере 2,5, в частности, по меньшей мере 3, конкретнее, по меньшей мере 3,5, конкретнее, по меньшей мере 5, конкретнее, по меньшей мере 10, еще конкретнее, по меньшей мере 15.

Соотношение пуллуланазы, выраженной как NPUN/г, и глюкоамилазы, выраженной как AGU/г, в частности, может находиться в пределах диапазона 2-15, как, например, в пределах диапазона 2-10, в пределах диапазона 2-5, в пределах диапазона 3-5 или в пределах диапазона 3,5-4.

Пуллуланаза

В способе по настоящему изобретению можно применять любую пуллуланазу. В одном варианте осуществления пуллуланаза является пуллуланазой из Bacillus deramificans, например, раскрытой в патентах US 6074854 и US 5817498, или пуллуланазой, полученной из Bacillus acidopullulyticus, например, раскрытой в WO2009/075682 (SEQ ID 4; GENESEQP: AXB71624).

Коммерчески доступные пуллуланазы включают Promozyme D2, доступный от Novozymes A/S, Bagsvaerd, Дания), Novozym 26062 (Novozymes) и Optimax L 1000 (DuPont-Genencor)

Глюкоамилаза

Глюкоамилазу, используемую в соответствии с настоящим изобретением, можно получать из любого подходящего источника, например, получать из микроорганизма или растения. Предпочтительные глюкоамилазы являются грибного или бактериального происхождения, выбранными из группы, состоящей из глюкоамилаз Aspergillus, в частности, глюкоамилазы G1 или G2 A. Niger (Boel et al., 1984, EMBO J. 3 (5): 1097-1102) или ее вариантов, таких как раскрытые в WO 92/00381, WO 00/04136 и WO 01/04273 (от Novozymes, Дания); глюкоамилазы A. Awamori,, раскрытой в WO 84/02921, глюкоамилазы A. oryzae (Agric. Biol. Chem., 1991, 55 (4): 941-949) или их вариантов или фрагментов. Другие варианты глюкоамилазы Aspergillus включают варианты с повышенной термоустойчивостью: G137A и G139A (Chen et al., 1996, Prot. Eng. 9: 499-505); D257E и D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al., 1994, Biochem. J. 301: 275-281); дисульфидные связи, A246C (Fierobe et al., 1996, Biochemistry 35: 8698-8704 и введение остатков Pro в положение A435 и S436 (Li et al., 1997, Protein Eng. 10: 1199-1204.

Другие глюкоамилазы включают глюкоамилазу Athelia rolfsii (ранее именуемого Corticium rolfsii) (см. патент США № 4727026 и Nagasaka et al., 1998, “Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii, Appl Microbiol Biotechnol 50:323-330), глюкоамилазы Talaromyces, в частности, полученные из Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (патент США № Re. 32153), Talaromyces duponti и Talaromyces thermophilus (патент США № 4587215).

Предусматриваемые грибные глюкоамилазы включают глюкоамилазу Trametes cingulata, раскрытую в WO 2006/069289.

В одном варианте осуществления глюкоамилаза получена из штамма рода Pycnoporus, в частности, штамма Pycnoporus, который описан в WO 2011/066576 (SEQ ID NO: 2, 4 или 6), или из штамма рода Gloephyllum, в частности, штамма Gloephyllum, который описан в WO 2011/068803 (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 или 16), или штамма рода Nigrofomes, в частности, штамма Nigrofomes sp., раскрытого в WO 2012/064351 (SEQ ID NO: 2) (все ссылки таким образом включены при помощи ссылки), или штамма Penicillium, в частности, Penicillium oxalicum, раскрытого в WO2011/127802 (SEQ ID NO: 2) или WO2013/036526. Также предусмотрены глюкоамилазы, которые проявляют высокую тождественность с любой из вышеупомянутых глюкоамилаз, т. е., по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, 100% тождественность с любой из зрелых частей последовательностей ферментов, упомянутых выше.

В одном варианте осуществления глюкоамилаза получена из штамма рода Trichoderma, в частности, такого, который описан в WO2009/048487, WO2009/048488, WO2008/045489, WO2011/022465, WO2012/001139.

Коммерчески доступные композиции с глюкоамилазой включают AMG 200L; AMG 300L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U, SPIRIZYME ULTRA™, SPIRIZYME EXCEL™ и AMG™ E (от Novozymes A/S, Дания); OPTIDEX™ 300, GC480™ и GC147™ (от Genencor Int., США); AMIGASE™ и AMIGASE™ PLUS (от DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ и G990 ZR (от DuPont-Genencor).

Альфа-амилаза

Грибные альфа-амилазы включают альфа-амилазы, полученные из штамма рода Aspergillus, такие как альфа-амилазы Aspergillus oryzae,Aspergillus niger и Aspergillus kawachii.

Предпочтительные кислые грибные альфа-амилазы представляют собой подобную фунгамилу альфа-амилазу, которая получена из штамма Aspergillus oryzae. В соответствии с настоящим изобретением термин «подобная фунгамилу альфа-амилаза» означает альфа-амилазу, которая проявляет высокую тождественность, т. е. более чем 70%, более чем 75%, более чем 80%, более чем 85%, более чем 90%, более чем 95%, более чем 96%, более чем 97%, более чем 98%, более чем 99% или даже 100% тождественность со зрелой частью аминокислотной последовательности, показанной под SEQ ID NO: 10 в WO 96/23874.

Другая предпочтительная кислая альфа-амилаза получена из штамма Aspergillus niger. В предпочтительном варианте осуществления кислая грибная альфа-амилаза является таковой из A. Niger,, раскрытой как «AMYA_ASPNG» в базе данных Swiss-prot/TeEMBL под исходным номером доступа P56271 и описанной в WO 89/01969 (пример 3).

Другие предусматриваемые альфа-амилазы дикого типа включают такие, которые получены из штамма рода Rhizomucor и Meripilus, предпочтительно штамма Rhizomucor pusillus (WO 2004/055178, включенной при помощи ссылки) или Meripilus giganteus.

В предпочтительном варианте осуществления альфа-амилаза получена из Aspergillus kawachii и описана Kaneko et al., 1996, J. Ferment. Bioeng. 81: 292-298, “Molecular-cloning and determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amylase from Aspergillus kawachii"; и, помимо этого, как EMBL:№ AB008370.

Грибная альфа-амилаза также может быть ферментом дикого типа, содержащим крахмал-связывающий домен (SBD) и каталитический домен альфа-амилазы (т. е. не является гибридной), или его вариант. В одном варианте осуществления альфа-амилаза дикого типа получена из штамма Aspergillus kawachii.

Грибная гибридная альфа-амилаза

В предпочтительном варианте осуществления альфа-амилаза является грибной кислой альфа-амилазой и является гибридной альфа-амилазой. Предпочтительные примеры грибных гибридных альфа-амилаз включают такие, которые раскрыты в WO 2005/003311, или в публикации заявки на выдачу патента США № 2005/0054071 (Novozymes), или в заявке на выдачу патента США № 60/638614 (Novozymes), которые таким образом включены при помощи ссылки. Гибридная альфа-амилаза может содержать каталитический домен альфа-амилазы (CD) и углевод-связывающий домен/блок (CBM), как, например, крахмал-связывающий домен, и, при необходимости, линкер.

Конкретные примеры предусмотренных гибридных альфа-амилаз включают такие, которые раскрыты в таблицах 1-5 в примерах в заявке на выдачу патента США № 60/638614, в том числе вариант фунгамила с каталитическим доменом JA118 и SBD Athelia rolfsii (SEQ ID NO:100 в US 60/638614), альфа-амилазу Rhizomucor pusillus с линкером и SBD AMG Athelia rolfsii (SEQ ID NO:101 в US 60/638614), альфа-амилазу Rhizomucor pusillus с линкером и SBD глюкоамилазы Aspergillus niger (которая раскрыта в таблице 5 в виде комбинации аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 96 в заявке на выдачу патента США № 11/316535) или как V039 в таблице 5 в WO 2006/069290 и альфа-амилазу Meripilus giganteus с линкером и SBD глюкоамилазы Athelia rolfsii (SEQ ID NO: 102 в заявке на выдачу патента США № 60/638,614). Другие особенно предусмотренные гибридные альфа-амилазы представляют собой любую из перечисленных в таблицах 3, 4, 5 и 6 в примере 4 в заявке на выдачу патента США № 11/316535 и WO 2006/069290 (таким образом включенных при помощи ссылки).

Другие конкретные примеры предусмотренных гибридных альфа-амилаз включают такие, которые раскрыты в публикации заявки на выдачу патента № 2005/0054071, включая такие, которые раскрыты в таблице 3 на странице 15, как, например, альфа-амилаза Aspergillus niger с линкером и крахмал-связывающим доменом Aspergillus kawachii.

Также предусмотрены альфа-амилазы, которые проявляют высокую тождественность с любой из упомянутых выше альфа-амилаз, т. е. более чем 70%, более чем 75%, более чем 80%, более чем 85%, более чем 90%, более чем 95%, более чем 96%, более чем 97%, более чем 98%, более чем 99% или даже 100% тождественность с последовательностями зрелых ферментов.

Бактериальная альфа-амилаза

Бактериальные альфа-амилазы, пригодные в способах в соответствии с настоящим изобретением, включают альфа-амилазы, полученные из штамма рода Bacillus, как, например, Bacillus licheniformis и Bacillus stearothermophilus.

Коммерческие продукты на основе альфа-амилазы

Предпочтительные коммерческие композиции, содержащие альфа-амилазу, включают MYCOLASE™ (DSM), BAN™, TERMAMYL™ SC, FUNGAMYL™, LIQUOZYME™ X, LIQUOZYME™ SC и SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) и CLARASE™ L-40000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, SPEZYME™ ALPHA, SPEZYME™ DELTA AA, GC358, GC980, SPEZYME™ CL и SPEZYME™ RSL (DuPont-Genencor), FUELZYME™ (от Verenium Corp, США).

В определенном варианте осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением, содержит альфа-амилазу, глюкоамилазу (AMG) и пуллуланазу, и при этом альфа-амилаза выбрана из альфа-амилаз Aspergillus niger или Rhizomucor pusillus или их вариантов, глюкоамилаза выбрана из глюкоамилаз Aspergillus niger, Talaromyces emersonii, Trametes cingulata или Gloeophyllum trabeum или их вариантов и пуллуланаза выбрана из пуллуланаз Bacillus deramificans или Bacillus acidopullulyticus или их гибридов и/или вариантов.

В дополнительных определенных вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит глюкоамилазу, которая содержит/состоит, главным образом, из/состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

i) аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15, или ее зрелого полипептида;

ii) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 1, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15, или ее указанного зрелого полипептида;

iii) аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в i) и ii).

В тех случаях, когда глюкоамилаза содержит подпоследовательность, определенную в ii), или аминокислотную последовательность, определенную в iii), она, предпочтительно, характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности соответствующей аминокислотной последовательности, определенной в i), подпоследовательностью или вариантом которой она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU)».

В других вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением, содержит альфа-амилазу, которая содержит/состоит, главным образом, из/состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

i) аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 2, 5, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25, или ее зрелого полипептида;

ii) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 2, 5, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25, или ее указанного зрелого полипептида;

iii) вариантной аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в i) и ii).

В тех случаях, когда альфа-амилаза, определенная выше, является подпоследовательностью или вариантом, она предпочтительно характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности соответствующей альфа-амилазы, выбранной из SEQ ID NO: 2, 5, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25, или ее зрелого полипептида, подпоследовательностью или вариантом которых она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))» или «Единиц Kilo Novo альфа-амилазы (KNU)». В контексте настоящего изобретения альфа-амилаза, содержащая аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 5 и 19, или их зрелые полипептиды, считается грибной альфа-амилазой, и ее активность тестируют как предусмотрено относительно указанного выше определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))». Альфа-амилаза, содержащая аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20-25, или их зрелые полипептиды, считается бактериальной альфа-амилазой, и ее активность тестируют как предусмотрено относительно указанного выше определения «Единиц Kilo Novo альфа-амилазы (KNU)».

В определенных вариантах осуществления альфа-амилаза, содержащая или состоящая из аминокислотной последовательности, определенной в iii), представляет собой вариант альфа-амилазы, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности, определенной под SEQ ID NO: 20, или ее зрелого полипептида, в которой были осуществлены следующие мутации: I181*/G182*/N193F (с использованием нумерации аминокислот из SEQ ID NO: 20).

В соответствии с другими вариантами осуществления альфа-амилаза, содержащая или состоящая из аминокислотной последовательности, определенной в iii), представляет собой вариант альфа-амилазы, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности, определенной под SEQ ID NO: 23, или ее зрелого полипептида, в которой были осуществлены следующие мутации: H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S (с использованием нумерации аминокислот из SEQ ID NO: 21).

В еще дополнительных вариантах осуществления альфа-амилаза, содержащая или состоящая из аминокислотной последовательности, определенной в iii), представляет собой вариант альфа-амилазы, содержащей или состоящей из аминокислотной последовательности, определенной под SEQ ID NO: 23, или ее зрелого полипептида, в которой были осуществлены следующие мутации: G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S (с использованием нумерации аминокислот из SEQ ID NO: 21).

В еще других вариантах осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением содержит пуллуланазу, которая содержит/состоит, главным образом, из/состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

i) аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 3, 16, 17 и 18, или ее зрелого полипептида;

ii) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 3, 16, 17 и 18, или ее указанного зрелого полипептида;

iii) аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в i) и ii).

В тех случаях, когда пуллуланаза содержит подпоследовательность, определенную в ii), или вариантную аминокислотную последовательность, определенную в iii), она, предпочтительно, характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% пуллуланазной активности соответствующей аминокислотной последовательности, определенной в i), подпоследовательностью или вариантом которой она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В пределах объема настоящего изобретения находятся варианты осуществления, где глюкоамилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

i) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида;

ii) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, или ее указанного зрелого полипептида и

iii) вариантной аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в i) и ii);

где пуллуланаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

iv) аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 3, 16, 17 и 18, или ее зрелого полипептида;

v) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 3, 16, 17 и 18, или ее указанного зрелого полипептида и

vi) вариантной аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой из аминокислотных последовательностей, изложенных в iv) и v); и

где альфа-амилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

vii) аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида;

viii) подпоследовательности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5, или ее указанного зрелого полипептида и

ix) вариантной аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, как, например, по меньшей мере 99,5% тождественностью последовательности с любой аминокислотной последовательностью, изложенной в vii) и viii).

В тех случаях, когда указанная глюкоамилаза является подпоследовательностью или вариантной аминокислотной последовательностью, определенной выше, она, предпочтительно, характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности соответствующей аминокислотной последовательности (например, аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида), подпоследовательностью или вариантом которой она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU)».

В тех случаях, когда указанная пуллуланаза является подпоследовательностью или вариантной аминокислотной последовательностью, определенной выше, она предпочтительно характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% пуллуланазной активности соответствующей аминокислотной последовательности (например, аминокислотной последовательности, изложенной под любым из SEQ ID NO: 3, 16, 17 и 18, или ее зрелого полипептида), подпоследовательностью или вариантом которой она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В тех случаях, когда альфа-амилаза, определенная выше, является подпоследовательностью или вариантом, она предпочтительно характеризуется по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности соответствующей альфа-амилазы, выбранной из SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, подпоследовательностью или вариантом которой она является, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))».

В определенном варианте осуществления глюкоамилаза выбрана из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 1 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU)».

В другом определенном варианте осуществления глюкоамилаза выбрана из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU)».

В определенном варианте осуществления альфа-амилаза выбрана из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или альфа-амилазы с тождественностью последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 2 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))». В другом определенном варианте осуществления альфа-амилаза выбрана из альфа-амилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 5, или альфа-амилазы с тождественностью последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 5 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))».

В определенном варианте осуществления пуллуланаза выбрана из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности с полипептидом SEQ ID NO: 3 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В дополнительном конкретном варианте осуществления композиция содержит

i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 1, или их зрелых полипептидов, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);

ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»; и

iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В частности, композиция может содержать:

i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 90% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);

ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 90% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»; и

iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 90% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В частности, композиция может содержать:

i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности с глюкоамилазой из SEQ ID NO: 1 или ее зрелого полипептида, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 1, или их зрелых полипептидов, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);

ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»;

iii) и пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В частности, композиция может содержать:

i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилаз, раскрытых под SEQ ID NO: 1, или их зрелых полипептидов, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);

ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»;

iii) и пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В частности, композиция может содержать:

i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилаз, раскрытых в SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 1, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);

ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 2, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»;

iii) и пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В дополнительном конкретном варианте осуществления композиция содержит:

i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает глюкоамилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);

ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))», и

iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 75%, как, например, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или как, например, по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В частности, композиция может содержать:

i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает глюкоамилазной активностью, например по меньшей мере 90% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);

ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»; и

iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 90%, которая обладает пуллуланазной активностью, например по меньшей мере 90% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В частности, композиция может содержать:

i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает глюкоамилазной активностью, например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);

ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»; и

iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 95%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В частности, композиция может содержать:

i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает глюкоамилазной активностью, например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);

ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»; и

iii) пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 97%, которая обладает пуллуланазной активностью, например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

В частности, композиция может содержать:

i) глюкоамилазу, выбранную из глюкоамилаз, раскрытых в SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида и глюкоамилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 4, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает глюкоамилазной активностью, например по меньшей мере 95% глюкоамилазной активности глюкоамилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 4, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Глюкоамилазной активности (AGU);

ii) альфа-амилазу, выбранную из альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида и альфа-амилазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 5, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает альфа-амилазной активностью; например по меньшей мере 95% альфа-амилазной активности альфа-амилазы, раскрытой под SEQ ID NO: 5, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Единиц кислой альфа-амилазы (FAU(A))»;

iii) и пуллуланазу, выбранную из пуллуланазы, раскрытой под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида и пуллуланазы с тождественностью последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющей по меньшей мере 99%, которая обладает пуллуланазной активностью; например по меньшей мере 95% пуллуланазной активности аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3, или ее зрелого полипептида, при тестировании, указанном выше относительно определения «Пуллуланазной активности (NPUN)».

Композиции можно получить в соответствии со способами, известными из уровня техники, и они могут быть в форме жидкой или сухой композиции. Композиции могут быть стабилизированы в соответствии со способами, известными из уровня техники.

Пути применения

Композицию в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в способе осахаривания для получения глюкозного сиропа. Таким образом, в дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, включающему приведение ожиженного крахмала в контакт с композицией в соответствии с настоящим изобретением.

Настоящее изобретение дополнительно описано при помощи следующих примеров, которые не следует толковать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

Примеры

Материалы и способы

Глюкоамилазная активность

Глюкоамилазная активность (AGU)

Единицу глюкоамилазы (AGU) определяли как количество фермента, которое гидролизует 1 микромоль мальтозы за минуту при стандартных условиях (37°C, pH 4,3, субстрат: мальтоза 100 мМ, буфер: ацетатный 0,1 М, время реакции 6 минут, как определено ниже для инкубирования с глюкоамилазой), образуя при этом глюкозу.

Принцип анализа представлен 3 стадиями реакции.

Стадия 1 представляет собой ферментативную реакцию.

Глюкоамилаза (AMG), EC 3.2.1.3 (экзо-альфа-1,4-глюкан-глюкогидролаза), гидролизует мальтозу с образованием альфа-D-глюкозы. После инкубирования реакцию останавливали при помощи NaOH.

Стадии 2 и 3 приводят к реакции, по которой оцениваются конечные показатели.

Глюкоза фосфорилируется ATP в реакции, катализируемой гексокиназой. Образованный глюкозо-6-фосфат окисляется до 6-фосфоглюконата глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназой. В этой же реакции эквимолярное количество NAD+ восстанавливается до NADH с получаемым в результате этого повышением поглощения при 340 нм. Можно использовать систему с автоматическим анализатором, такую как Konelab 30 Analyzer (Thermo Fisher Scientific).

Активность кислой альфа-амилазы

При применении в соответствии с настоящим изобретением активность любой кислой альфа-амилазы можно измерить в FAU(A) (единицах кислой грибной альфа-амилазы).

Активность кислой альфа-амилазы (FAU(A))

Активность кислой альфа-амилазы можно измерить в FAU(A) (единицах кислой грибной альфа-амилазы). 1 FAU(A) определяли как количество фермента, которое расщепляет 5,260 мг сухой массы крахмала за час при стандартных условиях.

Кислая альфа-амилаза, эндо-альфа-амилаза (1,4-альфа-D-глюкан-глюканогидролаза, E.C. 3.2.1.1), гидролизует альфа-1,4-глюкозидные связи во внутренних участках молекулы крахмала с образованием декстринов и олигосахаридов с различными длинами цепей. Интенсивность цвета, образуемого с йодом, прямо пропорциональна концентрации крахмала. Амилазную активность определяли с использованием обратной колориметрии как снижение концентрации крахмала при определенных аналитических условиях.

FAU(A), активность кислой альфа-амилазы определяли в соответствии с нижеследующим описанием и измеряли относительно стандарта Novozymes, который предоставляется по запросу компанией Novozymes A/S, Дания. Принцип реакции основан на двух стадиях. На первой стадии фермент кислая альфа-амилаза гидролизует крахмал до различных олигосахаридов. На второй стадии йод образует комплекс синего цвета с крахмалом, а не с продуктами расщепления.

Интенсивность цвета тем самым прямо пропорциональна концентрации крахмала. Активность определяли с использованием обратной колориметрии как снижение концентрации крахмала при определенных аналитических условиях.

В случае необходимости дополнительные подробности можно найти в EB-SM-0510.02, предоставляемом по запросу компанией Novozymes A/S, Дания, и включенном при помощи ссылки.

Пуллуланазная активность

Эндо-пуллуланазы гидролизуют α-1,6-гликозидные связи в пуллулане (-BH4-восстановленные для восстановления фоновых восстанавливающих сахаров), высвобождая мальтотриозные единицы с восстанавливающими углеводными концами. Пуллуланаза является пуллулан-6-глюкано-гидролазой с номером классификации ферментов E.C.3.2.1.41.

NPUN (новая единица Novozymes пуллуланазы) является единицей эндопуллуланазной активности, измеренной при помощи нижеследующей процедуры, и ее измеряют относительно стандарта Novozymes, который предоставляется по запросу компанией Novozymes A/S, Дания

1 NPUN = одну единицу пуллуланазы (NPUN) определяют как количество фермента, которое высвобождает восстанавливающие концы, соответствующие 0,35 мкмолям глюкозы, за минуту при стандартных условиях.

При первой реакции субстрат одинаково присутствует как в анализируемом образце, так и в холостой пробе. Однако реакцию с анализируемым образцом осуществляют при pH 5,0, в то время как реакция в холостой пробе отсутствует при pH 9,6, где ни пуллуланазы, ни амилоглюкозидазы (глюкоамилаза) не являются активными как ферменты.

При второй реакции pH доводили до примерно 9,6 и глюкоза в образце фосфорилировалась до невосстанавливающего D-глюкозо-6-фосфата глюкокиназой, которая обладает наилучшей активностью и стабильностью в данном диапазоне и является специфичной по отношению к глюкозе при pH 9 (см. Goward, Biochem. J. 1986, 237, pp 415-420). Данная стадия зависит от одинакового pH в анализируемом образце и холостой пробе для удаления равных количеств глюкозы в обоих.

Вторую реакцию останавливали при помощи щелочного реагента > pH 11, содержащего PAHBAH (гидразид п-гидроксибензойной кислоты) и висмут, который образовывал комплекс с восстанавливающими сахарами с получением цвета, определяемого при 405 нм. Полученный цвет пропорционален пуллуланазной активности.

В случае необходимости дополнительные подробности можно найти в 2010-28835-02, предоставляемом по запросу компанией Novozymes A/S, Дания, и включенном при помощи ссылки.

Пример 1.

Мальтодекстрин, декстрозный эквивалент (DE) которого доводили до 11, получали в результате обычного способа ожижения крахмала с использованием кукурузного крахмала и высушивали распылением для данного эксперимента. Порошок мальтодекстрина растворяли в воде milliQ и pH доводили при помощи HCl/NaOH так, чтобы он составлял 4,3 при 60°C, и затем твердые вещества доводили до 33% сухого твердого вещества (DS) при помощи измерения показателя преломления (RI) сиропа. Осахаривание начинали путем смешивания 18 г раствора мальтодекстрина и 2 мл смеси ферментов, содержащей глюкоамилазу Aspergillus niger (SEQ ID NO: 1), пуллуланазу (Promozyme D2®) (SEQ ID NO: 3) и кислую альфа-амилазу Aspergillus niger (SEQ ID NO: 2) в разных дозах. Образцы инкубировали при 60°C с перемешиванием и отбирали через разные временные интервалы для определения компонента, представляющего собой сахар. Дозы ферментов и композиции DP1-DP4+ в момент времени, на который фракция DP1 доведена до максимальной величины, показаны в таблице 1.

В таблице 1 показано, что смеси ферментов с соотношением NPUN/FAU(A) выше 44,89 демонстрировали более высокую фракцию DP1, чем Dextrozyme DX®. Даже при активности NPUN в 3 раза выше (1,01 NPUN/г DS), чем при Dextrozyme DX, максимальная DP1 не была такой же высокой, как Dextrozyme DX при активности FAU(A) более высокой, чем 0,045.

Пример 2.

Осахаривание с использованием разных смесей ферментов

Порошок мальтодекстрина, полученного в результате ожижения кукурузного крахмала, растворяли в воде в процессе нагревания с получением суспензии с 34,4% сухих твердых веществ. Содержание сухих веществ в суспензии измеряли при помощи измерения показателя преломления, показавшего 1,39271. Суспензию доводили до pH 4,3 при помощи 1 M раствора хлористоводородной кислоты. 18 грамм аликвот данной суспензии добавляли в 18 стеклянных реакционных сцинтилляционных флаконов с крышками с диафрагмами и вставляли в нагревательный блок для нагрева до температуры в 61°C. В каждый флакон вносили дозу ферментов, исходя из таблицы, приведенной ниже, и дополнительное количество воды добавляли в каждый флакон для достижения требуемого количества сухого твердого вещества 33%. Смесь ферментов содержала глюкоамилазу, полученную из Gloeophyllum trabeum (SEQ ID NO: 4), альфа-амилазу, полученную из Rhizomucor pusillus (SED ID NO: 5) и пуллуланазу, полученную из Bacillus deramificans (SEQ ID NO: 3). Образцы по 1,5 мл отбирали иголками через диафрагму из каждого флакона в разные моменты времени (36 часов, 42 часа, 48 часов, 54 часа и 60 часов) и деактивировали при 105°C в течение 5 минут. 1 мл каждого деактивированного образца разводили 4 мл деионизированной воды. Разведенные образцы оценивали при помощи способа HPLC для DP1-4 для измерения декстрозной чистоты (% DP1 или % DX).

По результатам из таблицы 2 видно чем выше соотношение NPUN/FAU(A), тем выше процентное содержание декстрозы.

Таблица 2.

Результаты разных экспериментов, выполненных в соответствии с той же процедурой, что и описанная выше, показаны в таблице 3.

Таблица 3.

Объем описанного и заявленного в данном документе изобретения не должен ограничиваться конкретными аспектами, раскрытыми в данном документе, поскольку эти аспекты предполагаются как иллюстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Предполагается, что любые эквивалентные аспекты находятся в пределах объема настоящего изобретения. Действительно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к продемонстрированным и описанным в данном документе станут очевидны специалистам в данной области из вышеприведенного описания. Предполагается, что такие модификации также входят в объем прилагаемой формулы изобретения. В случае противоречия настоящее раскрытие, в том числе определения, будет иметь преобладающую силу.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Novozymes A/S

<120> КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗНЫХ СИРОПОВ

<130> 12581-WO-PCT

<160> 25

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 616

<212> Белок

<213> Aspergillus niger

<400> 1

Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr

1 5 10 15

Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala

20 25 30

Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr

35 40 45

Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val

50 55 60

Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn

65 70 75 80

Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly

85 90 95

Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp

100 105 110

Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro

115 120 125

Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp

130 135 140

Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg

145 150 155 160

Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp

165 170 175

Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln

180 185 190

His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser

195 200 205

Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu

210 215 220

Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser

225 230 235 240

Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe

245 250 255

Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro

260 265 270

Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile

275 280 285

Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly

290 295 300

Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys

305 310 315 320

Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp

325 330 335

Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys

340 345 350

Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser

355 360 365

Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe

370 375 380

Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu

385 390 395 400

Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr

405 410 415

Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val

420 425 430

Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr

435 440 445

Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr

450 455 460

Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr

465 470 475 480

Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr

485 490 495

Ala Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro

500 505 510

Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly

515 520 525

Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu

530 535 540

Thr Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp

545 550 555 560

Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu

565 570 575

Tyr Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser

580 585 590

Asp Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr

595 600 605

Ala Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg

610 615

<210> 2

<211> 484

<212> Белок

<213> Aspergillus niger

<400> 2

Leu Ser Ala Ala Glu Trp Arg Thr Gln Ser Ile Tyr Phe Leu Leu Thr

1 5 10 15

Asp Arg Phe Gly Arg Thr Asp Asn Ser Thr Thr Ala Thr Cys Asp Thr

20 25 30

Gly Asp Gln Ile Tyr Cys Gly Gly Ser Trp Gln Gly Ile Ile Asn His

35 40 45

Leu Asp Tyr Ile Gln Gly Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro

50 55 60

Ile Thr Glu Gln Leu Pro Gln Asp Thr Ala Asp Gly Glu Ala Tyr His

65 70 75 80

Gly Tyr Trp Gln Gln Lys Ile Tyr Asp Val Asn Ser Asn Phe Gly Thr

85 90 95

Ala Asp Asp Leu Lys Ser Leu Ser Asp Ala Leu His Ala Arg Gly Met

100 105 110

Tyr Leu Met Val Asp Val Val Pro Asn His Met Gly Tyr Ala Gly Asn

115 120 125

Gly Asn Asp Val Asp Tyr Ser Val Phe Asp Pro Phe Asp Ser Ser Ser

130 135 140

Tyr Phe His Pro Tyr Cys Leu Ile Thr Asp Trp Asp Asn Leu Thr Met

145 150 155 160

Val Gln Asp Cys Trp Glu Gly Asp Thr Ile Val Ser Leu Pro Asp Leu

165 170 175

Asn Thr Thr Glu Thr Ala Val Arg Thr Ile Trp Tyr Asp Trp Val Ala

180 185 190

Asp Leu Val Ser Asn Tyr Ser Val Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser Val

195 200 205

Leu Glu Val Glu Pro Asp Phe Phe Pro Gly Tyr Gln Glu Ala Ala Gly

210 215 220

Val Tyr Cys Val Gly Glu Val Asp Asn Gly Asn Pro Ala Leu Asp Cys

225 230 235 240

Pro Tyr Gln Lys Val Leu Asp Gly Val Leu Asn Tyr Pro Ile Tyr Trp

245 250 255

Gln Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ile Ser Asn Leu

260 265 270

Tyr Asn Met Ile Lys Ser Val Ala Ser Asp Cys Ser Asp Pro Thr Leu

275 280 285

Leu Gly Asn Phe Ile Glu Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Ala Ser Tyr

290 295 300

Thr Ser Asp Tyr Ser Gln Ala Lys Asn Val Leu Ser Tyr Ile Phe Leu

305 310 315 320

Ser Asp Gly Ile Pro Ile Val Tyr Ala Gly Glu Glu Gln His Tyr Ser

325 330 335

Gly Gly Lys Val Pro Tyr Asn Arg Glu Ala Thr Trp Leu Ser Gly Tyr

340 345 350

Asp Thr Ser Ala Glu Leu Tyr Thr Trp Ile Ala Thr Thr Asn Ala Ile

355 360 365

Arg Lys Leu Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ala Tyr Ile Thr Tyr Ala Asn

370 375 380

Asp Ala Phe Tyr Thr Asp Ser Asn Thr Ile Ala Met Arg Lys Gly Thr

385 390 395 400

Ser Gly Ser Gln Val Ile Thr Val Leu Ser Asn Lys Gly Ser Ser Gly

405 410 415

Ser Ser Tyr Thr Leu Thr Leu Ser Gly Ser Gly Tyr Thr Ser Gly Thr

420 425 430

Lys Leu Ile Glu Ala Tyr Thr Cys Thr Ser Val Thr Val Asp Ser Ser

435 440 445

Gly Asp Ile Pro Val Pro Met Ala Ser Gly Leu Pro Arg Val Leu Leu

450 455 460

Pro Ala Ser Val Val Asp Ser Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Gly Arg

465 470 475 480

Leu Tyr Val Glu

<210> 3

<211> 928

<212> Белок

<213> Bacillus deramificans

<400> 3

Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Arg Pro Ala Gly

1 5 10 15

Asp Tyr Gln Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Gly Gly

20 25 30

Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Ala Asp Ser Phe Gly Ala Val Ala

35 40 45

Ser Ala Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val Arg

50 55 60

Thr Gln Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg Tyr Ile Asp Leu

65 70 75 80

Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn Ser Gln Ile Phe

85 90 95

Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser Asn

100 105 110

Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln Pro

115 120 125

Leu Thr Leu Gly Glu Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp Thr

130 135 140

Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu Gly

145 150 155 160

Gln Asp Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe Gly

165 170 175

Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Val

180 185 190

Thr Asn Asn Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn Tyr

195 200 205

Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr Pro

210 215 220

Ser Asp Asn Ile Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val Thr

225 230 235 240

Phe Ser Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn Asn

245 250 255

Pro Asn Ala Asp Leu Gln Val Glu Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu Val

260 265 270

Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser Ile

275 280 285

Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro Arg Asn Val Leu

290 295 300

Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr

305 310 315 320

Thr Gln Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln

325 330 335

Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys Ile

340 345 350

Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn

355 360 365

Gln Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly

370 375 380

Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn

385 390 395 400

Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly

405 410 415

Trp Asn Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val

420 425 430

Ile Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly

435 440 445

Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys

450 455 460

Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly

465 470 475 480

Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser Asn Ser Val Asp

485 490 495

Glu Thr Asp Pro Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr

500 505 510

Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala Arg

515 520 525

Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile

530 535 540

Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile

545 550 555 560

Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp

565 570 575

Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala

580 585 590

Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp

595 600 605

Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu

610 615 620

Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile

625 630 635 640

Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser

645 650 655

Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met

660 665 670

Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn

675 680 685

Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu

690 695 700

Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr

705 710 715 720

Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr

725 730 735

Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala

740 745 750

Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser

755 760 765

Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys

770 775 780

Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu Phe

785 790 795 800

Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser

805 810 815

Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr

820 825 830

Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn

835 840 845

Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly

850 855 860

Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val Ala Thr Ile Asn

865 870 875 880

Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly

885 890 895

Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile

900 905 910

Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys

915 920 925

<210> 4

<211> 559

<212> Белок

<213> Gloeophyllum trabeum

<400> 4

Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala

1 5 10 15

Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala

20 25 30

Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp Tyr

35 40 45

Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile

50 55 60

Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Pro Asn

85 90 95

Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn

100 105 110

Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp

115 120 125

Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu

130 135 140

Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro Ile

145 150 155 160

Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Thr

165 170 175

Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala

180 185 190

Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys Ile

195 200 205

Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn Leu

210 215 220

Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile Thr

225 230 235 240

Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu

245 250 255

Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr Thr

260 265 270

Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val

275 280 285

Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn

290 295 300

Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly

305 310 315 320

Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp

325 330 335

Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser Ile

340 345 350

Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly Thr

355 360 365

Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys

370 375 380

Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ala Pro Val

405 410 415

Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe

420 425 430

Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly Leu

435 440 445

Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly Glu

465 470 475 480

Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser Pro

485 490 495

Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile

500 505 510

Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg

515 520 525

Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile

530 535 540

Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

545 550 555

<210> 5

<211> 583

<212> Белок

<213> Rhizomucor pusillus

<400> 5

Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr

1 5 10 15

Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu

20 25 30

Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp

35 40 45

Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro

50 55 60

Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr

65 70 75 80

Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala

100 105 110

Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe Asp

115 120 125

Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asn Gln

130 135 140

Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile Asp

145 150 155 160

Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly

165 170 175

Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val Lys

180 185 190

His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val

195 200 205

Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly Pro

210 215 220

Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr Ala

225 230 235 240

Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile Ser

245 250 255

Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val Leu

260 265 270

Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser Gln

275 280 285

Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu Gly

290 295 300

Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser Gly

305 310 315 320

Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr Asp

325 330 335

Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val Arg

340 345 350

Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp Asn

355 360 365

Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn Tyr

370 375 380

Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys Phe

385 390 395 400

Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr Thr

405 410 415

Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu Pro

420 425 430

Ala Ile Phe Thr Ser Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro

435 440 445

Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala

450 455 460

Ser Lys Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr

465 470 475 480

Ala Val Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu

485 490 495

Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr

500 505 510

Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro

515 520 525

Leu Trp Tyr Val Thr Val Thr Leu Pro Ala Gly Glu Ser Phe Glu Tyr

530 535 540

Lys Phe Ile Arg Ile Glu Ser Asp Asp Ser Val Glu Trp Glu Ser Asp

545 550 555 560

Pro Asn Arg Glu Tyr Thr Val Pro Gln Ala Cys Gly Thr Ser Thr Ala

565 570 575

Thr Val Thr Asp Thr Trp Arg

580

<210> 6

<211> 573

<212> Белок

<213> Gloeophyllum sepiarium

<400> 6

Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys

20 25 30

Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp

50 55 60

Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr

85 90 95

Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser

100 105 110

Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe

115 120 125

Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg

130 135 140

Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro

165 170 175

Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr

195 200 205

Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala

210 215 220

Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn

225 230 235 240

Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu

260 265 270

Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala

275 280 285

Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr

290 295 300

Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Val Ala Ser

305 310 315 320

Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly

325 330 335

Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser

355 360 365

Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly

370 375 380

Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile

385 390 395 400

Lys Asn Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro

405 410 415

Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro

420 425 430

Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala

435 440 445

Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly

450 455 460

Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val

465 470 475 480

Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile

485 490 495

Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn

500 505 510

Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val

515 520 525

Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn

530 535 540

Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr

545 550 555 560

Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

565 570

<210> 7

<211> 573

<212> Белок

<213> Gloeophyllym sepiarium

<400> 7

Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys

20 25 30

Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp

50 55 60

Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr

85 90 95

Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser

100 105 110

Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe

115 120 125

Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg

130 135 140

Asp Gly Ser Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Lys Leu Trp Pro

165 170 175

Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr

195 200 205

Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala

210 215 220

Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn

225 230 235 240

Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu

260 265 270

Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala

275 280 285

Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr

290 295 300

Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser

305 310 315 320

Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly

325 330 335

Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser

355 360 365

Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly

370 375 380

Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile

385 390 395 400

Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Thr Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro

405 410 415

Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro

420 425 430

Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala

435 440 445

Phe Glu Ala Arg Asn Asp Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly

450 455 460

Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val

465 470 475 480

Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile

485 490 495

Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn

500 505 510

Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val

515 520 525

Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn

530 535 540

Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr

545 550 555 560

Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

565 570

<210> 8

<211> 573

<212> Белок

<213> Gloeophyllum trabeum

<400> 8

Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Thr Val Leu

1 5 10 15

Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys

20 25 30

Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp

50 55 60

Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr

85 90 95

Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser

100 105 110

Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe

115 120 125

Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg

130 135 140

Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Ile Leu Trp Pro

165 170 175

Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr

195 200 205

Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala

210 215 220

Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn

225 230 235 240

Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu

260 265 270

Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala

275 280 285

Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr

290 295 300

Phe Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Val Ala Ser

305 310 315 320

Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly

325 330 335

Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser

355 360 365

Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly

370 375 380

Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile

385 390 395 400

Lys Asn Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro

405 410 415

Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro

420 425 430

Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala

435 440 445

Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly

450 455 460

Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val

465 470 475 480

Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile

485 490 495

Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn

500 505 510

Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val

515 520 525

Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn

530 535 540

Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr

545 550 555 560

Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

565 570

<210> 9

<211> 573

<212> Белок

<213> Gloeophyllum sepiarium

<400> 9

Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys

20 25 30

Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp

50 55 60

Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr

85 90 95

Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser

100 105 110

Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe

115 120 125

Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg

130 135 140

Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro

165 170 175

Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr

195 200 205

Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala

210 215 220

Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn

225 230 235 240

Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu

260 265 270

Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala

275 280 285

Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr

290 295 300

Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser

305 310 315 320

Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly

325 330 335

Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Leu Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser

355 360 365

Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly

370 375 380

Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile

385 390 395 400

Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro

405 410 415

Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro

420 425 430

Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala

435 440 445

Phe Glu Ala Arg Asn Asp Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Ser

450 455 460

Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val

465 470 475 480

Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile

485 490 495

Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn

500 505 510

Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val

515 520 525

Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn

530 535 540

Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr

545 550 555 560

Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

565 570

<210> 10

<211> 573

<212> Белок

<213> Gloeophyllum sepiarium

<400> 10

Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Thr Val Leu

1 5 10 15

Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Val Ala Lys

20 25 30

Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp

50 55 60

Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr

85 90 95

Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser

100 105 110

Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe

115 120 125

Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg

130 135 140

Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro

165 170 175

Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr

195 200 205

Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala

210 215 220

Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn

225 230 235 240

Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu

260 265 270

Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala

275 280 285

Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr

290 295 300

Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser

305 310 315 320

Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly

325 330 335

Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser

355 360 365

Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly

370 375 380

Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile

385 390 395 400

Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro

405 410 415

Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro

420 425 430

Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala

435 440 445

Phe Glu Ala Arg Asn Asp Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly

450 455 460

Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val

465 470 475 480

Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile

485 490 495

Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn

500 505 510

Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val

515 520 525

Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn

530 535 540

Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr

545 550 555 560

Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

565 570

<210> 11

<211> 573

<212> Белок

<213> Gloeophyllum sp

<400> 11

Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Thr Val Leu

1 5 10 15

Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Val Ala Lys

20 25 30

Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp

50 55 60

Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr

85 90 95

Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser

100 105 110

Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe

115 120 125

Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg

130 135 140

Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro

165 170 175

Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr

195 200 205

Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala

210 215 220

Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn

225 230 235 240

Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu

260 265 270

Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala

275 280 285

Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr

290 295 300

Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser

305 310 315 320

Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly

325 330 335

Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser

355 360 365

Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly

370 375 380

Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile

385 390 395 400

Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro

405 410 415

Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro

420 425 430

Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala

435 440 445

Phe Glu Ala Arg Asn Asp Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly

450 455 460

Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val

465 470 475 480

Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile

485 490 495

Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn

500 505 510

Ala Leu Leu Leu Ser Ser Val Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val

515 520 525

Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn

530 535 540

Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr

545 550 555 560

Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

565 570

<210> 12

<211> 573

<212> Белок

<213> Gloeophyllum trabeum

<400> 12

Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Ala Ala Ser Val Leu

1 5 10 15

Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys

20 25 30

Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Ala Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp

50 55 60

Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Gly Thr Ser Ser Leu Arg Thr

85 90 95

Leu Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser

100 105 110

Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe

115 120 125

Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg

130 135 140

Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro

165 170 175

Ile Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr

195 200 205

Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala

210 215 220

Ile Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn

225 230 235 240

Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile

245 250 255

Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu

260 265 270

Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala

275 280 285

Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr

290 295 300

Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser

305 310 315 320

Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly

325 330 335

Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser

355 360 365

Thr Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly

370 375 380

Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile

385 390 395 400

Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Val Asn Ala Lys Tyr Thr Pro

405 410 415

Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro

420 425 430

Leu Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala

435 440 445

Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly

450 455 460

Leu Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val

465 470 475 480

Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile

485 490 495

Tyr Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn

500 505 510

Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val

515 520 525

Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn

530 535 540

Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr

545 550 555 560

Pro Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

565 570

<210> 13

<211> 576

<212> Белок

<213> Gloeophyllum trabeum

<400> 13

Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Leu Gly Thr Val Leu

1 5 10 15

Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys

20 25 30

Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Ala Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp

50 55 60

Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser

85 90 95

Leu Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Ser

100 105 110

Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe

115 120 125

Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg

130 135 140

Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro

165 170 175

Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr

180 185 190

Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr

195 200 205

Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys

210 215 220

Ile Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn

225 230 235 240

Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile

245 250 255

Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu

260 265 270

Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr

275 280 285

Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr

290 295 300

Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser

305 310 315 320

Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly

325 330 335

Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser

355 360 365

Ile Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly

370 375 380

Thr Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile

385 390 395 400

Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro

405 410 415

Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ser Pro

420 425 430

Val Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala

435 440 445

Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly

450 455 460

Leu Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly

465 470 475 480

Ser Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly

485 490 495

Glu Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser

500 505 510

Pro Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser

515 520 525

Ile Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile

530 535 540

Arg Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser

545 550 555 560

Ile Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

565 570 575

<210> 14

<211> 576

<212> Белок

<213> Gloeophyllum trabeum

<400> 14

Met Tyr Arg Phe Leu Val Cys Ala Leu Gly Leu Leu Gly Thr Val Leu

1 5 10 15

Ala Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys

20 25 30

Ala Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Ala Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp

50 55 60

Tyr Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser

85 90 95

Leu Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Ser

100 105 110

Asn Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe

115 120 125

Asn Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg

130 135 140

Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp

145 150 155 160

Leu Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro

165 170 175

Ile Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr

180 185 190

Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr

195 200 205

Ala Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys

210 215 220

Ile Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn

225 230 235 240

Leu Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile

245 250 255

Thr Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu

260 265 270

Leu Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr

275 280 285

Thr Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr

290 295 300

Val Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser

305 310 315 320

Asn Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly

325 330 335

Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr

340 345 350

Asp Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser

355 360 365

Ile Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly

370 375 380

Thr Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile

385 390 395 400

Lys Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro

405 410 415

Ser Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ala Pro

420 425 430

Val Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala

435 440 445

Phe Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly

450 455 460

Leu Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly

465 470 475 480

Ser Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly

485 490 495

Glu Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser

500 505 510

Pro Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser

515 520 525

Ile Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile

530 535 540

Arg Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser

545 550 555 560

Ile Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

565 570 575

<210> 15

<211> 618

<212> Белок

<213> Talaromyces emersonii

<400> 15

Met Ala Ser Leu Val Ala Gly Ala Leu Cys Ile Leu Gly Leu Thr Pro

1 5 10 15

Ala Ala Phe Ala Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu

35 40 45

Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly

50 55 60

Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe

85 90 95

Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser

100 105 110

Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser

115 120 125

Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe

130 135 140

Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala

145 150 155 160

Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala

165 170 175

Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser

180 185 190

Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu

195 200 205

Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu

210 215 220

Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn

225 230 235 240

Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp

245 250 255

Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly

260 265 270

Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala

275 280 285

Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu

290 295 300

Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile

305 310 315 320

Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro

325 330 335

Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala

340 345 350

Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly

355 360 365

Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr

370 375 380

Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn

385 390 395 400

Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile

405 410 415

Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser

420 425 430

Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr

435 440 445

Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala

450 455 460

Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala

465 470 475 480

Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro

485 490 495

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Cys Thr

500 505 510

Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser Thr Ser

515 520 525

Tyr Gly Glu Thr Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Pro Glu Leu Gly Asn

530 535 540

Trp Ser Thr Ala Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr Thr Asn

545 550 555 560

Ser Asn Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu Pro Pro Gly Thr Ser

565 570 575

Phe Glu Tyr Lys Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp

580 585 590

Glu Asp Asp Pro Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln

595 600 605

Thr Thr Ala Ile Leu Asp Asp Ser Trp Gln

610 615

<210> 16

<211> 828

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гибридная пуллуланаза

<400> 16

Asp Ser Thr Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp Ser

1 5 10 15

Asn Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val Asn

20 25 30

Gly Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Lys Asp Asp Phe Gly Val

35 40 45

Lys Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asp Thr Gln Val Gly Leu Ile

50 55 60

Val Arg Thr Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Ser Asp Asp Leu His

65 70 75 80

Ile Asp Leu Thr Lys Gly His Glu Ile Trp Ile Val Gln Gly Asp Pro

85 90 95

Asn Ile Tyr Tyr Asn Leu Ser Asp Ala Gln Ala Ala Ala Thr Pro Lys

100 105 110

Val Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys Leu

115 120 125

Thr Asn Pro Met Thr Leu Ser Asp Gly Ser Ser Gly Phe Thr Val Thr

130 135 140

Asp Lys Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Thr Ala Ala Thr Asn Ala

145 150 155 160

Asn Ser Ala Ser Ser Ser Glu Gln Thr Asp Leu Val Gln Leu Thr Leu

165 170 175

Ala Ser Ala Pro Asp Val Ser His Thr Ile Gln Val Gly Ala Ala Gly

180 185 190

Tyr Glu Ala Val Asn Leu Ile Pro Arg Asn Val Leu Asp Ser Ser Gln

195 200 205

Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr Tyr Thr His Lys Ala

210 215 220

Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr Gln Val Asn Val Leu

225 230 235 240

Leu Tyr Asn Ser Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys Thr Val Pro Met Thr

245 250 255

Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val Asn Gln Asn Leu Glu

260 265 270

Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln Gly Ser Thr Arg Thr

275 280 285

Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro Asn Gly Thr Arg Gly

290 295 300

Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala Gly Trp Asn Ser Asp

305 310 315 320

Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu Val Ile Tyr Glu Met

325 330 335

Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser Gly Met Lys Asn Lys

340 345 350

Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr Lys Gly Pro Asp Gly

355 360 365

Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu Gly Ile Thr His Val

370 375 380

Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Phe Ala Ser Val Asp Glu Thr Asp Pro

385 390 395 400

Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr Asp Val Pro Glu

405 410 415

Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Thr Ala Arg Ile Lys Glu Phe

420 425 430

Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His Ile Gly Val Asn Met

435 440 445

Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile Ser Asp Phe Asp

450 455 460

Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp Ala Gly Asn Tyr

465 470 475 480

Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ser Glu Arg Pro Met

485 490 495

Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp Val Asn Glu Tyr

500 505 510

His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu Leu Gly Lys Asp

515 520 525

Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile Asn Pro Gly Ile

530 535 540

Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser Ala Leu Pro Glu

545 550 555 560

Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met Gly Val Ala Val

565 570 575

Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn Val Phe Asp Ser

580 585 590

Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu Thr Asp Ala Ile

595 600 605

Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr Ser Ser Pro Gly

610 615 620

Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn Tyr Thr Leu Trp Asp

625 630 635 640

Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala Asp Arg Ile Lys

645 650 655

Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser Gln Gly Val Pro

660 665 670

Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys Gly Gly Asn Asp

675 680 685

Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Thr Val Asn Glu Phe Asp Trp Ser Arg

690 695 700

Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser Gly Leu Ile His

705 710 715 720

Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr Ala Asn Glu Ile

725 730 735

Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn Thr Val Ala Tyr

740 745 750

Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly Asn Ile Ile Val

755 760 765

Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Ala Thr Ile Asn Leu Pro Ser Gly

770 775 780

Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly Glu Ser Thr Leu

785 790 795 800

Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile Ser Met Met Ile

805 810 815

Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys

820 825

<210> 17

<211> 928

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гибридная пуллуланаза

<400> 17

Ala Ser Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp Ala Asn

1 5 10 15

Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val Asn Gly

20 25 30

Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Thr Asp Glu Phe Gly Val Thr

35 40 45

Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asn Thr Gln Val Gly Leu Ile Val

50 55 60

Arg Lys Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Pro Asp Asp Leu His Ile

65 70 75 80

Asp Leu Ser Lys Gly His Glu Val Trp Ile Asn Gln Gly Asp Pro Thr

85 90 95

Ile Tyr Tyr Asn Leu Asn Asp Ala Glu Ala Ala Ala Val Pro Ala Val

100 105 110

Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys Leu Ser

115 120 125

Ser Pro Met Thr Leu Thr Asp Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Asp

130 135 140

Glu Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Val Ser Ala Glu Ser Ala Asn

145 150 155 160

Pro Val Thr Ala Val Leu Val Gly Asp Phe Gln Gln Ala Leu Gly Ala

165 170 175

Ser Gly Asn Trp Ser Pro Asp Asp Asp His Thr Lys Leu Ser Lys Ile

180 185 190

Asn Ser Asn Leu Tyr Gln Phe Thr Gly Thr Leu Pro Ala Gly Thr Tyr

195 200 205

Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asp His Ser Trp Ser Ala Ser Tyr Pro Asn

210 215 220

Asn Asn Val Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Phe

225 230 235 240

Thr Tyr Ile Pro Ser Thr His Gln Val Phe Asp Ser Ile Asn Asn Pro

245 250 255

Asp Gln Thr Phe Pro Ser Ser Ser Ala Gly Thr Gln Ser Asp Leu Val

260 265 270

Gln Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Asp Ile Thr His Asp Leu Gln Val

275 280 285

Val Ala Asp Gly Tyr Lys Gly Gly Lys Ile Leu Pro Arg Asn Val Leu

290 295 300

Asn Leu Pro Arg Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asn Val Tyr

305 310 315 320

Ser Asn Lys Ala Thr Ala Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Asp

325 330 335

Val Gln Leu Leu Leu Tyr Asn Ser Glu Thr Gly Pro Val Thr Lys Gln

340 345 350

Leu Glu Met Gln Lys Ser Asp Asn Gly Thr Trp Lys Leu Lys Val Pro

355 360 365

Gly Asn Leu Lys Asn Trp Tyr Tyr Leu Tyr Gln Val Thr Val Asn Gly

370 375 380

Lys Thr Gln Thr Ala Val Asp Pro Tyr Val Arg Ala Ile Ser Val Asn

385 390 395 400

Ala Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Glu Asp Thr Asn Pro Pro Gly

405 410 415

Trp Lys Glu Asp His Gln Gln Thr Pro Ala Asn Pro Val Asp Glu Val

420 425 430

Ile Tyr Glu Val His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ala Asn Ser Gly

435 440 445

Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Phe Thr Glu His Gly Thr Lys

450 455 460

Gly Pro Asp Gly Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Glu Leu Gly

465 470 475 480

Ile Asn Ala Val Gln Leu Gln Pro Ile Glu Glu Phe Ala Ser Ile Asp

485 490 495

Glu Thr Gln Pro Asn Met Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr

500 505 510

Asn Val Pro Glu Gly Ala Tyr Ala Thr Thr Pro Glu Gly Thr Ala Arg

515 520 525

Ile Thr Glu Phe Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile His Lys Asp Arg Ile

530 535 540

Ala Ile Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ser Thr Leu Ile

545 550 555 560

Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Gln Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp

565 570 575

Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Val Gly Asn Glu Phe Ala Thr

580 585 590

Glu His Pro Met Ala Arg Lys Phe Val Leu Asp Ser Leu Lys Tyr Trp

595 600 605

Val Thr Gln Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu

610 615 620

Leu Gly Lys Asn Thr Met Ala Glu Ala Ser Lys Glu Leu His Ala Ile

625 630 635 640

Asn Pro Gly Ile Val Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser

645 650 655

Gly Ile Thr Gly Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Val Gln Lys Gly Leu

660 665 670

Gly Ile Gly Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn

675 680 685

Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu

690 695 700

Thr Asp Ala Ile Lys Arg Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr

705 710 715 720

Ser Ser Pro Ser Glu Thr Ile Asn Tyr Val Ser Cys His Asp Asn Tyr

725 730 735

Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala

740 745 750

Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser

755 760 765

Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys

770 775 780

Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Thr Val Asn Glu Phe

785 790 795 800

Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser

805 810 815

Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr

820 825 830

Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn

835 840 845

Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly

850 855 860

Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Ala Thr Ile Asn

865 870 875 880

Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly

885 890 895

Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile

900 905 910

Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys

915 920 925

<210> 18

<211> 928

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> гибридная пуллуланаза

<400> 18

Ala Ser Ser Thr Glu Val Ile Val His Tyr His Arg Phe Asp Ala Asn

1 5 10 15

Tyr Ala Asn Trp Asp Leu Trp Met Trp Pro Tyr Gln Pro Val Asn Gly

20 25 30

Asn Gly Ala Ala Tyr Glu Phe Ser Gly Thr Asp Glu Phe Gly Val Thr

35 40 45

Ala Asp Val Gln Val Pro Gly Asp Asn Thr Gln Val Gly Leu Ile Val

50 55 60

Arg Lys Asn Asp Trp Ser Gln Lys Asn Thr Pro Asp Asp Leu His Ile

65 70 75 80

Asp Leu Ser Lys Gly His Glu Val Trp Ile Asn Gln Gly Asp Pro Thr

85 90 95

Ile Tyr Tyr Asn Leu Asn Asp Ala Glu Ala Ala Ala Val Pro Ala Val

100 105 110

Ser Asn Ala Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Thr Val Leu Ala Lys Leu Ser

115 120 125

Ser Pro Met Thr Leu Thr Asp Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val Thr Asp

130 135 140

Glu Thr Thr Gly Glu Gln Ile Pro Val Val Ser Ala Glu Ser Ala Asn

145 150 155 160

Pro Val Thr Ala Val Leu Val Gly Asp Phe Gln Gln Ala Leu Gly Ala

165 170 175

Ser Gly Asn Trp Ser Pro Asp Asp Asp His Thr Lys Leu Ser Lys Ile

180 185 190

Asn Ser Asn Leu Tyr Gln Phe Thr Gly Thr Leu Pro Ala Gly Thr Tyr

195 200 205

Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asp His Ser Trp Ser Ala Ser Tyr Pro Asn

210 215 220

Asn Asn Val Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Thr Lys Val Thr Phe

225 230 235 240

Thr Tyr Ile Pro Ser Thr His Gln Val Phe Asp Ser Ile Asn Asn Pro

245 250 255

Asp Gln Thr Phe Pro Ser Ser Ser Ala Gly Thr Gln Ser Asp Leu Val

260 265 270

Gln Leu Thr Leu Ala Ser Ala Pro Asp Ile Thr His Asp Leu Gln Val

275 280 285

Val Ala Asp Gly Tyr Lys Gly Gly Lys Ile Leu Pro Arg Asn Val Leu

290 295 300

Asn Leu Pro Arg Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asn Asp Leu Gly Asn Val Tyr

305 310 315 320

Ser Asn Lys Ala Thr Ala Phe Arg Val Trp Ala Pro Thr Ala Ser Asp

325 330 335

Val Gln Leu Leu Leu Tyr Asn Ser Glu Thr Gly Pro Val Thr Lys Gln

340 345 350

Leu Glu Met Gln Lys Ser Asp Asn Gly Thr Trp Lys Leu Lys Val Pro

355 360 365

Gly Asn Leu Lys Asn Trp Tyr Tyr Leu Tyr Gln Val Thr Val Asn Gly

370 375 380

Lys Thr Gln Thr Ala Val Asp Pro Tyr Val Arg Ala Ile Ser Val Asn

385 390 395 400

Ala Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Glu Asp Thr Asn Pro Pro Gly

405 410 415

Trp Lys Glu Asp His Gln Gln Thr Pro Ala Asn Pro Val Asp Glu Val

420 425 430

Ile Tyr Glu Val His Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Ala Asn Ser Gly

435 440 445

Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Phe Thr Glu His Gly Thr Lys

450 455 460

Gly Pro Asp Gly Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Glu Leu Gly

465 470 475 480

Ile Asn Ala Val Gln Leu Gln Pro Ile Glu Glu Phe Ala Ser Ile Asp

485 490 495

Glu Thr Gln Pro Asn Met Tyr Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn Tyr

500 505 510

Asn Val Pro Glu Gly Ala Tyr Ala Thr Thr Pro Glu Gly Thr Ala Arg

515 520 525

Ile Thr Glu Phe Lys Gln Leu Ile Gln Ser Ile His Lys Asp Arg Ile

530 535 540

Ala Ile Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln Ile

545 550 555 560

Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp Asp

565 570 575

Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala Ala

580 585 590

Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr Trp

595 600 605

Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala Leu

610 615 620

Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala Ile

625 630 635 640

Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr Ser

645 650 655

Ala Leu Pro Glu Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly Met

660 665 670

Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn

675 680 685

Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly Leu

690 695 700

Thr Asp Ala Ile Lys Arg Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe Thr

705 710 715 720

Ser Ser Pro Ser Glu Thr Ile Asn Tyr Val Ser Cys His Asp Asn Tyr

725 730 735

Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu Ala

740 745 750

Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr Ser

755 760 765

Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr Lys

770 775 780

Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Thr Val Asn Glu Phe

785 790 795 800

Asp Trp Ser Arg Lys Ala Gln Tyr Pro Asp Val Phe Asn Tyr Tyr Ser

805 810 815

Gly Leu Ile His Leu Arg Leu Asp His Pro Ala Phe Arg Met Thr Thr

820 825 830

Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu Asn

835 840 845

Thr Val Ala Tyr Glu Leu Thr Asp His Val Asn Lys Asp Lys Trp Gly

850 855 860

Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Ala Ala Thr Ile Asn

865 870 875 880

Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val Gly

885 890 895

Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly Ile

900 905 910

Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys Lys

915 920 925

<210> 19

<211> 471

<212> Белок

<213> Rhizomucor pusillus

<400> 19

Met Lys Phe Ser Ile Ser Leu Ser Ala Ala Ile Val Leu Phe Ala Ala

1 5 10 15

Ala Thr Ser Leu Ala Ser Pro Leu Pro Gln Gln Gln Arg Tyr Gly Lys

20 25 30

Arg Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Ser Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu

35 40 45

Thr Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn

50 55 60

Leu Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu

65 70 75 80

Asp Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile

85 90 95

Pro Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe

100 105 110

Tyr Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu

115 120 125

Ile Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val

130 135 140

Ala Asn His Ala Gly Pro Thr Ser Asn Gly Tyr Ser Gly Tyr Thr Phe

145 150 155 160

Gly Asp Ala Ser Leu Tyr His Pro Lys Cys Thr Ile Asp Tyr Asn Asp

165 170 175

Gln Thr Ser Ile Glu Gln Cys Trp Val Ala Asp Glu Leu Pro Asp Ile

180 185 190

Asp Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser

195 200 205

Gly Trp Val Gly Asn Tyr Ser Phe Asp Gly Ile Arg Ile Asp Thr Val

210 215 220

Lys His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Val Phe Ala Thr Gly Glu Val Phe Asn Gly Asp Pro Ala Tyr Val Gly

245 250 255

Pro Tyr Gln Lys Tyr Leu Pro Ser Leu Ile Asn Tyr Pro Met Tyr Tyr

260 265 270

Ala Leu Asn Asp Val Phe Val Ser Lys Ser Lys Gly Phe Ser Arg Ile

275 280 285

Ser Glu Met Leu Gly Ser Asn Arg Asn Ala Phe Glu Asp Thr Ser Val

290 295 300

Leu Thr Thr Phe Val Asp Asn His Asp Asn Pro Arg Phe Leu Asn Ser

305 310 315 320

Gln Ser Asp Lys Ala Leu Phe Lys Asn Ala Leu Thr Tyr Val Leu Leu

325 330 335

Gly Glu Gly Ile Pro Ile Val Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Gly Phe Ser

340 345 350

Gly Gly Ala Asp Pro Ala Asn Arg Glu Val Leu Trp Thr Thr Asn Tyr

355 360 365

Asp Thr Ser Ser Asp Leu Tyr Gln Phe Ile Lys Thr Val Asn Ser Val

370 375 380

Arg Met Lys Ser Asn Lys Ala Val Tyr Met Asp Ile Tyr Val Gly Asp

385 390 395 400

Asn Ala Tyr Ala Phe Lys His Gly Asp Ala Leu Val Val Leu Asn Asn

405 410 415

Tyr Gly Ser Gly Ser Thr Asn Gln Val Ser Phe Ser Val Ser Gly Lys

420 425 430

Phe Asp Ser Gly Ala Ser Leu Met Asp Ile Val Ser Asn Ile Thr Thr

435 440 445

Thr Val Ser Ser Asp Gly Thr Val Thr Phe Asn Leu Lys Asp Gly Leu

450 455 460

Pro Ala Ile Phe Thr Ser Ala

465 470

<210> 20

<211> 514

<212> Белок

<213> B. stearothermophilus

<400> 20

Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu

1 5 10 15

Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn

20 25 30

Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys

35 40 45

Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp

50 55 60

Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Ala Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met

85 90 95

Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly

100 105 110

Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln

115 120 125

Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe

130 135 140

Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His

145 150 155 160

Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr

165 170 175

Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu

180 185 190

Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His

195 200 205

Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Ser Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn

210 215 220

Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys

225 230 235 240

Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Asp Val Arg Ser Gln Thr Gly

245 250 255

Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys

260 265 270

Leu His Asn Tyr Ile Met Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp

275 280 285

Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Thr

290 295 300

Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro

305 310 315 320

Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln

325 330 335

Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala

340 345 350

Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp

355 360 365

Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile

370 375 380

Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His

385 390 395 400

Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val

405 410 415

Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val

435 440 445

Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser

450 455 460

Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp

465 470 475 480

Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Ala Trp Ser Ile Thr Thr

485 490 495

Arg Pro Trp Thr Asp Glu Phe Val Arg Trp Thr Glu Pro Arg Leu Val

500 505 510

Ala Trp

<210> 21

<211> 483

<212> Белок

<213> Bacillus licheniformis

<400> 21

Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro

1 5 10 15

Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

20 25 30

Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

35 40 45

Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

50 55 60

Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys

65 70 75 80

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

85 90 95

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr

100 105 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

115 120 125

Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

130 135 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe

145 150 155 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys

165 170 175

Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn

180 185 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

195 200 205

Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

210 215 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225 230 235 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

245 250 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

260 265 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

275 280 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

290 295 300

Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser

305 310 315 320

Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

325 330 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

340 345 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

355 360 365

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile

370 375 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His

385 390 395 400

Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

405 410 415

Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr

435 440 445

Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser

450 455 460

Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465 470 475 480

Val Gln Arg

<210> 22

<211> 483

<212> Белок

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 22

Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp

1 5 10 15

Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp

20 25 30

Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser

35 40 45

Gln Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu

50 55 60

Phe Gln Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Ser Glu

65 70 75 80

Leu Gln Asp Ala Ile Gly Ser Leu His Ser Arg Asn Val Gln Val Tyr

85 90 95

Gly Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp

100 105 110

Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Glu Thr Ser

115 120 125

Glu Glu Tyr Gln Ile Lys Ala Trp Thr Asp Phe Arg Phe Pro Gly Arg

130 135 140

Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly

145 150 155 160

Ala Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Ile Ser Arg Ile Phe Lys Phe Arg

165 170 175

Gly Glu Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Ser Glu Asn Gly Asn

180 185 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

195 200 205

Val Ala Glu Thr Lys Lys Trp Gly Ile Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Ser

210 215 220

Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Ala Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225 230 235 240

Leu Arg Asp Trp Val Gln Ala Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Glu Met

245 250 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asn Ala Gly Lys Leu Glu Asn

260 265 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Phe Asn Gln Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

275 280 285

His Phe Asn Leu Gln Ala Ala Ser Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

290 295 300

Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala

305 310 315 320

Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

325 330 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

340 345 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

355 360 365

Thr Lys Gly Thr Ser Pro Lys Glu Ile Pro Ser Leu Lys Asp Asn Ile

370 375 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Glu Tyr Ala Tyr Gly Pro Gln His

385 390 395 400

Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

405 410 415

Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr

435 440 445

Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser

450 455 460

Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465 470 475 480

Val Gln Lys

<210> 23

<211> 483

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Конъюгат рекомбинантной альфа-амилазы

<400> 23

Ala Ala Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro

1 5 10 15

Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu

20 25 30

Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

35 40 45

Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

50 55 60

Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys

65 70 75 80

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

85 90 95

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr

100 105 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

115 120 125

Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

130 135 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe

145 150 155 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys

165 170 175

Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn

180 185 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

195 200 205

Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

210 215 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225 230 235 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

245 250 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

260 265 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

275 280 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

290 295 300

Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser

305 310 315 320

Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

325 330 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

340 345 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

355 360 365

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile

370 375 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His

385 390 395 400

Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

405 410 415

Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr

435 440 445

Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser

450 455 460

Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465 470 475 480

Val Gln Arg

<210> 24

<211> 483

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гибридная альфа-амилаза из Bacillus

<400> 24

Ala Ala Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro

1 5 10 15

Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu

20 25 30

Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Ala

35 40 45

Ile Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

50 55 60

Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys

65 70 75 80

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

85 90 95

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr

100 105 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

115 120 125

Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

130 135 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe

145 150 155 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys

165 170 175

Phe Gln Gly Lys Thr Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn

180 185 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Phe Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

195 200 205

Val Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

210 215 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225 230 235 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

245 250 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

260 265 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

275 280 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

290 295 300

Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser

305 310 315 320

Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

325 330 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

340 345 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

355 360 365

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile

370 375 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His

385 390 395 400

Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

405 410 415

Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr

435 440 445

Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser

450 455 460

Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465 470 475 480

Val Gln Arg

<210> 25

<211> 483

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант гибридной альфа-амилазы из Bacillus

<400> 25

Ala Ala Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro

1 5 10 15

Asn Asp Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu

20 25 30

Ser Asp Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Ala

35 40 45

Ile Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

50 55 60

Gly Glu Phe Trp Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys

65 70 75 80

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

85 90 95

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Ala Thr

100 105 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

115 120 125

Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

130 135 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Tyr Trp Tyr His Phe

145 150 155 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Leu

165 170 175

Phe Gln Gly Lys Thr Trp Asp Trp Pro Val Ser Asn Glu Phe Gly Asn

180 185 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Tyr Asp Tyr Asp Tyr Pro Asp Val

195 200 205

Val Ala Glu Ile Thr Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

210 215 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225 230 235 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

245 250 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Ser Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

260 265 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

275 280 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

290 295 300

Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser

305 310 315 320

Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

325 330 335

Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

340 345 350

Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly

355 360 365

Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile

370 375 380

Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His

385 390 395 400

Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val

405 410 415

Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Gly Ala Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr

435 440 445

Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser

450 455 460

Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr

465 470 475 480

Val Gln Arg

Реферат

Изобретение относится к пищевой промышленности. Представлена композиция для получения глюкозного сиропа из ожиженного крахмала, содержащая фермент альфа-амилазу, пуллуланазу и глюкоамилазу, где альфа-амилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 5 или ее зрелого полипептида, где пуллуланаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 3 или ее зрелого полипептида, и где глюкоамилаза содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 90% тождественность последовательности SEQ ID NO: 4 или ее зрелого полипептида. Изобретение позволяет повысить выход глюкозного сиропа. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

Формула