Штамм e.coli - продуцент полноразмерного протективного антигена bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц - RU2633504C1

Чертежи

Показать все 12 чертежа(ей)

Описание

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам получения вакцины для защиты животных и человека от сибиреязвенной инфекции, и позволяет получать основной защитный антиген возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis в форме вирусоподобных частиц (ВПЧ), что облегчает его очистку и потенциально повышает иммуногенность.

Уровень техники

Актуальность изобретения связана с тем, что сибирская язва представляет собой природно-очаговое заболевание, среди резервуарных хозяев которого есть дикие животные. Таким образом, окончательное искоренение этой инфекции не представляется возможным, и контроль за заболеваемостью наиболее чувствительных видов домашних животных – крупного рогатого скота и северного оленя – возможен только за счет ежегодной вакцинации. Вакцинация - исторически первое и на сегодняшний день наиболее эффективное средство специфической профилактики бактериальных и вирусных заболеваний людей и животных. Существует несколько подходов к изготовлению вакцинных субстанций [Борисевич И.В. и соавт., Медицинские иммунобиологические препарата, Справочник, Гела-Принт, Москва, 2011]. Это получение аттенуированных живых возбудителей, использование убитых клеток или инактивированных вирусных частиц вирулентных штаммов, а также различные варианты субъединичных вакцин, в которых используются отдельные компоненты возбудителей, выделенные либо из их активных культур, либо полученные генно-инженерным путем. Особо следует отметить такой тип вакцин, как анатоксины – инактивированные экзотоксины бактерий, которые вызывают выработку токсин-нейтрализующих антител, что эффективно защищает человека или животное от бактериальных инфекций, в патогенезе которых выработка экзотоксина имеет определяющее значение.

Вакцинация животных от сибирской язвы является первым в истории примером создания и коммерциализации вакцины на основе аттенуированного штамма возбудителя, который был получен в лаборатории Л. Пастера [Berche P. (2012) Clin. Microbiol. Infect. 18(5), 1-6]. Живые сибиреязвенные вакцины используются по настоящее время. В России для вакцинации людей применяется вакцинный штамм B. anthracis СТИ, а для ветеринарных целей – штамм ВНИВВиМ 0055. Вакцинация от сибирской язвы сельскохозяйственных животных входит в число обязательных ветеринарных мероприятий. Взрослому крупному рогатому скоту делают прививки против сибирской язвы один раз в год, желательно весной, перед выгоном на пастбище; телятам и ягнятам - с 3-месячного возраста. Вакцинации подлежат также лошади, козы, и другие животные в случае их нахождения в неблагоприятном по сибирской язве районе.

Основными факторами патогенности B. anthracis являются капсульный полисахарид, который обуславливает устойчивость бактерий к фагоцитозу и трехчастный экзотоксин [Liu S., Moayeri M., Leppla S.H. (2014) Trends Microbiol. 22(6), 317-325]. Синтез этих факторов патогенности обуславливается двумя крупными плазмидами pX02 и рX01 соответственно. У наиболее традиционного в РФ вакцинного штамма ВНИВВиМ 0055 в процессе аттенуации произошла потеря плазмиды рХO2 и, соответственно, утрата способности к синтезу капсулы. Поэтому основной эффект в протективный иммунитет, формируемый данной вакциной, вносят токсин-нейтрализующие антитела.

Из трех субъединиц сибиреязвенного токсина (PA – протективный антиген, EF – отечный фактор и LF – летальный фактор) набольшее значение имеет развитие иммунного ответа к РА [Wang H.C., An H.J., Yu Y.Z., Xu Q. (2014) Immunol. Lett., S0165-2478(14)00152-7]. Этот белок массой 83 кДа представляет собой рецептор–узнающую субъединицу, способную специфически связываться с рецепторами клеток, которых в настоящее время известно два – опухолевый эндотелиальный маркер (ТЕМ8) и продукт гена морфогенеза капилляров 2 (CMG2). После связывания с рецептором белок РА подвергается процессингу мембранной протеазой класса фуринов и утрачивает N-концевой 20 кДа домен (Домен I, РА20). Образующийся при этом белок РА63 (63 кДа) формирует гептамерные или октамерные комплексы, с которыми связываются каталитически активные субъединицы EF и/или LF. После фагоцитоза связанного с мембраной токсина РА происходит транспорт каталитических субъединиц из эндоцитозного пузырька в цитоплазму клетки, где они проявляют свою энзиматическую активность аденилат-циклазы и металлопротеазы, опосредуя возникновение цитопатогенных эффектов токсина. В отсутствие РА каталитические субъединицы токсина способны проникать в клетки, поэтому образование антител к РА полностью защищает от заражения сибирской язвой. В этой связи РА является основным антигеном, используемым для создания вакцин и сывороток для заблаговременной и экстренной иммунопрофилактики сибирской язвы, хотя имеются работы, направленные на создание иммунитета против каталитических субъединиц или разработку низкомолекулярных ингибиторов этих белков для целей экстренной профилактики.

Нейтрализующие антитела обнаруживаются в крови людей и животных в течение 6 – 12 мес.после вакцинации, однако, как было показано, клетки иммунологической памяти, опосредующие образование антител к РА, сохраняются как минимум несколько лет, что обуславливает определенный уровень защиты от инфекции умеренными дозами возбудителя.

Предпринимались неоднократные попытки создать вакцину на основе продуцентов рекомбинантного РА, однако продуктивность многих предложенных штаммов оказывалась не выше, чем продуктивность вакцинного штамма, кроме того, экспрессия не всегда была стабильной [Микшис Н.И., Попов Ю.А., Шулепов Д.В. (2008) патент РФ №2321629. Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis 55Δ тпа-1spo-(pUB110-PA1)-продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба]. Высокие защитные дозы PA (от 50 мкг на голову крупного рогатого скота) в сочетании с дорогостоящей очисткой РА в процессе получения субъединичной вакцины не позволили наладить массовый выпуск препаратов ветеринарного назначения ни в одной стране мира. Таким образом, усилия по повышению иммуногенности РА83 в настоящее время сохраняют практическую актуальность, создавая основу для снижения достаточно высокой стоимости вакцин для ежегодной вакцинации крупного рогатого скота и северного оленя против сибирской язвы. Известен ряд изобретений, описывающих повышение продукции РА83 B. anthracis за счет нарушения механизмов катаболической репрессии, прежде всего, гена AbrB [Yusibov V. патент US 20110142870, опубл. 16.06.2011; Yusibov V. патент WO/2008/048344, опубл. 24.04.2008; Baillie L.W.J. патент WO /1998/008952, опубл. 05.03.1998; Baillie L.W.J. патент EP 0927255, опубл. 07.07.1999], а также генов спорообразования [Leppla S.H., патент US 20130058967 опубл. 03.2013].

Вакцины на основе рекомбинантных белков имеют целый ряд преимуществ по сравнению с традиционными. Для них характерен высокий уровень биологической безопасности, так как ни в процессе изготовления, ни в самой готовой субстанции рекомбинантного белка не используются патогенные бактерии, вирусы или продукты их жизнедеятельности [Chroboczek J. Et al. Virus-like particles as vaccine. Acta Biochim. Pol. – 2014. – V.61(3). – P. 531−539]. Рекомбинантные технологии позволяют пользоваться для конструирования вакцин отдельными антигенами и даже их фрагментами, что обеспечивает высокую специфичность ответа. Однако на практике в настоящее время на рынке практически отсутствуют вакцины на основе рекомбинантных белков. Единственным значимым исключением из этого правила является вакцина против вирусного гепатита В [Борисевич И.В. и соавт., Медицинские иммунобиологические препарата, Справочник, Гела-Принт, Москва, 2011].

В случае противовирусных вакцин основной причиной такого положения является то, что субъединичные вакцины на основе растворимых антигенов уступают по иммуногенности цельновирионным, что приводит к необходимости использования высоких доз рекомбинантных антигенов по сравнению с природными. Природа повышенной иммуногенности антигена, имеющего наноразмерную корпускулярную структуру, остается неизвестной.

Анализ литературы [Летаров и соавт.(2016) Биотехнология №2, С.43–56] показывает, что наименьшая доза антигена – 1,5-3 мкг на дозу –используется при изготовлении цельновирионных инактивированных вакцин против клещевого энцефалита (ФСМЕ и Энцепур) и ветеринарной вакцины против ящура. При вакцинации против сибирской язвы используется протективный антиген в дозе от 50 до 4800 мкг (от 0,7 до 70 мкг/кг живой массы). При этом необходимо учитывать, что в состав вирусных частиц входит не один какой-либо чистый антиген, а набор белков, среди которых «нейтрализуемые» поверхностные антигены составляют, как правило, 1-5%. С учетом этого можно утверждать, что иммуногенность натуральных вирусных частиц вируса клещевого энцефалита и ящура в 200-400 раз выше, чем у протективного антигена B. anthracis, который многие авторы относят к высокоиммуногенным бактериальным белкам.

Увеличение иммуногенности белковых антигенов за счет создания искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ), экспонирующих целевой антиген на своей поверхности, описано в работе [Chroboczek J., Szurgot I., Szolajska E. (2014) Acta Biochim. Pol., 61, 531-539]. Сходные результаты описаны и в обширной литературе по использованию в качестве адъюванта основного белка жгутиков Salmonella typhimurium – флагеллина [Bennett K.M., Gorham R.D., Gusti V., Trinh L., Morikis D., Lo D.D. (2015) BMC Biotechnol., 15, 71]. Эти и многие другие авторы считают, что основой гипериммунногенности флагеллина (и искусственных белков на его основе) является сочетание способности этого белка к формированию линейных полимеров и высокой аффинности к нему рецепторов макрофагов и дендритных клеток TLR5.

Еще один подход к получению рекомбинантных антигенов в наноструктурированной форме с целью увеличения иммуногенности описан в работах [Гинцбург А.Л., Лунин В.Г., Карягина-Жулина А.С.(2007) Инновации, №12, 62-67]. При этом наноструктуризация антигена достигается за счет сорбции слитых бифункциональных белков-антигенов, имеющих в своем составе полисахарид-связывающие домены, с полисахаридными наночастицами. Аналогичное решение с применением наночастиц полифосфазола при создании вакцины против коклюша описано в работе [Garlapati S., Eng N.F., et al. (2011) Vaccine, 29(38), 6540-6548. DOI: 10.1016/j.vaccine.2011.07.009].

В то же время, само по себе формирование ВПЧ не является достаточным условием повышения иммуногенности до уровня, характерного для нативных вирусных частиц. Из таблицы 1 видно, что HBsAg вируса гепатита В, имеющий форму ВПЧ [Czyż M. et al. (2016) Biologicals, pii: S1045-1056(15)00137-2. DOI: 10.1016/j.biologicals.2015.12.001], используется в вакцинах в относительно высоких концентрациях ~20 мкг на дозу, характерных скорее для растворимых антигенов с высокой иммуногенностью. Антигены возбудителя коклюша B. pertussis: коклюшный антиген, филаментозный гемагглютинин и пертактин – также склонны к формированию агрегатов, что не позволяет считать их истинно мономерными белками и относить получаемые на них результаты к категории растворимых белков или ВПЧ [Scheller E.V., Cotter P.A. (2015) Pathog. Dis., 73(8)]. Аналогичная трудность с интерпретацией данных касается и поведения очищенного HA вируса гриппа, несомненно, склонного к агрегации даже в отсутствие других структурных белков вируса гриппа.

Неоднозначные результаты получены и при использовании рекомбинантных ВПЧ, сформированных капсидным антигеном вируса гепатита Е [Zhang X., Wei M., et al. (2014) Vaccine, 32(32), 4039-50]. Разработанная китайской компанией «Xiamen Innovax Biotech» вакцина против вируса гепатита Е HEV239 (коммерческое название Hecolin) в 2012 году прошла третью фазу клинических испытаний на двух группах из 50 000 человек каждая. Испытания проводились в провинции Цзянсу в течение 12 месяцев и показали высокую эффективность. Однако в 2014 году производство вакцины было свернуто из-за высокой себестоимости производства, не обеспечивающей рентабельности. Косвенно это свидетельствует о недостаточной иммуногенности ВПЧ на основе капсидного белка ВГЕ.

В настоящее время в США в стадии испытаний находятся 88 вакцин, основанных на применении ВПЧ самого различного происхождения (clinicaltrials.gov). Большинство этих препаратов предназначено для борьбы с вирусными инфекциями людей. По сведениям [Zeltins A. (2013) Mol. Biotechnol., 53(1), 92-107] было сконструировано около 110 различных вариантов ВПЧ, основанных на белках около 35 семейств вирусов. При создании противовирусных вакцин для защиты людей применяются, в основном, платформы на основе белков вирусов человека и животных, экспрессируемых в эукариотических системах.

Аналогами настоящего изобретения являются изобретения, в которых описаны способы получения различных практически важных белков в форме вирусоподобных частиц. К этому числу можно отнести Патент РФ №2409667 «Вирусоподобные частицы, включающие гибридный белок белка оболочки бактериофага ар205 и антигенного полипептида» швейцарских и латвийских авторов Бахманн М. (CH), Тиссо А. (CH), Дженнингс Г. (CH), Ренхофа Р. (LV), Пумпенс П. (LV), Сиеленс И. (LV) (заявлено 21.09.2005, опубликовано 20.01.2011, заявитель Цитос Биотехнологии АГ (CH). Описанная в этом изобретении вирусоподобная частица (ВПЧ) включает гибридный белок, который состоит из белка бактериофага АР205 и какого-либо антигена. Описана также композиция, включающая ВПЧ на основе РНК-содержащего бактериофага АР205. Изобретение включает в себя способ получения описанных выше ВПЧ. Модифицированная ВПЧ настоящего изобретения применяется для получения композиций для индукции иммунного ответа для профилактики и лечения различных заболеваний, в том числе инфекционных, аллергии, рака и наркомании.

В патенте РФ №2375076 «Гибридные вирусоподобные частицы» швейцарских авторов Бахманн М. и Шварц К. (заявлено 12.07.2004, опубликовано 10.12.2009, заявитель Цитос Биотехнологии АГ (CH)) описывается метод получения гибридных антигенов, связанных или слитых с ВПЧ, содержащей, по крайней мере, одну неметилированную CpG-последовательность в составе ДНК, и лиганд toll-подобного рецептора (TLR). Описывается метод получения вакцинной композиции и способ ее введения, обеспечивающий усиление иммунного ответа.

К аналогам можно отнести Патент РФ №2162856 «Изолированный полипептид, изолированный слитой белок (варианты) для получения наноструктуры» автора Голдберг Э.Б. (заявлено 13.10.1995, опубликовано 10.02.2001, заявитель Нанофреймз ЛЛС.(US)), описывающий метод получения наночастиц с применением белков бактериофага Т4. Метод конструирования полипептидов на основе белка gp36 бактериофага Т4 основан на получении слитого белка, состоящего из N-концевой части белка gp37 Т-четного (или родственного) бактериофага и С-концевых аминокислот белка gp36 (с 10 по 60) или N-концевой части белка gp36 и С-концевой части белка gp34 Т-четного (или родственного) бактериофага. Выделенный белок включает 20 смежных остатков белка gp37, белков gp36 или gp34 Т-четного (или родственного) бактериофага. Изобретение позволяет создавать препараты ВПЧ, размер и свойства которых могут быть адаптированы к конкретным задачам.

В патенте РФ №2470941 «Связывающие полипептиды и их применения» американских и канадского авторов Сидху С.С.(US), Бирталан С.К. (US), Феллуз Ф.А. (CA) (заявлено 01.12.2006, опубликовано 27.12.2012, заявитель Genentech Inc. (US)) в числе примеров описывается возможность использования белков Soc и Hoc бактериофага T4 для получения полипептидов, специфически связывающих DR5 человека, перспективных при лечении аллергических расстройств.

В качестве аналога изобретения, описывающего способы получения протективного антигена в В. anthracis в E.coli, можно привести патент РФ №2288272 «Высокие уровни конститутивной продукции протективного антигена сибирской язвы» индийских авторов Бхатнагар Р., Вахид С.М., Чаухан В. (заявлено 12.07.2001, опубликовано 27.11.2006, патентообладатель Бхатангар Р.). В патенте описан опытно-промышленный способ получения протективного антигена В. anthracis, включающий культивирование рекомбинантного штамма E.coli в лабораторных ферментерах с подпиткой. Штамм получен на базе плазмиды pQE30. Денатурированный мочевиной рекомбинантный белок РА, имеющий на N-конце 6His-таг, очищают с помощью металлоаффинной хроматографии. Известна также публикация Willhite с соавт., Protein and Peptide Letters, (1998), 5; 273-278, описывающая высокоэффективную экспрессию РА в цитоплазме E.coli в виде растворимого белка. Авторы это работы присоединили к N-концу продукта аффинную метку (таг) для упрощения процедуры его очистки.

Наиболее близким прототипом изобретения является действующий патент РФ №2270865 «Иммуногенный полипептид, вызывающий защитный иммунный ответ против Bacillus anthracis (варианты), способ его получения, нуклеиновая кислота, кодирующая его, вектор для экспрессии (варианты), способ и вакцина для предупреждения инфекции, вызванной Bacillus anthracis» авторов Уильямсон Э.Д. (GB), Миллер Дж. (GB), Уолкер Н.Дж. (GB), Бэйли Л.В.Д. (GB), Холден П.Т. (GB), Флик-Смит Х.К. (GB), Баллифент Х.Л. (GB), Титболл Р.В. (GB), Топпинг Э.В. (GB) (заявка подана 06.07.2001, опубликовано 27.02.2006, заявитель The secretary of State for defense DSTL (GB)). Описан способ получения иммуногенного полипептида, вызывающего иммунный ответ, обеспечивающий защиту от инфекции B. anthracis. Полипептид содержит один, два или три домена полноразмерного протективного антигена (РА) из В. anthracis или их варианты. По меньшей мере, один из указанных доменов является доменом 1, или доменом 4, или его вариантом. Варианты иммуногенного полипептида, а также полноразмерный РА, получают в результате экспрессии в E.coli. Описана структура векторов для экспрессии в E.coli, кодирующие перечисленные выше иммуногенные полипептиды. Авторы утверждают, что ими разработан способ предупреждения инфекции В. anthracis за счет введения достаточного количества иммуногенного полипептида. Конкретно ими предлагается также вакцина, обеспечивающая защиту мышей от экспериментальной инфекции В. anthracis, содержащая необходимое количество иммуногенного полипептида и носитель. При создании плазмид для экспрессии укороченных вариантов РА в прототипе используется экспрессионная система на основе промотора фага Т7 (вектор pGEX-6-Р3). Для повышения выхода белка оптимизируется кодоновый состав гена РА, повышая общий его общий GC-состав до уровня ~50%, характерного для E.coli (заменяются преимущественно третьи положения кодонов). Для облегчения очистки продукта в прототипе все варианты укороченного РА получаются в виде химерного белка, имеющего в своем составе глутатион-S-трансферазу E.coli. Авторы установили, что при введении созданной ими конструкции в штамм E.coli BL21 (DE3) и культивировании его при 37°С в присутствии индуктора (ИПТГ) полноразмерный PA распределяется между растворимой и нерастворимой клеточными фракциями в пропорции: 350 мг/л нерастворимого продукта против 650 мг/л продукта в растворимой форме.

Продукты получаются в форме телец включения, денатурируются в мочевине, ренатурируются и очищаются на глутатион-S-сефарозе. Для иммунизации все варианты белка РА вводятся мышам в дозе 10 мкг на животное (~500 мкг/кг живой массы) в адсорбированной на гидроксиде алюминия форме (без использования масляного адъюванта Фрейнда) двукратно с интервалом между иммунизациями в 28 суток. Животные дают ответ в виде образования IgG, специфичных к РА, от 6 до 1500 мкг/мл сыворотки. Два варианта белка из 14 испытанных дают полную защиту животных от заражения 10⁵ КОЕ спор штамма В. anthracis (штамм STI), что косвенно говорит о близости использованных концентраций к минимально необходимым для достижения защитного эффекта.

Раскрытие изобретения

Целью настоящего изобретения является разработка подхода к изучению механизма повышения иммуногенности антигена при его полимеризации и использование этого явления для создания рекомбинантной вакцины против актуальной ветеринарной инфекции - сибирской язвы с применением вирусоподобных частиц на основе белков бактериофагов, декорированных протективным антигеном B. anthracis.

Задачей настоящего изобретения является разработка метода получения РА В. anthracis в форме ВПЧ путем наработки в клетках E.coli слитого химерного производного, в составе которого РА трансляционно слит с белком трубки капсида Т5-подобного бактериофага DT57C (белок pb6). Белок pb6 является наиболее массовым компонентом хвоста Т5-подобных бактериофагов, в том числе фага DT57C.

Задача изобретения решается путем последовательного выполнения следующих стадий:

1. Получение конструкции рGEM-TTPPAG по следующей схеме: наработка фрагмента ДНК, соответствующего гену TTP, с использованием в качестве матрицы ДНК плазмиды pTTPХ; наработка фрагмента ДНК, соответствующего гену PА, с использованием в качестве матрицы геномной ДНК B. anthracis ВНИИВВиМ 0055, полученного из НИИ микробиологии МО РФ, г.Киров; соединение фрагментов ДНК путем рестрикции, лигирования и выполнения ПЦР с фланкирующими праймерами на матрице лигазной смеси; клонирование полученного продукта в вектор pGEM-T (Promega).

2. Получение штамма-продуцента путем введения ДНК плазмиды рGEM-TTPPAG в штамм E.coli BL21 (DE3).

3. Наработка биомассы в условиях, обеспечивающих наилучший выход целевого продукта.

4. Очистка фракции ВПЧ комбинацией низкоскоростного и высокоскоростного центрифугирования.

5. Оценка гомогенности и размера ВПЧ, содержащих РА B. anthracis, с применением методов динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии.

Техническим результатом изобретения является достижение превосходства над прототипом по следующим характеристикам:

- устранение необходимости ренатурировать целевой продукт, снижающую его иммуногенность, при сохранении выхода продукта на уровне ~1 г/л культуры;

- устранение необходимости использовать аффинную хроматографию, недостаточно пригодную для промышленной эксплуатации в виду недолговечности сорбентов на основе лиганд-сефарозы без перекрестных сшивок;

- придание антигену формы вирусоподобных частиц, потенциально обладающих повышенной иммуногенностью.

Краткое описание графических изображений:

Фиг.1. Карта экспрессионной конструкции pGEM-TTPPAG.

Фиг.2. Анализ продуктов экспрессии конструкций pGEM3z и pGEM-TTPPAG методом электрофореза белков в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле, окрашенном Кумасси R-250. Дорожки 1-4: фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM3z), дорожки 5-8 фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG). Дорожки 1, 5 – цельный гомогенат, 2, 6 – нерастворимая фракция гомогената после низкоскоростного центрифугирования, 3, 7 – супернатант после ультрацентрифугирования, 4, 8 – осадок после ультрацентрифугирования. Стрелкой отмечено расположение полосы с подвижностью, соответствующей ~121 кДа, присутствующей во фракции осадка после ультрацентрифугирования лизата E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG), но отсутствующей в аналогичной фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM3z).

Фиг.3. Анализ продуктов экспрессии конструкций pGEM3z и pGEM-TTPPAG методом электрофореза белков в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле, окрашенном антителами лошади, трехкратно гипериммунизированной живой противосибиреязвенной вакциной (ФКП Орловская биофабрика), с последующей визуализацией связанных антител конъюгатом стафилококкового белка А с пероксидазой хрена (ЗАО «Иннотех-21», Москва) и H₂O₂ в присутствии хромофорного субстрата пероксидазы (N,N’-диаминобензидин). Дорожки 1-5: фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM3z), дорожки 6-10 фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG). Дорожки 1, 6 – цельный гомогенат, 2, 7 – нерастворимая фракция гомогената после низкоскоростного центрифугирования, 3, 8 - растворимая фракция гомогената после низкоскоростного центрифугирования, 4, 9 – супернатант после ультрацентрифугирования, 5, 10 – осадок после ультрацентрифугирования. На дорожках 6-9 хорошо видно расположение иммуноположительной полосы с подвижностью, соответствующей ~121 кДа, присутствующей во фракции осадка после ультра центрифугирования лизата E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG), но отсутствующей в аналогичной фракции лизата E.coli BL21(DE3, pGEM3z).

Фиг.4. Результаты использования метода динамического светорассеяния для оценки распределения размеров и гомогенности наночастиц в очищенных двухступенчатым центрифугированием фракциях лизатов E.coli BL21(DE3, pGEM3z) (пунктирная кривая) и E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) (сплошная кривая). Съемка проведена на приборе Nano-ZS (Malvern instruments, UK) при угле рассеяния 173°.

Фиг.5. Результаты использования метода атомносиловой микроскопии для оценки распределения размеров и гомогенности наночастиц в очищенных двухступенчатым центрифугированием фракциях лизатов E.coli BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) (А) и E.coli BL21(DE3, pGEM3z) (Б). Съемка проведена на микроскопе Veeco Multimode 8 с контроллером Nanoscope V (Veeco, США) в нерезонансный режим сканирования PeakForce Tapping QNM. В качестве зондов использовали кантилеверы из нитрида кремния SNL-10A (номинальная силовая константа 0,35 Н/м, резонансная частота - 65 кГц) с иглой из кремния.

Осуществление изобретения

1.Получение конструкции рGEM-TTPPAG

С целью обеспечения максимально эффективной экспрессии гена полимеризующегося белка бактериофага, слитого с целевым антигеном B. antracis, для создания конструкций был выбран плазмидный вектор, контроль транскрипции целевых генов в котором осуществляется за счет промотора РНК-полимеразы фага Т7. С учетом этого, в целях создания вирусоподобных частиц на всех этапах конструирования были использован векторы семейства pET (Novagen), содержащий промотор РНК-полимеразы фага Т7. Основой для создания конструкций послужила плазмида pESL (Sycheva et al. 2012), которая в свою очередь является производным плазмиды pET28a (Novagen, США). В качестве примера автономно полимеризующегося белка бактериофага порядка Caudovirales был выбран белок pb6, являющийся главным белком хвоста Т5-подобных бактериофагов, в том числе фагов DT57C.

Ген белка TTP фага DT57C был амплифицирован в реакции ПЦР с праймерами:

57CTTP.F1 – BspHI (TATATTCATGaCTTTACAACTATTACG) и 57CTTP.R2 – EcoRI (TGAATTCTTCACCAGCACTAACTG).

Путем клонирования продукта ПЦР по сайтам NcoI/BspHI и EcoRI/MunI в pESL была получена конструкция pTTPX с геном ТТP (кодирует белок pb6), предназначенная для трансляционного слияния ТТP с целевыми белками через С-конец.

Для создания конструкции, экспрессирующей полноразмерный белок PAG, трансляционно слитый с белком ТТР, ген белка ТТP, содержащийся в плазмиде pTTP, на матрице плазмиды pTTPX была выполнена ПЦР с использованием прямого праймера T723a-for ATCCCGCGAAATTAATACGA и обратного праймера TTPbam-rev TATAGGATCCTTCACCAGCACTAACTGTGAT (BamHI). Ген белка PAG был наработан с помощью ПЦР с использованием прямого праймера PAGbam-for TATAGGATCCGAAGTTAAACAGGAGAACCGGT (BamHI), и обратного праймера PAG-rev TATAGTCGACGGGTACCTATCTCATAGCCT. Оба фрагмента ДНК после очистки на стеклянном сорбенте были обработаны рестриктазой BamHI и соединены между собой путем обработки Т4 ДНК-лигазой. Полученный продукт реакции лигирования был использован в качестве матрицы в ПЦР с использованием праймеров T723afor и PAGrev. Продукт ПЦР (экспрессионная единица), характеризующийся последовательностью SEQ ID NO 1, был клонирован в плазмиду pGEM-T (коммерческий продукт компании Promega, предназначенный для клонирования продуктов ПЦР без предварительной обработки рестриктазами). Полученная конструкция, характеризующаяся последовательностью SEQ ID NO 2, получила обозначение pGEM-TTPPAG (Фиг.1).

2. Получение штамма-продуцента

Для введения конструкции pGEM-TTPPAG в клетки штаммов E.coli, использовали 0,1 мкг очищенной ДНК плазмидной ДНК. Препарат плазмидной ДНК добавляли к аликвоте объемом 50 мкл компетентных клеток E.coli BL21(DE3), приготовленных по методике, предложенной в работе (Cohen et al, 1972). Обработанную суспензию клеток высевали на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл). Рекомбинантные клоны с введенной конструкцией pGEM-TTPPAG отбирали с помощью однократного пассирования на селективной среде, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), после чего переносили на полноценную питательную среду LB объемом 3 мл, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), культивировали на микробиологической качалке при ротации со скоростью 220 об/мин при 37°С в течение 16 часов.

3. Наработка биомассы в условиях, обеспечивающих наилучший выход целевого продукта

При проведении ферментации несколько десятков клонов инокулировали в жидкую среду LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и 0,4% глюкозы. Перед посевом ночную культуру хранили в течении дня при температуре +4°С. Для индукции синтеза белка культуру разводили в 100 раз в одной из сред с добавлением 100 мкг/мл ампициллина состава, указанного в Таблице 3, и инкубировали при интенсивной аэрации при температуре 30°С в течение ночи.

Клетки из объема среды 3 мл осаждали центрифугированием (10 тыс.g на настольной центрифуге) и ресуспендировали в охлажденном до 0°С буфере А (20 мМ Tрис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂). К суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 0,03 мг/мл и инкубировали 30 мин в ледяной бане. После инкубации с лизоцимом добавляли равное количество буфера А, содержащего 2% TX-100, и инкубировали еще 20 мин. Гомогенизацию проводили на ультразвуковом дезинтеграторе MSE Soniprep 150 Plus Ultrasonic Disintegrator 3 раза по 30 сек при выходной мощности 100 Вт, между обработками делали паузы по 1 мин для охлаждения, вся процедура осуществлялась при охлаждении пробирки с образцом в ледяной бане.

В качестве способа определения выхода белка-антигена использовали электрофорез растворимой фракций клеточного лизата в денатруирующих условиях по Лэммли с иммунологическим окрашиванием продукта антителами лошади, иммунизированной жидкой сибиреязвенной вакциной производства ФКП «Орловская биофбарика». Расчетная масса продукта 121 кДа.

Все операции по подготовке проб для электрофореза до стадии осаждения ацетоном выполняли на холоду (ледяная баня). В полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл вносили аликвоты растворимых фракций клеточного лизата биомассы штамма-трансформанта, производного от E.coli BL21(DE3), несущего конструкции pGEM-TTPPAG, содержащие по 2 мкг общего белка, доводили объем до 100 мкл забуференным физиологическим раствором (NaCl 100 мМ, фосфат натрия 10 мМ, рН 7,2), тщательно перемешивали и добавляли 100 мкл ацетона. Выдерживали при +4°С 30 минут и осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 12 тыс.g. Супернатант тщательно удаляли с помощью водоструйного насоса, а осадок подсушивали в открытых пробирках в воздушном термостате при +37°С в течение 10 минут.В каждую пробирку вносили 20 мкл свежеприготовленного буфера Лэммли (не допускали хранение этого буфера с добавленным восстановителем более 24 часов) для денатурации образцов и прогревали в сухом термостате при 96°С в течение 5 мин. Прогретые образцы тщательно гомогенизировали и осветляли центрифугированием в течение 10 минут при 12 тыс.g. С целью приготовления серии разведений с шагом падения концентрации в 10 раз готовили 3 пробирки, содержащие по 20 мл буфера Лоури для денатурации образцов. Из денатурированной пробы отбирали аликвоту 2 мкл и переносили в первую пробирку с буфером, тщательно перемешивают. Операцию аналогичным образом повторяли со следующими двумя пробирками, перенося аликвоты образца объемом по 2 мкл в буфер объемом 20 мкл.

В лунки денатурирующего ПААГ вносили по 10 мкл каждого разведения образца (соответствует 1, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг общего белка в растворимой клеточной фракции). Полиакриламидный гель для выполнения электрофореза готовили согласно прописи, приведенной в таблице 1.

Таблица 1 - Состав денатурирующего полиакриламидного геля.

Для электрофореза использовали следующие стандартные растворы: электродный буфер - 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 0,1% SDS, pH 8,6; верхний (концентрирующий) буфер (4×) - 50 мМ трис-HCl, 0,4% SDS, pH 6,8; нижний (разделяющий) буфер (4×) - 150 мМ трис-HCl, pH 8,8 0,4% SDS; буфер Лэммли с мочевиной- 25 мМ трис, 192 мМ глицин, pH 8,6, 1% SDS, 7 М мочевина, 50 мМ ДТТ, 0,001% бромфеноловый синий; буфер Лэммли без мочевины- 25 мМ трис, 192 мМ глицин, pH 8,6, 1% SDS, 60% сахароза, 50 мМ ДТТ, 0,001% бромфеноловый синий.

Концентрирование белков в концентрирующем геле проводили при напряжении 80 В, разделение белков по молекулярным массам в разрешающем геле проводят при напряжении 250 В и длине пробега около 5 см.

После проведения электрофореза в ПААГ белки растворимой клеточной фракции штамма-трансформанта переносили на нитроцеллюлозный фильтр в приборе «Mini-Protean 3 Cell» (фирмы Bio-Rad) в течение 1,5 ч и токе 0,8 мА/см при 20°С.После переноса фильтр окрашивали в растворе 1% Понсо красного, растворенного в 10% уксусной кислоте и фиксировали расположение полос молекулярно-весового стандарта и наиболее ярких полос образцов. После этого обесцвечивали фильтр 10 кратным промыванием в деионизованной воде и помещали в 25 мл раствора 0,1%-ного сывороточного альбумина быка (BSA) в буфере PBS для блокирования неспецифического связывания. Блокирование проводили в течение 4-20 часов при 20°С, затем отмывали в буфере PTBS (5 раз по 25 мл), после чего инкубировали в растворе PBS, содержащем 1 мкг/мл аффинно очищенных антител лошади, трехкратно гипериммунизированной живой противосибиреязвенной вакциной (ФКП Орловская биофабрика) в течение 2 часов при 20°С и слабом качании. Разведение исходного раствора антител составляло 1:20 000. Фильтр трехкратно тщательно отмывали в буфере PBST объемом 20 мл. После отмывки фильтр инкубировали в растворе PBS, содержащем конъюгат стафилококкового белка А с пероксидазой хрена (ЗАО «Иннотех-21», Москва) в разведении 1: 10 000 в течение 2 часов при 20°С и слабом качании. Фильтр трехкратно тщательно отмывали в буфере PBST объемом 20 мл и прокрашивали в растворе 0,065% H₂O₂ в присутствии хромофорного субстрата пероксидазы (N,N’-диаминобензидин), в течение 5-10 минут до появления окрашенных полос.Затем реакцию останавливали инкубацией фильтра в 10% серной кислоте и ополаскивали водой.

Фиксация результатов определения проводилась в форме титра путем выявления последнего разведения, реагирующего с антителами в блоттинге. Поскольку нанесенные на дорожки геля количества материала соответствуют 1, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг общего белка в растворимой клеточной фракции, а чувствительность использованных аффинно очищенных антител лошади, трехкратно гипериммунизированной живой противосибиреязвенной вакциной (ФКП Орловская биофабрика) согласно спецификации производителя составляет 50 пг в точке, содержание рекомбинантного белка – слитого протективного антигена B. anthracis в биомассе E.coli оценивалось с помощью таблицы 2.

Таблица 2 - Расчет доли продукта конструкции pGEM-TTPPAG от общего растворимого белка в клеточном лизате (%) методом предельных разведений в иммуноблоттинге.

Результаты работ по подбору условий культивирования представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Выход продукта конструкции pGEM-TTPPAG при культивировании рекомбинантного штамма E.coli BL21(DE3) в различных условиях.

Температура ферментации 30°С

Температура ферментации 37°С

Представленные результаты оптимизации условий культивирования штамма-трансформанта BL21(DE3), несущего конструкцию pGEM-TTPPAG, с целью повышения выхода целевого белка-антигена в форме наночастиц (а не телец включения) позволили предложить условия, обеспечивающие максимальный выход: культивирование при 30°С в течение 16 часов на среде LB состава (г/л): протеозный пептон (Difco) – 10, дрожжевой экстракт (Difco) – 5, NaCl – 10, без добавления индуктора. Причина снижения выхода растворимого антигена при добавлении индуктора, по-видимому, заключается в его ускоренном накоплении в виде аморфных агрегатов вместо растворимой нативной формы.

4. Очистка фракции ВПЧ комбинацией низкоскоростного и высокоскоростного центрифугирования

Клетки штаммов-трансформантов BL21(DE3), несущих конструкции pGEM-TTPPAG и pGEM3z, осаждали центрифугированием (10 тыс.g на центрифуге Allegra X-22R) из объема среды 200 мл и ресуспендировали в 15 мл холодного буфера А (20 мМ Tрис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂). К суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 0,03 мг/мл и инкубировали 30 мин в ледяной бане. После инкубации с лизоцимом добавляли равное количество буфера А, содержащего 2% TX-100 и инкубировали еще 20 мин. Гомогенизацию проводили на ультразвуковом дезинтеграторе MSE Soniprep 150 Plus Ultrasonic Disintegrator 3 раза по 30 сек при выходной мощности 100 Вт, между обработками делали паузы по 1 мин для охлаждения, вся процедура осуществлялась при охлаждении пробирки с образцом в ледяной бане.

Полученный гомогенат фракционировали с помощью двухступенчатого центрифугирования по следующей схеме:

• Низкоскоростное центрифугирование: лизат разделяли на настольной центрифуге путем центрифугирования при 10 тыс.g в течение 15 мин на центрифуге Allegra X-22R;

• Ультрацентрифугирование: супернатант, полученный после низкоскоростного центрифугирования, фракционировали при 100 тыс.g в течение 1 часа на ультрацентрифуге Avanti J-301 в роторе JS2438.

Осадки после низкоскоростного центрифугирования и ультрацентрифугирования ресуспендировали в 30 мкл буфера А с 1% TX-100. Для анализа белкового состава фракций, каждая из которых имела объем 30 мл, после тщательной гомогенизации на ручном вортексе отбирали аликвоты по 100 мкл и осаждали добавлением 100 мкл ацетона. Осаждение, денатурацию и разделение в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле проводили, как описано в разделе 3 главы «Осуществление изобретения». Гель окрашивали в 1% растворе Кумасси R-250 в 10% водной уксусной кислоте с последующим обесцвечиванием в горячей уксусной кислоте. Результаты представлены на Фиг.2.

Полусухой перенос разделенных в 12,5% денатурирующем полиакриламидном геле белков фракций на нитроцеллюлозную мембрану с окрашиванием аффинно очищенными антителами лошади, трехкратно гипериммунизированной живой противосибиреязвенной вакциной (ФКП Орловская биофабрика), проводили, как описано в разделе как описано в разделе 3 главы «Осуществление изобретения». Результаты представлены на Фиг.3.

5. Оценка гомогенности и размера ВПЧ, содержащих РА B. anthracis, с применением методов динамического светорассеяния и атомно-силовой микроскопии

Основной характеристикой препаратов наночастиц является морфологическая гомогенность, которая может быть оценена с помощью методов динамического светорассеяния (ДСР) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).

К преимуществам метода ДСР можно отнести высокую чувствительность и количественность оценки размеров частиц. К недостаткам относится невозможность наблюдать за формой частиц, что особенно важно при работе частицами, склонными к формированию вторичных агломератов. Кроме того, особенностью ДСР является резкое повышение чувствительности детекции с ростом размера частиц. Из-за этого метод не способен выявлять мелкие частицы в присутствии крупных.

Метод АСМ позволяет наблюдать за морфологией частиц и одинаково чувствительный к частицам любого размера. Однако, АСМ дает преимущественно качественную характеристику содержанию частиц в препарате.

При подготовке препаратов наночастиц лизатов E.coli BL21(DE3, pGEM3z) и BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) для ДСР и АСМ, представляющих собой фракцию осадка после ультрацентрифугирования, суспендированную в буфере А, проводили нормировку нагрузки клеточного материала по общему белку: для изготовления одного препарата использовали 0,1 мкг общего белка фракции лизата.

5.1. Динамическое светорассеяние

Измерение размера наночастиц в анализируемых образцах осуществлялось методом динамического светорассеяния на приборе Nano-ZS (Malvern instruments, UK). Для изучения размеров частиц в анализируемых образцах был выбран угол рассеяния 173°. В качестве отрицательного контроля использовался образец, полученный при трансформации Е. coli BL21 вектором pGEM3z. Результаты анализа представлены на Фиг.4. Они свидетельствуют о том, что в образце фракции наночастиц лизата BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) наблюдается фракция монодисперсных частиц с модальным размером 225,4 нм (Z-Averege=290 нм). Эти данные согласуются с ожидаемым размером вирусоподобных частиц, описанных в литературе.

Во фракции наночастиц отрицательного контроля - лизата BL21(DE3, pGEM3z) также наблюдалось наличие наночастиц. Однако интенсивность ДСР этими частицами составляла только 4,8% от сигнала ДСР (несмотря на выровненное количество общего белка в препарате), а размер частиц отличался неоднородностью (большая величина дисперсии). 98% частиц отрицательного образца попадала в диапазон от 50 до 150 нм.

5.2. Атомно-силовая микроскопия

Для проведения исследования использовали 10 мкл выровненных по содержанию общего белка препаратов фракций лизатов BL21(DE3, pGEM3z) и BL21(DE3, pGEM-TTPPAG), суспендированных в буфере. Для изготовления одного препарата использовали 0,1 мкг общего белка. Образец наносили на свежий скол слюды (SPI supplies grade V-1, свежий скол осуществлялся путем приклеивания и отрыва полосы скотча с поверхности слюды), помещали в спинкоатер (Chemat KW-4A) и проводили центрифугирование в течение 5 секунд при скорости вращения 1000 об/мин, затем еще 60 секунд при 3000 об/мин с целью обеспечения гомогенности покрытия на подложке. Подложку высушивали в течение ночи на воздухе, при комнатной температуре. Сканирование проводили через 12-20 часов после приготовления образцов.

Измерения проводились на микроскопе Veeco Multimode 8 с контроллером Nanoscope V (Veeco, США) в режиме PeakForce Tapping QNM. В качестве зондов использовали кантилеверы из нитрида кремния SNL-10A (номинальная силовая константа 0,35 Н/м, резонансная частота – 65 кГц) с кремниевой иглой. Сканирование проводили на воздухе при комнатной температуре.

PeakForce Tapping QNM представляет собой нерезонансный режим сканирования. При сканировании в каждой точке снимали силовую кривую с частотой 2 кГц, что позволяет получить информацию не только о рельефе образца, но и о его локальных механических свойствах: модуле упругости (DMT модуль), силе адгезии между зондом и образцом, уровне деформации образца при сканировании.

При сравнении фракций наночастиц лизатов BL21(DE3, pGEM3z) и BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) методом АСМ в основном подтвердились данные ДСР. Наиболее крупные частицы во фракции лизата BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) (Фиг.5А) имеют размер ~250 нм, а лизата BL21(DE3, pGEM3z) –<75 нм (Фиг.5Б). На картах модуля упругости видно, что крупные частицы лизата BL21(DE3, pGEM-TTPPAG) имеют жесткое ядро (иногда два ядра на частицу), окруженное менее упругой периферией. В частицах образца pGEM внутренней негомогенности не выявляется. Однако, этот вывод нельзя считать достоверным, так как эти частицы имеют малый размер, не позволяющий визуально наблюдать в их составе дискреты. Частицы лизата BL21(DE3, pGEM3z) склонны образовывать агломераты, что может приводить к существенному завышению их размера методом ДСР.

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E. coli, являющегося продуцентом антигена возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis. Представленный штамм получен на основе протективного антигена Bacillus anthracis путем введения в штамм E. coli BL21 (DE3) плазмиды pGEM-TTPPAG. Плазмида pGEM-TTPPAG содержит в своем составе промотор фага Т7, который контролирует экспрессию слитого гена, представляющего собой полноразмерный ген ТТP бактериофага DT57C (кодирует белок трубки хвоста pb6), слитый через 3’-конец с геном протективного антигена B. anthracis, и экспрессирующегося в форме вирусоподобных частиц. Изобретение обеспечивает выход целевого продукта в оптимальных условиях культивирования не ниже 1 г/л культуры, а также позволяет получить основной защитный антиген возбудителя сибирской язвы B. anthracis в форме вирусоподобных частиц (ВПЧ), имеющих размер 225,4 нм, что облегчает его очистку и потенциально повышает иммуногенность. Полученные ВПЧ, свободные от растворимого клеточного белка, могут использоваться в качестве антигена для иммунизации. 5 ил., 3 табл.

Формула