Способ извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона или жидких отходов ферментации и её повторного применения - RU2748950C1

Чертежи

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона или его жидких отходов и к способу повторного применения извлеченной фосфорной кислоты в процессе ферментации.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В некоторых случаях фосфорная кислота требуется в значительном количестве для производства целевого соединения путем ферментации. Например, в публикации международной патентной заявки WO 2014/182125 раскрыто, что источник фосфорной кислоты можно обеспечить для ферментации О-фосфосерина, который является прекурсором, используемым для производства L-цистеина. Кроме того, в публикации международной патентной заявки WO 2014/064244 раскрыт способ получения метионина из О-фосфогомосерина при использовании сульфида и превращающего фермента. Основываясь на этом, можно подтвердить, что фосфат важен в качестве источника фосфора при продуцировании О-фосфогомосерина посредством ферментации, который является прекурсором метионина. Таким образом, существует необходимость разработать способ извлечения остаточной фосфорной кислоты из ферментационного бульона или его жидких отходов, содержащих большое количество фосфата, и повторного применения извлеченной фосфорной кислоты в качестве источника фосфора.

Обычные способы извлечения фосфорной кислоты, как правило, проводят путем выделения фосфорной кислоты из содержащих фосфорную кислоту горных пород путем экстракции органическим растворителем и извлечения фосфорной кислоты путем процесса нейтрализации с помощью соли кальция, соли аммония, соли калия, соли натрия или тому подобного (US 3375068, US 3466141A, US 4543239, ЕР 0087323 А1, US 7687046 и US 8658117). Однако способ экстракции органическим растворителем является экономически неэффективным, поскольку технологические затраты при использовании растворителя увеличиваются, при этом он сложен, так как дополнительно нужно проводить процедуру извлечения растворителя. Кроме того, доступный органический растворитель даже в небольшом количестве может действовать как токсин в процессе ферментации, и, таким образом, трудно применять органический растворитель для процесса ферментации. Между тем, способ извлечения или производства фосфорной кислоты из жидких отходов процесса ферментации, а не из содержащих фосфорную кислоту горных пород способом без использования органического растворителя еще не описан в патентных или других ссылочных документах.

ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования по разработке способа извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона или жидких отходов ферментации, и в результате обнаружили, что фосфат можно извлекать из ферментационного бульона или жидких отходов ферментации без применения органического растворителя, а при повторном применении извлеченного фосфата в процессе ферментации продукт ферментации можно получить в количестве, аналогичном количеству, которое получают при использовании чистой фосфорной кислоты, завершив тем самым настоящее изобретение.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона или жидких отходов ферментации и ее повторного применения.

Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона О-фосфосерина (OPS) или жидких отходов ферментации, в котором удаляют цистеин или его производное, и ее повторного применения.

Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона О-фосфогомосерина (OPHS) или жидких отходов ферментации, в котором удаляют метионин или его производное, и ее повторного применения.

Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ извлечения фосфорной кислоты из жидких отходов ферментации, содержащих фосфорную кислоту.

ТЕХНИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В случае, когда фосфорную кислоту извлекают из процесса ферментации, а не из материалов горных пород, способ извлечения фосфорной кислоты способом, отличающимся от способа экстракции органическим растворителем, и повторного применения извлеченной фосфорной кислоты в процессе ферментации впервые был раскрыт в настоящем изобретении. Согласно способу извлечения фосфорной кислоты из ферментационной среды и ее повторного применения по настоящему изобретению фосфорную кислоту можно извлекать из ферментационного бульона или жидких отходов ферментации без использования органического растворителя и повторно применять в процессе ферментации. Следовательно, проблемы, вызванные применением органического растворителя, такие как его действие в качестве токсина в процессе ферментации, дополнительные затраты, связанные с использованием растворителя, и усложнение процесса из-за добавления процесса извлечения растворителя, можно преодолеть и, таким образом, способ согласно настоящему изобретению можно эффективно использовать в процессе ферментации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 представлена краткая схема способа извлечения фосфата из ферментационного бульона или жидких отходов ферментации, содержащих фосфорную кислоту.

На Фиг. 2 представлена краткая схема способа извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона, который получен посредством реакции ферментативного превращения в ферментационном бульоне О-фосфосерина (OPS) или О-фосфогомосерина (OPHS), или из жидких отходов ферментации, которые были получены путем удаления цистеина, производного цистеина, метионина или производного метионина из ферментационного бульона, и повторного применения извлеченной фосфорной кислоты в процессе ферментации О-фосфосерина или О-фосфогомосерина.

На Фиг. 3 представлена краткая схема способа извлечения фосфорной кислоты посредством двухстадийного способа из ферментационного бульона, который был получен посредством реакции ферментативного превращения в ферментационном бульоне О-фосфосерина (OPS) или О-фосфогомосерина (OPHS), или из жидких отходов ферментации, которые были получены путем удаления цистеина, производного цистеина, метионина или производного метионина из ферментационного бульона, и повторного применения извлеченной фосфорной кислоты в процессе ферментации О-фосфосерина или О-фосфогомосерина.

НАИЛУЧШЕЕ ВОПЛОЩЕНИЕ

Для достижения целей настоящего изобретения в одном аспекте настоящего изобретения предложен способ извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона или жидких отходов ферментации и повторного применения извлеченной фосфорной кислоты, включающий:

(a) концентрирование ферментационного бульона или жидких отходов ферментации, содержащих фосфорную кислоту (стадия концентрирования);

(b) регулирование рН концентрата в диапазоне от 8 до 11 (стадия регулирования рН);

(c) кристаллизацию фосфата в концентрате, имеющем отрегулированный рН, и выделение кристаллизованного фосфата из маточного раствора (стадия кристаллизации); и

(d) применение кристаллизованного фосфата в ферментационной среде в качестве источника фосфорной кислоты (стадия повторного применения).

В настоящем изобретении ферментационный бульон на стадии (а) (стадии концентрирования) может относиться к среде, полученной путем культивирования микроорганизма, который продуцирует продукт ферментации в среде, содержащей фосфорную кислоту; культуре, содержащей микроорганизм, культивируемый с помощью среды, или его раствору для ферментативного превращения.

Тип «продукта ферментации» не ограничивают, если ферментационный бульон содержит фосфорную кислоту, но в частности может представлять собой целевое вещество, его производное или прекурсор, которые образуются путем ферментации. Кроме того, целевое соединение может представлять собой аминокислоту, такую как цистеин или метионин, не ограничиваясь указанным. Кроме того, производное целевого соединения может представлять собой производное аминокислоты, в частности, производное цистеина или метионина. Более конкретно, производное цистеина может включать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из N-ацетилцистеин, цистина, комплекса цистеина с металлом (например, комплекса цистеина с цинком, комплекса цистеина с марганцем, комплекса цистеина с железом, комплекса цистеина с медью и комплекса цистеина с магнием) и соли цистеина (например, цистеина гидрохлорида), не ограничиваясь указанным. Производное метионина может включать по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из N-ацетил метионина, комплекса метионина с металлом (например, комплекса метионина с цинком, комплекса метионина с марганцем, комплекса метионина с железом, комплекса метионина с медью и комплекса метионина с магнием) и соли метионина, не ограничиваясь указанным. Кроме того, прекурсор целевого соединения может представлять собой прекурсор аминокислоты, в частности, прекурсор цистеина или метионина. Более конкретно, прекурсор может представлять собой О-фосфосерин (OPS) или О-фосфогомосерин (OPHS), не ограничиваясь указанным.

Помимо этого, «ферментационный бульон» может включать (а) ферментационный бульон целевого соединения или прекурсора или его производного, содержащий фосфорную кислоту, (b) ферментационный бульон, содержащий целевое соединение или его производные, полученные с помощью штамма, продуцирующего прекурсор целевого соединения, субстрат и превращающий фермент; и фосфорную кислоту, или (с) ферментационный бульон, содержащий целевое соединение или его производные, продуцируемые путем добавления превращающего фермента или микроорганизма, выделяющего превращающий фермент; и субстрат для ферментационного бульона прекурсора целевого соединения; и фосфорную кислоту, не ограничиваясь указанным.

Более конкретно, ферментационный бульон может представлять собой (i) ферментационный бульон О-фосфосерина, содержащий фосфорную кислоту, (ii) ферментационный бульон О-фосфогомосерина, содержащий фосфорную кислоту, или (iii) ферментационный бульон, содержащий аминокислоту или ее производные, полученные путем добавления превращающего фермента или выделяющего ее микроорганизма, сульфида для ферментационного бульона и фосфорную кислоту. Кроме того, ферментационный бульон (iii) может в частности представлять собой ферментационный бульон, содержащий цистеин или его производные, полученные путем добавления О-фосфосерин-сульфгидрилазы (OPSS) или выделяющего ее микроорганизма, сульфида для ферментационного бульона О-фосфосерина и фосфорную кислоту. Кроме того, ферментационный бульон (iii) может представлять собой ферментационный бульон, содержащий метионин или его производные, полученный путем добавления О-фосфогомосерин-зависимой (OPHS-зависимой) метионинсинтазы или выделяющего ее микроорганизма, сульфида для ферментационного бульона О-фосфогомосерина и фосфорную кислоту.

В данной заявке термин «жидкие отходы ферментации» может представлять собой раствор, полученный путем частичного или полного выделения и удаления продукта ферментации из ферментационного бульона, не ограничиваясь указанным. В частности, жидкие отходы ферментации могут представлять собой раствор, полученный путем частичного или полного выделения и удаления аминокислоты или ее производных или прекурсоров из ферментационного бульона, содержащего аминокислоту или ее производные или прекурсоры и фосфорную кислоту, не ограничиваясь указанным. Например, жидкие отходы ферментации могут представлять собой раствор, полученный путем частичного или полного выделения и удаления аминокислоты или ее производных из ферментационного бульона, содержащего аминокислоту и ее производные и фосфорную кислоту, или раствор, полученный путем частичного или полного выделения и удаления аминокислоты или ее производных из ферментационного бульона, содержащего аминокислоту или ее производные, полученные путем добавления субстрата и превращающего фермента или микроорганизма, продуцирующего превращающий фермент, в ферментационный бульон прекурсора аминокислоты, и фосфорную кислоту. Более конкретно, жидкие отходы ферментации могут представлять собой раствор, полученный путем частичного или полного выделения и удаления цистеина или его производных, полученных путем добавления О-фосфосерин-сульфгидрилазы (OPSS) или выделяющего ее микроорганизма, и сульфида в ферментационный бульон О-фосфосерина, из ферментационного бульона, содержащего цистеин или его производные, и фосфорную кислоту, или раствор, полученный путем частичного или полного выделения и удаления метионина или его производных, полученных путем добавления OPHS-зависимой метионинсинтазы или выделяющего ее микроорганизма, и сульфида в ферментационный бульон О-фосфогомосерина, из ферментационного бульона, содержащего метионин или его производные, и фосфорную кислоту, не ограничиваясь указанным.

В данной заявке «концентрирование» на стадии концентрирования можно осуществить любым способом без ограничения, пока концентрация фосфат-ионов, содержащихся в ферментационном бульоне или жидких отходах ферментации, увеличивается с помощью этого способа. В частности, концентрирование может быть осуществлено путем выпаривания, нагревания, декомпрессии, продувки, вымораживания или тому подобного, не ограничиваясь указанным.

В настоящем описании концентрирование осуществляют для увеличения степени извлечения фосфорной кислоты, и ферментационный бульон или жидкие отходы ферментации можно концентрировать на стадии концентрирования, так что концентрация фосфат-ионов, содержащихся в концентрате, имеющем отрегулированный рН, может составлять 60 г/л или более или 70 г/л или более, и более конкретно, находиться в диапазоне от 60 г/л до 300 г/л или от 70 г/л до 250 г/л, не ограничиваясь указанным.

Кроме того, в настоящем описании, перед стадией концентрирования может быть отрегулирован рН ферментационного бульона или жидких отходов ферментации. В частности, рН ферментационного бульона или жидких отходов ферментации может быть отрегулирован до 7 или более, 7,5 или более, 8 или более, 8,5 или более или 9 или более, более конкретно, в диапазоне от 8 до 11. Путем регулирования рН перед стадией концентрирования можно снизить количество примесей иона аммония, содержащихся в извлеченном фосфате.

В настоящем описании стадия (b) (стадия регулирования рН) является стадией регулирования рН концентрата перед кристаллизацией фосфата. рН концентрата не ограничивают, пока фосфат кристаллизуется при этом рН, но может быть отрегулирован от нейтрального уровня до щелочного уровня, в частности, до 7 или более, 7,5 или более, 8 или более, 8,5 или более или 9 или более, более конкретно, в диапазоне от 8 до 11.

Кроме того, в настоящем описании стадия регулирования рН может быть осуществлена путем добавления в концентрат щелочного вещества, в частности гидроксида. В частности, гидроксид может представлять собой гидроксид натрия или водный раствор гидроксида натрия, не ограничиваясь указанным.

В настоящем описании стадия (с) (стадия кристаллизации) является стадией извлечения фосфата из концентрата, имеющего отрегулированный рН, который получают на стадии регулирования рН. В настоящем описании извлечение фосфата осуществляют путем кристаллизации фосфата в концентрате, имеющем отрегулированный рН, и выделения образовавшихся кристаллов из маточного раствора без использования органического растворителя.

Для кристаллизации фосфата можно регулировать температуру и/или можно добавлять туда зародыш кристалла, не ограничиваясь указанным. В частности, для кристаллизации фосфата стадию охлаждения концентрата, имеющего отрегулированный рН, можно также проводить между стадией регулирования рН и стадией кристаллизации; или на стадии кристаллизации. Более конкретно, концентрат, имеющий отрегулированный рН, можно оставить при стоянии при комнатной температуре, концентрат, имеющий отрегулированный рН, можно охладить перед стадией кристаллизации, или концентрат, имеющий отрегулированный рН, можно охладить на стадии кристаллизации, не ограничиваясь указанным. Вместе с тем, хотя на степень извлечения фосфорной кислоты можно воздействовать путем температуры охлаждения, температуру охлаждения не ограничивают, пока образуются кристаллы фосфата. В частности, температура охлаждения может составлять 50°С или менее, в частности находиться в диапазоне от 0°С до 30°С, более конкретно в диапазоне от 10°С до 20°С, не ограничиваясь указанным.

Кроме того, в частности, для кристаллизации фосфата, стадию добавления кристаллов фосфата в качестве зародышей кристаллов можно также проводить между стадией регулирования рН и стадией кристаллизации или на стадии кристаллизации, не ограничиваясь указанным.

В данной заявке термин «фосфат» может относиться к соли фосфорной кислоты или ее гидрату, однако тип соли этим не ограничивают, пока фосфорная кислота может быть извлечена путем кристаллизации. В частности, фосфат может включать по меньшей мере одно вещество, выбранное из фосфата тринатрия, гидрофосфата динатрия, дигидрофосфата натрия и его гидратов, более конкретно, гидрофосфата динатрия или его гидратов, не ограничиваясь указанным. Число молекул воды, связанных в гидрате, не ограничивают, пока гидрат фосфата кристаллизуется, но может составлять, в частности, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 или более. Кроме того, гидрат может представлять собой, в частности, гептагидрат гидрофосфата динатрия или додекагидрат гидрофосфата динатрия, не ограничиваясь указанным.

В настоящем описании понятия фосфорной кислоты и фосфата могут использоваться взаимозаменяемо.

В настоящем описании любой способ, обеспечивающий отделение твердого вещества от жидкости, можно без ограничения применять для отделения образовавшихся кристаллов фосфата, в частности, можно применять центрифугу, фильтр-пресс, фильтр сжатия, роторный вакуумный фильтр, мембранный сепаратор или тому подобное, не ограничиваясь указанным.

В настоящем описании маточный раствор относится к раствору, полученному путем выделения и удаления образовавшихся кристаллов фосфата из концентрата, имеющего отрегулированный рН, и может содержать некристаллизовавшиеся фосфат-ионы, не ограничиваясь указанным.

Для повышения степени извлечения фосфорной кислоты способ согласно настоящему изобретению может дополнительно включать вторую стадию кристаллизации перекристаллизованного фосфата из маточного раствора. Согласно настоящему изобретению, высокую степень извлечения фосфорной кислоты можно получить путем добавления кристаллов фосфата, полученных на второй стадии кристаллизации (второго извлеченного фосфата), в кристаллы фосфата, полученные на предыдущей стадии кристаллизации (первого извлеченного фосфата). В частности, вторая стадия кристаллизации может включать (i) концентрирование маточного раствора (стадия повторного концентрирования), (ii) регулирование рН маточного раствора (стадия повторного регулирования рН) и (iii) кристаллизацию фосфата в маточном растворе, имеющем отрегулированный рН, и выделение из него кристаллизованного фосфата (стадия повторной кристаллизации). Стадии (i)-(iii) можно осуществить тем же способом, что и описанные выше стадия концентрирования, стадия регулирования рН и стадия кристаллизации. В частности, рН маточного раствора можно отрегулировать до 7 или более, 7,5 или более, 8 или более, 8,5 или более или 9 или более, более конкретно, в диапазоне от 8 до 11.

Кроме того, в частности, вторая стадия кристаллизации может также включать добавление кристаллов фосфата, в качестве зародышей кристаллов, в маточный раствор, например, между стадией повторного регулирования рН и стадией повторной кристаллизации или на стадии повторной кристаллизации, не ограничиваясь указанным.

Кроме того, согласно настоящему изобретению стадию кристаллизации можно осуществлять более двух раз для повышения степени извлечения фосфорной кислоты.

Способ по настоящему изобретению может также включать добавление спирта на стадии регулирования рН или между стадией регулирования рН и стадией кристаллизации. Из-за низкой растворимости фосфата в спирте, спирт, когда его смешивают с раствором фосфата, понижает растворимость фосфата в растворе, повышая тем самым степень извлечения фосфорной кислоты. Спирт не ограничивают, пока степень извлечения фосфорной кислоты увеличивается с его помощью, при этом он может представлять собой метанол, этанол, пропанол, бутанол или их комбинацию.

В настоящем описании стадия (d) (стадия повторного применения) является стадией применения кристаллов фосфата, извлеченных со стадии кристаллизации, в качестве источника фосфорной кислоты и/или фосфора в различных ферментационных средах, в которых необходим источник фосфорной кислоты и/или фосфора. Среда ферментации согласно настоящему изобретению не ограничивается, пока эту среду используют в процессе ферментации, для которой необходим источник фосфорной кислоты и/или фосфора, но может в частности представлять собой, ферментационную среду, применяемую при продуцировании О-фосфосерина или О-фосфогомосерина.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона или жидких отходов ферментации и повторного применения извлеченной фосфорной кислоты, включающий:

(а) продуцирование О-фосфосерина (OPS) с помощью микроорганизма в ферментационной среде, содержащей фосфорную кислоту (стадия OPS ферментации);

(b) получение ферментационного бульона цистеина или его производного путем взаимодействия О-фосфосерина, продуцированного на стадии (а), с сульфидом в присутствии О-фосфосерин-сульфгидрилазы (OPSS) или микроорганизма, выделяющего OPSS (стадия превращения);

(c) концентрирование ферментационного бульона или жидких отходов ферментации, полученных путем удаления цистеина или его производных из ферментационного бульона (стадия концентрирования);

(d) регулирование рН концентрата в диапазоне от 8 до 11 (стадия регулирования pН);

(e) кристаллизацию фосфата из концентрата, имеющего отрегулированный рН, и выделение кристаллизованного фосфата из маточного раствора (стадия кристаллизации); и

(f) применение кристаллизованного фосфата в ферментационной среде в качестве источника фосфорной кислоты (стадия повторного применения).

В настоящем описании, стадия (а) (стадия OPS ферментации) представляет собой стадию продуцирования О-фосфосерина при использовании ферментационной среды, содержащей фосфорную кислоту и микроорганизм. О-фосфосерин является сложным эфиром серина и фосфорной кислоты, поэтому фосфорная кислота необходима при продуцировании О-фосфосерина. Кроме того, микроорганизм может представлять собой любой известный микроорганизм, способный продуцировать О-фосфосерин, примерами такого микроорганизма могут быть, не ограничиваясь указанным, микроорганизмы, имеющие повышенную активность в отношении выделения О-фосфосерина (публикации международных патентных заявок № WO 2014/182125 и WO 2014/182119). Кроме того, примерами микроорганизмов, имеющих высокую способность в отношении продуцирования О-фосфосерина, может быть микроорганизм, имеющий пониженную активность в отношении эндогенной фосфосерин-фосфатазы (SerB) и/или повышенную активность в отношении фосфоглицерат-дегидрогеназы (SerA) и/или фосфосерин-аминотрансферазы (SerC) (публикация международной патентной заявки №WO 2012/053794), не ограничиваясь указанным.

В настоящем описании стадия (b) (стадия превращения) является стадией превращения О-фосфосерина, полученного на стадии OPS ферментации, в цистеин или его производные путем взаимодействия О-фосфосерина с сульфидом в условиях каталитического действия О-фосфосерин-сульфгидрилазы.

В настоящем описании реакцию превращения можно также осуществлять при использовании микроорганизма, выделяющего О-фосфосерин-сульфгидрилазу, а также фермента. Фермент и микроорганизм, выделяющий фермент, можно получить с помощью любого средства и способа, которые известны в уровне техники. В частности, фермент, О-фосфосерин-сульфгидрилаза, может быть любым известным ферментом, раскрытым в публикациях международных патентных заявок № WO 2013/089478, WO 2012/053794 и WO 2012/053777, не ограничиваясь указанными.

Кроме того, в настоящем описании сульфид не ограничивают, пока такой сульфид реагирует с О-фосфосерином в условиях каталитического действия О-фосфосерин-сульфгидрилазы, но может представлять собой по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из CH₃SH, Na₂S, NaSH, (NH₄)₂S, H₂S и Na₂S₂O₃.

В настоящем описании стадии (с)-(е) являются такими же, как описанные выше стадия концентрирования, стадия регулирования рН и стадия кристаллизации.

В настоящем описании стадия (f) (стадия повторного применения) представляет собой стадию использования кристаллов фосфата, извлеченных со стадии кристаллизации, в ферментационной среде, в которой необходим источник фосфорной кислоты и/или фосфора, в качестве источника фосфорной кислоты и/или фосфора. В частности, ферментационная среда может представлять собой любую ферментационную среду, используемую для продуцирования О-фосфосерина, не ограничиваясь указанным.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона или жидких отходов ферментации и повторного применения извлеченной фосфорной кислоты, включающий:

(a) продуцирование О-фосфогомосерина (OPHS) при использовании микроорганизма в ферментационной среде, содержащей фосфорную кислоту (стадия OPHS ферментации);

(b) получение ферментационного бульона метионина или его производного путем взаимодействия О-фосфогомосерина, продуцированного на стадии (а), с сульфидом в присутствии О-фосфогомосерин-зависимой метионинсинтазы или микроорганизма, выделяющего О-фосфогомосерин-зависимую метионинсинтазу (стадия превращения);

(c) концентрирование ферментационного бульона или жидких отходов ферментации, полученных путем удаления метионина или его производного из ферментационного бульона (стадия концентрирования);

(d) регулирование рН концентрата в диапазоне от 8 до 11 (стадия регулирования pН);

(e) кристаллизацию фосфата в концентрате, имеющем отрегулированный рН, и выделение кристаллизованного фосфата из маточного раствора (стадия кристаллизации); и

(f) применение кристаллизованного фосфата в качестве источника фосфорной кислоты в ферментационной среде (стадия повторного применения).

В настоящем описании стадия (а) (стадия OPHS ферментации) представляет собой стадию продуцирования О-фосфогомосерина при использовании ферментационной среды, содержащей фосфорную кислоту и микроорганизм. О-фосфогомосерин является сложным эфиром треонина и фосфорной кислоты, поэтому фосфорная кислота необходима для продуцирования О-фосфогомосерин. Кроме того, микроорганизм может представлять собой любой известный микроорганизм, способный продуцировать О-фосфогомосерин.

В настоящем описании стадия (b) (стадия превращения) является стадией превращения О-фосфогомосерина в метионин или его производные путем взаимодействия О-фосфогомосерина, продуцированного со стадии OPHS ферментации, с сульфидом в условиях каталитического действия OPHS-зависимой метионинсинтазы.

В настоящем описании реакцию превращения можно также осуществлять при использовании микроорганизма, выделяющего OPHS-зависимую метионинсинтазу, а также фермента. В частности, фермент и микроорганизм, выделяющий фермент, можно получить с помощью любого средства и способа, которые известны в уровне техники, например, способом, раскрытым в публикации международной патентной заявки № WO 2014/064244, не ограничиваясь указанным.

Кроме того, в настоящем описании, сульфид не ограничивают, пока такой сульфид реагирует с О-фосфогомосерином в условиях каталитического действия OPHS-зависимой метионинсинтазы, но может включать по меньшей мере одно вещество, выбранное из CH₃SH, Na₂S, NaSH, (NH₄)₂S, H₂S и Na₂S₂O₃.

В настоящем описании стадии (с)-(е) являются такими же, как описанные выше стадия концентрирования, стадия регулирования рН и стадия кристаллизации.

В настоящем описании стадия (f) (стадия повторного применения) представляет собой стадию применения кристаллов фосфата, извлеченных со стадии кристаллизации, в ферментационной среде, в которой необходим источник фосфорной кислоты и/или фосфора, в качестве источника фосфорной кислоты и/или фосфора. В частности, ферментационная среда может представлять собой любую ферментационную среду, используемую для продуцирования О-фосфогомосерина, не ограничиваясь указанным.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ извлечения фосфорной кислоты из жидких отходов ферментации.

В частности, способ согласно настоящему изобретению включает:

(a) концентрирование жидких отходов ферментации, содержащих фосфорную кислоту (стадия концентрирования);

(b) регулирование рН концентрата в диапазоне от 8 до 11 (стадия регулирования pН);

(c) кристаллизацию фосфата из концентрата, имеющего отрегулированный рН (стадия кристаллизации) и

(d) выделение кристаллизованного фосфата из маточного раствора (стадия выделения).

В настоящем описании жидкие отходы ферментации являются такими, как описано выше и могут содержать жидкие отходы ферментативного превращения.

В настоящем описании стадии (а)-(с) являются такими же, как описанные выше стадия концентрирования, стадия регулирования рН и стадия кристаллизации.

В настоящем описании способ выделения кристаллов фосфата из маточного раствора стадии (d) (стадии выделения) является таким, как описано выше на стадии кристаллизации.

ВОПЛОЩЕНИЕ ПО НАСТОЯЩЕМУ ИЗОБРЕТЕНИЮ

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры. Однако эти примеры являются иллюстративными и не предназначены для ограничения объема раскрытия настоящего изобретения.

Пример 1. Извлечение фосфорной кислоты при концентрировании жидких отходов ферментации О-фосфосерина

Пример 1-1. Извлечение фосфорной кислоты при использовании жидких отходов ферментации О-фосфосерина

После получения ферментационного бульона О-фосфосерина путем культивирования микроорганизма, способного к продуцированию О-фосфосерина (OPS) в ферментационной среде, содержащей фосфорную кислоту, ферментационный бульон реагировал с сульфидом при использовании О-фосфосерин-сульфгидрилазы (OPSS) с получением ферментационного бульона, содержащего цистеин или цистин (публикация международной патентной заявки № WO 2012/053794). Цистеин или цистин кристаллизовали в ферментационном бульоне и выделяли из него путем отделения твердого вещества от жидкости с получением жидких отходов ферментации.

Жидкие отходы ферментации О-фосфосерина имели следующий состав ионов (г/л): 24,4 ионов натрия, 6,4 ионов аммония, 14,8 ионов хлора, 3,4 сульфат-ионов и 34,3 фосфат-ионов. 1665 мл воды выпаривали из 2000 мл первоначальных жидких отходов и добавляли туда 50% (масс./масс.) водный раствор гидроксида натрия (38,0 мл) до тех пор, пока рН не достигал 9,00. Этот раствор имел концентрацию фосфат-ионов 185,4 г/л. Раствор охлаждали до 15°C с получением гептагидрата гидрофосфата динатрия. Суспензию отфильтровывали с помощью корзиночного фильтра центрифуги и промывали чистой водой.

Масса конечного продукта составляла 159,5 г. Конечный продукт имел следующий состав ионов (г/кг): 124,6 ионов натрия, 5,3 ионов аммония, 5,4 ионов хлора, 4,2 сульфат-ионов и 388,5 фосфат-ионов. Содержание влаги в конечном продукте составляло 45,7% (масс). Суммарная степень извлечения фосфорной кислоты составляла 79,2% (масс).

Пример 1-2. Извлечение фосфорной кислоты при использовании жидких отходов ферментации О-фосфосерина

Жидкие отходы из способа ферментации О-фосфосерина согласно данному примеру имели следующий состав ионов (г/л): 24,7 ионов натрия, 6,3 ионов аммония, 16,4 ионов хлора, 3,9 сульфат-ионов и 35,8 фосфат-ионов. 1555 мл воды выпаривали из 1945 мл первоначальных жидких отходов и добавляли туда 50% (масс/масс.) водный раствор гидроксида натрия (46,5 мл) до тех пор, пока рН не достигал 9,00. Этот раствор имел концентрацию фосфат-ионов 159,7 г/л. Раствор охлаждали до 15°C с получением гептагидрата гидрофосфата динатрия. Суспензию отфильтровывали с помощью корзиночного фильтра центрифуги и промывали чистой водой.

Масса конечного продукта составляла 132,3 г. Конечный продукт имел следующий состав ионов (г/кг): 127,4 ионов натрия, 10,9 ионов аммония, 5,2 ионов хлора, 3,1 сульфат-ионов и 358,6 фосфат-ионов. Содержание влаги в конечном продукте составляло 49,6% (масс). Суммарная степень извлечения фосфорной кислоты составляла 68,0% (масс).

Пример 1-3. Извлечение фосфорной кислоты при использовании жидких отходов ферментации О-фосфосерина

Жидкие отходы из способа ферментации О-фосфосерина согласно данному примеру имели следующий состав ионов (г/л): 24,6 ионов натрия, 6,2 ионов аммония, 16,3 ионов хлора, 3,5 сульфат-ионов и 35,6 фосфат-ионов. 1315 мл воды выпаривали из 1975 мл первоначальных жидких отходов и добавляли туда 50% (масс/масс.) водный раствор гидроксида натрия (43,0 мл) до тех пор, пока рН не достигал 9,01. Этот раствор имел концентрацию фосфат-ионов 99,9 г/л. Раствор охлаждали до 15°C с получением гептагидрата гидрофосфата динатрия. Суспензию отфильтровывали с помощью корзиночного фильтра центрифуги и промывали чистой водой.

Масса конечного продукта составляла 186,0 г. Конечный продукт имел следующий состав ионов (г/кг): 110,7 ионов натрия, 13,5 ионов аммония, 2,4 ионов хлора, 2,8 сульфат-ионов и 264,7 фосфат-ионов. Содержание влаги в конечном продукте составляло 60.8% (масс). Суммарная степень извлечения фосфорной кислоты составляла 70,1% (масс).

Пример 1-4. Извлечение фосфорной кислоты при использовании жидких отходов ферментации О-фосфосерина

Жидкие отходы из способа ферментации О-фосфосерина согласно данному примеру имели следующий состав ионов (г/л): 24,5 ионов натрия, 6,2 ионов аммония, 16,3 ионов хлора, 3,7 сульфат-ионов и 35,6 фосфат-ионов. 980 мл воды выпаривали из 1955 мл первоначальных жидких отходов и добавляли туда 50% (масс/масс) водный раствор гидроксида натрия (42,0 мл) до тех пор, пока рН не достигал 9,04. Этот раствор имел концентрацию фосфат-ионов 68,4 г/л. Раствор охлаждали до 15°C с получением гептагидрата гидрофосфата динатрия. Суспензию отфильтровывали с помощью корзиночного фильтра центрифуги и промывали чистой водой.

Масса конечного продукта составляла 172,9 г. Конечный продукт имел следующий состав ионов (г/кг): 112,8 ионов натрия, 20,2 ионов аммония, 1,2 ионов хлора, 2,6 сульфат-ионов и 255,9 фосфат-ионов. Содержание влаги в конечном продукте составляло 61.9% (масс). Суммарная степень извлечения фосфорной кислоты составляла 63,6% (масс).

Таким образом, было подтверждено, что так как понижается концентрация фосфат-ионов, содержащихся в концентрате, имеющем отрегулированный рН, понижается степень извлечения фосфорной кислоты.

Пример 2. Извлечение фосфорной кислоты в зависимости от температуры охлаждения

Жидкие отходы из способа ферментации О-фосфосерина согласно данному примеру имели следующий состав ионов (г/л): 23,8 ионов натрия, 6,5 ионов аммония, 15,1 ионов хлора, 3,4 сульфат-ионов и 35,0 фосфат-ионов. 1600 мл воды выпаривали из 2000 мл первоначальных жидких отходов (при температуре 50°C или выше) и добавляли туда 50% (масс./масс.) водный раствор гидроксида натрия (39,5 мл) до тех пор, пока рН не достигал 9,00. Этот раствор имел концентрацию фосфат-ионов 159,4 г/л. Экспериментальные условия были аналогичны условиям из Примера 1-2. Раствор охлаждали до 25°C с получением гептагидрата гидрофосфата динатрия. Суспензию отфильтровывали с помощью корзиночного фильтра центрифуги и промывали чистой водой.

Масса конечного продукта составляла 110,6 г. Конечный продукт имел следующий состав ионов (г/кг): 126,8 ионов натрия, 13,8 ионов аммония, 2,7 ионов хлора, 2,2 сульфат-ионов, 393,9 фосфат-ионов. Содержание влаги в конечном продукте составляло 43,9% (масс). Суммарная степень извлечения фосфорной кислоты составила 62,2% (масс). Этот результат показывает, что более низкая температура является предпочтительной для получения более высокой степени извлечения фосфорной кислоты.

Пример 3. Извлечение фосфорной кислоты путем дополнительного регулирования рН перед концентрированием

Жидкие отходы из способа ферментации О-фосфосерина согласно данному примеру имели следующий состав ионов (г/л): 23,4 ионов натрия, 6,4 ионов аммония, 14,9 ионов хлора, 3,5 сульфат-ионов и 34,7 фосфат-ионов. Перед упариванием туда добавляли 50% (масс./масс.) водный раствор гидроксида натрия (39,5 мл) до тех пор, пока рН не достигал 9,02. Затем 1600 мл воды выпаривали из 2000 мл первоначальных жидких отходов. рН раствора после выпаривания составил 7,06, поскольку был упарен аммиак. Следовательно, туда дополнительно добавляли 50% (масс./масс.) водный раствор гидроксида натрия (16,0 мл) до тех пор, пока рН не достигал 9,00. Концентрация фосфат-ионов раствора составляла 152,4 г/л. Условия концентрации были аналогичными условиям в Примере 1-2. Раствор охлаждали до 15°C с получением гептагидрата гидрофосфата динатрия. Суспензию отфильтровывали с помощью корзиночного фильтра центрифуги и промывали чистой водой.

Масса конечного продукта составляла 141,6 г. Конечный продукт имел следующий состав ионов (г/кг): 156,8 ионов натрия, 0,6 ионов аммония, 1,1 ионов хлора, 3,2 сульфат-ионов и 338,8 фосфат-ионов. Содержание влаги в конечном продукте составляло 51,2% (масс). Суммарная степень извлечения фосфорной кислоты составляла 69,1% (масс). Согласно этому способу количество примесей ионов аммония, содержащихся в извлеченном гидрофосфате динатрия, было значительно снижено по сравнению с другими способами.

Пример 4. Извлечение фосфорной кислоты путем добавления метанола

Пример 4-1. Извлечение фосфорной кислоты путем добавления 100 мл метанола

Жидкие отходы на основе способа ферментации О-фосфосерина согласно данному примеру имели следующий состав ионов (г/л): 23,8 ионов натрия, 6,4 ионов аммония, 15,3 ионов хлора, 6,4 сульфат-ионов и 37,1 фосфат-ионов. 1600 мл воды выпаривали из 2000 мл первоначальных жидких отходов. Затем туда добавляли 50% (масс./масс.) водный раствор гидроксида натрия (48,0 мл) до тех пор, пока рН не достигал 9,07 и добавляли туда 100 мл метанола. Этот раствор имел концентрацию фосфат-ионов 135,2 г/л. Раствор охлаждали до 15°C с получением гептагидрата гидрофосфата динатрия. Суспензию отфильтровывали с помощью корзиночного фильтра центрифуги и промывали чистой водой.

Масса конечного продукта составляла 182,7 г. Конечный продукт имел следующий состав ионов (г/кг): 135,5 ионов натрия, 24,9 ионов аммония, 13,1 ионов хлора, 2,2 сульфат-ионов и 328,5 фосфат-ионов. Содержание влаги в конечном продукте составляло 49,6% (масс). Суммарная степень извлечения фосфорной кислоты составляла 81,0% (масс).

Пример 4-2. Извлечение фосфорной кислоты путем добавления 200 мл метанола

Жидкие отходы из способа ферментации О-фосфосерина согласно данному примеру имели следующий состав ионов (г/л): 23,9 ионов натрия, 6,4 ионов аммония, 15,3 ионов хлора, 3,9 сульфат-ионов и 37,3 фосфат-ионов. 1600 мл воды выпаривали из 2000 мл первоначальных жидких отходов. Затем туда добавляли 50% (масс./масс.) водный раствор гидроксида натрия (47,0 мл) до тех пор, пока рН не достигал 9,04 и добавляли туда 200 мл метанола. Этот раствор имел концентрацию фосфат-ионов 115,2 г/л. Раствор охлаждали до 15°C с получением гептагидрата гидрофосфата динатрия. Суспензию отфильтровывали с помощью корзиночного фильтра центрифуги и промывали чистой водой.

Масса конечного продукта составляла 182,0 г. Конечный продукт имел следующий состав ионов (г/кг): 122,9 ионов натрия, 38,9 ионов аммония, 15,9 ионов хлора, 2,4 сульфат-ионов и 328,2 фосфат-ионов. Содержание влаги в конечном продукте составляло 46,6% (масс). Суммарная степень извлечения фосфорной кислоты составляла 80,2% (масс).

Таким образом, было подтверждено, что степень извлечения фосфорной кислоты повышалась при добавлении метанола после регулирования рН или на стадии регулирования рН.

Пример 5. Извлечение фосфорной кислоты путем двухстадийной кристаллизации

На основании публикации международной патентной заявки № WO 2014/182125, были проведены ферментация О-фосфосерина и реакция ферментативного превращения L-цистеина. По окончании этих процессов, ионный состав жидких отходов из этого способа был следующим (г/л): 21,7 ионов натрия, 4,4 ионов аммония, 16,0 ионов хлора, 30,1 сульфат-ионов и 30,3 фосфат-ионов. 16,7 л воды выпаривали из 20 л первоначальных жидких отходов, добавляли туда 50% (масс/масс.) водный раствор гидроксида натрия (0,4 л) до тех пор, пока рН не достигал 9,00. Этот раствор имел концентрацию фосфат-ионов 162,1 г/л. Раствор охлаждали до 15°C с получением гептагидрата гидрофосфата динатрия. Суспензию гептагидрата гидрофосфата динатрия отфильтровывали с помощью корзиночного фильтра центрифуги и промывали чистой водой. Масса извлеченного гептагидрата гидрофосфата динатрия составляла 1339,0 г. Продукт имел следующий состав ионов (г/кг): 133,5 ионов натрия, 18,7 ионов аммония, 5,3 ионов хлора, 1,3 сульфат-ионов и 323,4 фосфат-ионов. Содержание влаги в конечном продукте составляло 48,2% (масс).

После фильтрации суспензии фильтрат имел следующий состав ионов (г/л): 13,3 ионов натрия, 6,8 ионов аммония, 98,9 ионов хлора, 16,8 сульфат-ионов и 40,2 фосфат-ионов. 1,1 г додекагидрата гидрофосфата динатрия (образец, приготовленный в Примере 1-3) добавляли в 3,2 л оставшегося фильтрата и перемешивали при 15°C в течение 4 часов. Суспензию додекагидрата гидрофосфата динатрия отфильтровывали с помощью корзиночного фильтра центрифуги и промывали чистой водой.

Масса извлеченного додекагидрата гидрофосфата динатрия составляла 299,0 г. Продукт имел следующий состав ионов (г/кг): 128,2 ионов натрия, 6,1 ионов хлора, 3,8 сульфат-ионов и 239,5 фосфат-ионов. Содержание влаги составляло 61,3% (масс). Итоговая степень извлечения фосфорной кислоты в описанном выше двухстадийном способе составляла 83,2% (масс). Когда извлеченный гептагидрат гидрофосфата динатрия смешивали с додекагидратом гидрофосфата динатрия и повторно использовали в качестве прекурсора в процессе ферментации О-фосфосерина, процесс ферментации проходил без каких-либо проблем.

Пример 6. Получение О-фосфосерина при использовании извлеченного гидрофосфата динатрия

Штамм, депонированный под кодом No. KССМ11103Р и раскрытый в публикации международной патентной заявки № WO 2012/053794, инкубировали на чашке с MMYE агаровой средой, содержащей 50 мкг/мл спектиномицина (2 г/л глюкозы, 2 ммоль сульфата магния, 0,1 ммоль хлорида кальция, 6 г/л пирофосфата натрия, 0,5 г/л хлорида натрия, 3 г/л гидрофосфата динатрия, извлеченного согласно настоящему изобретению, 10 г/л экстракта дрожжей и 18 г/л агара) при 33°C в течение 24 часов. Полученные клетки отбирали с 1/10 площади каждой чашки с агаром, делали посев в 50 мл среды для посева, содержащей 50 мкг/мл спектиномицина (10 г/л глюкозы, 0,5 г/л сульфата магния, 3 г/л дигидрофосфата калия, 10 г/л экстракта дрожжей, 0,5 г/л хлорида натрия, 1,5 г/л хлорида аммония, 12,8 г/л пирофосфата натрия и 1 г/л глицина) в колбе с перегородками и инкубировали при 30°C в течение 6 часов при 200 об./мин.

По завершении посева культуры проводили пересев среды культуры посева в количестве 16% (об.) среды основной культуры на 1 л небольшого ферментатора, наполненного 300 мл среды основной культуры с последующим рассевом при 33°C и рН 7,0. В процессе рассева рН доводили до 7,0 путем добавления аммиачной воды. При истощении глюкозы в среде, проводили подпитку культуры путем добавления 520 г/л раствора глюкозы и 300 г/л гидрофосфата динатрия, извлеченного согласно настоящему изобретению. После проведения инкубирования в течение 80 часов О-фосфосерин с концентрацией 29,3 г/л анализировали методом ВЭЖХ.

Сравнительный пример. Получение О-фосфосерина при использовании чистой фосфорной кислоты

Штамм, депонированный под кодом No. KССМ11103Р, инкубировали в среде для посева и в основной среде так же, как в Примере 6. При истощении глюкозы проводили подпитку культуры путем добавления 520 г/л раствора глюкозы и 200 г/л чистой фосфорной кислоты. После проведения инкубирования в течение 80 часов О-фосфосерин с концентрацией 29,5 г/л анализировали методом ВЭЖХ.

Таким образом, было подтверждено, что, согласно способу извлечения фосфорной кислоты из ферментационной среды и ее повторного применения, фосфат может быть извлечен путем кристаллизации фосфата в ферментационном бульоне или жидких отходах ферментации и путем применения извлеченного фосфата в процессе ферментации, а продукт ферментации может быть получен в количестве, аналогичном количеству, полученному при использовании чистой фосфорной кислоты и, таким образом, способ по настоящему изобретению можно с высокой эффективностью использовать в процессах ферментации.

Приведенное выше описание настоящего изобретения представлено в целях иллюстрации и специалистам в данной области техники будет понятно, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без изменения технической концепции и существенных признаков настоящего изобретения. Таким образом, ясно, что описанные выше воплощения являются иллюстративными во всех аспектах и не ограничивают настоящее изобретение. Различные воплощения, раскрытые в данной заявке, не предназначены для ограничения, поскольку объем и сущность настоящего изобретения изложены в приложенной формуле изобретения. Настоящее изобретение может быть ограничено только признаками прилагаемой формулы изобретения, а также их эквивалентами.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ извлечения фосфорной кислоты из ферментационного бульона или его жидких отходов и ее повторное применение в процессе ферментации, включающий концентрирование ферментационного бульона или его жидких отходов, содержащих фосфорную кислоту, регулирование рН концентрата в диапазоне от 8 до 11 с последующей кристаллизацией фосфата, его выделение из маточного раствора и применение в ферментационной среде в качестве источника фосфорной кислоты. Изобретение обеспечивает извлечение фосфорной кислоты без использования органического растворителя, пригодной для повторного применения в процессе ферментации. 18 з.п. ф-лы, 3 ил., 10 пр.

Формула