Пробиотическая композиция, содержащая штаммы lactobacillus rhamnosus и lactobacillus paracasei - RU2744271C2

Чертежи

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ:

Настоящее изобретение относится к области пробиотиков. В частности, настоящее изобретение относится к пробиотической композиции, содержащей один данный штамм Lactobacillus rhamnosus strain и один данный штамм Lactobacillus paracasei. Настоящее изобретение относится также к применению этой композиции в способе профилактики и к способу получения этой композиции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ДЛЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

В течение длительного времени некоторым ферментированным пищевым продуктам, таким как йогурт, приписывали преимущества для здоровья в диапазоне от улучшенного усвоения/доступности питательных веществ, благодаря ферментации, до специфических эффектов, приписываемых самим штаммам бактерий.

Те живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах, обеспечивают преимущества для здоровья хозяина, как правило, обозначают как пробиотики. Большинство микроорганизмов, используемых в качестве пробиотиков, представляют собой молочнокислые бактерии, в частности штаммы из родов Lactobacillus и Bifidobacteria.

Множество исследований проведено для клинических исследований преимуществ для здоровья молочнокислых штаммов.

Сначала считалось, что молочнокислые штаммы оказывают обеспечивающее преимущества влияние на хозяина в основном посредством улучшения баланса микроорганизмов в его кишечнике, посредством конкуренции с бактериями, продуцирующими патогены и токсины.

В частности, было показано, что пробиотики предотвращают или лечат инфекции кишечника (Foster et al., 2011; Pamer, 2014). Такие способы ассоциированы также с более полным очищением от устойчивой к антибиотику инфекции у мышей (Vidal et al., 2010).

В настоящее время, показано также, что преимущества для здоровья от пробиотиков простираются дальше баланса микроорганизмов в кишечнике. Они также включают облегчение хронических воспалительных заболеваний кишечника, предотвращение и лечение индуцированной патогенами диареи, инфекций мочеполового тракта, атопических заболеваний и т.д. Например, показано, что Escherichia coli Nissle 1917, Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) и Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 предотвращали увеличение проницаемости кишечника in vivo (Ukena et 30 al., 2007, Donato et al. 2010 и Laval L et al., 2015).

Преимущества пробиотиков для здоровья отличаются между одним штаммом и другим, появились исследования композиций, содержащих множество видов пробиотиков. Однако на поведение одного штамма может влиять присутствие другого штамма. Действительно, из-за конкуренции и/или взаимодействия между некоторыми из этих бактерий или метаболитами, которые они образуют, не всегда является возможным получение композиции, содержащей несколько пробиотиков.

Фактически, в большинстве исследований пробиотиков используют отдельные штаммы. Существует меньше исследований эффективности смесей штаммов пробиотиков. И когда такие исследования проводили, доказательства, что смеси являются более эффективными, чем их штаммы-компоненты, ограничены (Chapman et al., 2011).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ:

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили очень эффективную композицию из множества штаммов, содержащую соответствующее соотношение данного штамма Lactobacillus rhamnosus к данному штамму Lactobacillus paracasei. Эта композиция из множества штаммов заметно предотвращает увеличение проницаемости кишечника.

Объектом настоящего изобретения, таким образом, является композиция, содержащая:

- данный штамм Lactobacillus rhamnosus и

- данный штамм Lactobacillus paracasei, где отношение указанного данного штамма Lactobacillus rhamnosus к указанному данному штамму Lactobacillus paracasei (LR_α:LP_α) выше или равно 8:1.

Отношение LR_α:LP_α можно определять различными способами. Например, его можно определять на основании количества колониеобразующих единиц данного штамма Lactobacillus rhamnosus и количества колониеобразующих единиц данного штамма Lactobacillus paracasei в композиции. Оно может быть также основано на КОЕ каждого из данных штаммов на грамм массы композиции в сухом состоянии или основано на КОЕ каждого из данных штаммов на объем композиции.

Отношение LR_α:LP_α может быть выше или равно 9:1, выше или равно 10:1, или выше или равно 11:1.

В одном варианте осуществления, отношение LR_α:LP_α строго выше, чем 10:1. Предпочтительно, отношение LR_α:LP_αравно 10:1.

Отношение LR_α:LP_α ниже 20:1, ниже 17:1 или ниже 15:1.

Предпочтительно, отношение LR_α:LP_α составляет между 9:1 и 15:1, более предпочтительно, между 10:1 и 12:1.

В предпочтительном варианте осуществления, композиция содержит по меньшей мере 10⁶ колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл) указанного данного штамма Lactobacillus rhamnosus, предпочтительно между 10⁸КОЕ/мл и 10¹⁰ КОЕ/мл, более предпочтительно, 10⁹ КОЕ/мл.

Поскольку отношение LR_α:LP_α известно, легко определить концентрацию указанного данного штамма Lactobacillus paracasei на основании концентрации указанного данного штамма Lactobacillus rhamnosus. Например, если данный штамм Lactobacillus rhamnosus присутствует при 10⁹ КОЕ/мл в композиции, и отношение LR_α:LP_α составляет 10:1. Тогда, данный штамм Lactobacillus paracasei присутствует при 10⁸ КОЕ/мл в композиции.

В предпочтительном варианте осуществления, композиция содержит по меньшей мере 10⁵ КОЕ/мл указанного данного штамма Lactobacillus paracasei, предпочтительно, от 10⁷ КОЕ/мл до 10⁸ КОЕ/мл, более предпочтительно, 10⁸ КОЕ/мл.

Как правило, указанный данный штамм Lactobacillus rhamnosus представляет собой пробиотический штамм, который регулирует барьерную функцию кишечника.

В предпочтительном варианте осуществления, указанный данный штамм Lactobacillus rhamnosus выбран из группы, состоящей из Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 и Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103).

Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 описан в WO2009/130423 и депонирован, по условиям Будапештского соглашения, в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris, France) 19 ноября 2006 г. под номером I-3690.

Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) (LGG®) описан в US4839281 и депонирован, по условиям Будапештского соглашения, в Американской коллекции типовых культур ATCC (American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Blvd. Manassas, Virginia 20110-2209 United States of America) под номером 53103.

Штаммы Lactobacillus rhamnosus, которые могут быть получены посредствоммутагенеза или посредством генетической трансформации вышеупомянутого данного штамма Lactobacillus rhamnosus и которые сохраняют свои пробиотические свойства, также включены в настоящее изобретение. Предпочтительно, штамм Lactobacillus rhamnosus представляет собой Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690.

Как правило, указанный Lactobacillus paracasei представляет собой пробиотический штамм с иммуномодулирующими свойствами. В предпочтительном варианте осуществления, указанный данный штамм Lactobacillus paracasei выбран из группы, состоящей из Lactobacillus paracasei CNCM I-3689 и Lactobacillus paracasei CNCM I-1518.

Lactobacillus paracasei CNCM I-3689 описан в WO2009122042 и депонирован, по условиям Будапештского соглашения, в CNCM 9 ноября 2006 г. под номером ссылки CNCM I-3689.

Lactobacillus paracasei CNCM I-1518 описан в EP0794707 и депонирован, по условиям Будапештского соглашения, в CNCM 28 сентября 1994 г. под номером ссылки CNCM I-1518,

Как Lactobacillus paracasei CNCM I-3689, так и Lactobacillus paracasei CNCM I-1518 имеют иммуномодулирующие свойства (а именно, см. WO2009/130423).

Как и для данных штаммов Lactobacillus rhamnosus, штаммы Lactobacillus paracasei, которые можно получать посредствоммутагенеза или посредством генетической трансформации штамма Lactobacillus paracasei CNCM I-3689 и Lactobacillus paracasei CNCM I-1518, которые сохраняют свои пробиотические свойства, также включены в настоящее изобретение.

В более предпочтительном варианте осуществления, композиция содержит данный штамм Lactobacillus rhamnosus, представляющий собой Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, и данный штамм Lactobacillus paracasei, представляющий собой Lactobacillus paracasei CNCM I-3689. Отношение данного штамма Lactobacillus rhamnosus, представляющего собой Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, к данному штамму Lactobacillus paracasei, представляющему собой Lactobacillus paracasei CNCM I-3689 (LR_α:LP_α), является таким, как упомянуто в настоящем описании выше, например, выше или равно 8:1, выше или равно 9:1, выше или равно 10:1, или выше или равно 11:1. В другом варианте осуществления, композиция содержит данный штамм Lactobacillus rhamnosus, представляющий собой Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, и данный штамм Lactobacillus paracasei, представляющий собой Lactobacillus paracasei CNCM I-1518. Отношение данного штамма Lactobacillus rhamnosus, представляющего собой Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, к данному штамму Lactobacillus paracasei, представляющему собой Lactobacillus paracasei CNCM I-1518 (LR_α:LP_α), является таким, как упомянуто в настоящем описании выше, например, выше или равно 8:1, выше или равно 9:1, выше или равно 10:1 или выше или равно 11:1.

В другом варианте осуществления, композиция содержит данный штамм Lactobacillus rhamnosus, представляющий собой Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, первый данный штамм Lactobacillus paracasei, представляющий собой Lactobacillus paracasei CNCM I-3689, и второй данный штамм Lactobacillus paracasei, представляющий собой Lactobacillus paracasei CNCM I-1518. Отношение данного штамма Lactobacillus rhamnosus, представляющего собой Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, к первому данному штамму Lactobacillus paracasei, представляющему собой Lactobacillus paracasei CNCM I-3689 (LR_α:LP_α1), является таким, как упомянуто в настоящем описании выше, например, выше или равно 8:1, выше или равно 9:1, выше или равно 10:1, или выше или равно 11:1.

И отношение данного штамма Lactobacillus rhamnosus, представляющего собой Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, к второму данному штамму Lactobacillus paracasei, представляющему собой Lactobacillus paracasei CNCM I-1518 (LR_α:LP_α2), также является таким, как упомянуто в настоящем описании выше, например, выше или равно 8:1, выше или равно 9:1, выше или равно 10:1, или выше или равно 11:1.

Композиция может дополнительно содержать другие штаммы Lactobacillus и/или штаммы бактерий, отличные от данного Lactobacillus rhamnosus или данного Lactobacillus paracasei.

Например, композиция может содержать различные ферменты, которые можно использовать для проведения ферментации молочного продукта, и в частности, культуру молочнокислых бактерий, таких как:

- виды Lactobacillus (например, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus bifidus и их комбинации),

- виды Lactococcus (например, Lactococcus lactis),

- виды Bifidobacterium (например, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium animalis, особенно Bifidobacterium animalis подвид lactis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum и их комбинации) и/или

- виды Streptococcus (например, Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis, Streptococcus raffinolactis, Streptococcus cremoris и их комбинации).

Предпочтительные молочнокислые бактерии для использования по настоящему изобретению, в частности, для получения ферментированной композиции молочных продуктов, выбраны из Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Bifidobacterium animalis подвид lactis, и их комбинаций.

В одном варианте осуществления, композиция содержит по меньшей мере один дополнительный штамм Lactobacillus paracasei. Дополнительный Lactobacillus paracasei отличается от указанного данного штамма Lactobacillus paracasei. Указанный по меньшей мере дополнительный штамм Lactobacillus paracasei может представлять собой, например, Lactobacillus paracasei CNCM I-1518 (при условии, что данный штамм Lactobacillus paracasei не представляет собой Lactobacillus paracasei CNCM I-1518). Когда композиция содержит такой дополнительный штамм Lactobacillus paracasei, дополнительный штамм Lactobacillus paracasei не принимают во внимание в соотношении LR_α:LP_α.

Например, если композиция содержит данный штамм Lactobacillus rhamnosus, представляющий собой Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, данный штамм Lactobacillus paracasei, представляющий собой Lactobacillus paracasei CNCM I-3689, и дополнительный штамм Lactobacillus paracasei, представляющий собой Lactobacillus paracasei,представляющий собой Lactobacillus paracasei CNCM I-1518, отношение LR_α:LP_α представляет собой отношение Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-3690 к Lactobacillus paracasei CNCM I-3689. Lactobacillus paracasei CNCM I-1518 не принимают во внимание в этом соотношении. Отношение Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 к Lactobacillus paracasei CNCM I-1518 (LR_α:LP_β) может отличаться от соотношения LR_α:LP_α. Например, отношение LR_α:LP_α может составлять 10:1, и отношение LR_α:LP_β может составлять 1:1. В соответствии с настоящим изобретением, композиция может находиться в форме для перорального введения. Это включает, например, твердые вещества, полутвердые вещества, жидкости и порошки. Полутвердые композиции, такие как йогурты, и жидкие композиции, такие как напитки, являются предпочтительными.

Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию или пищевую композицию. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, композиция представляет собой пищевую композицию, такую как пищевой продукт (включая функциональный пищевой продукт) или пищевая добавка,

«Пищевая добавка» обозначает продукт, который изготовлен из соединений, обычно используемый в качестве пищевых продуктов, но находящийся в форме таблеток, порошка, капсул, микстуры или в любой другой форме, обычно неассоциированной с продуктами питания, и который оказывает благоприятные эффекты на здоровье индивидуума. «Функциональный пищевой продукт» представляет собой продукт питания, который также оказывает благоприятные эффекты на здоровье индивидуума. В частности, пищевые добавки и функциональные пищевые продукты могут оказывать физиологический эффект - защитный или излечивающий - против заболевания, например, против хронического заболевания.

В рамках изобретения, композиция может представлять собой молочный продукт, предпочтительно, ферментированный молочный продукт.

В контексте настоящего изобретения, «ферментированный молочный продукт» обозначает, более конкретно, ферментированный молочный продукт, готовый для употребления человеком, такой как кисломолочный продукт, йогурт или молодой сыр, такой как белый сыр или творожный сыр. Он может представлять собой также сцеженный ферментированный молочный продукт, такой как сцеженный йогурт, называемый также концентрированным йогуртом или греческим йогуртом.

Термины «кисломолочный продукт» и «йогурт» имеют их обычные значения в области молочной промышленности, то есть, продукты, предназначенные для употребления человеком и происходящие от окисляющего молочнокислого брожения молочного субстрата. Эти продукты могут содержать вторичные ингредиенты, такие как фрукты, овощи, сахар и т.д.

Выражение «кисломолочный продукт», таким образом, закреплено в настоящей заявке за молочным продуктом, полученным из молочного субстрата, который подвергнут обработке, по меньшей мере эквивалентной пастеризации, засеян микроорганизмами, принадлежащими к характерным для каждого продукта видам.

Термин «йогурт» закреплен за кисломолочным продуктом, полученным, в соответствии с их локальным и повсеместным использованием, в результате развития специфических термофильных молочных бактерий, известных как Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и Streptococcus thermophilus, которые должны находиться в живом состоянии в конечном продукте, в минимальном соотношении. В конкретных странах, нормативы требуют добавления других молочных бактерий при изготовлении йогурта, и особенно, дополнительного использования штаммов Bifidobacterium и/или Lactobacillus acidophilus и/или Lactobacillus casei. Эти молочные штаммы предназначены для придания конечному продукту различных свойств, таких как благоприятный баланс кишечной флоры или модуляция иммунной системы. Йогурт может представлять собой перемешанный или термостатный йогурт.

На практике, выражение «кисломолочный продукт», таким образом, как правило, используют для обозначения кисломолочных продуктов, отличных от йогуртов. Он может также, в зависимости от страны, быть известным под разнообразными наименованиями, например, такими как «кефир», «кумыс», «ласси», «дахи», «лебен», «Filmjolk», «Villi», «ацидофильное молоко».

И наконец, наименование «белый сыр» или «творожный сыр», в настоящей заявке, закреплено за не подвергнутым ни рафинированию, ни посолке сыром, который подвергнут только ферментации молочнокислыми бактериями (и никакой другой ферментации, кроме молочнокислого брожения). Ферментированный молочный продукт изготовлен из цельного молока и/или полностью или частично обезжиренного молока, которое можно использовать в порошкообразной форме, которую можно разводить посредством добавления воды. Можно добавлять другие компоненты молока, такие как сливки, казеин, казеинат (например, казеинат кальция или натрия), белки молочной сыворотки, а именно, в форме концентрата (WPC), белки молока, а именно, в форме концентрата (MPC), гидролизаты белков молока и их смеси.

Молоко и компоненты молока, как правило, имеют животное происхождение, например, происходят из коровы, козы, овцы, буйвола, осла или верблюда.

Ферментированный молочный продукт содержит улучшающее текстуру средство, иными словами, средство, используемое для модификации общей текстуры или ощущения во рту пищевого продукта, такое как желирующие средства (например, желатин, агар, каррагинан, пектин, природные камеди), стабилизаторы (например, крахмал, агар, пектин, гуммиарабик, аравийская камедь), загустители (например, гуаровая камедь, ксантановая смола, пектин, крахмал, агар, каррагинан, альгиновая кислота). Оно может представлять собой, более конкретно, желирующее средство, такое как желатин, агар, каррагинан или пектин, в частности, желатин, агар или каррагинан. Могут присутствовать другие пищевые добавки, в дополнение к улучшающему текстуру средству, а именно, выбранные из:

- сахаров и подсластителей:

сахара и подсластители представляют собой пригодные для пищевых продуктов углеводные подсластители, которые могут представлять собой природные или искусственные, не содержащие калорий или низкокалорийные подсластители;

предпочтительными примерами пригодных сахаров являются сахароза, фруктоза, лактоза, глюкоза и мальтоза. Такие сахара можно включать в форме свекольного сахара, тростникового сахара, кленового сахара, мелассы, кукурузного сиропа, солодового сиропа, кленового сиропа, нектара агавы или также меда;

предпочтительными примерами пригодных не содержащих калорий или низкокалорийных подсластителей являются аспартам, сукралоза, ацесульфам калия, сахарин, цикламат натрия, тауматин, тагатоза, неогесперидин дигидрохалкон, изомальтулоза, ребаудиозид A или также экстракт стевии (содержащий ребаудиозид A),

- витамины (например, витамин A, B1, B2, B6, B12, C, D, E или K, фолиевая кислота и т.д.),

- антиокислители,

- модифицирующие pH средства (например, забуферивающие средства или подкисляющие средства, такие как лимонная кислота и ее соли, например, цитрат натрия, калия или кальция), смазывающие средства (например, растительные масла),

- консерванты (например, сорбиновая кислота и ее соли, такие как соли натрия, калия и кальция, диоксид серы, бензойная кислота и ее соли, такие как соли натрия, калия и кальция, этил-, метил- или пропил-п-гидроксибензоат и т.д.),

- усилители вкуса (например, глутаминовая кислота и ее соли, такие как соли натрия, калия, кальция, магния или аммония),

- вкусоароматические средства синтетического или природного происхождения (например, фруктовые ароматизаторы), и

окрашивающие средства (пигменты, красители и т.д.).

При необходимости, специалист в данной области способен выбирать пищевые добавки среди всех хорошо известных пищевых добавок и наполнителей, доступных на рынке.

Композиция по изобретению может также представлять собой ферментированный продукт, представляющий собой ферментированные овощи, такие как ферментированные соевые бобы, зерно и/или фрукты в термостатной, перемешанной или питьевой формах.

Ферментированный продукт может находиться в форме жидкости или в форме сухого порошка, полученного посредством высушивания ферментированной жидкости. Пищевые композиции, которые можно использовать по изобретению, включают также продукты детского питания, детские смеси для начального и дальнейшего кормления. В предпочтительном варианте осуществления, ферментированный продукт представляет собой свежий продукт. Свежий продукт, который не подвергали стадиям серьезной термической обработки, имеет то преимущество, что присутствующие бактериальные штаммы находятся в живой форме.

Настоящее изобретение также относится к композиции по изобретению для использования в способе профилактики или лечения организма человека или животного. Настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения у пациента, включающему введение указанному пациенту эффективного количества композиции по изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления, композиция по изобретению предназначена для использования в улучшении целостности эпителиального барьера кишечника. Действительно, поскольку вышеупомянутый указанный данный штамм Lactobacillus rhamnosus представляет собой, как правило, пробиотический штамм, регулирующий барьерную функцию кишечника.

Дисфункция барьерной функции кишечника является важным фактором в клиническом проявлении широкого ряда нарушений и заболеваний, таких как синдром раздраженной кишки (IBS), пищевая аллергия, диабет 1 типа, ожирение (Camilleri M LK et al., 2012, Perrier С СВ. et al. 2011, Vaarala O., 2012) и предшествует процессам хронического воспаления, таким как воспалительные заболевания кишечника (IBD) (Vetrano S. et al, 2011).

Таким образом, композиция по изобретению может быть предназначена для использования в профилактике или лечении нарушения, выбранного из группы, состоящей из нарушения желудочно-кишечного тракта, диабета 1 типа и ожирения. В частности, нарушение желудочно-кишечного тракта может представлять собой воспалительное заболевание кишечника (IBD) и/или синдром раздраженной кишки (IBS). За счет иммуномодулирующих свойств указанного данного штамма Lactobacillus paracasei, композиция может быть также предназначена для использования в качестве иммуномодулирующей композиции.

Предпочтительно, композиция по изобретению предназначена для использования как в качестве иммуномодулирующей композиции, так и в предотвращении или лечении нарушения, выбранного из группы, состоящей из нарушения желудочно-кишечного тракта, диабета 1 типа и ожирения.

Настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения нарушения, выбранного из группы, состоящей из нарушения желудочно-кишечного тракта, диабета 1 типа и ожирения, у пациента, включающему введение указанному пациенту эффективного количества композиции по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции по изобретению.

Пробиотические композиции, содержащие множество штаммов, классическим образом получают посредством отдельного выращивания каждого пробиотического штамма, подлежащего использованию в композиции, в условиях, подходящих для роста указанного штамма, и добавление их в конечный продукт после завершения их роста.

Таким образом, в одном варианте осуществления, способ получения композиции по изобретению включает стадию добавления в среду данного штамма Lactobacillus rhamnosus и данного штамма Lactobacillus paracasei. Данный штамм Lactobacillus rhamnosus и данный штамм Lactobacillus paracasei выращивают по отдельности в каждом виде условий, подходящих для роста штамма. Затем, после завершения их роста, указанный данный штамм Lactobacillus rhamnosus и указанный данный штамм Lactobacillus paracasei добавляют в среду таким образом, чтобы получить желательное отношение LR_α:LP_α, таким образом, получая композицию по изобретению. Если среда уже не содержит указанный данный штамм Lactobacillus rhamnosus и указанный данный штамм Lactobacillus paracasei, указанный данный штамм Lactobacillus rhamnosus и указанный данный штамм Lactobacillus paracasei можно добавлять в среду в желательном соотношении LR_α:LP_α.

Другим способом получения пробиотических композиций из множества штаммов является совместная ферментация, называемая также совместным культивированием.

В этом варианте осуществления, способ получения композиции по изобретению включает стадии:

- инокуляции среды для ферментации указанным данным штаммом Lactobacillus rhamnosus и указанным данным штаммом Lactobacillus paracasei и

- ферментации инокулированной среды посредством инкубации при температуре, подходящей для роста указанных штаммов. Ферментацию останавливают при достижении желательного соотношения LR_α:LP_α.

Основным преимуществом совместной ферментации является то, что метаболиты, высвобожденные штаммами в ходе ферментации, остаются в конечном продукте, т.е. в композиции по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к способу получения композиции, включающему стадии:

- добавления в среду данного штамма Lactobacillus rhamnosus и данного штамма Lactobacillus paracasei таким образом,чтобы получить композицию с отношением LR_α:LP_α выше или равно 8:1 или

- инокуляции среды для ферментации указанным данным штаммом Lactobacillus rhamnosus и указанным данным штаммом Lactobacillus paracasei и

- ферментации инокулированной среды посредством инкубации при температуре, подходящей для роста указанных штаммов, пока отношение LR_α:LP_α не станет выше или равно 8:1.

В предпочтительном варианте осуществления этого способа получения композиции, отношение LR_α:LP_αявляется таким, как описано в настоящем описании выше.

В одном варианте осуществления, способ получения композиции включает стадию добавления в среду данного штамма Lactobacillus rhamnosus и данного штамма Lactobacillus paracasei таким образом,чтобы получить композицию с отношением LR_α:LP_α, выше или равным 8:1. Каждый из данных штаммов выращивают отдельно в условиях, подходящих для его роста, затем каждый данный штамм добавляют в среду в подходящем количестве.

В другом варианте осуществления, способ получения композиции включает стадии инокуляции среды для ферментации указанным данным штаммом Lactobacillus rhamnosus и указанным данным штаммом Lactobacillus paracasei и ферментации инокулированной среды при температуре, подходящей для роста указанных штаммов, до достижения LR_α:LP_α,выше или равного 8:1. В этом варианте осуществления, данные штаммы совместно ферментируют, и ферментацию проводят для получения подходящего соотношения LR_α:LP_α в среде для ферментации по окончанию ферментации.

Предпочтительно, среда для ферментации представляет собой молоко.

Настоящее изобретение также относится к применению композиции по изобретению в изготовлении композиции для лечения организма человека или животного. В предпочтительном варианте осуществления, композиция по изобретению представляет собой ферментированный продукт, предпочтительно, ферментированный молочный продукт.

Существуют различные способы получения ферментированного продукта по изобретению.

Например, предварительную композицию, содержащую данное отношение LR_α:LP_α, можно добавлять в продукт, уже ферментированный таким образом, что отношение LR_α:LP_α в конечном продукте является таким, как описано в настоящем описании выше. Предварительную композицию можно получать посредством добавления в среду указанного данного штамма Lactobacillus rhamnosus и указанного данного штамма Lactobacillus paracasei или посредством совместной ферментации указанного данного штамма Lactobacillus rhamnosus и указанного данного штамма Lactobacillus paracasei. Предпочтительно, уже ферментированный продукт, к которому добавляют предварительную композицию, не содержит указанный данный штамм Lactobacillus rhamnosus и указанный данный штамм Lactobacillus paracasei. Следовательно, отношение LR_α:LP_α в предварительной композиции может являться таким же, как отношение LR_α:LP_α в конечном ферментированном продукте.

Другим способом получения ферментированного продукта по изобретению может являться совместная ферментация указанного данного штамма Lactobacillus rhamnosus и указанного данного штамма Lactobacillus paracasei с штаммами, используемыми для получения ферментированного продукта. Например, когда ферментированный продукт представляет собой йогурт, штаммы, использованные для молочной ферментации, представляют собой Lactobacillus deibrueckii подвид bulgaricus и Streptococcus thermophilus.Таким образом, Lactobacillus deibrueckii подвид bulgaricus, Streptococcus thermophilus, указанный данный штамм Lactobacillus rhamnosus и указанный данный штамм Lactobacillus paracasei можно подвергать совместной ферментации, чтобы получать йогурт по изобретению.

Молоко, как правило, сначала пастеризуют перед ферментацией.

Стадия пастеризации представляет собой обработку нагреванием при температуре, лежащей в диапазоне между 72°C и 138°C, предпочтительно, в течение от 2 секунд до 30 минут. Такая стадия и ее условия хорошо известны в данной области.

Стадия ферментации предпочтительно представляет собой молочную ферментацию с использованием способов, известных специалисту в данной области.

Когда приведена ссылка на «молочную ферментацию», это означает окисляющее молочнокислое брожение, приводящее к свертыванию и скисанию молока после продукции молочной кислоты, которая может сопровождаться продукцией других кислот, диоксида углерода и различных веществ, таких как экзополисахариды (EPS) или ароматические вещества, например, диацетил и ацетальдегид.

Для проведения такой молочной ферментации, молочные ферменты добавляют к неферментированному молочному продукту, в частности, молоку, как правило, перед этим пастеризованному, и температуру поддерживают между 25°C и 44°C, предпочтительно, в течение от 3 до 16 часов.

Изобретение далее проиллюстрировано следующими фигурами и примерами. Однако эти примеры и фигуры не следует интерпретировать как ограничивающие каким-либо образом объем настоящего изобретения.

ФИГУРЫ

На фигуре 1 показан эффект введения следующих композиций на защиту целостности барьера кишечника в модели индуцированного DNBS неспецифического воспаления у мышей.

Условные обозначения являются следующими:

носитель+PBS: мыши, не подвергнутые воздействию DNBS и не обработанные пробиотическими штаммами

DNBS+PBS: мыши, подвергнутые воздействию DNBS и не обработанные штаммами

DNBS+CNCM-13690: мыши, подвергнутые воздействию DNBS и обработанные L. rhamnosus (10⁹ КОЕ/мл)

DNBS+смесь 1:1: мыши, подвергнутые воздействию DNBS и обработанные одинаковой концентрацией (10⁹ КОЕ/мл) L. rhamnosus и L. paracasei

DNBS+смесь 1:10: мыши, подвергнутые воздействию DNBS и обработанные отношением L. rhamnosus:L. paracasei 10:1 (10⁹ КОЕ/мл: 10⁸ КОЕ/мл)

DNBS+CNCM-I3689: мыши, подвергнутые воздействию DNBS и обработанные L. paracasei (10⁹ КОЕ/мл)

ПРИМЕРЫ

Материал и способы:

Условия роста бактерий и животные

Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 и Lactobacillus paracasei CNCM I-3689 выращивали в среде MRS (Difco, USA) в анаэробных условиях при 37°C. Самцов мышей C57BL/шесть (в возрасте 6-8 недель; Janvier, Le Genest Saint Isle, France) содержали в вивариях National Institute of Agricultural Research (IERP, INRA, Jouy-en-Josas, France) в условиях отсутствия специфических патогенов (SPF). Мышей содержали в стандартных условиях в течение минимум 1 недели до экспериментов. Все эксперименты проведены в соответствии с правилами содержания животных Европейского Сообщества и одобрены соответствующим местным комитетом (Comethea) (Протокол номер 02550.0).

Дизайн эксперимента

Воспаление индуцировали, как описано ранее (Laval et al., 2015). Кратко, мышей под анестезией подвергали воздействию первой интраректальной дозы раствора 100 мг/кг динитробензолсульфоновой кислоты (DNBS) (ICN, Biomedical Inc.) в 30% этаноле (EtOH). Контрольным мышам (без колита) вводили только 30% EtOH.

Через тринадцать суток после первой инъекции DNBS, 10⁹ КОЕ только жизнеспособных Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, 10⁹ КОЕ жизнеспособных Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 и 10⁹ КОЕ жизнеспособных Lactobacillus paracasei CNCM I-3689 или 10⁹ КОЕ жизнеспособных Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 и 10⁸ КОЕ жизнеспособных Lactobacillus paracasei CNCM I-3689 в 200 мкл PBS, или только PBS вводили внутрижелудочно, ежесуточно в течение 10 суток (период искусственного питания).

Наконец, через 21 суток после первого воздействия, мышей снова подвергали воздействию с использованием второго введения 50 мг/кг DNBS или EtOH.

Потерю массы мониторировали в течение 3 суток после второй инъекции DNBS для оценки возможных клинических признаков дистресса. Для подтверждения отсутствия избыточного воспаления, макроскопические и гистологические оценки в баллах ободочной кишки, так же как активность миелопероксидазы (MPO) ободочной кишки (маркер степени инфильтрации полиморфноядерных нейтрофилов) и уровни липокалина-2 в сыворотке (раннего маркера воспаления) определяли, как описано ранее (Shashidharamurthy et al., 2013; Martin et al, 2014; Laval et al., 2015).

Проницаемость кишечника in vivo

Проницаемость in vivo оценивали с использованием метки конъюгированного с изотиоцианатом флуоресцеина декстрана (FITC-декстран 3000-5000 Да, Sigma-Aidrich), как описано ранее (Tambuwalaetal., 2010). Кратко, в конечной точке 0,6 мг/г массы тела FITC-декстрана, растворенного в PBS, вводили мышам посредством перорального зонда для искусственного питания. Для измерения присутствия FITC-декстрана в крови, через 3,5 час после искусственного питания, образцы крови выделяли из ретро-орбитального венозного сплетения и хранили в темноте при 4°C до анализа. В ходе этого периода мышей содержали в стандартных условиях с неограниченным доступом к воде и пище. Сыворотку отделяли посредством центрифугирования, и уровни FITC определяли с использованием флуоресцентного считывания микропланшетов (возбуждение 485 нм и излучение 530 нм; Tecan, Lyon, France).

Статистический анализ

Программное обеспечение GraphPad (GraphPad Sofware, LaJolla, CA, USA) использовали для статистического анализа. Результаты представлены как столбчатые диаграммы или точечные диаграммы со средними±SEM. В сравнениях использовали непараметрический критерий Крускала-Уоллиса с последующим критерием множественного сравнения Дьюнна. Значение p менее 0,05 считали значимым.

Результаты:

Оба штамма L. rhamnosus и L. paracasei тестировали в модели хронического неспецифического воспаления на мышах, индуцированного двумя интраректальными введениями динитробензолсульфоновой кислоты (DNBS), разделенными периодом восстановления. Эта модель характеризуется увеличением проницаемости барьера кишечника.

Как показано на фигуре 1, L. rhamnosus CNCM-I-3690, но не L. paracasei CNCM-I-3689, является способным восстанавливать целостность барьера кишечника. Когда штаммы L. rhamnosus CNCM-I-3690 и L. paracasei CNCM-I-3689 смешивали в соотношении 1:1, L. rhamnosus CNCM-I-3690 терял свою способность защищать барьер, но когда смесь присутствовала в соотношении 10:1, где присутствовало в 10 раз меньше L paracasei CNCM-I-3689, чем L. rhamnosus CNCM-I-3690, благоприятный эффект L. rhamnosus CNCM-I-3690 все еще присутствовал.

Реферат

Группа изобретений относится к области фармацевтики, а именно к ферментированному молочному продукту и способам его получения, а также к применению ферментированного молочного продукта для улучшения целостности эпителиального барьера кишечника и применению ферментированного молочного продукта для профилактики или лечения нарушения, выбранного из группы, состоящей из воспалительного заболевания кишечника, синдрома раздраженной кишки, диабета 1 типа и ожирения. Ферментированный молочный продукт содержит штаммLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 и штаммLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 в определенном соотношении, причем содержаниеLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 составляет по меньшей мере 106КОЕ/мл. Способы получения ферментированного молочного продукта включают стадию добавления в среду штаммаLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 и штаммаLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 или стадии инокуляции среды для ферментации и ферментации инокулированной среды штаммомLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 и штаммомLactobacillus paracaseiCNCM I-3689 до получения определенного соотношения между штаммами и содержанияLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 по меньшей мере 106КОЕ/мл. Группа изобретений обеспечивает получение продукта для улучшения целостности эпителиального барьера кишечника, причем в продукте сохраняются пробиотические свойства штаммаLactobacillus rhamnosusCNCM I-3690 в присутствииLactobacillus paracaseiCNCM I-3689. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

Формула