Штамм lactobacillus rhamnosus, обладающий противомикробными, иммуномодулирующими и специфичными в отношении маннозы адгезионными свойствами, а также продукт на его основе - RU2549699C2

Чертежи

Описание

Изобретение относится к новому штамму Lactobacillus rhamnosus, обладающему противомикробными и иммуномодулирующими свойствами.

В большом количестве научных исследований сообщалось о благоприятных воздействиях на здоровье определенных микроорганизмов, присутствующих в получаемых путем сбраживания продуктов питания, в частности в молочных продуктах. Данные микроорганизмы обычно обозначают как «пробиотики». Согласно общепринятому в настоящее время определению пробиотики представляют собой: «живые микроорганизмы, которые, при их употреблении в соответствующем количестве, обладают благоприятным воздействием на здоровье организма-хозяина» (отчет FAO/WHO об оценке здоровья и пищевых свойствах пробиотиков в продуктах питания, включающих порошковое молоко, содержащее живые кисломолочные бактерии; Кордова, Аргентина; 1-4 октября 2001 г.).

Было показано, что употребление продуктов питания, содержащих пробиотические бактерии, может оказать благоприятное воздействие на здоровье, в частности, посредством восстановления равновесия кишечной флоры, улучшения сопротивляемости инфекциям и модулирования иммунного ответа.

Пробиотические микроорганизмы, используемые в продуктах питания для людей, представляют собой, как правило, кисломолочные бактерии, принадлежащие, в основном, к роду Lactobacillus и Bifidobacterium.

Тем не менее благоприятные воздействия на здоровье в целом характерны не для всех бактерий одного и того же рода, даже не для одного и того же вида. Они обычно встречаются только у определенных штаммов; кроме того, наблюдаемые эффекты могут качественно и/или количественно изменяться от одного пробиотического штамма к другому, относящихся к одному и тому же виду.

Для того чтобы появилась возможность для микроорганизма считаться потенциально применимым в качестве пробиотика, он должен соответствовать, по меньшей мере, одному, и идеально, нескольким следующим ниже критериям:

- проявлять ингибиторную активность в отношении патогенных микроорганизмов, которые могут присутствовать в кишечной флоре, причем он обладает возможностью для такой активности либо в результате способности прикрепляться к клеткам кишечника, таким образом исключая или снижая прикрепление патогенов, либо в результате способности продуцировать вещества, которые ингибируют рост патогенов, либо в результате комбинации данных двух характеристик;

- проявлять иммуномодулирующие свойства и, в особенности, иммуностимулирующие и/или противовоспалительные свойства.

Кроме того, если такой микроорганизм предназначен для внесения в молочный продукт, он должен предпочтительно обладать удовлетворительным ростом в молоке.

В заключение, он должен сохранять хорошую жизнеспособность во время производства и хранения продуктов питания, в которые его будут вносить, и также после приема данных пищевых продуктов потребителем, с тем чтобы обладать способностью достигать кишечника и выживать в среде кишечника.

Тем не менее следует отметить, что, хотя жизнеспособность необходима, для того чтобы соответствовать существующему в настоящее время определению «пробиотик», было показано, что некоторые из благоприятных воздействий, связанных с пробиотическими штаммами, можно получить даже при отсутствии живых бактерий, и что они присущи определенным бактериальным фракциям или активным фракциям их надосадочных культуральных жидкостей. Например, в заявке PCT W02004093898 описан иммуномодулирующий препарат, получаемый фракционированием надосадочной культуральной жидкости штамма CNCM I-2219.

Авторам изобретения в настоящее время удалось выделить штамм Lactobacillus rhamnosus, который соответствует указанным выше критериям.

Объектом по настоящему изобретению является данный штамм, который был депонирован согласно будапештскому договору в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Microorganism Cultures], 25 rue du Docteur Roux, Paris), 9 ноября 2006 года под номером I-3690.

Он обладает следующими характеристиками:

Морфология: небольшие, коротенькие, иногда кокковидные, бациллы, отдельные или в небольших цепочках.

- сбраживание следующих ниже сахаров (результаты получали на стрипе api 50 CH в среде MRS -API при 37°C в течение 48 ч): рибозы, галактозы, D-глюкозы, D-фруктозы, D-маннозы, L-сорбозы, рамнозы, маннита, сорбита, метил-D-глюкозида, N-ацетилглюкозамина, арбутина, эскулина, салицина, мальтозы, лактозы, трегалозы, мелецитозы, бета-генциобиозы, D-туранозы, D-тагатозы и глюконата.

Он обладает, кроме того, противомикробными свойствами, которые обеспечивают устойчивую способность ингибировать рост патогенных микроорганизмов в культуре.

Он также обладает свойствами адгезии к маннозе. Известно, что гликоконъюгаты с высоким содержанием маннозы, присутствующие на поверхности эпителиальных клеток кишечника, играют центральную роль при присоединении патогенных бактерий, таких как энтеротоксичная Escherichia coli, сальмонелла, Vibrio cholerae или Pseudomonas aeruginosa, и сообщали, что адгезионные свойства к маннозе определенных пробиотических бактерий позволяют им конкурировать с данными патогенами и ингибировать их прилипание к слизистой оболочке кишечника, таким образом придавая им противоинфекционные свойства (Michail and Abernathy, Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 35, 350-355 2002; Mangell et al., Dig Dis Sci., 47, 511-506, 2002). Такие свойства тем не менее наблюдали в основном для бактерий вида Lactobacillus plantarum (в частности, штамм L. plantarum 229v, описанный в заявке EP0817640 и штамм L. plantarum WCFS1), но не для бактерий вида Lactobacillus rhamnosus.

Штамм CNCM I-3690 также обладает иммуномодулирующими свойствами и, в особенности, противовоспалительными свойствами.

Настоящее изобретение также охватывает в качестве объекта штаммы Lactobacillus rhamnosus, которые можно получать мутагенезом или генетической трансформацией штамма CNCM I-3690. Предпочтительно, данные штаммы сохраняют, по меньшей мере, противомикробные свойства или иммуномодулирующие свойства штамма CNCM I-3690. Они могут представлять собой штаммы, в которых один или несколько из эндогенных генов штамма CNCM I-3690 подверглись мутации, например, с тем, чтобы модифицировать некоторые из его метаболических свойств (например, способность данного штамма метаболизировать сахар, его устойчивость к прохождению содержимого через кишечник, его устойчивость к кислотности, его последующего окисления или получение его метаболита). Они могут также представлять собой штаммы, являющиеся результатом генетической трансформации штамма CNCM I-3690 одним или несколькими интересующими геном (генами), предоставляя им возможность, например, сообщить дополнительные физиологические характеристики указанному штамму, или экспрессировать белки терапевтического или вакцинного значения, которые желательно вводить посредством указанного штамма.

Данные штаммы можно получать из штамма CNCM I-3690 посредством общепринятых способов неспецифического или сайт-специфического мутагенеза и генетической трансформации молочнокислых бактерий, таких как бактерии, описанные, например, Gury et al. (Arch Microbiol., 182, 337-45, 2004) или Velez et al. (Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3604, 2007), или посредством методики, известной как «перестановка генома» (Patnaik et al. Nat Biotechnol, 20, 707-12, 2002; Wang Y. et al., J Biotechnol., 129, 510-15, 2007).

Объектом по настоящему изобретению также являются клеточные фракции, которые можно получать из штамма Lactobacillus rhamnosus по изобретению. Они, в частности, представляют собой препараты ДНК или препараты бактериальной стенки, получаемые из культур указанного штамма. Они также могут представлять собой надосадочные культуральной жидкости или фракции таких надосадочных жидкостей.

Объектом по настоящему изобретению также являются композиции, содержащие штамм Lactobacillus rhamnosus по изобретению или клеточные фракции, полученные из указанного штамма.

Данные композиции могут представлять собой, в частности, молочные ферменты, объединяющие штамм Lactobacillus rhamnosus по изобретению с одним или несколькими другими, необязательно пробиотическими, штаммом(ами) молочнокислых бактерий.

Они могут также представлять собой пищевые продукты и, в частности, молочные продукты, или фармацевтические или косметические продукты, содержащие штамм Lactobacillus rhamnosus по изобретению, или клеточные фракции, полученные из указанного штамма.

Когда указанный штамм присутствует в виде живых бактерий, они будут, предпочтительно, находится в соотношении, по меньшей мере, 10⁵ КОЕ на грамм, предпочтительно, по меньшей мере, 10⁶ КОЕ на грамм продукта, более предпочтительно, по меньшей мере, 10⁷ КОЕ на грамм, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 10⁸ КОЕ на грамм.

Настоящее изобретение будет понятно более очевидно из дополнительного описания, которое следует ниже, которое ссылается на примеры, иллюстрирующие противомикробные, иммуномодулирующие и противоинфекционные свойства штамма CNCM I-3690.

ПРИМЕР 1: СРАВНЕНИЕ СВОЙСТВ ШТАММА CNCM I-3690 СО СВОЙСТВАМИ ИЗВЕСТНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ

Свойства штамма CNCM I-3690 сравнивали со свойствами различных штаммов, известных из уровня техники по их пробиотическим свойствам.

Список таких штаммов приведен ниже в таблице I.

Материалы и способы

1 - Противомикробная активность

Исследование противомикробной активности проводили в сравнении с тремя целевыми патогенными бактериями: Escherichia coli E1392-75-2A, Salmonella enteritidis NIZO B1241 и Listeria monocytogenes 4B. Молочнокислые бактерии культивировали в чашках Петри в различных средах: LM17 (среда M17 (Terzaghi & Sandine, Appl. Microbiol. 29, 807-813, 1975) с добавлением 1% лактозы, среде Элликера (Elliker et al., J. Dairy Sci., 39, 1611-1612, 1956) и среде TGE (триптоноглюкозный мясной экстракт).

Чашки инкубировали при 37°C до тех пор, пока не появляются бактериальные колонии. Культуры Bifidobacterium получали при анаэробных условиях. Слой агара, содержащий среду BHI (сердечно-мозговой настой), и патогенный микроорганизм затем переливали на поверхность чашек. Чашки снова инкубировали при 37°C в течение 24 ч. Диаметры площадей ингибирования роста патогенных микроорганизмов затем измеряли вокруг каждой колонии молочнокислых бактерий. Оценка 1 соответствует диаметру в диапазоне от 1 до 3 мм. Оценка 2 соответствует диаметру в диапазоне от 4 до 6 мм. Оценка 3 соответствует диаметру более чем 6 мм. Каждый эксперимент проводили три раза независимо для каждого штамма.

Оценки, получаемые для целевых патогенных микроорганизмов в каждом эксперименте, суммировали, чтобы получить для каждой молочнокислой бактерии общую оценку противомикробной активности.

Результаты приведены ниже в таблице II.

Данные результаты показывают, что среди исследуемых штаммов штамм CNCM I-3690 наряду со штаммом ATCC55544 представляет собой штамм, который обладает наибольшей противомикробной активностью.

2 - Иммуномодулирующее действие

Иммуномодулирующие свойства различных молочнокислых бактерий оценивали, определяя модулирующее действие, вызванное данными бактериями, по воспалительной реакции эпителиальных клеток толстой кишки (HT-29), измеряя воздействие данных бактерий на активацию транскрипционного регулятора NF-κB и секрецию провоспалительного цитокина IL-8 клетками HT-29 в присутствие смеси TNFα, IL-1β и IFNγ (Cytomix), имитирующей условия воспалительного процесса.

Культивирование молочнокислых бактерий

Рост молочнокислых бактерий происходит в среде MRS (De Man et al., J. Appl. Bacteriol. 23, 130-135, 1960) или в среде MRS, дополненной L-цистеином (1% конечная концентрация), или в среде Элликера в зависимости от исследуемых бактериальных видов. Бактерии инокулировали и культивировали в 10 мл первой предварительной культуры в течение 16 ч при 37°C и повторно культивировали на следующий день в 100 мл второй культуры в течение 16 ч при 37°C и собирали в конце стационарной фазы.

Культивирование и получение клеток

Клетки HT29 сохраняют при 37°C и в атмосфере 5% CO₂ в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 4,5 г/л D-глюкозы, L-глутамина (1 мМ конечная концентрация), заменимых аминокислот (AA) (1% конечная концентрация), пенициллина/стрептомицина (1% конечная концентрация) и фетальной телячьей сыворотки (FCS) (10% конечная концентрация).

Клетки HT-29 высевают в 12-луночные планшеты в соотношении 2×10⁵ клеток на лунку в 2 мл среды за два дня до экспериментов по взаимодействию с бактериями и стимулирования при помощи Cytomix.

Для определения активации транскрипционного регулятора NF-κB клетки трансфицировали через один день после высевания репортерной плазмиды Ig-κB-люцифераза, как описано у Tien et al. (J. Immunol., 176, 1228-37, 2006). Перед трансфекцией клетки промывали и среду заменяли на такую же среду без антибиотиков. Трансфекцию выполняют, внося в каждую лунку 100 мкл смеси, содержащей 75 нг плазмиды pIg-κB-люцифераза и 1 мкл Lipofectamine 2000 в 99 мкл среды OptiPro. Планшеты затем инкубируют 24 ч при 37°C и в атмосфере 5% CO₂.

Взаимодействие с бактериями и стимуляция при помощи Cytomix

Бактерии извлекают в конце стационарной фазы и дважды промывают PBS до их взаимодействия с клетками.

Затем их инкубируют в течение 2 часов с бактериями при множественности заражения 100 бактерий на клетку. Через два часа после взаимодействия с бактериями клетки инкубируют в течение 6 часов в присутствии бактерий и Cytomix в количественном соотношении 50 нг/мл TNFα, 2,5 нг/мл IL-1β и 7,5 нг/мл IFNγ в среде для инкубации. Все инкубирования проводят при 37°C и в атмосфере 5% CO₂.

Для того чтобы определить исходный уровень активации NF-κB и секреции IL-8 в отсутствие молочнокислых бактерий, точно такой же эксперимент проводили со стимуляцией Cytomix, осуществляемой в течение 6 часов через два часа после инкубации клеток в отсутствие бактерий.

В конце 8 часов инкубации 1 мл среды извлекают для того, чтобы проанализировать секретируемый IL8. Данный анализ проводят при помощи ELISA, используя набор «QuantiGlo Human IL-8 chemiluminescent ELISA» (R&D Systems).

Для определения активации NF-κB клетки лизируют в 100 микролитрах буфера (25 мМ Tris, pH 7,9, 8 мМ MgCl₂, 1% тритон, 15% глицерин) с добавлением 1 мМ DTT. Для определения люциферазной активности 10 микролитров клеточного лизата добавляют к буферу для считывания (25 мМ Tris, pH 7,9, 8 мМ MgCl₂, 1% тритон, 15% глицерин) с добавлением 1 мМ DTT, 100 мМ АТФ и 2 мМ люциферин/K₂HPO₄ - pH 7,58. Измерения проводят, используя люминометр (Beckman Coulter).

Спустя 8 часов данного полного времени взаимодействия измеряют активацию NF-κB и секрецию IL-8.

Величины активации NF-κB и секреции IL-8 выражают как процентные соотношения относительно исходного уровня, наблюдаемого в отсутствие молочнокислых бактерий. Для каждого исследуемого штамма среднюю оценку иммуномодулирующего действия вычисляют, складывая процентное соотношение активации NF-κB и секреции IL-8. Данные результаты приведены в таблице III ниже.

Данные результаты показывают, что штамм CNCM I-3690 в значительной степени ингибирует воспалительную реакцию эпителиальных клеток HT-29. Среди других исследуемых штаммов только штамм HN001 обладает сравнимыми противовоспалительными свойствами.

3 - Выживание при желудочных и кишечных стрессовых воздействиях

Использовали модель in vitro, отражающую условия желудочного стрессового воздействия и кишечного стрессового воздействия.

Культуры молочнокислых бактерий получали в молоке с добавлением дрожжевого экстракта. Культуры инкубируют в течение от 24 до 48 ч в зависимости от видов (до стационарной фазы культуры).

Кишечное стрессовое воздействие: Приготавливают искусственный кишечный секрет, состоящий из свиных солей желчных кислот (при 3,3 г/л) и карбонатного буфера NaHCO₃ (при 16,5 г/л). Величину pH доводят до 6,3. 1 мл данного кишечного секрета добавляют к 100 мкл бактериальной культуры. Затем культуры инкубируют в течение 5 часов. Затем бактериальные популяции до и после стрессового воздействия оценивают на чашках.

Желудочное стрессовое воздействие: Приготавливают искусственный желудочный сок. Он состоит из молочной кислоты (9 г/л), пепсина (3,5 г/л) и NaCl (2,2 г/л). Величину pH доводят до 3,1. 1 мл данного искусственного сока добавляют к 100 мкл бактериальной культуры. Культуры инкубируют в течение различного времени: 10 мин, 30 мин и 60 мин. Бактериальные популяции оценивают на чашках.

Величины выражают следующим образом:

Желудочное стрессовое воздействие = среднее значение [log(КОЕ 10 мин/КОЕ 0) и log(КОЕ 0/КОЕ 0)]×10 + среднее значение [log(КОЕ 30 мин/КОЕ 0) и log(КОЕ 10 мин/КОЕ 0)]×20 + среднее значение [log(КОЕ 60 мин/КОЕ 0) и log(КОЕ 30 мин/КОЕ 0)]×30.

Кишечное стрессовое воздействие = log(КОЕ 5 ч/КОЕ 0 ч).

КОЕ X мин представляет собой концентрацию бактерий, выраженную в виде колониеобразующих единицах (КОЕ) через X минут инкубации.

Для желудочного стрессового воздействия выживание является хорошим, когда величина составляет более чем -50, сравнительно хорошим, когда величина находится в диапазоне от -50 до -100, и слабым, когда величина менее чем -100.

Для кишечного стрессового воздействия выживание является хорошим, когда величина составляет более чем -0,5, сравнительно хорошим, когда величина находится в диапазоне от -0,5 до -1,5, и слабым, когда величина менее чем -1,5.

Результаты приведены в следующей ниже таблице IV.

Результаты, проиллюстрированные выше в таблицах II, III и IV, показывают, что среди различных исследуемых штаммов штамм CNCM I-3690 является единственным, который обладает как значительными противомикробными свойствами, так и значительными противовоспалительными свойствами, сопровождаемыми, в дополнение, очень хорошими свойствами устойчивости к желудочному и кишечному стрессовым воздействиям.

Для того чтобы проиллюстрировать превосходство данного штамма, различные оценки, полученные для этого штамма с противомикробной точки зрения, складывали вместе и вычисляли среднее значение для результатов, полученных для данного штамма с точки зрения иммуномодулирующего действия. На фиг.1 показано положение, по которому данный штамм выделяется относительно других исследованных штаммов.

ПРИМЕР 2: АДГЕЗИОННЫЕ СВОЙСТВА В ОТНОШЕНИИ МАННОЗЫ ШТАММА CNCM I-3690

Способность штамма CNCM I-3690 специфически прилепляться к маннозе определяли посредством реакции агглютинации. Данная реакция основана на наличие содержащих маннозу полисахаридов на поверхности клеток Saccharomyces cerevisiae. Когда прилепляющиеся бактерии контактируют с S. cerevisiae, имеет место процесс агглютинации, который видно под микроскопом.

Данная модель позволяет оценить потенциальные противоинфекционные свойства бактерии, происходящие из ее способности конкурировать с патогенными микроорганизмами на уровне прилипания к слизистой оболочке кишечника.

Штаммы L. plantarum 229v и L. plantarum WCFS1, известные по их выраженной адгезионной способности к маннозе, использовали в качестве положительных контролей.

Штаммы Lactobacillus культивируют в среде MRS при температуре 37°C. Рост бактерий останавливают в стационарной фазе и затем бактерии промывают и выравнивают их концентрацию. Культивирование S. cerevisiae проводят в среде «солодовый экстракт» (Oxoid).

Объем 5 мкл бактериальной суспензии затем смешивают с PBS или метил-α-D-маннопиранозидом (конечная концентрация: 25 мМ). Затем добавляют 100 мкл препарата, содержащего клетки S. cerevisiae. Смесь перемешивают в течение 10 мин при температуре окружающей среды и затем исследуют под микроскопом и приписывают оценки, используя следующую ниже градацию:

Оценка 0 = агглютинация отсутствует

Оценка 1 = слабая агглютинация

Оценка 3 = значительная агглютинация

Оценка 5 = очень значительная агглютинация.

Эксперимент проводят три раза независимо для каждого штамма.

Результаты приведены далее в таблице V.

Замечено, что процентное количество клеток S. cerevisiae, агглютинированных штаммом CNCM I-3690, сопоставимо с процентным количеством клеток S. cerevisiae, агглютинированных штаммами L. plantarum 229v и L. plantarum WCFS1.

ПРИМЕР 3: РОСТ ШТАММА CNCM I-3690 В МОЛОКЕ

Свойства роста в молоке штамма CNCM I-3690 исследовали, используя следующий ниже протокол:

Среду, состоящую из обезжиренного молока, восстановленного водой, к которой добавляли порошок обезжиренного молока, засевали штаммом CNCM I-3690 в количествах в диапазоне от 5,5×10⁶ КОЕ/г до 3,3×10⁷ КОЕ/г.

Ферментативную активность штамма, которая связана с его ростом, измеряют посредством непрерывного слежения за величиной pH среды для выращивания.

Результаты показаны на фиг.2.

Данные результаты показывают, что штамм CNCM I-3690 обладает способностью эффективно расти в молоке, и что его, следовательно, можно использовать в промышленном производстве сброженных молочных продуктов.

Реферат

Группа изобретений относится к штамму Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 и к молочному пищевому продукту, содержащему указанный штамм. Предложенный штамм обладает специфичными в отношении маннозы адгезионными свойствами. Штамм обладает противомикробными свойствами в отношении, например, Escherichia coli, Salmonella enteritidis и Lysteria monocytogenes. Штамм обладает иммуномодулирующими свойствами, в частности обладает способностью ингибировать воспалительную реакцию эпителиальных клеток НТ-29. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 3 пр.

Формула