Композиция, способствующая выработке коллагена - RU2526199C2

Чертежи

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001]

Настоящее изобретение относится к композиции, способствующей выработке коллагена, которая содержит одно или несколько соединений, выбранных из группы, состоящей из D-аспарагиновой кислоты, D-аланина, их производных и/или солей, и к способу поддержания и/или улучшения состояния кожи, включающему стадию введения соединения.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002]

Коллаген I типа является одним из основных белков кожи и представляет собой белок в виде тройной спирали, состоящий из двух нитей α(альфа)1 (I) цепи и одной нити α(альфа)2 (I) цепи. Коллаген I типа вырабатывается фибробластами в дермальном слое кожи и формирует внеклеточный матрикс, в который включены фибробласты. Как старение, вызванное внутренним состоянием организма, так и старение кожи под воздействием ультрафиолетовых лучей сопровождаются пониженной выработкой коллагена и повышенной активностью коллагеназы (непатентные документы 1-3). Таким образом, считалось, что стимулирование выработки коллагена приводит к поддержанию и/или улучшению состояния кожи, подверженной старению, вызванному внутренним состоянием организма, или старению кожи под воздействием ультрафиолетовых лучей, например появление морщин. В действительности известно, что ретиноиды, т.е. производные витамина A, оказывают эффект при нанесении на кожу лица или кожу верхней части рук, подверженной старению, вызванному внутренним состоянием организма, или старению кожи под воздействием ультрафиолетовых лучей (непатентные документы 4 и 5). Однако ретиноиды обладают побочным эффектом, таким как фотосенсибилизация или воспалительная реакция, известная как реакция на ретиноиды (непатентный документ 6). Кроме того, обычно обладая высокой фотореакционной активностью, ретиноиды для постоянного хранения нуждаются в защите от светового излучения. Таким образом, после нанесения на кожу ретиноиды могут легко разлагаться под воздействием света, облучающего живой организм в условиях его обычного существования.

ДОКУМЕНТЫ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ

Непатентный документ

[0003]

Непатентный документ 1: Takeda, K. et al., J. Cell. Physiol., 153:450 (1992)

Непатентный документ 2: Varani, J. et al., Am. J. Pathol., 158:931 (2001)

Непатентный документ 3: Varani, J. et al., Am. J. Pathol., 168:1861 (2006)

Непатентный документ 4: Kligman, A. M. et al., J. Am. Acad. Dermatol., 15:836 (1986)

Непатентный документ 5: Kligman, A.M. et al., J. Am. Acad. Dermatol., 29:25 (1993)

Непатентный документ 6: Mukherjee, S. et al., Clin. Interv. Aging 1:327 (2006)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ЗАДАЧА, РЕШАЕМАЯ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

[0004]

При данных обстоятельствах существует потребность в разработке новой композиции, которая обладает эффектом стимулирования выработки коллагена, в частности композиции, которая обладает высокой светостабильностью и не имеет побочных эффектов, присущих ретиноидам.

СРЕДСТВА ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧИ

[0005]

Настоящее изобретение относится к композиции, способствующей выработке коллагена, содержащей одно или несколько соединений, выбранных из группы, состоящей из D-аспарагиновой кислоты, D-аланина, их производных и/или солей.

[0006] Композиция, способствующая выработке коллагена, по настоящему изобретению может быть использована для поддержания и/или улучшения состояния кожи.

[0007]

В отношении композиции, способствующей выработке коллагена, по настоящему изобретению, состояние кожи включает старение кожи от воздействия ультрафиолетовых лучей и/или морщины, но этим не ограничивается.

[0008]

Композиция, способствующая выработке коллагена, по настоящему изобретению, может быть использована для препарата для наружного нанесения на кожу.

[0009]

Композиция, способствующая выработке коллагена, по настоящему изобретению, может быть использована для продуктов питания.

[0010]

Композиция, способствующая выработке коллагена, по настоящему изобретению, может представлять собой композицию, усиливающую выработку коллагена I типа.

[0011]

Настоящее изобретение также относится к способу поддержания и/или улучшения состояния кожи, включающему стадию введения композиции, усиливающей выработку коллагена, содержащей одно или несколько соединений, выбранных из группы, состоящей из D-аспарагиновой кислоты, D-аланина, их производных и/или солей.

[0012]

Состояние кожи, которое поддерживается и/или улучшается способом по настоящему изобретению, включает старение кожи от воздействия ультрафиолетовых лучей и/или морщины, но этим не ограничивается.

[0013]

В отношении способа по настоящему изобретению, композиция, способствующая выработке коллагена, по настоящему изобретению, может быть использована в препарате для наружного нанесения на кожу.

[0014]

В отношении способа по настоящему изобретению, композиция, способствующая выработке коллагена, по настоящему изобретению, может быть использована в пищевой композиции.

[0015]

В отношении способа по настоящему изобретению, композиция, способствующая выработке коллагена, может представлять собой композицию, способствующую выработке коллагена I типа.

[0016]

Используемый в настоящем документе термин “соль” D-аспарагиновой кислоты и D-аланина обозначает любые соли, включая соль металла и соль амина или тому подобное, при условии, что эффект усиления выработки коллагена посредством D-аспарагиновой кислоты и D-аланина не ослабевает. Соли металла могут включать соль щелочного металла, соль щелочноземельного металла и тому подобное. Соли амина могут включать соль триэтиламина, соль бензиламина и тому подобное.

[0017]

Используемый в настоящем документе термин “производные” D-аспарагиновой кислоты и D-аланина обозначает молекулы D-аспарагиновой кислоты и D-аланина, которые ковалентно связаны с любой группой атомов с помощью своих аминогрупп, карбоксильных групп или боковых цепей, при условии, что эффект усиления выработки коллагена посредством D-аспарагиновой кислоты и D-аланина не ослабевает. Группа атомов включает, но ими не ограничивается, защитные группы, такие как N-фенилацетильная группа и 4,4'-диметокситритильная (DMT) группа; биополимеры, такие как белок, пептид, сахарид, липид и нуклеиновая кислота; синтетические полимеры, такие как полистирол, полиэтилен, поливинил, и сложный полиэфир; и функциональные группы, такие как группа сложного эфира. Группа сложного эфира может содержать, например, алифатический сложный эфир, такой как метиловый сложный эфир и этиловый сложный эфир; и ароматический сложный эфир.

[0018]

Аминокислота имеет оптические изомеры, которыми являются L-форма и D-форма. Природный белок содержит L-аминокислоты, связанные посредством пептидных связей, и используются только L-аминокислоты за исключением некоторых случаев, таких как бактериальная клеточная стенка. В связи с этим считали, что у млекопитающего, включая человека, присутствуют только L-аминокислоты и используются только L-аминокислоты (Kinouchi, T. et al., TANPAKUSHITSU KAKUSAN KOSO (PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME), 50:453-460 (2005), Lehninger Principles of Biochemistry [Vol. 1] 2nd ed., pp132-147(1993), Japanese-language translation, Hirokawa Shoten Ltd., Harper's Biochemistry, Original version, 22nd ed., pp21-30 (1991), Japanese-language translation Maruzen Co., Ltd.). Соответственно, теоретически и в смысле промышленного получения, в течение долгого времени в качестве аминокислот использовали в основном только L-аминокислоты.

[0019]

Исключительными случаями использования D-аминокислоты являются, например, случай использования в качестве исходного вещества для антибиотиков, получаемых с помощью микроорганизма, и в случае пищевой добавки, использующей D-аминокислоту в DL-аминокислотной смеси только с целью снижения стоимости выделения L-аминокислоты из смеси L- и D-аминокислот, которые получают в эквимолярных количествах путем синтеза аминокислот. Тем не менее не было случая использования в качестве физиологически активного вещества, в смысле промышленного применения, только D-аминокислоты, не включая L-аминокислоту.

[0020]

D-серин и D-аспарагиновая кислота имеют высокое относительное содержание D-формы, и, соответственно, было проведено большое количество исследований по сравнению с другими аминокислотами. D-серин локализован в головном мозге и гиппокампе и известен как регулирующий фактор для рецептора НМДА в головном мозге. D-аспарагиновая кислота локализована в мужской половой железе и шишковидном теле, и известно, что она принимает участие в регуляции гормональной секреции (Japanese Patent Unexamined Publication № 2005-3558). Однако физиологические активности D-аспарагиновой кислоты и D-аланина в кожной ткани ясно не определены.

[0021]

Как показано в следующих примерах, эффект стимулирования выработки коллагена посредством D-аспарагиновой кислоты и D-аланина до сих пор не был известен. Таким образом, композиция, способствующая выработке коллагена, по настоящему изобретению, содержащая D-аспарагиновую кислоту и/или D-аланин, является новым изобретением.

[0022]

Недавно сообщалось, что мыши линии ddY позволяли принимать внутрь, без ограничения, 10 мМ водный раствор D-аминокислоты в течение двух недель, и затем измеряли концентрацию D-аминокислоты в каждом органе, которая составляла 3-1000 пмоль на железу в шишковидном теле и 2-500 нмоль на грамм сырого веса в ткани головного мозга (Morikawa, A. et al., Amino Acids, 32:13-20 (2007)). С учетом вышесказанного, нижний предел ежедневного потребляемого количества D-аспарагиновой кислоты и D-аланина, содержащихся в композиции по настоящему изобретению, вычисляли описанным ниже методом.

[0023]

D-аспарагиновая кислота по настоящему изобретению обладает эффектом стимулирования выработки коллагена в культурированных фибробластах человека в пределах диапазона концентрации 0,01 мкМ (микромолярная) - 320 мкМ (микромолярная), как описано в следующих примерах. Таким образом, количество D-аспарагиновой кислоты, которая содержится в композиции по настоящему изобретению, может быть любым, при условии, что D-аспарагиновая кислота, в указанном выше диапазоне концентрации, доставляется к фибробластам в кожной ткани in vivo. В отношении препарата для наружного нанесения на кожу по настоящему изобретению, содержание D-аспарагиновой кислоты может составлять от 0,0000001% масс. до 50% масс. от всей композиции по изобретению, или вплоть до максимальной массовой концентрации, которую можно получить. В частности, в случае, когда композиция представляет собой средство для наружного нанесения на кожу, содержание D-аспарагиновой кислоты предпочтительно составляет от 0,000001% масс. до 30% масс., и наиболее предпочтительно от 0,00001% масс. до 3% масс. В случае, когда композиция по настоящему изобретению представляет собой средство для внутреннего введения, содержание D-аспарагиновой кислоты может быть в пределах от 0,0000001% масс. до 100% масс. В случае, когда композиция по настоящему изобретению представляет собой средство для внутреннего введения, содержание D-аспарагиновой кислоты предпочтительно составляет от 0,0000002% масс. до 80% масс., и наиболее предпочтительно от 0,000001% масс. до 60% масс. Кроме того, нижний предел количества суточного приема D-аспарагиновой кислоты, содержащейся в композиции по настоящему изобретению, может составлять 0,01 нг, предпочтительно 0,1 нг, и более предпочтительно 1 нг на 1 кг массы тела.

[0024]

Как показано в следующих примерах, в пределах диапазона концентрации от 0,01 мкМ (микромолярная) до 1000 мкМ (микромолярная), D-аланин по настоящему изобретению обладает эффектом стимулирования выработки коллагена в культурированных фибробластах человека. По существу, количество D-аланина, содержащегося в средстве для улучшения состояния кожи, препарате для наружного нанесения на кожу и пищевой композиции по настоящему изобретению, может быть любым при условии, что D-аланин, в вышеуказанном диапазоне концентрации, доставляется в фибробласты в кожной ткани in vivo. В отношении препарата для наружного нанесения на кожу по настоящему изобретению, содержание D-аланина может составлять от 0,000001% масс. до 50% масс. от всей композиции по изобретению, или вплоть до максимальной массовой концентрации, которую можно получить в лекарственном препарате. В частности, в случае, когда композиция представляет собой средство для наружного нанесения на кожу, содержание D-аланина предпочтительно составляет от 0,00001% масс. до 30% масс., и наиболее предпочтительно от 0,0001% масс. до 10% масс. В случае, когда композиция по настоящему изобретению представляет собой средство для внутреннего введения, содержание D-аланина может быть в пределах от 0,000001% масс. до 100% масс. В случае, когда композиция по настоящему изобретению представляет собой средство для внутреннего введения, содержание D-аланина предпочтительно составляет от 0,00001% масс. до 80% масс. и наиболее предпочтительно от 0,0001% масс. до 60% масс. Кроме того, нижний предел количества суточного приема D-аланина, содержащегося в композиции по настоящему изобретению, может составлять 0,01 нг, предпочтительно 0,1 нг и более предпочтительно 1 нг на 1 кг массы тела.

[0025]

Композиция по настоящему изобретению может, кроме того, содержать одну или несколько фармацевтически приемлемых добавок, в дополнение к группе D-аспарагиновой кислоты, D-аланина, солей D-аспарагиновой кислоты и D-аланина, и/или производным D-аспарагиновой кислоты и D-аланина, способным высвобождать D-аспарагиновую кислоту и D-аланин посредством метаболизирующего фермента, и так далее in vivo, при условии, что эффект усиления выработки коллагена посредством D-аспарагиновой кислоты и D-аланина не ослабевает. Такие добавки включают, но этим не ограничиваются, разбавитель и наполнитель, связующее вещество и клейкое вещество, смазывающее вещество, вещество, обеспечивающее «скольжение», смягчитель, разрыхлитель, растворитель - носитель, буферирующий агент, краситель, отдушку, подсластитель, консервант и стабилизатор, адсорбент, а также другие фармацевтические добавки, известные специалистам в данной области.

[0026]

Композиция по настоящему изобретению может быть получена с использованием в качестве активного компонента только D-аспарагиновой кислоты, D-аланина, соли D-аспарагиновой кислоты и D-аланина и/или производных D-аспарагиновой кислоты и D-аланина, способных высвобождать D-аспарагиновую кислоту и D-аланин посредством метаболизирующего фермента, и тому подобного, in vivo. Однако при условии, что эффект по настоящему изобретению не ослабевает, композиция может соответствующим образом быть получена с другими компонентами, используемыми для препарата для наружного нанесения на кожу, например, косметическими средствами, содержащими квазилекарственные препараты и фармацевтические препараты, если необходимо. Примеры других компонентов (т.е. компонентов, необязательно содержащихся в композиции) включают масло, поверхностно-активный агент, пудру, краситель, воду, спирты, загуститель, желатирующий агент, силиконы, антиоксидант, поглощающий УФ-агент, увлажняющий агент, отдушку, различные фармацевтически активные ингредиенты, консервант, регулирующий pH агент и нейтрализующий агент.

[0027]

Лекарственная форма композиции для усиления выработки коллагена по настоящему изобретению, применяемой для поддержания и/или улучшения состояния кожи (именуемая в дальнейшем “средство для улучшения состояния кожи”), может быть любой, которую обычно используют для композиций квазилекарственного препарата и фармацевтических композиций, содержащих средство для наружного нанесения на кожу, такой как мазь, крем, эмульсия, лосьон, пакет, гель и пластырь, оральный препарат, такой как порошок, гранулы, мягкая капсула и таблетка, назальный препарат, такой как назальный спрей и раствор для инъекции.

[0028]

Лекарственную форму средства для наружного нанесения на кожу в соответствии с настоящим изобретением особо никак не ограничиваютпри условии, что ее обычно используют для препарата для наружного нанесения на кожу и она включает мазь, крем, эмульсия, лосьон, пакет, гель и пластырь.

[0029]

Пищевая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать, помимо D-аспарагиновой кислоты, D-аланина, соли D-аспарагиновой кислоты и D-аланина и/или производных D-аспарагиновой кислоты и D-аланина, способных высвобождать D-аспарагиновую кислоту и D-аланин с помощью метаболизирующего фермента, и тому подобное in vivo, заправку, краситель, консервант и другие компоненты, которые обычно могут быть использованы для пищевых продуктов при условии, что эффект усиления выработки коллагена посредством D-аспарагиновой кислоты и D-аланина не ослабевает.

[0030]

Пищевая композиция по настоящему изобретению может быть любой композицией, обычно используемой в качестве пищевой композиции, включающей, но ими не ограничиваясь, конфеты, печенье, ореховую пасту, “французскую приправу”, майонез, “французский хлеб”, соевый соус, йогурт, сушеные измельченные приправы для риса, приправы/соус для натто (японские ферментированные бобы сои), натто, неочищенный черный уксус.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0031]

На фиг.1 графически показан эффект D-аспарагиновой кислоты в отношении выработки коллагена I типа в нормальных дермальных фибропластах человека.

На фиг.2 графически показан эффект D-аланина в отношении выработки коллагена I типа в нормальных дермальных фибропластах человека.

На фиг.3 графически показан эффект L- и D-аспарагиновой кислоты в отношении выработки коллагена I типа в нормальных дермальных фибропластах человека.

На фиг.4 графически показан эффект L- и D-аланина в отношении выработки коллагена I типа в нормальных дермальных фибропластах человека.

На фиг.5 графически показан эффект D-аспарагиновой кислоты и D-аланина в отношении выработки ателоколлагена I типа в нормальных дермальных фибропластах человека.

На фиг.6 графически показан эффект D-аланина в отношении выработки ателоколлагена I типа в нормальных дермальных фибропластах человека.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0032]

Описанные ниже примеры по настоящему изобретению предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения его объема. Объем настоящего изобретения ограничен только пунктами формулы изобретения.

[0033]

Все ссылки, приведенные в настоящем документе, включены посредством ссылки полностью.

Пример 1

[0034]

Способствующий выработке коллагена эффект D-аспарагиновой кислоты

Способы

Клеточная культура

Использовали коммерчески доступные человеческие неонатальные дермальные фибробласты (Cryo NHDF-Neo, производство Sanko Junyaku Co., Ltd.). Клетки инокулировали в коммерчески доступном 24-луночном планшете при 2×10⁵ клеток на лунку. Клетки культивировали в течение четырех часов в коммерчески доступной среде для клеточных культур (D-MEM (глюкоза 1 г/л), производство Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), к которой добавляли 10%-ную фетальную бычью сыворотку (именуемая в дальнейшем как “стандартная среда”) в атмосфере 5% CO₂ и насыщенного водяного пара при температуре 37°C (градусы Цельсия).

[0035]

Добавление аминокислот

Далее, среду заменяли на коммерчески доступную среду для клеточных культур (D-MEM (глюкоза 1 г/л), производство Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина (именуемая в дальнейшем “среда с низким содержанием сыворотки”) и культивировали в течение приблизительно одного дня в 5% CO₂ и насыщенного водяного пара при 37°C (градусы Цельсия). D-аспарагиновую кислоту (производство Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 018-04821) добавляли к среде с низким содержанием сыворотки с получением концентрации 0,01 мкМ (микромолярная), 0,1 мкМ (микромолярная), 10 мкМ (микромолярная), 100 мкМ (микромолярная) или 320 мкМ (микромолярная). В качестве положительного контроля, L-аскорбилфосфат магния (н-гидрат магниевой соли фосфата L-аскорбиновой кислоты, именуемый в дальнейшем “APM”, производство Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 013-19641) добавляли к среде с низким содержанием сыворотки с получением концентрации 150 мкМ (микромолярная), 250 мкМ (микромолярная), или 500 мкМ (микромолярная). Кроме того, вышеописанную среду с низким содержанием сыворотки, к которой не добавляли ни APM, ни D-аспарагиновую кислоту, использовали в качестве отрицательного контроля.

[0036]

Количественный анализ выработки коллагена I типа

После завершения культивирования клеток в течение двух дней супернатант культуры собирали и измеряли концентрацию C-концевого пептида проколлагена I типа (именуемый в дальнейшем “PIP”), полученного посредством человеческих неонатальных дермальных фибробластов, используя набор для EIA C-пептида проколлагена I (производство Takara Bio Inc.), в соответствии с инструкцией производителя.

[0037]

Количественные показатели результатов

На фиг.1 представлены результаты экспериментального исследования эффекта добавления D-аспарагиновой кислоты в отношении выработки коллагена I типа в человеческих неонатальных дермальных фибробластах. Величины ошибок для каждого экспериментального условия указывают на стандартные отклонения экспериментально измеренных значений, полученных повторением эксперимента четыре-шесть раз в одинаковых условиях. Кроме того, двойная звездочка (**) показывает, что p меньше чем 1% по тесту Бонферрони/Данна.

[0038]

Концентрация PIP составляла 583 нг/мл в отрицательном контроле. После добавления APM при концентрации 150 мкМ (микромолярная), 250 мкМ (микромолярная) и 500 мкМ (микромолярная) (т.е. положительные контроли), концентрации PIP повышались до 1183 нг/мл, 1666 нг/мл и 1416 нг/мл, соответственно. После добавления D-аспарагиновой кислоты при концентрации 0,01 мкМ (микромолярная), 0,1 мкМ (микромолярная), 10 мкМ (микромолярная), 100 мкМ (микромолярная) и 320 мкМ (микромолярная) концентрации PIP составляли 1286 нг/мл, 1159 нг/мл, 1117 нг/мл, 1119 нг/мл и 1007 нг/мл, соответственно. Таким образом, по сравнению с отрицательным контролем, среда с добавлением APM или D-аспарагиновой кислоты показала статистически значимый эффект усиления выработки коллагена I типа при всех концентрациях. Кроме того, эффект усиления выработки коллагена I типа посредством D-аспарагиновой кислоты при концентрациях от 0,01 мкМ (микромолярная) до 100 мкМ (микромолярная) был аналогичен эффекту, полученному при использовании APM при нижней концентрации, т.е. 150 мкМ (микромолярная), и, соответственно, это показывает, что D-аспарагиновая кислота имеет заметно более действенный эффект усиления выработки коллагена I типа, чем APM.

Пример 2

[0039]

Эффект стимулирования выработки коллагена посредством D-аланина

Способы

Клеточную культуру, добавление аминокислот и количественный анализ выработки коллагена I типа выполняли способом, аналогичным описанному в примере 1. В качестве аминокислоты использовали D-аланин (производство Peptide Institute, Inc., 2801) при концентрации 0,01 мкМ (микромолярная), 0,1 мкМ (микромолярная), 10 мкМ (микромолярная), 1000 мкМ мкМ (микромолярная) и 17400 мкМ (микромолярная). Кроме того, в качестве отрицательного контроля использовали описанную выше среду с низким содержанием сыворотки, к которой не добавляли ни APM, ни D-аланин.

[0040]

Результаты количественного анализа

На фиг.2 представлены результаты экспериментального исследования эффекта добавления D-аланина в отношении выработки коллагена I типа в неонатальных дермальных фибробластах человека. Величины ошибок для каждого экспериментального условия указывают на стандартные отклонения экспериментально измеренных значений, полученных повторением эксперимента четыре-шесть раз в одинаковых условиях. Звездочка (*) показывает, что p меньше чем 5% по тесту Бонферрони/Данна. Двойная звездочка (**) показывает, что p меньше чем 1% по тесту Бонферрони/Данна.

[0041]

Концентрация PIP составляла 551 нг/мл в отрицательном контроле. После добавления APM при концентрации 150 мкМ (микромолярная), 250 мкМ (микромолярная) и 500 мкМ (микромолярная) (т.е. положительные контроли) концентрации PIP повышались до 1183 нг/мл, 1666 нг/мл и 1416 нг/мл, соответственно, иллюстрируя усиление выработки коллагена I типа. После добавления D-аланина при концентрации 0,01 мкМ (микромолярная), 0,1 мкМ (микромолярная), 10 мкМ (микромолярная), 1000 мкМ (микромолярная) и 17400 мкМ (микромолярная), концентрации PIP составляли 750 нг/мл, 789 нг/мл, 876 нг/мл, 823 нг/мл и 799 нг/мл, соответственно. Таким образом, по сравнению с отрицательным контролем, среда с добавлением APM или D-аланина демонстрировала статистически значимый эффект в отношении усиления выработки коллагена I типа при всех концентрациях.

Пример 3

[0042]

Эффект стимулирования выработки коллагена посредством L- и D-аспарагиновой кислоты

Способы

Клеточную культуру, добавление аминокислот и количественный анализ выработки коллагена I типа выполняли способом, аналогичным описанному в примере 1. В качестве аминокислот использовали 0,1 мкМ (микромолярная) D-аспарагиновой кислоты (производство Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 018-04821) и 0,1 мкМ (микромолярная) L-аспарагиновой кислоты (производство Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 013-04832). Кроме того, в качестве отрицательного контроля использовали вышеописанную среду с низким содержанием сыворотки, к которой не добавляли ни L-аспарагиновую кислоту, ни D-аспарагиновую кислоту.

[0043]

Количественные показатели результатов

На фиг.3 представлены результаты экспериментального исследования эффекта добавления L- и D-аспарагиновой кислоты в отношении выработки коллагена I типа в человеческих неонатальных дермальных фибробластах. Величины ошибок для каждого экспериментального условия указывают на стандартные отклонения экспериментально измеренных значений, полученных повторением эксперимента шесть-двенадцать раз в одинаковых условиях. Двойная звездочка (**) показывает, что p меньше чем 1% по тесту Бонферрони/Данна.

[0044]

Концентрация PIP составляла 361 нг/мл в отрицательном контроле. После добавления L-аспарагиновой кислоты и D-аспарагиновой кислоты при концентрации 0,1 мкМ (микромолярная), концентрация PIP составляла 406 нг/мл и 456 нг/мл, соответственно. Основываясь на этих результатах, обнаружили, что выработка коллагена I типа статистически значимо усиливается при добавлении 0,1 мкМ (микромолярная) D-аспарагиновой кислоты, но не при добавлении 0,1 мкМ (микромолярная) L-аспарагиновой кислоты.

Пример 4

[0045]

Эффект стимулирования выработки коллагена посредством L- и D-аланина

Способы

Клеточную культуру, добавление аминокислот и количественный анализ выработки коллагена I типа выполняли способом, аналогичным описанному в примере 1. В качестве аминокислот использовали 0,1 мкМ (микромолярная) или 150 мкМ (микромолярная) D-аланина (производство Peptide Institute, Inc., 2801) и 0,1 мкМ (микромолярная) или 150 мкМ (микромолярная) L-аланина (производство Peptide Institute, Inc., 2701). Кроме того, в качестве отрицательного контроля использовали вышеописанную среду с низким содержанием сыворотки, к которой не добавляли ни L-аланин, ни D-аланин.

[0046]

Количественные показатели результатов

На фиг.4 представлены результаты экспериментального исследования эффекта добавления L- и D-аланина в отношении выработки коллагена I типа в человеческих неонатальных дермальных фибробластах. Величины ошибок для каждого экспериментального условия указывают на стандартные отклонения экспериментально измеренных значений, полученных повторением эксперимента шесть-двенадцать раз в одинаковых условиях. Звездочка (*) и двойная звездочка (**) указывают, что p меньше чем 5% и меньше чем 1%, соответственно, по тесту Бонферрони/Данна.

[0047]

Концентрация PIP составляла 361 нг/мл в отрицательном контроле. После добавления D-аланина при концентрации 0,1 мкМ (микромолярная) и 150 мкМ (микромолярная) концентрации PIP составляли 502 нг/мл и 450 нг/мл, соответственно. После добавления L-аланина при концентрации 0,1 мкМ (микромолярная) и 150 мкМ (микромолярная) концентрации PIP составляли 405 нг/мл и 413 нг/мл, соответственно. На основе этих результатов обнаружили, что выработка коллагена I типа статистически значимо усиливается при добавлении 0,1 мкМ (микромолярная) или 150 мкМ (микромолярная) D-аланина, но не при добавлении 0,1 мкМ (микромолярная) или 150 мкМ (микромолярная) L-аланина.

Пример 5

[0048]

Эффект стимулирования выработки коллагена посредством D-аспарагиновой кислоты и D-аланина

Способы

Клеточную культуру и добавление аминокислот выполняли способом, аналогичным описанному в примере 1. В качестве аминокислот использовали 0,1 мкМ (микромолярная) D-аспарагиновой кислоты (производство Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 018-04821) и 0,1 мкМ (микромолярная) или 0,001 мкМ (микромолярная) D-аланина (производство Peptide Institute, Inc., 2801). Кроме того, в качестве отрицательного контроля использовали вышеописанную среду с низким содержанием сыворотки, к которой не добавляли ни D-аспарагиновую кислоту, ни D-аланин. В качестве положительного контроля к вышеописанной среде с низким содержанием сыворотки добавляли APM с получением концентрации 250 мкМ (микромолярная). Для оценки количества выработки коллагена I типа проколлаген I типа и тропоколлаген, продуцированные человеческими неонатальными дермальными фибробластами, обрабатывали пепсином (800-2500 единица/мг, P7000, производство SIGMA), и концентрацию ателоколлагена I типа измеряли посредством анализа ELISA с использованием человеческого коллагена I типа (EC1-E105, производство AC Biotechnologies) в соответствии с инструкцией производителя.

[0049]

Количественные показатели результатов (1)

На фиг.5 представлены результаты экспериментального исследования эффекта добавления D-аспарагиновой кислоты и D-аланина в отношении выработки ателоколлагена I типа в человеческих неонатальных дермальных фибробластах. Величины ошибок для каждого экспериментального условия указывают на стандартные отклонения экспериментально измеренных значений, полученных повторением эксперимента пять-шесть раз в одинаковых условиях. Звездочка (*) и двойная звездочка (**) указывают, что p меньше чем 5% и меньше чем 1%, соответственно, по тесту Бонферрони/Данна.

[0050]

Концентрация ателоколлагена I типа составляла 1,8 мкг (микрограмм)/мл в отрицательном контроле. После добавления APM при концентрации 250 мМ (т.е. положительный контроль) концентрация ателоколлагена I типа повышалась до 3,9 мкг (микрограмм)/мл, демонстрируя усиление выработки коллагена I типа. После добавления D-аланина при концентрации 0,1 мкМ (микромолярная) концентрация ателоколлагена I типа составляла 4,0 мкг (микрограмм)/мл. После добавления D-аспарагиновой кислоты при концентрации 0,1 мкМ (микромолярная) концентрация ателоколлагена I типа составляла 3,8 мкг (микрограмм)/мл. На основе этих результатов обнаружили, что выработка коллагена I типа статистически значимо усиливается при добавлении 0,1 мкМ (микромолярная) D-аспарагиновой кислоты или D-аланина.

[0051]

Количественные показатели результатов (2)

На фиг.6 представлены результаты экспериментального исследования эффекта добавления D-аланина на выработку ателоколлагена I типа в человеческих неонатальных дермальных фибробластах. Величины ошибок для каждого экспериментального условия указывают на стандартные отклонения экспериментально измеренных значений, полученных повторением эксперимента два раза в одинаковых условиях.

[0052]

Концентрация ателоколлагена I типа составляла 1,7 мкг (микрограмм)/мл в отрицательном контроле. После добавления APM при концентрации 250 мМ (т.е. положительный контроль) концентрация ателоколлагена I типа повышалась до 2,6 мкг (микрограмм)/мл, демонстрируя усиление выработки коллагена I типа. После добавления D-аланина при концентрации 0,001 мкМ (микромолярная) концентрация ателоколлагена I типа составляла 2,1 мкг (микрограмм)/мл.

Пример 6

[0053]

Примеры составов композиции, содержащие D-аспарагиновую кислоту и/или D-аланин в соответствии с настоящим изобретением, т.е. эмульсионный препарат, пластырь, таблетка, мягкая капсула, гранула, напиток, конфета, печенье, ореховая паста, французская приправа, майонез, французский хлеб, соевый соус, йогурт, сухая приправа для риса, приправа/соус для натто, натто, неочищенный черный уксус, крем, крем для тела, гель, пиллинговая маска, влажное обертывание, эмульсия, лосьон для кожи и аэрозольный препарат, приведены ниже. Все указанные образцы составов являются иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

[0054]

[0055]

[0056]

[0057]

[0058]

[0059]

[0060]

[0061]

[0062]

[0063]

[0064]

[0065]

[0066]

[0067]

Способ получения образца состава 13 (Печенье)

Гранулированный сахар по частям добавляют к животному маслу при перемешивании, добавляют яйца, D-аспарагиновую кислоту и/или D-аланин и отдушку и перемешивают. После энергичного смешивания добавляют однородно просеянную слабую муку и перемешивают с небольшой скоростью и оставляют выдерживаться в виде объемной массы в холодильнике. Затем формуют и выпекают в течение 15 минут при температуре 170°C (градусы Цельсия) с получением печенья.

[0068]

[0069]

Способ получения образца композиции 14 (Ореховая паста)

Солодовый рис тщательно смешивали с солью. Промытые соевые бобы замачивали в течение ночи в трехкратном избытке по объему воды, которую затем сливали и добавляли свежую воду при кипячении и выливали в дуршлаг, собирая отвар (бульон для tanemizu), в котором растворяли D-аспарагиновую кислоту и/или D-аланин в количестве 10% масс./об. Пропаренные бобы сразу разминали, объединяли с солодовым рисом, смешанным с солью, в который добавляли бульон для tanemizu, содержащий растворенную в нем D-аспарагиновую кислоту и/или D-аланин, и однородно смешивали с получением глиноподобного продукта. Запекали и плотно наполняли в контейнер без образования каких-либо пустот и поверхность содержимого разравнивали и герметически закрывали пластиковой пленкой. Спустя три месяца содержимое переносили в новый контейнер и поверхность разравнивали и герметически закрывали пластиковой пленкой. Вместо добавления D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина в бульон tanemizu может быть использован солодовый рис, вырабатывающий большое количество D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина. Такой солодовый рис может быть выбран путем определения количества D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина с помощью способа, описанного в публикации не прошедшего экспертизу патента № 2008-185558. Альтернативно, коммерчески доступная ореховая паста может быть дополнена D-аспарагиновой кислотой и/или D-аланином или их солью.

[0070]

[0071]

[0072]

Способ получения образца композиций 15 и 16 (Французская приправа)

Уксус объединяли с хлоридом натрия и D-аспарагиновой кислотой или D-аланином и затем тщательно перемешивали до растворения. В смесь добавляли салатное масло, и смесь тщательно перемешивали и потом добавляли перец.

[0073]

[0074]

[0075]

Способ получения образца композиций 17 и 18 (майонез)

Яичный желток (комнатная температура) объединяли с уксусом, хлоридом натрия, D-аспарагиновой кислотой или D-аланином и перцем и тщательно перемешивали, используя взбивалку. Перемешивание продолжали, добавляя по частям салатное масло до образования эмульсии. Наконец, добавляли сахар и смесь перемешивали.

[0076]

[0077]

[0078]

Способ получения образца композиций 19 и 20 (Французский хлеб)

Теплую воду смешивали с 1 г сахара и сухими дрожжами, затем оставляли подвергаться предварительной ферментации. Муку из твердых сортов пшеницы, слабую муку, хлорид натрия, 5 г сахара и D-аспарагиновую кислоту или D-аланин помещали в миску, в которой были предварительно ферментированные дрожжи. После тщательно замешивания теста в шар проводили первичную ферментацию при температуре 30°C (градусы Цельсия). Тесто опять замешивали и оставляли выдерживаться и затем придавали соответствующую форму, которую подвергали конечной ферментации, используя электронное оборудование для ферментации. После формования нарезок выпечку осуществляли в течение 30 минут в печи при температуре 220°C (градусы Цельсия).

[0079]

[0080]

[0081]

Способ получения образца композиций 21 и 22 (Соевый соус)

В коммерчески доступный соевый соус добавляли D-аспарагиновую кислоту или D-аланин и тщательно перемешивали. Вместо добавления D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина или их соли для ферментации соевого соуса может быть использован солодовый рис, вырабатывающий большое количество D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина. Такой солодовый рис может быть выбран путем определения количества D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина с помощью способа, описанного в публикации не прошедшего экспертизу патента № 2008-185558.

[0082]

[0083]

[0084]

Способ получения образца композиции 23 и 24 (Йогурт)

Ферментацию проводят при температуре от 40 до 45°C (градусы Цельсия). Может быть использована другая коммерчески доступная микрофлора для ферментации семян и в коммерчески доступный йогурт может быть добавлена D-аспарагиновая кислота или D-аланин. Вместо добавления D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина или их соли может быть использована микрофлора семенного материала, вырабатывающая большое количество D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина. Такая микрофлора может быть выбрана путем определения количества D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина с помощью способа, описанного в публикации не прошедшего экспертизу патента № 2008-185558.

[0085]

[0086]

[0087]

[0088]

[0089]

Способ получения образца композиции 28 (Натто)

Вместо добавления D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина или их соли для выработки натто может быть использована микрофлора, вырабатывающая большое количество D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина. Такая микрофлора может быть выбрана путем определения количества D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина с помощью способа, описанного в публикации не прошедшего экспертизу патента № 2008-185558.

[0090]

[0091]

[0092]

Способ получения образца композиции 29 и 30 (Неочищенный черный уксус)

Вместо добавления D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина или их соли для выработки уксуса, черного уксуса или неочищенного уксуса может быть использована микрофлора семенного материала, вырабатывающая большое количество D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина. Такая микрофлора может быть выбрана путем определения количества D-аспарагиновой кислоты и/или D-аланина с помощью способа, описанного в публикации не прошедшего экспертизу патента № 2008-185558.

[0093]

[0094]

[0095]

[0096]

[0097]

[0098]

[0099]

[0100]

[0101]

[0102]

[0103]

[0104]

[0105]

[0106]

[0107]

[0108]

[0109]

[0110]

[0111]

[0112]

[0113]

[0114]

Способ наполнения образцом композиции 51 (Аэрозольный спрей на основе мочевины)

Основным раствором аэрозольного препарата на основе мочевины для внешнего применения и диметиловым эфиром наполняли аэрозольный алюминиевый баллон под давлением, наружная поверхность которого покрыта тефлоном (зарегистрированная торговая марка) для изготовления аэрозольного препарата.

Реферат

Изобретение относится к косметической промышленности и представляет собой композицию, способствующую выработке коллагена I типа в дермальных фибробластах человека, содержащую одно или несколько соединений, выбранных из группы, состоящей из D-аспарагиновой кислоты, D-аланина и/или их солей, и одну или несколько фармацевтически приемлемых добавок. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств, способствующих выработке коллагена I типа в дермальных фибробластах человека. 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 пр.

Формула