Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами - RU2016132974A

1. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина, включающий следующие стадии:

(а): создание изменения в одном или более положений в родительском полипептиде, обладающем активностью химозина, где изменение включает замену, делецию или инсерцию по меньшей мере в одном аминокислотном положении, соответствующем любому из положений 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 и 379; и

(б): продуцирование и выделение измененного полипептида стадии (а) и, таким образом, получение выделенного варианта полипептида химозина, где вариант обладает активностью химозина;

и где:

(1): аминокислотное положение родительского полипептида определяют путем выравнивания родительского полипептида с полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), т.е. полипептид с SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей аминокислотной последовательности в родительском полипептиде; и

(2): родительский полипептид обладает по меньшей мере 65%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), который находится от аминокислотного положения 59 до аминокислотного положения 381 SEQ ID NO: 1;

и при условии, что выделенный вариант полипептида химозина НЕ представляет собой конкретный вариант, выбранный из группы, состоящей из:

Q246E+G309D+S329P+D337E;

R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T;

Y185F+R213Q+Q246E;

V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;

G128D+L188I+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F;

D117N+V261A+R312S;

D216S+L224V+V263I+F281V+G309D;

Y79S+L224V+L311I; и

R119S+L224V+T297S.

2. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 1, где выделенный вариант полипептида химозина обладает:

- активностью химозина, обеспечивающей повышенное отношение С (удельная свертывающая активность)/Р(протеолитическая активность) по сравнению с отношением С/Р бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1; и

- активностью химозина, обеспечивающей повышенное отношение С/Р по сравнению с отношением С/Р верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2.

3. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 1, где изменение включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении, и где замена представляет собой L70M; F75Y; К77Т; Y79S; V90L; D102N; I103V; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; L163E; S212A; М223Е; L224V; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; R312D,E,S,T,N,Q; Е320Т; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; 1361L; V367I; или K379P.

4. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 3, где замена представляет собой Q246E; K279V; R300Q; R312S; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q или K336Q.

5. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 1, где изменение включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении, и где замена представляет собой:

H134Q+Q246E+Y326F;

D117N+L280I+G309D;

H134Q+D156V+G309D;

D156V+Q246E+L280I;

D117N+H134Q+L280I;

D156V+G309D+Y326F;

D117N+D156V+D325M;

L280I+D325M+Y326F;

D117N+Q246E+Y326F;

D117N+H134Q+D325M;

N310Q+N349Q+K279V;

R300Q+N307D;

N307D+G309D;

N307D+R312S;

R300Q+K336Q;

N307D+K336Q;

G309D+R312S;

R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;

N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;

L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q;

L280I+G309D+L224V+E320T+T235S;

L280I+G309W+K77T+R324I;

L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;

L280I+G309D+V213F+E320T+V90L;

L280I+G309D+Q220S+L224V+H134Q;

L280I+G309W+L238I+T342S;

L280I+G309W+F75Y+Y79S;

L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E;

L280I+G309D+L224V+I103V+L238I;

L280I+G309D+F124Y+Q346E+I154L;

L280I+G309D+I154L+V261A+V367I;

L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M;

L280I+G309D+Y79S+T342S+I154L;

L280I+G309D+Y79S+I103V+F281A;

L280I+G309D+V256I+V261A+K379P;

L280I+G309D+Q346E+K77T+T235S;

L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q;

L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;

L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309W+S212A+V261A;

L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F;

L280I+G309D+K120Q+М223Е+H239N;

L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q;

L280I+G309W+L238I+T342S;

L280I+G309D+V213F+Е320Т+V90L;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;

L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A;

L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309W+L238I+T342S;

L280I+G309D+V213F+Е320Т+V90L; или

L280I+G309W+S212A+V261A.

6. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 1-5, где родительский полипептид обладает по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин).

7. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 1-5, где родительский полипептид обладает по меньшей мере 95%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин), который находится от аминокислотного положения 59 до аминокислотного положения 381 SEQ ID NO: 2.

8. Выделенный вариант полипептида химозина, полученный способом по любому из пп. 1-7.

9. Выделенный вариант полипептида химозина, содержащий:

(а): изменение в одном или более положений в родительском полипептиде, обладающем активностью химозина, где изменение включает замену, делецию или инсерцию по меньшей мере в одном аминокислотном положении, соответствующем любому из положений 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 и 379; и

(б): где вариант обладает активностью химозина;

и где

(1): аминокислотное положение родительского полипептида определяют путем выравнивания родительского полипептида с полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), т.е. полипептид с SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей аминокислотной последовательности в родительском полипептиде; и

(2): родительский полипептид обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), который находится от аминокислотного положения 59 до аминокислотного положения 381 SEQ ID NO: 1; и

(3): выделенный вариантный полипептид обладает менее чем 100%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин);

и при условии, что выделенный вариант полипептида химозина НЕ представляет собой конкретный вариант, выбранный из группы, состоящей из:

Q246E+G309D+S329P+D337E;

R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T;

Y185F+R213Q+Q246E;

V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;

G128D+L188I+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F; и

D117N+V261A+R312S;

D216S+L224V+V263I+F281V+G309D

Y79S+L224V+L311I и

R119S+L224V+T297S; и

где выделенный вариант обладает активностью химозина, обеспечивающей повышенное отношение С/Р по сравнению с отношением С/Р бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид с SEQ ID NO: 1.

10. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 9, где родительский полипептид обладает по меньшей мере 97%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин); и

где выделенный вариант бычьего химозина содержит менее 10 изменений аминокислот (например, замен) по сравнению со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин).

11. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 9-10, где изменение включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении, и где замена представляет собой L70M; F75Y; К77Т; Y79S; V90L; D102N; 1103V; N108D; D117N; F114Y; K120Q; F124Y; H134Q; I154L; D156V; L163E; S212A; S222G; М223Е; L224V; D325Q; L238I; Q246E; V256I; V261A; K279V; L280I; F281A; R300D,E,S,T,N,Q; G309D,W; R312D,E,S,T,N,Q; Е320Т; R324V; Y326F; K336D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; S331Y; Q346E; I361L; V367I; или K379P.

12. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 9-10, где изменение включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении, и где замена представляет собой:

H134Q+Q246E+Y326F;

D117N+L280I+G309D;

H134Q+D156V+G309D;

D156V+Q246E+L280I;

D117N+H134Q+L280I;

D156V+G309D+Y326F;

D117N+D156V+D325M;

L280I+D325M+Y326F;

D117N+Q246E+Y326F;

D117N+H134Q+D325M;

N310Q+N349Q+K279V;

R300Q+N307D;

N307D+G309D;

N307D+R312S;

R300Q+K336Q;

N307D+K336Q;

G309D+R312S;

R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;

N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;

L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q;

L280I+G309D+L224V+Е320Т+T235S;

L280I+G309W+К77Т+R324I;

L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;

L280I+G309D+V213F+Е320Т+V90L;

L280I+G309D+Q220S+L224V+H134Q;

L280I+G309W+L238I+T342S;

L280I+G309W+F75Y+Y79S;

L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E;

L280I+G309D+L224V+I103V+L238I;

L280I+G309D+F124Y+Q346E+I154L;

L280I+G309D+I154L+V261A+V367I;

L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M;

L280I+G309D+Y79S+T342S+I154L;

L280I+G309D+Y79S+I103V+F281A;

L280I+G309D+V256I+V261A+K379P;

L280I+G309D+Q346E+K77T+T235S;

L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q;

L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;

L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q;

L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M;

L280I+G309W+S212A+V261A;

L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F;

L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N;

L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q;

L280I+G309W+L238I+T342S;

L280I+G309D+V213F+Е320Т+V90L;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;

L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A;

L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309W+L238I+T342S;

L280I+G309D+V213F+Е320Т+V90L; или

L280I+G309W+S212A+V261A.

13. Выделенный вариант полипептида химозина, содержащий:

(а): изменение в одном или более положений в родительском полипептиде, обладающем активностью химозина, где изменение включает замену, делецию или инсерцию по меньшей мере в одном аминокислотном положении, соответствующем любому из положений 70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223; 224; 238; 246; 256; 261; K279V; L280; F281; R300D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; G309; R312D,E,S,T,N,Q,C,U,G,P,A,V,I,L,M,F,Y,W; 320; 324; D325Q; 326; 331; 336; 346; 361; 367 и 379; и

(б): где вариант обладает активностью химозина;

и где

(1): аминокислотное положение родительского полипептида определяют путем выравнивания родительского полипептида с полипептидом с SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), т.е. полипептид с SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей аминокислотной последовательности в родительском полипептиде; и

(2): родительский полипептид обладает по меньшей мере 90%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин), который находится от аминокислотного положения 59 до аминокислотного положения 381 SEQ ID NO: 2; и

(3): выделенный вариантный полипептид обладает менее чем 100%-ной идентичностью последовательности со зрелым полипептидом с SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин);

и при условии, что выделенный вариант полипептида химозина НЕ представляет собой конкретный вариант, выбранный из группы, состоящей из:

Q246E+G309D+S329P+D337E;

R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T;

Y185F+R213Q+Q246E;

V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;

G128D+L188I+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F;

G128N+R312S+S313Y+Y326F;

D117N+V261A+R312S;

D216S+L224V+V263I+F281V+G309D;

Y79S+L224V+L311I; и

R119S+L224V+T297S; и

где выделенный вариант обладает активностью химозина, обеспечивающей повышенное отношение С/Р по сравнению с отношением С/Р верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид с SEQ ID NO: 2.

14. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 13, где изменение включает замену по меньшей мере в одном аминокислотном положении, и где замена представляет собой:

H134Q+Q246E+Y326F;

D117N+L280I+G309D;

H134Q+D156V+G309D;

D156V+Q246E+L280I;

D117N+H134Q+L280I;

D156V+G309D+Y326F;

D117N+D156V+D325M;

L280I+D325M+Y326F;

D117N+Q246E+Y326F;

D117N+H134Q+D325M;

N310Q+N349Q+K279V;

R300Q+N307D;

N307D+G309D;

N307D+R312S;

R300Q+K336Q;

N307D+K336Q;

G309D+R312S;

R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q; или

N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;

L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q;

L280I+G309D+L224V+Е320Т+T235S;

L280I+G309W+К77Т+R324I;

L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;

L280I+G309D+V213F+Е320Т+V90L;

L280I+G309D+Q220S+L224V+H134Q;

L280I+G309W+L238I+T342S;

L280I+G309W+F75Y+Y79S;

L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E;

L280I+G309D+L224V+I103V+L238I;

L280I+G309D+F124Y+Q346E+I154L;

L280I+G309D+I154L+V261A+V367I;

L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309D+Y79S+T342S+I154L;

L280I+G309D+Y79S+1103V+F281A;

L280I+G309D+V256I+V261A+K379P;

L280I+G309D+Q346E+K77T+T235S;

L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q;

L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;

L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q;

L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M;

L280I+G309W+S212A+V261A;

L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F;

L280I+G309D+K120Q+М223Е+H239N;

L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q;

L280I+G309W+L238I+T342S;

L280I+G309D+V213F+Е320Т+V90L;

L280I+G309D+L70M+T342S;

L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;

L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A;

L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F;

L280I+G309D+H134Q+М223Е+L70M;

L280I+G309W+L238I+T342S;

L280I+G309D+V213F+Е320Т+V90L; или

L280I+G309W+S212A+V261A.

15. Способ изготовления пищевого или кормового продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 8-14 к пищевому(ым) или кормовому(ым) ингредиенту(ам) и осуществление дальнейших этапов производства с получением пищевого или кормового продукта; и

где продукт представляет собой продукт на основе молока, и где способ включает добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 8-14 к молоку и осуществление дальнейших этапов производства с получением продукта на основе молока; и

где молоко представляет собой соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, молоко буйволиц, молоко яков, молоко лам, верблюжье молоко или коровье молоко; и

где продукт на основе молока представляет собой кисломолочный продукт, творог или сыр.