Способ ингибирования образования биопленки термофильных микроорганизмов на поверхности машин для изготовления бумаги и картона - RU2331193C2

Описание

Изобретение относится к способу ингибирования на поверхностях машин для изготовления бумаги и картона биопленки, которую образуют термофильные бактерии, и/или плесени, и которая препятствует технологическому процессу. Изобретение также относится к способу определения необходимости дозирования агента, противодействующего образованию биопленки, в технологический процесс изготовления бумаги и картона, и к набору оборудования, пригодному для этого определения.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ И ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Среда в машине для изготовления бумаги (так называемой бумагоделательной машине) благоприятна для размножения различных микроорганизмов. Вода, содержащаяся в машине для изготовления бумаги, обеспечивает микроорганизмы питательными веществами, в которых они нуждаются, имеет подходящий рН (от 4 до 9) и температуру (от 45 до 60°С). Микроорганизмы проникают в процесс совместно с сырьевыми материалами, такими как древесная масса, химикаты и вода. Свободно плавающие микроорганизмы не так вредны для технологического процесса, как микроорганизмы, которые присоединяются к поверхностям машины для изготовления бумаги и образуют биопленки. Смывание биопленок с поверхностей машины для изготовления бумаги затруднено и часто требует использования сильнодействующих химикатов. Микроорганизмы, живущие в биопленке, более устойчивы к биоцидным веществам, чем свободно плавающие микроорганизмы. При спонтанном отделении от поверхностей биопленки могут закупоривать фильтры, вызывать обрывы бумажного полотна и ухудшать качество бумаги, например, из-за образования отверстий или пятен. В отсутствие обрастания поверхностей биопленками работоспособность и, следовательно, производительность машин для изготовления бумаги может значительно повыситься по сравнению с настоящим временем.

Согласно последним исследованиям (М. Kolari, J. Nuutinen and M.S. Salkinoja-Salonen, Mechanism of biofilm formation in paper machines by Bacillus species: the role of Deinococcus geothermalis, Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology (2001), pp.343-351), важным фактором в образовании биопленки является так называемая первично адгезивная бактерия (Deinococcus geothermalis), которая может индуцировать образование биопленки. Эта бактерия широко распространена в машинах для изготовления бумаги. Поэтому предотвращение адгезии этой бактерии к стальным поверхностям может снизить образование биопленки, которое оказывает неблагоприятное влияние на работу машин для изготовления бумаги.

Марко Колари (Academic Dissertation in Microbiology: Attachment Mechanisms and Properties of Bacterial Biofilms on Non-living Surfaces, Dissertationes Biocentri Viikki Universitatis Helsingiensis 12/2003, тезисы докторской диссертации, Хельсинкский Университет) исследовал, например, присутствие и взаимодействия в биопленках некоторых микроорганизмов, таких как Deinococcus geothermalis, образующих биопленку и обнаруживаемых в процессах изготовления бумаги, а также воздействие питательных веществ и химикатов на эти микроорганизмы. Как правило, в исследованиях были использованы чистые культуры выделенных микроорганизмов.

В Патенте США 6,267,897 В описан способ предотвращения образования биопленки в коммерческих и промышленных системах водоснабжения посредством добавления в систему эфирного масла. В качестве примеров систем водоснабжения в публикации названы, среди прочих, системы, использующие воду для охлаждения, системы водоснабжения в пищевой промышленности, системы, содержащие целлюлозную массу и бумажную массу, аппаратуру для пастеризации на пивоваренных заводах, системы снабжения пресной водой и т.п. В этой патентной публикации описан анализ (тест), с помощью которого исследуют образование на стеклянных поверхностях биопленки микроорганизмом Sphaerotilus natans - мезофильным слизеобразующим микроорганизмом, который часто встречается на бумажных фабриках. Результаты анализа показывают, что эвкалиптовое масло, масло кассии и масло чайного дерева препятствуют прикреплению исследованных бактерий к стеклянным поверхностям более эффективно, чем сополимер этиленоксида и пропиленоксида, который был использован в качестве соединения сравнения. Согласно этой патентной публикации, эвкалиптовое масло и масло кассии, которые являются коммерческими лекарственными препаратами, являются особенно полезными эфирными маслами, которые, как хорошо известно, получают посредством паровой дистилляции. Другие эфирные масла, описанные в этой патентной публикации, получают посредством паровой дистилляции или посредством отжима.

Вышеупомянутая мезофильная бактерия Sphaerotilus natans не обнаруживается в современных высокотемпературных машинах для изготовления бумаги, поскольку она не может расти при температурах в диапазоне от 50 до 60°С. Вместо нее, очень проблематичной бактерией в современных машинах для изготовления бумаги является Deinococcus geothermalis, которая растет при высоких температурах (максимально при 56-57°С). Другими проблематичными термофильными микроорганизмами являются адгезивные бактерии Meiothermus sivanus, Burkholderia cepacia и Thermomonas sp., а также адгезивная плесень Aspergillus fumigatus.

Более конкретно, настоящее изобретение направлено на предотвращение образования такой биопленки, которая включает в себя в качестве неотъемлемой части проблематичные термофильные микроорганизмы, которые растут в современных машинах для изготовления бумаги при высоких температурах (от 50 до 60°С).

Соответственно, целью изобретения является обеспечение метода и используемого в нем средства, которое можно эффективно применять для предупреждения образования термофильными микроорганизмами биопленки на поверхностях машин для изготовления бумаги и картона.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что можно найти благоприятный для окружающей среды, естественный и эффективный способ предупреждения образования биопленки соединениями, содержащимися в природных растениях, поскольку многие из этих соединений эффективно препятствуют росту микроорганизмов. Такие соединения важны для выживания растений в природе. Были выполнены лабораторные анализы, для которых было отобрано 110 соединений, непосредственно выделенных из растений, или синтетических производных соединений, для которых в других исследованиях было показано, что они оказывают биологическое воздействие, а также 92 натуральных экстракта из финских растений. При использовании наиболее эффективных из этих веществ можно снизить образование биопленки термофильными бактериями, за счет чего можно увеличить производительность машин для изготовления бумаги и картона. По результатам проведенных лабораторных исследований наиболее эффективные вещества снижают адгезию микроорганизмов биопленки к поверхностям более чем на 90%.

Таким образом, изобретение предусматривает способ, который можно использовать для предупреждения образования биопленки термофильными адгезивными микроорганизмами (бактериями и/или плесневыми грибками), обнаруживаемыми в машинах для изготовления бумаги и картона на поверхностях этих машин, и/или который можно использовать для удаления уже образованных вредных биопленок с упомянутых поверхностей. Этот способ характеризуется тем, что к циркуляционным водам машин для изготовления бумаги и картона добавляют, по меньшей мере, одно чистое вещество, выделенное из растения, или, по меньшей мере, один растительный экстракт, или их смесь в такой концентрации, которая эффективна против термофильных адгезивных микроорганизмов.

В контексте настоящего изобретения термин "чистое вещество" относится к натуральному веществу, выделенному из растения, или к его синтетическому эквиваленту или производному, которое, кроме того, должно эффективно препятствовать образованию термофильными микроорганизмами биопленки на поверхностях и/или быть способным удалять такие биопленки с поверхностей. Соответственно, растительный экстракт должен быть эффективным против образования термофильными микроорганизмами биопленки на поверхностях и/или быть способным к удалению таких биопленок с поверхностей. Биопленка должна уменьшаться, по меньшей мере, на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, на 70% и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 90%.

Указанный растительный экстракт может происходить от следующих растений или частей растений: японская роза, кипрей узколистный, лабазник дланевидный или шалфей. Растительный экстракт может быть получен посредством экстракции растения или его части растворителем или смесью растворителей. Предпочтительным растворителем является метанол. Другими растворителями, пригодными для экстракции, являются ацетон, этанол, гексан и хлороформ.

Указанное чистое вещество, выделенное из растения, или его синтетическое производное могут быть фенольными соединениями, например сложным эфиром фенольной кислоты. Предпочтительным сложным эфиром фенольной кислоты является алкильный эфир галловой кислоты, который предпочтительно является октилгаллатом, лаурилгаллатом или их смесью.

Чистое вещество, или растительный экстракт, или их смесь добавляют к циркуляционной воде машины для изготовления бумаги или картона до получения концентрации продукта в диапазоне от 1 до 1000 промилле, предпочтительно - от 5 до 200 промилле и наиболее предпочтительно - от 10 до 100 промилле из расчета сухой массы чистого вещества или растительного экстракта.

Чистое вещество, или растительный экстракт, или их смесь можно дозировать в циркуляционную воду машины для изготовления бумаги или картона либо периодически, предпочтительно - от 2 до 8 раз в день, либо в виде одной дозы один раз в день. Эти вещества или их смеси можно также дозировать в контейнер в высоких дозах, от 500 до 5000 промилле (в пересчете на сухое вещество), чтобы отделить различные бактерии, сцепленные с поверхностями контейнера, с помощью так называемой шоковой дозировки.

Согласно настоящему изобретению можно использовать неочищенные экстракты, полученные из упомянутых растений, или наиболее эффективные компоненты, выделенные из этих неочищенных экстрактов.

Изобретение также относится к применению указанного чистого вещества, выделенного из растения, или растительного экстракта, или их смеси для предупреждения образования термофильными адгезивными микроорганизмами (бактериями или плесневыми грибками), содержащимися в машинах для изготовления бумаги или картона, биопленки на поверхностях машин для изготовления бумаги или картона и/или для удаления таких биопленок с этих поверхностей.

Авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что в процессах, связанных с производством бумаги, можно вести текущий контроль за присутствием образующих биопленку адгезивных микроорганизмов, и что действие веществ, предотвращающих образование биопленки, так называемых антибиопленочных средств, на рассматриваемые адгезивные микроорганизмы можно определить прямо в образце, взятом из технологического процесса, с помощью способа, который включает стадии:

1) забора пробы из технологического процесса производства бумаги, например с поверхностей машин для изготовления бумаги и картона, из производственной воды или сырьевых материалов,

2) при необходимости - удаления из пробы любых свободных неорганических и/или органических материалов и суспендирования оставшейся части пробы в водном растворе,

3) встряхивания суспендированной пробы в устройстве для культивирования микроорганизмов с раствором питательного вещества и, по выбору, с антибиопленочным средством в течение 8-48 часов, предпочтительно 12-24 часов,

4) удаления из устройства питательного (ростового) раствора совместно с любым материалом, который может быть выделен совместно с раствором, например с планктонным материалом и бактериями биопленки, которые не были адекватно сцеплены с поверхностью, и окрашивания микроорганизмов, сцепленных со стенкой устройства, и

5) на основании окрашивания и его интенсивности - качественного и/или количественного определения присутствия адгезивных микроорганизмов в суспендированной пробе и, по выбору, в суспендированной пробе, обработанной антибиопленочным средством.

В контексте настоящего изобретения термин "антибиопленочное средство" в целом относится к средству, которое обладает активностью в отношении снижения или предупреждения роста микроорганизмов, в частности - в отношении образования биопленок или агломератов, образуемых адгезивными микроорганизмами в технологических процессах производства бумаги или картона. Этот термин относится, в частности, к биоцидным веществам, известным в бумажной промышленности, а также к веществам растительного происхождения, используемым в настоящем изобретении, таким как чистые вещества, выделенные из растений, растительные экстракты, их смеси и их синтетические эквиваленты.

Соответственно, на основании результатов использования данного способа, то есть окрашивания и его интенсивности, можно определить и оценить необходимость добавления, то есть дозирования, антибиопленочного средства в технологический процесс до и/или после добавления антибиопленочного средства; другими словами - определить, следует ли добавить и/или повторно добавить какое-либо антибиопленочное средство в процесс. Особенно предпочтительно, если определение производится с целью мониторинга присутствия микроорганизмов, образующих биопленку, в процессе до и/или после добавления антибиопленочного средства растительного происхождения согласно настоящему изобретению.

В следующем предпочтительном примере осуществления изобретения определение производится с целью выбора средства, то есть антибиопленочного средства, предпочтительно - чистого вещества, выделенного из растения, или растительного экстракта, или их смеси, пригодного для предупреждения образования биопленки в рассматриваемом процессе и/или для определения концентрации антибиопленочного средства, необходимой для эффективного предупреждения образования биопленки.

На стадии (1) способа определения пробами в типичном случае являются пробы слизи или биопленки/отложений, взятые из производственной воды или отделенные со стенок оборудования.

Согласно настоящему изобретению любой свободный неорганический и/или органический материал удаляют из пробы до начала собственно анализа, например, посредством фильтрования и/или промывки. В предпочтительном примере осуществления изобретения пробой является, например, проба отложений на стенках, которую на стадии (2) промывают для удаления любого микробного материала, который легко переходит в свободное состояние, любых планктонных микроорганизмов и любых так называемых вторичных бактерий биопленки. Промывку предпочтительно осуществляют, например, посредством перемешивания пробы в промывной жидкости, такой как стерильная вода, осаждения полученного раствора, в ходе которого та часть пробы, которая остается агломерированной, выпадает в осадок, удаления жидкой фазы, образовавшейся над вероятным осадком и, предпочтительно, повторения этой процедуры в общей сложности 5-10 раз. Таким образом, промывку можно использовать для повышения избирательности определения в отношении действительных источников проблем, то есть микроорганизмов, первично образующих биопленку, которые способны сцепляться с чистыми поверхностями и расти на них и с которыми в свою очередь могут сцепляться вторично адгезивные бактерии. Кроме того, промывка может быть использована для снижения действия невредных планктонных микроорганизмов, например, при определении того антибиопленочного средства, которое эффективно препятствует образованию биопленки.

В случае использования пробы производственной воды эту пробу не нужно промывать.

Проба слизи из аппаратуры для производства бумаги часто является очень вязкой; поэтому пробу, предпочтительно пробу, оставшуюся после промывки, суспендируют в стерильной воде или в водном растворе обычным образом, например в разведении 1:10-1:40, посредством эффективного перемешивания для получения гомогенной пробы и использования ее на стадии (3). Затем суспендированную пробу помещают в одно или несколько углублений устройства для культивирования микроорганизмов, например в лунки планшета с лунками. В контексте настоящего изобретения было также обнаружено, что гомогенизация пробы может создавать проблемы; поэтому, особенно в тех случаях, когда определение проводят на серии проб, то есть в качестве серийного анализа и/или при обработке серией антибиопленочных средств, полезно помещать суспензию в каждое углубление в таких количествах, которые обычно не используются в данной области техники, а именно по меньшей мере 1,5 мл, предпочтительно от примерно 2 до 10 мл, более предпочтительно от 2 до 5 мл, например от 2 до 3 мл. Для этой цели в качестве устройства для культивирования можно использовать, например, имеющиеся в продаже 6- или 12-луночные планшеты. Если это желательно, можно использовать также пробирки и т.п.

Культивирование пробы посредством встряхивания в отсутствие и в присутствии антибиопленочного средства производят в питательном растворе, подходящем для микроорганизмов, образующих биопленку. В типичном случае на стадии (2) пробу суспендируют в питательном растворе. При необходимости в углубления можно затем добавить дополнительный питательный раствор. Питательный раствор может быть имеющимся в продаже питательным раствором, например бульоном R2 (можно приобрести, например, в компании Difco), или технологическим раствором, который взят из производственного процесса, стерилизован и в который предпочтительно добавлены питательные вещества.

С помощью упомянутого анализа также исследовано действие одного или нескольких антибиопленочных средств растительного происхождения на микроорганизмы, образующие биопленку, предпочтительно - на термофильные первично адгезивные микроорганизмы, с целью выявления такого средства растительного происхождения и/или его концентрации, которые подходят для процесса.

Соответственно, пробу, суспендированную на стадии 3), помещают, например, в количестве от 2 до 5 мл, например от 2 до 3 мл, в углубления устройства для культивирования без добавления антибиопленочного средства (образец 0) и с добавлением каждого из антибиопленочных средств, подлежащих испытанию. Если это желательно, можно также провести обработку смесью антибиопленочных средств. Антибиопленочное средство предпочтительно используют в форме раствора с концентрацией, подходящей для упомянутого средства, причем эта концентрация может очень значительно варьироваться в зависимости от средства. Антибиопленочное средство (или средства) предпочтительно испытывают в различных концентрациях в соответствии со стандартной практикой, то есть в виде серии разведений, для определения количества добавки, подходящего для рассматриваемого процесса. Кроме того, в дополнение к антибиопленочным средствам растительного происхождения могут быть испытаны также другие средства для использования совместно со средством растительного происхождения согласно настоящему изобретению.

Культивирование производят при температуре, которая может варьироваться от температуры окружающей среды до 65°С, предпочтительно от 35 до 65°С, более предпочтительно от 40 до 60°С, наиболее предпочтительно при температуре, которая близка к температуре того процесса, из которого взята проба, обычно в диапазоне от 40 до 60°С. Встряхивание производят в соответствии с обычной практикой, используемой в данной области техники, то есть во встряхивателе (качалке) со скоростью 100-300 об/мин, предпочтительно от 150 до 260 об/мин, при температурах, указанных выше, и в течение периода времени, определенного выше.

После культивирования во встряхивателе (4) раствор совместно с любым материалом, который свободно плавает в растворе, например с любыми планктонными микроорганизмами и с теми бактериями биопленки, которые были неадекватно сцеплены с поверхностью, удаляют из углублений. При необходимости раствор можно также исследовать на наличие роста планктонных микроорганизмов, которые выделены из пробы, например из агломератов, и на влияние антибиопленочного средства на этот рост.

После удаления раствора углубления обычно промывают, например, стерильной водой и окрашивают микробный компонент, прикрепленный к стенкам, красителем в соответствии с обычной практикой. Окрашивание можно проводить с использованием: 1) красителей, например кристаллического фиолетового (гексаметилпарарозанилин, кристаллвиолет) или сафранина, которые являются индикаторами общего количества биомассы; 2) красителей, например акридинового оранжевого, этидия бромида, DAPI, SYTO16 или других красителей, используемых для выявления нуклеиновых кислот, которые являются индикаторами числа микробных клеток; 3) красителей, например LIVE/DEAD™, CTC или различных тетразолиевых соединений, которые являются индикаторами жизнеспособности микробных клеток; или 4) субстратов специфических ферментов, которые являются индикаторами активности специфических ферментов и преобразуются во флуоресцирующие соединения в том случае, если биопленка проявляет, например, активность в отношении разложения крахмала, хитиназную активность, эстеразную активность, активность в отношении разложения сложных эфиров липидов, или фосфатазную активность. Избыток красителя смывают, а изменение цвета или его интенсивности, обусловленное окрашенными микроорганизмами, определяют качественно, например визуально, и/или количественно, например, посредством растворения красителя, например, в этаноле и определения интенсивности цвета посредством спектрофотометрии с использованием приборов, хорошо известных в данной области техники, таких как измеритель оптической плотности для планшета с лунками, или с помощью флюориметра.

На основании полученных результатов можно определить необходимость применения антибиопленочного средства и тип антибиопленочного средства, который является эффективным, а также концентрацию, которая эффективна для этой пробы, а значит эффективна против адгезивных микроорганизмов, присутствующих в процессе.

Способ определения согласно настоящему изобретению обеспечивает быстрое выявление присутствия адгезивных бактерий в технологическом процессе производства бумаги и антибиопленочного средства, эффективного против вышеупомянутых бактерий (необходимость добавления и количество, которое следует добавить), при этом промежуток между забором проб и обнаружением проблемы и началом осуществления мер для преодоления проблемы укорачивается по сравнению со стандартными определениями, которые занимают несколько дней и основаны на использовании чистых культур и которые, кроме того, часто обеспечивают лишь предупреждение роста планктонных микроорганизмов.

Далее изобретение предусматривает комплект аппаратуры для определения необходимости добавления антибиопленочного средства. Этот комплект включает в себя:

а) устройство для предварительной обработки проб, например пластмассовую пробирку с крышкой для забора пробы и для удаления из пробы свободного органического и/или неорганического материала;

б) по выбору - перемешивающее устройство, например вихревую мешалку, для суспендирования/гомогенизации пробы;

в) устройство для культивирования микроорганизмов, содержащее множество отдельных углублений, причем объем каждого углубления по меньшей мере 2 мл, предпочтительно по меньшей мере 3 мл, и больше объема части пробы, помещаемой в углубление, и это углубление может содержать суспендированную пробу в количестве по меньшей мере 1,5 мл, предпочтительно от 2 до 10 мл, более предпочтительно от 2 до 5 мл, и по выбору - антибиопленочное средство, например раствор антибиопленочного средства, и/или дополнительный питательный раствор;

г) встряхиватель, предпочтительно термостатируемый встряхиватель, для встряхивания устройства для культивирования микроорганизмов и обеспечения образования биопленки,

д) реагенты, которые включают:

а. по меньшей мере, одно антибиопленочное средство, например раствор антибиопленочного средства, по выбору - в виде серии разведений, для обработки суспендированной пробы во время встряхивания,

б. стерильный питательный раствор, и

в. раствор красителя для окрашивания микроорганизмов, присоединенных к стенке углубления.

Устройство для культивирования микроорганизмов, естественно, выбирают в соответствии с объемом части пробы, используемым в данном способе, так чтобы углубления устройства могли вместить желаемые дозы суспендированной пробы и, по выбору, раствора антибиопленочного средства и/или питательного раствора, который добавляют дополнительно, и так, чтобы дозированный раствор оставался в углублении в течение времени встряхивания. В качестве примера можно привести имеющиеся в продаже 6- или 12-луночные планшеты.

Комплект может дополнительно включать индикаторный прибор, например один из перечисленных выше, для качественного и/или количественного выявления окрашенных адгезивных микроорганизмов, стерильную воду для промывки пробы, измерительные устройства, например пипетки, для дозирования суспендированной пробы и ее промывки, растворы питательных веществ и/или антибиопленочных средств.

Кроме того, реагенты, входящие в комплект, могут находиться в упаковках, содержащих одну дозу или несколько доз, или некоторые реагенты, например антибиопленочное средство и/или дополнительный питательный раствор, могут быть заранее налиты в лунки устройства для культивирования микроорганизмов, например планшета с лунками, при этом лунки могут быть герметично закрыты, например, пленкой, которую можно удалить.

Далее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на лабораторные исследования и примеры.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ И ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способность чистых веществ препятствовать образованию биопленки адгезивными бактериями

Воздействие чистых веществ на образование биопленки адгезивными бактериями, выделенными из машин для изготовления бумаги, такими как Deinococcus geothermalis E50051, Burkholderia cepacia F28L1, Thermomonas sp. 11306 и Meiothermus silvanus R2A-50-3, было исследовано в испытании на 96-луночном планшете (планшет с лунками из полистирола, имеющего качество, достаточное для культивирования клеток, гидрофильного). Бактерии инокулировали из чашек Петри в пробирки с питательной жидкой средой за 24 часа до испытания и выращивали при встряхивании при температуре 45°С. Вначале в лунки планшета пипеткой переносили по 2,5 мкл разведений чистого вещества (растворенного в диметилсульфоксиде, ДМСО) в двух различных концентрациях. После этого добавляли суспензию бактерий, которая была разведена примерно до 2% питательным бульоном R2 (рН 7) в количестве 250 мкл/лунку. Бульон R2 - это синтетическая культуральная среда, которая хорошо подходит для культивирования адгезивных микроорганизмов, выделенных из машин для изготовления бумаги. Конечные концентрации чистых веществ в лунках планшетов были равны 25 мкмоль·л^-1 или 250 мкмоль·л^-1. Планшеты инкубировали при встряхивании со скоростью 160 об/мин при 45°С в течение 17-18 часов.

После культивирования лунки планшетов опустошали, тщательно промывали водопроводной водой и добавляли в лунки 0,1% раствор додецилсульфата натрия (ДСН) (анионного поверхностно-активного вещества) в количестве 280 мкл/лунку. Планшеты снова помещали во встряхиватель на 1 час. Соответственно, результаты показывают, что средства, препятствующие образованию биопленки, и средства, участвующие в образовании биопленки, имеют настолько рыхлую структуру, что они удаляются при промывке, которая обычно не влияет на рассматриваемые биопленки, образованные адгезивными бактериями. После промывки ДСН планшеты промывали водопроводной водой. Биопленки окрашивали раствором кристаллического фиолетового красителя и снова промывали. Для получения результатов краситель, присоединившийся к биопленке, растворяли в 96%-ном этаноле, и оптическую плотность растворов, содержавшихся в лунках, измеряли с помощью измерительного устройства ELISA при длине волны 595 нм. Посредством сравнения результатов с результатами, полученными для лунок, обработанных только ДМСО, можно рассчитать процент ингибирования биопленки каждым чистым веществом.

Пример 1

В общей сложности было исследовано 110 чистых веществ. В Таблице 1 приведены девять чистых веществ, которые оказывают сильное действие против образования биопленки и действуют более чем на один штамм адгезивных бактерий (сокращение биопленки более чем на 50% более чем для одного из исследованных штаммов).

Три чистых вещества (лаурилгаллат, октилгаллат и нордигидро-гуайаретовая кислота) имеют широкий спектр действия против образования биопленки, так как они снижают образование биопленки всеми четырьмя различными адгезивными бактериями в концентрации 250 мкмоль·л^-1. Галлаты, особенно лаурилгаллат, были эффективными и в концентрации 25 мкмоль·л^-1. Молекулярная масса лаурилгаллата равна 338,45 г·моль^-1, то есть это вещество обладает широким спектром эффективности против биопленки в концентрации 8,5 мг·л^-1 (=8,5 промилле). Октил- и лаурилгаллаты в наилучшем случае снижали сцепление бактерий биопленки с поверхностями более чем на 90% в обезжиренном питательном растворе (в концентрации 250 мкмоль·л^-1 против Deinococcus geothermalis и Burkholderia cepacia).

Было обнаружено, что многие чистые вещества оказывают определенный ингибирующий эффект в концентрации 250 мкмоль·л^-1, однако наблюдалось также, что при низкой их концентрации, равной 25 мкмоль·л^-1, образование биопленки, напротив, усиливается (например, при действии кумарина 102, флавона и норгидро-гуайаретовой кислоты, см. Таблицу 1). Это следует интерпретировать так, что в концентрации 25 мкМ эти вещества еще не обеспечивают концентрацию активного ингредиента, достаточно высокую для предотвращения образования биопленки, но эта концентрация может быть достаточной для того, чтобы создать неблагоприятные условия для роста свободно плавающих форм, и это может способствовать притяжению бактерий к биопленке.

Пример 2

Дальнейшие исследования были выполнены на наилучших антибиопленочных средствах из Примера 1 с включением в испытание нескольких штаммов бактерий, а также анализа без промывки ДСН. Также в испытание были включены штаммы адгезивных бактерий E-lvk-R2A-1 и E-jv-CTYE3, которые были выделены из машины для изготовления бумаги и еще не идентифицированы, и плесень Aspergillus fumigatus G3.1. Использованным веществом сравнения был часто применяемый биоцид Fennosan M9, эффективным ингредиентом которого является метиленбистиоцианат (9%). Результаты приведены в Таблице 2.

Доказано, что галлаты являются эффективными и против новых адгезивных микроорганизмов. Они были также эффективными и без промывки ДСН, что позволяет сделать вывод о том, что механизм влияния этих веществ включает в себя ингибирование образования биопленки. Как лаурил-, так и октилгаллат были активными против большинства исследованных микроорганизмов даже в концентрации, равной 25 мкмоль·л^-1. Они были также эффективными против биопленок, образованных В. cepacia и Thermomonas, с которыми очень трудно бороться. Эффект лаурилгаллата в испытаниях с бульоном R2 неожиданно оказался лучшим при низкой концентрации, чем при высокой. Это может быть следствием плохой растворимости вещества в бульоне R2. Эффект лаурилгаллата в концентрации 25 мкмоль·л^-1 (8,5 промилле) был почти равен эффекту метиленбистиоцианата (10 промилле), который был использован в качестве вещества сравнения.

Пример 3

Действие против образования биопленки наиболее эффективных чистых веществ из Примера 1 было исследовано также при культивировании микроорганизмов в воде из машины для изготовления бумаги (белая вода, с добавлением 1 г/л крахмала и 300 мг/л экстракта дрожжей, стерилизованная, 250 мкл/чашку, рН 7, инокуляция 2%, культивирование в течение 48 часов, 45°С, 160 об/мин). Результаты приведены в Таблице 3. Октил- и лаурилгаллат в стерилизованной белой воде в наилучшем случае снижали адгезию микроорганизмов биопленки к поверхностям более чем на 90% (при концентрации 25 мкМ - в случае Meiothermus silvanus и адгезивной бактерии E-jv-CTYE3). Для того чтобы адгезивные бактерии могли сформировать биопленку в воде из машины для изготовления бумаги, необходимо более длительное время культивирования. Действие чистых веществ и М9 оставалось слабым, вероятно - из-за более длительного времени культивирования. В среде машины для изготовления бумаги этой проблемы не существует, так как активный ингредиент добавляют в процесс через регулярные промежутки времени.

2. Способность растительных экстрактов препятствовать образованию биопленки адгезивными бактериями

В качестве способа испытания было использовано испытание на 96-луночном планшете (планшет с лунками из полистирола, подходящего для культивирования клеток, гидрофильного, жидкий бульон R2 по 250 мкл/лунку, рН 7, встряхивание при 160 об/мин, 45°С, от 17 до 18 часов), описанном выше. Исследованные бактерии из машин для изготовления бумаги включали Deinococcus geothermalis E50051, Burkholderia cepacia F28L1, Thermomonas sp. 11306 и Meiothermus sitvanus R2A-50-3. Конечные концентрации растительных экстрактов (экстрагированных метанолом) в лунках были равны 20 или 200 мг·л^-1. После культивирования планшеты споласкивали и промывали 0,1%-ным ДСН (анионное поверхностно-активное вещество) при встряхивании со скоростью 120 об/мин в течение 1 часа. Лунки планшетов промывали водопроводной водой и окрашивали кристаллическим фиолетовым красителем. Для получения результатов краситель, присоединившийся к биопленке, растворяли в 96%-ном этаноле, и оптическую плотность растворов в лунках измеряли с помощью измерительного устройства ELISA при длине волны 595 нм.

Пример 4

Способ испытания, описанный выше, был использован для изучения профилактического эффекта 92 растительных экстрактов на образование биопленки адгезивными бактериями. В Таблице 4 показаны только растительные экстракты, полученные с использованием метанола (18 проб), которые препятствовали размножению более чем одной бактерии. Наилучшими растительными экстрактами были экстракты из цветков овечьего щавеля, цветков желтого вербейника, листьев мелкоцветного кипрея волосистого, цветов мелкоцветного кипрея волосистого, корней крупноцветного пикульника, листьев японской розы, стебля японской розы, лепестков японской розы и листьев шалфея.

Некоторые из наиболее интересных растений включали японскую розу, мелкоцветный кипрей волосистый и шалфей, которые обладали наиболее широким спектром действия против микроорганизмов, образующих биопленку. Кроме того, антибиопленочный эффект был обнаружен у всех надземных частей японской розы и мелкоцветного кипрея волосистого, которые были исследованы. Экстракты, полученные из японской розы, были единственными экстрактами, которые также оказывали эффект на биопленки, образованные В.cepacia, с которыми, как было показано, труднее всего бороться. Что касается растений, которые являются эффективными, то проще всего выращивать японскую розу и шалфей.

Пример 5

Для подтверждения активности исследование было продолжено посредством проведения повторных экстракций и испытаний на японской розе, мелкоцветном кипрее волосистом и шалфее (хранившихся в сухом виде в течение 2 лет). Кроме того, было принято решение приготовить и испытать экстракты близкородственных растений - кипрея узколистного (листья, цветки и корни) и лабазника дланевидного (листья, цветки и корни). Родственные растения часто содержат сходные соединения, и поэтому ожидалось, что их экстракты также будут активными. Мелкоцветный кипрей волосистый является относительно редким растением; поэтому авторы настоящего изобретения ожидали, что экстракт из гораздо более распространенного кипрея узколистного также будет активным. Были выполнены испытания с промывкой ДСН и без промывки; поэтому результаты демонстрируют механизм влияния экстрактов (Н = уменьшает биопленку, без промывки ДСН нет заметного ингибирования биопленки; Е = препятствует образованию биопленки, промывка ДСН не дает эффекта).

Результаты представлены в Таблице 5. Наилучшие из исследованных растительных экстрактов (японская роза, кипрей узколистный, лабазник дланевидный и шалфей) препятствовали адгезии к поверхностям различных адгезивных бактерий, особенно - D.Geothermalis и М.silvanus. Полученные результаты показали, что новые экстракты японской розы также были активными, но не настолько активными, как оригинальные экстракты. Это можно объяснить тем, что прошло уже почти 2 года с момента сбора растений, и что во время хранения содержание активных ингредиентов могло снизиться. То же самое было в случае мелкоцветного кипрея волосистого. Было обнаружено, что новыми и интересными растениями являются кипрей узколистный и лабазник дланевидный - растения, родственные вышеупомянутым. Новый экстракт шалфея был примерно столь же эффективным, как и старый. В повторных исследованиях было доказано, что Thermomonas sp. является адгезивной бактерией, с которой труднее всего бороться: из всех исследованных экстрактов только экстракт шалфея препятствовал ее размножению.

Пример 6

Наиболее эффективные из экстрактов, испытанных в R2-бульоне, были также испытаны в воде из машины для изготовления бумаги (белая вода, с добавлением 1 г/л крахмала и 300 мг/л экстракта дрожжей, простерилизованная). В испытания было включено больше штаммов микроорганизмов (бактериальные штаммы E-lvk-R2A-1 и E-jv-CTYE3, которые выделены из машины для изготовления бумаги и еще не идентифицированы, и плесень Aspergillus fumigatus G 3.1.). Способом испытания был такой же анализ на планшете с лунками (планшет с лунками из полистирола, подходящего для культивирования клеток, гидрофильного, вода из машины для изготовления бумаги по 250 мкл/лунку, рН 7, 45°С, встряхивание со скоростью 160 об/мин в течение 48 часов). Поскольку бактерии в воде из машины для изготовления бумаги образуют биопленку не так быстро, как в R2-бульоне, необходимо более длительное время культивирования. Результаты приведены в Таблице 6, которая показывает, что эффект экстрактов был ниже, чем в R2-бульоне, возможно - из-за более длительного времени культивирования. В среде машины для изготовления бумаги это можно откорректировать посредством добавления активного ингредиента через регулярные интервалы.

В соответствии с результатами проведенных испытаний наиболее значимыми растительными экстрактами для ингибирования образования вредных биопленок в машинах для изготовления бумаги и картона являются, соответственно, экстракты из японской розы, лабазника дланевидного, кипрея узколистного и шалфея. Экстракты из мелкоцветного кипрея волосистого также были эффективными, но их трудно получить из-за редкости этого растения.

3. Мониторинг присутствия адгезивных бактерий, образующих биопленку, и определение эффекта антибиопленочных средств

Пример 7

С поверхности машины для изготовления бумаги (дисковый фильтр) в пробоотборный сосуд была взята проба отложений на стенках. К пробе слизи добавили стерильную воду и интенсивно перемешали ее при помощи вихревой мешалки. Пробе дали осесть и удалили супернатант. Процедуру повторили, осуществив в общей сложности 10 промывок. В заключение пробу развели питательным раствором R2 (Difco) так, чтобы получить разведения 1:10-1:40, и гомогенизировали. 2 мл полученной таким образом суспензии нанесли в лунки 12-луночного планшета (12-луночные планшеты N-150628 F12 производства компании Nunc). Часть лунок содержала только суспендированную пробу, а в другую часть лунок для изучения эффекта обработки антибиопленочными средствами были добавлены также антибиопленочные средства: 1) коммерческий продукт, содержащий глутаральдегид и 2) коммерческий продукт, содержащий DBNPA; оба продукта - в двух концентрациях, 100 промилле и 300 промилле, каждый продукт/каждую концентрацию добавляли в отдельную лунку. Закрытые крышками планшеты поместили в коммерческий термостатируемый встряхиватель и встряхивали в течение 24 часов со скоростью встряхивания 160 об/мин или 250 об/мин. Количество свободно плававших планктонных микроорганизмов оценивали посредством исследования мутности растворов.

Раствор остался прозрачным в тех лунках, в которые было добавлено антибиопленочное средство Fennosan GL10, что показывает, что это вещество подавляет также размножение планктонных микроорганизмов. После этого раствор удалили из лунок, лунки промыли водопроводной водой и заполнили сафрановым красителем, которому предоставили возможность действовать в течение 5 минут. Раствор красителя удалили, лунки несколько раз (4 раза) промыли, а затем заполнили этанолом и обеспечили краске возможность растворяться в этаноле в течение 1 часа, после чего концентрацию флуоресцентного красителя измерили с помощью прибора Fluoroscan. На основании этого испытания было установлено, что в месте забора пробы присутствовали адгезивные бактерии, а также что оба использованных антибиопленочных средства снижали адгезию адгезивных бактерий к поверхностям лунок.

Реферат

Изобретение относится к производству бумаги и картона. К циркуляционным водам машин для изготовления бумаги и картона добавляют, по меньшей мере, одно фенольное соединение, выделенное из растения, или, по меньшей мере, один растительный экстракт, или их смесь в такой концентрации, которая эффективна против термофильных адгезивных микроорганизмов. Растительный экстракт получен из японской розы, кипрея узколистного, шалфея или лабазника дланевидного. Указанные вещества применяют для ингилирования образования биопленок. Для определения необходимости добавления антибиопленочного средства в процесс производства бумаги или картона осуществляют следующие стадии: 1) взятие пробы с поверхностей, из производственной воды или сырьевых материалов машины для изготовления бумаги и картона, которую необходимо контролировать; 2) при необходимости - удаление из пробы любых свободных неорганических и/или органических материалов и суспендирование оставшейся части пробы в водном растворе; 3) встряхивание суспендированной пробы в устройстве для культивирования с раствором питательного вещества и, по выбору, с антибиопленочным средством; 4) удаление питательного раствора совместно с любым материалом, который может быть выделен совместно с указанным раствором, например - с планктонным материалом и бактериями биопленки, которые неадекватно сцеплены с поверхностью, и окрашивание микроорганизмов, сцепленных со стенкой устройства, и 5) качественное и/или количественное определение присутствия адгезивных микроорганизмов в суспендированной пробе и, по выбору, в суспендированной пробе, обработанной антибиопленочным средством, осуществляемое на основании образования цвета и его интенсивности. Изобретение позволяет представить образование биопленок при температуре 50-60°С. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 6 табл.

Формула