Способ отбора образцов из потока текучей среды для отслеживания загрязняющей примеси в непрерывном режиме - RU2755065C2

Чертежи

Описание

Белки в биотехнологическом производстве традиционно очищают партиями. Это означает, что отдельные технологические циклы осуществляют не непрерывно, а в периодическом режиме, и продукт удаляют полностью после завершения технологического цикла. После этого для нового технологического цикла необходимо начинать новый цикл производства продукта или партии. Таким же образом, отдельные технологические стадии осуществляют в периодическом режиме, причем в большинстве случаев промежуточный продукт перемещают целиком из одного питающего резервуара в другой резервуар, который используют в качестве питающего резервуара для следующей технологической стадии.

В фармацевтическом производстве, которое строго регулируют, для такого получения продукта в периодическом режиме требуются огромные затраты, времени, техники и труда, например, для получения очищенных и стерилизованных биореакторов в интересах надежного предотвращения перекрестного загрязнения в течение смены продуктов в многоцелевой системе или между двумя партиями продукта, а также для гарантии отсутствия микроорганизмов в продукте. Это распространяется как на обработку выше по потоку (USP), т. е. получение биологических продуктов в ферментаторах, так и на обработку ниже по потоку (DSP), т. е. очистку продуктов ферментации. В частности, в случае ферментации не содержащая микроорганизмов среда представляет собой необходимое условие успешной культивации. Как правило, для стерилизации ферментаторов периодического действия или с периодической подпиткой используют технологию стерилизации на месте (SIP). Однако остановки реактора вследствие технологических процедур могут приводить к высоким затратам в течение того времени, когда реактор выводят из производства.

Таким образом, непрерывная технология получения терапевтических белков приобретает все большее значение, и возникают первые решения для реализации действительно непрерывных систем. Кроме того, особый интерес вызывают непрерывные процессы получения терапевтического белка, допускающие применение технологии разового пользования.

В целях применения непрерывной технологии получения терапевтических белков согласно руководствам и стандартам, таким как надлежащая производственная практика (GMP), необходимо надежное предотвращение загрязнения, например, патогенами, точно так же, как в случае традиционных процессов периодического типа. Кроме того, необходимо также продемонстрировать, что вышеупомянутое загрязнение надежно предотвращено. Другими словами, требуется отслеживание возможной загрязняющей примеси. В традиционных периодических процессах получения терапевтических белков содержание микробов и другой загрязняющей примеси исследуют посредством отбора образцов из полной партии продукта. Например, концентрация белка клетки-хозяина (HCP) после стадии хроматографии может представлять собой важный критерий. Таким образом, после осуществления хроматографии отбирают образец, который считают представляющим среднюю концентрацию белка клетки-хозяина всей партии продукта.

Однако отличительный признак непрерывных процессов получения, например, терапевтических белков, заключается в том, что не всю партию продукта пропускают через данный технологический блок до того, как какая-либо часть всей вышеупомянутой партии продукта поступает в следующий технологический блок. В результате этого отсутствует момент времени отбора образца, который автоматически представляет собой среднюю концентрацию загрязняющей примеси. Следовательно, оказываются неприменимым традиционный подход к демонстрации того, что концентрация патогенов и/или другой загрязняющей примеси в данном производственном цикле удовлетворяет требуемым критериям.

Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить простое и экономичное решение для требуемой демонстрации того, что концентрация данной загрязняющей примеси в непрерывном потоке удовлетворяет требуемым критериям, таким как нормативные параметры.

Настоящее изобретение решает эту задачу, предлагая способ отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа в потоке текучей среды, включающий следующие стадии:

- обеспечение по меньшей мере двух технологических операций,

- обеспечение потока текучей среды, который проходит через указанные по меньшей мере две технологические операции по пути потока,

- отбор образцов из потока текучей среды заданным валидным способом,

- определение концентрации загрязняющей примеси в образце для отслеживания концентрации загрязняющей примеси в потоке текучей среды,

причем способ осуществляют в условиях непрерывности, замкнутости и уменьшенного числа патогенов.

Этот способ отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа имеет преимущество обеспечения простого и экономичного решения, демонстрирующего, что концентрация загрязняющей примеси, такой как патоген, в данном непрерывном потоке удовлетворяет критериям, установленным, например, регулирующими органами, предписанными правилами, такими как GMP, и/или определенным в течение процесса исследования характеристик, например, специфическим критериям для данного процесса в конкретных производственных условиях.

При использовании в настоящем документе термин «заданный валидный способ» означает, что должен быть осуществлен воспроизводимый отбор образцов, и место и/или время отбора образцов всегда должно гарантировать, что образец представляет собой среднюю концентрацию загрязняющей примеси или более чем среднюю концентрацию загрязняющей примеси, для возможности вывода, что поток текучей среды данного производственного процесса удовлетворяет критериям, например, установленным регулирующими органами или предписанным правилами, такими как GMP.

Другими словами, вместо отбора образца, представляющего среднюю концентрацию загрязняющей примеси во всей партии продукта, как в случае производственных условий периодического типа, образец представляет собой среднюю концентрацию загрязняющей примеси вплоть до наиболее высокой концентрации загрязняющей примеси в потоке текучей среды в данной определенной точке производственного процесса и в условиях непрерывного потока. Таким образом, если концентрация загрязняющей примеси в указанном образце, отобранном заданным валидным способом, находится ниже допустимого критического уровня, это означает, что концентрация загрязняющей примеси во всем обработанном потоке текучей среды находится ниже критического уровня.

Кроме того, отбор образцов потока текучей среды заданным валидным способом гарантирует, что концентрация загрязняющей примеси в данном конкретном цикле производственного процесса сопоставима с их концентрацией в других циклах производственного процесса, относящихся к тому же типу и осуществляемых в таких же условиях, например, на том же заводе и тем же предприятием.

При использовании в настоящем документе термин «непрерывный» означает способ последовательного расположения по меньшей мере двух технологических стадий и/или технологических блоков, в котором осуществляют поток текучей среды (движение текучей среды) от расположенной выше по потоку стадии перемещают до расположенной ниже по потоку стадии. Расположенная ниже по потоку ступень начинает обработку потока текучей среды до завершения расположенной выше по потоку ступени. Соответственно, непрерывный транспорт или перенос потока текучей среды из расположенного выше по потоку блока в расположенный ниже по потоку блок означает, что расположенный ниже по потоку блок начинает работать еще до прекращения работы расположенного выше по потоку блока, т. е. что два соединенных последовательно блока одновременно обрабатывают протекающий через них поток текучей среды.

При использовании в настоящем документе термин «поток текучей среды» или «движение текучей среды» означает непрерывный поток жидкости и/или газа.

Согласно предпочтительному варианту осуществления поток продукта или движение продукта представляет собой поток не содержащей клеток текучей среды, полученной из содержащей продукт гетерогенной текучей смеси клеточной культуры в результате любых других технологических стадий согласно настоящему изобретению, т. е. поток продукта после фильтрации, после хроматографии, после удаления вируса, после ультрафильтрации, после диафильтрации или после дополнительных технологических стадий согласно настоящему изобретению, причем указанные потоки продукта могут иметь различные концентрации и степени чистоты.

Согласно альтернативному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа поток текучей среды не содержит продукт. Этот поток текучей среды может представлять собой, например, поток текучей среды, поступающий в производственный процесс.

При использовании в настоящем документе выражение «по меньшей мере один» означает один или более.

Кроме того, следует понимать, что при использовании в настоящем документе грамматические формы единственного числа означают «по меньшей мере один», подразумевают возможность множественного числа и не ограничены единственным числом, если четко не задано иное условие.

При использовании в настоящем документе термин «загрязняющая примесь» означает все компоненты, включая патогены, которые представляют собой критические характеристики качества и, следовательно, подлежат наблюдению в производстве терапевтических белков.

При использовании в настоящем документе термин «патоген» означает микроорганизмы и вирусы.

Критические характеристики качества (CQA) представляют собой химические, физические, биологические и микробиологические характеристики, которые можно определять, измерять и непрерывно наблюдать, чтобы гарантировать сохранение качества конечного выпускаемого продукта в приемлемых пределах.

При использовании в настоящем документе термин «блок» или «технологический блок» означает устройство, которое осуществляет одну технологическую стадию в процессе производства биофармацевтического или биологического высокомолекулярного продукта, и процесс, который осуществляется в конкретном устройстве т. е. технологическом блоке. Другими словами, чтобы получить конечный биофармацевтический и/или биологический высокомолекулярный продукт, поток текучей среды следует пропустить через несколько блоков до тех пор, пока продукт не приобретет желательные характеристики и/или чистоту.

При использовании в настоящем документе термин «модульная система» означает последовательно соединенные друг с другом модули («блоки») для осуществления по меньшей мере двух расположенных ниже по потоку и/или расположенных выше по потоку стадий, в которых может перемещаться поток текучей среды. Согласно настоящему изобретению блоки являются подходящими для непрерывного выполнения стадии и могут обрабатывать текучую среду в непрерывном потоке, также называемом движением текучей среды (а если она содержит продукт, это также называют термином «поток продукта»). Отдельные модули этой «модульной системы» могут быть соединены друг с другом в любой комбинации. Примеры модулей в рамках значения настоящего изобретения представляют собой фильтрационный модуль, хроматографический модуль, ультрафильтрационный модуль, диафильтрационный модуль и диализный модуль.

При использовании в настоящем документе термин «модульный» означает, что отдельные технологические стадии могут быть осуществлены в отдельных соединенных друг с другом модулях, причем модули являются предварительно конфигурированными, обеспечивающими уменьшение числа микроорганизмов и замкнутыми, причем они могут быть соединены друг с другом в разнообразных комбинациях.

При использовании в настоящем документе термин «проточное устройство» означает любой агрегат или контейнер, через который проходит поток продукта, или с которым поток находится в контакте.

При использовании в настоящем документе термин «уменьшенное число патогенов» означает состояние уменьшенного числа патогенов, в котором число патогенов на единицу площади или объема является близким к нулю, что может быть достигнуто посредством подходящего способа уменьшения числа микроорганизмов, причем этот способ уменьшения числа микроорганизмов может быть выбран из гамма-облучения, бета-облучения, обработки в автоклаве, обработки этиленоксидом (ETO) и обработки паром на месте (SIP) и/или теплом на месте.

При использовании в настоящем документе термин «изделия разового пользования» означает, что соответствующие компоненты, вступающие в контакт с потоком текучей среды, в частности, оборудование, контейнеры, фильтры и соединительные элементы, являются подходящими для разового применения с последующей утилизацией, причем указанные контейнеры могут быть изготовлены как из пластмассы, так и из металла. В пределах объема настоящего изобретения данный термин также включает изделия разового пользования, такие как изделия, изготовленные из стали, которые используют только один раз в процессе согласно настоящему изобретению и не используют повторно в данном процессе. Тогда указанные изделия разового пользования, например, изделия, изготовленные из стали, также рассматриваются в пределах объема настоящего изобретения как «изделия разового пользования». Такие изделия разового пользования могут также присутствовать в процессе согласно настоящему изобретению как «утилизируемые» или «одноразовые» изделия согласно технологии разового пользования (SU). Таким образом, дополнительно улучшается состояние уменьшенного числа патогенов в процессе и модульной системе согласно настоящему изобретению.

При использовании в настоящем документе термин «замкнутый» означает, что описанный способ осуществляют таким образом, что поток текучей среды не вступает в контакт с окружающей средой в помещении. Материалы, оборудование, буферные растворы и другие предметы могут поступать извне, однако их поступление происходит таким образом, чтобы предотвращать контакт потока текучей среды с окружающей средой в помещении.

При использовании в настоящем документе термин «замкнутый» означает как «функционально замкнутый», так и «замкнутый».

Более конкретно, замкнутую технологическую систему проектируют и эксплуатируют таким образом, что продукт никогда не вступает в контакт с окружающей средой. Впуски в замкнутые системы и выпуски из них необходимо осуществлять в полностью замкнутом режиме. Могут быть использованы стерильный фильтры для обеспечения эффективных барьеров от загрязняющей примеси в окружающей среде. Термин «функционально замкнутый» означает процесс, который может быть незамкнутым, но «становится замкнутым» посредством очистки, санитарной обработки и/или стерилизации, которая выполняет или соблюдает технологические требования, в том числе стерильную или асептическую среду или низкую бионагрузку. Указанные системы должны оставаться замкнутыми в течение производства в пределах системы. Примеры представляют собой технологические резервуары, которые между применениями могут подвергаться очистке на месте (CIP) и стерилизации на месте (SIP). Нестерильные системы, такие как хроматографические или некоторые фильтрационные системы могут также становиться замкнутыми в операциях с низкой бионагрузкой, если предусмотрены соответствующие меры в ходе конфигурации конкретной системы.

В определенных обстоятельствах может оказаться полезным отбор образцов потока текучей среды до отбора образцов заданным валидным способом. Это может быть сделано, например, в том случае, если первая технологическая операция представляет собой аффинную хроматографию. В этой конфигурации отбор образцов потока текучей среды может быть также осуществлен после элюирования из первой колонки.

Согласно одному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа по меньшей мере тип загрязняющей примеси представляет собой микробную загрязняющую примесь и/или ядовитую загрязняющую примесь, и способ дополнительно включает:

- обеспечение по меньшей мере одного фильтра с размерами пор между 0,05 мкм и 0,2 мкм, который разделяет по меньшей мере два технологических блока,

- причем поток текучей среды проходит через указанный фильтр с размерами пор между 0,05 мкм и 0,2 мкм, кода он протекает из одного технологического блока во второй, и

- при этом отбор образцов из потока текучей среды заданным валидным способом, осуществляют посредством отбора образцов из потока текучей среды непосредственно перед его прохождением через указанный фильтр с размерами пор между 0,05 мкм и 0,2 мкм.

Этот вариант осуществления имеет преимущество, заключающееся в том, что концентрация микробной загрязняющей примеси и/или ядовитой загрязняющей примеси является максимально высокой непосредственно перед фильтром с размерами пор от 0,05 мкм до 2 мкм. Таким образом, если концентрация микробной загрязняющей примеси и/или ядовитой загрязняющей примеси в образце, отобранном в этой точке отбора образцов, является ниже применяемого порогового значения, то концентрация вышеупомянутой микробной загрязняющей примеси и/или ядовитой загрязняющей примеси в потоке текучей среды должна быть ниже указанного применяемого порогового значения.

Другими словами, поскольку весь поток текучей среды должен проходить через фильтр с размерами пор между 0,05 мкм и 0,2 мкм для достижения следующего технологического блока концентрация микробов и концентрация другой загрязняющей примеси является наиболее высокой на стороне ретентата фильтра. Следовательно, в этом случае образец больше не представляет собой среднюю концентрацию загрязняющей примеси, как в случае периодического процесса, но представляет собой наиболее высокую концентрацию загрязняющей примеси, собранных в течение определенного периода времени. Таким образом, если концентрация загрязняющей примеси в указанном образце ниже применяемого порогового значения, то концентрация загрязняющей примеси всего обработанного потока текучей среды находится ниже применяемого порогового значения.

Стадия определения концентрации микробной загрязняющей примеси может быть осуществлена, например, когда фильтр заменяют, или с заданными интервалами, или когда определенная характеристика потока текучей среды или фильтр достигает заданного порогового значения.

При использовании в настоящем документе термин «ретентат» означает вещество, которое задерживается данным фильтром. Другими словами, когда фильтрат проходит через фильтр, ретентат остается в фильтре или перед ним.

При использовании в настоящем документе термин «яд» или «ядовитая загрязняющая примесь» означает все компоненты, которые являются потенциально вредными для людей, животных и растений, например, посредством химической реакции или другой активности на молекулярном уровне, когда организм поглощает достаточное количество.

При использовании в настоящем документе термин «токсин» означает низкомолекулярные соединения, пептиды или белки, которые способны вызывать заболевание при контакте или абсорбции тканями организма, взаимодействуя с биологическими высокомолекулярными соединениями, такими как ферменты или клеточные рецепторы, например, бактериальные эндотоксины, бактериальный экзотоксины и грибковые биотоксины. Другими словами токсин представляет собой тип ядовитого вещества, производимого в живых клетках или организмах.

Как указано выше, фильтр имеет поры с размерами от 0,05 мкм до 2 мкм, предпочтительно от 0,05 мкм до 0,6 мкм, наиболее предпочтительно от 0,1 мкм до 0,2 мкм, чтобы фильтровать поток текучей среды и при этом отфильтровывать частицы, такие как агрегированные частицы продукта. При использовании в настоящем документе выражение «размеры пор от 0,05 мкм до 2 мкм» означает, что в данном фильтре у большинства пор наблюдаются данные размеры, и вышеупомянутые данные размеры составляют от 0,05 мкм до 2 мкм, например, размер большинства пор составляет 0,2 мкм.

Согласно предпочтительному варианту осуществления отбор образцов потока текучей среды осуществляют перед его прохождением через фильтр с размерами пор от 0,05 мкм до 2 мкм, и указанный отбор образцов происходит непосредственно перед фильтром или в выходном вентиляционном отверстии фильтра.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере один фильтр с размерами пор от 0,05 мкм до 2 мкм представляет собой фильтр Sartopore 2 XLG с размером пор 8 (0,2 мкм) (Sartorius, 5445307G8G).

Согласно следующему предпочтительному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси многоканальный и/или стерильный пакет присоединен к стороне ретентата фильтра с размерами пор между 0,05 мкм и 0,2 мкм, и указанный стерильный пакет может быть присоединен замкнутым или функционально замкнутым образом для отбора образца.

Согласно предпочтительному варианту осуществления описанного выше способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа по меньшей мере два фильтра с размерами пор от 0,05 мкм до 2 мкм установлены параллельно, таким образом, что первый фильтр может быть заменен в условиях с уменьшенным числом микроорганизмов, в то время как поток текучей среды проходит через второй фильтр.

Согласно другому варианту осуществления описанного выше способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа отбор образцов потока текучей среды заданным валидным способом осуществляют посредством отбора образцов из потока текучей среды в заданный момент времени по отношению к первому и/или второму технологическому блоку и/или отбора образцов из потока текучей среды, когда определенная характеристика потока текучей среды достигает заданного порогового значения.

Этот вариант осуществления имеет преимущество, заключающееся в том, что он допускает отбор образцов «заданным валидным способом» в точках, т. е. местах и/или моменты времени в течение производственного процесса, в которых не должен обязательно присутствовать фильтр.

Кроме того, в случаях, где анализируют фильтрованный материал, например, в конфигурации, где поток текучей среды фильтруют перед его поступлением в первый технологический блок, этот вариант осуществления допускает анализ фильтрованного материала. Это имеет преимущество, поскольку устройство для анализа образца, отобранного заданным валидным способом, должно иметь способность анализа только фильтрованного материала, в отличие от нефильтрованного материала, который мог бы потенциально блокировать аналитическое устройство вследствие присутствия более крупных (неотфильтрованных) частиц.

Следует отметить, что различные варианты осуществления, описанные в настоящем документе, могут быть объединены любым подходящим способом. Таким образом, один и тот же производственный процесс может включать, например, один или более отборов образцов заданным валидным способом непосредственно перед фильтром с размерами пор от 0,05 мкм до 2 мкм, а также один или более отборов образцов заданным валидным способом, что обеспечивают посредством отбора образцов из потока текучей среды в заданный момент времени по отношению к первому и/или второму технологическому блоку и/или отбора образцов из потока текучей среды, когда определенная характеристика потока текучей среды достигает заданного порогового значения. Таким образом, теоретически точки отбора образцов могут быть расположены непосредственно до и после фильтра с размерами пор от 0,05 мкм до 2 мкм.

При использовании в настоящем документе термин «проточный» означает режим эксплуатации хроматографического блока, в котором примеси специфически связываются разделительной средой, в то время как целевой продукт не связывается, что, таким образом, обеспечивает «проточный» режим выделения желательного продукта, и/или в котором целевой продукт и один или более примесей одновременно связываются разделительной средой. Во втором случае примеси связываются разделительной средой сильнее, чем целевой продукт, и, следовательно, когда продолжается загрузка, становится возможным «проточное» выделение несвязанного целевого продукта. Другими словами, поток текучей среды, выходящий из хроматографического технологического блока в течение всего времени загрузки продукта в хроматографический технологический блок, составляет поток продукта.

При использовании в настоящем документе термин «связывай и элюируй» означает режим эксплуатации хроматографического блока, в котором продукт дифференцированно связывается хроматографической средой. Следовательно, хроматография типа связывай и элюируй включает по меньшей мере стадии загрузки, промывки, элюирования и регенерации хроматографической колонки, причем поток текучей среды, выходящий из хроматографической колонки в течение элюирования, представляет собой поток продукта.

Пример способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа, в котором отбор образцов потока текучей среды заданным валидным способом осуществляют посредством отбора образцов из потока текучей среды в заданный момент времени по отношению к первому и/или второму технологическому блоку и/или отбора образцов из потока текучей среды, когда определенная характеристика потока текучей среды достигает заданного порогового значения, представляет собой отбор образцов из проточной хроматографической колонки после цикла пропускания продукта через колонку. Без намерения ограничения теорией неожиданно обнаружено, что образец представляет собой среднюю концентрацию загрязняющей примеси или выше чем среднюю концентрацию загрязняющей примеси, и это позволяет сделать вывод, что поток текучей среды данного производственного процесса удовлетворяет, например, критериям, заданным регулирующими органами или предписанным правилами, такими как GMP. Таким образом, если концентрация загрязняющей примеси в указанном образце, отобранном заданным валидным способом, является ниже требуемого критического уровня, это означает, что концентрация загрязняющей примеси всего обработанного потока текучей среды является ниже критического значения.

Момент времени отбора образца валидным способом может быть определен различными путями.

Этот момент времени может быть установлен на основании значений, полученных в течение экспериментов по определению характеристик процессов. Например, в случае ионообменной хроматографии, осуществляемой в проточном режиме, определено, что поток текучей среды проходит хроматографию в течение двух часов. Таким образом, установленный момент времени для отбора образца заданным валидным способом составляет 1 час 55 минут.

Аналогичным образом, данная характеристика может быть задана различными путями.

Один пример представляет собой отбор образцов из потока текучей среды, когда определенная характеристика потока текучей среды достигает заданного порогового значения, такого как, например, определенное количество продукта, такой как загрузка антител. Например, в случае хроматографии, осуществляемой в проточном режиме, определено, что максимальная загрузка колонки составляет 2 г антител на литр объема колонки. Таким образом, когда устанавливают новую колонку, счетчик, например, встроенный в систему автоматического управления процессом, устанавливают в исходное положение, а затем наблюдают загрузку колонки, например, посредством наблюдения скорости движения потока текучей среды и концентрации продукта в потоке текучей среды, например, измеряя поглощение при 280 нм. Образец отбирают, как только загрузка колонки достигает порогового значения, составляющего 1,95 г антител на литр объема колонки.

Другой пример представляет собой отбор образцов из потока текучей среды, когда определенная характеристика потока текучей среды достигает заданного порогового значения, например, когда определенный заданный объем загружают в хроматографическую колонку. Например, определено, что критический объем составляет 2 литра на 1 мл объема колонки. Таким образом, когда колонку присоединяют к проточному устройству, счетчик, например, встроенный в систему автоматического управления процессом, устанавливают в исходное положение, а затем наблюдают объем потока текучей среды, который проходит через вышеупомянутую хроматографическую колонку, например, посредством наблюдения скорости перекачивания определенных насосов. Образец отбирают, как только объем пропущенного потока текучей среды достигает порогового значения, составляющего 1,95 литра на 1 мл объема колонки.

Следующий пример представляет собой отбор образцов из потока текучей среды, когда определенная характеристика потока текучей среды достигает заданного порогового значения, например, когда определенный заданный объем элюируется из колонки на стадии хроматографии типа связывай и элюируй. Например, определено, что максимальная концентрация загрязняющей примеси достигается после критического объема элюирования, составляющего от 2 до 2,5 объемов колонки. Таким образом, когда колонку присоединяют к проточному устройству, счетчик, например, встроенный в систему автоматического управления процессом, устанавливают в исходное положение, а затем наблюдают объем элюирования. Как только объем элюирования достигает порогового значения, близкого к критическому объему элюирования, который составляет от 2 до 2,5 объемов колонки, осуществляют отбор образца, например, дифференциальный или интегральный отбор. В случае дифференциального отбора образца этот образец осуществляют в течение короткого периода, в который достигается заданный критический объем элюирования, составляющий от 2 до 2,5 объемов колонки. В случае интегрального отбора образца этот образец отбирают непрерывно в течение периода, в который достигается заданный критический объем элюирования, составляющий от 2 до 2,5 объемов колонки. Как правило, в случае интегрального отбора образца этот образец отбирают непрерывно в течение заданного периода, т. е. количества времени. Отбор образца в интегральном режиме может представлять собой преимущество, если необходимо отслеживание концентрации нескольких загрязняющей примеси, которые трудно отделить друг от друга. Кроме того, интегральный отбор образцов может быть осуществлен в повторяющемся, но в целом постоянном режиме, например, процедура интегрального отбора образцов для первого образца начинается в день 1 в момент времени X и заканчивается в день 2 в момент времени X₁, процедура интегрального отбора образцов для второго образца начинается в день 2 в момент времени X₁ и заканчивается в день 3 в момент времени X₂ и так далее. Другими словами, отбирают подсерии из непрерывного потока текучей среды.

Согласно одному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа поток текучей среды представляет собой поток продукта.

Этот поток продукта, например, вытекает из одного технологического блока в другой технологический блок до тех пор, пока не достигнуты желательные характеристики продукта. Это означает, что требуемое число технологических блоков можно соединять, например, в модульном режиме для достижения желательной характеристики данного продукта.

В таком же производственном процесс можно применить как описанный в настоящем документе способ отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа, в котором поток текучей среды представляет собой поток продукта, так и описанный в настоящем документе способ отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа, в котором поток текучей среды не содержит продукт.

Согласно одному варианту осуществления способа отслеживания концентрации по меньшей мере одной загрязняющей примеси продукт содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, которую составляют пептид, белок, низкомолекулярное лекарственное средство, нуклеиновая кислота.

При использовании в настоящем документе термин «пептид» означает аминокислотный полимер относительно малой длины (например, содержащий менее чем 50 аминокислотных звеньев). Этот полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать звенья из модифицированных аминокислот, и между аминокислотными звеньями могут присутствовать неаминокислотные звенья. Данный термин также охватывает аминокислотный полимер, который модифицирован, например, посредством образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой операции, такой как сочетание с маркирующим компонентом, таким как, без ограничения, флуоресцентные маркеры, частицы, биотин, гранулы, белки, радиоактивные метки, хемилюминесцентные метки, биолюминесцентные метки и т. п.

При использовании в настоящем документе термин «белок» означает полипептид из аминокислот. Данный термин охватывает белки, которые могут быть полноразмерными, относиться к дикому типу или представлять собой соответствующие фрагменты. Белок может быть человеческим, нечеловеческим, искусственным или представлять собой химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты и встречающихся в природе аминокислотных полимеров, а также не встречающийся в природе аминокислотный полимер.

Предпочтительно белок представляет собой терапевтический белок.

При использовании в настоящем документе термин «терапевтический белок» означает белок, который может быть введен в организм, чтобы вызвать биологический или медицинский отклик ткани, органа или системы вышеупомянутого организма.

Еще предпочтительнее белок представляет собой антитело.

Термин «антитело» при использовании в настоящем документе означает связующую молекулу, такую как иммуноглобулин или иммунологически активная часть иммуноглобулина, т. е. молекулу, которая содержит антигенсвязывающий центр.

При использовании в настоящем документе термин «низкомолекулярное лекарственное средство» означает соединение, имеющее низкую молекулярную массу (<900 дальтон), которое может способствовать регулированию биологического процесса.

При использовании в настоящем документе термин «нуклеиновая кислота» означает дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды и их полимеры в одноцепочеченой или двухцепочечной форме. Если отсутствуют конкретные ограничения, этот термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие аналоги природных нуклеотидов, имеющие связующие свойства, аналогичные свойствам сравнительной нуклеиновой кислоты, и подвергаемые метаболизму аналогично встречающимся в природе нуклеотидам. Если не указано иное условие, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также считается охватывающей соответствующие консервативно модифицированные варианты (например, вырожденные кодонные замещения) и комплементарные последовательности, а также определенно указанную последовательность.

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа, в котором отбор образцов потока текучей среды заданным валидным способом осуществляют посредством отбора образцов из потока текучей среды в заданный момент времени по отношению к первому и/или второму технологическому блоку и/или отбора образцов из потока текучей среды, когда определенная характеристика потока текучей среды достигает заданного порогового значения, первый из по меньшей мере двух технологических блоков, через которые проходит поток текучей среды, представляет собой хроматографический технологический блок типа связывай и элюируй.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа, в котором отбор образцов потока текучей среды заданным валидным способом осуществляют посредством отбора образцов из потока текучей среды в заданный момент времени по отношению к первому и/или второму технологическому блоку и/или отбора образцов из потока текучей среды, когда определенная характеристика потока текучей среды достигает заданного порогового значения, первый из по меньшей мере двух технологических блоков, через которые проходит поток текучей среды, представляет собой хроматографический технологический блок проточного типа.

Этот вариант осуществления имеет преимущество, заключающееся в том, что заданный момент времени для отбора образцов потока текучей среды заданным валидным способом может быть выбран по отношению к времени элюирования хроматографического технологического блока типа связывай и элюируй.

При использовании в настоящем документе термин «время элюирования» означает время, в течение которого осуществляется непрерывное элюирование конкретной хроматографической колонки.

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа, в котором отбор образцов потока текучей среды заданным валидным способом осуществляют посредством отбора образцов из потока текучей среды в заданный момент времени по отношению к первому и/или второму технологическому блоку и/или отбора образцов из потока текучей среды, когда определенная характеристика потока текучей среды достигает заданного порогового значения, определенная характеристика потока текучей среды представляет собой заданную загрузку антител в расчете на объем колонки и/или заданный загрузочный объем хроматографической колонки проточного типа и/или заданный объем элюирования хроматографической колонки типа связывай и элюируй.

Согласно предпочтительному варианту осуществления описанного выше способа отслеживания концентрации по меньшей мере одной загрязняющей примеси способ дополнительно включает стадию сравнения концентрации загрязняющей примеси с заданным эталонным значением.

Эта стадия позволяет оценить, находится ли концентрация загрязняющей примеси ниже заданного эталонного значения или нет.

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа способ осуществляет и регулирует автоматизированная система управления технологическими процессами, которая отбирает образцы автоматически.

Оказывается предпочтительным, что согласно этому варианту осуществления по меньшей мере два фильтра с размерами пор между 0,05 мкм и 0,2 мкм установлены параллельно, таким образом, что первый фильтр может быть автоматически заменен в условиях с уменьшенным числом микроорганизмов, причем автоматическая замена фильтра предпочтительно включает следующие стадии:

(i) переключение проточного устройства на второй, т. е. новый фильтр, когда пороговое значение превышено на датчике давления на стороне ретентата, с закрытием проточного устройства, причем котором продукт в первом, т. е. использованном фильтре смещен на сторону фильтрата, предпочтительно посредством газа или жидкости, или когда максимальное время первого используемого фильтра в проточном устройстве превышено, или когда превышен максимальный объем фильтрата через первый используемый фильтр,

(ii) вентиляция второго нового фильтра через воздушный фильтр на выпускном клапане нового фильтра, предпочтительно с переносом продукта в новый фильтр посредством питающего насоса или в закрытом пакете, прикрепленном в режиме уменьшения числа микроорганизмов,

(iii) обнаружение завершения вентиляции второго нового фильтра на стороне ретентата посредством датчика давления или датчика достижения уровня, или весов, или детектора жидкости,

(iv) открытие выпуска фильтрата и закрытие проточного устройства между выпускным клапаном и воздушным фильтром посредством клапана, и

(v) замена старого фильтра новым фильтром.

Одновременный или последовательный перенос продукта в новый фильтр может быть осуществлен, например, с помощью питающего насоса.

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа все компоненты, которые вступают в контакт с потоком текучей среды, стерилизуют посредством подходящего способа уменьшение числа микроорганизмов, причем способ уменьшения числа микроорганизмов способ предпочтительно выбирают из группы, которую составляют гамма-облучение, бета-облучение, обработка в автоклаве, обработка этиленоксидом (ETO), обработка озоном (O₃), обработка пероксидом водорода (H₂O₂) и обработка паром на месте (SIP).

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа поток текучей среды временно удерживают в пакете для хранения, и поток текучей среды кратковременно перемешивают в указанном пакете для хранения перед отбором образцов из потока текучей среды заданным валидным способом.

Такие контейнеры для хранения часто используют в непрерывных процессах в целях учета различий времени обработки, требуемого для различных технологических блоков. Однако постоянное перемешивание в вышеупомянутых пакетах для хранения может производить неблагоприятные воздействия, например, напряжение сдвига, образование невидимых невооруженным глазом частиц и/или агрегатов, на продукт, содержащийся в потоке текучей среды.

В настоящее время неожиданно обнаружено, что кратковременное перемешивание, т. е. перемешивание в течение короткого промежутка времени перед отбором образца потока текучей среды в пакете для хранения, не производит неблагоприятного воздействия на продукты, содержащиеся в потоке текучей среды, причем в то же время гарантирован гомогенный образец, который представляет собой средний состав потока текучей среды.

Короткий промежуток времени, в течение которого происходит кратковременное перемешивание, имеет продолжительность, составляющую предпочтительно от 30 секунд до 10 минут, предпочтительнее от 1 минуты до 5 минут, наиболее предпочтительно от 2 минут до 4 минут, в целях сокращения до минимума потенциального ущерба, наносимого продукту.

Такое кратковременное перемешивание может быть осуществлено автоматически например, посредством рециркуляционного насоса.

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа все компоненты, которые вступают в контакт с потоком текучей среды, представляют собой изделия разового пользования, или их применяют как изделия разового пользования.

Кроме того, оказывается возможным, что различные варианты осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа и, в частности, различные пути отбора образцов из потока текучей среды заданным валидным способом выбирают в различных точках, через которые поток текучей среды проходит в течение данного производственного процесса. Другими словами, комбинация различных вариантов осуществления способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа может быть использована в одном и том же производственном процессе.

Другой аспект, который описан в настоящем документе, относится к применению способа отслеживания концентрации загрязняющей примеси по меньшей мере одного типа в непрерывном процессе получения терапевтических белков.

Согласно предпочтительному варианту осуществления, вышеупомянутое применение способа относится к непрерывному процессу, проводимому в условиях уменьшения числа микроорганизмов для получения и/или обработки терапевтического белка, такого как антитело, из гетерогенной текучей смеси клеточной культуры, включая следующие стадии:

(a) получение не содержащей частиц текучей среды из гетерогенной текучей смеси клеточной культуры, которая содержит продукт в форме потока продукта,

(b) по меньшей мере одна фильтрация с получением фильтрата,

(c) по меньшей мере две стадии хроматографии для очистки продукта,

(d) по меньшей мере одно удаление вируса и

(e) по меньшей мере одна ультрафильтрация и/или по меньшей мере одна диафильтрация потока продукта, полученного на стадиях (b), (c) и/или (d),

и способ отличается тем, что по меньшей мере две хроматографические стадии (c) включают очистку посредством по меньшей мере двух хроматографических колонок и/или мембранных абсорберов на каждой стадии.

Согласно одному варианту осуществления вышеупомянутого применения способ применяют в непрерывном процессе, проводимом в условиях уменьшения числа микроорганизмов для получения и/или обработки терапевтического белка, в котором гетерогенную текучую смесь клеточной культуры получают на стадии (a) в условиях периодической подпитки и осуществляют промывание буферным раствором между обработкой различных собранных партий.

При использовании в настоящем документе термин «периодическая подпитка» означает состояние культуры, в котором клеточную культурную среду добавляют в клеточную культуру в течение культивации, но никакое непрерывное удаление клеточной культурной среды не происходит в течение культивации.

При использовании в настоящем документе термин «промывание буферным раствором» означает промывание всего проточного устройства для потока текучей среды буферным раствором для обеспечения того, чтобы технологические параметры, технологические условия и измеряемые характеристики качества полностью совпадали для каждой партии в биореакторе.

Таким образом, эффект этого промывания буферным раствором заключается в том, что если возникает несоответствие в отношении характеристик качества данного продукта, можно установить связь этого несоответствия с одной партией биореактора, чтобы определить, связано ли несоответствие с клеточной культурой, а также клеточную культуру, к которой это относится, соответственно. Другими словами, поскольку состояние клеточной культуры может производить значительное воздействие на критические характеристики качества, этот подход позволяет определить, связано ли несоответствие критических характеристик качества с клеточной культурой или нет, а также конкретную клеточную культуру, к которой это относится, соответственно.

Такое промывание буферным раствором может быть также осуществлено независимо от способа, описанного в настоящем документе, например, каждый раз перед началом обработки гетерогенной текучей смеси, например, гетерогенной текучей смеси клеточной культуры, полученной из другого источника, например, собранной партии.

Согласно другому варианту осуществления вышеупомянутого применения способ используют для непрерывного процесса в условиях уменьшения числа микроорганизмов для получения и/или обработки терапевтического белка, в котором гетерогенную текучую смесь клеточной культуры получают на стадии (a) как непрерывную клеточную культуру или с периодической подпиткой и осуществляют промывание буферным раствором в интервалах между обработкой определенных собранных объемов и/или через определенные промежутки времени.

Применение определенных собранных объемов и/или промежутков времени в установлении идеального момента времени для промывания буферным раствором позволяет определить, связано ли несоответствие с клеточной культурой даже в условиях непрерывной клеточной культуры.

При использовании в настоящем документе термин «непрерывная клеточная культура» означает состояние культуры, в котором раствор, такой как клеточная культурная среда, добавляют в клеточную культуру и непрерывно удаляют клеточную культуру с помощью аспиратора в течение культивации.

Один пример непрерывной клеточной культуры представляет собой перфузионную клеточную культуру. При использовании в настоящем документе термин «перфузионный» означает тип непрерывной клеточной культуры, в которой клеточную культурную среду непрерывно добавляют в клеточную культуру и удаляют из клеточной культуры в течение культивации. Чтобы поддерживать уровни плотности клеток, по меньшей мере часть культивированных клеток необходимо сохранять в резервуаре клеточной культуры или отделять от удаляемой среды в условиях перфузионной клеточной культуры. В случае отделения вне резервуара клеточной культуры клетки необходимо возвращать в резервуар клеточной культуры после их отделения от удаленного аспиратором раствора. Кроме того, в условиях перфузионной культуры часть культивируемых клеток, как правило, отбраковывают, т. е. не сохраняют в резервуаре культуры и не возвращают в него в целях поддержания целевой плотности данных клеток и удаляют нежизнеспособные клетки («очистка»).

При использовании в настоящем документе термин «определенные собираемые объемы» означает заданные объемы раствора, получаемого на стадии (a) указанного применения способа, описанного в настоящем документе. Другими словами, после достижения или превышения заданного объема не содержащей частиц текучей среды из гетерогенной текучей смеси клеточной культуры, которая содержит продукт в форме потока продукта, осуществляют промывание буферным раствором.

В качестве альтернативы, может быть задан период времени например, суточный, недельный и т. д., и промывание буферным раствором осуществляют после истечения данного промежутка времени.

Кроме того, комбинация определенных собираемых объемов и промежутков времени может быть также использована для определения момента времени, в который необходимо осуществлять промывание буферным раствором, например, в условиях непрерывной клеточной культуры.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Способ получения биофармацевтического и биологического продукта, к которому применен способ, описанный в настоящем документе, обычно включает по меньшей мере следующие технологические стадии, которые обычно сочетают друг с другом следующим образом:

B. По направлению потока

- Отделение клеток

- Замена буферного раствора или среды предпочтительно с концентрированием

- Уменьшение бионагрузки предпочтительно с помощью стерильного фильтра

- Препаративная хроматография

- Инактивация вирусов

- Нейтрализация, т. е. регулирование pH и электропроводности

- Хроматографическая промежуточная и тонкая очистка

- Регулирование pH и электропроводности

- Уменьшение бионагрузки, например, с помощью стерильного фильтра

- Замена буферного раствора и предпочтительное концентрирование

- Вирусная фильтрация

- Фильтрация через стерильный фильтр.

В качестве примера микробных исследований выбраны три основные технологические стадии.

1. Нейтрализация после инактивации вирусов

2. Регулирование pH и электропроводности после заключительной стадии хроматографии

3. Вирусная фильтрация

На фиг. 1 представлено устройство для отбора образцов, которое было использовано в трех точках отбора образцов для анализа микробов и эндотоксинов, т. е. представлен примерный способ отслеживания концентрации по меньшей мере одной загрязняющей примеси, в котором загрязняющая примесь по меньшей мере одного типа представляет собой микробную загрязняющую примесь и/или ядовитую загрязняющую примесь. Насос (2) перекачивает продукт с предшествующей технологической стадии (1) в фильтрационный блок. Продукт протекает только через один активный фильтр, в том числе посредством клапанов (3a) и (5a) через фильтр (4a) или посредством клапанов (3b) и (5b) через фильтр (4b), в пакет для хранения, также называемый резервуар (6) для хранения следующего технологического блока. В качестве фильтров использовали фильтры Sartopore 2 XLG с размером пор 8 (0,2 мкм) (Sartorius, 5445307G8G). Указанные фильтры снабжены гидрофобными воздушными фильтрами (7a, 7b) 0,2 мкм для деаэрации при начальной фильтрации. Поток был направлен сверху вниз, и воздушные фильтры были установлены на верхнем вентиляционном клапане. Нижний вентиляционный клапан фильтра был оборудован трубкой Cflex (внутренний диаметр 3,2 мм), к которой могут быть герметично приварены предварительно стерилизованные однолитровые пакеты Flexboy® (9a, 9b). Образцы отбирали, открывая запорные клапаны (8a) или (8b), соответственно. Для автоматического стерильного отбора образцов могут быть использованы клапаны (8a) и (8b), представляющие собой запорные клапаны с пневматическим или электрическим управлением, которое может осуществлять центральная система управления технологическими процессами (PCS).

Пример 2: проточная хроматография

На фиг. 2 представлено устройство для отбора образцов, которое может быть использовано для анализа немикробной загрязняющей примеси после технологической стадии проточной хроматографии, т. е. представлен примерный способ отслеживания концентрации по меньшей мере одной загрязняющей примеси, в котором отбор образцов из потока текучей среды заданным валидным способом осуществляют посредством отбора образцов из потока текучей среды в заданный момент времени по отношению к первому и/или второму технологическому блоку. Загрузочный насос (2) стадии (1) проточной хроматографии перекачивает продукт через хроматографическую колонку 12a или колонку 12b. В обеих колонках использован одинаковый материал на основе смолы, который занимает одинаковый объем колонки (Vcol). После пропускания определенного числа N объемов колонки начинают регенерацию полностью загруженной хроматографической колонки, и при это происходит загрузка второй хроматографической колонки. Поток продукт протекает через фильтрационный блок в пакет (6) для хранения следующего технологического блока. Продукт протекает только через один активный фильтр, в том числе посредством клапанов 3a и 5a через фильтр 4a или посредством клапанов 3b и 5b через фильтр 4b. В качестве фильтров использовали фильтры Sartopore 2 XLG с размером пор 8 (0,2 мкм) (Sartorius, 5445307G8G). Указанные фильтры снабжены гидрофобными воздушными фильтрами (7a, 7b) 0,2 мкм для деаэрации при начальной фильтрации. Продукт затем протекает через клапан (10) продукта в пакет (6) для хранения или через клапан (8) отбора образцов в пакет (9) для отбора образцов. В качестве пакета для отбора образцов может быть использован стерилизованный однолитровый пакет Flexboy®, который устанавливают/удаляют замкнутым или функционально замкнутым способом, например, посредством стерильной сварки трубок.

На фиг. 3 представлено, что концентрация загрязняющей примеси, представляющей собой белки клетки-хозяина (HCP), на мембранном абсорбере увеличивается при увеличении объема или количества продукта, загружаемого в хроматографическую колонку. Если бы отбор образцов осуществляли только в конкретные моменты времени, но независимо от загрузки хроматографической колонки, была бы высокой изменчивость результатов исследований CQA. Чтобы продемонстрировать технологический контроль CQA, образец продукта следует отбирать из конечных объемов колонки при загрузке колонки.

Это обеспечивают посредством применения автоматизированной системы управления технологическими процессами.

Локальная система управления хроматографической стадии (1) интегрирует объем, введенный в колонку в фазе загрузки. Хотя фактическое количество белка, загружаемое в колонку, а не загрузочный объем является критическим для CQA в проточном режиме, может быть использован оперативный метод анализа, такой как измерение поглощения УФ излучения при 280 нм. Сигнал УФ затем интегрируют со скоростью потока продукта. Интегрированное значение передают из локальной PCS в центральную систему управления, такую как Siemens PCS 7, используя, например, протокол OPC или Profibus. Когда интегрированное значение достигает валидированного критического порогового уровня для отбора образцов, т. е. выполняется условие отбора образцов, центральная PCS начинает процедуру отбора образцов. Таким образом, отбор образцов заданным валидным способом в данном примере зависит от заданного порогового значения УФ сигнала. После возможного периода задержки вследствие блокировки фильтрационной системы PCS открывает клапан 8 и закрывает клапан 9.

Оба клапана могут представлять собой запорные клапаны с пневматическим или электрическим управлением.

Исследования, которые привели к настоящей заявке, профинансированы посредством гранта 031A616M в рамках проекта «Wissensbasierte Prozessintelligenz-Neue Wege zu stabilen Bioprozessen Teilprojekt M».

Реферат

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ отслеживания концентрации по меньшей мере одного типа загрязняющей примеси в потоке текучей среды, а также применение указанного способа в непрерывном процессе для получения биофармацевтического, биологического, высокомолекулярного продукта. Способ включает обеспечение технологических блоков, обеспечение потока текучей среды через технологические блоки, отбор образцов из потока текучей среды заданным валидным способом, определение концентрации загрязняющей примеси в образце, обеспечение разделяющего технологические блоки фильтра с размерами пор между 0,05 мкм и 2 мкм, где отбор образцов из потока текучей среды осуществляют посредством отбора образцов из потока текучей среды непосредственно перед его прохождением через указанный фильтр. Способ осуществляют в условиях непрерывности, замкнутости и уменьшенного числа патогенов, причем тип загрязняющей примеси является микробной загрязняющей примесью и/или ядовитой загрязняющей примесью. Изобретения обеспечивают получение образца, представляющего среднюю концентрацию загрязняющей примеси или более высокую концентрацию, чем средняя концентрация загрязняющей примеси, в непрерывном потоке текучей среды. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

Формула