Биосинтетическое получение стевиоловых гликозидов и связанные с этим способы - RU2019114181A
Код документа: RU2019114181A
Формула
1. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, полученный с помощью трансформированной клеточной системы, выращенной в среде.
2. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 1, где указанная трансформированная клеточная система выбрана из группы, состоящей из дрожжей, растений, отличных от продуцирующих стевиоловый гликозид, водорослей и бактерий.
3. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 1, где указанный стевиоловый гликозид представляет собой Reb D4 структуры:
4. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 1, где указанный стевиоловый гликозид представляет собой Reb WB1.
5. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 1, где указанный стевиоловый гликозид представляет собой Reb WB2.
6. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 1, где исходным материалом является стевиол.
7. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 2, где указанная клеточная система представляет собой E. coli.
8. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 2, где содержание указанного стевиолового гликозида характеризуется чистотой, составляющей по меньшей мере 70%.
9. Потребительский продукт, содержащий подслащивающее количество стевиолового гликозида по п. 3.
10. Потребительский продукт, содержащий подслащивающее количество стевиолового гликозида по п. 4.
11. Потребительский продукт, содержащий подслащивающее количество стевиолового гликозида по п. 5.
12. Потребительский продукт по п. 9, выбранный из группы, состоящей из напитков, кондитерских изделий, хлебобулочных изделий, печенья и жевательных резинок.
13. Рекомбинантный полипептид CP1, содержащий последовательность ДНК, характеризующуюся по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO:3.
14. Рекомбинантный полипептид по п. 13, где аминокислотная последовательность характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью с SEQ ID NO:4.
15. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 2, где указанная клеточная система представляет собой бактерию и выбрана из группы, состоящей из Escherichia; Salmonella; Bacillus; Acinetobacter; Streptomyces; Corynebacterium; Methylosinus; Methylomonas; Rhodococcus; Pseudomonas; Rhodobacter; Synechocystis; Saccharomyces; Zygosaccharomyces; Kluyveromyces; Candida; Hansenula; Debaryomyces; Mucor; Pichia; Torulopsis; Aspergillus; Arthrobotlys; Brevibacteria; Microbacterium; Arthrobacter; Citrobacter; Escherichia; Klebsiella; Pantoea; Salmonella Corynebacterium; Clostridium и Clostridium acetobutylicum.
16. Биосинтетический способ получения стевиолового гликозида, представляющего интерес, предусматривающий:
a) обеспечение экспрессии фермента CP1 в трансформированной клеточной системе;
b) выращивание клеточной системы в среде и
c) получение стевиолового гликозида, представляющего интерес.
17. Способ по п. 16, дополнительно предусматривающий инкубирование рекомбинантной сахарозосинтазы с субстратом.
18. Способ по п. 17, дополнительно предусматривающий инкубирование рекомбинантной UDP-гликозилтрансферазы UGT85C2 с сахарозосинтазой, субстратом и рекомбинантным полипептидом CP1.
19. Способ по п. 18, дополнительно предусматривающий добавление фермента бета-глюкозидазы в реакционную смесь.
20. Способ по п. 17, где сахарозосинтаза выбрана из группы, состоящей из сахарозосинтазы 1 Arabidopsis, сахарозосинтазы 3 Arabidopsis и сахарозосинтазы Vigna radiate.
21. Способ по п. 17, где сахарозосинтаза представляет собой сахарозосинтазу 1 Arabidopsis thaliana.
22. Способ по п. 16, где полученные стевиоловые гликозиды представляют собой смесь Reb D4 и Reb M.
23. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 2, где способ получения дополнительно предусматривает i) очистку неочищенного продукта и ii) удаление растворителей в вакууме с получением концентрированного продукта.
24. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 23, где очистка указанного неочищенного продукта осуществляется с помощью колоночной хроматографии.
25. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 23, где очистка указанного неочищенного продукта осуществляется с помощью кислотно-щелочной экстракции.
26. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 23, где очистка указанного неочищенного продукта осуществляется с помощью вакуумной перегонки.
27. Стевиоловый гликозид, представляющий интерес, по п. 23, дополнительно предусматривающий очистку указанного стевиолового гликозида с использованием полупрепаративной HPLC.
28. Способ по п. 16, где указанный стевиоловый гликозид представляет собой Reb WB1.
29. Способ по п. 16, где указанный стевиоловый гликозид представляет собой Reb WB2.
30. Способ по п. 16, где указанный стевиоловый гликозид представляет собой Reb D4.
31. Способ по п. 16, где указанный стевиоловый гликозид представляет собой Reb M.
32. Способ по п. 16, дополнительно предусматривающий применение HV1 (SEQ ID NO:9).
33. Способ по п. 32, дополнительно предусматривающий применение UGT76G1 (SEQ ID NO:1).
34. Стевиоловый гликозид Reb D4, характеризующийся структурой:
35. Композиция, содержащая стевиоловый гликозид по п. 34, где содержание указанного стевиолового гликозида характеризуется чистотой, составляющей по меньшей мере 70%.
36. Потребительский продукт, содержащий подслащивающее количество стевиолового гликозида по п. 34.
37. Потребительский продукт по п. 36, выбранный из группы, состоящей из напитков, кондитерских изделий, хлебобулочных изделий, печенья и жевательных резинок.
38. Композиция, содержащая смесь Reb D4 и Reb M.
39. Стевиоловый гликозид Reb WB1, характеризующийся структурой:
40. Композиция, содержащая стевиоловый гликозид по п. 39, где содержание указанного стевиолового гликозида характеризуется чистотой, составляющей по меньшей мере 70%.
41. Потребительский продукт, содержащий подслащивающее количество стевиолового гликозида по п. 39.
42. Потребительский продукт по п. 41, выбранный из группы, состоящей из напитков, кондитерских изделий, хлебобулочных изделий, печенья и жевательных резинок.
43. Стевиоловый гликозид Reb WB2, характеризующийся структурой:
44. Композиция, содержащая стевиоловый гликозид по п. 43, где содержание указанного стевиолового гликозида характеризуется чистотой, составляющей по меньшей мере 70%.
45. Потребительский продукт, содержащий подслащивающее количество стевиолового гликозида по п. 43.
46. Потребительский продукт по п. 45, выбранный из группы, состоящей из напитков, кондитерских изделий, хлебобулочных изделий, печенья и жевательных резинок.
47. Способ получения ребаудиозида М, предусматривающий культивирование рекомбинантной клетки в подходящих для роста условиях, где указанная рекомбинантная клетка проявляет способность продуцировать стевиоловые гликозиды, при этом способ включает:
приведение в контакт указанной рекомбинантной клетки с реакционной композицией, содержащей стевиозид, сахарозосинтазу и сахарозу;
где указанная рекомбинантная клетка экспрессирует первую UDP-гликозилтрансферазу (UGT) или ее каталитически активную часть, способную использовать указанный стевиозидный субстрат для получения ребаудиозида E;
где указанная рекомбинантная клетка экспрессирует вторую UDP-гликозилтрансферазу (UGT) или ее каталитически активную часть, способную использовать указанный ребаудиозид E для получения ребаудиозида D4; и
где указанная рекомбинантная клетка экспрессирует третью UDP-гликозилтрансферазу (UGT) или ее каталитически активную часть, способную использовать указанный ребаудиозид D4 для получения ребаудиозида М.
48. Способ по п. 47, дополнительно предусматривающий ген сахарозосинтазы или ее каталитически активной части, экспрессируемый в указанной рекомбинантной клетке.
49. Способ по п. 47, дополнительно предусматривающий сахарозосинтазу, добавляемую к реакционной композиции.
50. Reb M, полученный с помощью способа по п. 47.
51. Рекомбинантная клетка, которая экспрессирует путь биосинтеза, определенный в п. 47.
52. Рекомбинантная клетка по п. 51, где клетка представляет собой дрожжевую клетку.
53. Рекомбинантная клетка по п. 51, где клетка представляет собой бактериальную клетку.
54. Рекомбинантная клетка по п. 51, где клетка представляет собой растительную клетку.
