Создание уменьшающих уровень аспарагина дрожжей путем адаптивной эволюции и их применение для уменьшения образования акриламида - RU2018104263A
Код документа: RU2018104263A
Формула
1. Выделенные не генетически модифицированные дрожжи, экспрессирующие аспарагиназу клеточной стенки и обладающие уменьшающей содержание аспарагина активностью в не индуцирующих условиях.
2. Выделенные не генетически модифицированные дрожжи по п. 1, в которых аспарагиназа клеточной стенки экспрессируется конститутивно.
3. Выделенные не генетически модифицированные дрожжи по п. 1 или 2, которые уменьшают содержание аспарагина на по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, или более, при выращивании в не индуцирующих условиях.
4. Выделенные не генетически модифицированные дрожжи по любому из пп. 1-3, в которых связанная с клеточной стенкой аспарагиназа закодирована локусом ASP3.
5. Способ выделения дрожжевого штамма, разрушающего L-аспарагин в не индуцирующих условиях, включающий:
a) субкультивирование дрожжевого штамма дикого типа, который экспрессирует, или способен экспрессировать, связанную с клеточной стенкой аспарагиназу в присутствии среды, содержащей D-аспарагин в виде единственного источника азота;
b) постоянное субкультивирование, отслеживание скорости роста и еженедельное осуществление мутагенеза;
c) отбор культур по пункту b), когда скорость роста достигает исходного уровня;
d) постоянное субкультивирование клеток в селективной среде, содержащей метиламин, отслеживание скорости роста и еженедельное осуществление мутагенеза до того момента, когда скорость роста в присутствии метиламина достигнет скорости роста в селективной среде без метиламина;
e) выделение отдельных колоний по пункту d) путем высевания на селективную среду, содержащую метиламин, выращивание указанных колоний и отбор крупных и быстро растущих колоний;
f) анализ выбранных колоний по пункту e) на способность разрушать L-аспарагин в не индуцирующих условиях и отбор по меньшей мере одной колонии с высокой разрушающей L-аспарагин активностью по сравнению с клетками в начале этапа d);
g) повторение этапов d) - f), с увеличением каждый раз концентрации метиламина, до того момента, когда разрушающая L-аспарагин активность достигнет плато;
h) выделение штамма из этапа g), в котором разрушающая L-аспарагин активность достигла плато.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что связанная с клеточной стенкой аспарагиназа закодирована локусом ASP3.
7. Способ по п. 5 или 6, отличающийся тем, что дрожжевой штамм дикого типа представляет собой пекарские дрожжи.
8. Способ по любому из пп. 5-7, отличающийся тем, что мутагенез представляет собой физический мутагенез или химический мутагенез.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что физический мутагенез представляет собой УФ-мутагенез.
10. Способ по любому из пп. 5-9, отличающийся тем, что период времени для этапов a) - c) составляет 2-4 недели.
11. Способ по любому из пп. 5-10, отличающийся тем, что период времени для этапов d) - g) составляет 6-48 недель.
12. Способ по любому из пп. 5-11, отличающийся тем, что колонии выращивают в течение 2-10 дней на этапе e) перед отбором крупных и быстро растущих колоний.
13. Способ по любому из пунктов 5-12, отличающийся тем, что на этапе g) концентрацию метиламина увеличивают медленно на еженедельной основе.
14. Способ по любому из пп. 5-13, отличающийся тем, что на этапе g) концентрацию метиламина увеличивают от 0,05 г/л до 12 г/л.
15. Способ по любому из пп. 5-14, отличающийся тем, что метиламин на этапе e) присутствует в количестве, достаточном для снижения скорости роста на 25-75% по сравнению со скоростью роста в селективной среде без метиламина.
16. Способ по любому из пп. 5-15, отличающийся тем, что отслеживание скорости роста включает измерение оптической плотности клеток или измерение размера колоний клеток, растущих на селективной среде.
17. Способ по любому из пп. 5-16, отличающийся тем, что число повторений на этапе g) составляет 5-20.
18. Выделенные дрожжи, полученные способом по любому из пп. 5-17.
19. Выделенный дрожжевой штамм, депонированный в международном депозитарии Канады (IDAC) под регистрационным номером 140515-01 (RBAR-01).
20. Выделенный дрожжевой штамм, депонированный в международном депозитарии Канады (IDAC) под регистрационным номером 140515-02 (RBAR-02).
21. Выделенный дрожжевой штамм, депонированный в международном депозитарии Канады (IDAC) под регистрационным номером 140515-03 (RBAR-03).
22. Способ уменьшения содержания аспарагина в процессе приготовления или обработки пищевых продуктов, включающий добавление дрожжевого штамма по любому из пп. 1-4 или 18-21 к пищевому продукту при приготовлении или обработке пищевого продукта; при этом дрожжи уменьшают содержание аспарагина в процессе приготовления или обработки пищевого продукта.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что дрожжевой штамм является неактивным.
24. Способ по п. 22, отличающийся тем, что дрожжевой штамм является свежим.
25. Способ по п. 22, отличающийся тем, что дрожжевой штамм представляет собой активные сухие дрожжи.
26. Способ по любому из пп. 22-25, отличающийся тем, что пищевой продукт представляет собой овощной пищевой продукт, напиток, хлебобулочный продукт, зерновой продукт, плод, бобы, молочный или мясной продукт.
27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что добавление дрожжевого штамма к пищевому продукту при приготовлении или обработке пищевого продукта включает замену дрожжевого ингредиента указанным дрожжевым штаммом.
28. Способ по п. 26, отличающийся тем, что добавление дрожжевого штамма к пищевому продукту при приготовлении или обработке пищевого продукта включает ферментацию.
29. Способ по п. 26, отличающийся тем, что пищевой продукт представляет собой картофель или продукт из картофеля.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что добавление дрожжевого штамма к пищевому продукту при приготовлении или обработке пищевого продукта включает предварительное замачивание картофеля или продукта из картофеля в смеси воды и дрожжевого штамма перед тепловой обработкой.
31. Способ по п. 26, отличающийся тем, что напиток представляет собой кофе.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что добавление дрожжевого штамма к пищевому продукту при приготовлении или обработке пищевого продукта включает замачивание кофейных бобов в экстракте кофейных бобов, который был предварительно обработан дрожжевым штаммом для уменьшения содержания аспарагина, в результате чего предварительно обработанный экстракт удаляет аспарагин из кофейных бобов перед обжариванием.
33. Пищевой продукт, имеющий сниженную концентрацию аспарагина или акриламида, который получен с использованием дрожжевого штамма по любому из пп. 1-4 или 18-21.
34. Пищевой продукт, имеющий сниженную концентрацию аспарагина или акриламида, который получен с использованием способа по любому из пп. 22-32.
