Доставка, конструирование и оптимизация систем, способы и композиции для целенаправленного воздействия и моделирования заболеваний и нарушений постмитотических клеток - RU2016101178A
Код документа: RU2016101178A
Формула
1. Способ модификации организма или отличного от человеческого организма путем манипуляции с целевой последовательностью постмитотической клетки в представляющем интерес локусе генома для вызова таким образом фенотипического изменения в постмитотической клетке, включающий
доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей:
I. полинуклеотидную последовательность системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность содержит:
(а) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью постмитотической клетки в эукариотической клетке,
(b) парную tracr-последовательность, и
(c) tracr-последовательность, и
II. полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент CRISPR, необязательно содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации,
где (a), (b) и (c) расположены в 5’-3’ ориентации,
где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью постмитотической клетки, и
где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая способна гибридизоваться с целевой последовательностью постмитотической клетки, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, где полинуклеотидная последовательность, кодирующая фермент CRISPR, представляет собой ДНК или РНК, и
где комплекс CRISPR управляет целевой последовательностью постмитотической клетки и тем самым вызывает фенотипические изменения в постмитотической клетке.
2. Способ по п. 1, где любая или все из полинуклеотидной последовательности, кодирующие фермент CRISPR, направляющую последовательность, парную tracr-последовательность или tracr-последовательность представляют собой РНК.
3. Способ по п. 1, где полинуклеотиды, кодирующие последовательность, кодирующую фермент CRISPR, направляющую последовательность, парную tracr-последовательность или tracr-последовательность, представляют собой РНК, и их доставляют посредством липосом, наночастиц, экзосом, микропузырьков или генной пушки.
4. Способ по п. 1, где полинуклеотиды содержатся в векторной системе, содержащей один или несколько векторов.
5. Способ модификации организма или отличного от человеческого организма путем манипуляции с целевой последовательностью постмитотической клетки в представляющем интерес локусе генома, включающий
доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей вирусную векторную систему, содержащую один или несколько вирусных векторов, функционально кодирующих композицию для ее экспрессии, где композиция содержит:
не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, содержащую векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих
I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность содержит или кодрует
(а) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью почки в эукариотической клетке,
(b) парную tracr-последовательность и
(c) tracr-последовательность, и
II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, необязательно содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации,
где (а), (b) и (c) расположены в 5’-3’ ориентации,
где компоненты I и II находятся в одном и том же или в разных векторах системы,
где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью почки, и
где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая способна гибридизоваться с целевой последовательностью почки, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью.
6. Способ по п. 5, где один или несколько из вирусных векторов доставляют посредством липосом, наночастиц, экзосом, микропузырьков или генной пушки.
7. Способ лечения или подавления состояния, вызванного дефектом в целевой последовательности почки в представляющем интерес локусе генома у субъекта или отличного от человека субъекта, нуждающегося в этом, включающий модификацию субъекта или отличного от человека субъекта путем манипуляции с целевой последовательностью почки, и где состояние является чувствительным к лечению или подавлению путем манипуляции с целевой последовательностью почки, включающий обеспечение лечения, включающего:
доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей векторную систему на основе AAV или лентивируса, содержащую один или несколько векторов на основе AAV или лентивируса, функционально кодирующих композицию для ее экспрессии, где манипуляцию с целевой последовательностью почки осуществляют с помощью композиции при ее экспрессии, где композиция содержит:
(A) не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, содержащую векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих
I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность содержит или кодирует
(а) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью почки в эукариотической клетке,
(b) парную tracr-последовательность и
(c) tracr-последовательность, и
II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации,
где (а), (b) и (c) расположены в 5’-3’ ориентации,
где компоненты I и II находятся в одном и том же или в разных векторах системы,
где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью почки, и
где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая способна гибридизоваться с целевой последовательностью почки, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью,
или
(B) не встречающуюся в природе или сконструированную композицию, содержащую векторную систему, содержащую один или несколько векторов, содержащих
I. первый регуляторный элемент, функционально связанный с
(а) направляющей последовательностью, способной гибридизироваться с целевой последовательностью почки в эукариотической клетке, и
(b) по меньшей мере одной или несколькими парными tracr-последовательностями,
II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, и
III. третий регуляторный элемент, функционально связанный с tracr-последовательностью,
где компоненты I, II и III находятся в одном и том же или в разных векторах системы,
где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью почки, и
где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая способна гибридизоваться с целевой последовательностью почки, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью.
8. Способ по любому из пп. 1, 5 или 7, где способ выполняют in vitro и/или ex vivo.
9. Способ по любому из пп. 1, 5 или 7, включающий индуцирование экспрессии.
10. Способ по любому из пп. 1, 5 или 7, где организм или субъект является эукариотом.
11. Способ по п. 10, где организм или субъект является отличным от человека эукариотом.
12. Способ по любому из пп. 1, 5 или 7, где организм или субъект является млекопитающим или отличным от человека млекопитающим.
13. Способ по любому одному из пп. 5 или 7, где вирусный вектор представляет собой вектор на основе AAV или лентивирусный вектор.
14. Способ по любому из пп. 1, 5 или 7, где ферментом CRISPR является Cas9.
15. Способ по любому из пп. 1, 5 или 7, где экспрессия направляющей последовательности находится под контролем промотора T7 и управляется экспрессией полимеразы T7.
16. Способ доставки фермента CRISPR по любому из предыдущих пунктов, включающий доставку в клетку мРНК, кодирующей фермент CRISPR.
17. Способ по любому из пп. 1, 5, 7 или 16, где полинуклеотид или кодирующую фермент последовательность, кодирующие фермент CRISPR, доставляют в постмитотическую клетку путем доставки мРНК, кодирующей фермент CRISPR, в постмитотическую клетку.
18. Способ получения вектора на основе AAV или лентивируса по п. 7, включающий трансфекцию плазмиды(плазмид), содержащей молекулу(молекулы) нуклеиновой кислоты, кодирующую AAV или лентивирус, или состоящих, по сути, из них, в клетки, инфицированные AAV или инфицированные лентивирусом, и обеспечение rep и/или cap AAV или лентивируса и/или вспомогательных молекул нуклеиновой кислоты, обязательных для репликации и упаковки AAV или лентивируса.
19. Способ получения вектора на основе AAV или лентивируса для применения в способе по п. 7, включающий трансфекцию плазмиды(плазмид), содержащей молекулу(молекулы) нуклеиновой кислоты, кодирующую AAV или лентивирус, или состоящих, по сути, из них, в клетки, инфицированные AAV или инфицированные лентивирусом, и обеспечение rep и/или cap AAV или лентивируса и/или вспомогательных молекул нуклеиновой кислоты, обязательных для репликации и упаковки AAV или лентивируса.
20. Способ по п. 18 или 19, где rep и/или cap AAV или лентивируса, обязательные для репликации и упаковки AAV или лентивируса, обеспечивают путем трансфекции постмитотических клеток плазмидой-помощником(плазмидами-помощниками) или вирусом-помощником(вирусами-помощниками).
21. Способ по п. 20, где вирусом-помощником является поксвирус, аденовирус, лентивирус, герпесвирус или бакуловирус.
22. Способ по п. 21, где поксвирусом является вирус осповакцины.
23. Способ по любому из пп. 18 или 19, где клетки, инфицированные AAV или лентивирусом, представляют собой клетки млекопитающего.
24. Способ по любому из пп. 18 или 19, где клетки, инфицированные AAV или лентивирусом, представляют собой клетки насекомого, а вирус-помощник (если присутствует) представляет собой бакуловирус.
25. Способ по любому из пп. 1, 5, 7, 16, 18 или 19, где целевая последовательность почки фланкируется на своем 3’ конце, или за ней следует 5’-NRG (где N представляет собой любой нуклеотид), или где фермент CRISPR получают из (или происходит из) рода, принадлежащего к группе, состоящей из Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma и Campylobacter.
26. Способ по любому из пп. 1, 5, 7, 16, 18 или 19, где полинуклеотид системы CRISPR-Cas является химерной РНК (chiRNA).
27. Способ по любому из пп. 1, 5, 7, 16, 18 или 19, где система CRISPR-Cas представляет собой мультиплексную ферментную систему CRISPR, дополнительно содержащую несколько химер и/или несколько направляющих последовательностей для нескольких мишеней и одну tracr-последовательность.
28. Способ по любому из пп. 1, 5, 7, 16, 18 или 19, где фермент CRISPR является нуклеазой, управляющей расщеплением обеих нитей в определенной точке целевой последовательности.
29. Способ по любому из пп. 1, 5, 7, 16, 18 или 19, где фермент CRISPR содержит одну или несколько мутаций.
30. Способ по п. 29, где фермент CRISPR содержит одну или несколько мутаций D10A, E762A, H840A, N854A, N863A или D986A.
31. Способ по п. 29, где одна или несколько мутаций находятся в домене RuvC1 фермента CRISPR.
32. Способ по п. 28, где фермент CRISPR является никазой, управляющей расщеплением в определенной точке целевой последовательности.
33. Способ по п. 32, где никаза является двойной никазой.
34. Способ по любому из пп. 1, 5, 7, 16, 18 или 19, дополнительно включающий по меньшей мере две или более NLS.
35. Способ по любому из пп. 1, 5, 7, 16, 18 или 19, где фермент CRISPR имеет одну или несколько мутаций в каталитическом домене, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и где фермент дополнительно содержит функциональный домен.
36. Способ по п. 35, где функциональный домен является доменом активации транскрипции.
37. Способ по п. 36, где доменом активации транскрипции является VP64.
38. Способ по любому из пп. 1, 5, 7, 16, 18 или 19, дополнительно включающий сведение к минимуму нецелевых модификаций посредством манипуляции с первой и второй целевой последовательностью на противоположных нитях ДНК-дуплекса в представляющем интерес локусе генома в клетке, включающий
доставку не встречающейся в природе или сконструированной композиции, содержащей:
I. полинуклеотидную последовательность химерной РНК (chiRNA) системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность содержит:
(a) первую направляющую последовательность, способную гибридизироваться с первой целевой последовательностью,
(b) первую парную tracr-последовательность,
(c) первую tracr-последовательность,
(d) вторую направляющую последовательность, способную гибридизироваться со второй целевой последовательностью,
(e) вторую парную tracr-последовательность и
(f) вторую tracr-последовательность, и
где необязательно между первой tracr-последовательностью и второй направляющей последовательностью находится линкерная последовательность, в результате чего первая направляющая последовательность и вторая направляющая последовательность расположены последовательно; и
II. полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент CRISPR, содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации, где (a), (b), (c), (d), (e) и (f) расположены в 5’-3’ ориентации, в результате чего первая направляющая последовательность и вторая направляющая последовательность расположены последовательно, и где при транскрипции первая и вторая парные tracr-последовательности гибридизируются с первой и второй tracr-последовательностями, соответственно, а первая и вторая направляющие последовательности управляют специфичным к последовательности связыванием первого и второго комплексов CRISPR с первой и второй целевыми последовательностями, соответственно,
или
II. второй регуляторный элемент, функционально связанный с кодирующей фермент последовательностью, кодирующей фермент CRISPR, и где компоненты I и II находятся в одном и том же или в разных векторах системы, и при транскрипции первая парная tracr-последовательность гибридизируется с первой tracr-последовательностью, а первая и вторая направляющие последовательности управляют специфичным к последовательности связыванием первого и второго комплексов CRISPR с первой и второй целевыми последовательностями, соответственно;
где первый комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) первой направляющей последовательностью, которая способна гибридизоваться с первой целевой последовательностью, и (2) первой парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с первой tracr-последовательностью,
где второй комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс со (1) второй направляющей последовательностью, которая способна гибридизоваться со второй целевой последовательностью, и (2) второй парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется со второй tracr-последовательностью,
где полинуклеотидная последовательность, кодирующая фермент CRISPR, представляет собой ДНК или РНК, и
где первая направляющая последовательность управляет расщеплением одной нити ДНК-дуплекса возле первой целевой последовательности, а вторая направляющая последовательность управляет расщеплением другой нити возле второй целевой последовательности, индуцируя двухнитевой разрыв, с модификацией, таким образом, организма или отличного от человеческого организма путем сведения к минимуму нецелевых модификаций.
39. Композиция, содержащая:
(A) - I. полинуклеотидную последовательность системы CRISPR-Cas, где полинуклеотидная последовательность содержит или кодирует:
(а) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью почки в эукариотической клетке,
(b) парную tracr-последовательность и
(c) tracr-последовательность, и
II. полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент CRISPR, необязательно содержащий по меньшей мере одну или несколько последовательностей ядерной локализации,
где (а), (b) и (c) расположены в 5’-3’ ориентации,
где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью почки, и
где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая способна гибридизоваться с целевой последовательностью почки, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, и полинуклеотидная последовательность, кодирующая фермент CRISPR, представляет собой ДНК или РНК,
или
(B) I. полинуклеотиды, содержащие или кодирующие:
(а) направляющую последовательность, способную гибридизироваться с целевой последовательностью почки в эукариотической клетке, и
(b) по меньшей мере одну или несколькo парных tracr-последовательностей,
II. полинуклеотидную последовательность, кодирующую фермент CRISPR, и
III. полинуклеотидную последовательность, содержащую tracr-последовательность,
где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью почки, и
где комплекс CRISPR содержит фермент CRISPR, образующий комплекс с (1) направляющей последовательностью, которая способна гибридизоваться с целевой последовательностью почки, и (2) парной tracr-последовательностью, которая гибридизируется с tracr-последовательностью, и полинуклеотидная последовательность, кодирующая фермент CRISPR, представляет собой ДНК или РНК,
для применения в медицине или терапии; или для применения в способе модификации организма или отличного от человеческого организма путем манипуляции с целевой последовательностью почки в представляющем интерес локусе генома; или для применения в способе лечения или подавления состояния, вызванного дефектом в целевой последовательности почки в представляющем интерес локусе генома; или для применения в редактировании гена или генома ex vivo.
40. Композиция по п. 39, где полинуклеотиды содержатся в векторной системе, содержащей один или несколько векторов.
41. Композиция по п. 39, где полинуклеотид системы CRISPR-Cas является химерной РНК (chiRNA).
42. Композиция по п. 39, где система CRISPR-Cas представляет собой мультиплексную ферментную систему CRISPR, дополнительно содержащую несколько химер и/или несколько направляющих последовательностей для нескольких мишеней и одну tracr-последовательность.
43. Композиция по п. 39, где фермент CRISPR является нуклеазой, управляющей расщеплением обеих нитей в определенной точке целевой последовательности.
44. Композиция по п. 39, где фермент CRISPR содержит одну или несколько мутаций.
45. Композиция по п. 44, где фермент CRISPR содержит одну или несколько мутаций D10A, E762A, H840A, N854A, N863A или D986A.
46. Композиция по п. 44, где одна или несколько мутаций находятся в домене RuvC1 фермента CRISPR.
47. Композиция по п. 43, где фермент CRISPR является никазой, управляющей расщеплением в определенной точке целевой последовательности.
48. Композиция по п. 47, где никаза является двойной никазой.
49. Композиция по п. 39, дополнительно включающие по меньшей мере две или более NLS.
50. Композиция по п. 39, где фермент CRISPR имеет одну или несколько мутаций в каталитическом домене, где при транскрипции парная tracr-последовательность гибридизируется с tracr-последовательностью, а направляющая последовательность управляет специфичным к последовательности связыванием комплекса CRISPR с целевой последовательностью, и где фермент дополнительно содержит функциональный домен.
51. Композиция по п. 50, где функциональный домен является доменом активации транскрипции.
52. Композиция по п. 48 где доменом активации транскрипции является VP64.
53. Композиция по п. 39, где ферментом CRISPR является Cas9.
54. Применение композиции по любому из пп. 39-53 в редактировании гена или генома ex vivo.
55. Применение композиции по любому из пп. 39-53 в производстве лекарственного препарата для редактирования гена или генома ex vivo или для применения в способе модификации организма или отличного от человеческого организма путем манипуляции с целевой последовательностью почки в представляющем интерес локусе генома или в способе лечения или подавления состояния, вызванного дефектом в целевой последовательности почки в представляющем интерес локусе генома.
