Система генной экспрессии - RU2016151395A
Код документа: RU2016151395A
Формула
1. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида, включающего первую и вторую системы генной экспрессии, где:
i) первая система генной экспрессии включает следующие компоненты: первый доминантный летальный ген, функционально связанный с первым промотором; ген, кодирующий первый фактор активации транскрипции и первую нуклеотидную последовательность, регулирующую сплайсинг;
ii) вторая система генной экспрессии включает следующие компоненты: второй доминантный летальный ген, функционально связанный со вторым промотором; ген, кодирующий второй фактор активации транскрипции и вторую нуклеотидную последовательность, регулирующую сплайсинг;
где каждый из указанных факторов активации транскрипции может активировать по меньшей мере один из указанных промоторов, при условии, что оба указанных промотора активируются при экспрессии обоих указанных факторов транскрипции;
каждая из двух указанных регуляторных последовательностей сплайсинга (первая и вторая) опосредует специфичную для самок экспрессию первого и второго доминантных летальных генов, соответственно, путем альтернативного сплайсинга;
трансактивационная активность каждого из указанных факторов активации транскрипции (первого и второго) подавляется первым и вторым экзогенными регуляторными факторами, соответственно, причем указанный первый экзогенный регуляторный фактор такой же, как и второй указанный экзогенный регуляторный фактор, или же другой, и
каждый из указанных компонентов указанной первой системы генной экспрессии такой же, как соответствующий компонент второй указанной системы генной экспрессии, или же другой.
2. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 1, где первый фактор активации транскрипции является продуктом первого доминантного летального гена и/или второй фактор активации транскрипции является продуктом второго доминантного летального гена, так что указанный фактор транскрипции также обеспечивает летальный эффект, обусловленный указанным доминантным летальным геном.
3. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 1 или 2, где одна из регуляторных последовательностей сплайсинга (первая или вторая) или обе (и первая, и вторая) опосредует специфичную для самок экспрессию соответствующего доминантного
летального гена путем, вместе со сплайсосомой, участия в сплайсинге РНК-транскрипта соответствующего доминантного летального гена с образованием матричной РНК, кодирующей функциональный белок, и по меньшей мере одной матричной РНК, кодирующей нефункциональный белок, причем матричная РНК, кодирующая функциональный белок, образуется у самок.
4. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по любому из предыдущих пунктов, где каждый из промоторов (первого и второго) практически неактивен в отсутствие фактора активации транскрипции, способного активировать указанный промотор.
5. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по любому из предыдущих пунктов, где один из двух (первого и второго) летальных генов или оба независимо друг от друга являются tTA или вариантом гена tTAV, предпочтительно вариантом гена tTAV.
6. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 5, где один из двух (первого и второго) доминантных летальных генов или оба независимо друг от друга являются одним из следующих: tTAV (SEQ ID NO: 26), tTAV2 (SEQ ID NO: 27) и tTAV3 (SEQ ID NO: 28).
7. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по любому из предыдущих пунктов, где одна из двух (первой и второй) нуклеотидных последовательностей, регулирующих сплайсинг, или обе независимо друг от друга происходят из интрона tra, гена dsx или гена Actin-4, предпочтительно из интрона tra.
8. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 7, где одна из двух (первой и второй) нуклеотидных последовательностей, регулирующих сплайсинг, или обе независимо друг от друга происходят из представителя семейства Tephritidae, предпочтительно относящегося к роду Ceratitis, Bactrocera, Anastrepha или Rhagoletis.
9. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 8, где одна из двух (первой и второй) нуклеотидных последовательностей, регулирующих сплайсинг, или обе происходят из представителя вида Ceratitis capitata.
10. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 8, где одна из двух (первой и второй) нуклеотидных последовательностей, регулирующих сплайсинг, происходит из представителя вида Ceratitis capitata, а другая нуклеотидная последовательность, регулирующая сплайсинг, происходит из другого вида.
11. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по любому из предыдущих пунктов, где одна из двух (первой и второй) систем генной экспрессии или обе содержит также энхансер, ассоциированный с соответствующим промотором, и по меньшей мере один из факторов, активирующих транскрипцию, действует на соответствующий
энхансер.
12. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 11, где энхансер, или один из двух энхансеров, или оба энхансера является элементом tetO, содержащим один или более повторов tetO.
13. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 12, где каждый из энхансеров независимо от других является tetOx7, tetOx14 или tetOx21.
14. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по любому из предыдущих пунктов, где один из двух (первого и второго) промоторов или оба экспрессируются в ходе по меньшей мере эмбрионального развития.
15. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по любому из предыдущих пунктов, где один из двух (первого и второго) промоторов или оба является минимальным промотором.
16. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 14 или 15, где каждый из двух промоторов (первого и второго) независимо от другого является Hsp70 или sryα, предпочтительно один промотор является Hsp70, а другой - sryα.
17. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по любому из предыдущих пунктов, где одна из двух (первой и второй) систем генной экспрессии или обе содержит третий доминантный летальный ген и третий промотор, функционально связанный с третьим доминантным летальным геном, причем фактор активации транскрипции, способный активировать промотор указанной экспрессионной системы способен также активировать этот третий промотор.
18. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 17 в зависимости от любого из пп. 11-13, где указанная система генной экспрессии также содержит энхансер, ассоциированный с промотором указанной экспрессионной системы, а третий промотор также ассоциирован с указанным энхансером, причем предпочтительно промотор указанной системы генной экспрессии ассоциирован с одним концом указанного энхансера, а третий промотор ассоциирован с другим концом указанного энхансера.
19. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по п. 17 или 18, где третьим доминантным летальным геном является VP16, а третьим промотором является Hsp70 или sryα.
20. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по любому из предыдущих пунктов, где эта последовательность содержит также генетический маркер, причем предпочтительно этот генетический маркер является флуоресцентным маркером, более предпочтительно, что генетическим маркером является DsRed2.
21. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по любому из предыдущих пунктов, где
первым доминантным летальным геном является tTAV (SEQ ID NO: 26), первым фактором активации транскрипции является продукт гена tTAV, первым промотором является Hsp70, первой нуклеотидной последовательностью, регулирующей сплайсинг, является Cctra,
вторым доминантным летальным геном является tTAV3 (SEQ ID NO: 28), вторым фактором активации транскрипции является продукт гена tTAV3, вторым промотором является sryα, второй нуклеотидной последовательностью, регулирующей сплайсинг, является Bztra,
первая система генной экспрессии содержит также первый энхансер, ассоциированный с первым промотором, причем первым энхансером является tetOx7,
вторая система генной экспрессии содержит также второй энхансер, ассоциированный со вторым промотором, причем вторым энхансером является tetOx14,
нуклеотидная последовательность этого полинуклеотида также содержит третий доминантный летальный ген, функционально связанный с третьим промотором, причем этот третий промотор ассоциирован со вторым энхансером, а указанным третьим доминантным летальным геном является VP16, третьим промотором является Hsp70; при этом второй промотор ассоциирован с одним концом второго энхансера и третий промотор ассоциирован с другим концом второго энхансера
нуклеотидная последовательность этого полинуклеотида также содержит первый генетический маркер, которым является DsRed2.
22. Нуклеотидная последовательность полинуклеотида по любому из предыдущих пунктов, где эта нуклеотидная последовательность содержит последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1.
23. Генетическая конструкция для трансформирования членистоногих, содержащая нуклеотидную последовательность полинуклеотида, описанную в любом из предыдущих пунктов.
24. Генетическая конструкция по п. 23, где эта конструкция содержит по меньшей мере четыре транспозируемых инвертированных повтора, образующих две пары разнонаправленных транспозируемых инвертированных повторов, причем указанная последовательность полинуклеотида расположена между двумя парами разнонаправленных транспозируемых инвертированных повторов, так что вырезание транспозазой или транспозазами указанных пар in situ эффективно для того, чтобы указанная последовательность полинуклеотида встраивалась в хозяйский геном без
фланкирующих транспозируемых инвертированных повторов в хозяйском геноме.
25. Генетическая конструкция по п. 24, где каждый из транспозируемых инвертированных повторов, связывающихся с указанной последовательностью полинуклеотида, является минимальным концевым инвертированным повтором, причем эти транспозируемые инвертированные повторы принадлежат к классу II транспозируемых элементов, предпочтительно являясь piggyBac.
26. Генетическая конструкция по п. 24 или 25, где имеются четыре инвертированных повтора.
27. Генетическая конструкция по п. 26, где четыре транспозируемых инвертированных повтора образуют первую и вторую пары разнонаправленных инвертированных повторов, причем
четыре транспозируемых инвертированных повтора являются инвертированными повторами piggyback,
первая пара повторов состоит из концевого участка внутреннего 3'-повтора PiggyBac, расположенного проксимально по отношению к указанной последовательности полинуклеотида, и концевого участка внешнего 5'-повтора piggyback, расположенного дистально по отношению к указанной последовательности полинуклеотида, и
вторая пара повторов состоит из концевого участка внутреннего 5'-повтора PiggyBac, расположенного проксимально по отношению к указанной последовательности полинуклеотида, и концевого участка внешнего 3'-повтора piggyback, расположенного дистально по отношению к указанной последовательности полинуклеотида, причем предпочтительно, что
концевой участок внутреннего 3'-повтора piggyBac состоит из нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 32
концевой участок внешнего 5'-повтора piggyBac состоит из нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 30
концевой участок внутреннего 5'-повтора piggyBac состоит из нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 30, и
концевой участок внешнего 3'-повтора piggyBac состоит из нуклеотидной последовательности, представленной как SEQ ID NO: 31.
28. Генетическая конструкция по любому из пп. 23-27, дополнительно содержащая по меньшей мере один генетический маркер между транспозируемыми инвертированными повторами по меньшей мере одной пары разнонаправленных транспозируемых инвертированных повторов, предпочтительно включая по меньшей мере один генетический маркер между инвертированными повторами каждой из по меньшей
мере двух пар разнонаправленных повторов.
29. Членистоногое, несущее нуклеотидную последовательность полинуклеотида, описанного в любом из пп. 1-22.
30. Членистоногое, несущее генетическую конструкцию, описанную в любом из пп. 23-28.
31. Членистоногое по п. 29 или 30, являющееся представителем семейства Tephritidae, Drosophilidae, Lonchaeidae, Pallopteridae, Platystomatidae, Pyrogotidae, Richardiidae или Ulidiidae, предпочтительно Tephritidae.
32. Членистоногое по п. 31, являющееся представителем рода Ceratitis, предпочтительно принадлежащим к виду Ceratitis capitata.
33. Членистоногое по любому из пп. 30-32, где это членистоногое несет нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 2 или 3, предпочтительно SEQ ID NO: 2.
34. Способ выявления членистоногого по любому из пп. 30-33, включающий следующие этапы:
i) контактирование образца ДНК, выделенной у насекомого, с парой праймеров, специфичных для трансформируемого насекомого, причем первый праймер из этой пары специфичен для нуклеотидной последовательности вводимой генетической конструкции, а второй праймер из указанной пары специфичен для принадлежащей геному насекомого нуклеотидной последовательности, фланкирующей нуклеотидную последовательность вводимой генетической конструкции,
ii) амплификация указанного образца ДНК, и
iii) выявление амплифицированной ДНК.
35. Способ по п. 34, где первый праймер имеет нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 6, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 7.
36. Способ по п. 34, где первый праймер имеет нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 4, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 5.
37. Способ по п. 34, где первый праймер имеет нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 10, а второй праймер имеет нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 11.
38. Способ по п. 37, где этап i) также включает контактирование образца ДНК с зондом, специфичным для продукта, полученного в результате амплификации путем полимеразной цепной реакции, на этапе ii), для выявления указанного продукта, причем
предпочтительно зонд является несущим двойную метку, включающую репортерную молекулу и молекулу-гаситель флуоресценции, причем репортерная молекулы выщепляется из зонда под действием полимеразы Taq в ходе амплификации путем PCR, когда указанный зонд гибридизуется с указанным продуктом амплификации.
39. Способ по п. 38, где в зонде имеется нуклеотидная последовательность, представленная как SEQ ID NO: 12.
40. Праймер для использования в способе по п. 34, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 4, 5, 6,7, 10 либо 11.
41. Праймер для использования в способе по п. 38, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 10 либо 11.
42. Зонд для использования в способе по п. 38 или 39, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 12.
43. Способ регуляции популяции членистоногих, включающий выпускание членистоногих, по любому из пп. 29-33, где членистоногим, подлежащим регуляции, предпочтительно является Ceratitis capitata.
