Не относящееся к человеку животное, у которого проявляется снижение функции верхних и нижних моторных нейронов и чувственного восприятия - RU2017135557A
Код документа: RU2017135557A
Формула
1. Генетически сконструированный грызун, содержащий в своем геноме модифицированный эндогенный локус DR6, в котором не хватает первой нуклеотидной последовательности, кодирующей полный цитоплазматический домен белка DR6.
2. Генетически сконструированный грызун по п. 1, у которого в модифицированном эндогенном локусе DR6 дополнительно не хватает второй нуклеотидной последовательности, кодирующей полный зрелый белок DR6.
3. Генетически сконструированный грызун по п. 1 или 2, у которого модифицированный эндогенный локус DR6 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный сигнальный пептид DR6, функционально слитый с по меньшей мере одним из трансмембранного домена и репортерного белка.
4. Генетически модифицированный грызун по п. 3, у которого нуклеотидная последовательность кодирует функциональный сигнальный пептид DR6, функционально слитый с трансмембранным доменом, и у которого трансмембранный домен функционально слит с репортерным белком.
5. Генетически модифицированный грызун по п. 3 или п. 4, у которого функциональный сигнальный пептид DR6 представляет собой эндогенный сигнальный пептид DR6.
6. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 3-5, у которого трансмембранный домен не представляет собой эндогенный трансмембранный домен DR6.
7. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 3-6, у которого трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен ROR1.
8. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 3-7, у которого репортерный белок представляет собой бета-галактозидазу.
9. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 3-8, у которого нуклеотидная последовательность функционально связана с эндогенной транскрипционной регуляторной последовательностью DR6.
10. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-9, являющийся гетерозиготным по модифицированному эндогенному локусу DR6.
11. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-10, проявляющий дисфункцию моторного нейрона.
12. Генетически модифицированный грызун по п. 11, у которого моторный нейрон представляет собой верхний моторный нейрон или нижний моторный нейрон.
13. Генетически модифицированный грызун по п. 12, у которого дисфункция моторного нейрона незаметна при слепой субъективной неврологической оценке в баллах, тесте на вращающемся стержне, тесте на мостике, тесте «открытое поле» и взвешивании, пока возраст грызуна не превысит 4 недели.
14. Генетически модифицированный грызун по любому из пп. 1-13, проявляющий снижение ноцицепции по сравнению с контрольными грызунами.
15. Генетически модифицированный грызун по п. 1, представляющий собой крысу или мышь.
16. Генетически модифицированный грызун по п. 15, представляющий собой мышь, которая содержит модифицированный эндогенный локус DR6, лишенный первой нуклеотидной последовательности, кодирующей полный зрелый белок DR6, и
при этом эндогенный локус DR6 мыши содержит функционально связанную с по меньшей мере одной эндогенной транскрипционной регуляторной последовательностью DR6 нуклеотидную последовательность, кодирующую эндогенный сигнальный пептид DR6, функционально слитый с трансмембранным доменом ROR1, который функционально слит с β-галактозидазой.
17. Генетически модифицированный грызун по п. 16, причем данная мышь взята из линии, которую выбирают из группы, состоящей из линии 129, линии C57BL/6 и скрещивания линий C57BL/6 × 129, и при этом у мыши проявляется сниженный привес по сравнению с контрольными животными дикого типа в возрасте от 8 до 20 недель.
18. Клетка или ткань, происходящая от генетически модифицированного грызуна, по любому из пп. 1-17.
19. Клетка или ткань по п. 18, причем клетка представляет собой моторный нейрон или эмбриональную стволовую клетку.
20. Способ создания генетически модифицированного грызуна по п. 1, включающий этап(-ы) делеции из эндогенного локуса DR6 грызуна первой эндогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей полный цитоплазматический домен DR6.
21. Способ по п. 20, в котором этап делеции содержит замещение второй эндогенной нуклеотидной последовательности, кодирующей полноразмерный и эндогенный зрелый белок DR6, на нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный домен и/или репортерный ген, причем нуклеиновая кислота состоит в функциональной связи с эндогенной транскрипционной регуляторной последовательностью DR6 и последовательностью сигнального пептида.
22. Способ создания популяции моторных нейронов, у которых проявляется повышенный окислительный стресс по сравнению с контрольными моторными нейронными клетками, включающий выращивание эмбриоидных тел из внутренней массы эмбриональных стволовых клеток, выделенных из грызуна по любому из пп. 1-17, и дифференцировку эмбриоидных тел в популяцию моторных нейронов.
23. Способ скрининга потенциального агента для модуляции дисфункции моторных нейронов, включающий:
(a) введение потенциального агента грызуну, содержащему в своем геноме модифицированный эндогенный локус DR6, в котором не хватает первой нуклеотидной последовательности, кодирующей полный цитоплазматический домен DR6, причем у грызуна проявляется дисфункция моторных нейронов; и
(b) определение любого модуляторного эффекта потенциального агента по меньшей мере по одному симптому дисфункции моторных нейронов у грызуна по сравнению с испытуемым контрольным грызуном;
причем наличие модуляторного эффекта по меньшей мере по одному симптому дисфункции моторных нейронов у грызуна по сравнению с испытуемым контрольным грызуном служит показателем того, что потенциальный агент полезен для модуляции дисфункции моторных нейронов.
24. Способ по п. 23, в котором в модифицированном эндогенном локусе DR6 дополнительно не хватает второй нуклеотидной последовательности, кодирующей полный зрелый эндогенный белок DR6.
25. Способ по п. 23 или 24, в котором модифицированный эндогенный локус DR6 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую функциональный сигнальный пептид DR6, функционально слитый с по меньшей мере одним из трансмембранного домена и репортерного белка.
26. Способ по любому из пп. 23-25, в котором агент вводят раньше обнаружения симптома по слепой субъективной неврологической оценке в баллах АБС-TDI, тесту на вращающемся стержне, тесту на мостике, тесту «открытое поле», взвешиванию и/или определению задержки ответа на болевой раздражитель.
27. Способ по любому из пп. 23-26, в котором агент вводят после обнаружения симптома путем одного или более из слепой субъективной неврологической оценки в баллах АБС-TDI, теста на вращающемся стержне, теста на мостике, теста «открытое поле», взвешивания и/или определения задержки ответа на болевой раздражитель.
28. Способ по любому из пп. 23-27, в котором данный агент вводят в двух или более разных точках времени.
29. Способ по любому из пп. 23-28, в котором по меньшей мере один симптом выбирают из кифоза, аномального сжатия нижних конечностей, недостаточной моторной координации, недостаточной способности к обучению движениям, потери массы тела и недостаточного чувственного восприятия по сравнению с контрольным грызуном, происходящим из идентичной с грызуном линии, но не содержащим данной нуклеиновой кислоты в своем геноме.
30. Способ по любому из пп. 23-29, в котором по меньшей мере один симптом происходит по причине дисфункции верхних моторных нейронов.
31. Способ по п. 30, в котором по меньшей мере один симптом выбирают из группы, состоящей из тремора, спастического паралича (ригидности), аномальных рефлексов и их сочетания.
32. Способ по любому из пп. 23-29, в котором по меньшей мере один симптом происходит по причине дисфункции нижних моторных нейронов.
33. Способ по п. 32, в котором по меньшей мере один симптом выбирают из группы, состоящей из мышечной слабости и истощения, фасцикуляций и их сочетания.
34. Способ по любому из пп. 23-33, в котором по меньшей мере один симптом дисфункции моторных нейронов представляет собой снижение привеса.
35. Способ по любому из пп. 23-34, в котором по меньшей мере один симптом дисфункции моторных нейронов представляет собой ослабление ноцицепции.
36. Способ по любому из пп. 23-35, в котором грызун представляет собой мышь, которая содержит модифицированный эндогенный локус DR6, лишенный первой нуклеотидной последовательности, кодирующей полный зрелый белок DR6, и
при этом эндогенный локус DR6 мыши содержит функционально связанную с по меньшей мере одной эндогенной транскрипционной регуляторной последовательностью DR6 нуклеотидную последовательность, кодирующую эндогенный сигнальный пептид DR6, функционально слитый с трансмембранным доменом ROR1, который функционально слит с β-галактозидазой.
37. Способ по п. 36, в котором мышь происходит из линии, которую выбирают из группы, состоящей из линии 129, линии C57BL/6 и скрещивания линий C57BL/6 × 129.
38. Способ скрининга потенциального агента для снижения окислительного стресса в моторных нейронах, включающий:
(a) культивирование моторных нейронов, которые происходят от грызуна по п. 1, в присутствии или в отсутствие агента;
(b) определение того, будет ли агент предотвращать, ингибировать и/или снижать окислительный стресс в моторных нейронах по сравнению с контрольными моторными нейронами, происходящими от данного грызуна, но культивированными в отсутствие агента; причем предотвращение, ингибирование и/или снижение окислительного стресса в моторных нейронах показательно для потенциального агента в отношении снижения окислительного стресса в моторных нейронах.
39. Нуклеиновая кислота, содержащая в функциональной связи и направлении от 5' до 3' первую нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид DR6, вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую трансмембранный домен, третью нуклеотидную последовательность, кодирующую репортерный ген, и/или четвертую нуклеотидную последовательность, кодирующую кассету селекции лекарственными средствами.
40. Нуклеотидная последовательность по п. 39, в которой первая нуклеотидная последовательность показана как SEQ ID NO: 6, вторая нуклеотидная последовательность показана как SEQ ID NO: 7, третья нуклеотидная последовательность показана как SEQ ID NO: 8 и/или четвертая нуклеотидная последовательность показана как SEQ ID NO: 3.
41. Нуклеиновая кислота по п. 39 или по п. 40, которая дополнительно содержит первое нацеливающее плечо и второе нацеливающее плечо, причем первое нацеливающее плечо находится на 5' конце от первой, второй и/или третьей нуклеотидных последовательностей и в функциональной связи с ними, причем второе нацеливающее плечо находится на 3' конце от первой, второй и/или третьей нуклеотидных последовательностей и в функциональной связи с ними, и при этом первое и второе нацеливающие плечи служат для нацеливания нуклеиновой кислоты для вставки в эндогенный локус DR6 не относящегося к человеку животного в функциональной связи с по меньшей мере одним эндогенным регуляторным элементом не относящегося к человеку животного.
42. Нуклеиновая кислота по п. 41, причем не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна.
43. Нуклеотидная последовательность по п. 42, причем грызун представляет собой мышь.
44. Нуклеотидная последовательность по п. 43, содержащая последовательность, которая показана как SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 17.
45. Клетка грызуна, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 39-44.
46. Клетка грызуна по п. 45, представляющая собой эмбриональную стволовую клетку.
