Способы и композиции для направленной модификации генома - RU2016126989A
Код документа: RU2016126989A
Формула
1. Способ модификации генома в представляющем интерес геномном локусе в мышиной клетке или человеческой клетке, включающий приведение генома в контакт с белком Cas, РНК CPISPR, которая гибридизируется с целевой последовательностью в представляющем интерес геномном локусе, и tracrPHK в присутствии крупного направляющего вектора (LTVEC),
при этом LTVEC составляет по меньшей мере 10 т.п.о. и содержит первую нуклеиновую кислоту, фланкируемую 5' плечом гомологии, которое гомологично 5' целевой последовательности в представляющем интерес геномном локусе, и 3' плечом гомологии, которое гомологично 3' целевой последовательности в представляющем интерес геномном локусе,
при этом после контакта с белком Cas, РНК CRISPR и tracrPHK в присутствии LTVEC происходит модификация генома так, чтобы он содержал направленную генетическую модификацию, включающую удаление области представляющего интерес геномного локуса и вставку первой нуклеиновой кислоты в представляющий интерес геномный локус,
при этом:
(i) удаляемая область представляющего интерес геномного локуса составляет по меньшей мере 30 т.п.о. и/или
(ii) вставленная первая нуклеиновая кислота составляет по меньшей мере 30 т.п.о.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что белок Cas, РНК CRISPR, tracrPHK и LTVEC вносят в мышиную клетку или человеческую клетку.
3. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий выявление модифицированной мышиной клетки или модифицированной человеческой клетки, содержащей направленную генетическую модификацию в представляющем интерес геномном локусе.
4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что РНК CRISPR и tracrPHK вносят вместе в форме одного транскрипта.
5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что РНК CRISPR и tracrPHK вносят отдельно.
6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что:
(a) белок Cas вносят в мышиную клетку или человеческую клетку в форме белка, матричной РНК (мРНК), кодирующей белок Cas, или ДНК, кодирующей белок Cas;
(b) РНК CRISPR вносят в мышиную клетку или человеческую клетку в форме РНК или ДНК, кодирующей РНК CRISPR; и
(c) tracrPHK вносят в мышиную клетку или человеческую клетку в форме РНК или ДНК, кодирующей tracrPHK.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что белок Cas, РНК CRISPR и tracrPHK вносят в мышиную клетку или человеческую клетку в виде комплекса белок-РНК.
8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что:
(a) ДНК, кодирующая белок Cas, находится в форме первой экспрессионной конструкции, содержащей первый промотор, функционально связанный со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей белок Cas;
(b) ДНК, кодирующая РНК CRISPR, находится в форме второй экспрессионной конструкции, содержащей второй промотор, функционально связанный с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей РНК CRISPR; и
(c) ДНК, кодирующая tracrPHK, находится в форме третьей экспрессионной конструкции, содержащей третий промотор, функционально связанный с четвертой нуклеиновой кислотой, кодирующей tracrPHK;
при этом первый, второй и третий промоторы активны в мышиной клетке или человеческой клетке.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что первая, вторая и/или третья экспрессионные конструкции находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты.
10. Способ по п. 6, отличающийся тем, что:
(a) ДНК, кодирующая белок Cas, находится в форме первой экспрессионной конструкции, содержащей первый промотор, функционально связанный со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей белок Cas; и
(b) ДНК, кодирующая РНК CRISPR, и ДНК, кодирующая tracrPHK, находятся в форме второй экспрессионной конструкции, содержащей второй промотор, функционально связанный с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей нРНК, содержащую РНК CRISPR и tracrPHK в одном транскрипте;
при этом первый и второй промоторы активны в мышиной клетке или человеческой клетке.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что первая и вторая экспрессионные конструкции находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты.
12. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация включает одновременное удаление эндогенной нуклеотидной последовательности в представляющем интерес геномном локусе и вставку первой нуклеиновой кислоты в представляющий интерес геномный локус на одном этапе.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что удаленная эндогенная нуклеотидная последовательность составляет от около 30 т.п.о. до около 110 т.п.о., а вставленная первая нуклеиновая кислоты составляет от около 40 т.п.о. до около 140 т.п.о.
14. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация является биаллельной генетической модификацией.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что биаллельная генетическая модификация включает удаление эндогенной нуклеотидной последовательности и вставку первой нуклеиновой кислоты в представляющий интерес геномный локус в двух гомологичных хромосомах.
16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что модифицированная мышиная клетка или модифицированная человеческая клетка является компаунд-гетерозиготной в представляющем интерес геномном локусе.
17. Способ по п. 14, отличающийся тем, что модифицированная мышиная клетка или модифицированная человеческая клетка является гемизиготной в представляющем интерес геномном локусе.
18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация в представляющем интерес геномном локусе в одной хромосоме включает удаление эндогенной нуклеотидной последовательности и вставку первой нуклеиновой кислоты.
19. Способ по п. 16, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация включает: (1) удаление эндогенной нуклеотидной последовательности в представляющем интерес геномном локусе в первой и второй гомологичных хромосомах; и (2) вставку первой нуклеиновой кислоты в представляющий интерес геномный локус в первой гомологичной хромосоме и разрушение представляющего интерес геномного локуса во второй гомологичной хромосоме.
20. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что LTVEC составляет по меньшей мере 15 т.п.о., по меньшей мере 20 т.п.о., по меньшей мере 30 т.п.о., по меньшей мере 40 т.п.о., по меньшей мере 50 т.п.о., по меньшей мере 60 т.п.о., по меньшей мере 70 т.п.о., по меньшей мере 80 т.п.о. или по меньшей мере 90 т.п.о.
21. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что LTVEC составляет по меньшей мере 100 т.п.о., по меньшей мере 150 т.п.о. или по меньшей мере 200 т.п.о.
22. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что первая нуклеиновая кислота составляет по меньшей мере 20 т.п.о., по меньшей мере 30 т.п.о., по меньшей мере 40 т.п.о., по меньшей мере 50 т.п.о., по меньшей мере 60 т.п.о., по меньшей мере 70 т.п.о., по меньшей мере 80 т.п.о., по меньшей мере 90 т.п.о., по меньшей мере 100 т.п.о., по меньшей мере 150 т.п.о., по меньшей мере 200 т.п.о., по меньшей мере 250 т.п.о. или по меньшей мере 300 т.п.о.
23. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что первая нуклеиновая кислота составляет от около 40 т.п.о. до около 140 т.п.о.
24. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что мышиная клетка или человеческая клетка является первичной клеткой или иммортализованной клеткой.
25. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что мышиная клетка или человеческая клетка является плюрипотентной клеткой.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что мышиная плюрипотентная клетка является мышиной эмбриональной стволовой (ЭС) клеткой.
27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что человеческая плюрипотентная клетка является человеческой эмбриональной стволовой (ЭС) клеткой, человеческой взрослой стволовой клеткой, человеческой клеткой-предшественником с ограниченным развитием или человеческой индуцированной плюрипотентной стволовой (иПС) клеткой.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что человеческие иПС клетки поддерживают в среде, содержащей основную среду и добавки, при этом среда содержит:
(a) полипептид фактора, ингибирующего лейкемию (LIF);
(b) ингибитор киназы гликогенсинтазы 3 (GSK3); и
(c) ингибитор МЕК;
При этом среда имеет осмолярность от около 175 мОсм/кг до около 280 мОсм/кг.
29. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что белок Cas представляет собой Cas9.
30. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что целевая последовательность непосредственно фланкируется последовательностью мотива, прилегающего к протоспейсеру (РАМ).
31. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что 5' и 3' плечи гомологии LTVEC в общей сумме составляют от около 10 т.п.о. до около 150 т.п.о.
32. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что 5' и 3' плечи гомологии LTVEC в общей сумме составляют от около 10 т.п.о. до около 20 т.п.о., от около 20 т.п.о. до около 40 т.п.о., от около 40 т.п.о. до около 60 т.п.о., от около 60 т.п.о. до около 80 т.п.о., от около 80 т.п.о. до около 100 т.п.о., от около 100 т.п.о. до около 120 т.п.о. или от около 120 т.п.о. до 150 т.п.о.
33. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация включает:
(a) замещение эндогенной нуклеотидной последовательности гомологичной или ортологичной нуклеотидной последовательностью;
(b) удаление эндогенной нуклеотидной последовательности;
(c) удаление эндогенной нуклеотидной последовательности,
при этом диапазон удаления составляет от около 5 т.п.о. до около 10 т.п.о., от около 10 т.п.о. до около 20 т.п.о., от около 20 т.п.о. до около 40 т.п.о., от около 40 т.п.о. до около 60 т.п.о., от около 60 т.п.о. до около 80 т.п.о., от около 80 т.п.о. до около 100 т.п.о., от около 100 т.п.о. до около 150 т.п.о. или от около 150 т.п.о. до около 200 т.п.о., от около 200 т.п.о. до около 300 т.п.о., от около 300 т.п.о. до около 400 т.п.о., от около 400 т.п.о. до около 500 т.п.о., от около 500 т.п.о. до около 1 м.п.о., от около 1 м.п.о. до около 1,5 м.п.о., от около 1,5 м.п.о. до около 2 м.п.о., от около 2 м.п.о. до около 2,5 м.п.о. или от около 2,5 м.п.о. до около 3 м.п.о.;
(d) вставку экзогенной нуклеотидной последовательности;
(e) вставку экзогенной нуклеотидной последовательности в диапазоне от около 5 т.п.о. до около 10 т.п.о., от около 10 т.п.о. до около 20 т.п.о., от около 20 т.п.о. до около 40 т.п.о., от около 40 т.п.о. до около 60 т.п.о., от около 60 т.п.о. до около 80 т.п.о., от около 80 т.п.о. до около 100 т.п.о., от около 100 т.п.о. до около 150 т.п.о., от около 150 т.п.о. до около 200 т.п.о., от около 200 т.п.о. до около 250 т.п.о., от около 250 т.п.о. до около 300 т.п.о., от около 300 т.п.о. до около 350 т.п.о. или от около 350 т.п.о. до около 400 т.п.о.;
(f) вставку экзогенной нуклеотидной последовательности, содержащей гомологичную или ортологичную нуклеотидную последовательность;
(g) вставку химерной нуклеотидной последовательности, содержащей человеческую и нечеловеческую нуклеотидную последовательность;
(h) вставку кондиционального аллеля, фланкируемого целевыми последовательностями сайт-специфической рекомбиназы;
(i) вставку селективного маркера или репортерного гена, функционально связанного с промотором, активным в плюрипотентной клетке; или
(j) их комбинацию.
34. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что 5' целевая последовательность и 3' целевая последовательность разделены по меньшей мере 5 т.п.о., но менее чем 3 м.п.о.
35. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что 5' целевая последовательность и 3' целевая последовательность разделены по меньшей мере 5 т.п.о., но менее чем 10 т.п.о., по меньшей мере 10 т.п.о., но менее чем 20 т.п.о., по меньшей мере 20 т.п.о., но менее чем 40 т.п.о., по меньшей мере 40 т.п.о., но менее чем 60 т.п.о., по меньшей мере 60 т.п.о., но менее чем 80 т.п.о., по меньшей мере около 80 т.п.о., но менее чем 100 т.п.о., по меньшей мере 100 т.п.о., но менее чем 150 т.п.о., или по меньшей мере 150 т.п.о., но менее чем 200 т.п.о., по меньшей мере около 200 т.п.о., но менее чем около 300 т.п.о., по меньшей мере около 300 т.п.о., но менее чем около 400 т.п.о., по меньшей мере около 400 т.п.о., но менее чем около 500 т.п.о., по меньшей мере около 500 т.п.о., но менее чем около 1 м.п.о., по меньшей мере около 1 м.п.о., но менее чем около 1,5 м.п.о., по меньшей мере около 1,5 м.п.о., но менее чем около 2 м.п.о., по меньшей мере около 2 м.п.о., но менее чем около 2,5 м.п.о., или по меньшей мере около 2,5 м.п.о., но менее чем около 3 м.п.о.
36. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что 5' целевая последовательность и 3' целевая последовательность разделены по меньшей мере 20 т.п.о., по меньшей мере 30 т.п.о., по меньшей мере 40 т.п.о., по меньшей мере 50 т.п.о., по меньшей мере 60 т.п.о., по меньшей мере 70 т.п.о., по меньшей мере 80 т.п.о., по меньшей мере 90 т.п.о., по меньшей мере 100 т.п.о., по меньшей мере 110 т.п.о., по меньшей мере 120 т.п.о., по меньшей мере 130 т.п.о., по меньшей мере 140 т.п.о., по меньшей мере 150 т.п.о., по меньшей мере 160 т.п.о., по меньшей мере 170 т.п.о., по меньшей мере 180 т.п.о., по меньшей мере 190 т.п.о. или по меньшей мере 200 т.п.о.
37. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что 5' целевая последовательность и 3' целевая последовательность разделены от около 30 т.п.о. до около 110 т.п.о.
38. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что представляющий интерес геномный локус содержит локус рецептора интерлейкина-2 гамма, локус АроЕ, локус Rag1, локус Rag2, оба локуса Rag1 и Rag2, локус Adamts5, локус Trpa1, локус Folh1, локус Erbb4, локус Lrp5, локус С5 (Hc), локус Ror1 или локус Dpp4.
39. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что представляющий интерес геномный локус содержит внехромосомную ДНК.
40. Способ получения мыши поколения F0, которая содержит направленную генетическую модификацию в представляющем интерес геномном локусе, включающий:
(а) приведение в контакт генома мышиной ЭС клетки с белком Cas, РНК CRISPR, которая гибридизируется с целевой последовательностью в представляющем интерес геномном локусе, и tracrPHK в присутствии крупного направляющего вектора (LTVEC) для формирования модифицированной мышиной ЭС клетки,
при этом LTVEC составляет по меньшей мере 10 т.п.о. и содержит первую нуклеиновую кислоту, фланкируемую 5' плечом гомологии, которое гомологично 5' целевой последовательности в представляющем интерес геномном локусе, и 3' плечом гомологии, которое гомологично 3' целевой последовательности в представляющем интерес геномном локусе,
при этом после контакта с белком Cas, РНК CRISPR и tracrPHK в присутствии LTVEC происходит модификация генома так, чтобы он содержал направленную генетическую модификацию, при этом направленная генетическая модификация включает удаление области представляющего интерес геномного локуса и вставку первой нуклеиновой кислоты в представляющий интерес геномный локус,
при этом:
(i) удаляемая область представляющего интерес геномного локуса составляет по меньшей мере 30 т.п.о. и/или
(ii) вставленная первая нуклеиновая кислота составляет по меньшей мере 30 т.п.о.;
(b) выявление модифицированной мышиной ЭС клетки, содержащей направленную генетическую модификацию в представляющем интерес геномном локусе;
(c) внесение модифицированной мышиной ЭС клетки в мышиный эмбрион-хозяина; и
(d) вынашивание мышиного эмбриона-хозяина суррогатной матерью,
при этом суррогатная мать производит мышь поколения F0, содержащую направленную генетическую модификацию в представляющем интерес геномном локусе.
41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что РНК CRISPR и tracrPHK вносят вместе в форме одного транскрипта.
42. Способ по п. 40, отличающийся тем, что РНК CRISPR и tracrPHK вносят отдельно.
43. Способ по любому из пп. 40-42, отличающийся тем, что:
(a) белок Cas вносят в мышиную ЭС клетку в форме белка, матричной РНК (мРНК), кодирующей белок Cas, или ДНК, кодирующей белок Cas;
(b) РНК CRISPR вносят в мышиную ЭС клетку в форме РНК или ДНК, кодирующей РНК CRISPR; и
(c) tracrPHK вносят в мышиную ЭС клетку в форме РНК или ДНК, кодирующей tracrPHK.
44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что белок Cas, РНК CRISPR и tracrPHK вносят в мышиную ЭС клетку в виде комплекса белок-РНК.
45. Способ по п. 43, отличающийся тем, что:
(а) ДНК, кодирующая белок Cas, находится в форме первой экспрессионной конструкции, содержащей первый промотор, функционально связанный со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей белок Cas;
(b) ДНК, кодирующая РНК CRISPR, находится в форме второй экспрессионной конструкции, содержащей второй промотор, функционально связанный с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей РНК CRISPR; и
(c) ДНК, кодирующая tracrPHK, находится в форме третьей экспрессионной конструкции, содержащей третий промотор, функционально связанный с четвертой нуклеиновой кислотой, кодирующей tracrPHK;
при этом первый, второй и третий промоторы активны в мышиной ЭС клетке.
46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что первая, вторая и третья экспрессионные конструкции находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты.
47. Способ по п. 43, отличающийся тем, что:
(a) ДНК, кодирующая белок Cas, находится в форме первой экспрессионной конструкции, содержащей первый промотор, функционально связанный со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей белок Cas; и
(b) ДНК, кодирующая РНК CRISPR, и ДНК, кодирующая tracrPHK, находятся в форме второй экспрессионной конструкции, содержащей второй промотор, функционально связанный с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей "руководящую" РНК, содержащую РНК CRISPR и tracrPHK в одном транскрипте;
при этом первый и второй промоторы активны в мышиной ЭС клетке.
48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что первая и вторая экспрессионные конструкции находятся в одной молекуле нуклеиновой кислоты.
49. Способ по любому из пп. 40-42, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация включает одновременное удаление эндогенной нуклеотидной последовательности в представляющем интерес геномном локусе и вставку первой нуклеиновой кислоты в представляющий интерес геномный локус.
50. Способ по любому из пп. 40-42, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация является биаллельной генетической модификацией.
51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что биаллельная генетическая модификация включает удаление эндогенной нуклеотидной последовательности и вставку первой нуклеиновой кислоты в представляющий интерес геномный локус в двух гомологичных хромосомах.
52. Способ по п. 50, отличающийся тем, что модифицированная мышиная ЭС клетка является компаунд-гетерозиготной в представляющем интерес геномном локусе.
53. Способ по п. 50, отличающийся тем, что модифицированная мышиная ЭС клетка является гемизиготной в представляющем интерес геномном локусе.
54. Способ по п. 52, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация в представляющем интерес геномном локусе в одной хромосоме включает удаление эндогенной нуклеотидной последовательности и вставку первой нуклеиновой кислоты.
55. Способ по п. 52, отличающийся тем, что направленная генетическая модификация включает: (1) удаление эндогенной нуклеотидной последовательности в представляющем интерес геномном локусе в первой и второй гомологичных хромосомах; и (2) вставку первой нуклеиновой кислоты в представляющий интерес геномный локус в первой гомологичной хромосоме и разрушение представляющего интерес геномного локуса во второй гомологичной хромосоме.
56. Способ по любому из пп. 40-42, отличающийся тем, что белок Cas представляет собой Cas9.
57. Способ модификации генома в представляющем интерес геномном локусе в эукариотической клетке, включающий приведение генома в контакт с белком Cas, РНК CRISPR, которая гибридизируется с целевой последовательностью в представляющем интерес геномном локусе, и tracrPHK в присутствии крупного направляющего вектора (LTVEC),
при этом LTVEC составляет по меньшей мере 10 т.п.о. и содержит первую нуклеиновую кислоту, фланкируемую 5' плечом гомологии, которое гомологично 5' целевой последовательности в представляющем интерес геномном локусе, и 3' плечом гомологии, которое гомологично 3' целевой последовательности в представляющем интерес геномном локусе,
при этом эукариотическая клетка не является крысиной клеткой, и
при этом после контакта с белком Cas, РНК CRISPR и tracrPHK в присутствии LTVEC происходит модификация генома так, чтобы он содержал направленную генетическую модификацию, включающую удаление области представляющего интерес геномного локуса и вставку первой нуклеиновой кислоты в представляющий интерес геномный локус,
при этом:
(i) удаляемая область представляющего интерес геномного локуса составляет по меньшей мере 30 т.п.о. и/или
(ii) вставленная первая нуклеиновая кислота составляет по меньшей мере 30 т.п.о.
58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что некрысиная эукариотическая клетка является плюрипотентной клеткой, неплюрипотентной клеткой, клеткой млекопитающего, клеткой человека, клеткой отличного от человека млекопитающего, клеткой грызуна, клеткой мыши, клеткой хомяка или фибробластом.
59. Способ по п. 57, отличающийся тем, что некрысиная эукариотическая клетка является первичной клеткой или иммортализованной клеткой.
