Способы преодоления иммунологической толерантности с использованием множества направляющих рнк - RU2018143655A
Код документа: RU2018143655A
Формула
1. Способ получения антигенсвязывающих белков против представляющего интерес чужеродного антигена, включающий:
(а) создание генетически модифицированного отличного от человека животного с пониженной толерантностью к представляющему интерес чужеродному антигену, включающее:
(i) введение в эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии или плюрипотентную клетку отличного от человека животного, которая не является эмбрионом на одноклеточной стадии:
(I) белка Cas9;
(II) первой направляющей РНК, которая гибридизуется с последовательностью, распознаваемой первой направляющей РНК в геномном локусе-мишени, причем геномный локус-мишень содержит весь или часть гена, кодирующего аутоантиген, гомологичный или обладающий общим представляющим интерес эпитопом с представляющим интерес чужеродным антигеном; и
(III) второй направляющей РНК, которая гибридизуется с последовательностью, распознаваемой второй направляющей РНК в геномном локусе-мишени;
причем геномный локус-мишень модифицируется в паре соответствующих первой и второй хромосом для получения модифицированного эмбриона отличного от человека животного на одноклеточной стадии или модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного с биаллельной модификацией, причем экспрессия аутоантигена устраняется; и
(ii) получение генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного из модифицированного эмбриона отличного от человека животного на одноклеточной стадии или модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного, причем геномный локус-мишень модифицирован в паре соответствующих первой и второй хромосом у генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного таким образом, что экспрессия аутоантигена устранена;
(b) иммунизацию генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного, полученного на стадии (а) представляющим интерес чужеродным антигеном; и
(с) поддержание генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного в условиях, достаточных для инициирования иммунного ответа на представляющий интерес чужеродный антиген, причем генетически модифицированное F0-поколение отличного от человека животного продуцирует антигенсвязывающие белки против представляющего интерес чужеродного антигена.
2. Способ по п. 1, в котором клетка на стадии (a)(i) представляет собой плюрипотентную стволовую клетку отличного от человека животного, и продуцирование генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного на стадии (а)(ii) включает:
(I) введение модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного в эмбрион-хозяин; и
(II) имплантацию эмбриона-хозяина суррогатной матери для получения генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного, у которого геномный локус-мишень модифицирован в паре соответствующих первой и второй хромосом так, что экспрессия аутоантигена устранена.
3. Способ по п. 2, в котором плюрипотентная клетка представляет собой эмбриональную стволовую (ЭС) клетку.
4. Способ по п. 1, в котором клетка на стадии (a)(i) представляет собой эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии, и продуцирование генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного на стадии (а)(ii) включает имплантацию модифицированного эмбриона отличного от человека животного на одноклеточной стадии суррогатной матери для получения генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного, у которого геномный локус-мишень модифицирован в паре соответствующих первой и второй хромосом так, что экспрессия аутоантигена устранена.
5. Способ по любому из пп. 1-4, дополнительно включающий получение гибридомы из В-клеток, выделенных из иммунизированного генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного.
6. Способ по любому из пп. 1-5, дополнительно включающий получение от иммунизированного генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина одного из антигенсвязывающих белков против представляющего интерес чужеродного антигена и/или второй последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина одного из антигенсвязывающих белков против представляющего интерес чужеродного антигена.
7. Способ по п. 6, в котором последовательность первой нуклеиновой кислоты и/или последовательность второй нуклеиновой кислоты получают из лимфоцита генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного или из гибридомы, полученной из лимфоцитов.
8. Способ по п. 6 или 7, в котором генетически модифицированное F0-поколение отличного от человека животного, содержит гуманизированный локус иммуноглобулина, и причем первая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина человека, а вторая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором антигенсвязывающие белки, продуцируемые генетически модифицированным F0-поколением отличного от человека животного, против представляющего интерес чужеродного антигена имеют более высокий титр, чем антигенсвязывающие белки, продуцируемые контрольным отличным от человека животным, которое является диким типом в геномном локусе-мишени, после иммунизации контрольного отличного от человека животного представляющего интерес чужеродным антигеном.
10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором более разнообразный генетический репертуар антигенсвязывающих белков против представляющего интерес чужеродного антигена продуцируется генетически модифицированным F0-поколением отличного от человека животного после иммунизации генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного представляющим интерес чужеродным антигеном по сравнению с антигенсвязывающими белками, продуцируемыми контрольным отличным от человека животным, которое является диким типом в указанном геномном локусе-мишени, после иммунизации контрольного отличного от человека животного представляющим интерес чужеродным антигеном.
11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором антигенсвязывающие белки, продуцируемые генетически модифицированным F0-поколением отличного от человека животного, против представляющего интерес чужеродного антигена используют большее разнообразие сегментов тяжелой цепи V гена и/или сегментов легкой цепи V гена по сравнению с антигенсвязывающими белками, продуцируемыми контрольным отличным от человеком животным, которое является диким типом в геномном локусе-мишени, после иммунизации контрольного отличного от человека животного представляющим интерес чужеродным антигеном.
12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором некоторые из антигенсвязывающих белков, продуцируемых генетически модифицированным F0-поколением отличного от человека животного, против представляющего интерес чужеродного антигена, перекрестно реагируют с аутоантигеном.
13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором последовательность, распознаваемая первой направляющей РНК, расположена в 5' положении относительно последовательности, распознаваемой второй направляющей РНК в геномном локусе-мишени, и
в котором стадия (a)(i) дополнительно включает в себя проведение анализа удерживания для определения того, что число копий равно 2 для участка в 5' положении и в пределах около 1 т.п.о. последовательности, распознаваемой первой направляющей РНК, и/или для участка в 3' положении и в пределах около 1 т.п.о. последовательности, распознаваемой второй направляющей РНК.
14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором представляющий интерес чужеродный антиген представляет собой ортолог аутоантигена.
15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором представляющий интерес чужеродный антиген содержит весь или часть белка человека.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором геномный локус-мишень модифицируется так, чтобы содержать вставку одного или более нуклеотидов, делецию одного или более нуклеотидов, или замену одного или более нуклеотидов.
17. Способ по п. 16, в котором геномный локус-мишень модифицируется так, чтобы содержать делецию одного или более нуклеотидов.
18. Способ по п. 17, в котором делеция является точной делецией без случайных вставок и делеций (инделей).
19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором последовательность, распознаваемая первой направляющей РНК, содержит старт-кодон для гена, кодирующего аутоантиген, или находится в пределах около 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 нуклеотидов от старт-кодона, и последовательность, распознаваемая второй направляющей РНК, содержит стоп-кодон для гена, кодирующего аутоантиген, или находится в пределах около 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, или 1000 нуклеотидов от стоп-кодона.
20. Способ по любому из пп. 1-18, в котором последовательности, распознаваемые первой и второй направляющими РНК, различны, и каждая из последовательностей, распознаваемых первой и второй направляющими РНК, содержит старт-кодон для гена, кодирующего аутоантиген, или находится в пределах около 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 нуклеотидов от старт-кодона.
21. Способ по любому из пп. 1-20, в котором геномный локус-мишень модифицируют так, чтобы он содержал биаллельную делецию размером между от около 0,1 т.п.о. до около 200 т.п.о.
22. Способ по любому из пп. 1-21, в котором модификация содержит биаллельную делецию всего или части гена, кодирующего аутоантиген.
23. Способ по любому из пп. 1-22, в котором модификация содержит биаллельное разрушение старт-кодона гена, кодирующего аутоантиген.
24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором стадия введения (a)(i) дополнительно включает введение в плюрипотентную клетку отличного от человека животного или эмбриона отличного от человека животного на одноклеточной стадии:
(iv) третьей направляющей РНК, которая гибридизуется с последовательностью, распознаваемой третьей направляющей РНК в геномном локусе-мишени; и/или
(v) четвертой направляющей РНК, которая гибридизуется с последовательностью, распознаваемой четвертой направляющей РНК в геномном локусе-мишени;
25. Способ по любому из пп. 1-24, в котором клетка на стадии (a)(i) представляет собой плюрипотентную стволовую клетку отличного от человека животного, и все из белка Cas9, первой направляющей РНК, и второй направляющей РНК вводят в плюрипотентную стволовую клетку отличного от человека животного в форме ДНК.
26. Способ по любому из пп. 1-25, в котором клетка на стадии (a)(i) представляет собой плюрипотентную стволовую клетку отличного от человека животного, и все из белка Cas9, первой направляющей РНК, и второй направляющей РНК вводят в плюрипотентную стволовую клетку отличного от человека животного путем электропорации или нуклеофекции.
27. Способ по любому из пп. 1-24, в котором клетка на стадии (a)(i) представляет собой эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии, и все из белка Cas9, первой направляющей РНК, и второй направляющей РНК вводят в эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии в форме РНК.
28. Способ по любому из пп. 1-24 и п. 27, в котором клетка на стадии (a)(i) представляет собой эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии, и все из белка Cas9, первой направляющей РНК, и второй направляющей РНК вводят в эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии путем пронуклеарной инъекции или цитоплазматической инъекции.
29. Способ по любому из пп. 1-28, в котором на стадии (a)(i) не вводится экзогенная матрица для репарации.
30. Способ по любому из пп. 1-28, в котором стадия введения (a)(i) дополнительно включает введение в плюрипотентную клетку отличного от человека животного или эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии экзогенной матрицы для репарации, содержащий 5'-плечо гомологии, которое гибридизуется с 5' последовательностью-мишенью в геномном локусе-мишени, и 3'-плечо гомологии, которое гибридизуется с 3' последовательностью-мишенью в геномном локусе-мишени, при условии, что если клетка на стадии (a)(i) представляет собой эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии, экзогенная матрица для репарации составляет не более чем около 5 т.п.о. в длину.
31. Способ по п. 30, в котором экзогенная матрица для репарации дополнительно содержит вставку нуклеиновой кислоты, фланкированную 5'-плечом гомологии и 3'-плечом гомологии.
32. Способ по п. 31, в котором вставка нуклеиновой кислоты гомологична или ортологична геномному локусу-мишени.
33. Способ по любому из пп. 30-32, в котором длина экзогенной матрицы для репарации находится в промежутке от около 50 нуклеотидов до около 1 т.п.о.
34. Способ по п. 33, в котором длина экзогенной матрицы для репарации находится в промежутке от около 80 нуклеотидов до около 200 нуклеотидов.
35. Способ по любому из пп. 30-34, в котором экзогенная матрица для репарации представляет собой одноцепочечный олигодезоксинуклеотид.
36. Способ по любому из пп. 30-32, в котором клетка на стадии (a)(i) представляет собой плюрипотентную клетку отличного от человека животного, и в котором:
(a) экзогенная матрица для репараци представляет собой большой нацеливающий вектор (LTVEC), который имеет длину по меньшей мере 10 т.п.о.; или
(b) экзогенная матрица для репараци представляет собой LTVEC, причем общая сумма 5'- и 3'-плечей гомологии LTVEC имеет длину по меньшей мере 10 т.п.о.
37. Способ по любому из пп. 30-36, в котором геномный локус-мишень модифицируется так, чтобы содержать делецию одного или более нуклеотидов, и
в котором последовательность удаленной нуклеиновой кислоты состоит из последовательности нуклеиновой кислоты между 5' и 3' последовательностями-мишенями.
38. Способ по любому из пп. 30-37, в котором экзогенная матрица для репарации содержит вставку нуклеиновой кислоты, фланкированную 5'-плечом гомологии и 3'-плечом гомологии,
в котором вставка нуклеиновой кислоты гомологична или ортологична удаленной последовательности нуклеиновой кислоты,
в котором геномный локус-мишень модифицируется так, чтобы содержать делецию одного или более нуклеотидов, и
в котором вставка нуклеиновой кислоты заменяет удаленную последовательность нуклеиновой кислоты.
39. Способ по любому из пп. 1-38, в котором отличное от человека животное содержит гуманизированный локус иммуноглобулина.
40. Способ по любому из пп. 1-39, в котором отличное от человека животное представляет собой грызуна.
41. Способ по п. 40, в котором грызун представляет собой мышь.
42. Способ по п. 41, в котором линия мыши содержит линию BALB/c.
43. Способ по п. 42, в котором линия мышей содержит линии BALB/c, C57BL/6 и 129.
44. Способ по п. 43, в котором линия мышей представляет собой 50% BALB/c, 25% C57BL/6 и 25% 129.
45. Способ по любому из пп. 41-44, в котором гаплотип МНС мыши представляет собой MHCb/d.
46. Способ по любому из пп. 41-45, в котором мышь содержит в своей зародышевой линии неперестроенные генные сегменты вариабельного участка человека, вставленные в эндогенный локус иммуноглобулина мыши.
47. Способ по п. 46, в котором неперестроенные генные сегменты вариабельного участка человека являются генными сегментами тяжелой цепи, а локус иммуноглобулина мыши является локусом тяжелой цепи, и/или в котором неперестроенные генные сегменты вариабельного участка человека являются сегментами легкой цепи каппа или лямбда, и локус иммуноглобулина мыши является локусом легкой цепи.
48. Способ по п. 46 или 47, в котором мышь содержит в своих зародышевых линиях неперестроенные генные сегменты вариабельного участка человека, функционально связанные с геном константного участка мыши, причем мышь не имеет гена константного участка человека, и причем ген константного участка мыши находится в эндогенном локусе иммуноглобулина мыши.
49. Способ по любому из пп. 46-48, в котором мышь содержит:
(a) гибридный локус тяжелой цепи, содержащий вставку генных сегментов V, D и J тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем генные сегменты V, D и J тяжелой цепи иммуноглобулина человека функционально связаны с геном тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, причем ген тяжелой цепи иммуноглобулина мыши находится в эндогенном локусе иммуноглобулина мыши; и
(b) гибридный локус легкой цепи, содержащий вставку генных сегментов V и J легкой цепи иммуноглобулина человека, причем генные сегменты V и J человека функционально связаны с последовательностью гена константного участка легкой цепи иммуноглобулина мыши;
причем (а) перестраивается с образованием гибридной последовательности тяжелой цепи, содержащей вариабельный участок человека, функционально связанный с константным участком мыши, и (b) перестраивается с образованием гибридной последовательности легкой цепи, содержащей вариабельный участок человека, функционально связанный с константным участком мыши, и причем мышь неспособна образовывать антитело, которое содержит вариабельный участок человека и константный участок человека.
50. Способ по любому из пп. 41-48, в котором мышь содержит в своей зародышевой линии гуманизированный вариабельный локус легкой цепи иммуноглобулина, содержащий не более одной или не более двух перестроенных последовательностей V/J легкой цепи человека, функционально связанных с константным участком легкой цепи мыши, и при этом мышь дополнительно содержит гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий по меньшей мере один неперестроенный V человека, по меньшей мере один неперестроенный D человека, и по меньшей мере один неперестроенный J сегмент человека, функционально связанный с геном константного участка тяжелой цепи мыши.
51. Способ по п. 50, в котором мышь содержит гуманизированный вариабельный локус тяжелой цепи иммуноглобулина и гуманизированный вариабельный локус легкой цепи иммуноглобулина, причем мышь экспрессирует одну легкую цепь.
52. Способ по п. 51, в котором мышь содержит:
(a) один перестроенный вариабельный участок легкой цепи иммуноглобулина человека (VL/JL), который кодирует VL домен легкой цепи иммуноглобулина человека, причем один перестроенный участок VL/JL человека выбирается из генного сегмента VK1-39/JK5 человека или генного сегмента VK3-20/JK1 человека; и
(b) замещение вариабельных генных сегментов эндогенной тяжелой цепи (VH) одним или более генными сегментами VH человека, причем генные сегменты VH человека функционально связаны с геном константного участка эндогенной тяжелой цепи (CH), и генные сегменты VH человека способны перестраиваться и формировать ген химерной тяжелой цепи человека/мыши.
53. Способ по п. 51, в котором мышь экспрессирует популяцию антител, и зародышевая линия мыши содержит только один ген вариабельного участка легкой цепи каппа иммуноглобулина, который представляет собой перестроенный ген вариабельного участка легкой цепи каппа зародышевой линии человека,
причем мышь является либо гетерозиготной по указанному одному гену вариабельного участка легкой цепи каппа иммуноглобулина в том, что она содержит только одну копию, либо гомозиготна по одному гену вариабельного участка легкой цепи каппа иммуноглобулина в том, что она содержит две копии, причем мышь характеризуется активным созреванием аффинности так, что:
(i) каждая легкая цепь каппа иммуноглобулина популяции содержит вариабельный домен легкой цепи, который кодируется перестроенным геном вариабельного участка легкой цепи каппа зародышевой линии человека или его соматически мутированным вариантом;
(ii) популяция содержит антитела, содержащие легкие цепи каппа иммуноглобулина, вариабельный домен легкой цепи которых кодируется перестроенным геном вариабельного участка легкой цепи каппа зародышевой линии человека, и антитела, содержащие легкие цепи каппа иммуноглобулина, вариабельный домен легкой цепи которых кодируется его соматически мутированными вариантами; и
(iii) мышь генерирует разнообразную коллекцию соматически мутированных тяжелых цепей с высокой аффинностью, которые успешно спариваются с легкими цепями каппа иммуноглобулина с образованием антител популяции.
54. Способ по п. 51, в котором мышь является гетерозиготной или гомозиготной по своей зародышевой линии для:
(a) вставки в эндогенный локус вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина к мыши перестроенной VK/JK последовательности, содержащей:
(i) одну последовательность VK зародышевой линии человека, причем указанная одна последовательность VK зародышевой линии человека присутствует в SEQ ID NO: 148 или SEQ ID NO: 149; и
(ii) одну последовательность JK зародышевой линии человека, причем перестроенная последовательность VK/JK функционально связана с эндогенным константным участком к мыши; и
(b) вставки в эндогенный локус вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина мыши множества генных сегментов вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем генные сегменты вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина человека функционально связаны с константным участком эндогенной тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, и генные сегменты вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина человека способны перестраиваться и формировать перестроенный ген тяжелой цепи химерного иммуноглобулина человека/мыши.
55. Способ по любому из пп. 46-54, в котором мышь содержит модификацию локуса тяжелой цепи иммуноглобулина, причем модификация уменьшает или устраняет эндогенную функцию ADAM6,
причем мышь содержит эктопическую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок ADAM6 мыши, его ортолог, его гомолог, или его фрагмент, причем белок ADAM6, его ортолог, его гомолог или его фрагмент, функционируют у самца мыши, и
причем эктопическая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок ADAM6 мыши, его ортолог, его гомолог или его фрагмент, присутствует в локусе вариабельного участка тяжелой цепи человека.
56. Способ по любому из пп. 1-55, в котором отличное от человека животное представляет собой мышь, которая, по меньшей мере, частично получена из линии BALB/c, и мышь содержит гуманизированный локус иммуноглобулина,
причем представляющий интерес чужеродный антиген представляет собой весь или часть человеческого белка, который ортологичен аутоантигену,
причем последовательность, распознаваемая первой направляющей РНК, содержит старт-кодон для гена, кодирующего аутоантиген, или находится в пределах около 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 нуклеотидов от старт-кодона, и последовательность, распознаваемая второй направляющей РНК, содержит стоп-кодон для гена, кодирующего аутоантиген, или находится в пределах около 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, или 1000 нуклеотидов от стоп-кодона, и
причем модификация включает биаллельную делецию всего или части гена, кодирующего аутоантиген, в результате чего экспрессия аутоантигена устранена.
57. Способ по любому из пп. 1-55, в котором отличное от человека животное представляет собой мышь, которая, по меньшей мере, частично получена из линии BALB/c, и мышь содержит гуманизированный локус иммуноглобулина,
причем представляющий интерес чужеродный антиген представляет собой весь или часть человеческого белка, который ортологичен аутоантигену,
причем последовательность, распознаваемая первой направляющей РНК, содержит старт-кодон для гена, кодирующего аутоантиген, и последовательность, распознаваемая второй направляющей РНК, содержит стоп-кодон для гена, кодирующего аутоантиген, или находится в пределах около 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, или 1000 нуклеотидов от стоп-кодона, и
причем модификация содержит биаллельное разрушение старт кодона для гена, кодирующего аутоантиген, в результате чего экспрессия аутоантигена устранена.
58. Способ по п. 56 или 57, в котором мышь содержит:
(a) последовательность эктопической нуклеиновой кислоты, кодирующую белок ADAM6 мыши, его ортолог, его гомолог, или его фрагмент, причем белок ADAM6, его ортолог, его гомолог или его фрагмент, функционируют у самца мыши;
(b) гибридный локус тяжелой цепи, содержащий вставку генных сегментов V, D и J тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем генные сегменты V, D и J тяжелой цепи иммуноглобулина человека, функционально связаны с геном тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, причем ген тяжелой цепи иммуноглобулина мыши находится в эндогенном локусе иммуноглобулина мыши; и
(c) гибридный локус легкой цепи, содержащий вставку генных сегментов V и J легкой цепи иммуноглобулина человека, причем генные сегменты V и J человека, функционально связаны с последовательностью гена константного участка легкой цепи иммуноглобулина мыши;
причем (b) перестраивается с образованием гибридной последовательности тяжелой цепи, содержащей вариабельный участок человека, функционально связанный с константным участком мыши, и (с) перестраивается с образованием гибридной последовательности легкой цепи, содержащей вариабельный участок человека, функционально связанный с константным участком мыши, и причем мышь неспособна образовывать антитело, которое содержит вариабельный участок человека и константный участок человека.
59. Способ по п. 56 или 57, в котором мышь является гетерозиготной или гомозиготной в своей зародышевой линии по:
(a) последовательности эктопической нуклеиновой кислоты, кодирующей белок ADAM6 мыши, его ортолог, его гомолог, или его фрагмент, причем белок ADAM6, его ортолог, его гомолог или его фрагмент, функционируют у самца мыши;
(b) вставке в эндогенный локус вариабельного участка легкой цепи иммуноглобулина к мыши перестроенной VK/JK последовательности, содержащей:
(i) одну последовательность VK зародышевой линии человека, причем указанная одна последовательность VK зародышевой линии человека присутствует в SEQ ID NO: 148 или SEQ ID NO: 149; и
(ii) одну последовательность JK зародышевой линии человека, причем перестроенная последовательность VK/JK функционально связана с эндогенным константным участком к мыши; и
(с) вставку в эндогенный локус вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина мыши множества генных сегментов вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина человека, причем генные сегменты вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина человека функционально связаны с константным участком эндогенной тяжелой цепи иммуноглобулина мыши, и генные сегменты вариабельного участка тяжелой цепи иммуноглобулина человека способны перестраиваться и формировать перестроенный ген тяжелой цепи химерного иммуноглобулина человека/мыши.
60. Способ по любому из пп. 1-59, в котором плюрипотентная клетка отличного от человека животного представляет собой гибридную клетку, или эмбрион отличного от человека млекопитающего на одноклеточной стадии представляет собой гибридный эмбрион на одноклеточной стадии, и причем способ дополнительно включает:
(а') сравнение последовательности пары соответствующих первой и второй хромосом в геномном локусе-мишени, и выбор участка-мишени в пределах геномного локуса-мишени перед стадией приведения в контакт (а) на основе участка-мишени, имеющего более высокий процент идентичности между парой соответствующих первой и второй хромосом относительно всего или части остатка геномного локуса-мишени, причем участок-мишень содержит:
последовательность, распознаваемую первой направляющей РНК, и по меньшей мере 10 п.о., 20 п.о., 30 п.о., 40 п.о., 50 п.о., 100 п.о., 200 п.о., 300 п.о., 400 п.о., 500 п.о., 600 п.о., 700 п.о., 800 п.о., 900 п.о., 1 т.п.о., 2 т.п.о., 3 т.п.о., 4 т.п.о., 5 т.п.о., 6, т.п.о., 7 т.п.о., 8 т.п.о., 9 т.п.о. или 10 т.п.о. фланкирующей последовательности на 5 'стороне, 3' стороне или на каждой стороне последовательности, распознаваемой первой направляющей РНК, и/или
последовательность, распознаваемую второй направляющей РНК, и по меньшей мере 10 п.о., 20 п.о., 30 п.о., 40 п.о., 50 п.о., 100 п.о., 200 п.о., 300 п.о., 400 п.о., 500 п.о., 600 п.о., 700 п.о., 800 п.о., 900 п.о., 1 т.п.о., 2 т.п.о., 3 т.п.о., 4 т.п.о., 5 т.п.о., 6, т.п.о., 7 т.п.о., 8 т.п.о., 9 т.п.о. или 10 т.п.о. фланкирующей последовательности на 5 'стороне, 3' стороне или на каждой стороне последовательности, распознаваемой второй направляющей РНК.
61. Способ по п. 60, в котором участок-мишень имеет более высокий процент идентичности последовательности между парой соответствующих первой и второй относительно остальной части геномного локуса-мишени.
62. Способ по п. 61, в котором участок-мишень имеет по меньшей мере 99,9% идентичности последовательности между парой соответствующих первой и второй хромосом, а остальная часть целевого геномного локуса-мишени имеет не более чем 99,8% идентичности последовательности между парой соответствующих первой и второй хромосом.
63. Способ создания генетически модифицированного отличного от человека животного с пониженной толерантностью к представляющему интерес чужеродному антигену, включающий:
(а) введение в эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии или плюрипотентную клетку отличного от человека животного, которая не является эмбрионом на одноклеточной стадии:
(i) белка Cas9;
(ii) первой направляющей РНК, которая гибридизуется с последовательностью, распознаваемой первой направляющей РНК в геномном локусе-мишени, причем геномный локус-мишень содержит весь или часть гена, кодирующего аутоантиген, гомологичный или обладающий общим представляющим интерес эпитопом с представляющим интерес чужеродным антигеном; и
(iii) второй направляющей РНК, которая гибридизуется с последовательностью, распознаваемой второй направляющей РНК в геномном локусе-мишени;
причем геномный локус-мишень модифицируется в паре соответствующих первой и второй хромосом для получения модифицированного эмбриона отличного от человека животного на одноклеточной стадии или модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного с биаллельной модификацией, причем экспрессия аутоантигена устраняется; и
(b) получение генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного из модифицированного эмбриона отличного от человека животного на одноклеточной стадии или модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного, причем геномный локус-мишень модифицирован в паре соответствующих первой и второй хромосом у генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного так, что экспрессия аутоантигена устранена.
64. Способ по п. 63, в котором клетка на стадии (а) представляет собой плюрипотентную стволовую клетку отличного от человека животного, и продуцирование генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного на стадии (b) включает:
(I) введение модифицированной плюрипотентной клетки отличного от человека животного в эмбрион-хозяин; и
(II) имплантацию эмбриона-хозяина суррогатной матери для получения генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного, у которого геномный локус-мишень модифицирован в паре соответствующих первой и второй хромосом так, что экспрессия аутоантигена устранена.
65. Способ по п. 64, в котором плюрипотентная клетка представляет собой эмбриональную стволовую (ЭС) клетку.
66. Способ по п. 63, в котором клетка на стадии (а) представляет собой эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии, и продуцирование генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного на стадии (b) включает имплантацию модифицированного эмбриона отличного от человека животного на одноклеточной стадии суррогатной матери для получения генетически модифицированного F0-поколения отличного от человека животного, у которого геномный локус-мишень модифицирован в паре соответствующих первой и второй хромосом, так что экспрессия аутоантигена устранена.
67. Способ по любому из пп. 63-66, в котором представляющий интерес чужеродный антиген представляет собой ортолог аутоантигена.
68. Способ по любому из пп. 63-67, в котором последовательность, распознаваемая первой направляющей РНК, содержит старт-кодон для гена, кодирующего аутоантиген, или находится в пределах около 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 нуклеотидов от старт-кодона, и последовательность, распознаваемая второй направляющей РНК, содержит стоп-кодон для гена, кодирующего аутоантиген, или находится в пределах около 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, или 1000 нуклеотидов от стоп-кодона.
69. Способ по любому из пп. 63-67, в котором последовательности, распознаваемые первой и второй направляющими РНК, различны, и каждая из последовательностей, распознаваемых первой и второй направляющими РНК, содержит старт-кодон для гена, кодирующего аутоантиген, или находится в пределах около 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 нуклеотидов от старт-кодона.
70. Способ по любому из пп. 63-69, в котором последовательность, распознаваемая первой направляющей РНК, расположена в 5' положении относительно последовательности, распознаваемой второй направляющей РНК в геномном локусе-мишени,
и в котором стадия (a)(i) дополнительно включает в себя проведение анализа удерживания для определения того, что число копий равно 2 для участка в 5' положении и в пределах около 1 т.п.о. последовательности, распознаваемой первой направляющей РНК, и/или для участка в 3' положении и в пределах около 1 т.п.о. последовательности, распознаваемой второй направляющей РНК.
71. Способ по любому из пп. 63-70, в котором модификация содержит биаллельную делецию всего или части гена, кодирующего аутоантиген.
72. Способ по любому из пп. 63-71, в котором модификация содержит биаллельное разрушение всего или части гена, кодирующего аутоантиген.
73. Способ по любому из пп. 63-72, в котором отличное от человека животное представляет собой мышь.
