Оптимальные локусы маиса - RU2016122046A
Код документа: RU2016122046A
Формула
1. Рекомбинантная последовательность, содержащая:
внегенную геномную последовательность маиса по меньшей мере 1 т.п.о., где указанная внегенная последовательность является гипометилированной, поддающейся нацеливанию, расположенной вблизи генной области в геноме маиса и демонстрирует признаки рекомбинации; и
представляющую интерес ДНК, которая вставлена в указанную внегенную последовательность.
2. Рекомбинантная последовательность по п. 1, где указанная внегенная последовательность обладает следующими характеристиками:
a. уровень метилирования указанной внегенной последовательности составляет 1% или менее;
b. указанная внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью, содержащейся в геноме Zea mays;
c. указанная внегенная последовательность расположена в пределах области 40 т.п.о. от известной или прогнозируемой экспрессируемой кодирующей последовательности маиса; и
d. указанная внегенная последовательность обладает частотой рекомбинации в геноме маиса более 0,00041 сМ/млн.п.о.
3. Рекомбинантная последовательность по п. 1, где указанная внегенная последовательность обладает максимальной длиной 8,3 т.п.о.
4. Рекомбинантная последовательность по п. 1, где указанная внегенная последовательность обладает 1% или менее метилирования нуклеотидов.
5. Рекомбинантная последовательность по п. 4, где указанная внегенная последовательность имеет длину 1 т.п.о. - 8,3 т.п.о. и не содержит метилированных остатков цитозина.
6. Рекомбинантная последовательность по п. 5, где указанная внегенная последовательность не выравнивается с более чем 40% идентичностью последовательности с любой другой последовательностью в геноме Zea mays.
7. Рекомбинантная последовательность по п. 5, где указанная внегенная последовательность демонстрирует признаки рекомбинации с частотой рекомбинации более 0,00041 сМ/млн.п.о.
8. Рекомбинантная последовательность по п. 5, где область 40 т.п.о. нативного генома маиса, содержащая указанную внегенную последовательность, содержит также по меньшей мере одну известную или прогнозируемая кодирующую последовательность маиса, или последовательность, содержащую 2 т.п.о. выше и/или 1 т.п.о. ниже последовательности известного гена маиса.
9. Рекомбинантная последовательность по п. 8, где указанная известная или прогнозируемая кодирующая последовательность маиса экспрессирует белок маиса.
10. Рекомбинантная последовательность по п. 1, где указанная внегенная последовательность не содержит метилированный полинуклеотид.
11. Рекомбинантная последовательность по п. 1, где один конец указанной внегенной последовательности находится в пределах 40 т.п.о. от экспрессируемого эндогенного гена.
12. Рекомбинантная последовательность по п. 1, где указанная представляющая интерес ДНК содержит аналитический домен.
13. Рекомбинантная последовательность по п. 1, где указанная представляющая интерес ДНК не кодирует пептид.
14. Рекомбинантная последовательность по п. 1, где указанная представляющая интерес ДНК кодирует пептид.
15. Рекомбинантная последовательность по п. 14, где указанная представляющая интерес ДНК содержит экспрессирующую генную кассету, содержащую ген устойчивости к инсектицидам, ген устойчивости к гербицидам, ген эффективности усвоения азота, ген эффективности усвоения воды, ген пищевой ценности, ген связывающего ДНК белка и ген селективного маркера.
16. Рекомбинантная последовательность по п. 1, отличающаяся тем, что указанная рекомбинантная последовательность обладает следующими характеристиками:
a. указанная внегенная последовательность содержит менее 1% метилирования ДНК;
b. указанная внегенная последовательность обладает частотой рекомбинации в геноме маиса 0,00041-62,42 сМ/млн.п.о.;
c. указанная внегенная последовательность обладает уровнем занятости нуклеосомами в геноме маиса 0-0,962;
d. указанная внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью, содержащейся в геноме маиса;
e. указанная внегенная последовательность обладает значением относительного расположения 0,00373-0,99908, представляющим собой отношение геномного расстояния от центромеры хромосомы маиса;
f. указанная внегенная последовательность обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне 25,17-68,3%;
g. указанная внегенная последовательность локализована вблизи генной последовательности; и
h. указанная внегенная последовательность локализована в области 1 млн.п.о. геномной последовательности маиса, содержащей одну или несколько дополнительных внегенных последовательностей.
17. Растение маиса, часть растения маиса, или клетка растения маиса, содержащие рекомбинантную последовательность по любому из пп. 1-16.
18. Растение маиса, часть растения маиса, или клетка растения маиса по п. 17, где указанная известная или прогнозируемая кодирующая последовательность маиса экспрессируется на уровне, находящимся в диапазоне от 0,00369 до 2233,06.
19. Рекомбинантная последовательность по п. 1, где указанная представляющая интерес ДНК и/или указанная внегенная последовательность модифицированы посредством вставки указанной представляющей интерес ДНК в указанную внегенную последовательность.
20. Способ получения трансгенной клетки растения, содержащей представляющую интерес ДНК, нацеленную на одну из внегенных геномных последовательностей маиса, где способ включает:
a. выбор оптимального внегенного геномного локуса маиса;
b. введение сайт-специфической нуклеазы в клетку растения, где сайт-специфическая нуклеаза расщепляет указанную внегенную геномную последовательность маиса;
c. введение представляющей интерес ДНК в клетку растения;
d. нацеливание представляющей интерес ДНК в указанный внегенный локус, где расщепление указанной внегенной последовательности облегчает интеграцию полинуклеотидной последовательности в указанный внегенный локус; и
e. отбор трансгенных клеток растений, содержащих представляющую интерес ДНК, нацеленную на указанный внегенный локус.
21. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 20, где указанная представляющая интерес ДНК содержит аналитический домен.
22. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 20, где указанная представляющая интерес ДНК не кодирует пептид.
23. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 20, где указанная представляющая интерес ДНК кодирует пептид.
24. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 20, где указанная представляющая интерес ДНК содержит экспрессирующую генную кассету, содержащую трансген.
25. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 20, где указанная сайт-специфическая нуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы с цинковыми пальцами, нуклеазы CRISPR, TALEN, эндонуклеазы хоминга или мегануклеазы.
26. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 20, где указанную представляющую интерес ДНК интегрируют в указанный внегенный локус посредством способа интеграции при направляемой гомологией репарации.
27. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 20, где указанную представляющую интерес ДНК интегрируют в указанный внегенный локус посредством способа интеграции при соединении негомологичных концов.
28. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 20, где указанный выбранный внегенный локус обладает следующими характеристиками:
a. указанный внегенный локус содержит менее 1% метилирования ДНК в последовательности;
b. указанный внегенный локус обладает частотой рекомбинации в геноме маиса 0,00041-62,42 сМ/млн.п.о.;
c. указанный внегенный локус обладает уровнем занятости нуклеосомами в геноме маиса 0-0,962;
d. указанный внегенный локус разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью 1 т.п.о., содержащейся в геноме маиса;
e. указанный внегенный локус обладает значением относительного расположения с отношением геномного расстояния от центромеры хромосомы маиса 0,00373-0,99908;
f. указанный внегенный локус обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне 25,17-68,3%;
g. указанный внегенный локус локализован вблизи генной последовательности; и
h. область 1 млн.п.о. геномной последовательности маиса, содержащая указанный внегенный локус, содержит по меньшей мере одну вторую внегенную последовательность.
29. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 28, где указанный внегенный локус имеет длину по меньшей мере 1т.п.о.
30. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 29, где известная или прогнозируемая кодирующая последовательность маиса, или последовательность, содержащая область 2 т.п.о. выше и 1 т.п.о. ниже известного гена, локализована в пределах 40 т.п.о. от указанного внегенного локуса.
31. Способ получения трансгенной клетки растения по п. 20, где указанную представляющую интерес ДНК и/или указанный внегенный локус модифицируют в ходе указанной интеграции полинуклеотидной последовательности в указанный внегенный локус со стадии (d).
32. Рекомбинантная поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса, содержащая:
внегенную последовательность из по меньшей мере 1 т.п.о., выбранную из группы, состоящей из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 или последовательности, разделяющей 99% идентичности последовательности с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из кластера 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 и соответствующих комплементарных им последовательностей, где указанные кластеры получены по статистическому алгоритму PCA, включающему значения PCA, определенные в таблице 6; и
представляющую интерес ДНК, вставленную в указанную внегенную последовательность.
33. Поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса по п. 32, где указанная представляющая интерес ДНК содержит аналитический домен.
34. Поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса по п. 32, где указанная представляющая интерес ДНК кодирует пептид.
35. Поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса по п. 32, где указанная представляющая интерес ДНК содержит экспрессирующую генную кассету, содержащую трансген.
36. Поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса по п. 32, где указанная представляющая интерес ДНК содержит сайт-специфический участок расщепления.
37. Поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса по п. 36, где указанный сайт-специфический участок расщепления расщепляется нуклеазой.
38. Поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса по п. 37, где указанная нуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы с цинковыми пальцами, нуклеазы CRISPR, TALEN, эндонуклеазы хоминга или мегануклеазы.
39. Поддающаяся нацеливанию внегенная геномная последовательность маиса по п. 32, где указанная вставка указанной представляющей интерес ДНК в указанную внегенную последовательность приводит к модификации указанной представляющей интерес ДНК и указанной внегенной последовательности.
40. Очищенная внегенная геномная последовательность маиса из по меньшей мере 1 т.п.о., гдн указанная внегенная последовательность является гипометилированной, поддающейся нацеливанию, расположенной вблизи генной области в геноме маиса, и демонстрирующей признаки рекомбинации.
41. Очищенная последовательность по п. 40, где указанная внегенная последовательность обладает следующими характеристиками:
a. уровень метилирования указанной внегенной последовательности составляет 1% или менее;
b. указанная внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью, содержащейся в геноме Zea mays;
c. указанная внегенная последовательность локализована в области 40 т.п.о. от известной или прогнозируемой экспрессируемой кодирующей последовательности маиса; и
d. указанная внегенная последовательность обладает частотой рекомбинации в геноме маиса более 0,00041 сМ/млн.п.о.
42. Очищенная последовательность по п. 40, где указанная внегенная последовательность обладает максимальной длиной 8,3 т.п.о.
43. Очищенная последовательность по п. 40, где указанная последовательность обладает следующими характеристиками:
a. указанная внегенная последовательность содержит менее 1% метилирования ДНК в ее нативной локализации;
b. указанная внегенная последовательность, в ее нативной локализации, обладает частотой рекомбинации в геноме маиса 0,00041-62,42 сМ/млн.п.о.;
c. указанная внегенная последовательность обладает уровнем занятости нуклеосомами в геноме маиса 0-0,962, в ее нативной локализации;
d. указанная внегенная последовательность разделяет менее 40% идентичности последовательности с любой другой последовательностью, содержащейся в геноме маиса;
e. указанная внегенная последовательность обладает значением относительного расположения с отношением геномного расстояния от центромеры хромосомы маиса 0,00373-0,99908, в ее нативной локализации;
f. указанная внегенная последовательность обладает процентным содержанием гуанина/цитозина в диапазоне 25,17-68,3%;
g. указанная внегенная последовательность локализована в пределах 40 т.п.о. от известной или прогнозируемой кодирующей последовательности маиса, или последовательности, содержащей область 2 т.п.о. выше и 1 т.п.о. ниже известного гена, в ее нативной локализации; и
h. указанная внегенная последовательность локализована в области 1 млн.п.о. геномной последовательности маиса, содержащей одну или несколько дополнительных внегенных последовательностей,в ее нативной локализации.
По доверенности
