Одновременное редактирование генов и индукция гаплоидов - RU2019119844A
Код документа: RU2019119844A
Формула
1. Способ редактирования геномной ДНК растения, предусматривающий
a) получение первого растения, где первое растение представляет собой линию-индуктор гаплоидов растения, и где указанное первое растение способно экспрессировать фермент для модификации ДНК и необязательно по меньшей мере одну направляющую нуклеиновую кислоту;
b) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию;
c) опыление второго растения пыльцой от первого растения и
d) отбор по меньшей мере одного гаплоидного потомка, полученного с помощью опыления на стадии (с), где гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и необязательной по меньшей мере одной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленных первым растением.
2. Способ по п. 1, где фермент для модификации ДНК представляет собой сайт-направленную нуклеазу, выбранную из группы, состоящей из мегануклеаз (MN), нуклеаз с "цинковыми пальцами" (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), нуклеазы Cas9, нуклеазы Cfp1, dCas9-FokI, dCpf1-FokI, химерной Cas9-цитидиндезаминазы, химерной Cas9-адениндезаминазы, химерной FEN1-FokI и Mega-TAL, никазы Cas9 (nCas9), химерной нуклеазы dCas9, не содержащей FokI, и нуклеазы dCpf1, не содержащей FokI.
3. Способ по п. 1, где по меньшей мере одна направляющая нуклеиновая кислота представляет собой направляющую РНК.
4. Способ по п. 1, где отредактированного гаплоидного потомка обрабатывают с помощью средства для удвоения числа хромосом, за счет чего получают потомка, являющегося удвоенным гаплоидом.
5. Способ по п. 4, где средство для удвоения числа хромосом представляет собой колхицин, пронамид, дитипир, трифлуралин или другое известное средство, ингибирующее образование микротрубочек.
6. Способ по п. 1, где первое растение является однодольным растением или двудольным растением.
7. Способ по п. 6, где первое растение представляет собой однодольное растение, выбранное из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, овса, тритикале, сорго, жемчужного проса, теосинте, бамбука, сахарного тростника, спаржи, лука и чеснока.
8. Способ по п. 1, где второе растение является однодольным растением или двудольным растением.
9. Способ по п. 8, где второе растение представляет собой однодольное растение, выбранное из группы, состоящей из маиса, пшеницы, риса, ячменя, овса, тритикале, сорго, жемчужного проса, теосинте, бамбука, сахарного тростника, спаржи, лука и чеснока.
10. Способ по п. 1, где необязательная направляющая РНК представляет собой последовательность из 18-21 нуклеотида и является гомологичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 4, 8, 21, 23, 25, 29, 32 и 33.
11. Способ по п. 1, где в первом растении экспрессируется маркерный ген.
12. Способ по п. 11, где маркерный ген выбран из группы, состоящей из GUS, PMI, PAT, GFP, RFP, CFP, B1, C1, R-nj, антоцианиновых пигментов и любого другого маркерного гена.
13. Способ по п. 1, где первое растение представляет собой растение маиса, выбранное и/или полученное из линий Stock6, RWK, RWS, UH400, AX5707RS, NP2222-matl или из любой из нескольких других известных линий HI.
14. Способ по п. 1, где первое растение и второе растение относятся к разным видам.
15. Способ по п. 14, где первое растение представляет собой растение пшеницы, а второе растение представляет собой растение маиса.
16. Способ по п. 14, где первое растение представляет собой растение маиса, а второе растение представляет собой растение пшеницы.
17. Растение с отредактированными генами, полученное с помощью способа по п. 1.
18. Способ редактирования геномной ДНК растения, предусматривающий
a) получение первого растения, где указанное первое растение способно экспрессировать фермент для модификации ДНК и необязательно направляющую нуклеиновую кислоту;
b) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию;
c) опыление второго растения пыльцой от первого растения;
d) применение композиции, содержащей липид или ингибитор фосфолипазы, непосредственно до, в ходе или после опыления на стадии (с) и
e) отбор по меньшей мере одного гаплоидного потомка, полученного с помощью опыления на стадии (с), где гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и необязательной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленных первым растением.
19. Способ по п. 18, где композиция из стадии (d) содержит метил-альфа-линоленоилфторфосфонат (MALFP), сложный этиловый эфир линолевой кислоты (LLAEE), линолевую кислоту (LLA), кукурузное масло, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), метиларахидонилфторфосфонат (MAFP), пальмитилтрифторметилкетон (PACOCF3), арахидонилтрифторметилкетон (AACOCF3), маноалид, сложный этиловый эфир линоленовой кислоты (LNAEE), сложный этиловый эфир линоленовой кислоты (LNAEE), сложный метиловый эфир олеиновой кислоты (ОАМЕ), сложный этиловый эфир олеиновой кислоты (ОАЕЕ), сложный этиловый эфир пальмитиновой кислоты (РАЕЕ), сложный этиловый эфир пальмитолеиновой кислоты (PLAEE), льняное масло, кукурузное масло, альфа-линоленовую кислоту (aLNA), гамма-линоленовую кислоту (gLNA), олеиновую кислоту, арахидоновую кислоту, стеариновую кислоту, 9(Z)-11(Е)-конъюгированную линолевую кислоту или 2-олеоил-1-пальмитоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин.
20. Способ редактирования геномной ДНК растения, предусматривающий
a) получение первого растения, где указанное первое растение способно экспрессировать фермент для модификации ДНК и необязательно направляющую нуклеиновую кислоту;
b) получение второго растения, где второе растение содержит геномную ДНК растения, которая подлежит редактированию;
c) скрещивание первого растения со вторым растением и
d) отбор по меньшей мере одного гаплоидного потомка, полученного путем скрещивания на стадии (с), где гаплоидный потомок содержит геном второго растения, но не первого растения, и при этом геном гаплоидного потомка был модифицирован с помощью фермента для модификации ДНК и необязательной направляющей нуклеиновой кислоты, доставленных первым растением.
21. Способ по п. 20, где первое растение выступает в качестве женского родительского растения в ходе скрещивания на стадии (с).
22. Способ по п. 21, где первое растение содержит мутацию в гене CENH3, гене ig1 или другую мутацию, обеспечивающую получение систем, индуцирующих гаплоиды, которые содержат геном отцовского растения.
