Стабилизирующая композиция для сухого хранения биологических материалов (варианты) - RU2573324C2

Чертежи

Описание

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области стабилизации биологических материалов в стеклообразной сухой структуре.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ

Важной проблемой для пищевой, нутрицевтической и фармацевтической отраслей является сохранение структуры и функции биологических материалов при длительном хранении при высокой температуре и высокой влажности. Чувствительные биологические материалы, такие как белки, ферменты, клетки, бактерии и вирусы, часто должны сохраняться в течение длительного периода хранения для дальнейшего использования. Простое замораживание, часто проводимое при сушке, или вредно или не подходит для конечного продукта. Для сохранения в сухом состоянии традиционно используют способ лиофильной сушки. Другие способы, такие как сушка воздухом комнатной температуры, сушка под вакуумом при комнатной температуре (вакуумная сушка) или сушка контактированием мелкодисперсных капель тумана с теплым воздухом (распылительная сушка) и сушка при использовании десикации, как правило, не подходят для чувствительныхбиологически активных веществ, таких как живые или аттенуированные бактерии и вирусы. Высокая температура сушки, используемая в этих способах, приводит к значительному повреждению биологически активного вещества.

Часто процесс лиофильной сушки может привести к значительной потере активности и повреждению биологически активного агента из-за образования кристаллов льда в процессе медленной сушки. При лиофильной сушке комбинируются стрессовые воздействия обоих, и замораживания, и сушки. Стадия замораживания в этом процессе может оказывать нежелательное воздействие, такое как денатурация белков и ферментов и разрушение клеток. Можно до определенной степени избежать повреждения, вызванного замораживанием, добавлением в раствор криопротекторных соединений или агентов. Такие защитные агенты представляют, как правило, химические вещества с высокой степенью растворимости, которые при добавлении в состав защищают клеточные мембраны и белки в процессе замораживания и повышают стабильность во время хранения. Традиционные стабилизаторы включают сахара, такие как сахароза, трегалоза, глицерин или сорбит при высоких концентрациях (Morgan et al., 2006; Capela et al., 2006). Дисахариды, такие как сахароза и трегалоза, представляют натуральные криопротекторы с хорошими защитными свойствами. Трегалоза по существу является привлекательным криопротектором, поскольку фактически выделена из растений и живых организмов, которые находятся в состоянии анабиоза во время засухи. Трегалоза продемонстрировала свою эффективность в качестве защитного агента для различных биологических материалов (смотрите, Crowe, J. H., 1983). В нескольких патентах описывается применение трегалозы или трегалозы в комбинации с другими криопротекторами для защиты белков и других биологических макромолекул, таких как ферменты, сыворотки, комплименты сыворотки, антитела, антигены, флуоресцентные белки и компоненты вакцины в процессе замораживания, сушки и регидратации (патент США № 5556771).

Однако существуют некоторые недостатки, ассоциируемые с применением трегалозы или других дисахаридов или моносахаридов, в качестве единственного криопротектора. Трегалоза может неадекватно проникнуть в клетку для защиты активных компонентов во внутриклеточном объеме, что может привести к нестабильности при хранении прошедших лиофильную сушку веществ. Дополнительно, иногда необходимы концентрации трегалозы более чем 60% по массе от заданной консервирующей среды. Даже еще более серьезная проблема, связанная с применением трегалозы, состоит в том, что биологические материалы, сохраненные при использовании только одной трегалозы, не стабильны при хранении в течение длительного периода времени, в частности при хранении при высоких температурах и/или высокой влажности. Таким образом, продолжает существовать необходимость в разработке оптимального состава и процесса сушки, минимизирующего потери при сушке, с достижением при этом адекватной стабильности при хранении прошедших сушку материалов.

Некоторые проблемы, связанные с трегалозой и процессом лиофильной сушки, были решены при использовании комбинации определенных составов и вакуумной сушки в стеклообразном состоянии (патент США № 6190701). В этих составах биологически активный агент защищен в стеклообразной матрице от неблагоприятных условий окружающей среды, таких как высокие температуры и влажность. Однако, в этих составах присутствие воды вы виде влаги окружающей среды действует как пластифицирующий агент и снижает температуру стеклования (Tg) стеклообразной матрицы. При высоких содержаниях воды Tg значительно снижена до такой степени, что сухой состав при комнатной температуре находится в нежелательном резиноподобном или пластикоподобном состоянии.

Преимущества сохранения стеклообразной формы состава включают повышенную физическую стабильность твердого вещества и снижение нежелательных межмолекулярных реакций. Подробное обсуждение физической химии взаимодействий вода-пищевой полимер, связанных со стеклообразным состоянием и температурой стеклования, может быть найдено в M. Le Meste, et al. 2002. Однако, ограничения аморфных систем, такие как физическая нестабильность и высокая химическая реакционная способность, препятствуют их широкой коммерциализации.

Следовательно, продолжает существовать необходимость в стабилизирующей композиции, которую используют для широкого ряда биологических материалов. Дополнительно, продолжает существовать необходимость в стабилизирующей композиции, которая может быть эффективно использована в обоих процессах: и процессе лиофильной сушки, и процессе сушки, включающем сушку при комнатной температуре. Также продолжает существовать необходимость в композиции смеси, менее дорогостоящей, чем таковая используемая в настоящее время. Наконец, и это главное, продолжает существовать необходимость в композиции смеси, обеспечивающей стабильную среду для сохранения биологических материалов в течение длительного периода времени при повышенных температурах и различных степенях влажности, которые могут возникать в процессе транспортировки и хранения материалов, с сохранением при этом значительной степени активности при регидратации.

Все эти проблемы разрешаются при использовании композиции смеси, способов сушки по настоящему изобретению с получением в результате сохраненных композиций биологического материала.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение включает композиции и способы сушки для сохранения чувствительных биологически активных материалов, таких как пептиды, белки, гормоны, нуклеиновые кислоты, антитела, лекарственные средства, вакцины, дрожжи, бактерии (пробиотические или иные), вирусы и/или суспензии клеток, при хранении.

Композиция по настоящему изобретению включает смесь углеводов из ди-, олиго- и полисахаридов и ионов органических кислот, предпочтительно лимонной кислоты и/или аскорбиновой кислоты. Состав получают диспергированием всех твердых компонентов в растворе. Раствор быстро замораживают при использовании средств, известных из предшествующего уровня техники, таких как жидкий азот или сухой лед, с получением мелких гранул, нитей или капель. Замороженные гранулы могут храниться в устройстве глубокой заморозки (от -30°C до -80°C) для последующего использования в замороженном состоянии или размещенными на поддонах в замороженном состоянии для сушки в традиционном устройстве для лиофильной сушки. Предпочтительный способ сушки оптимально начинается с короткой продувки и стадии стабилизации структуры замороженных частиц под вакуумным давлением менее чем <2000 мм рт. ст. с последующей стадией первичной сушки под вакуумным давлением более чем >2000 мм рт. ст. и при заданной температуре. На стадии вторичной и конечной сушки материала прилагают полное вакуумное давление и повышенную температуру с достижением конечной заданной активности воды сухого материала.

В одном конкретном варианте воплощения настоящего изобретения биологический материал включает живые бактерии (например, пробиотические бактерии). Примеры подходящих микроорганизмов включают без ограничения дрожжи, такие как Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia и Torulopsis, плесени, такие как Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium и Torulopsis, и бактерии, такие как рода Bifidobacterium, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Kocuriaw, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus и Lactobacillus. Конкретные примеры подходящих пробиотических микроорганизмов могут быть представлены следующими видами и включают все биотипы культур этих видов: Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus coagulans, B. lentus, B. licheniformis, B. mesentericus, B. pumilus, B. subtilis, B. natto, Bacteroides amylophilus, Bac. capillosus, Bac. ruminocola, Bac. suis, Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. longum, B. pseudolongum, B. thermophilum, Candida pintolepesii, Clostridium butyricum, Enterococcus cremoris, E. diacety lactis, E faecium, E. intermedius, E. lactis, E. muntdi, E. thermophilus, Escherichia coli, Kluyveromyces fragilis, Lactobacillus acidophilus, L. alimentarius, L. amylovorus, L. crispatus, L. brevis, L. case 4 L. curvatus, L. cellobiosus, L. delbrueckii ss. bulgaricus, L farciminis, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. lactis, L. plantarum, L. johnsonii, L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarius, Leuconostoc mesenteroides, P. cereviseae ( damnosus), Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Propionibacterium freudenreichii, Prop, shermanii, Saccharomyces cereviseae, Staphylococcus carnosus, Staph, xylosus, Streptococcus infantarius, Strep. salivarius ss. thermophilus, Strep. Thermophilus и Strep. lactis.

В одном конкретном варианте воплощения настоящего изобретения состав включает смесь углеводов ди-, олиго- и полисахаридов, в которую заключен биологически активный материал. Примеры подходящих полисахаридов включают без ограничения ацетат фталат целлюлозы (CAP), карбоксиметилцеллюлозу, пектин, альгинат натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлозу (HPMC), метилцеллюлозу, каррагенан, геллановую камедь, гуаровую камедь, камедь акации, ксантановую камедь, камедь рожкового дерева, хитозан и производные хитозана, коллаген, полигликолевую кислоту, крахмалы и модифицированные крахмалы. Примеры подходящих олигосахаридов включают без ограничения циклодекстрины, инулин, FOS, мальтодекстрины, декстраны и тому подобное; и их комбинации. Примеры подходящих дисахаридов включают без ограничения лактозу, трегалозу, сахарозу и тому подобное. В одном конкретном варианте воплощения настоящего изобретения предпочтительным полисахаридом является альгинат натрия или геллановая камедь. Предпочтительно смесь углеводов включает в процентах по массе по сухому веществу 0,1-10% полисахаридов, 1-10% олигосахаридов и 10-90% дисахаридов. В другом варианте воплощения настоящего изобретения смесь углеводов включает ди-, олиго- и полисахариды в массовом соотношении 10:0,1-4:0,1-2, и более предпочтительно, когда массовое соотношение дисахаридов/олигосахаридов/ полисахаридов составляет от около 10:0,2:0,1 до около 10:2:1.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения полисахариды в смеси углеводов перекрестносшиты с ионами двухвалентных металлов с получением плотного гидрогеля.

В другом варианте воплощения настоящего изобретения композиция включает значительные количества соединений, усиливающих формирование стеклообразной структуры, включая соли органических кислот, таких как молочная кислота, аскорбиновая кислота, малеиновая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, яблочная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, глютаминовая кислота и тому подобное. Соли могут включать катионы, такие как натрий, калий, кальций, магний и тому подобное. Примеры включают цитрат натрия, лактат натрия, малеат натрия, глюконат магния, аскорбат натрия и тому подобное. Предпочтительными являются соли, имеющие высокую температуру стеклования (Tg) и высокую растворимость. Самой предпочтительной органической кислотой является лимонная кислота и ее соли (например, цитрат натрия или калия, дигидрат тринатрий цитрата) и аскорбиновая кислота и ее соли (например, аскорбат натрия, аскорбат калия, аскорбат магния). Предпочтительное общее количество ионов цитрата или аскорбата в сухой композиции находится в таком молярном соотношении ионов к молям углеводных соединений, как от около 0,01 до около 0,3 и наиболее предпочтительно от около 0,1 до около 0,2.

Другие используемые усилителями формирования стеклообразной структуры включают белки, гидролизаты белков, полипептиды и аминокислоты. Они включают желатин, альбумин, сывороточный белок, соевый белок, казеин, казеинат, иммуноглобулины, соевые белки, гороховые белки, белки семян хлопка или другие пищевые и молочные или растительные белки и/или их гидролизаты. Примеры полиаминокислот включают полиаланиновую, полиаргининовую, полиглициновую, полиглутаминовую кислоту и тому подобное. Используемые аминокислоты включают лизин, глицин, аланин, аргинин или гистидин, наряду с гидрофобными аминокислотами (триптофан, тирозин, лейцин, фенилаланин и тому подобное) и метиламином, таким как бетаин. Предпочтительное общее количество белков, гидролизатов белков и аминокислот в сухой композиции составляет от около 1% до около 30% от общей массы смеси углеводов и наиболее предпочтительно от около 5% до около 20% массы углеводов. Идеально соединения представляют соединения, признанные полностью безопасными (GRAS), GRAS соединения предпочтительны перед не GRAS соединениями.

Следует отметить, что необходимое количество усилителей формирования стеклообразной структуры в композиции может зависеть от заданных характеристик сухой композиции. Определение необходимого количества усилителей формирования стеклообразной структуры должны быть сделаны согласно заданным условиям хранения. Например, композиция, содержащая смесь углеводов и белков или гидролизатов белков, может быть использована для усиления химической стабильности биологического материала при хранении при умеренной температуры и относительной влажности, таких как 25°C и 25% ОВ. Предпочтительными для включения в усилитель формирования стеклообразной структуры могут быть ионы цитрата с получением дополнительных преимуществ стабилизации при более высокой температуре и влажности. В качестве альтернативы, это может быть случай, когда более предпочтительна для включения в композицию комбинация ионов цитрата и/или аскорбата с другим усилителем формирования стеклообразной структуры, таким как белок или гидролизат белка.

Предпочтительный процесс смешивания биологического материала и композиции проводят добавлением всей композиции сухой смеси в концентрат культуры или раствор среды, содержащей биологический материал. Вес массы биологического материала в культуральной среде, как правило, составляет от около 5% до 30% масса/объем, и более предпочтительно от около 10% до 20% масса/объем, добавленный вес массы композиции смеси в культуральной среде, как правило, составляет от около 10% до около 60% и более предпочтительно от около 20% до 40%. Конечное содержание твердых сухих веществ в смешанной суспензии составляет от около 20% до около 60% и более предпочтительно от около 30% до около 50%. Предпочтительно раствор смешивают при комнатной температуре или немного нагретым для способствования растворению материалов в вязком растворе (например, от 20°C до 40°C). В варианте воплощения настоящего изобретения для достижения заданной вязкости и плотности состава регулируют общее количество углеводов смеси в составе, что позволяет проводить эффективную сушку, избегая при этом резиноподобного состава или избыточного пенообразования, которое может происходить во время стадии сушки. Предпочтительная вязкость суспензии составляет от около 1000 сП до около 500000 сП, и наиболее предпочтительно в пределах от около 10000 сП до около 300000 сП. Заданная вязкость и плотность конечной суспензии может быть достигнута при использовании любых средств, известных из предшествующего уровня техники, например, некоторое регулирование количества полисахаридов в смеси углеводов или дегазированием или инжектированием газа, такого как воздух, азот, диоксид углерода, аргон и тому подобное.

Суспензию биологического материала по настоящему изобретению, как правило, подвергают быстрому замораживанию при температуре от -30°C до -180°C, более предпочтительно состав подвергают быстрому замораживанию в жидком азоте мелкодисперсным распылением, капельным распылением или инжектированием в ванну с жидким азотом. Сбор частиц, гранул, нитей или капель из ванны с жидким азотом и сушка в лиофильной сушилке или вакуумной сушилке или, в качестве альтернативы, хранение их в устройстве для глубокой заморозки (от -30°C до -80°C) для последующего использования в замороженной форме или до момента сушки.

Как правило, используемая технология процесса сушки включает распылительную сушку; лиофилизацию с последующим измельчением для получения тонко измельченного порошка; и мелкодисперсное разбрызгивание на холодную поверхность с последующей сублимацией и сбором тонко измельченного порошка; сушку выпариванием не замороженного раствора в вакуумном сушильном шкафу или центробежном выпарном аппарате при температурах выше температуры замораживания суспензии (от -20 до 50°C), последующее измельчение до заданного размера частиц. Полученные в результате частицы порошка представляют внутри стеклообразные или кристаллоподобные, большая часть поверхности которых покрыта стеклообразным материалом. Преимущество нанесения покрытия из стеклообразных материалов на биологический материал повышает физическую стабильность продукта и снижает нежелательные межмолекулярные реакции в частицах. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения замороженные частицы загружают на поддоны и сразу же перемещают в камеру вакуумной сушилки, где проводят процесс сушки в три основные стадии, включающие: (1) необязательную короткую продувку и стадию стабилизации структуры замороженных частиц под вакуумным давлением менее чем <2000 мм рт. ст.,(2) стадию первичной сушки под вакуумным давлением более чем >2000 мм рт. ст. и при температуре выше, чем точка замерзания суспензии, и (3) стадию вторичной и конечной сушки стеклообразного аморфного материала при полном вакуумном давлении и повышенной температуре в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды прошедшей сушку композиции до 0,3 Aw или менее.

Прошедшая сушку и стабильная биологическая композиция может быть использована непосредственно в виде хлопьев или измельчена в порошок и просеяна с получением среднего размера частиц от около 10 µм до около 1000 µм. Состав может быть введен непосредственно животному, включая человека, в виде концентрированного порошка, в виде восстановленной жидкости (например, напиток), или может быть введена, как в форме хлопьев, так и форме порошка в существующий пищевой продукт или кормовой продукт.

Эти и другие преимущества и признаки настоящего изобретения будут описаны более полно в детальном в описании предпочтительных вариантов воплощения, приведенных ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фигуре 1 показано усиление стабильности коммерчески доступных пробиотических бактерий и пробиотических бактерий в сухой композиции по настоящему изобретению.

На Фигуре 2 показано воздействие различных молярных соотношений между усилителями формирования стеклоообразной структуры и углеводной смесью в композиции на пробиотическую стабильность (L. paracasei) при условиях ускоренного хранения (37°C и 33% ОВ).

На Фигуре 3 показано воздействие композиции по настоящему изобретению на стабильность при хранении пробиотических бактерий L. acidophilus. Стабильность сухих пробиотических бактерий тестируют при условиях ускоренного хранения 24°C и 33% ОВ в течение 537 дней.

На Фигуре 4 показано воздействие различных соединений-усилителей формирования стеклообразной структуры на стабильность хранения пробиотических бактерий L. acidophilus. Стабильность сухих пробиотических бактерий тестируют при условиях ускоренного хранения 24°C и 43% ОВ в течение 180 дней.

На Фигуре 2 показано воздействие различных соотношений гидролизат белка/сахар на стабильность хранения (35°C и 43% ОВ) пробиотических бактерий Bifidobacterium lactis.

На Фигуре 6 показана оптимизация pH для максимальной стабильности пробиотика L. rhamnosus (при условиях ускоренного хранения при температуре 40°C и 33% ОВ в течение 8 недель).

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Следует понимать, что терминология, используемая в описании настоящей патентной заявки, использована только для целей описания вариантов воплощения настоящего изобретения и не ограничивает его. Использованные в описании и приложенной формуле изобретения формы единственного числа включает множественное число, если ясно не указано иное. Таким образом, например, «белок» включает значение белок или комбинация двух или более белков; «фермент», «бактерия» и тому подобное включает единственный тип или смесь нескольких типов и тому подобное.

В описании и формуле изобретения настоящей патентной заявки используют следующую терминологию в соответствии с приведенными ниже определениями.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «биологический материал», «биологическая композиция» и «биологический состав» относится к препаратам, которые находятся в такой форме, которая обеспечивает биологическую активность биологически активных ингредиентов или агентов при однозначной их эффективности.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «усилитель формирования стеклообразной структуры» представляет химическое соединение со способностью образовывать аморфную или стеклообразную структуру при температуре ниже критической, температуре стеклования (Tg). В случае, когда усилитель формирования стеклообразной структуры сушат при температуре ниже этой Tg, будет образовываться стеклообразная структура. Однако, в случае, когда усилитель формирования стеклообразной структуры сушат при температуре выше этой Tg, то стеклообразная структура не образуется. В процессе образования стеклообразной структуры биологическое вещество может встроиться в стеклообразную структуру. Подходящие для использования в настоящем изобретении усилители формирования стеклообразной структуры включают без ограничения соли органических кислот, таких как молочная кислота, аскорбиновая кислота, малеиновая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, яблочная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, глютаминовая кислота и тому подобное. Соли могут включать катионы, такие как натрий, калий, кальций, магний, фосфат и тому подобное. Другие используемые усилители формирования стеклообразной структуры включают белки, гидролизаты белков, полипептиды и аминокислоты. Также входит в единую композицию комбинация агентов, образующих стеклообразную структуру. Процесс, используемый для получения стеклообразной структуры для целей настоящего изобретения, как правило, представляет сублимацию растворителя и/или технологию выпаривания. Идеально, когда соединения представляют соединения GRAS, GRAS соединения предпочтительны перед не GRAS соединениями.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «углеводы» или «полигидроксисоединения» относится к сахаридам, главным образом состоящим из углерода, водорода и кислорода. Как правило, сахарид состоит из сахарного скелета повторяющихся структурных единиц, соединенных линейно или нелинейно, некоторые из которых содержат положительно или отрицательно заряженные химические группы. Повторяющиеся единицы могут составлять в пределах от двух до нескольких миллионов. Используемые сахариды включают редуцирующие и нередуцирующие сахара, сахарные спирты, дисахариды, олигосахариды, водорастворимые полисахариды и их производные. Два моносахарида соединены вместе с образованием дисахарида. Два моносахарида, используемые для образования дисахарида, могут быть одинаковыми или отличающимися. Примеры дисахаридов, которые могут быть использованы в углеводной смеси по настоящему изобретению, включают сахарозу, трегалозу, лактозу, мальтозу, изомальтозу. Малое число моносахаридов, соединенных вместе (как правило, от трех до десяти), образует олигосахарид. Моносахариды, используемые для образования олигосахарида, могут быть одинаковыми или отличающимися компонентами сахаров. Примеры олигосахаридов, подходящих для использования, включают инулин, мальтодекстрин, декстраны, фруктооолигосахариды (FOS), галактоолигосахариды (GOS), маннанолигосахариды (MOS) и их комбинации. Большое число моносахаридов, соединенных вместе (как правило, больше чем десять), образует полисахарид. Моносахариды, используемые для образования полисахарида, могут быть одинаковыми или отличающимися компонентами сахаров. Примеры полисахаридов, подходящих для использования, включают без ограничения метилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу и гипромеллозу; растворимые крахмалы или фракции крахмалов, ксантановую камедь, гуаровую камедь, пектины, каррагенан, галактоманнан, геллановую камедь, включая любые их производные, ацетат фталат целлюлозы (CAP), карбоксиметилцеллюлозу, альгинат натрия, соли альгиновой кислоты, гидроксипропилметилцеллюлозу (HPMC), камедь акации, камедь рожкового дерева, хитозан и производные хитозана, коллаген, полигликолевую кислоту, крахмалы и модифицированные крахмалы и циклодекстрины.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «стабильный» состав или композиция представляет таковую, в которой биологически активный материал по существу сохраняет при хранении свою физическую стабильность, химическую стабильность и/или биологическую активность. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре и влажности в течение выбранного периода времени. Анализ показателей может быть использован для оценки ожидаемого срока годности перед фактическим хранением материала в течение такого периода времени. Например, для живых бактерий стабильность определяют, как время, требуемое для потери 1 log КОЕ/г сухого состава при заранее заданных условиях температуры, влажности и периода времени.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «жизнеспособность» в отношении бактерий относится к способности образовывать колонию (Кое или колониеобразующая единица) на питательной среде, подходящей для роста этих бактерий. Жизнеспособность в отношении вирусов относится к способности инфицировать и воспроизводиться в подходящей клетке - хозяине с образованием в результате налета на газоне из клеток-хозяев.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «комнатная» температура или условия относится к таковым в любое данное время в данной окружающей среде. Как правило, комнатная температура, составляющая 22-25°C, атмосферное давление и атмосферную влажность легко могут быть измерены и могут варьировать в зависимости от времени года, погоды и климатических условий, высоты над уровнем моря и тому подобное.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «активность воды» или «Aw» в контексте сухого состава композиций относится к доступности воды и представляет энергетический статус воды в системе. Она определена, как давление водяных паров над образцом, деленное на чистую воду при той же температуре. Чистая дистиллированная вода имеет активность воды точно один или Aw=1,0.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «относительная влажность» или «ОВ» в контексте стабильности при хранении относится к количеству водяного пара в воздухе при данной температуре. Относительная влажность, как правило, меньше чем таковая, требуемая для насыщения воздуха, и выражается в процентах от насыщенной влажности.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «сухой» и его варианты относится к физическому состоянию, которое представляет дегидратированное или безводное, то есть, по существу с отсутствием жидкости. Сушка включает, например, распылительную сушку, лиофилизацию и вакуумную сушку.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «лиофилизация» или лиофильная сушка относится к получению композиции в сухой форме быстрым замораживанием и дегидратацией в замороженном состоянии (иногда указывается, как сублимация). Лиофилизация происходит при температуре, которая в результате приводит к кристаллизации полимеров. Этот процесс может происходить при вакуумном давлении, достаточном для сохранения замороженного продукта, предпочтительно менее чем около <2000 мм рт. ст.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «первичная сушка» или «сушка жидкости» в отношении процессов, приведенных в описании настоящей патентной заявки, относится к дегидратационной сушке, которая происходит с момента оттаивания замороженных частиц до момента начала вторичной сушки. Как правило, основная часть первичной сушки происходит за счет экстенсивного испарения, при этом температура продукта остается значительно более низкой, чем температура источника тепла. Этот процесс может происходить под вакуумом при давлении, достаточном для сохранения оттаянного продукта, предпочтительно более чем около >2000 мм рт. ст.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «вторичная сушка» в отношении процессов, приведенных в описании настоящей патентной заявки, относится к стадии сушки, которая происходит при температуре выше температуры замораживания состава и близка к температуре источника тепла. Этот процесс может происходить под вакуумом при давлении, достаточном для снижения активности воды состава, предпочтительно менее чем около <1000 мм рт. ст. В типичном процессе сушки состава стадия вторичной сушки снижает активность воды состава до Aw 0,3 или менее.

Композиции и способы сушки по настоящему изобретению решают проблему обеспечения более дешевых и промышленно применимых замороженных или высушенных составов, содержащих чувствительные биологически активные материалы, такие как пептиды, белки, гормоны, нуклеиновые кислоты, антитела, лекарственные средства, вакцины, дрожжи, бактерии, вирусы и/или суспензии клеток со значительно более длительным сроком годности в сухом состоянии. Настоящее изобретение обеспечивает консервирующую композицию и способ сушки, включающий биологический материал, окруженный аморфной стеклообразной структурой из соединений с высокой степенью растворимости. Процесс замораживания и сушки включает: смешивание биологического материала и композиции в жидкую суспензию, быстрое замораживание указанной композиции суспензии в жидком азоте с образованием капель, нитей или гранул, продувку замороженных частиц под высоким вакуумом с последующей сушкой биологически активного материала с достижением стеклообразного состояния сахара выпариванием влаги при пониженном давлении с нагреванием композиции.

Настоящее изобретение основывается на поразительном открытии, состоящем в том, что биологические материалы могут быть защищены в стеклообразной структуре с сохранением при этом существенной активности. Когда биологический материал комбинируют с композицией смеси по настоящему изобретению и подвергают вакуумной сушке по настоящему изобретению, достигается превосходная стабильность при длительном воздействии неблагоприятной температуры и влажности. Настоящее изобретение включает композиции, содержащие биологический материал, смесь растворимых углеводов и соли карбоновой кислоты, усиливающие формирование стеклообразной структуры. Композиции по настоящему изобретению по своей природе отличаются по физической структуре и функции от не вязких или концентрированных сахарных композиций, которые просто сушат при использовании традиционных процессов сушки. Например, в патенте США № 6919172 описывается аэрозольная порошкообразная композиция для ингаляционного введения, которая содержит смесь различных углеводов и цитрата натрия. Однако в описанной в патенте композиции отсутствует дополнительное белковообразное соединение, что является существенным для дополнительной стабильности и для образования заданной физической структуры во время сушки растворов с высокой концентрацией сахаров. Также в описанной в этом патенте композиции отсутствует вязкая или гидрогелевая структура, которая позволяет эффективную сушку оттаянного или незамороженного раствора для усиления формирования стеклообразной структуры. В противоположность, композиция и процесс сушки по настоящему изобретению разрешают все эти вопросы с достижением при этом превосходной стабильности биологического материала.

в предшествующем уровне техники усиленной стеклообразной структуры, как правило, достигают за счет вспенивания или кипячения раствора под вакуумом для содействия эффективной сушке. Как правило, вспенивания на стадии вспенивания достигают в результате экстенсивного кипения и выплеска раствора, что является неизбежными последствиями сушки незамороженного раствора, и в результате заполняется только очень малый рабочий объем сосуда или емкости (смотрите, например, патент США № 6534087, в котором толщина конечного вспененного продукта составляет менее чем 2 мм). Композиции и способы сушки по настоящему изобретению позволяют избежать кипения и вспенивания состава, что позволяет обеспечить значительно большую загрузку материала на площадь сушки, и в результате она легко может быть увеличена для получения больших количеств материала без использования специально разработанных емкостей и поддонов или устройств.

Широкий ряд биологических материалов может быть использован в композиции по настоящему изобретению с образованием водной консервирующей среды по настоящему изобретению. Затем эта консервирующая среда может быть подвергнута процессам сушки по настоящему изобретению с получением стабильного сухого порошка биологического материала. Эти биологические материалы включают без ограничения ферменты, такие как панкреатические ферменты, липазы, амилазы, протеазы, фитазы, лактатдегидрогеназы; белки, такие как инсулин; вакцины; вирусы, такие как аденовирус; клетки, включая прокариотические клетки (включая бактерии), и эукариотические клетки, другие биологические материалы, включая лекарственные средства, нуклеиновые кислоты и липосомы.

По существу были показаны преимущества композиций и способов сушки по настоящему изобретению для пробиотических бактерий. Стабильный сухой пробиотический порошок, полученный согласно композициям и способам по настоящему изобретению, включая смешивание свежих, замороженных или сухих культур пробиотических бактерий со смесью углеводов и соединениями, усиливающими формирование стеклообразной структуры, быстрое замораживание вязкого состава в жидком азоте с образованием замороженных твердых капель, нитей или гранул и вакуумную сушку за счет начального приложения достаточного вакуумного давления для продувки и стабилизации структуры замороженных частиц, повышение температуры состава выше температуры замораживания и снабжение источником тепла 20°C и выше для содействия первичному удалению воды. Поддержание температуры состава выше точки замерзания может быть осуществлено регулированием вакуумного давления и подведением тепла к составу. Для завершения процесса сушки и дополнительного снижения активности воды состава ниже Aw 0,3 или менее, вторую стадию сушки проводят при максимальном вакуумном давлении и при повышенной температуре вплоть до 70°C. Такая композиция может оставаться стабильной при неблагоприятных условиях хранения, таких как 40°C и 33% ОВ в течение 60 дней или более.

Получение композиций

Композиция для получения стабильного замороженного или сухого порошка из биологических материалов по настоящему изобретению включает углеводную смесь и усилитель формирования стеклообразной структуры. Такие материалы при смешивании с предпочтительным биологически активным материалом образуют гранулы, нити или капли в жидком азоте и могут быть эффективно высушены с получением аморфной стеклообразной структуры согласно способам по настоящему изобретению и обеспечивают большие количества стабильных сухих композиций для хранения и введения указанного биологически активного материала (смотрите Фигуру 1 - отличия в физических изменениях и активности воды (Aw) состава после сушки). Углеводная смесь обеспечивает структурную стабильность составу и/или физические и химические защитные преимущества биологически активным материалам и предотвращает или снижает негативное воздействие при восстановлении или регидратации.

Фракция полисахаридов в углеводной смеси может обеспечивать усиление вязкости состава и более лучший контроль плотности состава при приложении вакуумного давления и повышенную структурную прочность сухим композициям состава по настоящему изобретению. Предпочтительные полисахариды, в частности для живых организмов, представляют водорастворимые камеди в виду их характерных свойств образования вязкого геля при умеренных температурах. Также было обнаружено, что камеди при определенной концентрации эффективно стабилизируют структуру состава под вакуумом, обеспечивая подходящую вязкость и плотность составу, позволяя осуществлять эффективную сушку состава на стадии первичной сушки жидкости при определенной вязкости. Определенные камеди также могут образовывать гидрогель перекрестным сшиванием с двухвалентными или мультивалентными катионами (например, альгинаты, пектины, хитозан)или изменениями температуры или pH (например, желатины, CMC,CAP, геллановая камедь). Гидрогелевые растворы предотвращают проблемы, связанные с вакуумной сушкой незамороженных растворов.

Фракция дисахаридов в углеводной смеси включает различные сахара и сахарные спирты. Предпочтительный дисахарид представляет таковой, не кристаллизующий и/или не повреждающий или не дестабилизирующий биологически активный материал в составе при температурах замерзания (например, ниже чем -20°C) и во время удаления воды. Например, биологически активный материал может быть физически заключен в сахара, формирующие стеклообразную структуру, такие как сахароза, лактоза или трегалоза, для содействия сохранению молекулярной структуры в процессе сушки и придают ригидность структуре аморфной матрицы в сухом состоянии. Подходящие дисахариды эффективно замещают воду гидратации, потерянную во время сушки, предотвращая повреждения мембран клеток и денатурацию ферментов (смотрите, обзор Crowe et al., 1998). Другие функции дисахаридов в композиции могут включать защиту биологически активного материала от повреждающего воздействия света, кислорода, окисляющих агентов и влаги. Подходящие дисахариды должны легко растворяться в растворе. Трегалоза представляет по существу привлекательный защитный агент, поскольку она является нередуцирующим дисахаридом, присутствующим в растениях и живых организмах (например, бактерии, грибки и беспозвоночные, такие как насекомые и нематоды), которые сохраняются в состоянии анабиоза во время засухи. Трегалоза продемонстрировала свою эффективность, как защитный агент для различных биологических материалов, включая белки и другие биологические макромолекулы, такие как ферменты, сыворотка, антитела, антигены и компоненты вакцины (Sanchez et al, 1999, Intl. J. Pharm. 185, 255-266; Esquisabel et al, 1997, J. Microencapsulation, 14, 627-638). В некоторых случаях может быть выгодно включить два или более различных дисахарида, таких как смесь трегалозы и сахарозы, для ингибирования образования кристаллов, для усиления стабильности прошедшего сушку биологически активного материала состава в условиях хранения в течение длительного периода времени и для снижения стоимости.

Фракция олигосахаридов в углеводной смеси включает инулин, мальтодекстрины, декстраны, фруктоолигосахариды (FOS), галактоолигосахариды (GOS), маннанолигосахариды (MOS) и их комбинации. Олигосахариды смягчают некоторые проблемы, связанные с использованием только одной трегалозы в качестве защитного агента, для различных сохраненных биологических материалов. Хотя трегалоза очень эффективна для защиты биологического материала во время дегидратации и регидратации, только одна трегалоза в качестве стабилизатора не обеспечивает заданную стабильность при хранении в течение длительного периода времени, в частности при высоких температурах и/или влажности. Эта проблема решается в настоящем изобретении добавлением олигосахаридов, предпочтительно инулина в углеводную смесь.

Предпочтительное массовое соотношение сахаридов в углеводной смеси составляет 10:0,1-4:0,1-2 дисахариды/олигосахариды/ полисахариды и более предпочтительно, когда массовое соотношение дисахариды/олигосахариды/полисахариды составляет от около 10:0,2:0,1 до около 10:2:1. Предпочтительно углеводная смесь включает в процентах по массе по сухому веществу 10-90% дисахаридов, 1-10% олигосахаридов и 0,1-10% полисахаридов.

Усилители формирования стеклообразной структуры по настоящему изобретению включают соли органических кислот, таких как молочная кислота, аскорбиновая кислота, малеиновая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, яблочная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, глютаминовая кислота и тому подобное. Соли могут включать катионы, такие как натрий, калий, кальций, магний, буферные соли, фосфатный буфер и тому подобное. Примеры включают цитрат натрия, лактат натрия, малеат натрия, глюконат магния, аскорбат натрия, аскорбат калия, фосфат буферных солей и тому подобное. Как правило, мультивалентные анионы образуют стеклообразную структуру легче с высокой Tg, чем моновалентные анионы. Предпочтительны анионы, имеющие высокую Tg и достаточную растворимость для ингибирования кристаллизации и, таким образом, образования прочной стеклообразной структуры. В некоторых случаях могут быть использованы смеси органических солей (например, цитрата натрия и аскорбата натрия). Было обнаружено, что цитрат натрия взаимодействует с гидроксильными группами и образует связь через карбоксильные группы, что в результате приводит к очень сильному повышению температуры стеклования витрифицированной сахарозы (Kets et al., 2004. Citrate increases glass transition temperature of vitrified sucrose preparations Cryobiology, 48:46-54). Цитрат натрия является традиционной пищевой добавкой подтвержденной, как GRAS (21 CFR 184.1751 - Sodium citrate). Дополнительные функции цитрата натрия в композициях связанны с буферной способностью и предотвращением значительных изменений pH жидкой среды в процессе замораживания, что может привести к денатурации подвергаемого лиофильной сушке белка.

Другие подходящие усилители формирования стеклообразной структуры, которые входят в композицию для дополнительного усиления стабильности, включают белки, гидролизаты белков, полипептиды и аминокислоты. Предпочтительно используют казеин или гороховый белок и более предпочтительно гидролизованный белок или гидролизованные гороховые белки. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «гидролизованный белок» относится к белку, прошедшему частичный или полный гидролиз кислотой или ферментативный гидролиз с получением гидролизованного белка с молекулярной массой от около 1 кДа до около 50 кДа. Предпочтительно по меньшей мере 20% белкового субстрата превращено в пептиды с молекулярными массами от 200 до 2000 Дальтон. Гидролизованный белок имеет приблизительно такую же аминокислотную композицию, как у полного белка, и может быть получен из любого из множества коммерческих источников. Будучи гипоаллергенным, гидролизованный белок может быть преимущественно использован в определенных пищевых продуктах для потребителей с гиперчувствительностью, таких как дети и взрослые.

Количество усилителей формирования стеклообразной структуры, используемых в композиции, может варьировать в зависимости от композиции и ее предполагаемых условий хранения в сухом виде. Как правило, молярное соотношение усилителей формирования стеклообразной структуры к общим углеводам будет составлять от около 0,01 до около 0,3. Предпочтительная композиция включает молярное соотношение около 0,1-0,2.

Предпочтительная композиция включает от около 0,5% до около 90% углеводного компонента, включающего по меньшей мере ди-, олиго- и полисахариды и белковый компонент, включающий от около 0,5% до около 40% гидролизованного белка. Более предпочтительно композиция включает от около 30% до около 70% углеводного компонента и от около 10% до около 40% компонента усилителя формирования стеклообразной структуры, такого как гидролизованный белок и карбоновая кислота, где углеводный компонент включает от около 10% до 90% и более предпочтительно от около 40% до 80% дисахаридов; от около 1% до около 10% и более предпочтительно от около 5% до 10% олигосахаридов; и от около 0,1 до около 10% и более предпочтительно от около 5% до около 10% полисахаридов. Композиция дополнительно включает соль органической кислоты, которая считается другим компонентом - усилителем формирования стеклообразной структуры и включает от около 0,5% до 20% карбоновой кислоты от общей массы композиции.

Раствор, содержащий биологический материал и стабилизирующую композицию по настоящему изобретению, может включать существенное количество общих сухих веществ (составляющие минус растворитель, такой как вода) от около 20% до около 60%, предпочтительно около 30-50%) массовых процентов. Основная часть общих сухих веществ может состоять из биологически активного материала, углеводной смеси и усилителей формирования стеклообразной структуры. Например, биологически активный материал может иметь концентрацию в составе в пределах от около 5% до 30% масса/объем, предпочтительно около 10-20% масса/объем. Вес массы композиции смеси в культуральной среде, как правило, составляет от около 10% до около 60% масса/объем, предпочтительно около 20-40% масса/объем. Вязкость составов по настоящему изобретению, как правило, составляет более чем 1000 сантипуазов (сП); более предпочтительно более чем 5000 сП; и наиболее предпочтительно более чем 10000 сП.

Способы получения стабильных сухих составов

Для сушки композиций могут быть эффективно использованы различные технологии сушки. При том что эти способы менее сложные и более дешевые, чем лиофильная сушка или вакуумная сушка, как правило, более они разрушительные для биологических материалов. Многие биологические материалы более подвержены выраженным конформационным изменениям и нежелательным реакциям при консервации и использованием способов, которые проводят при комнатной или более высокой температуре, чем при лиофильной сушке или сушке охлаждением (chill drying). В результате даже при использовании известных в настоящее время защитных агентов, активность многих регидратированных биологических материалов неудовлетворительна как таковая, и также значительно ниже, чем при консервации с проведением низкотемпературной сушки.

Предпочтительные способы получения стабильных сухих составов, содержащих биологически активные материалы, включают; (1) получение вязкой суспензии состава смешиванием биологически активного материала с композицией по настоящему изобретению в водном растворе, (2) быстрое замораживание суспензии состава с получением твердых замороженных частиц, (3) необязательно обработку замороженных частиц под высоким вакуумным давлением в течение короткого периода времени для продувки частиц и стабилизации их структуру, (4) удаление воды выпариванием влаги при температуре выше температуры замораживания состава, (5) дополнительное снижение активности воды состава до менее чем 0,3 Aw под полным вакуумом и повышенной температуре.

Например, сухая форма биологически активного материала может быть переведена в форму раствора или суспензии, содержащей композицию порошкообразной смеси. Композиция смеси может быть растворена в теплом водном растворе с приложением слабого сдвигового усилия перед охлаждением и смешиванием с биологически активным материалом. Биологически активный материал, такой как культивированный вирус или бактерии, может быть подвергнут концентрированию и отделен от культуральной среды центрифугированием или фильтрацией перед ресуспендированием в состав. В качестве альтернативы, вся вода состава обеспечена за счет жидкости концентрированного биологического материала. Суспензию поддерживают при температуре немного выше комнатной температуре и сухую композицию порошкообразного материала медленно добавляют в теплую (от 25°C до 40°C) суспензию, содержащую биологически активный материал. Суспензию осторожно перемешивают в планетарном миксере до полного диспергирования или растворения и получения гомогенной суспензии всех компонентов.

Затем вязкий раствор может быть перекрестно сшит с образованием гидрогеля(в зависимости от свойств полисахарида) добавлением ионов металла или изменением температуры или pH суспензии и затем подвергнут сушке согласно способам сушки по настоящему изобретению. В качестве альтернативы, суспензия может быть быстро заморожена при мелкодисперсном распылении через форсунку, капельным распылением или инжектированием в сухой лед или в ванну с жидким азотом с образованием мелких частиц или твердых капель, нитей или гранул. Замороженные твердые частицы могут храниться в устройстве для глубокого замораживания при температуре от -30°C до - 80°C для последующего использования в качестве стабильного замороженного продукта или до момента сушки. Предпочтительный способ сушки представляет вакуумную сушку, где температуру продукта поддерживают немного выше температуры замерзания. Замороженные капли или гранулы помещают на поддоны при норме загрузки от около 0,1 кг/фут кв. (0,093 м²) до около 1,5 кг/фут кв. (0,093 м²)и сушат согласно способу по настоящему изобретению. Предпочтительно процесс сушки начинают со стадии короткой продувки, что способствует акклиматизации продукта к начальной температуре и релаксации и стабилизации структуры замороженных частиц и дегазации избыточного воздуха. Как правило, стадия продувки занимает от 1 до 60 минут в зависимости от вязкости продукта и нормы загрузки поддона. Гранулы или частицы остаются в твердой замороженной форме в течение всей стадии продувки. Затем температуру продукта доводят до температуры выше температуры его замерзания и проводят стадию первичной сушки до выпаривания всей свободной воды из продукта. Как только температура состава достигает заданной температуры, нагревание регулируют для поддержания этой температуры, и испарение на стадии первичной сушки жидкости прогрессирует. На этой стадии состав уже оттаял и происходит усиленное испарение воды без какого-либо кипения или вспенивания. Процесс сушки завершают дополнительной фазой вторичной сушки под максимальным вакуумом и при повышенной температуре.

Традиционные способы из предшествующего уровня техники включают экстенсивное вспенивание и/или разбрызгивание и сильное кипение, что может повредить чувствительные биологически активные материалы и вызывает трудности при промышленном осуществлении при высокой норме загрузки (смотрите, например, патент США № 6534087, где приложенное вакуумное давление вызывает сильное кипение и вспенивание). Однако композиции и способы по настоящему изобретению позволяют избежать кипения или вспенивания состава с достижением при этом значительно более высокой скорости сушки и позволяют высокую норму загрузки состава. Дополнительно, полная и эффективная дегазация вязких жидких суспензий очень трудная и может требовать длительного периода времени. Все эти проблемы решаются настоящим изобретением при использовании подходящей композиции, которая позволяет эффективную первичную сушку жидкости с образованием стеклообразной структуры без кипения и избыточного вспенивания. Загрузка твердых замороженных частиц на поддон в отличие от суспензии или вязкого сиропа позволяет значительно повысить норму загрузки на площадь сушки на поддонах по сравнению с таковой в предшествующем уровне техники.

В одном предпочтительном примере настоящего изобретения биологический материал представляет концентрат культуры живых пробиотических бактерий. Порошкообразная композиция смеси предпочтительно содержит 1-4% альгината натрия или геллановой камеди, 50-75% трегалозы, 1-10% инулина или FOS, 10-20% гидролизатов белка, таких как гидролизаты казеинового, сывороточного, горохового, соевого белка или белка семян хлопка и 1-10% цитрата натрия или аскорбата натрия. Пробиотическая культура может быть свежей, замороженной или уже высушенной в форме сухого порошка. Композицию смеси добавляют в концентрированную пробиотическую культуральную среду с доведением содержания твердых веществ раствора смеси до 40-60% (масса/масса) и pH регулируют до 6,5-7,5 при использовании ионов фосфата или цитрата. Раствор смешивают при температуре немного выше комнатной (как правило, от 25°C до 37°C)до момента полного их растворения. Вязкую суспензию распыляют каплями в жидкий азот с образованием маленьких капель или гранул, которые затем удаляют из жидкого азота, упаковывают в мешочки и хранят в устройстве для глубокой заморозки при температуре -80°C до момента сушки.

Традиционный способ сушки живых пробиотических бактерий включает распределение твердых замороженных гранул на поддонах равномерным слоем при норме загрузки 100-1500 г/фут кв. (0,093 м²) и поддоны сразу же помещают в лиофильную сушилку. Затем прилагают вакуумное давление около 1000 мм рт. ст. или менее, и в зависимости от размера лиофильной сушилки и типа источника тепла температуру на полке регулируют, таким образом, чтобы поддерживать ее для хранения частиц от около -20 до около - 30°C. Твердые замороженные гранулы подвергают продувке в течение от около 1 до около 60 минут и регулируют вакуум от 2000 до 10 000 мм рт. ст. и повышают теплопередачу для повышения температуры состава от -10°C до +0°C. Эту температуру и вакуумное давление поддерживают во время стадии первичной сушки жидкости, которая может длиться от нескольких часов до 24 часов в зависимости от загрузки поддона. В какой-то момент во время процесса первичной сушки скорость испарения растворителя снижается, и температура состава начинает повышаться благодаря избыточному теплу в сушильной камере. Этот момент указывает на окончание стадии первичной сушки по настоящему изобретению. Поскольку растворитель выведен из состава, соединения, формирующие стеклообразную структуру, в растворе становятся концентрированными и более густыми до момента прекращения течения, как жидкости и образуют аморфную и/или стабильную стеклообразную структуру.

Затем проводят стадию вторичной сушки под максимальным вакуумом и при температуре состава от 30°C до 50°C. Цель стадии вторичной сушки состоит в удалении оставшейся уловленной или связанной влаги и обеспечении композиции стабильной при хранении в течение длительного периода времени при комнатной температуре. Стадия вторичной сушки может длиться несколько часов и она заканчивается в момент, когда состав становится полностью сухим и его активность воды ниже чем 0,3 Aw.

Способы сушки по настоящему изобретению позволяют получить биологически активный материал, встроенный в аморфную стеклообразную структуру, предотвращая, таким образом, раскручивание или денатурацию белков и значительно замедляя молекулярные взаимодействия или перекрестную реактивность из-за значительного снижения мобильности соединения и других молекул в аморфной стеклообразной композиции. При условии, что температуру аморфной твердой структуры поддерживают ниже ее температуры стеклования при относительно низкой остаточной влажности (то есть, ниже Aw 0,5), пробиотические бактерии могут оставаться относительно стабильными. Следует отметить, что достижение стеклообразной структуры не является обязательным условием для стабильности при длительном хранении, поскольку некоторые биологически активные материалы могут быть более стабильны в более кристаллизованном состоянии.

Прошедшая сушку стеклообразная структура может быть использована целиком, нарезана на заданные формы и размеры или измельчена или помолота с получением свободно сыпучего порошка, что обеспечивает легкую последующую обработку, такую как влажное или сухое агломерирование, гранулирование, таблетирование, прессование, пеллетизация или любой другой вид для доставки. Процессы дробления, помола, измельчения или тонкого измельчения хорошо известны из предшествующего уровня техники. Может быть использована, например, молотковая дробилка, воздушная мельница, мельница ударного типа, струйная мельница, штифтовая мельница, мельница Wiley или аналогичное им устройство для измельчения. Предпочтительный размер частиц составляет менее чем около 1000 µм и предпочтительно менее чем 500 µм.

Композиции и способы, приведенные в описании настоящей патентной заявки, стабилизируют биологический материал и сохраняют его активность в течение длительного периода времени при температуре и влажности выше комнатной. Например, композиции тестируют на стабильность, подвергая их воздействию повышенной температуры (например, 40°C) и высокой влажности (например, 33% ОВ) и измеряя биологическую активность составов. Результаты исследований использования в качестве примера живых пробиотических бактерий показали, что бактерии, входящие в эти композиции, стабильны в течение по меньшей мере 60 дней. Стабильность определяют, как время, требуемое для потери эффективности одного log КОЕ/г. Такие составы стабильны и могут быть использованы даже при высоких концентрациях биологически активного материала. Следовательно, эти составы имеют преимущества, состоящие в том, что их можно транспортировать и хранить при комнатной температуре или при температуре выше комнатной в течение длительного периода времени.

ПРИМЕРЫ

Следующие Примеры приведены только для иллюстрации и не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения.

Пример 1

Получение сухой и стабильной композиции

Основная углеводная смесь

Гомогенно смешивают в порошкообразной форме около 70 г трегалозы (Cargill Minneapolis, MN), около 5 г быстрорастворимого инулина (Cargill Minneapolis, MN) и около 3 г альгината натрия (ISP Corp., Wayne, NJ).

Основная смесь усилителей формирования стеклообразной структуры.

Гомогенно смешивают в порошкообразной форме около 17 г гидролизата казеина или гидролизата горохового белка (прошедшие ультрафильтрацию гидролизаты, Marcor, Carlstadt, NJ) и 5 г цитрата натрия или аскорбата натрия (Sigma, St. Louis, MO).

Стабилизация пробиотических бактерий

Концентрат свежих Lactobacillus rhamnosus (100 мл при 10% сухих веществ, непосредственно собран при ферментации) добавляют в блендер и выдерживают при температуре 35°C. В пробиотическую культуру медленно добавляют около 78 г основной углеводной смеси и около 22 г основной смеси усилителя формирования стеклообразной структуры и смешивают при температуре около 35°C в течение 10 минут. Затем вязкую суспензию перемещают в емкость с перфорированным дном для вытекания каплями в ванну с жидким азотом. Затем из жидкого азота удаляют гранулы и сразу же перемещают их на сушку.

Сушка замороженных гранул, содержащих пробиотические бактерии.

Замороженные гранулы распределяют по поддону при норме загрузки 200 г/фут кв. (0,093 м²) и сразу же помещают на полку в устройство для глубокой заморозки (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Затем регулируют вакуум 2000-2700 мм рт. ст. и температуру на полке повышают до +30°C. Эти установки температуры и давления поддерживают в течение 5 часов. Перед началом первичной сушки жидкости с приложением вакуумного давления около 1000 мм рт. ст. температуру замораживания гранул акклиматизируют необязательно до около -20°C и проводят продувку твердых замороженных гранул в течение около 10 минут. Затем проводят стадию первичной сушки при приложении вакуумного давления 2000-2700 мм рт. ст. и температуру на полке повышают до +30°C. Эти установки температуры и давления поддерживают в течение 5 часов. Затем проводят стадию вторичной сушки при полном вакууме (150-200 мм рт. ст.) и поддерживают температуру на полке от 30°C до 50°C в течение дополнительных 3 часов. Состав полностью высушивают и измеряют его активность воды при использовании Hygropalm Awl instrument (Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY.), Aw=0,23.

Пример 2

Стабильность при хранении сухих пробиотических бактерий

На Фигуре 1 показана стабильность хранения при двух различных ускоренных условиях хранения при температуре 40°C и 33% ОВ и при температуре 30°C и 43% ОВ сухих стабильных пробиотических бактерий по Примеру 1 и коммерчески доступных сухих пробиотических бактерий (Culturelle, Amerifit, Inc., Cromwell, CT). Коммерческие пробиотические бактерии полностью утрачивают свою жизнеспособность в течение первых нескольких недель в условиях ускоренного хранения, при этом сухая композиция пробиотических бактерий по настоящему изобретению потеряли только 1,18 log после 60 дней хранения при температуре 30°C и 43% ОВ и только 1,09 log при температуре 40°C и 33% ОВ.

Пример 3

Увеличение масштабов производства стабильной сухой композиции, содержащей пробиотические бактерии Lactobacillus rhamnosus.

Lactobacillus rhamnosus (400 г замороженного концентрата из коммерческого источника) оттаивают при температуре 37°C в планетарном миксере с двойной рубашкой (DPM, lqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,) и регулируют содержание твердых сухих веществ до 10% сухих веществ по массе дистиллированной водой). Гомогенно смешивают в порошкообразной форме около 212 г трегалозы (Cargill Minneapolis, MN), около 20 г растворимого инулина (Cargill Minneapolis, MN), около 12 г альгината натрия (ISP Corp., Wayne, NJ), около 136 г гидролизатов казеина (прошедшие ультрафильтрацию гидролизаты Marcor, Carlstadt, NJ) и около 20 г аскорбата натрия (Sigma, St. Louis, MO). Смесь порошков медленно добавляют в пробиотическую культуру, смешивание проводят при 40 оборотах в минуту и температуре 37°C в течение 10 минут. Затем суспензию перемещают в емкость с перфорированным дном для вытекания каплями в ванну с жидким азотом. Затем из жидкого азота удаляют гранулы и помещают их герметичный пакет из алюминиевой фольги и хранят в устройстве для глубокой заморозки при температуре -80°C в течение нескольких недель.

Для сушки замороженные гранулы равномерно распределяют по поддонам при загрузочной норме от 500 вплоть до 1500 г/фут кв. (0,093 м²) и помещают поддоны на полки в устройстве для глубокой заморозки (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Стадию первичной сушки начинают регулированием вакуумного давления 2000-2700 мм рт. ст. и температуру продукта поднимают и стабилизируют при температуре от -10 до -5°C. С течением времени (около 10-16 ч) температуру продукта повышают до от около 20 до 25°C, в этот момент начинают стадию вторичной сушки при максимальном вакууме (150-200 мм рт. ст.) и поддерживают температуру продукта от 30 до 40°C в течение дополнительных 14 часов. Состав полностью высушивают, и измеренная активность воды составила 0,23 Aw.

Пример 4

Увеличение масштаба производства стабильной сухой композиции, содержащей пробиотические бактерии Bifidobacterium lactis.

Bifidobacterium lactis (400 г замороженного концентрата из коммерческого источника) оттаивают при температуре 37°C в планетарном миксере с двойной рубашкой (DPM, lqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,). Гомогенно смешивают в порошкообразной форме около 212 г трегалозы (Cargill Minneapolis, MN), около 20 г растворимого инулина (Cargill Minneapolis, MN), около 12 г альгината натрия (ISP Corp., Wayne, NJ) и около 20 г аскорбата натрия (Sigma, St. Louis, MO). Смеси порошков медленно добавляют в пробиотическую культуру. Около 136 г гидролизата горохового белка (прошедшие ультрафильтрацию гидролизаты Marcor, Carlstadt, NJ) растворяют в 80 г дистиллированной воды и смесь подвергают микроволновому воздействию в течение короткого периода времени или нагревают на водяной бане до температуры 60°C до полного растворения и затем охлаждают до температуры около 35°C. Сухую порошкообразную смесь и раствор, содержащий гидролизат горохового белка, добавляют в пробиотический концентрат, смешивание проводят при 40 оборотах в минуту и температуре 37°C в течение 20 минут. Затем суспензию перемещают в емкость с перфорированным дном для вытекания каплями в ванну с жидким азотом. Затем из жидкого азота удаляют гранулы и помещают их в герметичный пакет из алюминиевой фольги и хранят в устройстве для глубокой заморозки при температуре -80°C в течение нескольких недель.

Для сушки замороженные гранулы равномерно распределяют по поддонам при загрузочной норме 800 г/фут кв. (0,093 м²) и помещают поддоны на полки в устройстве для глубокой заморозки (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Стадию первичной сушки жидкости начинают регулированием вакуумного давления 2000-2700 мм рт. ст. и температуру продукта поднимают и стабилизируют при температуре от -10 до -5°C. С течением времени (около 10-16 ч) температуру продукта повышают до от около 20 до 25°C, в этот момент начинают стадию вторичной сушки при максимальном вакууме (150-200 мм рт. ст.) и поддерживают температуру продукта от 30 до 40°C в течение дополнительных 14 часов. Состав полностью высушивают, и измеренная активность воды составила 0,23 Aw.

Пример 5

Получение гидрогелевого состава, содержащего пробиотические бактерии.

Концентрированную пробиотическую суспензию Bifidobacterium lactis получали по Примеру 1. В основу состава добавляют 0,5 г двуосновного фосфата кальция, затем добавляют 0,5 г глюконолактона. Суспензию выдерживают для стабилизации при комнатной температуре в течение следующих 2 часов с получением плотного гидрогеля. Плотный гель нарезают на тонкие длинные нити при использовании коммерчески доступного слайсера/шредера. Тонкие нити сразу же загружают на поддоны во влажной форме или подвергают быстрому замораживанию в жидком азоте и загружают на поддон при норме загрузки 500 г/фут кв. (0,093 м²) и помещают в устройство для глубокой заморозки для сушки по Примеру 3. Активность воды (Aw) состава составила 0,05 (Измерено при использовании HygroPalm Awl, Rotonic Huntington, NY). Затем сухой состав измельчают с получением тонкого порошка при использовании стандартного молоткового устройства для измельчения и просеивают через сито с размером ячеек 50-250 микрон.

Пример 6

Оптимизация молярного соотношения между усилителями формирования стеклообразной структуры и углеводной смесью.

Получили несколько композиций, содержащих различные молярные пропорции усилителей формирования стеклообразной структуры и углеводной смеси по Примеру 1. Концентрированную культуру пробиотических бактерий L. paracasei получили из коммерческого источника и получили ее сухую композицию по Примеру 1 за исключением, того что суспензию сразу же загружают на поддоны во влажной форме без проведения быстрого замораживания и стадии продувки. Суспензию сушат с проведением первичной и вторичной стадий сушки по Примеру 1 и 3 за исключением того, что температуру на полке повышают до 40°C во время стадий первичной и вторичной сушки. Стабильный порошок подвергают ускоренному хранению при температуре 37°C и 33% ОВ в течение 84 дней. На Фигуре 2 показано воздействие различных молярных соотношений на стабильность прошедших сушку бактерий. Из результатов видно, что оптимальное молярное соотношение между усилителями формирования стеклообразной структуры и смесью углеводов составляет около 0,12-0,15.

Пример 7

Воздействие композиции по настоящему изобретению на стабильность при хранении пробиотических бактерий L. acidophilus

Получили композицию, содержащую смесь углеводной смеси и усилителей формирования стеклообразной структуры по Примеру 1. Концентрированную культуру пробиотических бактерий L. acidophilus получили из коммерческого источника и получили ее сухую композицию по Примеру 1 и 3, и стабильный порошок подвергают ускоренному хранению при температуре 24°C и 33% ОВ в течение 537 дней. На Фигуре 3 показана превосходная стабильность пробиотиков в композиции по настоящему изобретению. Результаты показывают, что жизнеспособность пробиотиков снизилась только на 0,18 log за 537 дней хранения на складе при специфических условиях.

Пример 8

Воздействие различных соединений усилителей формирования стеклообразной структуры на стабильность при хранении пробиотических бактерий L. acidophilus.

Получили несколько композиций, содержащих смеси углеводов по Примеру 1 и соединения усилителей формирования стеклообразной структуры, содержащих гидролизат казеина и цитрат натрия или аскорбат натрия, или комбинации обоих. Концентрированную культуру пробиотических бактерий L. acidophilus получили из коммерческого источника и получили ее сухую композицию по Примеру 1 за исключением, того что суспензию сразу же загружают на поддоны во влажной форме без проведения быстрого замораживания и стадии продувки. Суспензию сушат с проведением первичной и вторичной стадий сушки по Примеру 1 и 3 за исключением того, что температуру на полке повышают до 24°C и 43% ОВ в течение 180 дней. На Фигуре 4 показано воздействие различных соединений усилителей формирования стеклообразной структуры на стабильность прошедших сушку бактерий. Результаты показывают, что значительно лучшая стабильность получена при включении дополнительного усилителя формирования стеклообразной структуры дополнительно к гидролизату белка. В частности, включение равных количеств ацетата натрия и аскорбата натрия обеспечивает наиболее стабильную композицию. Из результатов Примеров 5 и 6 видно, что различные усилители формирования стеклообразной структуры могут быть более эффективны или даже могут действовать, как дестабилизаторы, в зависимости от бактериального штамма.

Пример 9

Воздействие различных соотношений гидролизат белка/сахар на стабильность при хранении пробиотических бактерий Bifidobacterium lactis.

Получили несколько композиций, содержащих смеси углеводов и соединения усилителей формирования стеклообразной структуры по Примеру 1, и композиции, содержащие равные количества, но при различных соотношениях гидролизата горохового белка/трегалозы с или без аскорбатом натрия. Концентрированную культуру пробиотических бактерий Bifidobacterium lactis получили из коммерческого источника и получили ее сухую композицию по Примерам 1 и 3, и стабильный порошок подвергают ускоренному хранению при температуре 35°C и 43% ОВ в течение 7 недель. На Фигуре 5 показано воздействие соотношений от 1:4, 1:2,5 до 1:1,5 гидролизат горохового белка/трегалоза с или без аскорбата натрия на стабильность при хранении прошедших сушку бактерий. Результаты показывают, что значительно более высокая стабильность получена при повышении соотношений гидролизат горохового белка/трегалоза. В частности, соотношение 1:1,5 гидролизат горохового белка/трегалоза обеспечивает более стабильную композицию. Включение аскорбата натрия при более высоком соотношении гидролизат горохового белка/трегалоза приводит к превосходной стабильности по сравнению с составами, из которых исключен аскорбат натрия.

Пример 10

Оптимизация pH для максимальной стабильности пробиотика L. rhamnosus.

Получили несколько композиций, содержащих смеси углеводов и соединения усилителей формирования стеклообразной структуры по Примеру 1, при различных pH. Концентрированную культуру пробиотических бактерий L. rhamnosus получили из коммерческого источника и получили ее сухую композицию по Примерам 1 и 3. Стабильный порошок подвергают ускоренному хранению при температуре 40°C и 33% ОВ в течение 8 недель. На Фигуре 6 показано воздействие pH суспензии на стабильность прошедших сушку бактерий. Результаты показывают, что оптимальная стабильность достигнута при нейтральном pH (~7).

Пример 11

Стабильный сухой порошок, содержащий фермент:

Получили гидрогелевую формулу, содержащую 40 массовых процентов фитазы (BASF, GmBH), смешиванием 400 г углеводной смеси и 200 г смеси усилителей формирования стеклообразной структуры по Примерам 1 и 4 и 400 г фитазы в 1000 мл воды. Пропущенный через шредер гидрогелевый состав подвергают быстрой заморозке в жидком азоте и сушат вакуумной сушилке при температуре первичной и вторичной сушки 50°C. Для определения нормы нагрузки и стабильности при хранении прошедшей сушку формулы сухой образец аккуратно отвешивают (<100 мг) в микроцентрифужные пробирки. Добавляют 200 µл диметилсульфоксида (DMSO). Состав растворяют в DMSO буфере при использовании вортекса. В этот образец добавляют 0,8 мл раствора, содержащего 0,05 N NaOH, 0,5% SDS и 0,075 M лимонной кислоты (тринатриевой соли). Пробирки подвергают обработке ультразвуком в течение 10 минут при температуре 45°C, затем проводят короткое центрифугирование при 5000 оборотов в минуту в течение 10 минут. Аликвоты чистого раствора DMSO/NaOH/SDS/цитрата помещают в лунки микропланшета и проводят анализ содержания белка при использовании методики определения количественного состава Bradford. Стабильность стабильной ферментной сухой композиции, подвергшейся воздействию температуры 95°C в течение 20 минут, значительно выше, чем у сухого фермента без композиции по настоящему изобретению.

Пример 12

Стабильный сухой порошок, содержащий вакцину от вируса инфекционной анемии лососевых (ISAV)

Концентрированную суспензию из вакцины ISAV (Novozyme, Denmark) получили по Примеру 4 за исключением того, что 20 мл 4% раствора хитозана в 0,5% уксусной кислоте добавили в суспензию, содержащую концентрат вакцины ISAV, смесь углеводов и усилителей формирования стеклообразной структуры. Добавляют 0,5 г двуосновного фосфата кальция и затем добавляют 0,5 глюконолактона. Суспензию выдерживают для стабилизации при комнатной температуре в течение следующих 2 часов с получением плотного гидрогеля. Плотный гель нарезают на тонкие длинные нити при использовании коммерчески доступного слайсера/шредера. Тонкие нити сразу же загружают на поддоны во влажной форме или подвергают быстрому замораживанию в жидком азоте и загружают на поддон при норме загрузки 1500 г/фут кв. (0,093 м²) и помещают в устройство для глубокой заморозки для сушки по Примеру 3. Активность воды (Aw) состава составила 0,25. Затем сухой состав измельчают с получением тонкого порошка при использовании стандартного молоткового устройства для измельчения и просеивают через сито с размером ячеек 50-150 микрон. Стабильную сухую композицию ISAV используют для оральной вакцинации нанесением на коммерческий кормовой продукт сухой композиции и скармливанием ее рыбам атлантического лосося.

Пример 13

Получение приманки для инвазивных видов

Получили пеллетизированную приманку, содержащую пестициды для конкретных инвазивных видов, по настоящему изобретению. Получили 200 г состава по Примеру 9 и добавили его в 200 г воды. В этот раствор добавили 90 г Rotenone и 0,5 г двуосновного фосфата кальция, затем добавили 0,5 гм глюконолактона. Суспензию сразу же подвергают распылительной сушке в стандартной промышленной распылительной сушилке, и сухой состав используют для конкретных инвазивных видов без оказания негативного воздействия токсинов на окружающую среду или закрытые экосистемы.

Пример 14

Получение защитного пробиотического состава для растений:

Получили агент для биологической борьбы, такой как Rhizobacteria, в виде сухой композиции по Примеру 4. Эффективность сухой композиции Rhizobacteria оценили на росте салата-латука в гнотобиологических условиях. Дозы 100 мг сухой композиции Rhizobacteria на растение инокулируют в банках с песком с предварительно пророщенными (24 ч) сеянцами салата-латука. В банку с растениями вносят дозу нутриента из 5 мл стерилизованного раствора Hoagland. Банки случайным образом устанавливают в вегетационную камеру с температурой 28°C с 12 часовым фотопериодом. Через каждые 7 дней после инокуляции растения и приставший песок осторожно удаляют из банки. Корни промывают в стерильном фосфатном буфере (pH 7,0), измеряют и записывают длину корней.

Ссылки

Содержание следующих ссылок введено здесь ссылками для всех целей.

Ссылки на патенты США и патентные заявки США:

6190701 Composition and method for stable injectable liquids, March 1999, Roser et al.

6964771 Method for stably incorporating substances within dry, foamed glass matrices, September 1997, Roser et al.

5766520 Preservation by formulation formation, June 1998, Bronshtein.

6534087 Process for preparing a pharmaceutical composition, June 2001, Busson and Schroeder.

6884866 Bulk drying and the effects of inducing bubble nucleation, April 2005, Bronshtein.

7153472 Preservation and formulation of bioactive materials for storage and delivery in hydrophobic carriers, December, 2006, Bronshtein.

2008/0229609, Preservation by Vaporization., June 2005, Bronshtein.

6306345 Industrial scale barrier technology for preservation of sensitive biological materials at ambient temperatures, October 2001, Bronshtein et al.

7381425, Preservation of bioactive materials by freeze dried foam, September 2006, Truong-le, Vu.

Другие ссылки:

Morgan, C.A., Herman, N., White, P.A., Vesey, G., 2006, Preservation of micro-organisms by drying; a review. J. Microbiol. Methods. 66(2):183-93.

Capela, P., Hay, T. K. C, & Shah, N. P., 2006, Effect of cryoprotectants, prebiotics and microencapsulation on survival of probiotic organisms in yoghurt and freeze-dried yoghurt. Food Research International, 39(3) 203-211).

Annear, 1962, The Preservation of Leptospires by Drying From the Liquid State, J. Gen. Microbiol, 27:341-343.

Crowe, J.F., Carpenter, J.F. and Crowe, L.M., 1998, THE ROLE OF VITRIFICATION

IN ANHYDROBIOSIS. Annu. Rev. Physiol. 60:73-103.

Crowe, J. H., Crowe., L. M., and Mouriadian, R., 1983, Cryobiology, 20, 346-356.

M. Le Meste, et al, 2002, Glass Transition and Food Technology: A Critical Appraisal, Journal of Food Science, 67:2444-2458.

Sanchez et al, 1999, Intl. J. Pharm. 185, 255-266.

Esquisabel et al, 1997, J. Microencapsulation, 14, 627-638.

Kets et al., 2004. Citrate increases glass transition temperature of vitrified sucrose preparations, Cryobiology, 48:46-54.

Реферат

Предложена сухая стабилизирующая композиция для биологического материала. Композиция включает углеводную смесь дисахаридов, олигосахаридов и полисахаридов, составляющую от 0,5% до 90%, гидролизованный белок, составляющий от 0,5% до 40% от общей массы композиции, и соль карбоновой кислоты. Также предложен способ получения сухой стабилизирующей композиции для биологического материала и варианты состава для оральной доставки. Способ предусматривает комбинирование биологического материала со смесью соединений стабилизирующей композиции в водном растворе с получением вязкой суспензии. После чего суспензию быстро замораживают в жидком азоте с получением твердых замороженных частиц, гранул, капель или нитей. Затем направляют на стадию первичной сушки жидкости из состава выпариванием под вакуумом при температуре состава выше его температуры замерзания и на вторичную сушку состава под максимальным вакуумом и при температуре 20°C или выше в течение периода времени, достаточного для снижения активности воды состава. Изобретение позволяет защитить биологические материалы в стеклообразной структуре с сохранением их существенной активности. 6 н. и 21 з.п. ф-лы, 6 ил., 14 пр.

Формула