Способ получения рекомбинантных белков в молочной железе нетрансгенных млекопитающих - RU2345088C2

Чертежи

Описание

Настоящее изобретение относится к способу получения биологически активных белков, имеющих фармацевтическую ценность, с использованием молочной железы в качестве биореактора и рекомбинантных аденовирусов в качестве векторов для переноса генов.

Уровень техники

Лечение многих заболеваний требует введения биологически активных белков. Эти фармацевтические препараты можно очистить из крови и тканей способами, которые, кроме затрат времени и средств, связаны с риском передачи инфекционных агентов, таких как агенты, вызывающие СПИД и гепатит.

Создание ДНК-рекомбинантной технологии позволило использовать в качестве систем-хозяев с относительно небольшими затратами бактерий и дрожжей для получения фармацевтически ценных белков. Тем не менее, во многих случаях биологическая активность указанных белков страдает вследствие неэффективной пост-трансляционной обработки указанных систем. По этой причине, для продукции большого числа биологически активных белков требуются биосинтетические системы высших эукариотов. В этом смысле системы, основанные на бакуловирусе и клетках млекопитающих, могли бы быть целесообразными стратегиями. Тем не менее, ферментация животных клеток представляет собой дорогой и технически сложный метод.

Было установлено, что возможным решением указанных трудностей является использование молочной железы трансгенных животных в качестве биореактора. Основное преимущество переноса генов основано на возможности создания новой трансгенной популяции из животного-основателя путем естественной репродукции. Несмотря на многообещающую перспективу такой технологии, в настоящее время существуют ограничения, которые препятствуют ее использованию в более универсальной форме. В частности, если трансгенных животных создают из крупных сельскохозяйственных животных, то требуется много времени и усилий для получения очень ограниченного количества G0, трансгенного поколения. Лишь небольшая пропорция трансгенных G0 будет экспрессировать в молоке интересующий белок на приемлемом уровне с тем, чтобы осуществить переход на коммерческую фазу. Дополнительное длительное время требуется для размножения посредством скрещивания линий G0 с высокими уровнями экспрессии до тех пор, пока не будет достигнута подходящая производительность, которая обеспечит возможность выхода на рынок. В течение данного периода наращивания производства также имеется риск того, что трансгенное потомство не будет экспрессировать экзогенный белок на уровнях первоначального основателя.

Благодаря соматическому клонированию в качестве альтернативного пути можно решить некоторые из указанных выше ограничений, однако, высокая стоимость, а также неэффективность данной методики препятствуют более частому и широкому ее применению.

Использование трансгенных млекопитающих в качестве биологических фабрик подразумевает конструкцию сложных кассет экспрессии, в которых экзогенный ген связан с регуляторными последовательностями, обеспечивая экспрессию только в эпителиальной ткани молочной железы во время лактации. Во многих случаях данные регуляторные последовательности не работают эффективно и являются причиной того, что в других тканях синтезируются небольшие количества рекомбинантного белка, нанося ущерб здоровью животного.

Прямой перенос генов в эпителий молочной железы (MGE) у взрослых животных представляет собой очень перспективную стратегию. Данная технология может не только уменьшить затраты на продукцию биофармацевтических препаратов, но также значительно снизить время, необходимое для их получения. Трансформация MGE in vivo может быть осуществлена у любого животного, независимо от его генетического фона, и при минимальных технических требованиях.

В предваряющей работе Archer et al (Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91(15):6840-4) оценили пригодность использования ретровирусных векторов для переноса гена человеческого гормона роста (hGH) в эпителиальные клетки молочной железы коз. hGH можно выявить в молоке, хотя и в очень низких концентрациях, но такая экспрессия снижалась до исходных уровней после первого дня.

В патентных документах US 5215904 и WO99/43795 также описаны способы, в которых авторы использовали ретровирусные векторы для трансформации MGE. Опосредованный рецепторами эндоцитоз, описанный в ЕР 725141,А4, и использование комплексов на основе поликатионов и/или липидов, описанное в US 5780009, также являются альтернативами для введения генов в MGE. Хотя данные работы обеспечивают возможность получения интересующего белка в молоке обработанных животных, до настоящего момента отмеченные уровни эффективности очень низкие, и полученные уровни белка находятся в диапазоне нанограммов на 1 мл, что является серьезным ограничением для применения способа в процессе производства.

Аденовирусные векторы могут инфицировать широкий диапазон типов клеток независимо от того, активно ли они делятся или нет. В общих чертах, экспрессия трансгенов, содержащихся в аденовирусных векторах, очень устойчива. После инфицирования вирус остается эписомным, и поэтому на экспрессию не влияет эффект положения. Однако экспрессия трансгенов из аденовирусных векторов прекращается примерно через 10 дней. Это, главным образом, связано с высокой иммунной реакцией, возникающей в организме в ответ на экспрессированные вирусом белки.

Для получения более длительной экспрессии гена были созданы новые аденовирусные векторы, из которых были удалены большинство или все вирусные кодирующие последовательности (Robin J. Parks et al., Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93(24):13565-70). Амплификацию указанных векторов получали при совместном инфицировании продуцирующих клеток вторым вирусом, который обеспечивает транскрипцию всех требуемых аденовирсуных белков. Это новое поколение векторов было названо вектором, зависимым от вируса-помощника или Gutless, и оно сохраняет только элементы, необходимые для репликации и упаковки инвертированных концевых повторов (ITR) и упаковывающих последовательностей, соответственно. Клонирующая способность этих векторов составляет до 36 т.п.н., и в анализах генной терапии in vivo было показано, что она очень устойчива.

Способность аденовирусных векторов переносить гены in vivo в эпителиальные клетки молочной железы мышей была показана Yang и сотрудниками (Cancer Lett. 1995, 98(1):9-17). С тех пор до настоящего времени было опубликовано несколько работ по применению аденовируса для переноса генов в MGE, но ни в одной из этих работ интересующий ген не был мишенью для экспрессии в молоке.

Возможность использования аденовируса в качестве инструмента для продукции биологически активных соединений описана в патентной заявке WO97/17090. Тем не менее, хотя в этом документе упомянута возможность трансформации MGE, все представленные экспериментальные данные, а также результаты, сосредоточены на трансформации in vitro образцов культуры ткани, ни один из которых не состоял из эпителиальных клеток молочной железы.

Единственной реализацией изобретения, раскрытого в WO97/17090, где описывается инфицирование MGE аденовирусом, является инъекция рекомбинантного аденовируса в молочную железу лактирующих коров; тем не менее, в соответствии с данным способом, уровни инфицирования и, следовательно, продукции рекомбинантного белка, очень низкие, и поэтому не подтверждают, что трансформация MGE аденовирусными векторами может быть целесообразной альтернативой для продукции биологически активных фармацевтических средств в молоке.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу, который делает возможным получение гетерологичных белков на высоких уровнях в молоке нетрансгенных млекопитающих. Более конкретно, данное изобретение относится к применению аденовирусных векторов, зависимых от вируса-помощника типа ΔЕ1ΔЕ3, для переноса чужеродных генов в клетки MGE. Клетки, трансформированные таким образом, синтезируют и секретируют биологически активные белки в молоко.

Поэтому в объеме настоящего изобретения находится простой и эффективный способ получения большого количества сложных биологически активных белков в молоке нетрансгенных млекопитающих.

Предложенный в настоящем изобретении способ делает возможным эффективную трансформацию in vivo эпителиальных клеток молочной железы. Указанные клетки будут иметь доступ ко всему требуемому генетическому материалу с тем, чтобы они могли секретировать биофармацевтические белки в молоко обработанных животных. В частности, в настоящем изобретении аденовирусные векторы используются для переноса чужеродной ДНК внутрь клеток MGE. После инфицирования вирусная ДНК остается эписомно в ядре инфецированных клеток, и делает возможным экспрессию трансгена, содержащегося в вирусном векторе.

Способ по настоящему изобретению включает введение раствора, содержащего аденовирусные векторы, непосредственно через канал сосков. Животными должны быть предпочтительно жвачные животные (например, коровы, овцы или козы). Животные могут подвергаться гормональной индукции маммогенеза и лактогенеза, альтернативно, можно использовать естественно лактирующих животных. После инфицирования трансгены переносятся внутрь секреторных клеток молочной железы, транскрибируются, транслируются и подвергаются посттрансляционным процессам, необходимым перед секрецией в молоко. При доении указанные инфицированные животные становятся живой фабрикой для производства чужеродных белков, представляющих биофармацевтический интерес.

Вирусные векторы должны содержать экспрессионную кассету, включающую ДНК, кодируемую интересующий белок, последовательность сигнального пептида для эффективной секреции, этот сигнальный пептид может быть из кодирующего гена или гетерологичным, промоторную последовательность, необязательно специфичную к эпителию молочной железы, последовательность расщепления и сигнал полиаденилирования.

Вирусные векторы основаны предпочтительно на человеческих аденовирусах типа 2 и 5. Альтернативно, могут использоваться аденовирусные векторы, лишенные генов Е1 и Е3, или даже лишенные всех аденовирусных кодирующих последовательностей (зависимый от вируса-помощника или gutless).

Использование аденовирусных векторов с дефективной репликацией (например, вектора ΔЕ1ΔЕ3), как описано в настоящем изобретении, делает возможным экспрессию высоких уровней рекомбинантных белков в молоке иммунокомпетентных животных приблизительно через 10 дней у. Указанные векторы особенно подходят для белков, требующихся в небольших количествах для физической и химической характеристики или терапевтических способов лечения. Это относится к эритропоэтину и активатору тканевого плазминогена.

Альтернативно, как описано в предложенном способе, зависимые от вируса-помощника аденовирусы являются наилучшим вариантом, если требуются большие количества белков. Было показано, что эти векторы очень стабильны в MGE, что делает возможным экспрессию рекомбинантных белков в молоке до пяти месяцев у иммунокомпетентных животных. Стабильность «gutless» векторов можно улучшить в зависимости от иммуногенности рекомбинантного белка, или используя животных с подавленным иммунитетом. «Gutless» векторы, кроме того, обладают большой клонирующей способностью (до 36 т.п.н.), обеспечивающей возможность инсерции множественных кассет экспрессии.

Кассеты экспрессии

Аденовирусные векторы настоящего изобретения содержат кассету экспрессии, состоящую из промотера, не обязательно специфичного для MGE, кодирующую последовательность для интересующего гена, последовательность расщепления и полиаденилирования.

Для конструирования указанной кассеты экспрессии можно использовать конститутивные промотеры; указанные промотеры могут быть гетерологичными для трансформируемых клеток. Примеры указанных промотеров включают ранний прямой человеческий цитомегаловирус, актин, ранний SV40, миозин и вирус саркомы Ру. Особый интерес могут представлять промотеры, естественно запускающие экспрессию белков в молочной железе. Примеры таких промотеров включают казеин αS1, казеин αS2, β-лактобактерин, κ-казеин, сывороточный кислотный белок и α-лактальбумин.

Кодирующая последовательность может быть комплементарной ДНК (кДНК), включающей или не включающей интрон для увеличения уровня экспрессии. Альтернативно и в зависимости от клонирующей способности вектора, можно использовать геномную ДНК, включающую интроны гена. Данная конструкция является предпочтительной, так как она дает лучшие уровни экспрессии по сравнению с экспрессией, запускаемой кДНК.

В сущности, любой гетерологичный белок может быть экспрессирован в молоке с использованием предлагаемой в настоящем описании системе. Особенно эффективными могут быть белки, имеющие терапевтическую или профилактическую ценность у людей или животных. Примеры белков, которые могут быть получены с использованием данного изобретения, включают, но ими не ограничиваются, антигены (например, поверхностный антиген гепатита В), факторы роста (например, человеческий гормон роста, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста, колониестимулирующий фактор, стимулирующий гранулоциты-макрофагальный фактор, фактор роста нервов, эритропоэтин), антитела, цитокины (например, интерлейкин 6 или интерлейкин 2), α1-антитрипсин, человеческий сывороточный альбумин, β-глобин, тканевой активатор плазминогена, супрессирующие опухоль белки (например, р53), белок С и интерфероны.

Каждый из указанных гетерологичных белков, получаемый в соответствии с настоящим изобретением, должен быть связан с сигнальным пептидом, направляющим секрецию в молоко. Указанный сигнальный пептид может быть из гетерологичного белка, если белок секретируется в природе. Если белок не является секретируемым, генная конструкция должна включать гетерологичный сигнальный пепетид, способный к секреции указанного белка.

Стабильность матричной РНК управляется в большой степени областью, расположенной в конце 3' гена. Данная область должна включать последовательность расщепления и полиаденилирования. Данные последовательности могут быть гетерологичными, но чаще используются последовательности, полученные из гена глобина, бычьего гормона роста, тимидинкиназы простого герпеса или ранней области вируса SV40.

Аденовирусные векторы

Было показано, что аденовирусные векторы человеческого происхождения способны эффективно инфицировать эпителиальные клетки молочных желез жвачных животных. Их устойчивость в секреторном эпителии зависит в большой степени от степени иммуногенности белков, экспрессированных из вирусного генома; они включают белки и вирусного происхождения, и биофармацевтический белок. Аденовирусные векторы с дефектами репликации (например, вектор ΔЕ1ΔЕ3) способны повышать уровни экспрессии рекомбинантных белков, но имеют пониженную стабильность вследствие сильной иммунной реакции, вызванной вирусными белками, против инфицированных клеток.

Зависимые от вируса-помощника или gutless векторы не содержат в своих геномах вирусные гены, следовательно, иммунная реакция против инфицированных клеток гораздо меньше, и она определяется только иммуногенностью самого рекомбинантного белка. Авторы показали, что указанные векторы очень стабильны и делают возможным экспрессию биофармацевтического белка в молоке обработанных животных.

Аденовирусные векторы с дефектом репликации могут быть сконструированы в соответствии с обычными методиками, описанными в литературе (Tong-Chuan He et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 1998, 95(5):2509-14). И упаковка, и амплификация вирусных частиц осуществляется в линии клеток НЕК-293 или в любых других линиях клеток, способных дополнить недостаточность аденовируса. Аденовирусные векторы, зависимые от вируса-помощника, могут быть сконструированы в соответствии с принципами Robin J. Parks et al (Proc. Netl. Acad. Sci. USA 1996, 93(24):13565-70). Для этого требуется одновременное инфицирование с аденовирусом-помощником; такой вирус-помощник должен обеспечить транскрипцию всех белков, требуемых для правильной упаковки вектора. В обоих случаях, векторы экстрагируются из клеток тремя циклами замораживания и оттаивания. Функциональность кассеты экспрессии, содержащейся в аденовирусных векторах, можно проанализировать in vitro инфицированием культивируемых эпителиальных клеток млекопитающих. В зависимости от инфицирования, интересующий белок может быть обнаружен в культуральной среде. Особенно эффективными в этом отношении могут быть эпителиальные клетки млекопитающих НС11 или клетки KIM2 мышиного происхождения и клетки МАС-Т коровьего происхождения. Рекомендуется очищать вирусные белки двойным центрифугированием в градиенте CsCl для удаления клеточных обломков и дефектных частиц, которые могут потенциально препятствовать эффективной инфекции эпителиальных клеток молочной железы. Для очистки аденовирусных векторов, зависимых от вируса-помощника, обязательным является центрифугирование в градиенте CsCl для очистки возможного загрязнения аденовирусом-помощником. Аденовирусы, очищенные этим способом, диализируют, так как высокая концентрация CsCl может препятствовать вирусному инфицированию клеток и тканей. После диализа аденовирусы можно хранить при -80°С без заметных изменений их титра.

Животные

Настоящее изобретение можно применить ко всем млекопитающим; тем не менее, жвачные животные являются предпочтительными из-за их более высокой способности продуцировать молоко. Можно использовать животных на ранних стадиях полового созревания. Этих животных подвергают гормональной схеме для того, чтобы вызвать маммогенез и лактацию. Как правило, у естественно лактирующих животных имеются более высокие уровни продукции молока и, следовательно, трансгена, чем у животных с гормонально вызванной лактацией.

Инфузия

Перед инфузией раствора, содержащего аденовирусные векторы, животное необходимо подоить для устранения молока, содержащегося в цистернах. Затем в молочную железу вливали изоосмотический раствор через канал соска до тех пор, пока железа не становилась заполненной, с помощью массажа железы раствор достигал всех альвеол, и раствор удаляют доением. Данный этап следует повторить два или три раза для того, чтобы удостовериться в полной промывке молочной железы и растяжении альвеол и тканей протоков. Изоосмотическим раствором может быть PBS, 0,9% NaCl, 5% глюкоза, среда для культуры ткани HBS.

Инфузию раствора, содержащего вирусные частицы, осуществляют непосредственно через канал соска. В качестве несущей жидкости можно использовать изотонический растворы 5% PBS, 0,9% NaCl, HBS или среду для культуры ткани (например, DMEM). Концентрация вируса в растворе для инфузии может изменяться, хотя желательная концентрация составляет 1 х 10⁹ PFU (бляшкообразующих единиц)/мл или выше. Оптимальный объем инфузии может изменяться в зависимости от размера молочной железы, например, у коз объем может изменяться от 50 до 300 мл на молочную железу.

Для осуществления инфузии через канал соска можно использовать шприц, соединенный с канюлей. Инфузию следует выполнять медленно, осуществляя массаж во время и после инфузии для обеспечения равномерного распределения раствора во всех эпителиальных клетках молочной железы.

Сбор гетерологичного белка

Молоко обработанных животных может быть получено обычными способами ручной и автоматизированной дойки. Казеины и жир отделяют от сыворотки, большую часть которой хранят при -20°С, тогда как маленькие фракции используют для определения и количественного анализа интересующего белка общеизвестными аналитическими методиками (например, ELISA, вестерн-блоттинг и способы определения биологической активности). Сыворотку, содержащую значительные количества интересующих белков, смешивают и используют в качестве активного основного материала для очистки гетерологичного белка. Способ очистки может значительно изменяться в зависимости от заданного белка.

Таким образом, для способа получения рекомбинантного белка с высоким содержанием в молоке в соответствии с настоящим изобретением необходимы следующие этапы.

1. Конструирование рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету экспрессии с желательным геном. Эта стадия включает:

а) конструирование рекомбинантного аденовирусного генома,

b) получение вирусных частиц в линии клеток 293,

с) амплификацию и очистку аденовирусных векторов.

2. Инфицирование эпителиальных клеток молочной железы. Эта стадия включает:

а) индукцию маммогенеза и лактации в случае, если используют животное без естественной лактации;

b) инфузию в молочную железу раствора, содержащего вирусные частицы.

3. Выделение рекомбинантного белка. Эта стадия включает:

а) доение обработанного животного,

b) определение и количественный анализ гетерологичного белка в собранном молоке,

с) очистку гетерологичного белка.

Ниже следуют некоторые иллюстративные примеры для лучшего понимания настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Конструирование аденовирусных векторов (ΔЕ1ΔЕ3), содержащих гены hGH и hEPO.

Аденовирусные векторы с дефектной репликацией конструировали на основе системы AdEasy (Tong-Chuan He et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 1998, 95(5):2509-14); в качестве вектора переноса использовали плазмиду pAdTrack-CMV (фиг.1). Система на основе AdEasy является быстрым и легким вариантом для получения рекомбинантных аденовирусов. Необходимо проведение двухэтапного процесса, где первая кассета экспрессии клонируется в вектор переноса и затем переносится в вирусный геном гомологичной рекомбинацией в бактериальный штамм BJ5183. Затем аденовирусный геном ферментируют эндонуклеазой Рас I и трансфецируют в линию клеток 293 или 911. В данном случае и образование инфекционных вирионов, и конечную амплификацию контролируют совместной экспрессией белка зеленого флюоресцентного белка (GFP), содержащегося в векторе переноса pAdTrack-CMV.

Пример 2: Конструкция аденовирусных векторов, зависимых от вируса-помощника

Аденовирусные векторы, зависимые от вируса-помощника, конструировали клонированием кассеты экспрессии, содержащей ген эритропоэтина в сайте множественного клонирования плазмиды pSH-1. С целью придания полученной плазмиде соответствующего размера, позволяющего осуществить упаковку, ее переносили в вектор pStuffer-26 гомологичной рекомбинацией в бактериальном штамме BJ5183 (фиг.2). В результате гомологичной рекомбинации была создана плазмида, содержащая более чем 28 т.п.н. После ферментирования эндонуклеазой Рас I плазмиду трансфецируют в линию клеток 293-Cre и позднее инфицируют аденовирусом-помощником AdInvLΨL-GFP. Экспрессия рекомбиназы Cre в линии клеток 293-Cre способствует рекомбинации между сайтами Lox P, фланкирующими последовательность упаковки в аденовирусе-помощнике, который будет не способен к упаковке, но сохранит способность реплицироваться и поэтому обеспечить транскрипцию вирусных белков, требуемых для получения вирусных частиц, содержащих геном аденовирусного вектора, зависимого от вируса-помощника.

Пример 3: Экспрессия человеческого гормона роста (hGH) и человеческого эритропоэтина (hEPO) первичных культивированных клеток эпителия молочной железы

Для анализа правильного функционирования кассет экспрессии hGH и hEPO, сконструированных в аденовирусных векторах, инфицировали эпителиальные клетки НС11 молочной железы. Клетки культивировали в DMEM с добавлением EGF (10 ηг/мл) и инсулина (10 мкг/мл). При 80%-ном слиянии аденовирусные векторы в соотношении 20 частиц на лунку добавляли в клеточную культуру. Через 24 часа среду меняли на такую же среду, но с добавлением EGF и инсулина, но без FCS. Через 48 ч среду собирали и белки, содержащиеся в 1 мл, осаждали трихлоруксусной кислотой и ресуспендировали в 40 мкл воды; 20 мкл использовали для электрофореза и последующего анализа вестерн-блоттингом.

Пример 4: Экспрессия человеческого гормона роста (hGH) и человеческого эритропоэтина (hEPO) в молоке мышей

Способность аденовирусов инфицировать MGE и дополнительно способствовать секреции в молоко интересующего белка оценивали у мышей. Были подготовлены 3 экспериментальных группы по 5 мышей в каждой. Самкам мышей B6D2F1 на 17-й день беременности вливали 100 мкл препарата, содержащего вирус, в зависимости от экспериментальной группы: 1-2,5 х 10⁷ GTU/мл аденовируса (ΔЕ1ΔЕ3), содержащего ген hEPO; III-солевой раствор.

Доение обработанных мышей начинали после 2-го дня после родов. Собранное молоко разбавляли 1:5 в сепарационном буфере для разделения (10 мМ Tris-HCl, рН 8, 10 мМ CaCl₂), и казеины отделяли от сыворотки холодовым центрифугированием при 4°С в течение 30 мин при 15000 g.

Содержание hGH в образцах молока выявляли вестерн-блоттингом и количественно анализировали ELISA (hGH ELISA, Boehtinger Mannheim, Cat. No. 1585878) (фиг.3). Содержание hEPO также выявляли вестерн-блоттингом и количественно анализировали ELISA (ELISA, изготовленным в CIGB) (фиг.4).

Пример 5: Индукция лактации у коз

Рекомбинантные аденовирусные векторы для переноса генов в молочную железу можно использовать по существу у любых видов млекопитающих; однако предпочтительны жвачные животные ввиду их высокой продукции молока. Можно использовать животных на ранних стадиях их полового созревания, у которых можно гормонально вызвать маммогенез и лактогенез. Также можно использовать животных в естественной фазе лактации. Если животные, которых предстоит использовать, например, представляют собой коз, то гормональную индукцию можно осуществить введением эстрадиола (0,25 мг/кг внутримышечно, в/м) и прогестерона (0,75 мг/кг в/м) на 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13-й день, тогда как преднизолон (0,4 мг/кг в/м) следует вводить на 14-16 день, проводя ежедневный массаж вымени, начиная с 5-го дня.

Пример 6: Инфузия рекомбинантного аденовируса (ΔЕ1ΔЕ3), содержащего ген человеческого гормона роста hGH в молочную железу коз

Козам в фазу лактации внутримышечно вводили 10 мг диазепама для уменьшения стресса во время обработки. Животных интенсивно доили для удаления как можно большего количества молока из каверн; молочные железы дважды промывали вливанием 200 мл солевого раствора при 37°С и затем доили. Все вливания проводили непосредственно через канал соска 50-мл шприцем, соединенным с катетером. Вливания производили медленно с одновременным массажем вымени, в которое проводили вливание. У коз вымя разделено на 2 независимые половины; в одну из них вливали раствор, содержащий аденовирусный вектор, тогда как в другую вливали только солевой раствор и использовали в качестве отрицательного внутреннего контроля. В каждую молочную железу вводили раствор 200 мл солевого раствора, содержащего вирусную нагрузку 10⁹ GTU/мл, что означает то, что в каждую молочную железу вводили в целом 2 х 10¹¹ вирусных частиц. После вливания вымя массировали для однородного распределения раствора и для того, чтобы он достиг все протоки и альвеолы. Влитый раствор удаляли на следующий день дойкой.

Пример 7: Вливание рекомбинантного, зависимого от вируса-помощника, аденовируса, содержащего ген эритропоэтина, в молочную железу коз

Козам в фазу лактации внутримышечно вводили 10 мг диазепама для уменьшения стресса во время обработки. Животных интенсивно доили для удаления как можно большего количества молока из каверн; молочные железы дважды промывали вливанием 200 мл солевого раствора при 37°С и затем доили. Все вливания проводили непосредственно через канал соска 50-мл шприцем, соединенным с катетером. Вливания производили медленно с одновременном массажем вымени, в которое проводили вливание. У коз вымя разделено на 2 независимые половины; в одну из них вливали раствор, содержащий аденовирусный вектор, тогда как в другую вливали только солевой раствор и использовали в качестве отрицательного внутреннего контроля. В каждую молочную железу вводили раствор 200 мл солевого раствора, содержащего вирусную нагрузку 10⁹ GTU/мл, что означает то, что в каждую молочную железу вводили в целом 2 х 10¹¹ вирусных частиц. После вливания вымя массировали для однородного распределения раствора и для того, чтобы он достиг все протоки и альвеолы. Влитый раствор удаляли на следующий день дойкой.

Пример 8: Выявление hGH и hEPO в молоке коз, которым вливали аденовирусный вектор

Молоко животных после вливания собирали ручной дойкой, через 48 ч после вливания. Ежедневно выполняли 2 дойки, одну утром, а другую поздно вечером. Большую часть собранного молока хранили при -70°С для окончательной очистки белка, в то время как небольшие образцы использовали для определения и количественного анализа содержания hGH и hEPO в каждом из лотов.

Определение hGH и hEPO проводили следующим образом. К 150 мкл образцам молока добавляли 4 объема буфера для разделения (10 мМ Tris-HCl, 10 мМ CaCl₂) и центрифугировали при 4°С в течение 30 мин при 15000 g для отделения сыворотки от жира и казеинов. Выделяли сывороточную фракцию и белки, содержащиеся в 10 мкл, разделяли SDS-PAGE (электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) на 12,5% акриламидном геле. Белки переносили на нитроцеллюлозные фильтры и метили поликлональным антителом против hGH (1/500). Иммунореактивные полосы визуализировали хемилюминисцентной системой (ECL) от Amersham Pharmacia Biotech (фиг.5В).

Количественный анализ hGH проводили с помощью ELISA hGH от Boehringer Mannheim (каталожный № 1585878). Все процедуры проводили в соответствии с инструкциями изготовителя. Количественный анализ hEPO проводили сэндвич-ELISA, изготовленным в Центре генетической инженерии и биотехнологии, Гавана, Куба.

У животных, которым осуществляли инфузию аденовирусных векторов типа ΔЕ1ΔЕ3, hGH, выявляли в течение 11-и дней после инфузии, значения достигали 0,3 мг/мл в течение первых трех дней (фиг.5С).

В случае инокуляции животных аденовирусными векторами, зависимыми от вируса-помощника, уровни hEPO были также значительно высокими (фиг.6). Уровни экспрессии при использовании этих векторов были выше 0,2 мг/мл в течение первых 5 недель, незначительно снижались до достижения уровня 5 нг/мл на 145-й день после вливания.

Преимущества предложенного раствора

Способ, предложенный в настоящем изобретении, решает проблемы растущих потребностей в получении биофармацевтических средств белкового состава. В частности, с помощью настоящего изобретения возможно крупномасштабное производство белков, чья биологическая активность тесно связана со сложной посттрансляционной обработкой и, следовательно, зависит от биосинтетического механизма высших организмов. С помощью предложенного в настоящем изобретении способа возможно быстро, просто и экономически осуществить продукцию таких белков. В этом смысле, с помощью настоящего изобретения можно быстро реагировать в короткий период времени на изменения на рынке, его применение не связано с большими техническими требованиями, и реакционная способность может быть легко изменена в зависимости от нужд.

Кроме того, настоящее изобретение дает возможность съэкономить время и ресурсы в качестве альтернативы для исследования посттрансляционных изменений молочной железы различных видов. Принимая во внимание то, что кодирующие последовательности исследуемого белка содержатся в аденовирусном векторе, его можно перенести в молочную железу различных видов животных, позволяя, таким образом, исследовать дифференциальные модификации, которым подвергается тот же белок в зависимости от вида, у которого он продуцируется.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показана стратегия, использованная для конструирования аденовирусных векторов ΔЕ1ΔЕ3, содержащих гены hGH и hEPO.

На фиг.2 показана стратегия, использованная для конструирования, зависимого от вируса-помощника аденовирусного генома, содержащего ген (hEPO).

На фиг.3 представлен анализ экспрессии hGH в молоке мышей, которым осуществляли инфузию 2,5 х 10⁶ GTU на молочную железу аденовируса ΔЕ1ΔЕ3, содержащего ген hGH, под контролем промотера цитомегаловируса человека.

А) Анализ вестерн-блоттингом: отрицательный контроль (С-) относится к молоку мыши, которой осуществляли инфузию аденовируса, лишенного кассеты экспрессии для hGH, полосы 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 содержат образцы молока, собранные в соответствующие дни лактации.

В) Концентрация hGH в молоке относительно дней после рождения.

На фиг.4 представлен анализ экспрессии hEPO в молоке мышей, которым осуществляли инфузию 1х10⁸ GTU на молочную железу аденовируса ΔЕ1ΔЕ3, содержащего ген hEPO, под контролем промотера цитомегаловируса человека.

А) Анализ вестерн-блоттингом: отрицательный контроль (С-) относится к молоку мыши, которой осуществляли инфузию аденовируса, лишенного кассеты экспрессии для hEPO, полосы 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 содержат образцы молока, собранные в соответствующие дни лактации.

В) Концентрация hEPO в молоке относительно дней после рождения.

На фиг.5 показано наличие hGH в молоке коз, которым вводили 2 х 10¹¹ GTU на молочную железу аденовирусного вектора ΔЕ1ΔЕ3, содержащего ген hGH, под контролем промотера цитомегаловируса человека.

А) Электрофорез образцов молока, собранных в первые 10 дней после вливания, отрицательным контролем является молоко из молочной железы, в которую вводили аденовирусный вектор, лишенный кассеты экспрессии hGH.

В) Анализ вестерн-блотом, показывающий экспрессию hGH в молоке коз; отрицательным контролем является молоко их молочной железы после введения аденовирусного вектора, лишенного кассеты экспрессии для hGH; положительным контролем является рекомбинантный hGH, очищенный из бактериальных клеток.

С) Концентрация hGH в молоке относительно дней после введения.

На фиг.6 показаны результаты ELISA, демонстрирующие уровни hEPO в молоке коз после вливания аденовирусного вектора, зависимого от вируса-помощника, содержащего ген hEPO, под контролем промотера цитомегаловируса человека.

Реферат

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии. Способ предусматривает трансформацию эпителиальных клеток молочной железы аденовирусным вектором, несущим гены, кодирующие интересующие гетерологичные белки. Способ позволяет получать гетерологичные белки в молоке млекопитающих в большой концентрации. Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии и животноводстве. 3 з.п. ф-лы, 10 ил.

Формула