Животные, отличные от человека, имеющие гуманизированный ген 1 запрограммированной гибели клеток - RU2735958C2

Чертежи

Показать все 11 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[01] Настоящая заявка заявляет преимущество приоритета на основании предварительных заявок на патент США №62/014181, поданной 19 июня 2014 г., 62/086518, поданной 2 декабря 2014 г., и 62/138221, поданной 25 марта 2015 г., полное содержание которых включено в данный документ посредством ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[02] Перечень последовательностей в виде текстового файла ASCII размером 23 кБ под названием 31969_SEQ.txt, созданный 4 июня 2015 г. и поданный в Ведомство по патентам и товарным знакам США через EFS-Web, включен в данный документ посредством ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[03] Хотя значительное внимание научных исследований и разработок в области медицины было посвящено иммунотерапии рака, и были достигнуты значительные улучшения, рак остается основной проблемой в отрасли здравоохранения во всем мире. Эта основная проблема частично обусловлена способностью раковых клеток ускользать от механизмов надзора иммунной системы, что отчасти является результатом ингибирования и/или инактивации противоопухолевого иммунитета. Разработка систем in vivo для оптимального определения терапевтического потенциала новых методов терапии рака, предназначенных для активации и/или стимуляции противоопухолевого иммунитета, и определения молекулярных аспектов передачи ингибирующих сигналов от раковых клеток к иммунным клеткам (например, Т-клеткам) по-прежнему является недостаточной. Такие системы обеспечивают источник для анализов для оценки терапевтической эффективности средств-кандидатов, обеспечивающих противоопухолевую среду in vivo.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[04] Настоящее изобретение охватывает понимание того, что для обеспечения улучшенных систем для идентификации и разработки новых терапевтических средств, которые можно применять для лечения рака, желательным является получение с помощью генной инженерии животных, отличных от человека. Настоящее изобретение также охватывает понимание того, что для обеспечения улучшенных систем для идентификации и разработки новых терапевтических средств, которые можно применять для лечения аутоиммунных (или воспалительных) заболеваний, нарушений или состояний, желательным является получение с помощью генной инженерии животных, отличных от человека. Дополнительно, настоящее изобретение также охватывает понимание того, что, например, для применения в идентификации и разработке противораковых терапевтических средств, повышающих противоопухолевый иммунитет, желательными являются животные, отличные от человека, имеющие гуманизированный ген Pdcd1 и/или иным образом экспрессирующие, содержащие или продуцирующие человеческий или гуманизированный полипептид PD-1. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают улучшенные системы in vivo для идентификации и разработки методов комбинированной терапии, предусматривающих целенаправленное воздействие на PD-1.

[05] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает животное, отличное от человека, имеющее геном, содержащий ген Pdcd1, который включает в себя генетический материал от двух различных видов (например, человека и вида, отличного от человека). В некоторых вариантах осуществления ген Pdcd1 животного, отличного от человека, описанного в данном документе, кодирует полипептид PD-1, содержащий человеческую и отличную от человеческой части, где человеческая и отличная от человеческой части соединены вместе и образуют функциональный полипептид PD-1. В некоторых вариантах осуществления ген Pdcd1 животного, отличного от человека, описанного в данном документе, кодирует полипептид PD-1, содержащий полный или неполный внеклеточный домен человеческого полипептида PD-1.

[06] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает животное, отличное от человека, которое экспрессирует полипептид PD-1, причем данный полипептид PD-1 содержит человеческую часть и эндогенную часть. В некоторых вариантах осуществления полипептид PD-1 по настоящему изобретению образуется в результате трансляции в клетке животного, отличного от человека, с сигнальным пептидом, отличным от человеческого; в некоторых определенных вариантах осуществления с сигнальным пептидом грызуна.

[07] В некоторых вариантах осуществления эндогенная часть содержит внутриклеточную часть эндогенного полипептида PD-1. В некоторых вариантах осуществления эндогенная часть дополнительно содержит трансмембранную часть эндогенного полипептида PD-1. В некоторых вариантах осуществления эндогенная часть имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичную соответствующей аминокислотной последовательности мышиного полипептида PD-1, представленной на фигуре 8. В некоторых вариантах осуществления эндогенная часть имеет аминокислотную последовательность, практически идентичную соответствующей аминокислотной последовательности мышиного полипептида PD-1, представленной на фигуре 8. В некоторых вариантах осуществления эндогенная часть имеет аминокислотную последовательность, идентичную соответствующей аминокислотной последовательности мышиного полипептида PD-1, представленной на фигуре 8.

[08] В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит аминокислоты 35-145, 27-145, 27-169, 26-169 или 21-170 человеческого полипептида PD-1. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичную соответствующей аминокислотной последовательности человеческого полипептида PD-1, представленной на фигуре 8. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит аминокислотную последовательность, практически идентичную соответствующей аминокислотной последовательности человеческого полипептида PD-1, представленной на фигуре 8. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит аминокислотную последовательность, идентичную соответствующей аминокислотной последовательности человеческого полипептида PD-1, представленной на фигуре 8.

[09] В некоторых вариантах осуществления полипептид PD-1, который содержит человеческую часть и эндогенную часть, кодируется эндогенным геном Pdcd1. В некоторых определенных вариантах осуществления эндогенный ген Pdcd1 содержит эндогенные экзоны 1, 4 и 5 Pdcd1. В некоторых определенных вариантах осуществления эндогенный ген Pdcd1 дополнительно содержит полный или неполный эндогенный экзон 3 Pdcd1. В некоторых определенных вариантах осуществления эндогенный ген Pdcd1 содержит SEQ ID NO: 21. В некоторых определенных вариантах осуществления эндогенный ген Pdcd1 содержит SEQ ID NO: 22. В некоторых определенных вариантах осуществления эндогенный ген Pdcd1 содержит SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22.

[010] В некоторых вариантах осуществления полипептид PD-1, экспрессируемый животным, отличным от человека, описанным в данном документе, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления полипептид PD-1, экспрессируемый животным, отличным от человека, описанным в данном документе, имеет аминокислотную последовательность, практически идентичную SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления полипептид PD-1, экспрессируемый животным, отличным от человека, описанным в данном документе, имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 6.

[011] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает гуманизированный локус Pdcd1, содержащий один или более экзонов гена Pdcd1, отличного от человеческого, функционально связанных с одним или более полными или неполными экзонами человеческого гена Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный локус Pdcd1 дополнительно содержит 5'- и 3'-концевые нетранслируемые области (UTR) Pdcd1, отличного от человеческого, фланкирующие один или более экзонов человеческого гена Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный локус Pdcd1 находится под контролем промотора грызуна; в некоторых определенных вариантах осуществления эндогенного промотора грызуна.

[012] В некоторых вариантах осуществления гуманизированный локус Pdcd1 содержит экзоны 1, 3, 4 и 5 Pdcd1, отличного от человеческого, функционально связанные с экзоном 2 человеческого Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный локус Pdcd1 содержит экзоны 1, 4 и 5 Pdcd1, отличного от человеческого, экзон 2 человеческого Pdcd1 и дополнительно содержит экзон 3 Pdcd1, причем экзон 3 Pdcd1 содержит человеческую часть и часть, отличную от человеческой, и где указанные отличные от человеческих и человеческие экзоны функционально связаны. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть экзона 3 Pdcd1 включает в себя нуклеотиды, которые кодируют последовательность «стволовой» части PD-1. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть экзона 3 Pdcd1 включает в себя приблизительно 71 п.о. экзона 3 человеческого Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления часть экзона 3 Pdcd1, отличная от человеческой, включает в себя нуклеотиды, которые кодируют последовательность трансмембранной части. В некоторых вариантах осуществления часть экзона 3 Pdcd1, отличная от человеческой, включает в себя приблизительно 91 п.о. экзона 3 Pdcd1 грызуна.

[013] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает животное, отличное от человека, содержащее ген Pdcd1, который содержит эндогенную часть и человеческую часть, где эндогенная и человеческая части функционально связаны с промотором Pdcd1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления промотор Pdcd1 грызуна представляет собой эндогенный промотор Pdcd1 грызуна.

[014] В некоторых вариантах осуществления эндогенная часть содержит эндогенные экзоны 1, 4 и 5 Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления эндогенная часть дополнительно содержит полный или неполный эндогенный экзон 3 Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления экзон 1, полный или неполный экзон 3, экзоны 4 и 5 эндогенного гена Pdcd1 по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичны соответствующим экзону 1, полному или неполному экзону 3, экзонам 4 и 5 эндогенного гена Pdcd1, представленного на фигуре 8. В некоторых вариантах осуществления экзон 1, полный или неполный экзон 3, экзоны 4 и 5 эндогенного гена Pdcd1 практически идентичны соответствующим экзону 1, полному или неполному экзону 3, экзонам 4 и 5 эндогенного гена Pdcd1, представленного на фигуре 8. В некоторых вариантах осуществления экзон 1, полный или неполный экзон 3, экзоны 4 и 5 эндогенного гена Pdcd1 идентичны соответствующим экзону 1, полному или неполному экзону 3, экзонам 4 и 5 эндогенного гена Pdcd1, представленного на фигуре 8.

[015] В некоторых вариантах осуществления человеческая часть кодирует аминокислоты 21-170, 26-169, 27-169, 27-145 или 35-145 человеческого полипептида PD-1.

[016] В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит экзон 2 человеческого гена Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть дополнительно содержит полный или неполный экзон 3 человеческого Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления экзон 2 и полный или неполный экзон 3 человеческого Pdcd1 по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичны соответствующим экзону 2 и полному или неполному экзону 3 человеческого гена Pdcd1, представленного на фигуре 8. В некоторых вариантах осуществления экзон 2 и полный или неполный экзон 3 человеческого Pdcd1 практически идентичны соответствующим экзону 2 и полному или неполному экзону 3 человеческого гена Pdcd1, представленного на фигуре 8. В некоторых вариантах осуществления экзон 2 и полный или неполный экзон 3 человеческого Pdcd1 идентичны соответствующим экзону 2 и полному или неполному экзону 3 человеческого гена Pdcd1, представленного на фигуре 8. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит последовательность, подвергнутую оптимизации кодонов для экспрессии у животного, отличного от человека; в некоторых вариантах осуществления экспрессии у грызуна; в некоторых определенных вариантах осуществления экспрессии у мыши; в некоторых определенных вариантах осуществления экспрессии у крысы.

[017] В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит последовательность, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит последовательность, практически идентичную SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит последовательность, идентичную SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит SEQ ID NO: 23.

[018] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает полипептид PD-1, продуцируемый (или образуемый) животным, отличным от человека, описанным в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления полипептид PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, описанным в данном документе, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичную SEQ ID NO: 6. В некоторых определенных вариантах осуществления полипептид PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, описанным в данном документе, содержит аминокислотную последовательность, практически идентичную SEQ ID NO: 6. В некоторых определенных вариантах осуществления полипептид PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, описанным в данном документе, содержит аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 6.

[019] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенную клетку или ткань животного, отличного от человека, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает выделенную клетку или ткань, содержащую ген Pdcd1, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой лимфоцит. В некоторых вариантах осуществления клетка выбрана из В-клетки, дендритной клетки, макрофага, моноцита (например, активированного моноцита), NK-клетки и Т-клетки (например, активированной Т-клетки). В некоторых вариантах осуществления ткань выбрана из жировой ткани, ткани мочевого пузыря, головного мозга, молочной железы, костного мозга, глаза, сердца, кишечника, почки, печени, легкого, лимфатического узла, мышцы, поджелудочной железы, плазмы крови, сыворотки крови, кожи, селезенки, желудка, вилочковой железы, яичка, яйцеклетки и их комбинации.

[020] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает эмбриональную стволовую клетку, отличную от человеческой, геном которой содержит ген Pdcd1, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и получена из линии 129, линии C57BL/6 или линии BALB/c. В некоторых вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и получена из линии 129, линии C57BL/6 или их помеси. В некоторых вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и получена из помеси линий 129 и C57BL/6.

[021] В некоторых вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, имеет геном, содержащий ген Pdcd1, который содержит SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 или их комбинацию.

[022] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой, описанной в данном документе, для получения животного, отличного от человека. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку мыши и применяется для получения мыши, содержащей ген Pdcd1, описанный в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку крысы и применяется для получения крысы, содержащей ген Pdcd1, описанный в данном документе.

[023] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает эмбрион, отличный от человеческого, содержащий эмбриональную стволовую клетку, отличную от человеческой, содержащую ген Pdcd1, описанный в данном документе, созданный из нее, полученный из нее или образованный из нее. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбрион, отличный от человеческого, представляет собой эмбрион грызуна; в некоторых вариантах осуществления эмбрион мыши; в некоторых вариантах осуществления эмбрион крысы.

[024] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение эмбриона, отличного от человеческого, описанного в данном документе, для получения животного, отличного от человека. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбрион, отличный от человеческого, представляет собой эмбрион мыши и применяется для получения мыши, содержащей ген Pdcd1, описанный в данном документе. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбрион, отличный от человеческого, представляет собой эмбрион крысы и применяется для получения крысы, содержащей ген Pdcd1, описанный в данном документе.

[025] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает целенаправленно воздействующий вектор (или конструкцию нуклеиновой кислоты), описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает целенаправленно воздействующий вектор (или конструкцию нуклеиновой кислоты), которые содержат гуманизированный ген Pdcd1, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает целенаправленно воздействующий вектор (или конструкцию нуклеиновой кислоты), которые содержат ген Pdcd1, кодирующий полипептид PD-1, который содержит полный или неполный человеческий внеклеточный домен; в некоторых определенных вариантах осуществления полипептид PD-1, который содержит аминокислоты 21-170, 26-169, 27-169, 27-145 или 35-145 человеческого полипептида PD-1.

[026] В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующий вектор (или конструкция нуклеиновой кислоты) содержит один или более полных или неполных экзонов гена Pdcd1, отличного от человеческого, функционально связанных с одним или более полными или неполными экзонами человеческого гена Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующий вектор (или конструкция нуклеиновой кислоты) содержит 5'- и 3'-концевые нетранслируемые области (UTR) Pdcd1, отличного от человеческого, фланкирующие один или более экзонов человеческого гена Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующий вектор (или конструкция нуклеиновой кислоты) содержит один или более селективных маркеров. В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующий вектор (или конструкция нуклеиновой кислоты) содержит один или более сайтов сайт-специфической рекомбинации. В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующий вектор (или конструкция нуклеиновой кислоты) содержит экзон 2 человеческого Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующий вектор (или конструкция нуклеиновой кислоты) содержит экзон 2 человеческого Pdcd1 и полный или неполный экзон 3 человеческого Pdcd1.

[027] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение целенаправленно воздействующего вектора (или конструкции нуклеиновой кислоты), описанных в данном документе, для получения модифицированной эмбриональной стволовой клетки, отличной от человеческой. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение целенаправленно воздействующего вектора (или конструкции нуклеиновой кислоты), описанных в данном документе, для получения модифицированного эмбриона, отличного от человеческого. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение целенаправленно воздействующего вектора (или конструкции нуклеиновой кислоты), описанных в данном документе, для получения животного, отличного от человека.

[028] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ получения животного, отличного от человека, которое экспрессирует полипептид PD-1 с эндогенного гена Pdcd1, где полипептид PD-1 содержит человеческую последовательность, при этом способ включает (a) вставку геномного фрагмента в эндогенный ген Pdcd1 в эмбриональной стволовой клетке грызуна, при этом указанный геномный фрагмент содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует полный или неполный человеческий полипептид PD-1; (b) получение эмбриональной стволовой клетки грызуна, образованной на стадии (a); и создание грызуна с применением эмбриональной стволовой клетки грызуна из стадии (b).

[029] В некоторых вариантах осуществления человеческая последовательность содержит аминокислоты 35-145, 27-145, 27-169, 26-169 или 21-170 человеческого полипептида PD-1.

[030] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность содержит экзон 2 человеческого Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность дополнительно содержит полный или неполный экзон 3 человеческого Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность содержит один или более селективных маркеров. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность содержит один или более сайтов сайт-специфической рекомбинации.

[031] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ получения животного, отличного от человека, геном которого содержит ген Pdcd1, который кодирует полипептид PD-1, имеющий человеческую часть и эндогенную часть, причем эти части функционально связаны с промотором Pdcd1 грызуна, при этом способ включает модифицирование генома животного, отличного от человека, таким образом, чтобы он содержал ген Pdcd1, который кодирует полипептид PD-1, имеющий человеческую часть и эндогенную часть, причем эти части функционально связаны с промотором Pdcd1 грызуна, с получением таким образом указанного животного, отличного от человека.

[032] В некоторых вариантах осуществления промотор Pdcd1 грызуна представляет собой эндогенный промотор Pdcd1 грызуна.

[033] В некоторых вариантах осуществления человеческая часть содержит аминокислоты 35-145, 27-145, 27-169, 26-169 или 21-170 человеческого полипептида PD-1.

[034] В некоторых вариантах осуществления ген Pdcd1 модифицируют для того, чтобы он включал в себя экзон 2 человеческого Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления ген Pdcd1 модифицируют для того, чтобы он включал в себя экзон 2 человеческого Pdcd1 и полный или неполный экзон 3 человеческого Pdcd1.

[035] В некоторых вариантах осуществления модифицирование генома животного, отличного от человека, осуществляют в эмбриональной стволовой клетке, отличной от человеческой, с последующим созданием животного, отличного от человека, с указанной эмбриональной стволовой клеткой, отличной от человеческой. В некоторых определенных вариантах осуществления эмбриональная стволовая клетка, отличная от человеческой, представляет собой эмбриональную стволовую клетку грызуна; в некоторых вариантах осуществления эмбриональную стволовую клетку мыши; в некоторых вариантах осуществления эмбриональную стволовую клетку крысы.

[036] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает животное, отличное от человека, получаемое с помощью способов, описанных в данном документе.

[037] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ снижения темпов роста опухоли у животного, отличного от человека, при этом способ включает стадии введения лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческий PD-1, животному, отличному от человека, геном которого содержит ген Pdcd1, который кодирует полипептид PD-1, имеющий человеческую часть и эндогенную часть, причем эти части функционально связаны с промотором Pdcd1 грызуна; при этом введение осуществляют в условиях и в течение времени, достаточных для снижения темпов роста опухоли у животного, отличного от человека.

[038] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ уничтожения опухолевых клеток у животного, отличного от человека, при этом способ включает стадии введения лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческий PD-1, животному, отличному от человека, геном которого содержит ген Pdcd1, который кодирует полипептид PD-1, имеющий человеческую часть и эндогенную часть, причем эти части функционально связаны с промотором Pdcd1 грызуна; при этом введение осуществляют в условиях и в течение времени, достаточных для того, чтобы лекарственное средство опосредовало уничтожение опухолевых клеток у животного, отличного от человека.

[039] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ оценки фармакокинетических свойств лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческий PD-1, при этом способ включает стадии введения лекарственного средства животному, отличному от человека, геном которого содержит ген Pdcd1, который кодирует полипептид PD-1, имеющий человеческую часть и эндогенную часть, причем эти части функционально связаны с промотором Pdcd1 грызуна; и проведения анализа для определения одного или более фармакокинетических свойств лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческий PD-1.

[040] Во многих вариантах осуществления животное, отличное от человека, описанное в данном документе, представляет собой грызуна, геном которого включает в себя ген Pdcd1, который кодирует полипептид PD-1, имеющий человеческую часть и эндогенную часть, причем эти части функционально связаны с промотором Pdcd1 грызуна. Во многих вариантах осуществления промотор Pdcd1 грызуна представляет собой эндогенный промотор Pdcd1 грызуна. Во многих вариантах осуществления человеческая часть содержит аминокислоты 35-145, 27- 145, 27-169, 26-169 или 21-170 человеческого полипептида PD-1.

[041] В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на человеческий PD-1, представляет собой антагонист PD-1. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на человеческий PD-1, представляет собой агонист PD-1. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на человеческий PD-1, представляет собой антитело к PD-1. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на человеческий PD-1, вводят внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно.

[042] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает модель опухоли на животных, отличных от человека, в которой животное, отличное от человека, экспрессирует полипептид PD-1, содержащий человеческую часть и эндогенную часть.

[043] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает модель опухоли на животных, отличных от человека, в которой животное, отличное от человека, имеет геном, содержащий ген Pdcd1, который содержит эндогенную часть и человеческую часть, где эндогенная и человеческая части функционально связаны с промотором Pdcd1 животного, отличного от человека.

[044] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает модель опухоли на животных, отличных от человека, получаемую путем (a) обеспечения животного, отличного от человека, геном которого содержит ген Pdcd1, который включает в себя эндогенную часть и человеческую часть, причем эти эндогенная и человеческая части функционально связаны с промотором Pdcd1 животного, отличного от человека; и (b) имплантирования одной или более опухолевых клеток грызуну из стадии (a) с обеспечением таким образом указанной модели опухоли на животных, отличных от человека.

[045] В некоторых вариантах осуществления модель опухоли на животных, отличных от человека, по настоящему изобретению представляет собой модель опухоли на грызунах. В некоторых вариантах осуществления промотор Pdcd1 животного, отличного от человека, представляет собой промотор Pdcd1 грызуна.

[046] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации или валидации лекарственного средства или вакцины, при этом способ включает стадии доставки лекарственного средства или вакцины животному, отличному от человека, геном которого включает в себя ген Pdcd1, который кодирует полипептид PD-1, причем полипептид PD-1 содержит человеческую часть и эндогенную часть, и мониторинга одного или более из иммунного ответа на лекарственное средство или вакцину, профиля безопасности лекарственного средства или вакцины или эффекта в отношении заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления мониторинг профиля безопасности включает определение того, проявляется ли у животного, отличного от человека, побочный эффект или нежелательная реакция в результате доставки лекарственного средства или вакцины. В некоторых вариантах осуществления побочный эффект или нежелательная реакция выбраны из заболеваемости, смертности, изменения массы тела, изменения уровня одного или более ферментов (например, печеночных), изменения массы одного или более органов, потери функции (например, сенсорной, двигательной, функции органов и т.д.), повышенной восприимчивости к одному или более заболеваниям, изменений в геноме животного, отличного от человека, увеличения или уменьшения потребления пищи и осложнений одного или более заболеваний. В некоторых вариантах осуществления у животного, отличного от человека, индуцируют заболевание, нарушение или состояние. В некоторых вариантах осуществления заболевание, нарушение или состояние, индуцируемое у животного, отличного от человека, ассоциировано с заболеванием, нарушением или состоянием, от которого страдают один или более пациентов-людей, нуждающихся в лечении. В некоторых определенных вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой антитело.

[047] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение животного, отличного от человека, описанного в данном документе, в разработке лекарственного средства или вакцины для применения в медицине, такого как применение в качестве лекарственного препарата.

[048] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает применение животного, отличного от человека, описанного в данном документе, в производстве лекарственного препарата для лечения рака, новообразования, инфекционного заболевания, воспалительного заболевания, нарушения или состояния или аутоиммунного заболевания, нарушения или состояния.

[049] В различных вариантах осуществления ген Pdcd1 по настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, описанный в данном документе. В различных вариантах осуществления ген Pdcd1 по настоящему изобретению кодирует полипептид PD-1, имеющий человеческую часть и эндогенную часть, причем эти части функционально связаны с промотором Pdcd1 грызуна. В различных вариантах осуществления промотор грызуна представляет собой эндогенный промотор грызуна. В различных вариантах осуществления человеческая часть содержит экзон 2 человеческого Pdcd1. В различных вариантах осуществления человеческая часть содержит экзон 2 человеческого Pdcd1 и дополнительно содержит полный или неполный экзон 3 человеческого Pdcd1.

[050] В различных вариантах осуществления полипептид PD-1 по настоящему изобретению включает в себя полипептид PD-1, описанный в данном документе. В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению не характеризуется выявляемой экспрессией эндогенного полноразмерного полипептида PD-1, отличного от человеческого. В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению не характеризуется выявляемой экспрессией внеклеточной части эндогенного полипептида PD-1. В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению не характеризуется выявляемой экспрессией N-концевого иммуноглобулинового V-домена эндогенного полипептида PD-1.

[051] В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой грызуна; в некоторых вариантах осуществления мышь; в некоторых вариантах осуществления крысу. В некоторых вариантах осуществления мышь по настоящему изобретению выбрана из группы, включающей линию 129, линию BALB/C, линию C57BL/6 и линию смешанного происхождения 129×C57BL/6; в некоторых определенных вариантах осуществления 50% 129 и 50% C57BL/6; в некоторых определенных вариантах осуществления 25% 129 и 75% C57BL/6.

[052] Используемые в данной заявке термины «приблизительно» и «примерно» используются в качестве эквивалентов. Предполагается, что все числа, используемые в данной заявке, вместе с термином «приблизительно/примерно» или без него охватывают любые нормальные отклонения, понятные специалисту в соответствующей области.

[053] Другие признаки, цели и преимущества настоящего изобретения очевидны из нижеследующего подробного описания определенных вариантов осуществления. Следует, однако, понимать, что подробное описание, хоть и указывает на определенные варианты осуществления настоящего изобретения, приведено только в целях иллюстрации, а не ограничения. Различные изменения и модификации в пределах объема настоящего изобретения станут очевидными специалистам в данной области из подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[054] Графические материалы, включенные в данный документ, которые содержат следующие фигуры, приведены только в иллюстративных целях, а не для ограничения.

[055] На фигуре 1 показана схема геномной организации отличного от человеческого (например, мышиного) и человеческого генов 1 запрограммированной гибели клеток (Pdcd1) без соблюдения масштаба. Номера экзонов и нетранслируемых областей (UTR) приведены под каждым экзоном и над каждой UTR.

[056] На фигуре 2 показана схема иллюстративного способа гуманизации гена 1 запрограммированной гибели клеток (Pdcd1), отличного от человеческого, без соблюдения масштаба. Выбранные места сочленения нуклеотидов отмечены линией ниже каждого сочленения. Последовательности этих выбранных сочленений нуклеотидов указаны по SEQ ID NO.

[057] На фигуре 3 показана схема геномной организации мышиного и человеческого генов 1 запрограммированной гибели клеток (Pdcd1) без соблюдения масштаба, на которой указаны примерные местоположения зондов, применяемых в анализе, описанном в примере 1.

[058] На фигуре 4 показаны иллюстративные гистограммы для Т-клеток, гейтированных по CD19 и CD8, выделенных из мыши дикого типа и мыши, гетерозиготной по гуманизированному эндогенному гену Pdcd1, описанному в примере 1, которые экспрессируют мышиный и/или гуманизированный PD-1. Указаны стимулированные и нестимулированные популяции клеток, равно как и клетки, окрашенные изотипическим контролем.

[059] На фигуре 5 показаны иллюстративные кривые роста опухоли в течение 21 дня у мышей, гомозиготных по гуманизированному эндогенному гену Pdcd1, описанному в примере 1. Контроль: антитело, не специфичное к PD-1, Ab α-hPD-1: антитело, специфичное к человеческому PD-1. Стрелки указывают на дни обработки антителами. Для каждой группы обработки показано количество безопухолевых мышей в день 21.

[060] На фигуре 6 показан иллюстративный ПЦР-анализ в режиме реального времени экспрессии мРНК CD8b, CD3, IFN-g и PD-1 в селезенках мышей, гомозиготных по гуманизированному эндогенному гену Pdcd1, описанному в примере 1, после обработки антителом к PD-1. А - средние значения для пяти мышей на группу. В - уровни экспрессии у отдельных мышей в каждой группе обработки. Контроль: антитело, не специфичное к PD-1; α-PD-1: антитело к PD-1.

[061] На фигуре 7 показаны иллюстративные кривые роста опухоли в течение 60 дней у мышей, гомозиготных по гуманизированному эндогенному гену Pdcd1, описанному в примере 1, которым вводили 0,3-25 мг/кг антитела к hPD-1 или 25 мг/кг контрольного антитела (антитела, не специфичного к PD-1). Стрелки указывают на дни обработки антителами. Для каждой группы обработки показано количество безопухолевых мышей в день 60.

[062] На фигуре 8 представлены иллюстративные последовательности мышиных, человеческих и гуманизированных Pdcd1 и PD-1, а также иллюстративная последовательность человеческой нуклеиновой кислоты для гуманизации гена Pdcd1, отличного от человеческого. В последовательностях мРНК кодирующая последовательность указана жирным шрифтом, а последовательные экзоны в случаях, когда они указаны, разделены чередующимся подчеркнутым текстом; в гуманизированных последовательностях мРНК человеческие последовательности заключены в круглые скобки. В белковых последовательностях сигнальные пептиды подчеркнуты, внеклеточные последовательности выделены жирным шрифтом, последовательности иммуноглобулиновых V-доменов заключены в круглые скобки, и внутриклеточные последовательности выделены курсивом; а в гуманизированных белковых последовательностях последовательности, отличные от человеческих, указаны обычным шрифтом, а человеческие последовательности указаны жирным шрифтом.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[063] Настоящее изобретение не ограничено конкретными способами и условиями эксперимента, описанными в данном документе, поскольку такие способы и условия могут изменяться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена быть ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения определяется формулой изобретения.

[064] Если не определено иное, все термины и фразы, используемые в данном документе, имеют значения, которые данные термины и фразы приобрели в данной области, если в контексте, в котором используется термин или фраза, четко не указано или четко не видно противоположное. Хотя при практическом осуществлении или испытании настоящего изобретения можно применять любые способы и материалы, сходные с описанными в данном документе или эквивалентные им, в данном документе описаны только конкретные способы и материалы. Все публикации, упомянутые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки.

[065] Термин «примерно», применяемый в данном документе в отношении одного или более значений, представляющих интерес, относится к значению, сходному с указанным эталонным значением. В некоторых вариантах осуществления термин «примерно» или «приблизительно» относится к диапазону значений, находящихся в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в любую сторону (большую или меньшую) от указанного эталонного значения, если иное не указано или иное не очевидно из контекста (за исключением случаев, в которых такое число будет превышать 100% от возможного значения).

[066] Термин «биологически активный» включает характеристику любого средства, обладающего активностью в биологической системе in vitro или in vivo (например, в организме). Например, средство, которое в случае присутствия в организме обладает биологическим эффектом в этом организме, считается биологически активным. В конкретных вариантах осуществления, в которых белок или полипептид является биологически активным, часть этого белка или полипептида, обладающая по меньшей мере одним общим с данным белком или полипептидом видом биологической активности, обычно называется «биологически активной» частью.

[067] Термин «сравнимый» включает два или более средств, объектов, положений, наборов условий и т.д., которые могут не быть идентичными друг другу, но которые являются достаточно сходными для обеспечения возможности сравнения между ними, так что на основании наблюдаемых различий или сходств можно сделать разумные выводы. Среднему специалисту в данной области будет понятно по контексту, какая степень идентичности необходима в любых заданных обстоятельствах для двух или более таких средств, объектов, ситуаций, наборов условий и т.д., чтобы считать их сравнимыми.

[068] Термин «консервативный», например, как в случае консервативной аминокислотной замены, включает замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим R-группу боковой цепи со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Как правило, консервативная аминокислотная замена практически не будет изменять функциональные свойства белка, представляющие интерес, например, способность рецептора связываться с лигандом. Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают: алифатические боковые цепи, такие как у глицина, аланина, валина, лейцина и изолейцина; алифатические боковые цепи с гидроксильными группами, такие как у серина и треонина; амидосодержащие боковые цепи, такие как у аспарагина и глутамина; ароматические боковые цепи, такие как у фенилаланина, тирозина и триптофана; основные боковые цепи, такие как у лизина, аргинина и гистидина; кислые боковые цепи, такие как у аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты; и серосодержащие боковые цепи, такие как у цистеина и метионина. Группы консервативных аминокислотных замен включают, например, валин/лейцин/изолейцин, фенилаланин/тирозин, лизин/аргинин, аланин/валин, глутамат/аспартат и аспарагин/глутамин. В некоторых вариантах осуществления консервативная аминокислотная замена может представлять собой замену любого нативного остатка в белке аланином, применяемую, например, в аланин-сканирующем мутагенезе. В некоторых вариантах осуществления проводят консервативную замену, которая имеет положительное значение в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45, включенной в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления замена представляет собой умеренно консервативную замену, где замена имеет неотрицательное значение в матрице логарифмической функции правдоподобия РАМ250.

[069] Термин «контроль» имеет понятное в данное области значение «контроля», подразумевающее стандарт, с которым сравнивают результаты. Как правило, контроли применяют для повышения целостности в экспериментах путем разделения переменных для того, чтобы сделать вывод об этих переменных. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой реакцию или анализ, проводимые одновременно с тестовыми реакцией или анализом для обеспечения объекта сравнения. Как используется в данном документе, «контроль» может включать «контрольное животное». «Контрольное животное» может иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, отличную от описанной в данном документе, или не иметь модификации (т.е. в случае животного дикого типа). В одном эксперименте применяют «тест» (т.е. тестируемую переменную). Во втором, «контрольном», эксперименте тестируемую переменную не применяют. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой исторический контроль (т.е. тест или анализ, проведенный ранее, или количество или результат, известные заранее). В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой или включает напечатанную или иным образом сохраненную запись. Контроль может представлять собой положительный контроль или отрицательный контроль.

[070] Термин «разрушение» включает результат события гомологичной рекомбинации с молекулой ДНК (например, с эндогенной гомологичной последовательностью, такой как ген или локус гена). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к вставке, делеции, замене, замещению, миссенс-мутации или сдвигу рамки считывания в последовательности (последовательностях) ДНК или любой их комбинации или может быть представлено таковыми. Вставки могут включать вставку целых генов или фрагментов генов, например, экзонов, которые могут иметь происхождение, отличное от такого происхождения для эндогенной последовательности (например, гетерологичной последовательности). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к повышению экспрессии и/или активности гена или продукта гена (например, белка, кодируемого геном). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к снижению экспрессии и/или активности гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к изменению последовательности гена или кодируемого продукта гена (например, кодируемого белка). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к усечению или фрагментации гена или кодируемого продукта гена (например, кодируемого белка). В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к удлинению гена или кодируемого продукта гена; в некоторых таких вариантах осуществления разрушение может приводить к сборке белка слияния. В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к изменению уровня экспрессии, но не активности гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может приводить к изменению активности, но не уровня экспрессии гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может не оказывать значительный эффект на уровень экспрессии гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может не оказывать значительный эффект на активность гена или продукта гена. В некоторых вариантах осуществления разрушение может не оказывать значительный эффект ни на уровень экспрессии, ни на активность гена или продукта гена.

[071] Термины «определение», «измерение», «установление», «оценка», «анализ» и «анализирование» используются взаимозаменяемо для обозначения любой формы измерения и включают определения присутствия или отсутствия элемента. Эти термины включают количественные, а также и/или качественные определения. Анализ может быть относительным или абсолютным. «Анализ на наличие» может представлять собой определение количества чего-либо присутствующего и/или определение того, присутствует или отсутствует ли оно.

[072] Термин «режим дозирования» или «терапевтический режим» включает набор разовых доз, в некоторых вариантах осуществления более одной, которые вводят субъекту по отдельности, обычно с разделением периодами времени. В некоторых вариантах осуществления указанное терапевтическое средство характеризуется рекомендованным режимом дозирования, который может предусматривать одну или более доз. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает множество доз, каждая из которых отделена от другой временным периодом одной и той же длины; в некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает множество доз и по меньшей мере два неодинаковых временных периода, разделяющих отдельные дозы.

[073] Фраза «эндогенный локус» или «эндогенный ген» включает генный локус, обнаруживаемый в родительском или эталонном организме. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус имеет последовательность, обнаруживаемую в природе. В некоторых вариантах осуществления эндогенный локус представляет собой локус дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой организм дикого типа. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой организм, полученный с помощью генной инженерии. В некоторых вариантах осуществления эталонный организм представляет собой организм, выведенный в лаборатории (дикого типа либо полученный с помощью генной инженерии).

[074] Фраза «эндогенный промотор» включает промотор, связанный в естественных условиях, например, в организме дикого типа, с эндогенным геном.

[075] Термин «гетерологичный» включает средство или объект из другого источника. Например, при использовании по отношению к полипептиду, гену или продукту гена, присутствующему в конкретной клетке или организме, данный термин поясняет, что соответствующий полипептид, ген или продукт гена: 1) был сконструирован человеком; 2) был введен в клетку или организм (или их предшественник) руками человека (например, посредством генной инженерии) и/или 3) в естественных условиях не продуцируется соответствующими клеткой или организмом (например, соответствующим типом клетки или типом организма) или не присутствует в них.

[076] Термин «клетка-хозяин» включает клетку, в которую были введены гетерологичные (например, экзогенные) нуклеиновая кислота или белок. Специалистам в данной области при прочтении данного раскрытия будет понятно, что такие термины относятся не только к конкретной рассматриваемой клетке, но также используются для обозначения потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях вследствие влияния мутаций или окружающей среды могут происходить определенные модификации, такое потомство в действительности может не быть идентичным родительской клетке, но по-прежнему включается в объем термина «клетка-хозяин». В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой или включает прокариотическую или эукариотическую клетку. Как правило, клетка-хозяин представляет собой любую клетку, подходящую для приема и/или продуцирования гетерологичных нуклеиновой кислоты или белка, независимо от того, к какому царству живой природы относится клетка. Иллюстративные клетки включают клетки прокариот и эукариот (одноклеточных или многоклеточных), бактериальные клетки (например, штаммы Е. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. и т.д.), клетки микобактерий, клетки грибов, клетки дрожжей (например, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica и т.д.), растительные клетки, клетки насекомых (например, SF-9, SF-21, клетки насекомых, зараженные бакуловирусами, Trichoplusia ni и т.д.), клетки животных, отличных от человека, клетки человека или продукты слияния клеток, такие как, например, гибридомы или квадромы. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой клетку человека, обезьяны, человекообразной обезьяны, хомяка, крысы или мыши. В некоторых вариантах осуществления клетка является эукариотической и выбрана из следующих клеток: СНО (например, СНО K1, DXB-11 СНО, Veggie-CHO), COS (например, COS-7), клетки сетчатки, Vero, CV1, клетки почки (например, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, НВ 8065, HL-60 (например, BHK21), Jurkat, Daudi, А431 (эпидермальной), CV-1, U937, 3Т3, L-клетки, клетки С127, SP2/0, NS-0, ММТ 060562, клетки Сертоли, клетки BRL 3А, клетки НТ1080, клетки миеломы, опухолевой клетки и линии клеток, происходящей из вышеупомянутых клеток. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит один или более вирусных генов, например, клетка сетчатки, которая экспрессирует вирусный ген (например, клетка PER.C6™). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой или включает выделенную клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой часть ткани. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой часть организма.

[077] Термин «гуманизированный» включает нуклеиновые кислоты или белки, структуры (т.е. нуклеотидные или аминокислотные последовательности) которых включают части, практически соответствующие или идентичные структурам конкретного гена или белка, обнаруживаемого в природе у животного, отличного от человека, а также включают части, отличающиеся от обнаруживаемых в соответствующем конкретном гене или белке, отличном от человеческого, и вместо этого более близко соответствующие сравнимым структурам, обнаруживаемым в соответствующем человеческом гене или белке. В некоторых вариантах осуществления «гуманизированный» ген представляет собой ген, который кодирует полипептид, имеющий практически такую же аминокислотную последовательность, как у человеческого полипептида (например, у человеческого белка или его части - например, у его характерной части). В виде лишь одного примера, в случае мембранного рецептора «гуманизированный» ген может кодировать полипептид, имеющий внеклеточную часть, имеющую полностью или частично такую же аминокислотную последовательность, как у человеческой внеклеточной части, и такую же остальную часть последовательности, как у полипептида, отличного от человеческого (например, мышиного). В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген содержит по меньшей мере часть последовательности ДНК человеческого гена. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген содержит всю последовательность ДНК человеческого гена. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок содержит последовательность, имеющую часть, представленную в человеческом белке. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный белок содержит всю последовательность человеческого белка и экспрессируется с эндогенного локуса животного, отличного от человека, который соответствует гомологу или ортологу человеческого гена.

[078J Термин «идентичность», как, например, применительно к сравнению последовательностей, включает идентичность, определяемую с помощью ряда различных алгоритмов, известных из уровня техники, которые можно применять для измерения идентичности нуклеотидных и/или аминокислотных последовательностей. В некоторых вариантах осуществления значения идентичности, описанные в данном документе, определяют с применением выравнивания ClustalW v. 1.83 (медленного), в котором используются штраф за открытие гэпа 10,0, штраф за продление гэпа 0,1, а также с применением матрицы подобия Gonnet (MACVECTOR™ 10.0.2, Mac Vector Inc., 2008).

[079] Термин «выделенный» включает вещество и/или объект, которые были (1) отделены от по меньшей мере некоторых компонентов, с которыми они были связаны при первоначальном продуцировании (будь то в природе и/или в условиях проведения эксперимента), и/или (2) разработаны, продуцированы, получены и/или произведены руками человека. Выделенные вещества и/или объекты могут быть отделены от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99% других компонентов, с которыми они были изначально связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные средства являются чистыми на приблизительно 80%, на приблизительно 85%, на приблизительно 90%, на приблизительно 91%, на приблизительно 92%, на приблизительно 93%, на приблизительно 94%, на приблизительно 95%, на приблизительно 96%, на приблизительно 97%, на приблизительно 98%, на приблизительно 99% или более чем на приблизительно 99%. Вещество является «чистым», если оно практически не содержит других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, что будет понятно специалистам в данной области, вещество может по-прежнему считаться «выделенным» или даже «чистым» после объединения с определенными другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или наполнителей (например, с буфером, растворителем, водой и т.д.); в таких вариантах осуществления процент выделения или чистоты вещества рассчитывают без учета таких носителей или наполнителей. В виде лишь одного примера, в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, такой как полипептид или полинуклеотид, встречающийся в природе, считается «выделенным», если: a) он ввиду своего происхождения или источника получения не связан с некоторыми или всеми компонентами, сопровождающими его в его нативном состоянии в природе; b) он практически не содержит других полипептидов или нуклеиновых кислот того же вида от вида, который продуцирует их в природе; или c) он экспрессируется или иным образом связан с компонентами в клетке или другой системе экспрессии, не принадлежащей к виду, который продуцирует его в природе. Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, синтезируемый химическим путем или синтезируемый в клеточной системе, отличной от той, которая продуцирует его в природе, считается «выделенным» полипептидом. В качестве альтернативы или в дополнение, в некоторых вариантах осуществления полипептид, который был подвергнут одной или более методикам очистки, может считаться «выделенным» полипептидом в той степени, в которой он был отделен от других компонентов: a) с которыми он связан в природе и/или b) с которыми он был связан при первоначальном продуцировании.

[080] Фраза «животное, отличное от человека» включает любой позвоночный организм, который не является человеком. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, представляет собой круглоротое, костную рыбу, хрящевую рыбу (например, акулу или ската), земноводное, пресмыкающееся, млекопитающее и птицу. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее, отличное от человека, представляет собой примата, козу, овцу, свинью, собаку, корову или грызуна. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, представляет собой грызуна, такого как крыса или мышь.

[081] Фраза «нуклеиновая кислота» включает любое соединение и/или вещество, включенное или которое может быть включенным в состав олигонуклеотидной цепи. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой соединение и/или вещество, включенное или которое может быть включенным в состав олигонуклеотидной цепи с помощью фосфодиэфирной связи. Как будет очевидно из контекста, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» включает в себя отдельные остатки нуклеиновой кислоты (например, нуклеотиды и/или нуклеозиды); в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» включает в себя олигонуклеотидную цепь, содержащую отдельные остатки нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит РНК; в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой или содержит ДНК. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более остатков природной нуклеиновой кислоты, содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более аналогов нуклеиновой кислоты, содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления аналог нуклеиновой кислоты отличается от «нуклеиновой кислоты» тем, что в нем не используется фосфодиэфирный остов. Например, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой одну или более «пептидных нуклеиновых кислот», которые известны из уровня техники и имеют в остове пептидные связи вместо фосфодиэфирных связей, содержит их или состоит из них, и они считаются находящимися в пределах объема настоящего изобретения. В качестве альтернативы или в дополнение, в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет одну или более фосфотиоатных и/или 5'-N-фосфорамидитных связей вместо фосфодиэфирных связей. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более природных нуклеозидов (например, аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимидин, дезоксигуанозин и дезоксицитидин), содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» представляет собой один или более аналогов нуклеозидов (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, С5-пропинилцитидин, С5-пропинилуридин, 2-аминоаденозин, С5-бромуридин, С5-фторуридин, С5-йодуридин, С5-пропинилуридин, С5-пропинилцитидин, С5-метилцитидин, 2-аминоаденозин, 7-дезазааденозин, 7-дезазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, О(6)-метилгуанин, 2-тиоцитидин, метилированные основания, интеркалированные основания и их комбинации), содержит их или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» содержит один или более модифицированных сахарных остатков (например, 2'-фторрибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) по сравнению с таковыми сахарными остатками в природных нуклеиновых кислотах. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет нуклеотидную последовательность, которая кодирует функциональный продукт гена, такой как РНК или белок. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» включает в себя один или более интронов. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновую кислоту» получают посредством одного или более из выделения из природного источника, ферментативного синтеза путем полимеризации на основе комплементарной матрицы (in vivo или in vitro), воспроизводства в рекомбинантной клетке или системе и химического синтеза. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет длину по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» является однонитевой; в некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» является двухнитевой. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» имеет нуклеотидную последовательность, содержащую по меньшей мере один элемент, который кодирует полипептид, или являющуюся комплементарной по отношению к последовательности, которая кодирует полипептид. В некоторых вариантах осуществления «нуклеиновая кислота» обладает ферментативной активностью.

[082] Фраза «функционально связанный» включает контактное положение, в котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать надлежащим образом. Контролирующая последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается в условиях, совместимых с функционированием контролирующих последовательностей. «Функционально связанные» последовательности включают в себя как последовательности, контролирующие экспрессию, смежные с геном, представляющим интерес, так и последовательности, контролирующие экспрессию, действующие в транс-положении или на некотором расстоянии, осуществляя контроль над геном, представляющим интерес. Термин «последовательность, контролирующая экспрессию» включает полинуклеотидные последовательности, необходимые для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. «Последовательности, контролирующие экспрессию» включают: соответствующие последовательности для инициации и терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; сигналы для эффективного процессинга РНК, такие как сигналы для сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, повышающие эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козак); последовательности, повышающие стабильность белка; и, при необходимости, последовательности, усиливающие секрецию белка. Природа таких контролирующих последовательностей различается в зависимости от организма-хозяина. Например, у прокариот такие контролирующие последовательности обычно включают в себя промотор, сайт связывания рибосом и последовательность для терминации транскрипции, тогда как у эукариот такие контролирующие последовательности обычно включают в себя промоторы и последовательность для терминации транскрипции. Термин «контролирующие последовательности» подразумевает включение компонентов, наличие которых является существенным для экспрессии и процессинга, и также может включать дополнительные компоненты, наличие которых является преимущественным, например, лидерные последовательности и последовательности-партнеры по слиянию.

[083] Термин «пациент» или «субъект» включает любой организм, которому вводят или могут вводить обеспечиваемую композицию, например, для экспериментальных, диагностических, профилактических, косметических и/или терапевтических целей. Типичные пациенты включают животных (например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, приматы, отличные от человека, и/или люди). В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой животное, отличное от человека. В некоторых вариантах осуществления пациент (например, пациент, являющийся животным, отличным от человека) может иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, отличную от описанной в данном документе, или не иметь модификации (т.е. в случае пациента, являющегося животным дикого типа, отличным от человека). В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, страдает от одного или более нарушений или состояний или подвержено им. В некоторых вариантах осуществления у животного, отличного от человека, проявляются один или более симптомов нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления у животного, отличного от человека, было диагностировано одно или более нарушений или состояний.

[084] Термин «полипептид» включает любую полимерную цепь из аминокислот. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, встречающуюся в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, не встречающуюся в природе. В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая содержит части, встречающиеся в природе отдельно друг от друга (т.е. из двух или более различных организмов, например, человеческую и отличную от человеческой части). В некоторых вариантах осуществления полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая является сконструированной в том смысле, что она разработана и/или получена в результате действий человека.

[085] Термин «рекомбинантный» подразумевает включение полипептидов (например, полипептидов PD-1, описанных в данном документе), разрабатываемых, конструируемых, получаемых, экспрессируемых, создаваемых или выделяемых с помощью рекомбинантных способов, таких как полипептиды, экспрессируемые с помощью рекомбинантного вектора экспрессии, вводимого путем трансфекции в клетку-хозяина, полипептиды, выделяемые из комбинаторной библиотеки рекомбинантных человеческих полипептидов (Hoogenboom Н.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy Н., and Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., and Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), антитела, выделяемые из животного (например, мыши), трансгенного по генам человеческих иммуноглобулинов (см., например, Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370; Murphy, A.J., et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Set U.S.A. 111(14):5153-5158), или полипептиды, получаемые, экспрессируемые, создаваемые или выделяемые любыми другими способами, предусматривающими соединение выбранных элементов последовательностей друг с другом. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательностей обнаруживаются в природе. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательностей разрабатывают in silico. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательностей получают в результате мутагенеза (например, in vivo или in vitro) известного элемента последовательности, например, из природного или синтетического источника. Например, в некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид содержит последовательности, обнаруживаемые в геноме организма-источника, представляющего интерес (например, человека, мыши и т.д.). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид имеет аминокислотную последовательность, полученную в результате мутагенеза (например, in vitro или in vivo, например, у животного, отличного от человека), так что аминокислотные последовательности рекомбинантных полипептидов представляют собой последовательности, которые хоть и происходят из последовательностей полипептидов и являются родственными им, но в естественных условиях могут не существовать в геноме животного, отличного от человека, in vivo.

[086] Термин «замещение» включает процесс, посредством которого «замещаемая» последовательность нуклеиновой кислоты (например, ген), обнаруживаемая в локусе хозяина (например, в геноме), удаляется из локуса, а другая, «замещающая», нуклеиновая кислота располагается на ее месте. В некоторых вариантах осуществления последовательность замещаемой нуклеиновой кислоты и последовательности замещаемых нуклеиновых кислот сравнимы друг с другом в том, например, что они являются гомологичными друг другу и/или содержат соответствующие элементы (например, элементы, кодирующие белок, регуляторные элементы и т.д.). В некоторых вариантах осуществления замещаемая последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя один или более из промотора, энхансера, донорного сайта сплайсинга, акцепторного сайта сплайсинга, интрона, экзона, нетранслируемой области (UTR); в некоторых вариантах осуществления замещающая последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя одну или более кодирующих последовательностей. В некоторых вариантах осуществления замещающая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой гомолог замещаемой последовательности нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления замещающая последовательность нуклеиновой кислоты является ортологом замещаемой последовательности. В некоторых вариантах осуществления замещающая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит человеческую последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления, в том числе в тех, в которых замещающая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность человеческой нуклеиновой кислоты, замещаемая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой или содержит последовательность от грызуна (например, мышиную или крысиную последовательность). Последовательность нуклеиновой кислоты, расположенная таким образом, может включать в себя одну или более регуляторных последовательностей, которые являются частью исходной последовательности нуклеиновой кислоты, применяемой для получения последовательности, расположенной таким образом (например, промоторы, энхансеры, 5'- или 3'-концевые нетранслируемые области и т.д.). Например, в различных вариантах осуществления замещение представляет собой замену эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью, что приводит к продуцированию продукта гена на последовательности нуклеиновой кислоты, расположенной таким образом (содержащей гетерологичную последовательность), но не к экспрессии с эндогенной последовательности; эндогенная геномная последовательность замещается последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, имеющий функцию, сходную с таковой у полипептида, кодируемого эндогенной последовательностью (например, эндогенная геномная последовательность кодирует полипептид PD-1, а фрагмент ДНК кодирует один или более человеческих полипептидов PD-1). В различных вариантах осуществления эндогенный ген или его фрагмент замещают соответствующим человеческим геном или его фрагментом. Соответствующий человеческий ген или его фрагмент представляет собой человеческий ген или его фрагмент, который является ортологом замещаемого эндогенного гена или его фрагмента или практически сходным или одинаковым с ним по структуре и/или функции.

[087] Фраза «белок 1 запрограммированной гибели клеток» или «белок PD-1» включает трансмембранный белок I типа, принадлежащий к семейству CD28/CTLA-4 регуляторов Т-клеток. Белковая структура белка PD-1 включает внеклеточный аминоконцевой иммуноглобулиновый V-домен, трансмембранный домен и карбоксиконцевой внутриклеточный «хвост», причем этот внутриклеточный «хвост» содержит иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM) и иммунорецепторный тирозиновый переключающий мотив. PD-1 экспрессируется на клеточной поверхности и взаимодействует с PD-L1 и PD-L2, представителями семейства В7 иммунорегуляторных лигандов (Collins, М. et al. (2005) Genome Biol. 6:223). PD-1 экспрессируется, помимо прочего, в активированных Т-клетках, В-клетках, макрофагах, моноцитах, тучных клетках, а также во многих опухолях. Было показано, что PD-1 участвует в отрицательной регуляции иммунного ответа и, в частности, в отрицательной регуляции Т-клеточных ответов. В качестве иллюстрации, нуклеотидные и аминокислотные последовательности мышиного и человеческого генов Pdcd1, которые кодируют белки PD-1, приведены на фигуре 8. Специалистам в данной области при прочтении данного описания будет понятно, что один или более эндогенных генов Pdcd1 в геноме (или их все) можно заместить одним или более гетерологичными генами Pdcd1 (например, полиморфными вариантами, подтипами или мутантными формами, генами из других видов, гуманизированными формами и т.д.).

[088] «Клетка, экспрессирующая PD-1» включает клетку, которая экспрессирует мембранный белок PD-1 I типа. В некоторых вариантах осуществления клетка, экспрессирующая PD-1, экспрессирует мембранный белок PD-1 I типа на своей поверхности. В некоторых вариантах осуществления белок PD-1 экспрессируется на поверхности клетки в количестве, достаточном для опосредования межклеточных взаимодействий. Иллюстративные клетки, экспрессирующие PD-1, включают В-клетки, макрофаги и Т-клетки. Клетки, экспрессирующие PD-1, регулируют различные клеточные процессы посредством взаимодействия с PD-1, экспрессируемым на поверхности иммунных клеток (например, Т- и В-клеток), и играют роль в определении дифференцировки и судьбы таких клеток. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению демонстрируют регуляцию различных клеточных процессов (описанных в данном документе) с помощью гуманизированных белков PD-1, экспрессируемых на поверхности одной или более клеток животного, отличного от человека. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению демонстрируют отрицательную регуляцию передачи сигналов через Т-клеточные рецепторы (TCR) с помощью гуманизированных белков PD-1, экспрессируемых на поверхности одной или более клеток животного, отличного от человека. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, демонстрируют отрицательную регуляцию иммунных ответов с помощью гуманизированных белков PD-1, экспрессируемых на поверхности одной или более клеток животного, отличного от человека.

[089] Термин «эталон» включает стандартные или контрольные средство, группу, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение, с которыми сравнивают средство, животное, группу, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение, представляющие интерес. В некоторых вариантах осуществления эталонные средство, группу, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение тестируют и/или определяют практически одновременно с тестированием или определением средства, группы, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения, представляющих интерес. В некоторых вариантах осуществления эталонные средство, группа, индивидуум, популяция, образец, последовательность или значение представляют собой исторический эталон, необязательно воплощенный в материальной форме. В некоторых вариантах осуществления эталон может относиться к контролю. Используемый в данном документе, термин «эталон» может включать «эталонное животное». «Эталонное животное» может иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, отличную от описанной в данном документе, или не иметь модификации (т.е. в случае животного дикого типа). Как будет понятно специалисту в данной области, эталонные средство, животное, группу, индивидуум, популяцию, образец, последовательность или значение обычно определяют или характеризуют в условиях, сравнимых с условиями, используемыми для определения или получения характеристик средства, животного (например, млекопитающего), группы, индивидуума, популяции, образца, последовательности или значения, представляющих интерес.

[090] Выражение «практически» включает качественное состояние проявления полной или почти полной меры или степени выраженности характеристики или свойства, представляющих интерес. Специалисту в области биологии будет понятно, что биологические и химические явления редко, если это вообще происходит, продолжаются до окончания и/или протекают до завершения или достижения или избегания абсолютного результата. Таким образом, термин «практически» используется в данном документе для охвата потенциального отсутствия завершенности, присущего многим биологическим и химическим явлениям.

[091] Фраза «практически гомологичный» включает сравнение между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот. Как будет понятно специалисту в данной области, две последовательности обычно считаются «практически гомологичными», если они содержат гомологичные остатки в соответствующих положениях. Гомологичные остатки могут являться идентичными остатками. В качестве альтернативы, гомологичные остатки могут являться неидентичными остатками с соответствующими сходными структурными и/или функциональными характеристиками. Например, как хорошо известно специалистам в данной области, определенные аминокислоты обычно классифицируют как «гидрофобные» или «гидрофильные» аминокислоты и/или как имеющие «полярные» или «неполярные» боковые цепи. Замена одной аминокислоты другой того же типа часто может считаться «гомологичной» заменой. Типичные виды распределения аминокислот по категориям обобщены в таблицах 1 и 2.

[092] Как хорошо известно из уровня техники, аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот можно сравнивать с помощью любого из разнообразных алгоритмов, в том числе алгоритмов, доступных в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, BLAST с гэпами и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Такие иллюстративные программы описаны в Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul et al. (1997) Methods in Enzymology; Altschul et al., «Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs», Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis et al. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; и Misener et al. (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. В дополнение к идентификации гомологичных последовательностей, программы, упомянутые выше, обычно выдают показатель степени гомологии. В некоторых вариантах осуществления две последовательности считаются практически гомологичными, если по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 91%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков являются гомологичными на протяжении рассматриваемого фрагмента из остатков. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент представляет собой полную последовательность. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или более остатков. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент включает смежные остатки вдоль полной последовательности. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент включает прерывисто расположенные остатки вдоль полной последовательности. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.

[093] Фраза «практически идентичный» включает сравнение между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот. Как будет понятно специалисту в данной области, две последовательности обычно считаются «практически идентичными», если они содержат идентичные остатки в соответствующих положениях. Как хорошо известно из уровня техники, аминокислотные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот можно сравнивать с помощью любого из разнообразных алгоритмов, в том числе алгоритмов, доступных в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для нуклеотидных последовательностей и BLASTP, BLAST с гэпами и PSI-BLAST для аминокислотных последовательностей. Такие иллюстративные программы описаны в Altschul et al. (1990) Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul et al., Methods in Enzymology; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis et al. (1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; и Misener et al., (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. В дополнение к идентифицированию идентичных последовательностей, программы, упомянутые выше, обычно выдают показатель степени идентичности. В некоторых вариантах осуществления две последовательности считаются практически идентичными, если по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более их соответствующих остатков являются идентичными на протяжении рассматриваемого фрагмента из остатков. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент представляет собой полную последовательность. В некоторых вариантах осуществления рассматриваемый фрагмент содержит по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более остатков.

[094] Фраза «целенаправленно воздействующий вектор» или «целенаправленно воздействующая конструкция» включает молекулу полинуклеотида, содержащую область для целенаправленного воздействия. Область для направленного воздействия содержит последовательность, идентичную или практически идентичную последовательности в целевых клетке, ткани или животном, и обеспечивает интеграцию целенаправленно воздействующей конструкции в положение в геноме клетки, ткани или животного посредством гомологичной рекомбинации. Также включены области для целенаправленного воздействия, на которые целенаправленно воздействуют с помощью сайтов для распознавания сайт-специфической рекомбиназы (например, сайтов loxP или Frt). В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующая конструкция по настоящему изобретению дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты или ген, представляющие особенный интерес, селективный маркер, контрольные и/или регуляторные последовательности, а также другие последовательности нуклеиновых кислот, обеспечивающие возможность рекомбинации, опосредованной добавлением экзогенных белков, которые способствуют или содействуют рекомбинации с участием таких последовательностей. В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующая конструкция по настоящему изобретению дополнительно содержит полный или неполный ген, представляющий интерес, где ген, представляющий интерес, представляет собой гетерологичный ген, который кодирует полный или неполный белок, имеющий функцию, сходную с таковой у белка, кодируемого эндогенной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления целенаправленно воздействующая конструкция по настоящему изобретению дополнительно содержит гуманизированный полный или неполный ген, представляющий интерес, где гуманизированный ген, представляющий интерес, кодирует полный или неполный белок, имеющий функцию, сходную с таковой функцией у белка, кодируемого эндогенной последовательностью.

[095] Выражение «терапевтически эффективное количество» включает количество, которое приводит к требуемому эффекту, ради которого его вводят. В некоторых вариантах осуществления данный термин относится к количеству, которое при введении субъекту (например, животному), страдающему от заболевания, нарушения и/или состояния или подверженному ему, в соответствии с терапевтическим режимом дозирования является достаточным для лечения заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективным является количество, обуславливающее уменьшение частоты возникновения и/или тяжести и/или задержку начала проявления одного или более симптомов заболевания, нарушения и/или состояния. Специалистам в данной области будет понятно, что термин «терапевтически эффективное количество» в действительности не требует достижения успешного лечения конкретного индивидуума. Терапевтически эффективное количество скорее может представлять собой такое количество, которое обеспечивает конкретный требуемый фармакологический ответ у значительного количества субъектов при введении субъектам, нуждающимся в таком лечении. В некоторых вариантах осуществления ссылка на терапевтически эффективное количество может являться ссылкой на количество, измеренное в одной или более конкретных тканях (например, в ткани, пораженной заболеванием, нарушением или состоянием) или жидкостях (например, в крови, слюне, сыворотке крови, поту, слезной жидкости, моче и т.д.). Специалистам в данной области будет понятно, что в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество конкретного средства или терапевтического препарата можно составлять и/или вводить в одной дозе. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное средство можно составлять и/или вводить во множестве доз, например, в качестве части режима дозирования.

[096] Термин «лечение» (также «лечить» или «осуществлять лечение») в своем самом широком смысле включает введение вещества (например, обеспечиваемых композиций), которое частично или полностью облегчает один или более симптомов, характерных черт и/или причинных факторов конкретного заболевания, нарушения и/или состояние, уменьшает их интенсивность, ослабляет их, подавляет их, задерживает начало их проявления, уменьшает их тяжесть и/или уменьшает частоту их возникновения. В некоторых вариантах осуществления такое лечение можно осуществлять в отношении субъекта, у которого не проявляются признаки соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния, и/или субъекта, у которого проявляются только ранние признаки заболевания, нарушения и/или состояния. В качестве альтернативы или в дополнение, в некоторых вариантах осуществления лечение можно осуществлять в отношении субъекта, у которого проявляются один или более устойчивых признаков соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления лечение можно проводить в отношении субъекта, который при диагностике был определен как страдающий от соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления лечение можно проводить в отношении субъекта, о котором известно, что он имеет один или более факторов восприимчивости, статистически коррелирующих с повышенным риском развития соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния.

[097] Термин «вариант» включает объект, демонстрирующий значительную структурную идентичность с эталонным объектом, но структурно отличающийся от эталонного объекта по наличию или уровню одного или более химических фрагментов по сравнению с эталонным объектом. Во многих вариантах осуществления «вариант» также отличается функционально от своего эталонного объекта. Как правило, то, уместно ли считать конкретный объект «вариантом» эталонного объекта, зависит от степени его структурной идентичности с эталонным объектом. Как будет понятно специалистам в данной области, любой биологический или химический эталонный объект имеет определенные характерные структурные элементы. «Вариант» по определению представляет собой отличающийся химический объект, имеющий один или более общих таких характерных структурных элементов. В виде лишь нескольких примеров, малая молекула может иметь характерный сердцевинный структурный элемент (например, макроциклическую сердцевину) и/или один или более характерных «подвешенных» фрагментов, так что вариант малой молекулы имеет общие с ней сердцевинный структурный элемент и характерные «подвешенные» фрагменты, но отличается по другим «подвешенным» фрагментам и/или по типам связей (одинарные по сравнению с двойными, Е по сравнению с Z и т.д.), присутствующих в сердцевине, полипептид может иметь характерный элемент последовательности, содержащий множество аминокислот, имеющих определенные положения по отношению друг к другу в линейном или трехмерном пространстве и/или способствующих осуществлению конкретной биологической функции, нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, содержащий множество нуклеотидных остатков, имеющих определенные положения по отношению друг к другу в линейном или трехмерном пространстве. Например, «вариант полипептида» может отличаться от эталонного полипептида вследствие одного или более различий в аминокислотной последовательности и/или одного или более различий в химических фрагментах (например, углеводах, липидах и т.д.), прикрепленных ковалентной связью к полипептидному остову. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» демонстрирует общую идентичность последовательности с эталонным полипептидом, составляющую по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. В качестве альтернативы или в дополнение, в некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» не имеет по меньшей мере один характерный элемент последовательности, общий с эталонным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид обладает одним или более видами биологической активности. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» обладает одним или более видами биологической активности, общими с эталонным полипептидом. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» не обладает одним или более видами биологической активности эталонного полипептида. В некоторых вариантах осуществления «вариант полипептида» демонстрирует пониженный уровень одного или более видов биологической активности по сравнению с эталонным полипептидом. Во многих вариантах осуществления полипептид, представляющий интерес, считается «вариантом» исходного или эталонного полипептида, если полипептид, представляющий интерес, имеет аминокислотную последовательность, идентичную такой последовательности у исходной молекулы, за исключением небольшого количества изменений в конкретных положениях в последовательности. У варианта обычно заменены менее 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% остатков по сравнению с исходной молекулой. В некоторых вариантах осуществления «вариант» имеет 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 замененный остаток по сравнению с исходной молекулой. «Вариант» часто имеет очень небольшое количество (например, менее 5, 4, 3, 2 или 1) замененных функциональных остатков (т.е. остатков, принимающих участие в конкретном виде биологической активности). Кроме того, «вариант» обычно имеет не более 5, 4, 3, 2 или 1 добавления или делеции и часто не имеет добавлений или делеций по сравнению с исходной молекулой. Более того, любые добавления или делеции обычно охватывают менее приблизительно 25, приблизительно 20, приблизительно 19, приблизительно 18, приблизительно 17, приблизительно 16, приблизительно 15, приблизительно 14, приблизительно 13, приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6 и зачастую охватывают менее приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3 или приблизительно 2 остатков. В некоторых вариантах осуществления исходный или эталонный полипептид обнаруживается в природе. Как будет понятно специалистам в данной области, множество вариантов конкретного полипептида, представляющего интерес, можно зачастую обнаружить в природе, особенно если полипептид, представляющий интерес, представляет собой возбудитель инфекции в виде полипептида.

[098] Термин «вектор» включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В некоторых вариантах осуществления векторы способны к внехромосомной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они связаны в клетке-хозяине, такой как эукариотическая и/или прокариотическая клетка. Векторы, способные управлять экспрессией функционально связанных генов, называются в данном документе «векторами экспрессии».

[099] Термин «дикий тип» включает объект, обладающий структурой и/или активностью, обнаруживаемой в природе в «нормальном» (в противоположность мутантному, болезненному, измененному и т.д.) состоянии или окружении. Специалистам в данной области будет понятно, что гены и полипептиды дикого типа часто существуют в нескольких различных формах (например, аллелях).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0100] Настоящее изобретение обеспечивает, помимо прочего, улучшенных и/или полученных с помощью генной инженерии животных, отличных от человека, имеющих гуманизированный генетический материал, кодирующий ген 1 запрограммированной гибели клеток (Pdcd1), для определения терапевтической эффективности модуляторов Pdcd1 (например, антитела к PD-1) для лечения рака и анализов Т-клеточных ответов и сигнальной трансдукции. Предполагается, что такие животные, отличные от человека, обеспечивают улучшение определения терапевтической эффективности модуляторов PD-1 и их потенциала в блокировании PD-1. Таким образом, настоящее изобретение особенно применимо для разработки методов терапии с применением антител к PD-1 для лечения различных форм рака, а также для усиления иммунных ответов для лечения и/или устранения вирусной инфекции у животных, отличных от человека. В частности, настоящее изобретение охватывает гуманизацию мышиного гена Pdcd1, приводящую к экспрессии гуманизированного белка PD-1 на поверхности клеток животного, отличного от человека. Такие гуманизированные белки PD-1 обладают способностью обеспечивать источник человеческих PD-1⁺ клеток для определения эффективности стимулирования противоопухолевых иммунных ответов терапевтическими средствами на основе антител к PD-1. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению демонстрируют усиленные иммунные ответы посредством блокады передачи сигналов, опосредованной PD-1, с помощью гуманизированного белка PD-1, экспрессируемого на поверхности клеток животного, отличного от человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные белки PD-1 имеют последовательность, соответствующую полному или неполному N-концевому иммуноглобулиновому V-домену человеческого белка PD-1. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные белки PD-1 имеют последовательность, соответствующую внутриклеточному «хвосту» мышиного белка PD-1; в некоторых вариантах осуществления последовательность, соответствующую трансмембранному домену и внутриклеточному «хвосту» мышиного белка PD-1. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные белки PD-1 имеют последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 21-170 (или 26-169, 27-169, или 27-145, или 35-145) человеческого белка PD-1. В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению содержат эндогенный ген Pdcd1, который содержит генетический материал от животного, отличного от человека, и гетерологичного вида (например, человека). В некоторых вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению содержат гуманизированный ген Pdcd1, где гуманизированный ген Pdcd1 содержит экзон 2 и полный или неполный экзон 3 человеческого гена PDCD1. В некоторых определенных вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению содержат гуманизированный ген Pdcd1, где гуманизированный ген Pdcd1 содержит 883 п.о. человеческого гена PDCD1, соответствующие экзону 2 и первым 71 п.о. экзона 3 (т.е. кодирующие «стволовую» часть) человеческого гена PDCD1.

[0101] Различные аспекты настоящего изобретения подробно описаны в следующих разделах. Использование разделов не подразумевает ограничения настоящего изобретения. Каждый раздел можно применять к любому аспекту настоящего изобретения. В настоящей заявке использование «или» означает «и/или», если не указано иное.

Ген 1 запрограммированной гибели клеток (Pdcd1)

[0102] Pdcd1 (также называемый CD279) был изначально обнаружен в качестве гена с повышенным уровнем экспрессии в Т-клеточной гибридоме, подвергавшейся апоптозу (Ishida, Y. et al. (1992) EMBO J. 11(11):3887-3895). Ген Pdcd1 содержит 5 экзонов, которые кодируют PD-1, представляющий собой мембранный белок I типа (называемый PD-1), который включает в себя N-концевой иммуноглобулиновый V-домен (IgV), «стволовую» часть (длиной ~20 аминокислот), трансмембранный домен и внутриклеточный «хвост», который содержит как иммунорецепторный тирозиновый ингибирующий мотив (ITIM), так и иммунорецепторный тирозиновый переключающий мотив (ITSM). PD-1 экспрессируется на многих типах клеток, таких как, например, В-клетки, дендритные клетки, активированные моноциты, естественные клетки-киллеры (NK) и активированные Т-клетки (Keir, М.Е., et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704). Также сообщалось о различных сплайс-вариантах PD-1, и они различаются в зависимости от того, какой экзон отсутствует (Nielsen, С. et al. (2005) Cell. Immunol. 235:109-116). Более того, наблюдали, что определенные сплайс-варианты являются причинными факторами аутоиммунных заболеваний (Wan, В. et al. (2006) J. Immunol. 177(12):8844-8850). Дополнительно, сообщалось о том, что у мышей с дефицитом Pdcd1 развивались аутоиммунные состояния (Nishimura, Н. et al. (1998) Intern. Immunol. 10(10): 1563-1572; Nishimura, H. et al. (1999) Immunity 11:141-151; Nishimura, H. et al. (2001) Science 291:319-322), что сделало первый шаг к утверждению PD-1 в качестве отрицательного регулятора активированных лимфоцитов, который служит для защиты от развития аутоиммунного заболевания. Что интересно, было обнаружено, что в опухолях используется передача сигналов, опосредованная PD-1, для ускользания от надзора иммунной системы. Таким образом, PD-1 и по меньшей мере один из его лигандов (т.е. PD-L1) в настоящее время изучаются в качестве мишеней для терапии рака путем стимуляции противоопухолевой активности в микросредах опухолей посредством блокады PD-1 (см., например, Pedoeem, A. et al. (2014) Clin. Immunol. 153:145-152; и Philips, G.K. and Atkins, M. (2014) Intern. Immunol. 8 pages).

[0103] Для разработки применимых на практике методов целенаправленно воздействующей терапии для лечения рака в будущем необходимо более обстоятельное и доскональное понимание функций, опосредованных PD-1, и сигнального пути PD-1.

Последовательности Pdcd1 и PD-1

[0104] Иллюстративные мышиные, человеческие и гуманизированные последовательности Pdcd1 и PD-1 представлены на фигуре 8. Иллюстративная последовательность человеческой нуклеиновой кислоты для гуманизации гена Pdcd1, отличного от человеческого, также представлена на фигуре 8.

Животные, отличные от человека, с гуманизированным Pdcd1

[0105] Обеспечиваются животные, отличные от человека, которые экспрессируют гуманизированные белки PD-1 на поверхности клеток животных, отличных от человека, в результате генетической модификации эндогенного локуса (например, локуса Pdcd1), кодирующего белок PD-1, у животного, отличного от человека. Подходящие примеры, описанные в данном документе, включают грызунов, в частности, мышей.

[0106] Гуманизированный ген Pdcd1 в некоторых вариантах осуществления содержит генетический материал от гетерологичного вида (например, человека), где гуманизированный ген Pdcd1 кодирует белок PD-1, который содержит часть, кодируемую генетическим материалом от гетерологичного вида. В некоторых вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 по настоящему изобретению содержит геномную ДНК от гетерологичного вида, которая кодирует внеклеточную часть белка PD-1, экспрессируемого на плазматической мембране клетки. Также обеспечиваются животные, отличные от человека, эмбрионы, клетки и направленные конструкты для получения животных, отличных от человека, эмбрионов, отличных от человеческих, и клеток, содержащих указанный гуманизированный ген Pdcd1.

[0107] В некоторых вариантах осуществления эндогенный ген Pdcd1 подвергают делеции. В некоторых вариантах осуществления эндогенный ген Pdcd1 изменяют, при этом часть эндогенного гена Pdcd1 замещают гетерологичной последовательностью (например, полной или неполной последовательностью человеческого PDCD1). В некоторых вариантах осуществления весь или практически весь эндогенный ген Pdcd1 замещают гетерологичным геном (например, человеческим геном PDCD1). В некоторых вариантах осуществления часть гетерологичного гена Pdcd1 вставляют в эндогенный ген Pdcd1, отличный от человеческого, в эндогенном локусе Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления гетерологичный ген представляет собой человеческий ген. В некоторых вариантах осуществления модификацию или гуманизацию проводят в отношении одной из двух копий эндогенного гена Pdcd1, что приводит к получению животного, отличного от человека, являющегося гетерозиготным относительно гуманизированного гена Pdcd1. В других вариантах осуществления обеспечивают животное, отличное от человека, являющееся гомозиготным по гуманизированному гену Pdcd1.

[0108] В различных аспектах животное, отличное от человека, содержит полный или неполный человеческий ген PDCD1 в эндогенном локусе Pdcd1, отличного от человеческого. Таким образом, такие животные, отличные от человека, могут быть описаны как имеющие гетерологичный ген Pdcd1. Замещенный, вставленный, модифицированный или измененный ген Pdcd1 в эндогенном локусе Pdcd1 или белок, экспрессируемый с такого гена, можно выявить с применением разнообразных способов, включающих, например, ПЦР, вестерн-блоттинг, Саузерн-блоттинг, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP) или анализ приобретения или потери аллеля. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, является гетерозиготным относительно гуманизированного гена Pdcd1.

[0109] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd 1, который имеет второй экзон, имеющий последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную второму экзону, представленному в человеческом гене PDCD1 на фигуре 8.

[0110] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который имеет второй экзон, имеющий последовательность, практически идентичную второму экзону, представленному в человеческом гене PDCD1 на фигуре 8.

[0111] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который имеет второй экзон, имеющий последовательность, идентичную второму экзону, представленному в человеческом гене PDCD1 на фигуре 8.

[0112] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который имеет третий экзон, имеющий последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную третьему экзону, представленному в гуманизированной последовательности мРНК Pdcd1 на фигуре 8.

[0113] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который имеет третий экзон, имеющий последовательность, практически идентичную третьему экзону, представленному в гуманизированной последовательности мРНК Pdcd1 на фигуре 8.

[0114] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который имеет третий экзон, имеющий последовательность, идентичную третьему экзону, представленному в гуманизированной последовательности мРНК Pdcd1 на фигуре 8.

[0115] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который содержит последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23.

[0116] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который содержит последовательность, практически идентичную SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23.

[0117] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который содержит последовательность, идентичную SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23.

[0118] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который имеет второй экзон и часть третьего экзона, каждый из которых имеет последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную второму экзону и части третьего экзона, представленным в человеческом гене PDCD1 на фигуре 8.

[0119] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который имеет первый, четвертый и пятый экзоны, каждый из которых имеет последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную первому, четвертому и пятому экзонам, представленным в мышином гене Pdcd1 на фигуре 8.

[0120] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который имеет первый, часть третьего, четвертый и пятый экзоны, каждый из которых имеет последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную первому, части третьего, четвертому и пятому экзонам, представленным в мышином гене Pdcd1 на фигуре 8.

[0121] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который имеет 5'-концевую нетранслируемую область и 3'-концевую нетранслируемую область, каждая из которых имеет последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную 5'-концевой нетранслируемой области и 3'-концевой нетранслируемой области, представленным в мышином гене Pdcd1 на фигуре 8.

[0122] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению включает в себя ген Pdcd1, который имеет нуклеотидную кодирующую последовательность (например, последовательность кДНК), по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную нуклеотидной кодирующей последовательности, представленной в гуманизированной нуклеотидной кодирующей последовательности Pdcd1 на фигуре 8.

[0123] В различных вариантах осуществления гуманизированная последовательность мРНК Pdcd1 согласно настоящему изобретению содержит последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную гуманизированной последовательности мРНК, представленной на фигуре 8.

[0124] В различных вариантах осуществления гуманизированный ген Pdcd1 согласно настоящему изобретению кодирует полипептид PD-1, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную аминокислотной последовательности, представленной в последовательности полипептида PD-1 на фигуре 8.

[0125] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, имеющую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную внеклеточной части человеческого белка PD-1, представленного на фигуре 8.

[0126] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%о, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную аминокислотным остаткам 21-170, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0127] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, практически идентичную аминокислотным остаткам 21-170, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0128] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотным остаткам 21-170, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0129] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную аминокислотным остаткам 26-169, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0130] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, практически идентичную аминокислотным остаткам 26-169, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0131] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотным остаткам 26-169, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0132] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 91%, 98%о, 99% или более) идентичную аминокислотным остаткам 27-169, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0133] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, практически идентичную аминокислотным остаткам 27-169, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0134] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотным остаткам 27-169, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0135] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную аминокислотным остаткам 27-145, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0136] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, практически идентичную аминокислотным остаткам 27-145, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0137] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотным остаткам 27-145, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0138] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную аминокислотным остаткам 35-145, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0139] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, практически идентичную аминокислотным остаткам 35-145, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0140] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внеклеточную часть, причем эта внеклеточная часть содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотным остаткам 35-145, представленным в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0141] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет N-концевой иммуноглобулиновый V-домен, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную N-концевому иммуноглобулиновому V-домену человеческого или гуманизированного белка PD-1, представленного на фигуре 8.

[0142] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет N-концевой иммуноглобулиновый V-домен, имеющий аминокислотную последовательность, практически идентичную N-концевому иммуноглобулиновому V-домену, представленному в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0143] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет N-концевой иммуноглобулиновый V-домен, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную N-концевому иммуноглобулиновому V-домену, представленному в человеческом или гуманизированном белке PD-1 на фигуре 8.

[0144] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет трансмембранный домен, имеющий последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную трансмембранному домену мышиного белка PD-1, представленного на фигуре 8.

[0145] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет внутриклеточный «хвост», имеющий последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную внутриклеточному «хвосту» мышиного белка PD-1, представленного на фигуре 8.

[0146] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную аминокислотным остаткам 27-169 (или 26-169), представленным в человеческом белке PD-1 на фигуре 8.

[0147] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, практически идентичную аминокислотным остаткам 27-169 (или 26-169), представленным в человеческом белке PD-1 на фигуре 8.

[0148] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотным остаткам 27-169 (или 26-169), представленным в человеческом белке PD-1 на фигуре 8.

[0149] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50% (например, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более) идентичную аминокислотной последовательности гуманизированного белка PD-1, представленного на фигуре 8.

[0150] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, практически идентичную аминокислотной последовательности гуманизированного белка PD-1, представленного на фигуре 8.

[0151] В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, продуцируемый животным, отличным от человека, по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности гуманизированного белка PD-1, представленного на фигуре 8.

[0152] Обеспечиваются композиции и способы для получения животных, отличных от человека, которые экспрессируют гуманизированный белок PD-1, в том числе конкретные полиморфные формы, аллельные варианты (например, с одиночными аминокислотными различиями) или изоформы, полученные в результате альтернативного сплайсинга, включающие композиции и способы для получения животных, отличных от человека, которые экспрессируют такие белки под контролем человеческой промоторной и человеческой регуляторной последовательности. В некоторых вариантах осуществления также обеспечиваются композиции и способы для получения животных, отличных от человека, которые экспрессируют такие белки под контролем эндогенного промотора и эндогенной регуляторной последовательности. В некоторых определенных вариантах осуществления эндогенные промоторы и эндогенные регуляторные последовательности представляют собой эндогенные промоторы грызунов и эндогенные регуляторные последовательности грызунов. Способы включают вставку генетического материала, кодирующего полный или неполный человеческий белок PD-1, в точное местоположение в геноме животного, отличного от человека, которое соответствует эндогенному гену Pdcd1, с созданием таким образом гуманизированного гена Pdcd1, который экспрессирует белок PD-1, являющийся полностью или частично человеческим. В некоторых вариантах осуществления способы включают вставку геномной ДНК, соответствующей экзону 2 и полному или неполному экзону 3 человеческого гена PDCD1, в эндогенный ген Pdcd1 животного, отличного от человека, с созданием таким образом гуманизированного гена, который кодирует белок PD-1, содержащий человеческую часть, содержащую аминокислоты, кодируемые вставленными экзонами.

[0153] При необходимости кодирующую область генетического материала или полинуклеотидной(полинуклеотидных) последовательности(последовательностей), кодирующую полный или неполный человеческий (или гуманизированный) белок PD-1, можно модифицировать с тем, чтобы она включала в себя кодоны, оптимизированные для экспрессии в клетках животного, отличного от человека (см., например, патенты США №№5670356 и 5874304). Кодон-оптимизированные последовательности представляют собой синтетические последовательности и предпочтительно кодируют идентичный полипептид (или биологически активный фрагмент полноразмерного полипептида, обладающий практически такой же активностью, как и полноразмерный полипептид), кодируемый исходным полинуклеотидом, не являющимся кодон-оптимизированным. В некоторых вариантах осуществления кодирующая область генетического материала, кодирующая полный или неполный человеческий (или гуманизированный) белок PD-1, может включать в себя измененную последовательность для оптимизации частоты использования кодонов для конкретного типа клеток (например, клетки грызуна). Например, кодоны геномной ДНК, соответствующие экзону 2 и части экзона 3 (например, 71 п.о.) человеческого гена PDCD1, подлежащим вставке в эндогенный ген Pdcd1 животного, отличного от человека (например, грызуна), можно оптимизировать для экспрессии в клетке животного, отличного от человека. Такая последовательность может быть описана как последовательность, подвергнутая оптимизации кодонов.

[0154] В подходе с гуманизированным геном Pdcd1 используется относительно минимальная модификация эндогенного гена, и это приводит к естественной сигнальной трансдукции, опосредованной PD-1, у животного, отличного от человека, в различных вариантах осуществления, поскольку геномные последовательности Pdcd1 модифицированы в одном фрагменте и поэтому сохраняют нормальные функциональные свойства благодаря включению в себя необходимых регуляторных последовательностей. Таким образом, в таких вариантах осуществления модификация гена Pdcd1 не влияет на другие окружающие гены или другие эндогенные гены, взаимодействующие с Pdcd1 (например, PD-L1, PD-L2 и т.д.). Дополнительно, в различных вариантах осуществления модификация не влияет на сборку функционального трансмембранного белка PD-1 на клеточной мембране и сохраняет нормальные эффекторные функции посредством связывания и последующей сигнальной трансдукции с помощью цитоплазматической части белка, не подвергнутой влиянию модификации.

[0155] Схематическая иллюстрация (без соблюдения масштаба) геномной организации эндогенного мышиного гена Pdcd1 и человеческого гена PDCD1 приведена на фигуре 1. Иллюстративный способ гуманизации эндогенного мышиного гена Pdcd1 с помощью геномного фрагмента, содержащего экзон 2 и часть экзона 3 человеческого гена PDCD1, приведен на фигуре 2. Как проиллюстрировано, фрагмент геномной ДНК размером 883 п.о., содержащий экзон 2 и часть экзона 3 (например, первые 71 п.о.) человеческого гена PDCD1, вставляют на место последовательности локуса эндогенного мышиного гена Pdcd1 размером 900 п.о. с помощью целенаправленно воздействующей конструкции. Фрагмент человеческой ДНК размером 883 п.о. можно клонировать непосредственно из человеческой ДНК или синтезировать из исходной последовательности (например, имеющей № доступа в GenBank NM 005018.2). Эта геномная ДНК включает в себя часть гена, которая кодирует практически всю внеклеточную часть (например, аминокислотные остатки 27-169 или 26-169) человеческого белка PD-1, отвечающую за связывание с лигандом.

[0156] Животное, отличное от человека (например, мышь), имеющее гуманизированный ген Pdcd1 в эндогенном локусе Pdcd1, можно получить любым способом, известным из уровня техники. Например, можно получить целенаправленно воздействующий вектор, с помощью которого вводят полный или неполный человеческий ген Pdcd1 вместе с селективным маркерным геном. На фигуре 2 проиллюстрирован целенаправленно воздействующий вектор, который содержит эндогенный локус Pdcd1 генома мыши, содержащий вставку фрагмента человеческой ДНК размером 883 п.о., который включает в себя экзон 2 и первые 71 п.о. экзона 3 человеческого гена PDCD1. Как проиллюстрировано, целенаправленно воздействующая конструкция содержит 5'-концевое гомологичное плечо, содержащее последовательность выше экзона 2 эндогенного мышиного гена Pdcd1 (~61,7 т.п.о.), за которой расположены кассета для отбора по чувствительности к лекарственному средству (например, ген устойчивости к неомицину, фланкированный с обеих сторон последовательностями loxP; ~5 т.п.о.), фрагмент геномной ДНК, содержащий экзон 2 и первые 71 п.о. экзона 3 человеческого гена Pdcd1 (883 п.о.), а также 3'-концевое гомологичное плечо, содержащее остальную часть последовательности эндогенного мышиного экзона 3 (т.е. часть, которая кодирует трансмембранную часть белка PD-1), экзон 4 и экзон 5 эндогенного мышиного гена Pdcd1 (~84 т.п.о.). Целенаправленно воздействующая конструкция содержит самоудаляющуюся кассету для отбора по чувствительности к лекарственному средству (например, ген устойчивости к неомицину, фланкированный последовательностями loxP; см. патенты США №№8697851, 8518392 и 8354389, все из которых включены в данный документ посредством ссылки). При электропорации в эмбриональных стволовых клетках создают модифицированный эндогенный ген Pdcd1, в котором происходит замена 900 п.о. эндогенного гена Pdcd1 дикого типа на 883 п.о. человеческого гена PDCD1 (т.е. экзон 2 и первые 71 п.о. экзона 3), которые содержатся в целенаправленно воздействующем векторе. Создают гуманизированный ген Pdcd1, что приводит к получению клетки или животного, отличного от человека, которые экспрессируют гуманизированный белок PD-1, содержащий аминокислоты, кодируемые фрагментом человеческой ДНК размером 883 п.о. (т.е. экзоном 2 и 71 п.о. экзона 3 человеческого гена Pdcd1). Кассету для отбора по чувствительности к лекарственному средству удаляют способом, зависимым от развития, т.е. у потомства, происходящего от мышей, клетки зародышевой линии которых содержат гуманизированный ген Pdcd1, описанный выше, будет утрачиваться селективный маркер из дифференцированных клеток в ходе развития (см. нижнюю часть фигуры 2).

[0157] Хотя варианты осуществления, в которых используется гуманизированный ген Pdcd1 мыши (т.е. мыши с геном Pdcd1, кодирующим белок PD-1, который включает в себя человеческую часть и мышиную часть), широко обсуждаются в данном документе, также обеспечиваются другие животные, отличные от человека, которые содержат гуманизированный ген Pdcd1. В некоторых вариантах осуществления такие животные, отличные от человека, содержат гуманизированный ген Pdcd1, функционально связанный с промотором Pdcd1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления такие животные, отличные от человека, содержат гуманизированный ген Pdcd1, функционально связанный с эндогенным промотором Pdcd1; в некоторых вариантах осуществления с эндогенным промотором Pdcd1 грызуна. В некоторых вариантах осуществления такие животные, отличные от человека, экспрессируют гуманизированный белок PD-1 в эндогенном локусе, где гуманизированный белок PD-1 содержит аминокислотные остатки 21-170 (или 26-169, или 27-169, 27-145 или 35-145) человеческого белка PD-1. Такие животные, отличные от человека, включают любых из тех, которые можно генетически модифицировать для экспрессии белка PD-1, раскрытого в данном документе, в том числе, например, млекопитающих, например, мышь, крысу, кролика, свинью, бычьих (например, корову, быка, буйвола), оленя, овцу, козу, курицу, кошку, собаку, хорька, примата (например, игрунку, макака-резуса) и т.д. Например, для тех животных, отличных от человека, для которых подходящие генетически модифицируемые ES-клетки являются труднодоступными, используют другие способы для получения животного, отличного от человека, содержащего генетическую модификацию. Такие способы включают, например, модификацию генома клеток, отличных от ES-клеток (например, фибробласта или индуцированной плюрипотентной клетки), и использование переноса ядер соматических клеток (SCNT) для переноса генетически модифицированного генома в подходящую клетку, например, в энуклеированный ооцит, и вынашивание модифицированной клетки (например, модифицированного ооцита) животным, отличным от человека, в подходящих условиях с образованием эмбриона.

[0158] Способы модификации генома животного, отличного от человека (например, генома свиньи, коровы, грызуна, курицы и т.д.), включают, например, использование нуклеазы с «цинковыми пальцами» (ZFN) или эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), для модификации генома с тем, чтобы он включал в себя гуманизированный ген Pdcd1.

[0159] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой млекопитающее. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой мелкое млекопитающее, например, из надсемейства Dipodoidea или Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное по настоящему изобретению представляет собой грызуна. В некоторых вариантах осуществления грызун по настоящему изобретению выбран из мыши, крысы и хомяка. В некоторых вариантах осуществления грызун по настоящему изобретению выбран из надсемейства Muroidea. В некоторых вариантах осуществления генетически модифицированное животное по настоящему изобретению принадлежит к семейству, выбранному из Calomyscidae (например, мышевидные хомячки), Cricetidae (например, хомяки, крысы и мыши Нового света, полевки), Muridae (настоящие мыши и крысы, песчанки, иглистые мыши, косматые хомяки), Nesomyidae (лазающие мыши, скальные мыши, белохвостые крысы, малагасийские крысы и мыши), Platacanthomyidae (например, колючие соневидные хомяки) и Spalacidae (например, слепыши, бамбуковые крысы и цокоры). В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированный грызун по настоящему изобретению выбран из настоящей мыши или крысы (семейство Muridae), песчанки, иглистой мыши и косматого хомяка. В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь по настоящему изобретению является представителем семейства Muridae. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой грызуна. В некоторых определенных вариантах осуществления грызун по настоящему изобретению выбран из мыши и крысы. В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой мышь.

[0160] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой грызуна, который является мышью линии C57BL, выбранной из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. В некоторых определенных вариантах осуществления мышь по настоящему изобретению представляет собой линию 129, выбранную из группы, включающей линию 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (см., например, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). В некоторых определенных вариантах осуществления генетически модифицированная мышь по настоящему изобретению является помесью вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6. В некоторых определенных вариантах осуществления мышь по настоящему изобретению является помесью вышеупомянутых линий 129 или помесью вышеупомянутых линий BL/6. В некоторых определенных вариантах осуществления линия 129 в помеси, описанной в данном документе, представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В некоторых вариантах осуществления мышь по настоящему изобретению представляет собой линию BALB, например, линию BALB/c. В некоторых вариантах осуществления мышь по настоящему изобретению представляет собой помесь линии BALB и другой вышеупомянутой линии.

[0161] В некоторых вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению представляет собой крысу. В некоторых определенных вариантах осуществления крыса по настоящему изобретению выбрана из крысы линии Wistar, линии LEA, линии Sprague Dawley, линии Fischer, F344, F6 и Dark Agouti. В некоторых определенных вариантах осуществления линия крыс, описанная в данном документе, представляет собой помесь двух или более линий, выбранных из группы, включающей Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 и Dark Agouti.

Способы, в которых используются животные, отличные от человека, имеющие гуманизированные гены Pdcd1

[0162] В исследовании функции PD-1 задействовали применение различных животных, отличных от человека, мутантных и трансгенных по Pdcd1 (например, см. Nishimura, H. et al. (1998) Intern. Immunol. 10(10): 1563-1572; Nishimura, H. et al. (1999) Immunity 11:141-151; Nishimura, H. et al. (2001) Science 291:319-322; Iwai, Y. et al. (2004) Intern. Immunol. 17(2): 133-144; Keir, M.E. et al. (2005) J. Immunol. 175:7372-7379; Keir, M.E. et al. (2007) J. Immunol. 179:5064-5070; Carter, L.L. et al. (2007) J. Neuroimmunol. 182:124-134; Chen, L. et al. (2007) Europ. Soc. Organ Transplant. 21:21-29; Okazaki, T. et al. (2011) J. Exp. Med. 208(2):395-407; патент США №7414171 и европейский патент №1334659 В1; причем эти литературные источники включены в данный документ посредством ссылки). Такие мутантные и трансгенные животные были применимы в определении молекулярных аспектов экспрессии PD-1, его функции и регуляции различных клеточных процессов. Тем не менее, в их случае не обойтись без ограничений. Например, мыши с дефицитом PD-1, создаваемые посредством нокина кДНК человеческого PD-1 в экзоне 1 мышиного гена Pdcd1, не экспрессируют человеческий PD-1 даже после стимуляции с помощью РМА (Carter, L.L. и соавт., выше). Дополнительно, значительные фенотипические различия среди животных, мутантных по PD-1, в различных генетических окружениях осложняли исследование, особенно при попытке приписывания PD-1 различных функций и/или видов регуляторной активности. Тем не менее, были созданы другие трансгенные животные, которые сверхэкспрессируют PD-1 (Chen, L. и соавт., выше). У таких животных проявлялись различные паттерны экспрессии трансгена, которые можно объективно объяснить структурой конструкции. Дополнительно, в связи с применением того же исходного генетического материала (т.е. мышиного), сверхэкспрессия PD-1 могла соответствовать эндогенному PD-1, а не трансгенному PD-1, в связи с возможными эффектами положения трансгена. Хотя для мышей, трансгенных по PD-1, была подтверждена применимость в прояснении некоторых биологических функций, опосредованных PD-1, они продемонстрировали изменчивость полученных результатов, которая по меньшей мере частично обусловлена различием подходов, используемых для их получения. Таким образом, существующие в настоящее время системы in vivo, в которых используются биологические функции, опосредованные PD-1, являются несовершенными. Молекулярные аспекты биологических функций и сигнальных путей, опосредованных PD-1, не использовались у трансгенных мышей в своем полном потенциале.

[0163] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают улучшенную систему in vivo и источник биологических материалов (например, клеток), экспрессирующих человеческий (или гуманизированный) PD-1, которые являются применимыми в разнообразных анализах. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют для разработки терапевтических средств, которые целенаправленно воздействуют на PD-1 и/или модулируют передачу сигналов, опосредованную PD-1 (например, препятствующих взаимодействиям с PD-L1 и/или PD-L2). В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют для идентификации, скрининга и/или разработки терапевтических средств-кандидатов (например, антител), которые связывают человеческий PD-1. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют для скрининга и разработки терапевтических средств-кандидатов (например, антител), которые блокируют взаимодействие человеческого PD-1 с человеческим PD-L1 и/или человеческим PD-L2. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют для определения профиля связывания антагонистов и/или агонистов гуманизированного PD-1 на поверхности клетки животного, отличного от человека, описанного в данном документе; в некоторых вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют для определения эпитопа или эпитопов для одного или более терапевтических антител-кандидатов, которые связывают человеческий PD-1.

[0164] В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют для определения фармакокинетических профилей антител к PD-1. В различных вариантах осуществления каждое из одного или более животных, отличных от человека, по настоящему изобретению и одного или более контрольных или эталонных животных, отличных от человека, подвергают воздействию одного или более терапевтических антител-кандидатов к PD-1 в различных дозах (например, 0,1 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 7,5 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг, 25 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг или более). Терапевтические антитела-кандидаты можно дозировать посредством любого необходимого пути введения, включающего парентеральный и непарентеральный пути введения. Парентеральные пути включают, например, внутривенный, внутриартериальный, интрапортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, интраспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, интракраниальный, интраплевральный или другие пути инъекции. Непарентеральные пути включают, например, пероральный, интраназальный, трансдермальный, ингаляционный, ректальный, трансбуккальный, вагинальный, внутриглазной. Введение также можно осуществлять посредством непрерывной инфузии, локального введения, замедленного высвобождения из имплантатов (гелей, мембран и т.п.) и/или внутривенной инъекции. У животных, отличных от человека (гуманизированных и контрольных), отбирают кровь в различные моменты времени (например, 0 ч., 6 ч., 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней или до 30 или более дней). Можно проводить различные анализы для определения фармакокинетических профилей вводимых терапевтических антител-кандидатов с применением образцов, полученных от животных, отличных от человека, описанных в данном документе, в том числе без ограничения уровня общего IgG, гуморального ответа на терапевтические антитела, агглютинации и т.д.

[0165] В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют для измерения терапевтического эффекта блокирования или модулирования передачи сигналов, опосредованной PD-1, и эффекта в отношении экспрессии генов в результате клеточных изменений. В различных вариантах осуществления животное, отличное от человека, по настоящему изобретению или клетки, выделенные из него, подвергают воздействию терапевтического средства-кандидата, которое связывается с гуманизированным белком PD-1 (или человеческой частью белка PD-1) на поверхности клетки животного, отличного от человека, и по истечении последующего периода времени анализируют на эффекты в отношении PD-1-зависимых процессов, например, адгезии, апоптоза, продуцирования цитокинов, воспаления, пролиферации, аутотолерантности и вирусной инфекции (или ответов).

[0166] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению экспрессируют гуманизированный белок PD-1, поэтому можно создавать клетки, линии клеток и культуры клеток, служащие в качестве источника гуманизированного PD-1 для применения в анализах связывания и функциональных анализах, например, для анализа связывания или функции антагониста или агониста PD-1, в частности, если антагонист или агонист является специфичным к последовательности или эпитопу человеческого PD-1 или, в качестве альтернативы, специфичным к последовательности или эпитопу человеческого PD-1, которые подвергаются ассоциации с PD-L1 и/или PD-L2. В различных вариантах осуществления эпитопы PD-1, которые связывают терапевтические антитела-кандидаты, можно определять с применением клеток, выделенных из животных, отличных от человека, по настоящему изобретению. В различных вариантах осуществления гуманизированный белок PD-1, экспрессируемый животным, отличным от человека, описанным в данном документе, может содержать вариант аминокислотной последовательности. Сообщалось о вариантах человеческих белков PD-1 (например, полиморфных формах), ассоциированных с аутоиммунными и инфекционными заболеваниями (см., например, Lee, Y.H. et al. (2014) Z. Rheumatol. PMID: 24942602; Mansur, A. et al. (2014) J. Investig. Med. 62(3):638-643; Nasi, M. et al. (2013) Intern. J. Infect. Dis. 17:e845-e850; Piskin, I.E. et al. (2013) Neuropediatrics 44(4):187-190; Carter, L.L. et al. (2007) J. Neuroimmunol. 182(1-2):124-134; Wan, B. et al. (2006) J. Immunol. 177(12):8844-8850). Иллюстративные варианты человеческого PD-1 включают варианты, перечисленные на веб-странице SNP GeneView NCBI, и обобщены в таблице 3. В различных вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению экспрессируют вариант гуманизированного белка PD-1. В различных вариантах осуществления вариант является полиморфным в положении аминокислоты, ассоциированном со связыванием лиганда. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют для определения эффекта связывания лиганда посредством взаимодействия с полиморфным вариантом человеческого PD-1. В некоторых определенных вариантах осуществления животные, отличные от человека, по настоящему изобретению экспрессируют вариант человеческого PD-1, представленный в таблице 3.

[0167] Клетки животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно выделять и применять для конкретной цели или можно поддерживать в культуре в течение многих поколений. В различных вариантах осуществления клетки животного, отличного от человека, по настоящему изобретению иммортализируют (например, посредством применения вируса) и сохраняют в культуре в течение неопределенного времени (например, в сериях культур).

[0168] В различных вариантах осуществления клетки и/или животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют в различных режимах иммунизации для определения функций, опосредованных PD-1, в иммунном ответе на антиген. В некоторых вариантах осуществления терапевтические средства-кандидаты, которые связываются с человеческим (или гуманизированным) PD-1 или блокируют одну или более его функций, характеризуют у животного, отличного от человека, по настоящему изобретению. Подходящие измерения включают различные клеточные анализы, анализы пролиферации, анализ уровня сывороточного иммуноглобулина (например, титра антител), анализы цитотоксичности, получение характеристик лиганд-рецепторных взаимодействий (например, анализы иммунопреципитации). В некоторых вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для получения характеристик функций, опосредованных PD-1, регулирующих иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с аутоиммунным заболеванием, нарушением или состоянием. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с воспалительным заболеванием, нарушением или состоянием. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой тест-антиген (например, овальбумин или OVA). В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой мишень, ассоциированную с заболеванием или состоянием, от которого страдают один или более пациентов-людей, нуждающихся в лечении.

[0169] В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению применяют в анализах сыворотки крови для определения титров продуцируемых аутоантител для тестирования фармакотоксикологических аспектов терапевтических средств-кандидатов, целенаправленно воздействующих на человеческий PD-1. В некоторых вариантах осуществления продуцирование аутоантител у животных, отличных от человека, по настоящему изобретению является следствием одного или более аутоиммунных заболеваний, нарушений или состояний, индуцированных у животного, отличного от человека.

[0170] В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для стимуляции одним или более антигенами для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования PD-1-зависимой регуляции иммунного ответа, в том числе без ограничения специфических ответов на указанный антиген, зависимых от Т-клеток и зависимых от В-клеток.

[0171] В различных вариантах осуществления клетки и/или животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализе выживаемости и/или пролиферации (например, с использованием В- или Т-клеток) для скрининга и разработки терапевтических средств-кандидатов, модулирующих передачу сигналов, опосредованную человеческим PD-1. Активация или утрата PD-1 играет важную роль в регуляции Т-клеточных ответов, и регуляция аутотолерантности с помощью PD-1 может являться следствием активации специфических эпитопов внеклеточного домена PD-1, и поэтому модуляторов-кандидатов для PD-1 (например, антагонистов или агонистов) можно идентифицировать, характеризовать и разрабатывать с использованием клеток животных, отличных от человека, по настоящему изобретению и/или животного, отличного от человека, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетки и/или животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализе(анализах) выживаемости или гибели для определения эффекта в отношении пролиферации или апоптоза конкретной(конкретных) клетки(клеток) (например, раковых клеток) в присутствии и в отсутствие PD-1.

[0172] В различных вариантах осуществления клетки и/или животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в ксенотрансплантации гетерологичных (например, человеческих) клеток или ткани для определения функций, опосредованных PD-1, в физиологическом (например, иммунном) ответе на трансплантированные человеческие клетки или ткань. В некоторых вариантах осуществления терапевтические средства-кандидаты, которые связываются с человеческим PD-1 или блокируют одну или более его функций, характеризуют у животного, отличного от человека, по настоящему изобретению. Подходящие измерения включают различные клеточные анализы, анализы пролиферации, анализ уровня сывороточного иммуноглобулина (например, титра антител), анализы цитотоксичности и получение характеристик лиганд-рецепторных взаимодействий (анализы иммунопреципитации). В некоторых вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для получения характеристик функций, опосредованных PD-1, регулирующих иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с новообразованием. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с аутоиммунным заболеванием, нарушением или состоянием. В некоторых вариантах осуществления антиген ассоциирован с воспалительным заболеванием, нарушением или состоянием. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой мишень, ассоциированную с заболеванием или состоянием, от которого страдают один или более пациентов-людей, нуждающихся в лечении.

[0173] В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в экспериментах по трансплантации или адоптивному переносу для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования PD-1-зависимой регуляции новых лимфоцитов и их иммунной функции. В различных вариантах осуществления животным, отличным от человека, по настоящему изобретению трансплантируют человеческие Т-клетки; в некоторых вариантах осуществления наивные Т-клетки; в некоторых вариантах осуществления активированные Т-клетки.

[0174] В различных вариантах осуществления клетки животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализах Т-клеток для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования PD-1-зависимой регуляции ответа и функции, зависимых от Т-клеток. Иллюстративные анализы Т-клеток включают без ограничения ELISpot, внутриклеточное окрашивание цитокинов, анализ рестрикции по антигенам главного комплекса гистосовместимости (МНС), анализы супрессии вируса, анализы цитотоксичности, анализы пролиферации и анализы супрессии регуляторными Т-клетками.

[0175] В различных вариантах осуществления клетки животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализе трансмиграции клеток для скрининга и разработки терапевтических средств-кандидатов, модулирующих человеческий PD-1. Трансмиграция клеток включает миграцию клеток через эндотелий, и анализы трансмиграции позволяют проводить измерение взаимодействий эндотелия с лейкоцитами или опухолевыми клетками и их трансмиграции через него.

[0176] В различных вариантах осуществления клетки животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализах роста (или пролиферации) опухолевых клеток для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования PD-1-зависимых регуляции и/или апоптоза опухолевых клеток.

[0177] В различных вариантах осуществления клетки животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют в анализах продуцирования цитокинов для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования PD-1-зависимой регуляции высвобождения цитокинов из Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для выявления (и/или измерения) высвобождения внутриклеточных цитокинов в результате взаимодействия гуманизированного PD-1 с лекарственным средством, целенаправленно воздействующим на человеческий PD-1 или лиганд PD-1 (например, PD-L1 или PD-L2).

[0178] В различных вариантах осуществления у одного или более животных, отличных от человека, по настоящему изобретению индуцируют аутоиммунное заболевание, нарушение или состояние для обеспечения системы in vivo для определения терапевтического потенциала соединений или биологических средств в отношении модулирования PD-1-зависимой регуляции одной или более функций при аутоиммунном заболевании, нарушении или состоянии. Иллюстративные аутоиммунные заболевания, нарушения или состояния, которые можно индуцировать у одного или более животных, отличных от человека, по настоящему изобретению, включают сахарный диабет, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (например, модель для изучения рассеянного склероза), ревматоидный артрит и системную красную волчанку.

[0179] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают систему in vivo для анализа и тестирования лекарственного средства или вакцины. В различных вариантах осуществления лекарственное средство-кандидат или вакцину-кандидат можно доставлять одному или более животным, отличным от человека, по настоящему изобретению с последующим мониторингом животных, отличных от человека, для определения одного или более из иммунного ответа на лекарственное средство или вакцину, профиля безопасности лекарственного средства или вакцины или эффекта в отношении заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления вакцина целенаправленно воздействует на вирус, такой как, например, вирус иммунодефицита человека или вирус гепатита (например, HCV). Иллюстративные способы, используемые для определения профиля безопасности, включают измерения токсичности, оптимальной концентрации дозы, эффективности лекарственного средства или вакцины и возможных факторов риска. Такие лекарственные средства или вакцины можно улучшать и/или разрабатывать у таких животных, отличных от человека.

[0180] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают систему in vivo для оценки фармакокинетических свойств лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческий PD-1. В различных вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на человеческий PD-1, можно доставлять или вводить одному или более животным, отличным от человека, по настоящему изобретению с последующим мониторингом или проведением одного или более анализов в отношении животных, отличных от человека (или клеток, выделенных из них), для определения эффекта лекарственного средства в отношении животного, отличного от человека. Фармакокинетические свойства включают без ограничения характер переработки животным лекарственного средства в различные метаболиты (или выявляемое наличие или отсутствие одного или более метаболитов лекарственных средств, в том числе токсичных метаболитов), период полувыведения лекарственного средства, уровни циркулирующего в крови лекарственного средства после введения (например, концентрацию лекарственного средства в сыворотке крови), гуморальный ответ на лекарственное средство (например, выработку антител к лекарственным средствам), всасывание и распределение лекарственного средства, путь введения, пути выведения и/или клиренс лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления мониторинг фармакокинетических и фармакодинамических свойств лекарственных средств (например, модуляторов PD-1) проводят у животных, отличных от человека, по настоящему изобретению или посредством их применения.

[0181] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают систему in vivo для оценки целевой токсичности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческий PD-1. В различных вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на человеческий PD-1, можно доставлять или вводить одному или более животным, отличным от человека, по настоящему изобретению с последующим мониторингом или проведением одного или более анализов в отношении животных, отличных от человека (или клеток, выделенных из них), для определения целевого эффекта токсичности лекарственного средства в отношении животного, отличного от человека. Как правило, лекарственные средства предназначены для модулирования одной или более функций их мишеней. В виде лишь одного примера, модулятор PD-1 предназначен для модулирования функций, опосредованных PD-1 (например, сигнальной трансдукции, опосредованной PD-1), посредством взаимодействия некоторым образом с молекулой PD-1 на поверхности одной или более клеток. В некоторых вариантах осуществления такой модулятор может оказывать неблагоприятный эффект, заключающийся в усилении требуемого(требуемых) фармакологического(фармакологических) действия(действий) модулятора. Такие эффекты называют целевыми эффектами. Иллюстративные целевые эффекты включают чрезмерно высокую дозу, длительную активацию/инактивацию и надлежащее действие в ненадлежащей ткани. В некоторых вариантах осуществления целевые эффекты лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на PD-1, которые идентифицируют у животных, отличных от человека, по настоящему изобретению или посредством их применения, используют для определения ранее неизвестной(неизвестных) функции(функций) PD-1.

[0182] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают систему in vivo для оценки нецелевой токсичности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческий PD-1. В различных вариантах осуществления лекарственное средство, целенаправленно воздействующее на человеческий PD-1, можно доставлять или вводить одному или более животным, отличным от человека, по настоящему изобретению с последующим мониторингом или проведением одного или более анализов в отношении животных, отличных от человека (или клеток, выделенных из них), для определения нецелевого эффекта токсичности лекарственного средства в отношении животного, отличного от человека. Нецелевые эффекты могут иметь место в тех случаях, когда лекарственное средство взаимодействует с ненамеченной мишенью (например, при перекрестной реактивности в отношении общего эпитопа). Такие взаимодействия могут иметь место в намеченной или ненамеченной ткани. В виде лишь одного примера, изомеры лекарственного средства, представляющие собой его зеркальные отражения (энантиомеры), могут приводить к нецелевым эффектам токсичности. Дополнительно, лекарственное средство может ненадлежащим образом взаимодействовать с различными подтипами рецепторов и непреднамеренно активировать их. Иллюстративные нецелевые эффекты включают ненадлежащие активацию/ингибирование ненадлежащей мишени вне зависимости от ткани, в которой находится ненадлежащая мишень. В некоторых вариантах осуществления нецелевые эффекты лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческий PD-1, определяют путем сравнения эффектов от введения лекарственного средства животным, отличным от человека, по настоящему изобретению и одному или более эталонным животным, отличным от человека.

[0183] В некоторых вариантах осуществления проведение анализа включает определение эффекта в отношении фенотипа и/или генотипа животного, отличного от человека, которому вводят лекарственное средство. В некоторых вариантах осуществления проведение анализа включает определение изменчивости от партии к партии для модулятора PD-1 (например, антагониста или агониста). В некоторых вариантах осуществления проведение анализа включает определение различий между эффектами лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на PD-1, вводимого животному, отличному от человека, по настоящему изобретению и эталонному животному, отличному от человека. В различных вариантах осуществления эталонные животные, отличные от человека, могут иметь модификацию, описанную в данном документе, модификацию, отличную от описанной в данном документе (например, в случае животного, имеющего разрушенный, содержащий делецию или по иным причинам нефункциональный ген Pdcd1), или не иметь модификации (т.е. в случае животного дикого типа, отличного от человека).

[0184] Иллюстративные параметры, которые можно измерять у животных, отличных от человека (или в клетках, выделенных из них, и/или с их применением), для оценки фармакокинетических свойств, целевой токсичности и/или нецелевой токсичности лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческий PD-1, включают без ограничения агглютинацию, аутофагию, клеточное деление, клеточную гибель, комплементзависимый гемолиз, целостность ДНК, титр антител, специфичных к лекарственному средству, метаболизм лекарственного средства, экспрессию генов, определяемую с помощью биочипов, метаболическую активность, митохондриальную активность, окислительный стресс, фагоцитоз, биосинтез белка, распад белка, секрецию белка, стрессовую реакцию, концентрацию лекарственного средства в целевой ткани, концентрацию лекарственного средства в нецелевой ткани, транскрипционную активность и т.п. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для определения фармацевтически эффективной дозы модулятора PD-1.

[0185] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают улучшенную систему in vivo для разработки и получения характеристик терапевтических средств-кандидатов для использования при раке. В различных вариантах осуществления животным, отличным от человека, по настоящему изобретению можно имплантировать опухоль с последующим введением одного или более терапевтических средств-кандидатов. В некоторых вариантах осуществления терапевтические средства-кандидаты могут включать полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело) или коктейль из антител; в некоторых вариантах осуществления использованием терапевтических средств-кандидатов включает комбинированную терапию, такую как, например, последовательное или одновременно введение доз моноспецифических антител. Опухоли может быть предоставлено достаточное время для развития в одном или более местоположениях в организме животного, отличного от человека. Пролиферацию, рост, выживаемость и т.д. опухолевых клеток можно измерять как до, так и после введения терапевтического(терапевтических) средства-кандидата(средств-кандидатов). При желании у животного, отличного от человека, также можно измерять цитотоксичность терапевтических средств-кандидатов.

[0186] Животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно использовать для разработки одной или более моделей заболевания для установления или оценки эффективности терапевтических средств-кандидатов и/или терапевтических режимов (например, монотерапии, комбинированной терапии, тестирования с подбором дозы и т.д.) в лечении заболеваний, нарушений или состояний, поражающих людей. У животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно сформировать различные болезненные состояния с последующим введением одной или более молекул-кандидатов (например, лекарственных средств, целенаправленно воздействующих на PD-1) таким образом, чтобы можно было определить эффективность одной или более молекул-кандидатов при болезненном состоянии. В некоторых вариантах осуществления модели заболеваний включают аутоиммунные, воспалительные и/или неопластические заболевания, нарушения или состояния.

[0187] В виде лишь одного примера, животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают улучшенную животную модель для профилактической и/или терапевтической обработки опухоли или опухолевых клеток. В различных вариантах осуществления животным, отличным от человека, по настоящему изобретению можно имплантировать одну или более опухолевых клеток с последующим введением одного или более терапевтических средств-кандидатов (например, антител). В некоторых вариантах осуществления введение одного или более терапевтических средств-кандидатов проводят после имплантации (например, через несколько минут или часов, но обычно в тот же день) одной или более опухолевых клеток, и у животных, отличных от человека, по настоящему изобретению устанавливают эффективность одного или более терапевтических средств-кандидатов в предупреждении развития солидной опухоли и/или роста опухолевых клеток у указанных животных, отличных от человека. В некоторых вариантах осуществления введение одного или более терапевтических средств-кандидатов проводят после (например, через несколько дней после) имплантации одной или более опухолевых клеток и в некоторых определенных вариантах осуществления после прохождения периода времени, достаточного для того, чтобы одна или более имплантированных опухолевых клеток достигли предварительно определенного размера (например, объема) у животных, отличных от человека, по настоящему изобретению; и для одного или более терапевтических средств-кандидатов устанавливают эффективность в лечении одной или более развившихся опухолей. Животных, отличных от человека, можно поместить в различные группы обработки в зависимости от дозы таким образом, чтобы можно было определить оптимальную дозу или диапазон доз, коррелирующие с эффективным лечением развившейся опухоли.

[0188] Молекулы-кандидаты можно вводить животным, отличным от человека, в моделях заболеваний с помощью любого способа введения, в том числе парентеральных и непарентеральных путей введения. Парентеральные пути включают, например, внутривенный, внутриартериальный, интрапортальный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, интраспинальный, интратекальный, интрацеребровентрикулярный, интракраниальный, интраплевральный или другие пути инъекции. Непарентеральные пути включают, например, пероральный, интраназальный, трансдермальный, ингаляционный, ректальный, трансбуккальный, вагинальный, внутриглазной. Введение также можно осуществлять посредством непрерывной инфузии, локального введения, замедленного высвобождения из имплантатов (гелей, мембран и т.п.) и/или внутривенной инъекции. В тех случаях, когда у животных, отличных от человека, по настоящему изобретению оценивают комбинированную терапию, молекулы-кандидаты можно вводить посредством одного и того же пути введения или посредством различных путей введения. В тех случаях, когда у животных, отличных от человека, по настоящему изобретению оценивают режим дозирования, молекулы-кандидаты можно вводить два раза в месяц, раз в месяц, три раза неделю, два раза в неделю, раз в неделю, один раз в сутки, с переменными интервалами и/или в повышающихся концентрациях для определения режима дозирования, при котором у животного, отличного от человека, у которого были сформированы одна или более моделей заболеваний, демонстрируется требуемый терапевтический или профилактический эффект.

[0189] Животные, отличные от человека, по настоящему изобретению обеспечивают улучшенную систему in vivo для разработки и получения характеристик терапевтических средств-кандидатов для применения при инфекционных заболеваниях. В различных вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно заразить путем инъекции вируса (например, MHV, HIV, HCV и т.д.) или патогена (например, бактерий) с последующим введением одного или более терапевтических средств-кандидатов. В некоторых вариантах осуществления терапевтические средства-кандидаты могут включать полиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело) или коктейль из антител; в некоторых вариантах осуществления применение терапевтических средств-кандидатов включает комбинированную терапию, такую как, например, последовательное или одновременное введение доз моноспецифических антител; в некоторых вариантах осуществления терапевтические средства-кандидаты могут включать вакцину. Вирусу или патогену может быть предоставлено достаточное время для развития в одном или более местоположениях или клетках в организме животного, отличного от человека, чтобы у животного, отличного от человека, развились один или более симптомов, ассоциированных с инфекцией, вызванной вирусом или патогеном. Пролиферацию и рост Т-клеток можно измерять как до, так и после введения терапевтического(терапевтических) средства-кандидата(средств-кандидатов). Кроме того, у животных, отличных от человека, зараженных вирусом или патогеном, можно измерять выживаемость, проводить анализ сывороточных и/или внутриклеточных цитокинов, гистопатологическое исследование печени и/или селезенки. В некоторых вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для определения степени повреждения органов, ассоциированного с вирусной инфекцией. В некоторых вариантах осуществления животных, отличных от человека, по настоящему изобретению используют для определения профиля экспрессии цитокинов в различных органах животных, отличных от человека, зараженных конкретным вирусом.

[0190] Животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно использовать для оценки эффективности терапевтического лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческие клетки. В различных вариантах осуществления животному, отличному от человека, по настоящему изобретению трансплантируют человеческие клетки, и такому животному, отличному от человека, вводят лекарственное средство-кандидат, целенаправленно воздействующее на такие человеческие клетки. Затем определяют терапевтическую эффективность лекарственного средства путем мониторинга человеческих клеток у животного, отличного от человека, после введения лекарственного средства. Лекарственные средства, которые можно тестировать на животных, отличных от человека, включают как низмолекулярные соединения, т.е. соединения со значениями молекулярной массы менее 1500 кДа, 1200 кДа, 1000 кДа или 800 дальтон, так и высокомолекулярные соединения (такие как белки, например, антитела), которые оказывают предусматриваемые терапевтические эффекты для лечения человеческих заболеваний и состояний путем целенаправленного воздействия на человеческие клетки (например, путем связывания с ними и/или действия на них).

[0191] В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство представляет собой противораковое лекарственное средство, и человеческие клетки представляют собой раковые клетки, которые могут представлять собой клетки первичной раковой опухоли или клетки из линий клеток, развившихся из первичной раковой опухоли. В этих вариантах осуществления животному, отличному от человека, по настоящему изобретению трансплантируют человеческие раковые клетки, и животному, отличному от человека, дают противораковое лекарственное средство. Эффективность лекарственного средства можно определить путем оценки ингибирования роста или метастазирования человеческих раковых клеток у животного, отличного от человека, в результате введения лекарственного средства.

[0192] В конкретных вариантах осуществления противораковое лекарственное средство представляет собой молекулу антитела, которая связывается с антигеном на человеческих раковых клетках. В конкретных вариантах осуществления противораковое лекарственное средство представляет собой биспецифическое антитело, которое связывается с антигеном на человеческих раковых клетках и с антигеном на других человеческих клетках, например, клетках иммунной системы человека (или «человеческих иммунных клетках»), таких как В-клетки и Т-клетки.

ПРИМЕРЫ

[0193] Следующие примеры приведены для того, чтобы обеспечить специалистов в данной области описанием того, как создавать и применять способы и композиции по настоящему изобретению, и они не предполагают ограничение объема того, что авторы настоящего изобретения рассматривают в качестве своего изобретения. Если не указано иное, температура указана по Цельсию, а давление является атмосферным или близким к нему.

Пример 1. Гуманизация эндогенного гена 1 запрограммированной гибели клеток (Pdcd1)

[0194] В данном примере показаны иллюстративные способы гуманизации эндогенного гена Pdcd1, кодирующего белок 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1), у млекопитающего, отличного от человека, такого как грызун (например, мышь). Способы, описанные в данном примере, можно по желанию использовать для гуманизации эндогенного гена Pdcd1 животного, отличного от человека, с помощью любой человеческой последовательности или комбинации человеческих последовательностей (или фрагментов последовательностей). В данном примере для гуманизации эндогенного гена Pdcd1 мыши используют фрагмент человеческой ДНК размером ~883 п.о., содержащий экзон 2, интрон 2 и первые 71 п.о. экзона 3 человеческого гена PDCD1, представленного в GenBank под номером доступа NM_005018.2 (SEQ ID NO: 23). Направленный вектор для гуманизации генетического материала, кодирующего внеклеточный N-концевой домен IgV эндогенного гена Pdcd1, конструировали с использованием технологии VELOCIGENE® (см., например, патент США №6586251 и Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-659; включенные в данный документ посредством ссылки).

[0195] Вкратце, искусственную бактериальную хромосому (ВАС) клона RP23-93N20 для мыши (Invitrogen) модифицировали с делецией последовательности, содержащей экзон 2, интрон 2 и часть экзона 3 эндогенного гена Pdcd1, и вставкой экзона 2, интрона 2 и части экзона 3 человеческого гена PDCD1 с использованием фрагмента человеческой ДНК размером ~883 п.о., который кодирует аминокислоты 26-169 человеческого полипептида PD-1. Эндогенную ДНК, содержащую экзон 1, часть экзона 3 (т.е. кодирующую трансмембранный домен), экзоны 4 и 5, а также 5'- и 3'-концевые нетранслируемые области (UTR), сохраняли. Анализ последовательности фрагмента человеческой ДНК размером ~883 п.о. подтвердил наличие всех экзонов (т.е. экзона 2 и 71 п.о. экзона 3) и сигналов для сплайсинга человеческого PDCD1. Анализ последовательности выявил, что последовательность соответствует эталонному геному и транскрипту PDCD1 NM_005018.2.

[0196] Более подробно, вначале конструировали небольшой бактериальный донорный компонент гомологичной рекомбинации из синтетического фрагмента ДНК, содержащего следующее: [(HindIII)-(вышерасположенные мышиные 78 п.о.)-(сайты для ферментов рестрикции XhoI/NheI)-(883 п.о. человеческого PDCD1)-(нижерасположенные мышиные 75 п.о.)-(HindIII)]. Этот фрагмент синтезировали в Genescript Inc. (Пискатауэй, Нью-Джерси) и клонировали в плазмидный вектор с геном устойчивости к ампициллину. Сайты XhoI-NheI использовали для лигирования самоудалающейся кассеты для отбора по чувствительности к неомицину размером ~4996 п.о., фланкированной сайтами распознавания рекомбиназы (loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-CreI-loxP; см. патенты США №№8697851, 8518392 и 8354389, которые включены в данный документ посредством ссылки). При последующем отборе использовали неомицин. Фланкирующие сайты HindIII использовали для линеаризации целенаправленно воздействующего вектора перед гомологичной рекомбинацией с ВАС клона RP23-93N20 для мыши. Согласно замыслу участок сочленения между фрагментом человеческого PDCD1 размером 883 п.о. и нижерасположенными мышиными 75 п.о. сохранял открытую рамку считывания в экзоне 3 (фигура 2). Полученный в результате целенаправленно воздействующий вектор содержал в направлении от 5' к 3' 5'-концевое гомологичное плечо, содержащее ~61,7 т.п.о. мышиной геномной ДНК из ВАС клона RP23-93N20, самоудаляющуюся кассету для отбора по чувствительности к неомицину, фланкированную сайтами loxP, фрагмент человеческой геномной ДНК размером 883 п.о. (содержащий человеческий ген Pdcd1 от экзона 2 до первых 71 п.о. экзона 3 включительно) и ~84 т.п.о. мышиной геномной ДНК из ВАС клона RP23-93N20.

[0197] Модифицированный клон RP23-93N20 ВАС, описанный выше, использовали для электропорации эмбриональных стволовых (ES) клеток мыши, создавая модифицированные ES-клетки, содержащие эндогенный ген Pdcd1, гуманизированный от экзона 2 до части экзона 3 включительно (т.е. с делецией 900 п.о. эндогенного гена Pdcd1 и вставкой 883 п.о. человеческой последовательности). Подвергнутые положительному целенаправленному воздействию ES-клетки, содержащие гуманизированный ген Pdcd1, идентифицировали с помощью анализа (Valenzuela и соавт., выше), в котором выявляли наличие последовательностей человеческого PDCD1 (например, экзона 2 и части экзона 3) и подтверждали потерю и/или сохранение последовательностей мышиного Pdcd1 (например, экзона 2 и части экзона 3 и/или экзонов 1, 4 и 5). В таблице 4 представлены праймеры и зонды, которые использовали для подтверждения гуманизации эндогенного гена Pdcd1, описанной выше (фигура 3). Нуклеотидная последовательность, охватывающая расположенную выше от точки вставки часть, включала в себя следующее, означающее эндогенную мышиную последовательность (ниже заключенную в круглые скобки с выделенным курсивом сайтом рестрикции XhoI) выше 5'-конца самоудаляющейся кассеты для отбора по чувствительности к неомицину в точке вставки, соединенную со смежными сайтом loxP (выделенным жирным шрифтом) и последовательностью кассеты, присутствующей в точке вставки:

Нуклеотидная последовательность, охватывающая расположенную ниже от точки вставки часть с 3'-конца геномной последовательности человеческого PDCD1, включала в себя следующее, означающее последовательность человеческого PDCD1, смежную с геномной последовательностью мышиного Pdcd1 (ниже заключенной в круглые скобки):

[0198] Положительные клоны ES-клеток затем использовали для имплантации самкам мышей с применением способа VELOCIMOUSE® (см., например, патент США №7294754 и Poueymirou et al., 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) для создания выводка детенышей, содержащих вставку экзона 2 человеческого PDCD1 и части экзона 3 человеческого PDCD1 в эндогенном гене Pdcd1 мыши. Для мышей, содержащих гуманизированные экзон 2 и часть экзона 3 (т.е. фрагмент человеческой ДНК размером 883 п.о.) эндогенного гена Pdcd1, вновь проводили подтверждение и идентификацию путем генотипирования ДНК, выделенной из отрезанных фрагментов хвостов, с применением анализа модификации аллеля (Valenzuela и соавт., выше), выявившего наличие последовательностей человеческого гена PDCD1. Детенышей генотипировали, и группы животных, гетерозиготных по конструкции с гуманизированным геном Pdcd1, отбирали для получения характеристик.

Пример 2. Экспрессия гуманизированного PD-1 на активированных Т-клетках

[0199] В этом примере демонстрируется, что животные, отличные от человека (например, грызуны), модифицированные с тем, чтобы содержать гуманизированный ген Pdcd1 согласно примеру 1, экспрессируют гуманизированный белок PD-1 на поверхности активированных лимфоцитов. В данном примере активированные Т-клетки мышей, гетерозиготных по гуманизированному эндогенному гену Pdcd1, описанному в примере 1, окрашивали антителами к PD-1 для определения экспрессии PD-1 в стимулированных Т-клетках, выделенных из мышей дикого типа и гуманизированных мышей.

[0200] Вкратце, собирали селезенки мыши дикого типа и мыши, гетерозиготной по гуманизированному эндогенному гену Pdcd1, описанному в примере 1, и преобразовывали в суспензии отдельных клеток путем механической диссоциации. Клетки промывали в среде (RPMI, дополненной 10% FBS) и ресуспендировали при 1×10⁶/мл, и 200 мкл (200000 клеток) высевали в 96-луночные планшеты. Клетки в выбранных лунках стимулировали антителами к CD3 и к CD28 (в обоих случаях при 1 мкг/мл) в течение 72 часов. Клетки окрашивали для FACS согласно условиям производителя с помощью антител, распознающих CD4, CD8, CD19 и человеческий (клон MIH4, BD Biosciences) или мышиный (клон J43, eBioscience) PD1. Окрашенные клетки прогоняли на проточном цитометре LSRII, и данные анализировали с помощью программного обеспечения Flow Jo. CD8⁺ Т-клетки гейтировали (CD19^-CD8⁺) для выявления экспрессии человеческого и мышиного PD1. Иллюстративные результаты показаны на фигуре 4.

[0201] Как показано на фигуре 4, мыши, содержащие гуманизированный ген Pdcd1, описанный в примере 1, экспрессируют полипептид PD-1, который содержит человеческую часть и эндогенную мышиную часть. Экспрессию человеческой части выявляют посредством распознавания антителом, которое распознает полностью человеческий полипептид PD-1.

Пример 3. Эффективность модуляторов PD-1 in vivo

[0202] В этом примере демонстрируется, что животных, отличных от человека (например, грызунов), модифицированных с тем, чтобы содержать гуманизированный ген Pdcd1 согласно примеру 1, можно использовать в анализе in vivo для скрининга модуляторов PD-1 (например, антител к PD-1) и определения различных характеристик, таких как, например, ингибирование роста опухоли и/или уничтожение опухолевых клеток. В этом примере у мышей, гомозиготных по гуманизированному эндогенному гену Pdcd1, описанному в примере 1, некоторые антитела к PD-1 подвергали скринингу для определения оптимальной дозы антитела, ингибирующей рост опухоли, и степени, в которой антитела к PD-1 опосредуют уничтожение опухолевых клеток.

[0203] Вкратце, мышей в зависимости от массы тела равномерно разделяли на пять групп обработки или контрольных групп для исследования 1 (n=5/группа), восемь групп обработки или контрольных групп для исследования 2 (n=5/группа) и пять групп обработки или контрольных групп для исследования 3 (n=7/группа). В нулевой день мышей анестезировали путем ингаляции изофлурана, а затем в правый бок подкожно инъецировали клетки MC38.ova в 100 мкл суспензии в DMEM (исследование 1: 5×10⁵; исследование 2/3: 1×10⁶). Клетки MC38.ova (аденокарциномы толстого кишечника мыши) модифицировали с помощью генной инженерии для экспрессии куриного овальбумина в целях повышения иммуногенности опухоли. В рамках исследования 1 в группах обработки проводили внутрибрюшинную инъекцию 200 мкг одного из трех антител к PD-1 либо антитела изотипического контроля с несоответствующей специфичностью в дни 3, 7, 10, 14 и 17 эксперимента, при этом одну группу мышей оставляли необработанной. В рамках исследования 2 в группах обработки проводили внутрибрюшинную инъекцию одного из трех антител к PD-1 при 10 мг/кг или 5 мг/кг на дозу, одного антитела к PD-1 (Ab В, IgG4) при 10 мг/кг на дозу либо антитела изотипического контроля с несоответствующей специфичностью при 10 мг/кг в дни 3, 7, 10, 14 и 17 эксперимента. В рамках исследования 3 в группах обработки проводили внутрибрюшинную инъекцию одного из двух антител к PD-1 при 5 мг/кг или 2,5 мг/кг на дозу либо контрольного антитела, не специфичного к PD-1 (контроля), при 5 мг/кг в дни 3, 7, 10, 14 и 17 эксперимента. В таблице 5 представлен экспериментальный протокол дозирования и обработки для групп мышей.

[0204] В рамках каждого из исследований для каждой группы обработки регистрировали средние значения объема опухоли, определяемые путем измерений штангенциркулем, и процент выживаемости в день 14 или 17 и день 23 или 24 каждого эксперимента. В конце исследования также оценивали количество безопухолевых мышей (день 42 для исследования 1 и день 31 для исследования 2 и исследования 3). В рамках каждого исследования рассчитывали средний объем опухоли (мм³)(±SD), процент выживаемости и количество безопухолевых мышей (таблицы 7-9). Иллюстративные кривые роста опухолей приведены на фигуре 5.

[0205] Как показано в таблице 6 для исследования 1, у мышей, обработанных Ab A, не развивались какие-либо выявляемые опухоли в ходе исследования. У мышей, обработанных Ab C, проявлялось устойчивое уменьшение объема опухоли по сравнению с контролями в дни 17 и 24 исследования; и 3 из 5 мышей к концу эксперимента были безопухолевыми. В отличие от этого, обработка с помощью Ab B в данном исследовании не демонстрировала значительную эффективность в уменьшении объема опухоли по сравнению с контролями. Ко дню 23 исследования в группе, получавшей Ab B, умерла 1 из 5 мышей, а в группе обработки изотипическим контролем умерли 2 из 5 мышей. В группе без обработки и группе изотипического контроля у некоторых мышей проявлялась спонтанная регрессия опухоли (соответственно у 1 из 5 мышей и у 2 из 5 мышей).

[0206] Как показано в таблице 7 для исследования 2, у мышей, обработанных Ab A при 10 мг/кг, в ходе исследования не развивались выявляемые опухоли. У мышей в группах, обработанных 10 мг/кг Ab C либо Ab D, проявлялось значительное уменьшение объема опухоли по сравнению с контролями в дни 17 и 24 исследования. Четыре из 5 мышей в каждой группе, обработанной 10 мг/кг Ab C либо Ab D, были безопухолевыми в день 31, тогда как в группе обработки изотипическим контролем только 1 из 5 животных было безопухолевым в результате спонтанной регрессии опухоли. Для Ab B, тестируемого при 10 мг/кг, демонстрировалось значительное уменьшение объема опухоли по сравнению с контролями в дни 17 и 24 исследования, однако это антитело было наименее эффективным антителом к PD1 с учетом того, что лишь 2 из 5 мышей остались в живых в конце эксперимента.

[0207] В группах, обработанных Ab A, Ab C и Ab D, наблюдали дозозависимую реакцию супрессии опухоли в тестируемых дозах (5 мг/кг и 10 мг/кг). Терапия с применением Ab A или Ab C при 5 мг/кг была менее эффективной с учетом того, что в конце эксперимента в день 31 безопухолевыми были 4 из 5 мышей, тогда как в группе Ab A при дозе 10 мг/кг безопухолевыми оставались 5 из 5 мышей. С помощью 2-факторного ANOVA с применением критерия Даннета для множественных сравнений выявили, что различия в росте опухолей между группой, обработанной антителом изотипического контроля при 10 мг/кг в качестве эталона, и группами, обработанными Ab A, Ab C или Ab D при 10 мг/кг, были статистически значимыми при p-значении <0,005. Различия в росте опухолей между группой, обработанной антителом изотипического контроля при 10 мг/кг в качестве эталона, и группами, обработанными Ab А, Ab C или Ab D при 5 мг/кг, также были статистически значимыми при p-значении <0,05.

[0208] Как показано в таблице 8 для исследования 3, 6 из 7 мышей, обработанных Ab A или Ab C при 5 мг/кг, были безопухолевыми в конце эксперимента, тогда как в группе изотипического контроля не было безопухолевых животных. Одна имеющая опухоль мышь в контрольной группе IgG4 умерла в день 17 после имплантации. Только 4 из 7 мышей, обработанных Ab C при 2,5 мг/кг, оставались безопухолевыми в конце эксперимента. Различие в объемах опухолей в день 21 между группами обработки тестируемыми антителами к PD-1 и группой изотипического контроля было статистически значимым, как определили с помощью однофакторного ANOVA с применением апостериорного критерия Даннета для множественных сравнений, при p<0,01. Все четыре тестируемых антитела к PD-1 были равным образом более эффективными в дозе 5 мг/кг, чем в дозе 2,5 мг/кг.

[0209] Как показано на фигуре 5, антитела к PD-1 значительно ингибировали рост опухоли в профилактической модели роста опухоли из MC38.ova на мышах с гуманизированным PD-1, полученных согласно примеру 1. Терапия с применением Ab к PD-1 при 10 мг/кг стимулировала регрессию опухоли у всех мышей (5 из 5) на протяжении всего эксперимента, тогда как в контрольной группе только одно из пяти животных оставалось безопухолевым в результате спонтанной регрессии опухоли. Терапия с применением антител к PD-1 при 5 мг/кг была несколько менее эффективной с учетом того, что в конце эксперимента безопухолевыми были четыре из пяти мышей. Однофакторный ANOVA с применением апостериорного критерия Даннета для множественных сравнений выявил значимое различие в объемах опухолей между обработками антителом к PD-1 и контрольным антителом при p-значении <0,05 (5 мг/кг) и p-значении <0,01 (10 мг/кг).

[0210] В аналогичном эксперименте исследовали ненарушенную функциональную передачу сигналов, опосредованную PD-1, у мышей с гуманизированным PD-1, полученных согласно примеру 1, путем измерения ответов со стороны CD8⁺ Т-клеток и CD3⁺ Т-клеток и продуцирования IFNγ в селезенках имеющих опухоль мышей, обработанных антителом к PD-1.

[0211] Вкратце, клетки селезенки получали от мышей с гуманизированным PD-1 (75% C57BL/6/25% 129), обработанных антителом к PD-1 или контрольным антителом, в конце экспериментов в день 21 (описано выше). Выделяли общую РНК, и с обратно транскрибированной кДНК проводили ПЦР в режиме реального времени с применением олигонуклеотидов и смеси зондов TaqMan, специфичных к мышиному CD8b (прямой праймер:

[0212] Как показано на фигуре 6, введение антитела к hPD-1 индуцировало повышение продуцирования CD8⁺ и CD3⁺ Т-клеток в селезенках гуманизированных мышей (полученных согласно примеру 1), несущих опухоли из MC38.ova. Дополнительно, активность антитела к hPD-1 у имеющих опухоль мышей с гуманизированным PD-1 зависела от IFNγ, что подтверждало надлежащую передачу сигналов через гуманизированный PD-1 на клеточной поверхности. В целом для обеих групп обработки наблюдали повышение уровня Т-клеток и IFNγ по сравнению с мышами, обработанными контролем.

[0213] Экспрессию мРНК человеческого PD-1 измеряли с помощью зондов, специфичных к генам человека, предназначенных для внеклеточной части белка PD-1, и подтверждали надлежащую экспрессию гуманизированного белка PD-1 на клеточной поверхности. В дополнение, при измерении экспрессии мРНК мышиного PD-1 с помощью праймеров, предназначенных для выявления внеклеточной части мышиного PD-1, не удалось получить продукт.

[0214] В совокупности в данном примере демонстрируется, что животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно использовать для оценки эффективности лекарственных средств (например, антитела), целенаправленно воздействующих на PD-1, in vivo, и такие животные являются применимыми в проведении различий между антителами к PD-1 по терапевтическому эффекту. Более того, животных, отличных от человека, описанных в данном документе, можно применять для оценки степени, в которой лекарственные средства, целенаправленно воздействующие на PD-1, могут ингибировать рост опухоли и/или опосредовать уничтожение опухолевых клеток. Животные, отличные от человека (например, мыши), по настоящему изобретению демонстрируют функциональную передачу сигналов, опосредованную PD-1, и надлежащие PD-1-зависимые иммунные ответы посредством гуманизированного PD-1, о чем свидетельствует размножение Т-клеток и экспрессия цитокинов (например, IFN-γ).

Пример 4. Модель терапии опухоли с применением антител к PD-1 на грызунах

[0215] В данном примере демонстрируется, что животных, отличных от человека (например, грызуны), модифицированных с тем, чтобы содержать гуманизированный ген Pdcd1 согласно примеру 1, можно использовать в модели опухоли для определения оптимальной(оптимальных) терапевтической(терапевтических) дозы(доз) модуляторов PD-1 (например, антител к PD-1). В этом примере антитело к PD-1 вводят мышам, гомозиготным по гуманизированному эндогенному гену Pdcd1, описанному в примере 1, для определения оптимальной терапевтической дозы для лечения развившихся опухолей.

[0216] Вкратце, мышам, содержащим гуманизированный ген Pdcd1 (описанный в примере 1), подкожно имплантировали 1×10⁶ клеток MC38.Ova (описанных выше), а после этого их рандомизировали в шесть групп обработки (n=8-9 на группу) по достижении объемов опухолей 80-120 мм³ (день 0). Мышам внутрибрюшинно вводили антитело к hPD-1 в диапазоне повышающихся доз 0,3-25 мг/кг (т.е. 0,3, 1, 3, 10 или 25 мг/кг) или антитело изотипического контроля при 25 мг/кг. Антитела дозировали в дни 0, 3, 7, 10 и 13. Проводили мониторинг объемов опухолей путем измерений штангенциркулем дважды в неделю в течение всего периода проведения эксперимента (60 дней). Иллюстративные кривые роста опухолей приведены на фигуре 7.

[0217] Как показано на фигуре 7, ни одна из мышей, которым вводили контрольное антитело, не была безопухолевой в конце эксперимента. В отличие от этого, диапазон доз антитела к hPD-1 3-25 мг/кг давал в результате приблизительно 44-55% безопухолевых мышей среди различных групп обработки. В совокупности в данном примере демонстрируется, что животных, отличных от человека, по настоящему изобретению можно использовать в качестве модели опухоли на грызунах для определения оптимальной дозы и/или диапазона доз лекарственных средств (например, антитела), целенаправленно воздействующих на PD-1, для эффективного лечения развившихся опухолей.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

[0218] При наличии описанных таким образом некоторых аспектов по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения специалистам в данной области будет понятно, что различные изменения, модификации и улучшения без труда придут на ум специалистам в данной области. Подразумевается, что такие изменения, модификации и улучшения являются частью настоящего раскрытия, и подразумевается, что они находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения. Соответственно, вышеприведенные описание и графические материалы представлены исключительно в качестве примера, и настоящее изобретение подробно описано в нижеследующей формуле изобретения.

[0219] Порядковые термины, такие как «первый», «второй», «третий» и т.д., используемые в формуле изобретения для модификации элемента формулы изобретения, сами по себе не означают какой-либо приоритет, предшествование или порядок расположения одного элемента формулы изобретения перед другим или временной порядок, в котором осуществляют действия способа, но используются исключительно в качестве отметок для проведения различий между одним элементом формулы изобретения, имеющим определенное название, и другим элементом, имеющим такое же название (за исключением используемого порядкового термина), для проведения различий между элементами формулы изобретения.

[0220] Формы единственного числа, используемые в данном документе в описании и формуле изобретения, если четко не указано противоположное, следует понимать как включающие ссылки на множественное число. Признаки формулы изобретения или описания, включающие «или» между одним или более членами группы, считаются удовлетворенными, если один, более одного или все члены группы присутствуют в указанном продукте или способе, используются в них или иным образом имеют отношение к ним, если не указано противоположное или иное не очевидно из контекста. Настоящее изобретение включает варианты осуществления, в которых ровно один член группы присутствует в указанном продукте или способе, используется в них или иным образом имеет отношение к ним. Настоящее изобретение также включает варианты осуществления, в которых более одного или все члены группы присутствуют в указанном продукте или способе, используются в них или иным образом имеют отношение к ним. Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все варианты, комбинации и перестановки, в которых одно или более ограничений, элементов, условий, описательных терминов и т.д. из одного или более перечисленных пунктов формулы изобретения входят в другой пункт формулы изобретения, зависимый от того же основного пункта формулы изобретения (или, в зависимости от того, что применимо, любого другого пункта формулы изобретения), если не указано иное или если среднему специалисту в данной области не будет очевидным возникновение противоречия или несоответствия. В тех случаях, когда элементы представлены в виде перечней (например, в виде группы Маркуша или в аналогичном формате), следует понимать, что также раскрыта каждая подгруппа элементов, и любой(любые) элемент(элементы) можно исключить из группы. Следует понимать, что, как правило, в тех случаях, когда настоящее изобретение или аспекты настоящего изобретения рассматриваются как включающие конкретные элементы, признаки и т.д., определенные варианты осуществления настоящего изобретения или аспектов настоящего изобретения включают или включают главным образом такие элементы, признаки и т.д. В целях простоты эти варианты осуществления не были в каждом случае специально недвусмысленно изложены в данном документе. Также следует понимать, что любой вариант осуществления или аспект настоящего изобретения может быть явным образом исключен из формулы изобретения независимо от упоминания конкретного исключения в описании.

[0221] Специалистам в данной области будут понятны типичные среднеквадратические отклонения или ошибки, присущие значениям, получаемым в анализах или других процессах, описанных в данном документе. Публикации, вебсайты и другие справочные материалы, упоминаемые в данном документе для описания предпосылок настоящего изобретения и для предоставления дополнительных подробностей, относящихся к его практическому осуществлению, включены в данный документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Бурова, Елена

Муджика, Александер О.

Лаи, Ка-Ман Венус О.

Мерфи, Эндрю Дж.

<120> ЖИВОТНЫЕ, ОТЛИЧНЫЕ ОТ ЧЕЛОВЕКА, ИМЕЮЩИЕ ГУМАНИЗИРОВАННЫЙ ГЕН 1 ЗАПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК

<130> 31969 (10121US1)

<150> 62/086518

<151> 2014-12-02

<150> 62/138221

<151> 2015-03-25

<150> 62/014181

<151> 2014-06-19

<160> 29

<170> PatentIn версии3.5

<210> 1

<211> 1972

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 1

tgagcagcgg ggaggaggaa gaggagactg ctactgaagg cgacactgcc aggggctctg 60

ggcatgtggg tccggcaggt accctggtca ttcacttggg ctgtgctgca gttgagctgg 120

caatcagggt ggcttctaga ggtccccaat gggccctgga ggtccctcac cttctaccca 180

gcctggctca cagtgtcaga gggagcaaat gccaccttca cctgcagctt gtccaactgg 240

tcggaggatc ttatgctgaa ctggaaccgc ctgagtccca gcaaccagac tgaaaaacag 300

gccgccttct gtaatggttt gagccaaccc gtccaggatg cccgcttcca gatcatacag 360

ctgcccaaca ggcatgactt ccacatgaac atccttgaca cacggcgcaa tgacagtggc 420

atctacctct gtggggccat ctccctgcac cccaaggcaa aaatcgagga gagccctgga 480

gcagagctcg tggtaacaga gagaatcctg gagacctcaa caagatatcc cagcccctcg 540

cccaaaccag aaggccggtt tcaaggcatg gtcattggta tcatgagtgc cctagtgggt 600

atccctgtat tgctgctgct ggcctgggcc ctagctgtct tctgctcaac aagtatgtca 660

gaggccagag gagctggaag caaggacgac actctgaagg aggagccttc agcagcacct 720

gtccctagtg tggcctatga ggagctggac ttccagggac gagagaagac accagagctc 780

cctaccgcct gtgtgcacac agaatatgcc accattgtct tcactgaagg gctgggtgcc 840

tcggccatgg gacgtagggg ctcagctgat ggcctgcagg gtcctcggcc tccaagacat 900

gaggatggac attgttcttg gcctctttga ccagattctt cagccattag catgctgcag 960

accctccaca gagagcaccg gtccgtccct cagtcaagag gagcatgcag gctacagttc 1020

agccaaggct cccagggtct gagctagctg gagtgacagc ccagcgcctg caccaattcc 1080

agcacatgca ctgttgagtg agagctcact tcaggtttac cacaagctgg gagcagcagg 1140

cttcccggtt tcctattgtc acaaggtgca gagctggggc ctaagcctat gtctcctgaa 1200

tcctactgtt gggcacttct agggacttga gacactatag ccaatggcct ctgtgggttc 1260

tgtgcctgga aatggagaga tctgagtaca gcctgctttg aatggccctg tgaggcaacc 1320

ccaaagcaag ggggtccagg tatactatgg gcccagcacc taaagccacc cttgggagat 1380

gatactcagg tgggaaattc gtagactggg ggactgaacc aatcccaaga tctggaaaag 1440

ttttgatgaa gacttgaaaa gctcctagct tcgggggtct gggaagcatg agcacttacc 1500

aggcaaaagc tccgtgagcg tatctgctgt ccttctgcat gcccaggtac ctcagttttt 1560

ttcaacagca aggaaactag ggcaataaag ggaaccagca gagctagagc cacccacaca 1620

tccagggggc acttgactct ccctactcct cctaggaacc aaaaggacaa agtccatgtt 1680

gacagcaggg aaggaaaggg ggatataacc ttgacgcaaa ccaacactgg ggtgttagaa 1740

tctcctcatt cactctgtcc tggagttggg ttctggctct ccttcacacc taggactctg 1800

aaatgagcaa gcacttcaga cagtcagggt agcaagagtc tagctgtctg gtgggcaccc 1860

aaaatgacca gggcttaagt ccctttcctt tggtttaagc ccgttataat taaatggtac 1920

caaaagcttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1972

<210> 2

<211> 288

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 2

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp

20 25 30

Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met

50 55 60

Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala

65 70 75 80

Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln

85 90 95

Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp

100 105 110

Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val

130 135 140

Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala

165 170 175

Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val

180 185 190

Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp

195 200 205

Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala

210 215 220

Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro

225 230 235 240

Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly

245 250 255

Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln

260 265 270

Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 3

<211> 2115

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

agtttccctt ccgctcacct ccgcctgagc agtggagaag gcggcactct ggtggggctg 60

ctccaggcat gcagatccca caggcgccct ggccagtcgt ctgggcggtg ctacaactgg 120

gctggcggcc aggatggttc ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct 180

ccccagccct gctcgtggtg accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca 240

acacatcgga gagcttcgtg ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca 300

agctggccgc cttccccgag gaccgcagcc agcccggcca ggactgccgc ttccgtgtca 360

cacaactgcc caacgggcgt gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca 420

gcggcaccta cctctgtggg gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc 480

tgcgggcaga gctcagggtg acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc 540

cctcacccag gccagccggc cagttccaaa ccctggtggt tggtgtcgtg ggcggcctgc 600

tgggcagcct ggtgctgcta gtctgggtcc tggccgtcat ctgctcccgg gccgcacgag 660

ggacaatagg agccaggcgc accggccagc ccctgaagga ggacccctca gccgtgcctg 720

tgttctctgt ggactatggg gagctggatt tccagtggcg agagaagacc ccggagcccc 780

ccgtgccctg tgtccctgag cagacggagt atgccaccat tgtctttcct agcggaatgg 840

gcacctcatc ccccgcccgc aggggctcag ctgacggccc tcggagtgcc cagccactga 900

ggcctgagga tggacactgc tcttggcccc tctgaccggc ttccttggcc accagtgttc 960

tgcagaccct ccaccatgag cccgggtcag cgcatttcct caggagaagc aggcagggtg 1020

caggccattg caggccgtcc aggggctgag ctgcctgggg gcgaccgggg ctccagcctg 1080

cacctgcacc aggcacagcc ccaccacagg actcatgtct caatgcccac agtgagccca 1140

ggcagcaggt gtcaccgtcc cctacaggga gggccagatg cagtcactgc ttcaggtcct 1200

gccagcacag agctgcctgc gtccagctcc ctgaatctct gctgctgctg ctgctgctgc 1260

tgctgctgcc tgcggcccgg ggctgaaggc gccgtggccc tgcctgacgc cccggagcct 1320

cctgcctgaa cttgggggct ggttggagat ggccttggag cagccaaggt gcccctggca 1380

gtggcatccc gaaacgccct ggacgcaggg cccaagactg ggcacaggag tgggaggtac 1440

atggggctgg ggactcccca ggagttatct gctccctgca ggcctagaga agtttcaggg 1500

aaggtcagaa gagctcctgg ctgtggtggg cagggcagga aacccctcca cctttacaca 1560

tgcccaggca gcacctcagg ccctttgtgg ggcagggaag ctgaggcagt aagcgggcag 1620

gcagagctgg aggcctttca ggcccagcca gcactctggc ctcctgccgc cgcattccac 1680

cccagcccct cacaccactc gggagaggga catcctacgg tcccaaggtc aggagggcag 1740

ggctggggtt gactcaggcc cctcccagct gtggccacct gggtgttggg agggcagaag 1800

tgcaggcacc tagggccccc catgtgccca ccctgggagc tctccttgga acccattcct 1860

gaaattattt aaaggggttg gccgggctcc caccagggcc tgggtgggaa ggtacaggcg 1920

ttcccccggg gcctagtacc cccgccgtgg cctatccact cctcacatcc acacactgca 1980

cccccactcc tggggcaggg ccaccagcat ccaggcggcc agcaggcacc tgagtggctg 2040

ggacaaggga tcccccttcc ctgtggttct attatattat aattataatt aaatatgaga 2100

gcatgctaag gaaaa 2115

<210> 4

<211> 288

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro

225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 5

<211> 1972

<212>ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированный Pdcd1

<400> 5

tgagcagcgg ggaggaggaa gaggagactg ctactgaagg cgacactgcc aggggctctg 60

ggcatgtggg tccggcaggt accctggtca ttcacttggg ctgtgctgca gttgagctgg 120

caatcagggt ggcttctaga ctccccagac aggccctgga acccccccac cttctcccca 180

gccctgctcg tggtgaccga aggggacaac gccaccttca cctgcagctt ctccaacaca 240

tcggagagct tcgtgctaaa ctggtaccgc atgagcccca gcaaccagac ggacaagctg 300

gccgccttcc ccgaggaccg cagccagccc ggccaggact gccgcttccg tgtcacacaa 360

ctgcccaacg ggcgtgactt ccacatgagc gtggtcaggg cccggcgcaa tgacagcggc 420

acctacctct gtggggccat ctccctggcc cccaaggcgc agatcaaaga gagcctgcgg 480

gcagagctca gggtgacaga gagaagggca gaagtgccca cagcccaccc cagcccctca 540

cccaggccag ccggccagtt ccaaaccctg gtcattggta tcatgagtgc cctagtgggt 600

atccctgtat tgctgctgct ggcctgggcc ctagctgtct tctgctcaac aagtatgtca 660

gaggccagag gagctggaag caaggacgac actctgaagg aggagccttc agcagcacct 720

gtccctagtg tggcctatga ggagctggac ttccagggac gagagaagac accagagctc 780

cctaccgcct gtgtgcacac agaatatgcc accattgtct tcactgaagg gctgggtgcc 840

tcggccatgg gacgtagggg ctcagctgat ggcctgcagg gtcctcggcc tccaagacat 900

gaggatggac attgttcttg gcctctttga ccagattctt cagccattag catgctgcag 960

accctccaca gagagcaccg gtccgtccct cagtcaagag gagcatgcag gctacagttc 1020

agccaaggct cccagggtct gagctagctg gagtgacagc ccagcgcctg caccaattcc 1080

agcacatgca ctgttgagtg agagctcact tcaggtttac cacaagctgg gagcagcagg 1140

cttcccggtt tcctattgtc acaaggtgca gagctggggc ctaagcctat gtctcctgaa 1200

tcctactgtt gggcacttct agggacttga gacactatag ccaatggcct ctgtgggttc 1260

tgtgcctgga aatggagaga tctgagtaca gcctgctttg aatggccctg tgaggcaacc 1320

ccaaagcaag ggggtccagg tatactatgg gcccagcacc taaagccacc cttgggagat 1380

gatactcagg tgggaaattc gtagactggg ggactgaacc aatcccaaga tctggaaaag 1440

ttttgatgaa gacttgaaaa gctcctagct tcgggggtct gggaagcatg agcacttacc 1500

aggcaaaagc tccgtgagcg tatctgctgt ccttctgcat gcccaggtac ctcagttttt 1560

ttcaacagca aggaaactag ggcaataaag ggaaccagca gagctagagc cacccacaca 1620

tccagggggc acttgactct ccctactcct cctaggaacc aaaaggacaa agtccatgtt 1680

gacagcaggg aaggaaaggg ggatataacc ttgacgcaaa ccaacactgg ggtgttagaa 1740

tctcctcatt cactctgtcc tggagttggg ttctggctct ccttcacacc taggactctg 1800

aaatgagcaa gcacttcaga cagtcagggt agcaagagtc tagctgtctg gtgggcaccc 1860

aaaatgacca gggcttaagt ccctttcctt tggtttaagc ccgttataat taaatggtac 1920

caaaagcttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1972

<210> 6

<211> 288

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированный PD-1

<400> 6

Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Ile Gly Ile Met Ser Ala

165 170 175

Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val

180 185 190

Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp

195 200 205

Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala

210 215 220

Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro

225 230 235 240

Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly

245 250 255

Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln

260 265 270

Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 7

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: прямой праймер 7106 hTU

<400> 7

cccagcagagacttctcaatgac 23

<210> 8

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: зонд 7106 hTU

<400> 8

tggcccttccagagcccttg 20

<210> 9

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: обратный праймер 7106 hTU

<400> 9

cggccacctgctcacatc 18

<210> 10

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: прямой праймер7106 hTD

<400> 10

ggcatctctgtcctctagctc 21

<210> 11

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: зонд 7106 hTD

<400> 11

aagcaccccagcccctctagtctg 24

<210> 12

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: обратный праймер 7106 hTD

<400> 12

gggctgtgggcacttctg 18

<210> 13

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: прямой праймер7106 TU

<400> 13

ccttcctcacagctctttgttc 22

<210> 14

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: зонд 7106 TU

<400> 14

tctgcatttcagaggtccccaatgg 25

<210> 15

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: обратный праймер 7106 TU

<400> 15

gagccaggctgggtagaag 19

<210> 16

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: прямой праймер 7106 TD

<400> 16

cggtgtcctagaactctattctttg 25

<210> 17

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: зонд 7106 TD

<400> 17

tcctggagacctcaacaagatatccca 27

<210> 18

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: обратный праймер 7106 TD

<400> 18

tgaaaccggccttctggtt 19

<210> 19

<211> 156

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 19

tcaaaggacagaatagtagcctccagaccctaggttcagttatgctgaaggaagagccct 60

ctcgagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatatgcatggcctccgcgccgg 120

gttttggcgcctcccgcgggcgcccccctcctcacg 156

<210> 20

<211> 236

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 20

ctggaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgctagtaactataacggtcct 60

aaggtagcgagctagcaagaggctctgcagtggaggccagtgcccatccccgggtggcag 120

aggccccagcagagacttctcaatgacattccagctggggtggcccttccagagcccttg 180

ctgcccgagggatgtgagcaggtggccggggaggctttgtggggccacccagcccc 236

<210> 21

<211> 160

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 21

cccttccagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcacccaggccag 60

ccggccagttccaaaccctggtcattggtatcatgagtgccctagtgggtatccctgtat 120

tgctgctgctggcctgggccctagctgtcttctgctcaac 160

<210> 22

<211> 232

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 22

tcaaaggacagaatagtagcctccagaccctaggttcagttatgctgaaggaagagccct 60

ctcgagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgctagtaactataacggtcc 120

taaggtagcgagctagcaagaggctctgcagtggaggccagtgcccatccccgggtggca 180

gaggccccagcagagacttctcaatgacattccagctggggtggcccttcca 232

<210> 23

<211> 883

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид: фрагмент человеческой ДНК размером 883 п.о.

<400> 23

aagaggctctgcagtggaggccagtgcccatccccgggtggcagaggccccagcagagac 60

ttctcaatgacattccagctggggtggcccttccagagcccttgctgcccgagggatgtg 120

agcaggtggccggggaggctttgtggggccacccagccccttcctcacctctctccatct 180

ctcagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagccctgctcgtggt 240

gaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgt 300

gctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggccgccttccccga 360

ggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcg 420

tgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtgg 480

ggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggt 540

gacaggtgcggcctcggaggccccggggcaggggtgagctgagccggtcctggggtgggt 600

gtcccctcctgcacaggatcaggagctccagggtcgtagggcagggaccccccagctcca 660

gtccagggctctgtcctgcacctggggaatggtgaccggcatctctgtcctctagctctg 720

gaagcaccccagcccctctagtctgccctcacccctgaccctgaccctccaccctgaccc 780

cgtcctaacccctgacctttgtgcccttccagagagaagggcagaagtgcccacagccca 840

ccccagcccctcacccaggccagccggccagttccaaaccctg 883

<210> 24

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 24

gctctggctggtcttcagtatg 22

<210> 25

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 25

ttgccgtatggttggtttgaac 22

<210> 26

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 26

agcagctctgccctcat 17

<210> 27

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 27

acttccacatgagcgtgg 18

<210> 28

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 28

gggctgtgggcacttctg 18

<210> 29

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический олигонуклеотид

<400> 29

gcagatcaaa gagagcctgc 20

Реферат

Изобретение относится к области биохимии, в частности к грызуну, экспрессирующему гуманизированный полипептид 1 запрограммированной гибели клеток (PD-1), к его клетке, ткани, а также к способу его получения. Также раскрыт способ оценки фармакокинетических свойств лекарственного средства, целенаправленно воздействующего на человеческий PD-1, предусматривающий использование вышеуказанного грызуна. Изобретение позволяет эффективно получать грызуна, экспрессирующего гуманизированный полипептид 1 запрограммированной гибели клеток. 8 н. и 18 з.п. ф-лы, 8 ил., 8 табл., 4 пр.

Формула