Нецитотоксическое вещество, способ регуляции выделения нейромедиатора или нейромодулятора из первичных сенсорных афферентных клеток и способ регуляции выделения нейромедиатора и нейромодулятора из первичных ноцицептивных афферентных клеток - RU2165976C2

Чертежи

Показать все 8 чертежа(ей)

Описание

Это изобретение относится к новому средству, которое способно модифицировать функции периферической афферентной системы. Это средство может подавлять выделение нейромедиаторов из дискретных популяций нейронов и тем самым снижать, или, предпочтительно, предотвращать, передачу афферентных болевых сигналов от периферических к центральным болевым волокнам. Это вещество может использоваться в медикаменте, или в виде медикамента для лечения боли, особенно хронической боли.

Предпосылки создания изобретения
Ощущение прикосновения традиционно рассматривалось как одно из пяти классических чувств, но в действительности оно является очень сложным, передающим ряд различных ощущений. Эти ощущения регистрируются на периферии нервными окончаниями и связанными с ними структурами. Некоторые из этих рецепторов являются специфическими для механических стимулов различного рода, таких как прикосновение, давление, вибрация и деформация волос на голове или лице. Другой класс нервных окончаний способен обнаруживать температуру, причем при нагревании и охлаждении активируются разные волокна. Другие популяции нервных окончаний обычно не возбуждаются мягкими стимулами, а возбуждаются только при сильном воздействии. Чувствительные нервы этой категории часто отвечают на более чем один стимул и известны как высокопороговые полимодальные волокна. Они могут задействоваться для ощущения потенциально повреждающих ситуаций или объектов. Полимодальные волокна передают также химические сигналы, такие, как ощущение "жжения", вызываемое кислотой. Таким образом, ощущение прикосновения может передавать очень детализированное описание объектов и служить как при информирующих, так и при предостерегающих явлениях.

Превращение сенсорных сигналов с периферии в самоощущение достигается с помощью полинейронного пути и центров переработки информации мозга. Первые нервные клетки пути, участвующие в передаче сенсорных стимулов, называются первичными сенсорными афферентными клетками. Группы первичных сенсорных афферентных клеток головы и некоторых из внутренних органов находятся в разных ганглиях, связанных с черепно-мозговыми нервами, в частности с ядром тройничного нерва и ядром одиночного тракта. Группы клеток первичных чувствительных афферентных путей для остальных частей тела располагаются в дорзальных корешковых ганглиях спинного мозга. Первичные сенсорные афферентные клетки и процессы в них классифицированы гистологически; клеточные узлы делятся на два класса A-типа - большие (60-120 мкм в диаметре), тогда B-типа - меньше 14-30 мкм) и более многочисленные. Соответствующие процессы делятся на две категории: у C-волокон отсутствует миелиновая оболочка, которая есть у A-волокон. A-волокна могут быть далее подразделены на A_β-волокна, которые имеют большой диаметр с хорошо развитой миелиновой оболочкой. Общепринято считать, что A_β-волокна идут от скоплений клеток A-типа, и что A_δ- и C-волокна идут от скоплений клеток B-типа. Эти классификации могут быть продолжены далее и подразделяться по изучению селективной экспрессии ряда молекулярных маркеров.

Функциональные анализы показывают, что при нормальных обстоятельствах A_β-волокна передают ощущения прикосновения и различие умеренной температуры, тогда как C-волокна главным образом эквивалентны полимодальным высокопороговым волокнам, упомянутым выше. Роль A_β-волокон менее ясна, так как они, по-видимому, имеют разные способы реакции, как с высоким, так и с низким порогом чувствительности.

После активации первичных сенсорных афферентных клеток следующей стадией при передаче сенсорных сигналов является активация передающих нейронов, которые несут сигнал в более высокие части центральной нервной системы, такие как ядра таламуса. Клеточные скопления этих нейронов (кроме тех, которые связаны с черепно-мозговыми нервами) расположены в дорзальных рогах спинного мозга. Это также происходит там, где расположены синапсы между первичными афферентными волокнами и передающими нейронами. Дорзальный рог образован несколькими слоями, которые наложены друг на друга, причем слой I является самым дорзальным, за которым следует слой II, и т.д. Различные классы первичных афферентных волокон имеют синапсы в разных слоях. Для кожных первичных афферентных клеток C-волокна имеют синапсы в слоях I и II, A_δ-волокна - в слоях I, II и V, а A_β-волокна - в слоях III, IV и V. Более глубокие слои (V-VII, X), как полагают, включены в сенсорные пути, идущие из более глубоких тканей, таких как мышцы и внутренние органы.

Преобладающим нейромедиатором в синапсах между первичными афферентными волокнами и передающими нейронами является глютамат, хотя важно, что C-волокна содержат несколько нейропептидов, таких как субстанция P и пептид, связанный с геном кальцитонина (ПСГК). A-волокна могут также выделять нейропептиды, такие как нейропептид Y, при некоторых обстоятельствах.

Эффективность передачи в этих синапсах может быть изменена через нисходящие пути и с помощью локальных промежуточных нейронов в спинном мозге. Эти модуляторные нейроны выделяют ряд медиаторов, которые являются или подавляющими (например, опиоидными пептидами, глицином) или возбуждающими (например, окись азота, холецистокинин) для обеспечения механизма усиления или снижения стимуляции ощущений.

Категорией ощущения, которая требует такой физиологической модуляции, является боль. Боль является ощущением, которое может предупреждать о повреждении или болезни, и как таковое является существенно важным для повседневной жизни. Но порой, однако, существует необходимость быть способным игнорировать ее, и физиологически это является функцией, например, опиоидных пептидов. К сожалению, несмотря на эти физиологические механизмы, боль может продолжать ощущаться во время заболеваний и после травм долго после того, как пользы от нее уже нет. При этих обстоятельствах боль становится симптомом заболевания, который лучше было бы облегчить.

Клинически боль можно разделить на три категории: (1) Острая боль, обычно возникающая в результате травмы или хирургического вмешательства, которая, как ожидается исчезнет, когда рана заживает. (2) Хроническая боль, возникающая в результате злокачественного заболевания; большинство людей с метастазирующим раком ощущают боль, от умеренной до сильной, и эта проблема разрешается или путем успешного лечения заболевания или в результате смерти пациента. (3) Хроническая боль, вызываемая незлокачественным заболеванием; эта боль имеет гетерогенное происхождение, вызывается рядом заболеваний, включая артрит и периферические нейропатии, которые обычно не являются угрожающими жизни, но которые могут продолжаться в течение десятилетий с повышающимся уровнем боли.

Физиология боли, которая возникает в результате повреждения ткани, более понятна, чем той, которая вызывается нарушениями центральной нервной системы. В нормальных условиях ощущения, которые приводят к боли, сначала вызываются A_δ- и C-волокнами, которые несут высокопороговые сигналы. Таким образом, синапсы в слоях I и II участвуют в передаче болевых сигналов с использованием глютамата и пептидов, выделяемых C-волокнами, чтобы вызвать активацию соответствующих передающих нейронов. Однако существуют данные, что при некоторых состояниях хронической боли болевые сигналы могут нести другие A-волокна (включая A_β -волокна) и таким образом действовать как первичные ноцицептивные афференты, например, при гипералгезии и аллодинии, связанной с нейропатической болью. Эти изменения связывали с экспрессией пептидов, таких как нейропептид Y, в A-волокнах. Во время различных состояний хронической боли синапсы разных сенсорных афферентных волокон с передающими нейронами могут быть модифицированы различными путями: могут существовать изменения в морфологии, приводящие к повышению числа синапсов, могут меняться уровни и соотношения различных пептидов и может меняться чувствительность передающих нейронов.

При условии огромности клинической проблемы, представляемой болью, были затрачены огромные усилия на поиск способов для ее облегчения. Наиболее широко известные фармацевтические препараты для облегчения боли делятся на две категории: (1) Нестероидные противовоспалительные препараты (НСПВП), включающие аспирин и ибупрофен, (2) опиониды, включающие морфин.

НСПВП оказывают свое главное анальгетическое действие на периферии путем подавления продукции простагландинов поврежденными тканями. Простагландины, как было показано, являются периферическими медиаторами боли и воспаления, и снижение их концентрации приносит облегчение больным. Это особенно выражено в случае артрита в легкой форме, когда воспаление является главной причиной боли. Предполагают, что простагландины участвуют в медиации боли в спинном мозге и головном мозге; этим можно объяснить, почему НСПВП обладают анальгетическим действием при некоторых состояниях боли, которые не включают воспаление или повреждение периферической ткани. Однако, поскольку простагландины являются только одним из нескольких медиаторов боли, одни НСПВП эффективны для снижения некоторых типов легкой боли до приемлемых уровней. Они рассматриваются как имеющие потолок активности, выше которого повышение доз не дает увеличения облегчения боли. Кроме того, они обладают различным побочным действием, которое ограничивает их применение при хронических болезнях. Применение НСПВП связано с воспалением желудочно-кишечного тракта, а продолжительное применение может привести к развитию обширного изъязвления кишечника. Это особенно реально у пожилых больных, которые образуют наибольшую группу больных, например, с артритом.

Опиоиды действуют на уровне спинного мозга с подавлением эффективности нейромышечной передачи между первичными ноцицептивными волокнами (главным образом C-волокнами) и передающими нейронами. Они осуществляют это, вызывая продолжительную гиперполяризацию обоих элементов этих синапсов. Использование опиоидов эффективно для облегчения большинства видов острой боли и хронической боли при злокачественных заболеваниях. Существует, однако, ряд состояний с хронической болью при злокачественных заболеваниях, которые частично или полностью не поддаются опиоидной анальгезии, особенно те, которые включают сдавливание нерва, например путем образования опухоли. К сожалению опиоиды также имеют нежелательные системные побочные эффекты, включающие: (1) угнетение дыхательной системы на уровне дыхательных центров в головном мозге; (2) индукцию запора путем ряда эффектов на гладкую мускулатуру желудочно-кишечного тракта; и (3) психоактивные эффекты, включающие успокоение и индукцию эйфории. Эти побочные эффекты проявляются при дозах, сходных с теми, которые вызывают анальгезию, и поэтому ограничивают дозы, которые можно давать больным.

Введение опиоидов на уровне спинного мозга может снижать резкость побочных эффектов, но требует или частых повторных инъекций в спинно-мозговую жидкость или установки катетера, оба эти способа повышают риск отрицательных побочных эффектов. Установка катетера требует, чтобы больной по существу был прикован к постели, таким образом дополнительно ограничивая качество жизни.

Использование опиоидов для лечения некоторых других типов хронической боли в основном неэффективно или нежелательно. Примеры включают боль, связанную с ревматоидным артритом и нейромами, которые развиваются после повреждения нерва. Нежелательные свойства лечения опиоидами у этих больных связаны не только с уже упомянутыми побочными эффектами и с возможной продолжительностью заболевания, а также с четвертым главным побочным эффектом опиоидов: зависимостью. Опиоиды, такие как морфин и героин, являются хорошо известными лекарствами, связанными с злоупотреблением, которое приводит к физической зависимости, этот последний побочный эффект включает развитие толерантности: доза препарата, необходимая для получения того же самого анальгетического эффекта, со временем повышается. Это может приводить к состоянию, при котором дозы, необходимые для облегчения боли, являются угрожающими жизни из-за первых трех побочных эффектов.

Хотя НСПВП и опиоиды полезны при лечении боли, существует общее мнение, что они часто не подходят для адекватного лечения боли, особенно хронической и сильной боли.

Используются также и другие виды лечения, в частности для лечения сильной хронической боли, включая хирургическое нарушение болевых путей на нескольких уровнях от периферических нервов до сечения дорзальных корешков и от кордотомии до разрушения гипофиза. Все они, однако, являются наиболее тяжелыми операциями, которые связаны со значительным риском для больного.

Поэтому можно видеть, что сохраняется значительная потребность разработки новых классов фармацевтических препаратов для лечения многих типов боли. Желательные свойства такой новой терапии могут быть кратко выражены следующим образом: (1) способность обеспечить значительное облегчение боли, включая сильную; (2) отсутствие системных побочных действий, которые значительно снижают качество жизни больного; (3) длительное действие, которое не требует частых инъекций или длительной катетеризации больных; (4) получение средств, которые не приводят к толерантности и связанной с этим зависимости.

Изложение изобретения
Данное изобретение относится к средству, которое может снижать и, предпочтительно, предотвращать передачу сигналов боли с периферии в центральную нервную систему, тем самым снижая ощущение боли. Конкретно, изобретение может обеспечить средство, которое может снижать и, предпочтительно, предупреждать передачу сигналов боли с ноцицептивных афферентных клеток передающим нейронам. Более конкретно, это изобретение может обеспечить средство, которое может подавить экзоцитоз по крайней мере одного нейромедиаторного или нейромодуляторного вещества из по крайней мере одного вида ноцицептивных афферентных клеток.

В первом аспекте этого изобретения представлено средство, которое может быть введено системно, и может конкретно доставляться к определенным популяциям ноцицептивных афферентных клеток для того, чтобы подавить выделение по крайней мере одного нейромедиатора или нейромодулятора из синаптических окончаний нервов.

Во втором аспекте изобретения представлено средство, которое может применяться местно на периферии и которое способно подавлять выделение по крайней мере одного нейромедиатора или нейромодулятора из синаптических окончаний ноцицептивных афферентных клеток, передающих болевой сигнал с периферии.

В третьем аспекте этого изобретения представлено средство, которое может вводиться в спинно-мозговую жидкость и которое может подавлять выделение по крайней мере одного нейромедиатора или нейромодулятора из синаптических окончаний ноцицептивных афферентных волокон, оканчивающихся в области спинного мозга.

В четвертом аспекте изобретения представлено средство, которое может специфически доставляться в определенные популяции афферентных нейронов, так что действие средства ограничивается этим типом клеток.

В пятом аспекте изобретения представлен способ лечения боли, который включает введение эффективной дозы средства по этому изобретению.

В шестом аспекте изобретения это средство может быть экспрессировано рекомбинантно в виде белка слияния, который включает необходимые компоненты средства.

Определения
Без желания быть ограниченными представленными ниже определениями, предполагается, что в этом описании следующие термины имеют следующие значения:
Легкая цепь означает меньшую из двух полипептидных цепей, которые образуют нейротоксины клостридий; она имеет молекулярную массу примерно 50 кДа и обычно называется L-цепь или просто L.

Тяжелая цепь означает большую из двух полипептидных цепей, которые образуют нейротоксины клостридий; она имеет молекулярную массу, равную примерно 100 кДа, и обычно называется H-цепью или просто H.

H_C-фрагмент означает фрагмент, полученный из H-цепи нейротоксина клостридий, примерно эквивалентный карбокси-концевой части H-цепи, или домен, соответствующий этому фрагменту в интактной H-цепи. Он содержит домен природного токсина, участвующего в связывании моторных нейронов.

H_N-фрагмент означает фрагмент, произведенный из H-цепи нейротоксина бактерий, примерно эквивалентный амино-концевой половине H-цепи, или домен, соответствующий этому фрагменту в интактной H-цепи. Он содержит домен, участвующий в транслокации L-цепи через мембрану эндосом.

LH_N означает фрагмент, полученный из нейротоксина клостридий, который содержит L-цепь, или функциональный его фрагмент, соединенный с фрагментом H_N. Его обычно получают из интактного нейтротоксина путем нейропротеолиза.

Доставочная (нацеливающая) часть (ДЧ) означает любую химическую структуру вещества, которое функционально взаимодействует со связывающим сайтом, создавая физическую связь между веществом и поверхностью первичной сенсорной афферентной клетки.

Связывающий сайт (СС) означает структуру на поверхности клетки, с которой экзогенные молекулы способны взаимодействовать таким образом, чтобы привести к физической связи с клеткой.

Первичная сенсорная афферентная клетка является нервной клеткой, которая может передавать сенсорную информацию с периферии к центральной нервной системе.

Первичная ноцицептивная афферентная клетка является нервной клеткой, которая может нести сенсорную информацию с периферии к центральной нервной системе, где эта информация может приводить к ощущению боли.

Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет окрашивание кумасси анализа электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ЭПАС-ДСН) фракций с хроматографии исключения размера продуктов реакции присоединения между дериватизированным фактором роста нервной ткани (ФРН) и дериватизированным LH_N с BoNT/A.

Фиг. 2 представляет окрашивание кумасси анализа ЭПАГ-ДСН конъюгата ФРН и LH_N, в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях.

Фиг. 3 представляет Вестерн-блоттинг экстрактов клеток PC12, обработанных конъюгатом ФРН и LH_N, зондированный антителами, которые распознают продукт протеолиза SNAP-25 по L-цепи BoNT/A.

Фиг. 4 представляет Вестерн-блоттинг экстрактов нейронов ганглиев дорзальных корешков крыс, обработанных конъюгатом ФРН и LH_N, зондированный антителами, которые распознают продукт протеолиза SNAP-25 по L-цепи BoNT/A.

Детальное описание изобретения
Можно видеть, что вещество для снижения или предотвращения проведения болевых сигналов с периферии, ноцицептивных афферентных нейронов к передающим нейронам имеет множество потенциальных применений при снижении ощущения боли, особенно сильной хронической боли.

По этому изобретению получают вещество, которое может подавлять выделение по крайней мере одного нейромедиатора или нейромодулятора или обоих из синаптических окончаний ноцицептивных афферентных клеток.

Это вещество обладает рядом дискретных функций:
1) Оно связывает поверхностную структуру (связывающий сайт [СС], который является характерным и обладает некоторой степенью специфичности для ноцицептивных афферентных нейронов.

2) Оно проникает в нейрон. Проникновение молекул в клетку может происходить путем процесса эндоцитоза. Только некоторые СС на поверхности клетки подвергаются эндоцитозу, и предпочтительно, СС, с которыми связывается вещество, является одним из них. При одном аспекте этого изобретения СС присутствуют на периферических, сенсорных волокнах ноцицептивных афферентных нейронов и после поглощения клеткой подвергаются обратному транспорту в тело клетки и центральные процессы нейрона, и таким образом, что вещество также доставляется в эти области нейрона. В другом аспекте этого изобретения СС, с которыми связывается вещество, присутствует в центральных процессах или теле клетки ноцицептичного афферентного нейрона.

3) Вещество проникает в цитозоль.

4) Вещество модифицирует компоненты механизма экзоцитоза, присутствующие в синаптических окончаниях центральных процессов этих нейронов, так что снижается или, предпочтительно, предотвращается выделение по крайней мере одного нейромедиатора или нейромодулятора.

Неожиданно, что вещество данного изобретения может продуцироваться путем модификации нейротоксина клостридий или его фрагмента. Нейротоксины клостридий являются белками с молекулярной массой порядка 150 кДа. Они продуцируются разными видами рода Clostridium, наиболее значительно C.tetani, и несколькими штаммами C.botulium. В настоящее время известно восемь различных классов нейротоксинов: столбнячный токсин, ботулинический нейротоксин в его серотипах A, B, C1, D, E, F и G, и они все обладают сходным строением и способом действия. Нейротоксины клостридий синтезируются бактериями в виде единичного полипептида, который модифицируется посттрансляционно с образованием двух полипептидных цепей, соединенных вместе дисульфидной связью. Две цепи называются тяжелой цепью (H), которая имеет молекулярную массу, равную примерно 100 кДа, и легкой цепью (L), которая имеет молекулярную массу, равную примерно 50 кДа. Нейротоксины бактерий связывают с акцепторным сайтом на клеточной мембране моторного нейрона на нейромышечном соединении и проникают в клетку путем механизма эндоцитоза. Проникшие в клетку нейротоксины бактерий обладают высоко специфичной активностью, зависимой от цинка эндоцептидазы, которая гидролизует специфичную пептидную связь в по крайней мере одном из трех белков, синаптобревина, синтаксина или SNAP-25, которые являются решающими компонентами нейросекретного механизма, и эта активность токсинов клостридий приводит к продолжительному мышечному параличу. Активность зависимой от цинка эндопептидазы нейротоксинов клостридий, как обнаружено, находится в L-цепи. Нейротоксины клостридий высокоселективны для двигательных нейронов благодаря специфичной природе акцепторного сайта на этих нейронах. Специфичная активность по связыванию с нейромышечным соединением нейротоксинов бактерий, как известно, находится в карбокси-концевой части компонента из тяжелой цепи молекулы нейротоксина из двух цепей, в области, известной как H_C.

Неожиданно, что путем ковалентного связывания нейротоксина клостридий, или гибрида двух нейротоксинов клостридий, в котором область H_C область H-цепи была удалена или модифицирована с новой молекулой или частью (заместителем), доставочная часть (ДЧ), которая связывается с СС на поверхности сенсорных нейронов, получается новое вещество, способное к подавлению выделения по крайней мере одного нейромедиатора или нейромодификатора из ноцицептивных афферентных клеток. Дополнительный неожиданный аспект данного изобретения состоит в том, что если L-цепь нейротоксина клостридий или фрагмент L-цепи, заключающие эндопептидазную активность, ковалентно связаны с ДЧ, которая также может действовать на проникновение L-цепи или ее фрагмента в цитоплазму сенсорного нейрона, это также создает новое вещество, способное к подавлению выделения по меньшей мере одного нейромедиатора или нейромодулятора. Ковалентные связи, используемые для того, чтобы соединить составные части вещества, могут включать соответствующие разделительные (спейсерные) области.

ДЧ обеспечивает специфичность для СС на ноцицептивных афферентных нейронах. Компонент ДЧ этого вещества может включать одну из многих клеточных связывающих молекул, включающих, но не ограничивающихся ими, антитела, моноклональные антитела, фрагменты антител (Fab, F(ab)'₂, Fv, ScFv и т.д.), лектины и лиганды к рецепторам для гормонов, цитокинов, факторов роста или нейропептидов. Перечень возможных ДЧ дан в таблице 1, этот перечень является иллюстративным и не предназначен для ограничения широты выбора ДЧ, которые могли бы отвечать требованиям этого изобретения. При одном осуществлении этого изобретения ДЧ связывается с СС, который подвергается обратному транспорту.

Известно, что H_C часть молекулы нейротоксина может быть отделена от остальной части тяжелой цепи, известной как H_N, так что фрагмент H_N остается связанным дисульфидом с легкой цепью (L-цепью) молекулы нейротоксина, чтобы получить фрагмент, известный как LH_N. Таким образом при одном осуществлении данного изобретения фрагмент LH_N нейротоксина клостридий ковалентно связывается с использованием связей, которые могут включать одну или более разделяющих областей, с ДЧ.

При другом осуществлении изобретения домен H_C нейротоксина клостридий изменяется или модифицируется, например, путем химической модификации, чтобы снизить или, предпочтительно, устранить его способность связывать нейротоксин с рецепторами на нейромышечном соединении. Этот модифицированный нейротоксин клостридий затем ковалентно связывается с использованием связей, которые могут включать одну или более разделяющих областей, с ДЧ.

При другом осуществлении этого изобретения тяжелая цепь нейротоксина бактерий, в которой домен H_C изменен или модифицирован, например, путем химической модификации, чтобы снизить или, предпочтительно, устранить его способность связывать нейротоксин с рецепторами на нейромышечном соединении, присоединяется к L-цепи другого нейротоксина клостридий. Гибридный модифицированный нейротоксин клостридий затем ковалентно связывается с использованием связывающих групп, которые могут включать одну или более разделяющих областей, с ДЧ.

При другом осуществлении этого изобретения часть H_N нейротоксина клостридий соединяется с L-цепью другого нейротоксина клостридий. Гибридный LH_N затем ковалентно связывается с использованием связывающих групп, которые могут включать одну или более спейсерных областей, с ДЧ.

При другом осуществлении этого изобретения легкая цепь нейротоксина клостридий или фрагмент легкой цепи, содержащие эндопептидазную активность, связывается с использованием связывающих групп, которые могут включать одну или более спейсерных областей, с ДЧ, которая может также осуществлять проникновение легкой цепи или ее фрагмента, содержащего эндопептидазную активность, в цитоплазму клетки.

При другом осуществлении этого изобретения это вещество рекомбинантно экспрессируется как белок слияния, который включает соответствующий фрагмент доставочной части в дополнение к желаемым спейсерным доменам. Рекомбинантно экспрессируемое вещество может производиться полностью геном, кодирующим один серотип нейротоксина, или быть химерой, производимой генами, кодирующими два разных серотипа.

При другом осуществлении этого изобретения необходимая LH_N, которая может быть гибридной из L и H_N из разных типов токсинов клостридий, рекомбинантно экспрессируется в виде слитого белка, с ДЧ и могут также включать одну или более спейсерных областей.

При другом осуществлении этого изобретения легкая цепь нейротоксина клостридий или фрагмент легкой цепи, содержащий эндопептидазную активность, экспрессируется рекомбинантно в виде белка слияния с ДЧ, которая может также осуществлять проникновение в клетку легкой цепи или ее фрагмента, содержащего эндопептидазную активность, в цитоплазму клетки. Экспрессируемый слитый белок может также включать одну или более спейсерных областей.

Основой этого описания является создание новых веществ с очень специфичной и определенной активностью в отношении ограниченного и определенного класса нейронов (первичные сенсорные афферентные клетки), и как таковые эти вещества могут рассматриваться как представляющие одну из форм нейротоксина. Терапевтическое применение ботулинических нейротоксинов также хорошо известно в этой области ранее. Способ действия ботулинических нейротоксинов, который описан в предшествующих работах, однако, состоит в механизме подавления выделения ацетилхолина, и осуществляется в отношении категории мишеневых нейронов, эфферентных двигательных нейронов, явно отличается от действия веществ, описанных в этом изобретении. В прототипе не указывается на какую-либо активность химической структуры раскрываемых веществ. Таким образом, хотя, как обсуждается в этой заявке, в прототипе много сообщается о природных нейротоксинах клостридий, природные немодифицированные нейротоксины бактерий не являются предметом этого раскрытия. Вещество этого изобретения требует модификации нейротоксинов бактерий, так что свойство доставки (нацеливания), указанное в прототипе, устраняется. Модифицированный нейротоксин затем соединяется с новой (нацеливающей) доставочной функциональной группой (ДЧ) с получением нового вещества с новыми биологическими свойствами, отличающимися от свойств природных нейротоксинов клостридий, и не указанными в прототипе. Это является новым веществом с новыми свойствами, которые являются предметом этого описания.

Использование в промышленности
Вещество, описанное в этом изобретении, может использоваться in vivo, или непосредственно или в виде фармацевтически приемлемой соли, для лечения боли.

Например, вещество по этому изобретению может применяться системно для лечения тяжелой хронической боли. Конкретным примером этого является применение при лечении объективной боли, связанной с ревматоидным артритом, поражающим многие суставы.

В другом примере вещество по этому изобретению может применяться местно для лечения боли. Конкретным примером этого является лечение путем местного введения в сустав, пораженный воспалением при боли.

В последующем примере вещество по этому изобретению может быть введено с помощью инъекции в спинно-мозговую жидкость (эпидуральной или интратекальной) на уровне сегмента спинного мозга, участвующего в иннервации пораженного органа, для лечения боли. Это, например, применимо при лечении боли, происходящей из глубоких тканей, такой как хроническая боль при злокачественном заболевании.

Данное изобретение теперь будет проиллюстрировано с помощью ссылок на следующие неограничивающие примеры.

Пример 1. Синтез конъюгата ФРН и LH_N фрагмента BoNT/A
Лиофилизированный мышиный 2,5 S ФРН растворяли путем добавления воды и диализировали в буфер MES (0,1 М MES, 0,1 М хлорид натрия, pH 5,0). К этому раствору (при концентрации, равной примерно 0,3 мг/мл) добавляли PD PH (100 мг/мл в ДМФ) до конечной концентрации, равной 1 мг/мл. После перемешивания добавляли твердый EDAC с получением конечной концентрации, равной 0,2 мг/мл. Давали пройти реакции в течение по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. Избыток PDPH удаляли путем удаления соли на колонке PD-10 (Pharmacia), предварительно уравновешенной буфером MES.

LH_N фрагмент BoNT/A получали по существу по методу Shone C.C., Hambleton P. , and Melling, J., 1987, Eur, J. Biochem, 167, 175-180. Количество LH_N, эквивалентное половине используемого ФРН, растворенное в триэтаноламиновом буфере (0,02 М триэтаноламин/HCl, 0,1 М хлорид натрия, pH 7,8) при концентрации, равной примерно 1 мг/мл, приводили в реакцию с реагентом Траута (100 мМ эталонный раствор в 1 М триэтаноламин/HCl, pH 8,0) при конечной концентрации, равной 2 мМ. Через час LH_N обессоливали в ФБФРЭ (фосфатно-буферном физиологическом растворе с 1 мМ ЭДТУ) с использованием колонки PD-10 (Pharmacia). Белковый пик из колоночного элюата концентрировали с использованием Microcon 50 (Amicon) до концентрации, равной примерно 2 мг/мл.

Дериватизированный ФРН подвергали конечной стадии концентрирования, приводящей к снижению объема менее 10% от исходного и затем смешивали с дериватизированным LH_N в течение ночи при комнатной температуре. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE = ЭПАГ-ДСН).

Конъюгат, полученный в результате вышеприведенной реакции, частично очищали с помощью хроматографии исключения по размеру через Bio-Gel P-100 (Bio-Rad). За картиной элюирования следили путем измерения оптической плотности при 280 нм и с помощью анализа фракций путем ЭПАГ-ДСН. Это давало возможность отделения конъюгата от свободного ФРН и побочных продуктов реакции.

Фиг. 1 представляет анализ фракций путем ЭПАГ-ДСН с одной такой колонки Bio-Gel P-100. Свободный LH_N и конъюгат (M_r 100 кДа и выше) четко отделялись от большинства свободного ФРН (M_r 13 кДа). Поскольку 2,5 S ФРН является гомодимером, образованным с помощью нековалентного взаимодействия, он диссоциирует при обработке ДСН. Таким образом, молекулы, которые образованы ковалентными перекрестными связями с LH_N через только одну субъединицу будут диссоциировать во время анализа ЭПАГ-ДСН и давать увеличение полосы свободного ФРН, наблюдаемое на фракциях 4-6. Этот результат показывает, что гомодимерная структура ФРН остается интактной после дериватизации. Свободный LH_N, наблюдаемый в этих фракциях, представляет второстепенный компонент, который не соединен с ФРН. Фракции 4-6 объединяли перед дальнейшим анализом.

Фиг. 2 показывает анализ конъюгата с помощью ЭПАГ-ДСН в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Дорожка 1 представляет свободный LH_N в невосстанавливающих условиях, дорожка 2 представляет то же самое количество LH_N, восстановленное с помощью 50 мМ дитиотреитола. Дорожки 3 и 4 представляют конъюгат после хроматографии исключения по размеру или без восстановления (дорожка 3) или с восстановлением (дорожка 4) дитиотреитолом. Подобным же образом, дорожки 5 и 6 показывают ФРН без восстановления или с восстановлением, соответственно. Результаты четко показывают, что вещество на дорожке 5 с выявленной молекулярной массой более 100 кДа дает при восстановлении полосы только составляющих частей LH_N и ФРН. Кроме того, интенсивность полос после восстановления является такой, что они должны быть произведены из другого материала, а не из небольших количеств свободного LH_N и ФРН, наблюдаемых в невосстановленном образце. Единственным доступным источником для избытка является вещество с выявленной молекулярной массой >100 кДа. Конъюгат во фракциях, полученных после хроматографии исключения по размеру, таким образом, представляет ФРН и LH_N, ковалентно связанные путем восстанавливаемых дисульфидных связей.

Фракции, содержащие конъюгат, хранили при 4^oC до затребования.

Пример 2. Активность конъюгата ФРН и LH_N в клетках PC-12
Клетки PC12 являются клеточной линией нейроэктодермального происхождения, которые обычно используются как модельная система для изучения функции нервов. В качестве модельной системы для испытания действия конъюгата ФРН и LH_N, они обладают двумя необходимыми свойствами: во-первых, известно, что они имеют клеточные поверхностные рецепторы для ФРН, которые, как было показано, участвуют в процессе дифференциации в ответ на низкие концентрации ФРН. Во-вторых, они, как было показано, имеют механизмы экзоцитоза для выделения нейромедиатора, включающий, что важно для этого примера, SNAP-25.

Клетки PC12 помещали в 24-ячеечную плату, которая была покрыта подложечным мембранным матриксом MATRIGEL (Collaborative Biomedical Products), при плотности, равной примерно 5 · 10⁵ клеток на ячейку. После нескольких дней культивирования (RPMI 1640 с 2 мМ глютамина, 10% лошадиной сыворотки и 5% плодной телячьей сыворотки, 37^oC, 5% CO₂) среду заменяли свежей средой, содержащей добавленный конъюгат (приготовленный, как описано в примере 1) или LH_N или без добавки. После выдерживания культуры в течение ночи среду удаляли, и клетки промывали один раз свежей средой. Клетки затем лизировали путем добавления 0,45 мл гидроксида натрия (0,2 М) в течение 30 мин. После этого срока растворы нейтрализовали путем добавления 0,45 мл хлористоводородной кислоты (0,2 М) с последующим добавлением 0,1 мл ГЭПЭС/NaOH (1 М, pH 7,4). Чтобы экстрагировать мембранные белки из этих смесей добавляли Тритон-X-114 (10%, об/об) и инкубировали при 4^oC в течение 60 мин, нерастворимый материал удаляли путем центрифугирования, а супернатанты затем прогревали при 37^o C в течение 30 мин. Полученные две фазы разделяли путем центрифугирования и верхнюю фазу отбрасывали. Белки в нижней фазе осаждали с помощью хлороформа/метанола для анализа путем Вестерн-блоттинга.

Образцы разделяли с помощью ЭПАГ-ДСН и переносили на нитроцеллюлозу. Протеолиз SNAP-25, решающего компонента нейросекреторного процесса и субстрат для цинк-зависимой эндопептидазной активности BoNT/A, затем определяли путем пробы с антителом, распознающим недавно открытый карбокси-конец расщепленного SNAP-25 (антитело описано в Patent Application PCT/GB 95/01279). Фиг. 3 показывает пример такого Вестерн-блоттинга. Не наблюдалось значительной иммунореактивности в образцах из контрольных клеток (дорожки 1 и 2), тогда как наблюдалась слабая полоса, соответствующая молекулярной массе, равной 29 кДа в образцах, инкубированных с 10 мг/мл LH_N (дорожки 5 и 6) и сильная полоса в образцах, инкубированных с 10 мг/мл конъюгата ФРН и LH_N (дорожки 3 и 4). Таким образом инкубация клеток PC12 с конъюгатом приводит к заметному протеолизу SNAP-25, показывающему, что конъюгат имеет введенную зависимую от цинка протеолитическую активность L-цепи BoNT/A в клеточной цитоплазме. Слабая или отсутствие такой активности наблюдалось с образующими компонентами конъюгата.

Инкубация клеток с конъюгатом в присутствии избытка свободного ФРН приводила к сниженной продукции протеолитического продукта SNAP-25, по сравнению с инкубацией с одним конъюгатом. Это показывает, что действие конъюгата происходит путем взаимодействия доставочной части ФРН с поверхностными рецепторами клетки для ФРН.

Пример 3. Активность конъюгата ФРН и LH_N в первичных культурах нейронов ганглиев дорзальных корешков
Ганглии дорзальных корешков содержат клеточные тела первичных ноцицептивных афферентных клеток. Хорошо установлено, что в первичных культурах in vitro этой ткани нейроны сохраняют многие из характеристик ноцицептивных афферентных клеток. Эти характеристики включают способность выделять нейропептиды, такие как субстанция P, в ответ на химические раздражители, которые, как известно, вызывают боль in vivo (например, капсаицин). Кроме того, нейроны, как известно, обладают рецепторами к ФРН.

Первичные культуры нейронов ганглиев дорзальных корешков создавали после диссоциации ганглиев, иссеченных у зародышей крыс (эмбриональный возраст 12-15 дней). Клетки распределяли по 12-ячеечным платам при начальной плотности, равной 3 · 10⁵ клеток/ячейку в среде, содержащей ФРН (100 нг/мл). Через один день культивирования добавляли свежую среду, содержащую цитозина арабинозид (10 мМ), чтобы убить нейронные клетки. Цитозина арабинозид удаляли через 2-4 дня. Через еще несколько дней культивирования среду заменяли свежей, содержащей конъюгат LH_N в отсутствие ФРН. После инкубации в течение ночи при 37^oC среду удаляли, клетки лизировали и гидрофобные белки экстрагировали, используя Тритон-X-114, как описано в примере 2.

Образцы анализировали путем Вестерн-блоттинга, как описано в примере 2, с антителами, которые распознают продукт BoNT/A протеолиза SNAP-25. Никакой иммунореактивности не наблюдалось в образцах из контрольных клеток (дорожка 4), тогда как в образцах, инкубированных с 10 мг/мл LH_N (дорожка 3) наблюдалась слабая полоса, соответствующая молекулярной массе 29 кДа, и сильная - в образцах, инкубированных с 10 мг/мл конъюгата ФРН и LH_N (дорожки 1 и 2).

Этот результат показывает, что конъюгат может доставлять протеолитически активную L-цепь BoNT/A в цитоплазму нейронных клеток, которые in vivo образуют первичные ноцицептивные афферентные волокна.

Пример 4. Продукция химерных LH_N, в которых L-цепь происходит из BoNT/B, а H_N-фрагмент - из BoNT/A
H_N-фрагмент из BoNT/A получают по методу, описанному Shone C.C., Hambleton P., and Melling, J. (1987, Eur. J. Biochem. 167, 175-180), а L-цепь из BoNT/B - по методу Sathyamoorthy, V. and DasGupta, B.R. (1985, J. Biol. Chem. 260, 10461-10466). Из свободного цистеина на H_N-фрагменте из BoNT/A затем получают производное путем добавления десятикратного молярного избытка дипиридилсульфида с последующей инкубацией при 4^oC в течение ночи. Избыток дипиридилсульфида и тиопиридона, побочного продукта, затем удаляли путем обессоливания белка на колонке PD10 (Pharmacia) в ФБФР (фосфатно-буферный физиологический раствор).

Дериватизированный H_N затем концентрировали до концентрации белка в избытке, равной 1 мг/мл перед смешиванием с эквимолярной частью L-цепи из BoNT/B (>1 мг/мл в ФБФР). После инкубации в течение ночи при комнатной температуре смесь разделяли с помощью хроматографии исключения по размеру на Superose 6 (Pharmacia), и фракции анализировали с помощью ЭПАГ-ДСН. После этого имеется в наличии LH_N для получения производного для продукции конъюгата с целевой доставкой, как описано в примере 1.

Примеры, описанные выше, являются чисто иллюстративными для изобретения. При синтезе вещества присоединение ДЧ к модифицированному нейротоксину клостридий или его фрагменту достигается путем химического присоединения с использованием реагентов и методик, известных опытным специалистам. Таким образом, хотя в данных примерах используются химические реакции с PDPH/EDAC и реагентом Траута, любые другие реакции присоединения, путем которых возможно ковалентное связывание компонента ДЧ этого вещества с компонентом - производным нейротоксина клостридий, и известные опытным специалистам, охватываются объемом этой заявки. Подобным же образом для опытного специалиста очевидно, что могла бы использоваться также кодирующая ДНК для или всего вещества или фрагментов вещества, которую можно легко сконструировать, с экспрессией в соответствующем микроорганизме, для рекомбинантной технологии получения этого вещества или фрагментов этого вещества. Такие генетические конструкции для вещества этого изобретения, получаемые известными опытным специалистам методами, также охватываются объемом этого изобретения.

Таблица 1. Возможные (нацеливающие) достаточные части (ДЧ)
Факторы роста
1. Фактор роста нервной ткани (ФРН)
2. Фактор подавления лейкемии (ФПЛ)
3. Основной фактор роста фибробластов (оФРФ)
4. Вырабатываемый головным мозгом нейтотрофный фактор (НТФГМ)
5. Нейротрофин-3 (НТ-3)
6. Активаторный пептид hydra head (HHAP)
7. Фактор трансформации роста 1 (ФТР-1)
8. Фактор трансформации роста 2 (ФТР-2)
9. Фактор трансформации роста (ФТР)
10. Эпидермальный фактор роста (ЭФП)
11. Цилиарный нейротрофный фактор (ЦНТФ)
Цитокины
1. Фактор некроза опухоли (ФНО)
2. Интерлейкин-1 (ИЛ-1)
3. Интерлейкин-1 (ИЛ-1)
4. Интерлейкин-8 (ИЛ-8)
Пептиды
1. Эндорфин
2. Метионин-энкефалин
3. D-Ala²-D-Leu⁵-энкефалин
4. Брадикинин
Антитела
Антитела к лактосерийным углеводным эпитопам, обнаруженным на поверхности нейронов ганглиев дорзальных корешков (например, моноклональные антитела IB2 и LA4).

2. Антитела к любому из рецепторов для лиганд, данных выше.

3. Антитела к антигену Thyl, экспрессируемому на поверхности (например, моноклональные антитела MRC OX7).

Пример 5. Продукция NC164 - конъюгата лектина Erythrina corallodendron и LH_N/A.

Материалы
Лектин из E.corallodendron (EcL) получали от Sigma Ltd.

LH_N/A получали, по существу, в соответствии с методикой Shone C.Q, Hambleton, P. и Melling, J., 1987, Eur. J. Biochem. 167, 175-180.

SPDP получали от Pierce Chemical Co.

Обессоливающие колонки PD-10 получали от Pharmacia.

Диметилсульфоксид (ДМСО) поддерживали безводным путем хранения над молекулярными ситами.

Электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) проводили с использованием гелей и реактивов, полученных от Novex.

Агарозу с иммобилизованной лактозой получали от Sigma Ltd.

Дополнительные реактивы получали от Sigma Ltd.

Методы
Лиофилизованный лектин (EcL) регидратировали в фосфатно-буферном растворе (ФБР) до конечной концентрации 10 мг/мл. Аликвоты данного раствора хранили при -20^oC до применения.

EcL взаимодействовал с равной концентрацией SPDP вследствие добавления 10 мМ маточного раствора SPDP в ДМСО при перемешивании. По прошествии одного часа при комнатной температуре реакцию останавливали путем обессоливания в ФБР на колонке PD-10.

Тиопиридоновую уходящую группу удаляли из продукта путем восстановления дитиотреитолом (ДТТ, 5 мМ, 30 мин). Продукт данной реакции анализировали спектрофотометрически при 280 нм и 343 нм в целях определения достигнутой степени дериватизации. Достигнутая степень дериватизации составила 0,8 ± 0,06 моль/моль. Тиопиридон и ДТТ удаляли с помощью еще одного обессоливания в ФБР на колонке PD-10.

LH_N/A обессоливали в PBSE (ФБР, содержащий 1 мМ ЭДТА). Проводили реакцию полученного раствора (0,5-1,0 мг/мл) с четырех- или пятикратным избытком SPDP путем добавления 10 мМ маточного раствора SPDP в ДМСО. По прошествии 3 ч при комнатной температуре реакцию останавливали путем обессоливания в ФБР на колонке PD-10.

Часть производного LH_N/A удаляли из раствора и восстанавливали ДТТ (5 мМ, 30 мин). Данный образец анализировали спектрофотометрически при 280 нм и 343 нм в целях определения степени дериватизации. Достигнутая степень дериватизации составила 2,26 ± 0,10 моль/моль.

Производное LH_N/A и производное EcL перемешивали в такой пропорции, что EcL присутствовал более, чем в трехкратном молярном избытке. Реакция конъюгации протекала в течение >16 ч при 4^oC.

Содержащую продукт смесь центрифугировали в целях удаления всех выпавших осадков. Супернатант концентрировали путем центрифугирования через концентраторы (с пределом исключения по молекулярной массе 10000-50000) до проведения двухстадийной методики очистки. На первой стадии концентрированный материал наносили на колонку с Superose 12 в хроматографической системе СЖХБ (Pharmacia). Колонку элюировали ФБР и профиль элюции изучали при 280 нм. Фракции анализировали по методу SDS-PAGE на гелях с градиентом 4-20% полиакриламида и подвергали окрашиванию кумасси синим. Основную полосу конъюгата выделяли из смеси оставшегося неконъюгированных LH_N/A и EcL. Фракции, содержащие конъюгат, собирали перед второй хроматографической стадией на агарозе с иммобилизованной лактозой. Отобранные пост-Superose-12 фракции наносили на промытую ФБР агарозу с лактозой и инкубировали в течение 2 часов при 4^oC для улучшения связывания. Лектинсодержащие белки (т.е. конъюгаты EcL-LH_N/A) оставались связанными с агарозой во время последующего промывания ФБР в целях удаления примесей (преимущественно неконъюгированного LH_N/A). Конъюгат EcL-LH_N/A элюировали с колонки путем добавления 0,3 М лактозы (в ФБР) и профиль элюции изучали при 280 нм. Фракции, содержащие конъюгат собирали, диализовали против ФБР и хранили при 4^oC до применения.

Пример 6. Конъюгат NC164 обладает специфичностью в отношении блокирования нейрональной активности по передаче сигналов боли в отсутствие значительных эффектов на нейроны, не участвующие в передаче таких сигналов.

Чувствительные нейроны спинно-мозговых корешков (СМК) играют важную роль в передаче афферентных сигналов в ЦНС. В состав данной гетерогенной популяции нейронов входят немиелинизированные C-волокна малого диаметра, ответственные за передачу сигналов боли. Передача сигналов данными нейронами в ЦНС происходит посредством синапсов, где быстрым нейротрансмиттером является глютамат. Данные C-волокна также экспрессируют и высвобождают нейропептиды, включая вещество P.

Как C-волокна, так и Α_δ-волокна ответственны за передачу сигналов боли путем высвобождения нейротрансмиттеров и/или нейромодуляторов (например, глютамата) и нейропептидов (например, вещества P).

Как показано на фиг. 5 и 7, введение конъюгата NC164 путем интратекальной инъекции крысам проводило к значительному снижению как реакции C-волокон, так и A_δ-волокон. На фиг. 6 показано, что конъюгат NC164 не оказывает значительного эффекта на порог активности C-волокна, тогда как на фиг. 8 показано, что конъюгат NC164 обладает специфичностью в отношении блокирования нейрональной активности по передаче сигналов боли в отсутствие значительных эффектов на нейроны других типов (например, A_β-волокна), которые не участвуют в передаче сигналов боли.

Ключевые данные по конъюгату NC164 приведены ниже.

Результаты исследований in vivo
Требованием к анальгетикам на основе эндопептидаз является их способность in vivo ингибировать высвобождение нейротрансмиттера в первичных афферентных синапсах спинного мозга, посредством чего блокируется передача сигнала боли. Проводилась оценка соединения NC164 как в поведенческих, так и в электрофизиологических моделей боли. Ключевым результатом исследований in vivo, очевидно, является то, что NC164 подавляет активность C-волокон в электрофизиологической модели in vivo с обработкой за 24 часа.

Дозу в размере 45 мкг NC164 в 10 мкл носителя вводили путем интратекальной инъекции на уровне L4-L5 за 24 часа до электрофизиологического анализа нейрональной активности. Результаты, полученные на группе из 3 животных, у каждого из которых исследования проводились на 10 нейронах, показали, что реакции C-волокон нейронов значительно ослаблялись (фиг. 5) при том, что порог стимула повышался лишь слегка (фиг. 6). Также значительно ослаблялись реакции A_δ-волокон (фиг. 7). Реакции A_β-волокон на данный стимул оставались, по существу, неизменными (фиг.. 8).

Экспериментальные данные показывают, что нейроэндопептидаза NC164 оказывает селективное блокирующее пресинаптическое воздействие на нейрональную активность, вызванную вредоносным стимулом, (боль) in vivo. В острой электрофизиологической модели анальгезия развивается с 5-часовой задержкой, и эффект все еще силен через 24 часа после введения. Профили NC164 in vitro (не указано) и in vivo свидетельствуют о том, что нейроэндопептидазы являются мощными анальгетиками с продолжительным временем действия.

Таким образом, заявителем разработан ряд анальгетиков на основе нейроэндопептидаз, полученных из серотипа A ботулинического нейротоксина (BoNT/A). Ряд исследований in vitro и in vivo показал, что данные соединения обладают необходимой мощностью, продолжительностью и селективностью действия для применения в лечении умеренной и сильной боли. Сравнимые результаты были получены при использовании целого ряда соединений, включая различные лиганды.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Предложено вещество, которое способно модифицировать функции периферической афферентной системы, и способ его использования. Изобретение позволяет уменьшить болевой синдром при острых и хронических заболеваниях. 2 с. и 34 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.

Формула