Оптимизированные с помощью компьютера антигены с широким спектром реактивности для вирусов гриппа h3n2 - RU2653756C2

Чертежи

Показать все 8 чертежа(ей)

Описание

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США №61/596014, поданной 7 февраля 2012 г., которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее раскрытие относится к оптимизированным белкам-гемагглютининам вируса гриппа, которые вызывают иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении вирусов гриппа H3N2, H2N2 или В, и к их применению в качестве вакцин.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вирус гриппа является представителем семейства Orthomyxoviridae. Существует три подтипа вирусов гриппа, обозначаемые как вирус гриппа А, вирус гриппа В и вирус гриппа С. Вирион вируса гриппа содержит геном, состоящий из сегментированной отрицательно-полярной нити РНК, который кодирует следующие белки: гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксный белок (M1), белок протонного канала (М2), нуклеопротеин (NP), основный белок полимеразного комплекса 1 (РВ1), основный белок полимеразного комплекса 2 (РВ2), кислый белок полимеразного комплекса (РА) и неструктурный белок 2 (NS2). Белки НА, NA, M1 и М2 являются белками, ассоциированными с мембраной, тогда как NP, РВ1, РВ2, РА и NS2 являются белками, ассоциированными с нуклеокапсидом. Белок M1 является наиболее распространенным белком в частицах вируса гриппа. Белки НА и NA являются гликопротеинами оболочки, отвечающими за прикрепление вируса и проникновение вирусных частиц в клетку, а также являются источниками основных иммунодоминантных эпитопов для нейтрализации вируса и для защитного иммунитета. Как белок HA, так и белок NA считаются наиболее важными компонентами профилактических вакцин против гриппа.

Ежегодно сезонные вспышки гриппа являются причиной более 300000 случаев госпитализации и 36000 смертельных случаев только в США (Simonsen et al., Lancet Infect Dis 7:658-66, 2007). Появление нового вируса гриппа H1N1 в 2009 г. показало, насколько быстро пандемия нового вида гриппа может распространиться по всему миру. Штаммы вируса гриппа H3N2 могут инфицировать как птиц, так и млекопитающих, и вирус гриппа H3N2 становится все более распространенным при сезонном гриппе. H2N2 является другим подтипом вируса гриппа, который ранее вызывал вспышки пандемии среди людей. Штамм H2N2 вызвал пандемию в 1957 году в Азии. Вирус гриппа B является другим типом вируса гриппа, который инфицирует людей, и представляет собой существенную причину сезонного гриппа, но не известно, чтобы он вызывал вспышки пандемии, поскольку у него ограниченный круг хозяев (люди и тюленевые).

В настоящее время в США лицензированы два типа подходов к вакцинации против гриппа – применение инактивированной сплит-вакцины и применение вакцины на основе живого ослабленного вируса. Инактивированные вакцины могут эффективно индуцировать гуморальный иммунный ответ, но, как правило, вызывают только незначительный клеточный иммунный ответ. Вакцины на основе живого вируса не могут вводиться пациентам с ослабленным иммунитетом или беременным пациентам в связи с имеющимся у них повышенным риском развития инфекции. Таким образом, существует потребность в вакцине против вируса гриппа, обладающей широким спектром защитной активности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

В данном документе раскрывается получение оптимизированных с помощью компьютера полипептидов HA вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B, вызывающих иммунный ответ с широким спектром реактивности против вируса гриппа. Оптимизированные полипептиды HA разрабатывали путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего получения консенсусных последовательностей на основании строения определенных изолятов вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B.

В данном документе представлены рекомбинантные полипептиды HA вируса гриппа, имеющие оптимизированную аминокислотную последовательность, вызывающие иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B. В некоторых вариантах осуществления полипептид HA содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,6% идентичную SEQ ID NO: 1, по меньшей мере на 99,4% идентичную SEQ ID NO: 2, по меньшей мере на 99,7% идентичную SEQ ID NO: 4, по меньшей мере на 99,6% идентичную SEQ ID NO: 5, по меньшей мере на 98,8% идентичную SEQ ID NO: 6, по меньшей мере на 99,7% идентичную SEQ ID NO: 8, по меньшей мере на 98,4% идентичную SEQ ID NO: 9, по меньшей мере на 97,8% идентичную SEQ ID NO: 10 или по меньшей мере на 98,9% идентичную SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность полипептида содержит не более 2 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 1; не более 3 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 2; не более 1 аминокислотной замены по сравнению с SEQ ID NO: 4; не более 2 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 5; не более 7 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 6; не более 10 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 8; не более 9 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 9; не более 10 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 10; или не более 6 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления в полипептиде НА вируса гриппа отсутствует N-концевой метиониновый остаток.

Молекулы выделенных нуклеиновых кислот и векторы, кодирующие рекомбинантные полипептиды НА, также обеспечиваются в настоящем раскрытии. Дополнительно обеспечиваются выделенные клетки, содержащие такие векторы.

Также представлены вирусоподобные частицы (VLP), сходные с частицами вируса гриппа, и слитые белки, содержащие оптимизированные полипептиды НА, раскрытые в данном документе.

Дополнительно представлены композиции, которые включают оптимизированные полипептиды НА вируса гриппа, слитые белки или VLP, раскрытые в данном документе, в фармацевтически приемлемом носителе. В настоящем раскрытии также предусмотрены способы вызова иммунного ответа против вируса гриппа у субъекта путем введения раскрытых композиций, слитых белков или VLP.

Также представлены способы иммунизации субъекта против вируса гриппа путем введения субъекту композиции, содержащей VLP, которая содержит оптимизированный полипептид НА.

Вышеуказанные и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными из последующего подробного описания, которое следует далее ссылаясь на прилагаемые графические материалы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA НА вируса гриппа H2N2 в соответствии со способом 2, как описано в примере 1.

Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H2N2 в соответствии со способом 3, как описано в примере 1.

Фиг. 3 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа B в соответствии со способом 2, как описано в примере 2.

Фиг. 4 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа B в соответствии со способом 3, как описано в примере 2.

Фиг. 5 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H3N2 в соответствии со способом 1, как описано в примере 3.

Фиг. 6 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H3N2 в соответствии со способом 2, как описано в примере 3.

Фиг. 7 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H3N2 в соответствии со способом 3, как описано в примере 3.

Фиг. 8 представляет собой схематическое изображение, которое обобщает способ получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H3N2 в соответствии со способом 4, как описано в примере 3.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, показаны с помощью стандартных буквенных обозначений для нуклеотидных оснований и трехбуквенного кода для аминокислот, как определено в §1.822 главы 37 Свода федеральных нормативных актов США. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но подразумевается, что комплементарная цепь включена в документ посредством любой ссылки на указанную цепь. Перечень последовательностей представлен в виде текстового файла с кодировкой ASCII, созданного 30 января 2013 года, 53,7 KB, который включен в данный документ посредством ссылки. В прилагаемом перечне последовательностей:

SEQ ID NO: 1-4 представляют собой аминокислотные последовательности COBRA для HA вируса гриппа H2N2.

SEQ ID NO: 5-7 представляют собой аминокислотные последовательности COBRA для HA вируса гриппа B.

SEQ ID NO: 8-11 представляют собой аминокислотные последовательности COBRA для HA вируса гриппа H3N2.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

I. Сокращения

COBRA: оптимизированный с помощью компьютера антиген с широким спектром реактивности;

HA: гемагглютинин;

HAI: подавление гемагглютинина;

HRP: пероксидаза хрена;

M1: матриксный белок 1;

NA: нейраминидаза;

PFU: бляшкообразующая единица;

VLP: вирусоподобная частица.

II. Выражения и способы

Если не указано иное, технические выражения используются согласно традиционному способу употребления. Определения общепринятых выражений в области молекулярной биологии могут быть найдены в Benjamin Lewin, Genes V, опубликованном Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованном Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованном VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Для того чтобы облегчить обзор различных вариантов осуществления настоящего раскрытия, представлены следующие объяснения конкретных выражений.

Адъювант. Вещество или среда, которые неспецифически усиливают иммунный ответ в отношении антигена. Адъюванты могут включать суспензию минеральных веществ (квасцы, гидроксид алюминия или фосфат алюминия), на которой адсорбируется антиген; или эмульсию типа “вода-в-масле”, в которой раствор антигена эмульгирован в минеральном масле (например, неполном адъюванте Фрейнда), иногда с включением убитых микобактерий (полный адъювант Фрейнда) для дополнительного усиления антигенных свойств. В качестве адъювантов можно также применять иммуностимулирующие олигонуклеотиды (как, например, содержащие мотив CpG) (например, см. патенты США №№6194388; 6207646; 6214806; 6218371; 6239116; 6339068; 6406705 и 6429199). Адъюванты также включают биологические молекулы, такие как ко-стимулирующие молекулы. Иллюстративные биологические адъюванты включают IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L и 41 BBL.

Вводить. Как применяется в данном документе, введение композиции субъекту означает предоставление, нанесение или приведение композиции в контакт с субъектом. Введение можно осуществлять любым из ряда путей, как, например, местным, пероральным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным, подоболочечным и внутрикожным.

Антитело. Молекула иммуноглобулина, вырабатываемая B-лимфоцитами с определенной аминокислотной последовательностью. Выработка антител у людей или других животных происходит под действием специфического антигена (иммуногена). Антитела характеризуются специфической реакцией с антигеном, происходящей некоторым очевидным образом, при этом каждое из выражений “антитело” и “антиген” определен относительно другого. Выражение “вызывать ответ с формированием антител” относится к способности антигена или другой молекулы индуцировать выработку антител.

Антиген. Соединение, композиция или вещество, которое может стимулировать выработку антител или Т-клеточный ответ у животного, в том числе композиции, инъецируемые животному или поглощаемые ним. Антиген реагирует с продуктами специфических гуморальных или клеточных иммунных реакций, в том числе с таковыми, индуцируемыми гетерологичными иммуногенами. В некоторых вариантах осуществления раскрытых композиций и способов антиген представляет собой белок HA вируса гриппа.

Подвергнутый оптимизации кодонов. Выражение “нуклеиновая кислота, подвергнутая оптимизации кодонов” относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая была изменена таким образом, что кодоны являются оптимальными для экспрессии в конкретной системе (такой как конкретный вид или группа видов). Например, последовательность нуклеиновой кислоты может быть оптимизирована для экспрессии в клетках млекопитающих. Оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность кодируемого белка.

Слитый белок. Белок, полученный путем экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, сконструированной из последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют по меньшей мере часть двух различных (гетерологичных) белков. Для создания слитого белка последовательности нуклеиновых кислот должны находиться в одной той же рамке считывания и не содержать внутренних стоп-кодонов. Например, слитый белок может включать НА вируса гриппа, слитый с гетерологичным белком.

Гемагглютинин (НА). Поверхностный гликопротеин вируса гриппа. НА опосредует связывание вирусной частицы с клетками-хозяевами и последующее проникновение вируса в клетку-хозяина. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности множества белков НА вирусов гриппа известны в данном уровне техники и публично доступны, как, например, через NCBI базу данных ресурсов по вирусам гриппа (Bao et al., J Virol 82:596-601, 2008). НА (наряду с NA) является одной из двух основных антигенных детерминант вируса гриппа.

Иммунный ответ. Ответ клетки иммунной системы, такой как В-клетка, Т-клетка, макрофаг или полиморфноядерный лейкоцит, на стимул, такой как антиген или вакцина. Иммунный ответ может затрагивать любую клетку тела, участвующую в защитной реакции организма-хозяина, включая, например, эпителиальную клетку, которая секретирует интерферон или цитокин. Иммунный ответ включает, но без ограничений, врожденный иммунный ответ или воспаление. Как применяется в данном документе, защитный иммунный ответ относится к иммунному ответу, который защищает субъект от инфекции (предупреждает инфекцию или предупреждает развитие заболевания, ассоциированного с инфекцией). Способы оценивания иммунных ответов хорошо известны в данном уровне техники и включают, например, оценивание пролиферации и/или активности лимфоцитов (таких как В- или Т-клетки), секреции цитокинов или хемокинов, воспаления, выработки антител и т.п.

Иммуноген. Соединение, композиция или вещество, которое в соответствующих условиях способно стимулировать иммунный ответ, такой как выработка антител или Т-клеточный ответ, у животного, в том числе композиции, инъецируемые животному или поглощаемые ним. Как применяется в данном документе, “иммуногенная композиция” представляет собой композицию, которая содержит иммуноген (например, полипептид HA).

Подвергать иммунизации. Предоставлять субъекту защиту от инфекционного заболевания, например, путем вакцинации.

Вирус гриппа. Вирус с сегментированной отрицательно-полярной нитью РНК, который принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Существует три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирусы гриппа А инфицируют большое число видов птиц и млекопитающих, в том числе людей, лошадей, морских млекопитающих, свиней, хорьков и кур. У животных большинство вирусов гриппа A вызывают локализованные инфекции дыхательных путей и кишечника в легкой форме. Тем не менее, высокопатогенные штаммы вируса гриппа A, такие как H5N1, вызывают системные инфекции домашней птицы, при которых смертность может достигать 100%. В 2009 г. вирус гриппа H1N1 был наиболее частой причиной заболевания людей гриппом. Новый штамм H1N1, происходящий от свиней, появился в 2009 г. и был объявлен пандемическим Всемирной организацией здравоохранения. Этот штамм был назван “вирусом свиного гриппа”. Вирусы гриппа A H1N1 также были причиной пандемии испанского гриппа в 1918 г., вспышки заболевания в Форт-Дикс в 1976 г. и эпидемии гриппа в России в 1977-1978 гг. Вирусы гриппа H3N2, H2N2 и B также инфицируют людей и являются этиологическим фактором сезонного гриппа.

Выделенный. “Выделенный” биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота, белок или вирус) был практически отделен или очищен от других биологических компонентов (таких как клеточный детрит или другие белки или нуклеиновые кислоты). Биологические компоненты, которые были “выделены”, включают компоненты, очищенные с помощью стандартных способов очистки. Это выражение также охватывает рекомбинантные нуклеиновые кислоты, белки или вирусы (или VLP), а также химически синтезированные нуклеиновые кислоты или пептиды.

Линкер. Одна или несколько аминокислот, которые служат в качестве спейсера между двумя полипептидами слитого белка.

Матриксный белок (M1). Структурный белок вируса гриппа, обнаруженный в оболочке вируса. Полагают, что M1 участвует в сборке и отпочковании.

Нейраминидаза (NA). Мембранный гликопротеин вируса гриппа. NA участвует в разрушении клеточного рецептора к вирусному НА за счет отщепления концевых остатков сиаловой кислоты от углеводных фрагментов, расположенных на поверхности инфицированных клеток. NA также отщепляет остатки сиаловой кислоты от вирусных белков, предупреждая агрегацию вирусов. NA (наряду с НА) является одной из двух основных антигенных детерминант вируса гриппа.

Функционально связанный. Первая последовательность нуклеиновой кислоты является функционально связаннойй со второй последовательностью нуклеиновой кислоты в том случае, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты размещена в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если этот промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, функционально связанные последовательности ДНК являются смежными и, при необходимости, соединения двух областей, кодирующих белок, находятся в одной и той же рамке считывания.

Оптимизированный белок НА вируса гриппа. Как применяется в данном документе, "оптимизированный белок НА вируса гриппа" относится к консенсусной последовательности белка НА, полученной с помощью выравниваний последовательностей изолятов вирусов гриппа H2N2, H3N2 или В (как описано в примерах 1-3 ниже). Нуклеотидные последовательности, кодирующие оптимизированные белки HA, могут быть дополнительно оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих посредством оптимизации кодонов и оптимизации РНК (так, чтобы повысить стабильность РНК). Оптимизированные белки HA вируса гриппа, раскрытые в данном документе (и приведенные в данном документе как SEQ ID NO: 1-11), также называют последовательностями “COBRA” (оптимизированного с помощью компьютера антигена с широким спектром реактивности). Оптимизированные полипептиды HA предназначены для того, чтобы вызывать у субъекта иммунный ответ с широким спектром реактивности. В контексте настоящего раскрытия “с широким спектром реактивности” означает, что белковая последовательность вызывает такой иммунный ответ у субъекта, который является достаточным для ингибирования, нейтрализации или предупреждения инфицирования широким спектром вирусов гриппа (таких как большинство или все вирусы гриппа в рамках определенного подтипа). В некоторых случаях оптимизированный белок HA вируса гриппа способен вызывать иммунный ответ, такой как защитный иммунный ответ, в отношении большинства или всех изолятов вируса гриппа H3N2, большинства или всех изолятов вируса гриппа H2N2 или большинства или всех изолятов вируса гриппа B.

Вспышка. Как применяется в данном документе, “вспышка” вируса гриппа относится к накоплению изолятов вируса внутри отдельной страны в определенный год.

Фармацевтически приемлемые среды. Фармацевтически приемлемые носители (среды), применимые в настоящем раскрытии, являются традиционными. В Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975) описаны композиции и составы, пригодные для фармацевтической доставки одной или нескольких терапевтических композиций, таких как одна или несколько вакцин против гриппа, и дополнительные фармацевтические средства.

В целом, природа носителя будет зависеть от конкретного используемого способа введения. Например, составы для парентерального применения обычно содержат инъекционные жидкости, которые в качестве среды включают фармацевтически и физиологически приемлемые жидкости, такие как вода, физиологический раствор, сбалансированные солевые растворы, водный раствор декстрозы, глицерин или т.п. В случае твердых композиций (например, в форме порошка, драже, таблеток или капсул) обычные нетоксичные твердые носители могут включать, например, маннит, лактозу, крахмал или стеарат магния фармацевтической степени чистоты. Вводимые фармацевтические композиции в дополнение к биологически нейтральным носителям могут содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты и буферные средства, поддерживающие pH, и т.п., например, ацетат натрия или сорбитанмонолаурат.

Полипептид. Полимер, мономерами в котором являются аминокислотные остатки, соединенные друг с другом посредством амидных связей. Если аминокислоты представляют собой альфа-аминокислоты, то можно применять либо L-оптический изомер, либо D-оптический изомер. Выражения “полипептид” или “белок”, применяемые в данном документе, предназначены охватывать любую аминокислотную последовательность и включать модифицированные последовательности, такие как гликопротеины. Выражение “полипептид” конкретно предназначено охватывать белки, встречающиеся в природе, а также белки, полученные рекомбинантным или синтетическим путем. Выражение “остаток” или “аминокислотный остаток” включает ссылку на аминокислоту, которая встроена в белок, полипептид или пептид.

Консервативные аминокислотные замены являются заменами, которые в случае их осуществления нарушают свойства исходного белка в наименьшей степени, то есть структура и, в особенности, функция белка сохраняются и существенно не изменяются вследствие таких замен. Примеры консервативных замен показаны ниже.

При консервативных заменах, как правило, сохраняется (a) структура полипептидного остова в области замены, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряд или гидрофобность молекулы в целевом сайте или (c) объем боковой цепи.

Замены, которые в общем, как ожидается, приведут к наибольшим изменениям свойств белка, будут неконсервативными, например, изменениями, при которых (а) гидрофильный остаток, например, серил или треонил, заменяют на гидрофобный остаток (гидрофобным остатком), например, лейцил, изолейцил, фенилаланил, валил или аланил; (b) цистеин или пролин заменяют на любой другой остаток (любым другим остатком), (с) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, лизил, аргинил или гистидил, заменяют на электроотрицательный остаток (электроотрицательным остатком), например, глутамил или аспартил; или (d) остаток, имеющий объемную боковую цепь, например, фенилаланин, заменяют на остаток (остатком), который не имеет боковой цепи, например, глицин.

Предупреждение, лечение или уменьшение интенсивности заболевания. “Предупреждением” заболевания называют ингибирование полного развития заболевания. “Лечением” называют терапевтическое вмешательство, которое уменьшает интенсивность признака или симптома заболевания или патологического состояния после начала его развития. “Уменьшением интенсивности” называют снижение числа или уменьшение степени тяжести признаков или симптомов заболевания.

Промотор. Промотор представляет собой совокупность контрольных последовательностей нуклеиновых кислот, управляющих транскрипцией нуклеиновой кислоты. Промотор включают необходимые последовательности нуклеиновых кислот, располагающиеся возле сайта инициации транскрипции. Промотор также необязательно содержит дистальные энхансерные или репрессорные элементы. “Конститутивный промотор” представляет собой промотор, который является постоянно активным и не подвергается регуляции внешними сигналами или молекулами. В отличие от этого, активность “индуцибельного промотора” регулируется внешними сигналами или молекулами (например, фактором транскрипции). В некоторых вариантах осуществления, представленных в данном документе, промотор представляет собой промотор CMV.

Очищенный. Выражение “очищенный” не подразумевает абсолютную чистоту; его, скорее, предполагается использовать как относительное выражение. Таким образом, например, очищенные пептид, белок, вирус, VLP или другое активное соединение представляют собой таковые, которые отделены полностью или частично от белков и других примесей, которые в естественных условиях ассоциированы с ними. В некоторых вариантах осуществления выражение “практически очищенный” относится к пептиду, белку, вирусу, VLP или другому активному соединению, выделенным из клетки, среды для культивирования клеток или другого неочищенного препарата и подвергнутым фракционированию для удаления различных компонентов из исходного препарата, таких как белки, клеточный детрит и другие компоненты.

Рекомбинантный. Рекомбинантные нуклеиновая кислота, белок, вирус или VLP представляют собой таковые, имеющие последовательность, которая не встречается в природе, или имеющие последовательность, полученную путем искусственного объединения двух сегментов последовательности, которые в остальных случаях отделены друг от друга. Это искусственное объединение часто выполняют путем химического синтеза или путем искусственного воздействия на выделенные сегменты нуклеиновых кислот, например, при помощи методик генной инженерии.

Идентичность последовательностей. Подобие между аминокислотными последовательностями или последовательностями нуклеиновых кислот выражается в аспекте подобия между последовательностями, которое иначе называют идентичностью последовательностей. Идентичность последовательностей часто выражается в аспекте процентной идентичности (или подобия, или гомологии); чем выше процентное значение, тем более высоким является подобие двух последовательностей. Гомологи или варианты данного гена или белка будут обладать относительно высокой степенью идентичности последовательностей при выравнивании с применением стандартных способов.

Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данном уровне техники. Различные программы и алгоритмы выравнивания описаны в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988; и Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, 1988. Altschul et al., Nature Genet. 6:119-129, 1994.

Cредство поиска основного локального выравнивания (BLAST^TM) NCBI (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) доступно из нескольких источников, включая Национальный центр биотехнологической информации (NCBI, Бетесда, Мэриленд) и Интернет, для применения вместе с программами анализа последовательностей blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx.

Субъект. Живые многоклеточные позвоночные организмы, категория, которая включает как человека, так и млекопитающих, отличных от человека, таких как приматы, отличные от человека.

Терапевтически эффективное количество. Количество определенного средства, достаточное для достижения необходимого эффекта у субъекта, подвергающегося лечению с помощью этого средства. Например, это может быть количество вакцины против вируса гриппа, пригодное для вызова иммунного ответа у субъекта и/или предупреждения инфекции или заболевания, вызываемых вирусом гриппа. Идеально, в контексте настоящего раскрытия, терапевтически эффективным количеством вакцины против гриппа является количество, достаточное для повышения резистентности к инфекции, вызываемой вирусом гриппа, ее предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения у субъекта, которое при этом не вызывает значительного цитотоксического эффекта у субъекта. Эффективное количество вакцины против гриппа, пригодное для повышения резистентности к инфекции, ее предупреждения, уменьшения интенсивности и/или лечения у субъекта, будет зависеть, например, от субъекта, подвергающегося лечению, способа введения терапевтической композиции и других факторов.

Трансформированный. Трансформированная клетка представляет собой клетку, в которую ввели молекулу нуклеиновой кислоты при помощи методик молекулярной биологии. Как применяется в данном документе, выражение “трансформация” охватывает все способы, при помощи которых молекулу нуклеиновой кислоты можно вводить в такую клетку, в том числе трансфекцию с применением вирусных векторов, трансформацию с применением плазмидных векторов и введение “голой” ДНК путем электропорации, липофекции и ускорения частиц при помощи генной пушки.

Вакцина. Препарат на основе иммуногенного материала, способного стимулировать иммунный ответ, вводимый для предупреждения, уменьшения интенсивности или лечения заболевания, такого как инфекционное заболевание. Иммуногенный материал может включать, например, ослабленные или убитые микроорганизмы (например, ослабленные вирусы) или антигенные белки (в том числе VLP), пептиды или ДНК, полученные из них. Вакцины могут вызвать как профилактический (предупредительный), так и терапевтический ответ. Способы введения варьируют в зависимости от вакцины, но могут включать прививку, проглатывание, ингаляцию или другие формы введения. Прививки могут производиться с помощью ряда различных путей, включая парентеральный, например, внутривенный, подкожный или внутримышечный. Вакцины можно вводить с адъювантом, чтобы усилить иммунный ответ.

Вектор. Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая позволяет производить вставку чужеродной нуклеиновой кислоты без нарушения способности вектора к репликации и/или интеграции в клетке-хозяине. Вектор может включать последовательности нуклеиновых кислот, которые позволяют ему реплицироваться в клетке-хозяине, например, точку начала репликации. Инсерционный вектор способен вставляться в нуклеиновую кислоту хозяина. Вектор также может включать один или несколько селектируемых маркерных генов и других генетических элементов. Вектор экспрессии представляет собой вектор, который содержит необходимые регуляторные последовательности для осуществления транскрипции и трансляции вставленного гена или генов. В некоторых вариантах осуществления настоящего раскрытия вектор кодирует белок HA, NA или М1 вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор экспрессии pTR600 (публикация заявки на патент США № 2002/0106798; Ross et al., Nat Immunol. 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001).

Вирусоподобная частица (VLP). Вирусные частицы, образованные одним или несколькими структурными белками вируса, но не имеющие вирусного генома. Поскольку VLP не имеют вирусного генома, они являются неинфекционными. Кроме того, VLP часто могут быть получены путем гетерологичной экспрессии и могут быть легко очищены. Большинство VLP содержат по меньшей мере сердцевинный вирусный белок, который управляет отпочкованием и высвобождением частиц из клетки-хозяина. Одним из примеров такого сердцевинного белка является M1 вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления, описываемых в данном документе, VLP, сходная с частицей вируса гриппа, содержит белки HA, NA и/или М1. VLP, сходные с частицами вируса гриппа, могут быть получены путем трансфекции клеток-хозяев с помощью плазмид, кодирующих белки HA и NA и необязательно белок М1. После инкубирования трансфицированных клеток в течение соответствующего периода времени, необходимого для обеспечения экспрессии белка (как, например, в течение приблизительно 72 часов), VLP можно выделять из надосадочной жидкости культуры клеток. В примере 5 приводится иллюстративный протокол очистки VLP, сходных с частицами вируса гриппа, от надосадочной жидкости культуры клеток. В этом примере VLP выделяют путем низкоскоростного центрифугирования (для удаления клеточного детрита), вакуум-фильтрации и ультрацентрифугирования в 20% глицерине. Другие способы получения VLP, сходных с частицами вируса гриппа, известны в данном уровне техники (см., например, публикации заявки на патент США №№ 2006/0263804; 2008/0031895; 2010/0166769 и 2010/0239610).

Если не истолковывается иначе, все технические и научные выражения, применяемые в данном документе, имеют то же значение, что и обычно понимаемое специалистом в той области техники, к которой принадлежит настоящее раскрытие. Выражения в единственном числе включают в себя определяемые объекты во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. “Содержащий A или B” означает включающий А или В или А и B. Также следует понимать, что все размеры оснований или размеры аминокислот и все значения молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предназначены для описания. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описываемым в данном документе, можно применять в практическом осуществлении или тестировании настоящего раскрытия, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упоминаемые в данном документе, включены посредством ссылки в полном объеме. В случае конфликта в качестве контрольного документа будет выступать настоящее описание, включая пояснения выражений. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены быть ограничивающими.

III. Обзор некоторых вариантов осуществления

В данном документе раскрывается получение оптимизированных с помощью компьютера полипептидов HA вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B, вызывающих иммунный ответ с широким спектром реактивности против вируса гриппа. Оптимизированные полипептиды HA разрабатывали путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего получения консенсусных последовательностей на основании строения определенных изолятов вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B. Способы, применяемые для получения оптимизированных консенсусных последовательностей HA, описаны в примерах 1-3 и показаны на фиг. 1-7. Аминокислотные последовательности 10 определенных полипептидов HA приведены в данном документе как SEQ ID NO: 1-11.

В данном документе представлены рекомбинантные полипептиды HA вируса гриппа, имеющие оптимизированную аминокислотную последовательность, вызывающие иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении вирусов гриппа H2N2, H3N2 и B. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полипептид HA вируса гриппа содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,6% идентичную остаткам 2-562 из SEQ ID NO: 1; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,4% идентичную остаткам 2-562 из SEQ ID NO: 2; аминокислотную последовательность, содержащую остатки 2-562 из SEQ ID NO: 3; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,7% идентичную остаткам 2-562 из SEQ ID NO: 4; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,6% идентичную остаткам 2-584 из SEQ ID NO: 5; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98,8%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную остаткам 2-585 из SEQ ID NO: 6; аминокислотную последовательность, содержащую остатки 2-585 из SEQ ID NO: 7; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 97,7%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 98,5%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную остаткам 2-566 из SEQ ID NO: 8; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98,4%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную остаткам 2-566 из SEQ ID NO: 9; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 97,8%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 98,5%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную остаткам 2-566 из SEQ ID NO: 10; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98,9%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную остаткам 2-566 из SEQ ID NO: 11.

В конкретных примерах аминокислотная последовательность полипептида HA вируса гриппа содержит аминокислотную последовательность из остатков 2-562 из SEQ ID NO: 1, остатков 2-562 из SEQ ID NO: 2, остатков 2-562 из SEQ ID NO: 3, остатков 2-562 из SEQ ID NO: 4, остатков 2-584 из SEQ ID NO: 5, остатков 2-585 из SEQ ID NO: 6, остатков 2-585 из SEQ ID NO: 7, остатков 2-566 из SEQ ID NO: 8, остатков 2-566 из SEQ ID NO: 9, остатков 2-566 из SEQ ID NO: 10 или остатков 2-566 SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HA вируса гриппа содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,6% идентичную SEQ ID NO: 1; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,4% идентичную SEQ ID NO: 2; аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,7% идентичную SEQ ID NO: 4; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,6% идентичную SEQ ID NO: 5; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98,8%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную SEQ ID NO: 6; аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 99,7% идентичную SEQ ID NO: 8; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98,4%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную SEQ ID NO: 9; аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 97,8%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 98,5%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную SEQ ID NO: 10; или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 98,9%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 99,5% идентичную SEQ ID NO: 11.

В некоторых примерах аминокислотная последовательность полипептида HA характеризуется большей степенью идентичности, чем процентные идентичности, описанные выше. В других примерах аминокислотная последовательность содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.

В некоторых вариантах осуществления полипептид HA содержит не более 2 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 1; не более 3 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 2; не более 1 аминокислотной замены по сравнению с SEQ ID NO: 4; не более 2 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 5; не более 7 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 6; не более 10 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 8; не более 9 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 9; не более 10 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 10; или не более 6 аминокислотных замен по сравнению с SEQ ID NO: 11. В некоторых примерах аминокислотная замена представляет собой консервативную замену. В некоторых примерах аминокислотная замена представляет собой неконсервативную замену. В других примерах количество замен по сравнению с указанной последовательностью составляет меньше количества замен, указанных выше.

Дополнительно обеспечиваются молекулы выделенных нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантный полипептид HA, раскрытый в данном документе. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты подвергнута оптимизации кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих. Молекула нуклеиновой кислоты необязательно дополнительно оптимизирована для обеспечения стабильности РНК.

Векторы, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие рекомбинантные полипептиды HA, также обеспечиваются в настоящем раскрытии. Вектором может быть любой вектор, подходящий для экспрессии полипептида HA, такой как вектор экспрессии у млекопитающих. В конкретных примерах вектор представляет собой вектор экспрессии pTR600 (публикация заявки на патент США №2002/0106798, которая включена в данный документ посредством ссылки; Ross et al, Nat Immunol. 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001).

В некоторых примерах вектор содержит промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид НА. В конкретных примерах промотор представляет собой промотор CMV.

Также обеспечиваются выделенные клетки, содержащие раскрываемые векторы. В некоторых случаях клетка представляет собой клетку любого типа, подходящего для выработки и экспрессии VLP, такую как клетка млекопитающего.

Дополнительно обеспечиваются VLP, сходные с частицами вируса гриппа, содержащие оптимизированный полипептид НА, раскрытый в данном документе. VLP, сходные с частицами вируса гриппа, могут дополнительно включать любые дополнительные белки вируса гриппа, необходимые для формирования вирусной частицы. В некоторых вариантах осуществления VLP, сходные с частицами вируса гриппа, дополнительно включают белок-нейраминидазу (NA) вируса гриппа, матриксный белок (M1) вируса гриппа или оба эти белка.

Также представлены VLP, сходные с частицами вируса гриппа, содержащие полипептид НА вируса гриппа, раскрытый в данном документе, полученные путем трансфекции клетки-хозяина с помощью вектора, кодирующего полипептид НА, вектора, кодирующего белок NA вируса гриппа, и вектора, кодирующего белок M1 вируса гриппа, в условиях, достаточных для обеспечения экспрессии белков НА, M1 и NA.

Слитые белки, содержащие оптимизированный полипептид НА вируса гриппа, дополнительно обеспечиваются настоящим раскрытием.

Также в данном документе обеспечиваются композиции, содержащие оптимизированный белок НА вируса гриппа, описанный в данном документе, или слитый белок или VLP, содержащие оптимизированный белок НА вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления композиции дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель и/или адъювант. Например, адъювант может представлять собой квасцы, полный адъюванта Фрейнда, биологический адъювант или иммуностимулирующие олигонуклеотиды (такие как CpG-олигонуклеотиды).

Дополнительно обеспечивается способ вызова иммунного ответа в отношении вируса гриппа у субъекта путем введения оптимизированного белка НА вируса гриппа, слитого белка, содержащего оптимизированный полипептид НА вируса гриппа, VLP, содержащих оптимизированный НА вируса гриппа, или их композиций, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вирус гриппа представляет собой вирус гриппа H3N2, H2N2 или В. В некоторых вариантах осуществления белок НА, слитый белок, содержащий НА, или VLP можно вводить с помощью любого подходящего пути введения, такого как, например, внутримышечный, интраназальный или пероральный. В некоторых вариантах осуществления белок НА, слитый белок или VLP вводят в форме композиции, дополнительно содержащей фармацевтически приемлемый носитель и/или адъювант. Например, адъювант может представлять собой квасцы, полный адъюванта Фрейнда, биологический адъювант или иммуностимулирующие олигонуклеотиды (такие как CpG-олигонуклеотиды).

Также обеспечивается способ иммунизации субъекта против вируса гриппа путем введения субъекту VLP, содержащих оптимизированный белок НА вируса гриппа, раскрытый в данном документе, или путем введения их композиции. В некоторых вариантах осуществления способа композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель и/или адъювант. Например, адъювант может представлять собой квасцы, полный адъювант Фрейнда, биологический адъювант или иммуностимулирующие олигонуклеотиды (такие как CpG-олигонуклеотиды). В некоторых вариантах осуществления VLP (или их композиции) вводят внутримышечно.

В некоторых вариантах осуществления способов вызова иммунного ответа или иммунизации субъекта субъекту вводят от около 1 до около 25 мкг VLP, содержащих оптимизированный белок HA. В конкретных примерах субъекту вводят от около 5 до около 20 мкг VLP или от около 10 до около 15 мкг VLP. В одном конкретном неограничивающем примере субъекту вводят около 15 мкг VLP. Однако, специалист в данной области способен определить терапевтически эффективное количество (например, количество, обеспечивающее защиту от инфекции, вызываемой вирусом гриппа H3N3, H2N2 или B) VLP, которое необходимо ввести субъекту.

IV. Вирусы гриппа

Вирусы гриппа представляют собой вирусы с сегментированной отрицательно-полярной нитью РНК, которые принадлежат к семейству Orthomyxoviridae. Существует три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирусы гриппа А инфицируют большое число видов птиц и млекопитающих, в том числе людей, лошадей, морских млекопитающих, свиней, хорьков и кур. У животных большинство вирусов гриппа A вызывают локализованные инфекции дыхательных путей и кишечника в легкой форме. Тем не менее, высокопатогенные штаммы вируса гриппа A, такие как H5N1, вызывают системные инфекции домашней птицы, при которых смертность может достигать 100%. Животные, инфицированные вирусом гриппа А, часто выступают в роли резервуара вирусов гриппа, и было показано, что определенные подтипы могут преодолевать межвидовой барьер, инфицируя людей.

Вирусы гриппа A могут быть классифицированы на подтипы на основании аллельных вариаций антигенных областей двух генов, которые кодируют поверхностные гликопротеины, а именно, гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA), которые необходимы для прикрепления вируса и высвобождения из клетки. В настоящее время известно шестнадцать подтипов HA (H1-H16) и девять антигенных вариантов NA (N1-N9) вируса гриппа A. Ранее были известны только три подтипа, циркулирующие в крови человека (H1N1, H1N2 и H3N2). Однако в последние годы сообщалось о том, что патогенный подтип H5N1 птичьего гриппа A преодолевает межвидовой барьер и инфицирует людей, что было документально зафиксировано в Гонконге в 1997 и 2003 гг. и привело к смерти нескольких пациентов.

Вирусы гриппа B вызывают тот же спектр заболеваний, что и вирусы гриппа A. Тем не менее вирусы гриппа B не вызывают пандемии, что, вероятно, является следствием ограниченного круга хозяев этого вируса (люди и тюленевые), что ограничивает возникновение новых штаммов путем реассортации. Вирусы гриппа B являются причинами значительной распространенности болезни; в США в 2008 году приблизительно одна треть всех лабораторно подтвержденных случаев гриппа вызывалась вирусом гриппа B. Таким образом существующая сезонная тривалентная вакцина против гриппа содержит компонент вируса гриппа B.

В 2009 г. вирус гриппа H1N1 был наиболее частой причиной заболевания людей гриппом. Новый штамм H1N1, происходящий от свиней, появился в 2009 г. и был объявлен пандемическим Всемирной организацией здравоохранения. Этот штамм был назван “вирусом свиного гриппа”. Вирусы гриппа A H1N1 также были причиной пандемии испанского гриппа в 1918 г., вспышки заболевания в Форт-Дикс в 1976 г. и эпидемии гриппа в России в 1977-1978 гг.

Сегментированный геном вируса гриппа содержит восемь генных сегментов отрицательно-полярной нити РНК (nsRNA) (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA и NA), которые кодируют по меньшей мере десять полипептидов, в том числе белки РНК-полимеразы, управляемые РНК (PB2, PB1 и PA), нуклеопротеин (NP), нейраминидазу (NA), гемагглютинин (субъединицы HA1 и HA2), матриксные белки (M1 и M2) и неструктурные белки (NS1 и NS2) (Krug et al., в “The Influenza Viruses”, R. M. Krug, ed., Plenum Press, N.Y., 1989, pp. 89 152).

Способность вируса гриппа вызывать широко распространенное заболевание связана с его способностью избегать действия иммунной системы путем подвергания антигенному изменению, которое, как полагают, происходит в том случае, когда хозяин одновременно инфицирован как вирусом гриппа животных, так и вирусом гриппа человека. Во время мутации и реассортации, происходящих в организме хозяина, вирус может внедрять в свой геном ген поверхностного белка HA и/или NA из другого вируса, что, тем самым, приводит к образованию нового подтипа вируса гриппа и избеганию действия иммунной системы.

HA является поверхностным гликопротеином вируса, который обычно содержит приблизительно 560 аминокислот и представляет 25% от общего количества вирусного белка. Он отвечает за прикрепление вирусной частицы к клетке-хозяину и ее проникновение в нее на ранних стадиях инфекции. Расщепление вирусного предшественника HA0 на субфрагменты HA1 и HA2 является необходимым этапом для того, чтобы вирус инфицировал клетку. Таким образом, расщепление требуется для того, чтобы превратить новые вирусные частицы в клетке-хозяине в вирионы, способные инфицировать новые клетки. Известно, что расщепление происходит во время транспортировки интегрального мембранного белка HA0 из эндоплазматического ретикулума инфицированной клетки к плазматической мембране. В ходе транспортировки гемагглютинин подвергается ряду ко- и посттрансляционных модификаций, включая протеолитическое расщепление предшественника HA на амино-концевой фрагмент HA1 и карбокси-концевой HA2. Одна из основных трудностей при выращивании штаммов гриппа в первичной культуре ткани или в устойчивых клеточных линиях проистекает из потребности в активации протеолитического расщепления гемагглютинина вируса гриппа в клетке-хозяине.

Хотя известно, что нерасщепленный HA может опосредовать прикрепление вируса к его рецепторам на поверхности клетки, содержащим нейраминовую кислоту, он не способен к участию в следующем этапе инфекционного цикла, которым является слияние. Сообщалось, что для гидрофобного амино-конца HA2, образуемого при расщеплении, необходимо, чтобы он был выставлен на поверхности, так чтобы он мог встраиваться в целевые клетки, тем самым образуя мостик между мембранами вируса и целевой клетки. Следом за этим процессом происходит слияние двух мембран и проникновение вируса в целевую клетку.

Протеолитическая активация HA включает расщепление по аргининовому остатку с помощью трипсиноподобной эндопротеазы, которая часто является внутриклеточным кальций-зависимым ферментом, оптимальное значение рН для которого является нейтральным. Так как активирующие протеазы являются клеточными ферментами, то, будет ли расщепляться HA, определяется типом инфицированных клеток. HA вирусов гриппа млекопитающих и непатогенных вирусов птичьего гриппа являются восприимчивыми к протеолитическому расщеплению только в ограниченном количестве типов клеток. С другой стороны, HA патогенных вирусов птиц из подтипов Н5 и Н7 расщепляются протеазами, присутствующими в широком круге различных клеток-хозяев. Таким образом, существуют различия в круге хозяев, происходящие из различий в способности гемагглютинина к расщеплению, которые коррелируют с патогенными свойствами вируса.

Нейраминидаза (NA) является вторым мембранным гликопротеином вирусов гриппа. Было показано, что присутствие NA вируса является важным для формирования многостороннего защитного иммунного ответа в отношении инфицирующего вируса. У большинства вирусов гриппа A NA имеет длину 413 аминокислот и кодируется геном, содержащим 1413 нуклеотидов. Девять различных подтипов NA были идентифицированы в вирусах гриппа (N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 и N9), все из которых были обнаружены у диких птиц. NA участвует в разрушении клеточного рецептора к HA вируса за счет отщепления концевых остатков нейраминовой кислоты (также называемой сиаловой кислотой) от углеводных фрагментов, расположенных на поверхности инфицированных клеток. NA также отщепляет остатки сиаловой кислоты от вирусных белков, предупреждая агрегацию вирусов. Гипотетически предполагается, что при помощи этого механизма NA облегчает высвобождение вирусного потомства, предупреждая накопление вновь образованных вирусных частиц вдоль клеточной мембраны, а также содействуя транспортировке вируса через слизь, присутствующую на поверхности слизистой оболочки. NA является важной антигенной детерминантой, которая подвергается антигенной вариации.

Вирус гриппа, в дополнение к поверхностным белкам HA и NA, содержит шесть дополнительных внутренних генов, которые отвечают за синтез восьми различных белков, в том числе гены белков полимеразного комплекса PB1, PB2 и PA, матриксных белков M1 и M2, нуклеопротеина (NP) и неструктурных белков NS1 и NS2 (Horimoto et al., Clin Microbiol Rev. 14(1):129-149, 2001).

Для упаковки в вирионы потомства вирусная РНК транспортируется из ядра в виде рибонуклеопротеинового (RNP) комплекса, образованного тремя белками, представляющими собой полимеразы вируса гриппа, нуклеопротеином (NP) и вирусной РНК, в ассоциации с матриксным белком 1 (M1) вируса гриппа и белком ядерного экспорта (Marsh et al., J Virol, 82:2295-2304, 2008). Считается, что белок М1, который располагается в оболочке, задействован в сборке и отпочковании. Ограниченное число белков M2 интегрировано в вирионы (Zebedee, J. Virol. 62:2762-2772, 1988). Они образуют тетрамеры, обладающие активностью ионных каналов для H+, и при активации под действием низкого pH в эндосомах подкисляют внутреннее пространство вириона, облегчая сбрасывание его оболочки (Pinto et al., Cell 69:517-528, 1992). Амантадин является противогриппозным лекарственным средством, которое предупреждает вирусную инфекцию путем нарушения активность ионных каналов, образуемых белками М2, тем самым ингибируя сбрасывание оболочки вируса.

NS1, неструктурный белок, имеет несколько функций, включая регуляцию сплайсинга и ядерного экспорта клеточных мРНК, а также стимуляцию трансляции. По-видимому, основной функцией NS1 является противодействие активности интерферона хозяина, поскольку вирус с нокаутом гена NS1 был жизнеспособным, хотя характеризовался менее эффективным ростом, чем родительский вирус, в клетках без недостаточности интерферона (Garcia-Sastre, Virology 252:324-330, 1998).

NS2 выявляли в вирусных частицах (Richardson et al., Arch. Virol. 116:69-80, 1991; Yasuda et al., Virology 196:249-255, 1993). По оценкам, среднее количество белков NS2 в вирусной частице составляет 130-200 молекул. Анализ связывания in vitro показывает наличие прямого белок-белкового контакта между M1 и NS2. Комплексы NS2-M1 также выявляли с помощью иммунопреципитации в лизатах клеток, инфицированных вирусом. Считается, что белок NS2 играет роль в экспорте RNP из ядра посредством взаимодействия с белком М1 (Ward et al., Arch. Virol. 140:2067-2073, 1995).

VI. VLP, сходные с частицами вируса гриппа, и их введение

В данном документе обеспечиваются VLP, сходные с частицами вируса гриппа, содержащие оптимизированный HA (такой как HA, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную как любая из SEQ ID NO: 1-11). VLP, сходные с частицами вируса гриппа, как правило, образованы белками HA, NA и М1. Получение VLP, сходных с частицами вируса гриппа, описано в данной области техники и находится в пределах квалификации специалиста в данной области. Например, VLP, сходные с частицами вируса гриппа, можно получить путем трансфекции клеток-хозяев с помощью плазмид, которые кодируют белки HA, NA и М1. После инкубирования трансфицированных клеток в течение соответствующего периода времени, необходимого для обеспечения экспрессии белка (как, например, в течение приблизительно 72 часов), VLP можно выделять из надосадочной жидкости культуры клеток. В примере 5 ниже приводится иллюстративный протокол очистки VLP, сходных с частицами вируса гриппа, от надосадочной жидкости культуры клеток. В этом примере VLP выделяют путем низкоскоростного центрифугирования (для удаления клеточного детрита), вакуум-фильтрации и ультрацентрифугирования в 20% глицерине.

VLP, сходные с частицами вируса гриппа, раскрытые в данном документе, можно применять в качестве вакцин против гриппа для вызова защитного иммунного ответа в отношении вирусов гриппа H3N2 и H2N2, а также вирусов гриппа B.

VLP, сходные с частицами вируса гриппа, или композиции с ними можно вводить субъекту любым путем, обычно применяемым для введения рекомбинантных вирусов субъекту. Способы введения включают, но без ограничений, внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, парентеральный, внутривенный, подкожный, вагинальный, ректальный, интраназальный, ингаляционный или пероральный. Парентеральное введение, такое как, подкожное, внутривенное или внутримышечное введение, как правило, совершают путем инъекции. Инъекционные лекарственные средства можно получать в традиционных формах либо в виде жидких растворов, либо суспензий, в твердых формах, пригодных для получения раствора или суспензии в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Инъекционные растворы и суспензии можно получать из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного типа. Введение может быть системным или локальным.

VLP, сходные с частицами вируса гриппа, или композиции с ними вводят любым подходящим способом, как, например, с помощью фармацевтически приемлемых носителей. Фармацевтически приемлемые носители частично определяются конкретной вводимой композицией, а также конкретным способом, применяемым для введения композиции. Соответственно, в настоящем раскрытии представлено большое разнообразие подходящих составов фармацевтических композиций.

Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе солевые и буферные среды. Среды для парентерального применения включают раствор хлорида натрия, декстрозу в растворе Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактатный раствор Рингера или нелетучие масла. Среды для внутривенного применения включают жидкие и питательные наполнители, электролитные наполнители (как, например, на основе декстрозы в растворе Рингера) и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатообразующие средства и инертные газы и т.п.

Некоторые из композиций, вероятно, можно вводить в виде фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты или основания, образованной в результате реакции с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, перхлорная кислота, азотная кислота, тиоциановая кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота и фумаровая кислота, или в результате реакции с неорганическим основанием, таким как гидроксид натрия, гидроксид аммония, гидроксид калия, и органическими основаниями, такими как моно-, ди-, триалкиламины, и ариламины, и замещенные этаноламины.

Введение можно осуществлять с применением однократных или многократных доз. Доза, вводимая субъекту в контексте настоящего раскрытия, должна быть достаточной для индуцирования благоприятного терапевтического эффекта у субъекта, продолжающегося в течение длительного времени, или для подавления или предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гриппа H2N2, H3N2 и/или B. Требуемая доза будет варьировать для различных субъектов в зависимости от вида, возраста, веса и общего состояния субъекта, тяжести инфекции, лечение которой осуществляется, конкретной применяемой композиции и способа ее введения. Соответствующая доза может быть определена специалистом в данной области при помощи только стандартных экспериментов.

В данном документе обеспечиваются фармацевтические композиции, которые включают терапевтически эффективное количество VLP, сходных с частицами вируса гриппа, отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемые носители включают, но без ограничений, солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Носитель и композиция могут быть стерильными, а состав соответствует режиму введения. Композиция может также содержать небольшие количества смачивающих или эмульгирующих средств или буферных средств, поддерживающих pH. Композиция может представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетку, драже, капсулу, состав с замедленным высвобождением или порошок. Композицию можно составить в виде суппозитория с традиционными связующими и носителями, такими как триглицериды. Составы для перорального применения могут включать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза и карбонат магния фармацевтической степени чистоты. Можно применять любые обычные фармацевтические носители, такие как стерильный солевой раствор или кунжутное масло. Среда может также содержать традиционные фармацевтические вспомогательные средства, такие как, например, фармацевтически приемлемые соли для корректировки осмотического давления, буферы, консерванты и т.п. Другие среды, которые можно применять с композициями и способами, обеспеченными в данном документе, представляют собой физиологический раствор и кунжутное масло.

VLP, сходные с частицами вируса гриппа, описанные в данном документе, можно вводить отдельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами для усиления антигенных свойств. Например, VLP, сходные с частицами вируса гриппа, можно вводить с адъювантом, таким как неполный адъювант Фрейнда или полный адъювант Фрейнда.

Необязательно, один или несколько цитокинов, таких как IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-α или IFN-γ, один или несколько факторов роста, таких как GM-CSF или G-CSF; одну или несколько молекул, таких как OX-40L или 41 BBL, или комбинации этих молекул можно применять в качестве биологических адъювантов (см., например, Salgaller et al., 1998, J. Surg. Oncol. 68(2):122-38; Lotze et al., 2000, Cancer J. Sci. Am. 6(Suppl 1):S61-6; Cao et al., 1998, Stem Cells 16(Suppl 1):251-60; Kuiper et al., 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90). Эти молекулы можно вводить хозяину системно (или локально).

Известен ряд средств, индуцирующих клеточный ответ как in vitro, так и in vivo. Липиды были идентифицированы в качестве средств, способных содействовать in vivo праймингу CTL против различных антигенов. Например, как описано в патенте США №5662907, остатки пальмитиновой кислоты могут прикрепляться к альфа- и эпсилон-аминогруппам лизинового остатка, а затем связываться (например, посредством одного или нескольких связывающих остатков, таких как глицин, глицин-глицин, серин, серин-серин или т.п.) с иммуногенным пептидом. Липидизированный пептид можно затем инъецировать напрямую в мицеллярной форме, включенным в липосому или эмульгированным в адъюванте. В качестве другого примера, для праймирования опухолеспецифического CTL можно применять липопротеины E.coli, такие как трипальмитоил-S-глицерилцистеинилсерилсерин, в случаях, когда они ковалентно присоединены к соответствующему пептиду (см. Deres et al., Nature 342:561, 1989). Дополнительно, поскольку индуцирование выработки нейтрализующих антител также может быть достигнуто с помощью праймирования той же молекулой, конъюгированной с пептидом, у которого обнаруживается соответствующий эпитоп, две композиции можно объединить, чтобы вызвать как гуморальный, так и клеточный ответы в тех случаях, когда это считается необходимым.

Хотя в данном документе в качестве примера приводится введение VLP, содержащих COBRA HA, специалист в данной области поймет, что для того, чтобы вызвать иммунный ответ у субъекта, также можно вводить белок HA вируса гриппа сам по себе (в отсутствие вирусной частицы) или в форме слитого белка. В вариантах осуществления вводят фрагмент белка НА, такой как субфрагмент НА1 или НА2.

Следующие примеры приведены для иллюстрации конкретных отдельных признаков и/или вариантов осуществления. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие раскрытие конкретными описываемыми признаками или вариантами осуществления.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: получение последовательностей COBRA вируса гриппа H2N2

Данный пример описывает получение четырех последовательностей COBRA НА вируса гриппа H2N2 с применением четырех различных способов.

Для получения последовательности COBRA НА вируса гриппа H2N2 согласно способу 1, получали консенсусную последовательность НА, используя 59 штаммов H2N2, выделенных в период с 1957 по 1968 гг.Последовательность COBRA, полученная согласно способу 1, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 1:

MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLRVPEWSYIMEKENPRDGLCYPGSFNDYEELKHLLSSVKHFEKVKILPKDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSFFRNMVWLTKKGSNYPVAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPNDETEQRTLYQNVGTYVSVSTSTLNKRSTPEIATRPKVNGLGSRMEFSWTLLDMWDTINFESTGNLIAPEYGFKISKRGSSGIMKTEGTLGNCETKCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGECPKYVKSEKLVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFSNLERRLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI

В способе 2 получали два уровня консенсусных последовательностей (см. фиг. 1). На первом уровне получали четыре отдельные консенсусные последовательности с использованием (1) 21 штамма, выделенных в 1957 г., (2) 12 штаммов, выделенных в период с 1958 по 1960 гг., (3) 8 штаммов, выделенных в период с 1961 по 1964 гг., и (4) 18 штаммов, выделенных в период с 1965 по 1968 гг. На втором уровне получали конечную консенсусную последовательность, используя четыре отдельные консенсусные последовательности, полученные на первом уровне. Последовательность COBRA, полученная согласно способу 2, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 2:

MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLSVPEWSYIMEKENPRYSLCYPGSFNDYEELKHLLSSVKHFEKVKILPKDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSFFRNMVWLTKKGSNYPVAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPNDETEQRTLYQNVGTYVSVSTSTLNKRSTPDIATRPKVNGLGSRMEFSWTLLDMWDTINFESTGNLIAPEYGFKISKRGSSGIMKTEGTLGNCETKCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGECPKYVKSEKLVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFSNLEKRLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI

В способе 3 получали два уровня консенсусных последовательностей с использованием 98 "человеческих" и "птичьих" изолятов H2N2 (см. фиг. 2). На первом уровне получали шесть отдельных консенсусных последовательностей с использованием (1) 21 штамма, выделенных в 1957 г., (2) 12 штаммов, выделенных в период с 1958 по 1960 гг., (3) 8 штаммов, выделенных в период с 1961 по 1964 гг., (4) 18 штаммов, выделенных в период с 1965 по 1968 гг., (5) 1 штамма, выделенного в 2005 г., и (6) 38 "птичьих" штаммов, выделенных в период с 1961 по 2007 гг. На втором уровне получали конечную консенсусную последовательность, используя шесть отдельных консенсусных последовательностей, полученных на первом уровне. Последовательность COBRA, полученная согласно способу 3, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 3:

MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLSVPEWSYIMEKENPRDGLCYPGSFNDYEELKHLLSSVKHFEKVKILPKDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSFFRNMVWLTKKGSNYPVAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPNDETEQRTLYQNVGTYVSVGTSTLNKRSTPEIATRPKVNGLGSRMEFSWTLLDMWDTINFESTGNLIAPEYGFKISKRGSSGIMKTEGTLENCETKCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGECPKYVKSEKLVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFSNLERRLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI

В способе 4 получали одиночную консенсусную последовательность с использованием 98 "человеческих" и "птичьих" штаммов H2N2, выделенных в период с 1957 по 2007 гг. Последовательность COBRA, полученная согласно способу 4, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 4:

MAIIYLILLFTAVRGDQICIGYHANNSTEKVDTILERNVTVTHAKDILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGDCSIAGWLLGNPECDRLLSVPEWSYIMEKENPRNGLCYPGSFNDYEELKHLLSSVKHFEKVKILPKDRWTQHTTTGGSRACAVSGNPSFFRNMVWLTKKGSNYPVAKGSYNNTSGEQMLIIWGVHHPNDEAEQRTLYQNVGTYVSVGTSTLNKRSTPEIATRPKVNGLGGRMEFSWTLLDMWDTINFESTGNLIAPEYGFKISKRGSSGIMKTEGTLENCETKCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGECPKYVKSEKLVLATGLRNVPQIESRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFSNLERRLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQLRDNVKELGNGCFEFYHKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQILAIYATVAGSLSLAIMMAGISFWMCSNGSLQCRICI

Пример 2: получение последовательностей COBRA вируса гриппа B

Данный пример описывает получение трех последовательностей COBRA HA вируса гриппа B с применением трех различных способов.

Для получения последовательности COBRA HA вируса гриппа B согласно способу 1, получали консенсусную последовательность HA, используя 318 штаммов вируса гриппа B, выделенных в период с 1940 по 2011 гг. Последовательность COBRA, полученная согласно способу 1, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 5:

MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTKTRGKLCPNCLNCTDLDVALGRPMCVGTTPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTQNVINAEKAPGGPYRLGTSGSCPNVTSRSGFFATMAWAVPRDNNKTATNPLTVEVPYICTKGEDQITVWGFHSDNKTQMKNLYGDSNPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKPGKTGTIVYQRGVLLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVDIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFIVYMVSRDNVSCSICL

В способе 2 получали два уровня консенсусных последовательностей с использованием 318 изолятов вируса гриппа B (см. фиг. 3). На первом уровне получали десять отдельных консенсусных последовательностей с использованием (1) 15 штаммов, выделенных в период с 1940 по 1986 гг., (2) 3 штаммов, выделенных в 1987 г., (3) 5 штаммов, выделенных в период с 1988 по 1989 гг., (4) 17 штаммов, выделенных в период с 1990 по 1992 гг., (5) 61 штамма, выделенных в период с 1993-1998 гг., (6) 52 штаммов, выделенных в период с 1999 по 2000 гг., (7) 39 штаммов, выделенных в период с 2002 по 2003 гг., (8) 29 штаммов, выделенных в период с 2004 по 2005 гг.; (9) 36 штаммов, выделенных в период с 2006 по 2007 гг., и (10) 61 штамма, выделенных в период с 2008 по 2011 гг. На втором уровне получали конечную консенсусную последовательность, используя десять отдельных консенсусных последовательностей, полученных на первом уровне. Последовательность COBRA, полученная согласно способу 2, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 6:

MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTKTRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCMGTIPSAKASILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYENIRLSTHNVINAEKAPGGPYRIGTSGSCPNVTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNPLTVEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMKKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTIVYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVDIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFNAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFIVYMVSRDNVSCSICL

В способе 3 получали два уровня консенсусных последовательностей с использованием 318 изолятов вируса гриппа B (см. фиг. 4). На первом уровне получали пять отдельных консенсусных последовательностей с использованием (1) 52 штаммов, выделенных в период с 1999 по 2001 гг., (2) 39 штаммов, выделенных в период с 2002 по 2003 гг., (3) 29 штаммов, выделенных в период с 2004 по 2005 гг., (4) 36 штаммов, выделенных в период с 2006 по 2007 гг., и (5) 61 штамма, выделенных в период с 2008 по 2011 гг. На втором уровне получали конечную консенсусную последовательность, используя пять отдельных консенсусных последовательностей, полученных на первом уровне. Последовательность COBRA, полученная согласно способу 3, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 7:

MKAIIVLLMVVTSNADRICTGITSSNSPHVVKTATQGEVNVTGVIPLTTTPTKSHFANLKGTKTRGKLCPKCLNCTDLDVALGRPKCTGNIPSAKVSILHEVRPVTSGCFPIMHDRTKIRQLPNLLRGYEHIRLSTHNVINAEKAPGGPYKIGTSGSCPNVTNGNGFFATMAWAVPKNDNNKTATNPLTIEVPYICTEGEDQITVWGFHSDNETQMAKLYGDSKPQKFTSSANGVTTHYVSQIGGFPNQTEDGGLPQSGRIVVDYMVQKSGKTGTITYQRGILLPQKVWCASGRSKVIKGSLPLIGEADCLHEKYGGLNKSKPYYTGEHAKAIGNCPIWVKTPLKLANGTKYRPPAKLLKERGFFGAIAGFLEGGWEGMIAGWHGYTSHGAHGVAVAADLKSTQEAINKITKNLNSLSELEVKNLQRLSGAMDELHNEILELDEKVDDLRADTISSQIELAVLLSNEGIINSEDEHLLALERKLKKMLGPSAVEIGNGCFETKHKCNQTCLDRIAAGTFDAGEFSLPTFDSLNITAASLNDDGLDNHTILLYYSTAASSLAVTLMIAIFVVYMVSRDNVSCSICL

Пример 3: получение последовательностей COBRA вируса гриппа H3N2

Данный пример описывает получение четырех последовательностей COBRA HA вируса гриппа H3N2 с применением четырех различных способов.

Для получения последовательности COBRA HA вируса гриппа H3N2 согласно способу 1 (консенсусная последовательность декады), получали два уровня консенсусных последовательностей с использованием 935 изолятов H3N2 (см. фиг. 5). На первом уровне получали четыре отдельные консенсусные последовательности с использованием (1) 61 штамма, выделенных в период с 1968-1979; (2) 33 штаммов, выделенных в период с 1980 по 1990 гг.; (3) 288 штаммов, выделенных в период с 1991 по 1999 гг.; и (4) 553 штаммов, выделенных в период с 2000 по 2011 гг. На втором уровне получали конечную консенсусную последовательность, используя четыре отдельные консенсусные последовательности, полученные на первом уровне. Последовательность COBRA H3N2, полученная согласно способу 1, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 8:

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGENCTLIDALLGDPHCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINESFNWTGVTQNGGSSACKRGSVNSFFSRLNWLTKLKYKYPALNVTMPNNDKFDKLYIWGVHHPSTDQDQTSLYVQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGTCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI

В способе 2 (консенсусная последовательность антигенной эры) получали два уровня консенсусных последовательностей с использованием 909 изолятов H3N2 (см. фиг. 6). На первом уровне получали 12 отдельных консенсусных последовательностей с использованием (1) 23 штаммов, выделенных в период с 1968 по 1972 гг.; (2) 8 штаммов, выделенных в период с 1973 по 1974 гг.; (3) 21 штамма, выделенных в период с 1975 по 1978 гг.; (4) 9 штаммов, выделенных в период с 1979 по 1981 гг.; (5) 19 штаммов, выделенных в период с 1982 по 1985 гг.; (6) 14 штаммов, выделенных в период с 1986 по 1988 гг.; (7) 13 штаммов, выделенных в период с 1989 по 1992 гг.; (8) 275 штаммов, выделенных в период с 1993 по 1998 гг.; (9) 294 штаммов, выделенных в период с 1999 по 2003 гг.; (10) 57 штаммов, выделенных в 2004 г.; (11) 80 штаммов, выделенных в период с 2005 по 2006 гг.; и (12) 96 штаммов, выделенных в период с 2007 по 2008 гг. На втором уровне получали конечную консенсусную последовательность, используя 12 отдельных консенсусных последовательностей, полученных на первом уровне. Последовательность COBRA H3N2, полученная согласно способу 2, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 9:

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNKKWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINESFNWTGVTQNGGSYACKRGSVNSFFSRLNWLHKSESKYPALNVTMPNNDKFDKLYIWGVHHPSTDQEQTSLYVQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRTGKSSIMRSDAPIGTCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI

В способе 3 (1968-2011) получали два уровня консенсусных последовательностей с использованием 935 изолятов H3N2 (см. фиг. 7). На первом уровне получали 13 отдельных консенсусных последовательностей с использованием (1) 23 штаммов, выделенных в период с 1968 по 1972 гг.; (2) 8 штаммов, выделенных в период с 1973 по 1974 гг.; (3) 21 штамма, выделенных в период с 1975 по 1978 гг.; (4) 9 штаммов, выделенных в период с 1979 по 1981 гг.; (5) 19 штаммов, выделенных в период с 1982 по 1985 гг.; (6) 14 штаммов, выделенных в период с 1986 по 1988 гг.; (7) 13 штаммов, выделенных в период с 1989 по 1992 гг.; (8) 275 штаммов, выделенных в период с 1993 по 1998 гг.; (9) 294 штаммов, выделенных в период с 1999 по 2003 гг.; (10) 57 штаммов, выделенных в 2004 г.; (11) 80 штаммов, выделенных в период с 2005 по 2006 гг.; (12) 96 штаммов, выделенных в период с 2007 по 2008 гг.; и (13) 26 штаммов, выделенных в период с 2009 по 2011 гг. На втором уровне получали конечную консенсусную последовательность, используя 13 отдельных консенсусных последовательностей, полученных на первом уровне. Последовательность COBRA H3N2, полученная согласно способу 3, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 10:

MKTIIALSYILCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINESFNWTGVTQNGGSYACKRGSNNSFFSRLNWLTKSESKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPSTDKEQTSLYVQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRTGKSSIMRSDAPIGTCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI

В способе 4 (1968-2004) получали два уровня консенсусных последовательностей с использованием 733 изолятов H3N2 (см. фиг. 8). На первом уровне получали 10 отдельных консенсусных последовательностей с использованием (1) 23 штаммов, выделенных в период с 1968 по 1972 гг.; (2) 8 штаммов, выделенных в период с 1973 по 1974 гг.; (3) 21 штамма, выделенных в период с 1975 по 1978 гг.; (4) 9 штаммов, выделенных в период с 1979 по 1981 гг.; (5) 19 штаммов, выделенных в период с 1982 по 1985 гг.; (6) 14 штаммов, выделенных в период с 1986 по 1988 гг.; (7) 13 штаммов, выделенных в период с 1989 по 1992 гг.; (8) 275 штаммов, выделенных в период с 1993 по 1998 гг.; (9) 294 штаммов, выделенных в период с 1999 по 2003 гг.; и (10) 57 штаммов, выделенных в 2004 г. На втором уровне получали конечную консенсусную последовательность, используя 10 отдельных консенсусных последовательностей, полученных на первом уровне. Последовательность COBRA H3N2, полученная согласно способу 4, показана ниже и приведена в данном документе как SEQ ID NO: 11:

MKTIIALSYIFCLVFAQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGRICDSPHRILDGKNCTLIDALLGDPHCDGFQNEKWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFINEGFNWTGVTQNGGSYACKRGSVNSFFSRLNWLHKSESKYPVLNVTMPNNDKFDKLYIWGVHHPSTDKEQTSLYVQASGRVTVSTKRSQQTVIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRTGKSSIMRSDAPIGTCSSECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRLIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIGSIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQKGNIRCNICI

Пример 4: последовательность гена COBRA, подвергнутая оптимизации кодонов

Аминокислотные последовательности COBRA, раскрытые в данном документе, могут подвергаться обратной трансляции и оптимизации для экспрессии в клетках млекопитающих, включая оптимизацию частоты использования кодонов и РНК (GeneArt; Регенсбург, Германия). Оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот могут быть вставлены в соответствующий вектор экспрессии, такой как вектор экспрессии pTR600 (публикация заявки на патент США №2002/0106798; Ross et al., Nat Immunol. 1(2):102-103, 2000; Green et al., Vaccine 20:242-248, 2001). Векторы экспрессии, кодирующие последовательности генов COBRA, подвергнутые оптимизации кодонов, можно применять, например, для получения VLP, содержащих COBRA HA.

Пример 5: получение VLP, сходных с частицами вируса гриппа, и иммунизация с их помощью

Следующие способы можно применять для получения и определения характеристик VLP, сходных с частицами вируса гриппа, содержащих COBRA HA. Иллюстративные способы иммунизации мышей, хорьков и макак также описаны ниже (см. также Giles and Ross, Vaccine 29(16):3043-3054, 2011).

Получение вакцины

Клетки 293T подвергают транзиентной трансфекции с помощью плазмид, экспрессирующих M1, NA и оптимизированный HA, и инкубируют в течение 72 часов при 37^oC. Последовательности, кодирующие M1, NA и HA, могут быть подвергнуты оптимизации кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих. Собирали надосадочную жидкость, а клеточный детрит удаляли путем низкоскоростного центрифугирования с последующей вакуум-фильтрацией через стерильный фильтр на 0,22 мкм. VLP очищали при помощи ультрацентрифугирования (100000 x g в 20% глицерине, вес/объем) в течение 4 часов при 4^oC. Осадки затем ресуспендировали в PBS, pH 7,2, и хранили в виде аликвот для однократного применения при -80^ºC до применения. Общую концентрацию белка определяли с помощью набора реагентов для анализа белков Micro BCA^TM (Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США).

Определение дозы

Удельное содержание HA можно определить при помощи вестерн-блоттинга и денситометрического анализа. Очищенный рекомбинантный COBRA HA и очищенные VLP получали при стандартном общем количестве белка, и подвергали электрофорезу в 10% SDS-PAGE геле, и переносили на PVDF-мембрану. Блот зондировали при помощи мышиной поликлональной антисыворотки, полученной от мышей, инфицированных вирусом гриппа, и комплексы HA-антитело выявляли при помощи антител козы к IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) (Southern Biotech; Бирмингем, Алабама, США). HRP выявляли с помощью хемилюминесцентного субстрата (Pierce Biotechnology; Рокфорд, Иллинойс, США), и делали рентгеновский снимок (ThermoFisher; Питтсбург, Пенсильвания, США). Оптическую плотность полос определяли при помощи программного обеспечения ImageJ (NIH). Значения оптической плотности полос рекомбинантного HA применяли для расчета стандартной кривой, а значения оптической плотности очищенных VLP интерполировали с применением результатов, полученных для рекомбинантного HA.

Исследования на мышах

Мышей BALB/c (Mus musculis, самки, возраст 6-8 недель) можно приобрести у Harlan Sprague Dawley (Индианаполис, Индиана, США). Мышей содержали в микроизоляторных блоках, им обеспечивали свободный доступ к пище и воде, и уход за ними осуществляли в соответствии с директивами USDA в отношении лабораторных животных. Мышей вакцинировали с помощью одной из трех доз очищенных VLP с COBRA HA (1,5 мкг, 0,3 мкг или 0,06 мкг), исходя из содержания HA, определенного в результате денситометрического анализа, посредством внутримышечной инъекции на 0 неделе, а затем им вводили такую же дозу посредством бустер-инъекции на 3 неделе. Вакцины в каждой дозе составляли с квасцовым адъювантом (Imject Alum, Pierce Biotechnology; Рокфорд, Иллинойс, США), CpG-олигонуклеотидами или только со средой. Через четырнадцать - двадцать один день после каждой вакцинации у мышей под анестезией из ретроорбитального сплетения забирали кровь и переносили ее в микроцентрифужную пробирку. Пробирки центрифугировали и сыворотку отбирали и замораживали при -80±5ºС. Сывороточный титр антител, ингибирующих гемагглютинацию (HAI), для каждой группы вакцинации определяли на 5 неделе при помощи типичных реассортантных вирусов или VLP с COBRA HA.

Через три недели после заключительной вакцинации производили интраназальное контрольное заражение мышей патогенным вирусом гриппа (таким как изолят патогенного вируса гриппа H2N2, H3N2 или B) в объеме 50 мкл. После инфицирования проводили ежедневное отслеживание мышей в отношении снижения массы тела, наличия признаков заболевания и наступления смерти в течение 14 дней после инфицирования. Индивидуальные значения массы тела, баллы по шкале оценки заболевания (Toapanta and Ross, Respiratory Research 10(1):112, 2009) и случаи смерти регистрировали для каждой группы ежедневно после прививки.

Исследования на хорьках

Черных хорьков (Mustela putorius furo, самки, возраст 6-12 месяцев), не подвергавшихся ранее заражению вирусом гриппа и с удаленными пахучими железами, можно приобрести у Marshall Farms (Сейр, Пенсильвания, США). Хорьков содержали парами в клетках из нержавеющей стали (Shor-line, Канзас-Сити, Канзас, США), в которых была подстилка для лабораторных животных Sani-chips (P.J. Murphy Forest Products, Монтвилл, Нью-Джерси, США). Хорьки получали корм для хорьков Teklad Global (Harlan Teklad, Мэдисон, Висконсин, США) и свежую воду ad libitum. VLP с COBRA HA разводили в PBS, pH 7,2, до достижения конечной концентрации. Хорьков вакцинировали с помощью одной из двух доз очищенных VLP с COBRA (15 мкг, 3 мкг), исходя из содержания HA, определенного денситометрическим анализом, посредством внутримышечной инъекции в четырехглавую мышцу в объеме 0,25 мл на 0 неделе, а затем им вводили такую же дозу посредством бустер-инъекции на 3 неделе. Вакцины хранили при -80ºС до применения и составляли с квасцовым адъювантом (Imject Alum; Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США) непосредственно перед применением. Проводили еженедельное отслеживание животных в отношении нежелательных явлений, включая снижение массы тела, повышение температуры, снижение активности, выделения из носа, чихание и диарею, во время действия режима вакцинации. До вакцинации животных подвергали анализу на HAI для подтверждения того, что они являются серонегативными в отношении циркулирующих в крови вирусов гриппа A и гриппа B. Через четырнадцать - двадцать один день после каждой вакцинации у хорьков под анестезией из передней полой вены забирали кровь и переносили ее в микроцентрифужную пробирку. Пробирки центрифугировали и сыворотку отбирали и замораживали при -80±5ºС. Сывороточный титр HAI-антител для каждой группы вакцинации определяли на 5 неделе при помощи типичных реассортантных вирусов или VLP с COBRA HA.

Через три недели после заключительной вакцинации производили интраназальное контрольное заражение хорьков патогенным вирусом гриппа (таким как изолят патогенного вируса гриппа H2N2, H3N2 или B) в объеме 1 мл. После инфицирования проводили ежедневное отслеживание хорьков в отношении снижения массы тела, наличия признаков заболевания и наступления смерти в течение 14 дней после инфицирования. Индивидуальные значения массы тела, баллы по шкале оценки заболевания и случаи смерти регистрировали для каждой группы ежедневно после прививки. Промывания полости носа выполняли путем закапывания 3 мл PBS в ноздри хорьков под анестезией ежедневно в течение 7 дней после прививки. Смывы собирали и хранили при -80°С до применения.

Иммунизации приматов

Макак-крабоедов (Macaca fascicularis, самцы, возраст 3-5 лет) можно приобрести у Harlan Sprague Dawley (Индианаполис, Индиана, США). Макак вакцинировали с помощью очищенных VLP с COBRA HA (15 мкг), исходя из содержания HA, определенного в результате денситометрического анализа, посредством внутримышечной инъекции на 0 неделе, а затем им вводили такую же дозу посредством бустер-инъекции на 3 и 6 неделях. Вакцины составляли с квасцовым адъювантом (Imject Alum; Pierce Biotechnology, Рокфорд, Иллинойс, США) непосредственно перед применением. Через двадцать один день после каждой вакцинации у макак под анестезией из бедренной вены забирали кровь и переносили в пробирку для отделения сыворотки. В пробирках обеспечивали возможность активации свертывания, после чего центрифугировали, а сыворотку отбирали и замораживали при -80±5ºС. Конечную точку титрования IgG и сывороточный титр HAI-антител для каждой группы вакцинации определяли на 5 неделе при помощи типичных реассортантных вирусов или VLP с COBRA HA.

Через три недели после заключительной вакцинации производили контрольное заражение макак посредством интраназальной, интратрахеальной или глазничной прививки патогенным вирусом гриппа (таким как изолят патогенного вируса гриппа H2N2, H3N2 или B) в объеме 1 мл. После инфицирования проводили ежедневное отслеживание макак в отношении снижения массы тела, наличия признаков заболевания и наступления смерти в течение 5 дней после инфицирования. Индивидуальные значения массы тела, баллы по шкале оценки заболевания и случаи смерти регистрировали для каждой группы ежедневно после прививки.

Ввиду многих возможных вариантов осуществления, к которым могут быть применены принципы раскрытого изобретения, следует признать, что проиллюстрированные варианты осуществления являются только предпочтительными примерами настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, объем настоящего изобретения определяется следующей формулой изобретения. Поэтому в качестве настоящего изобретения заявляется все, что находится в пределах объема и сущности данной формулы изобретения.

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены рекомбинантный полипептид гемагглютинин (НА) вируса гриппа для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H3N2, молекула нуклеиновой кислоты, его кодирующая, и вектор экспрессии, слитый белок и вирусоподобная частица (VLP), содержащие указанный полипептид НА, и выделенная клетка для выработки и экспрессии указанной VLP, а также композиция, содержащая указанные полипептид, VLP и слитый белок, и способ вызова иммунного ответа в отношении вируса гриппа H3N2. Предложенный полипептид содержит одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11 и получен путем проведения серии выравниваний последовательностей белков HA и последующего получения консенсусных последовательностей на основании строения изолятов вирусов гриппа H3N2. Предложенный полипептид вызывает иммунный ответ с широким спектром реактивности в отношении изолятов вируса гриппа H3N2 и может быть использован в медицине для вызова иммунного ответа на вирус гриппа H3N2. 9 н. и 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл., 5 пр.

Формула