Способ продуцирования в высокой степени вирусобезопасных компонентов для получения фибринового клея из пула плазмы человека - RU2236237C2

Чертежи

Описание

Область изобретения

Настоящая заявка относится к продуцированию в высокой степени вирусобезопасных биологических клеев, состоящих из двух компонентов: первого компонента, представляющего собой концентраты белков свертывания крови, главным образом фибриногена, фактора XIII и фибронектина, и второго компонента, представляющего собой концентрат тромбина, полученный из того же самого пула плазмы человека. В частности, данный способ включает в себя три стадии инактивации вирусов: обработку растворителем/детергентом, нанофильтрацию и термообработку.

Предпосылки изобретения

Биологические клеи представляют собой концентраты адгезивных белков, состоящие из фибрина, генерированного из фибриногена, активированного тромбином и фактором XIII в присутствии ионов кальция. Адгезивная способность кровяного сгустка, обусловленная сетчатой структурой полимеризованного фибрина, известна уже давно. В качестве адгезива фибрин стал использоваться уже в начале этого века и был открыт Бергелем (Bergel: Uber Wirkungen des Fibrins (Dtschr. Med-Wochenschr 1909; 3: 633-665)), который выяснил, что этот белок является физиологическим клеящим веществом, и, кроме того, описал его лечебные свойства. За этим открытием сразу последовало открытие Грея (Grey: Fibrin as hemostatic in cerebral surgery (Surg. Gynecol. Obstet. 1915; 21: 452)), использовавшего фибриновые тампоны для прекращения внутри-мозгового и печеночного кровотечений, а также в хирургии головного мозга. Однако только в 1944 году Кронкит (Cronkite: Use of thrombin and fibrinogen in skin grafting (JAMA 1944, 124: 976-978)), а затем R.T. Tidrick & E.D. Warner (Fibrin fixation of skin transplants (Surgery 1944; 15: 90-95)) использовали фибриноген вместе с тромбином для предупреждения отторжения кожного трансплантата. Но низкая концентрация этих продуктов не позволяла обеспечить ни высококачественную адгезию, ни длительного эффекта. С 1946 г. благодаря важным научным исследованиям E.J. Cohn et al. (Preparation and properties of serum plasma proteins. A system for separation into fraction of proteins and lipoprotein components of biological tissues and fluids (J. Am. Chem. Soc. 1946; 68: 459-475)) по фракционированию белков плазмы были, в частности, использованы белки свертывания крови, а через несколько лет был выявлен механизм свертывания крови и основные белки свертывания крови, а именно фактор XIII. Matras (Topographical anatomy of total osteotomy of the midface (J. Maxillofac Surg. 1975; 3(4): 260-262)) впервые использовал адгезивные свойства фибрина с применением высококонцентрированного фибриногена. С этого времени биологические клеи окончательно вытеснили синтетические клеи и все больше используются в клинической практике для лечения человека.

Использование биологических клеев открывает новые возможности в хирургии и наложении швов. В течение длительного времени хирурги пытались получить эффективный, простой в обращении и, в основном, хорошо переносимый адгезив, который мог бы использоваться в дополнение к хирургическим швам или вместо них. Хирургические швы имеют важное значение в современной хирургии. Однако в связи с ними возникает множество проблем, таких как их непереносимость или токсичность. Для хирургов кровь, благодаря своим коагулирующим свойствам, всегда представляла собой идеальную модель биологической адгезии, но использование биологических адгезивов, полученных из человеческих источников, связано с проблемой передачи вирусов. Опасность передачи вируса зависит, главным образом, от методов очистки концентратов плазмы. Для клинического использования у человека биологические клеи должны быть получены с применением тщательной обработки, направленной на инактивацию вируса, но не оказывающей неблагоприятного воздействия на качество продуктов. В настоящее время проводятся исследования в целях разработки адгезива, обладающего следующими свойствами:

- высокой вирусобезопасностью,

- достаточной адгезивностью,

- хорошей адаптивностью,

- хорошей фиксацией на близлежащих тканях,

- отсутствием токсичности,

- отсутствием метаболического действия,

- хорошей переносимостью.

В патентах США №5290918 и №5395923, выданных Наеmacure Biotech Corp., описаны методы получения и использования концентрата фибриногена, фактора XIII и фибронектина в терапевтических целях.

Благодаря своим коагулирующим свойствам, концентрат, богатый фибриногеном и фактором XIII, дает возможность клиницистам использовать его как точный и эффективный инструмент при хирургических операциях, где его гемостатические свойства крайне необходимы. Областями клинического применения такого концентрата могут быть нейрохирургия, сердечно-сосудистая хирургия, пластическая хирургия (трансплантация кожи), ЛОР-хирургия, стоматология, ортопедическая хирургия, общая хирургия и травматология.

Главным белком в этом концентрате является фибриноген, который, благодаря своей ферментативной реакции в присутствии тромбина и ионов кальция, продуцирует фибринопептиды А и В, что приводит к образованию мономеров фибрина. Эти мономеры быстро полимеризуются и превращаются в растворимый фибрин. Затем фибрин-стабилизирующий фактор (фактор XIII) под действием ионов кальция образует с этим растворенным фибрином ковалентные связи, которые делают его стабильным и нерастворимым в кислой среде или в присутствии мочевины.

Образованный таким образом фибрин является необратимым, стабильным и полностью выполняет свою функцию коагулянта. Он устойчив к фибринолизу благодаря высокой концентрации в нем фибриногена, не содержащего плазминогена, и сохраняет свою форму в результате отсутствия экссудации. Этот концентрат имеет следующие свойства: превосходную стабильность после его последующего растворения в водном растворе, способность к солюбилизации в течение нескольких минут при комнатной температуре, хорошую эластичность и, наконец, хорошую адгезивность.

Эти свойства зависят только от способа его получения из плазмы. Этот способ является простым, быстрым и легко применимым к промышленному производству. Полученный биологический и биохимический концентрат, в основном, хорошо сохраняется, и этот продукт отвечает клиническим требованиям.

Использование продуктов, происходящих из крови, всегда связано с проблемой передачи вируса, несмотря на имеющиеся вирусологические тесты. Способом обеспечения безопасности продуктов, происходящих из крови, является систематическая инактивация предположительно присутствующих в крови вирусов с использованием методики, не оказывающей негативного воздействия на биохимические свойства продуктов плазмы. В настоящее время существует много известных методов инактивации вирусов, основанных на природе данных вирусов и типах белков, подлежащих выделению, о чем свидетельствует все возрастающее число научных публикаций в этой области.

Наиболее широко используемыми продуктами крови являются альбумин, иммуноглобулины и концентраты факторов свертывания крови. Gellis et al. (Chemical, clinical and immunological studies on products of human plasma fractionation: inactivation of virus of homologous serum albumin by means of heat (J. Clin. Invest., 1948; 27: 239-244)) впервые использовали метод инактивации вирусов путем нагревания препарата альбумина при 60°С в течение десяти часов. Этот метод, благодаря его проверенной эффективности в снижении риска передачи вируса, используется и до настоящего времени. Этот же самый метод был использован для получения иммуноглобулинов G (IgG) с той же самой эффективностью. Такая эффективность может быть обусловлена методом очистки этих продуктов крови, а в частности, использования полного цикла фракционирования, описанного Cohn (см. выше) или Kistler & Nitschmann: Large scale production of human plasma fraction (Vox Sanguinis 1962; 7: 414-424).

Использование этанола в многочисленных стадиях фракционирования альбумина и IgG позволяет осуществлять перераспределение количества вируса в различных фракциях. Известно, что этанол является дезинфицирующим средством против патогенных агентов, таких как вирусы, как было упомянуто Henin et al.: Inactivation and partition of human immunodeficiency virus during Kistler and Nitschmann fractionation of human blood plasma (Vox Sanguinis 1988; 54: 78-83) и Morgenthaler: Effects of ethanol on virus inactivation in plasma products (Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Basel Karger 1989; 56: 109-121).

Пастеризация альбумина и IgG начала применяться в начале 50-х годов. Однако эта техника была направлена на инактивацию вируса гепатита (гепатита В и гепатита не-А, не-В). Curran и др. (Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) associated with transfusion (N. Engl. J. Med. 1984; 310: 69-75)) указали на возможность передачи вируса типа ВИЧ при переливании крови или при использовании других производных крови, а в частности, факторов свертывания крови. С этих пор методы инактивации вирусов были направлены на инактивацию ВИЧ. Использование альбумина или IgG не приводило к передаче ВИЧ, и предполагалось, что это отсутствие передачи вируса обусловлено проведением стадии пастеризации (Mitra et al.: Elimination of infections retroviruses during preparation of immunoglobulins (Transfusion 1986; 26: 394-397)). Факторы свертывания крови, такие как фактор VIII и фактор IX, широко использовались для лечения пациентов с гемофилией. Heimburger и др. (a-Factor VIII - Konzentrathepatitissicher: Fort-schritte in der Behandlung der Hamophilie A (Die gelben Hefte 1980; 20: 165-174) и b-A Factor VIII concentrate, high purified and heated in solution (1^stInternational Hemophilia Conference, Bonn. October 3-7, 1980, abstr. 110 and 117)) при получении этих продуктов применяли ту же самую описанную технику пастеризации, которая была использована для альбумина в целях инактивации вирусов в процессе получения фактора VIII в присутствии глицина и сахарозы, во избежание денатурации белков во время тепловой денатурации при температуре 60°С в течение десяти часов. Исследования этих авторов продемонстрировали эффективность инактивации ВИЧ, вируса гепатита В и вируса гепатита не-А, не-В.

Hilfenhaus и др. (a-Safety of human blood products: Inactivation of retroviruses by heat treatment at 60°C (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1985; 178: 580-584), b-Inactivation of the AIDS-causing retrovirus and other human viruses in antihemophilic plasma proteins preparations by pasteurization (Vox Sanguinis 1986; 50: 208-211), c-Pasteurization as an efficient method to inactivate blood borne viruses in F. VIII concentrates (Drug Res. 1986; 22: 621-625)) подтвердили, что пастеризация является эффективным методом инактивации вирусов, таких как ВИЧ, в процессе получения концентрата фактора VIII. Tabor и др. (Inactivation of hepatitis В virus by heat in antithrombin III stabilized with citrates (Thromb. Res. 1982; 22: 233-238)) инактивировали вирус гепатита В путем нагревания антитромбина III в присутствии цитрата в качестве стабилизирующего агента. Hollinger и др. (Reduction in risk of hepatitis transmission by heat treatment of human factor VIII concentrate (J. Infect. Dis. 1984; 150: 250-262)) нагревали концентрат фактора VIII в лиофилизованном состоянии для снижения риска передачи ВИЧ-инфекции и гепатита. Piszkiewicz и др. (a-Heat inactivation of human immunodeficiency virus in lyophilized anti-inhibitor coagulant complex (Autoplex) (Thromb. Res. 1986; 44: 701-707), b-Heat inactivation of human immunodeficiency virus in lyophilized factor VIII and factor IX concentrates (Tromb. Res. 1987; 47: 235-241)) продемонстрировали, что термообработка лиофилизованных концентратов факторов свертывания крови не оказывает какого-либо значительного воздействия на активность этих факторов. Эти авторы особо подчеркивали, что, благодаря термообработке, какого-либо продуцирования новых антигенов, очевидно, не происходит.

Исследования по инактивации вируса под действием термообработки были проведены Piszkiewicz и др. (Virus inactivation by heat treatment of lyophilized coagulation factor concentrates. Virus inactivation in plasma products (Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Basel, Karger 1989; 56: 44-46)) при получении "антигемофилических факторов" (Hemofil® Т, Hemofil® CT), где указанные факторы нагревали в течение 72 часов при 60°С, и при получении комплексов ингибитора антикоагулянта (Autoplex® Т), комплекса фактора IX (Proplex® SX-T и Proplex® Т), где указанные комплексы нагревали при 60°С в течение 144 часов. При этом о какой-либо серологической конверсии ВИЧ, обусловленной использованием любого из пяти термообработанных продуктов свертывания крови, не сообщалось. При исследованиях, проведенных на обезьянах, было обнаружено, что концентрат Hemofil® Т, полученный из плазмы, которая была скринирована на HBsAg и анти-НВс, не передает гепатит не-А, не-В (NANBH). Однако использование того же самого продукта, полученного из плазмы, скринированной лишь на HBsAg, приводило к NANBH у пациентов (Colombo et al., Transmission of non-A, non-B hepatitis by heat treated factor VIII concentrate (Lancet 1985; ii: 1-4)). В настоящее время Hemofil® T производят из плазмы, которая является нереактивной в отношении HBsAg и имеет нормальные уровни ALT.

Вирусы, а также белки являются более стабильными и более резистентными к нагреванию в том случае, когда они находятся в сухом (лиофилизованном) состоянии. Для минимизации денатурации белков температуру и продолжительность нагревания варьируют в зависимости от природы этих белков. Однако ни в одной из работ не сообщалось об абсолютной эффективности инактивации вирусов: Colombo и др. (см. выше) сообщали о передаче NANBH; While и др. (HTLV-III seroconversion associated with heat-treated factor VIII concentrate (Lancet 1986; i: 611-612)), а также Van den Berg и др. (Seroconversion to HTLV-III in hemophiliac given heat-treated factor VIII concentrate (Lancet 1986; i: 803-803)) сообщали о передаче ВИЧ. Исходя из этого, Winkelman и др. (A new therapeutic factor VIII concentrate of high specific activity and high yield (Tromb. Haemost. 1985; 54: 19-22)) осуществляли нагревание концентрата фактора VIII (тип 8Y), фактора IX (тип 9А), фактора VII, фактора XI и тромбина при 80°С в течение 72 часов. Исследования, проведенные с участием 29 пациентов, которым вводили эти термообработанные продукты, указывали на отсутствие у этих пациентов серологической конверсии ВИЧ или НВ и на значительное снижение случаев передачи NANBH.

Другие методы инактивации вирусов были разработаны с использованием источников света (УФ-излучение, гамма-излучение и лазерное излучение) для облучения инфекционных агентов в плазме. В качестве ссылок можно указать на следующие работы: Oliphant et al.: Homologous serum jaundice; experimental inactivation of etiologic agent in serum by ultraviolet irradiation (Publ. Health Rep 1946; 61: 598-600), Wolf et al.: Ultraviolet irradiation of human plasma to control homologous serum jaundice (JAMA 1947; 135: 476-477), Blanchard et al.: Methods of protection against homologous serum hepatitis II. The inactivation hepatitis virus serum with ultraviolet rays (JAMA 1948; 138: 341), Murray et al.: Effect of ultraviolet radiation on the infectivity of icterogenic plasma (JAMA 1955; 157: 8-14), Gurzagyan et al.: Mechanism of high power picosecond laser UV irradiation of viruses and bacterial plasmids (Photochem. Photobiol. 1981; 3: 835-838), Redfield et al.: Psoralen inactivation of influenza and herpes simplex virus and of viral infected cells (Infect Immun 1981; 32: 1216-1226), Heindrich et al.: Clinical evaluation of the hepatitis safety of beta-propiolactone-ultraviolet treated factor IX concentrate (PPBS), (Throm. Res. 1982; 28: 75), Kitchen et al.: Effect of gamma irradiation of the human immunodeficiency virus and human coagulation proteins (Vox Sang. 1989, 56: 233-229).

В течение более десяти лет одним из наиболее часто используемых методов инактивации вирусов в продуктах, происходящих из крови, является метод, в котором одновременно используются растворитель и детергент. Этот метод был разработан Neurath & Horowitz (патент США №4540573, выданный в сентябре 85 г.; патенты США №4613501, №4764369, выданные в августе 1988; патент США №4820805, выданный в апреле 1989; патент США №4841023, выданный в июне 1989, и патент США №5541294, выданный в июле 1996). Смесь растворителя/детергента (три(н-бутил)-фосфата/детергента) обычно инактивирует вирусы с оболочкой, такие как ВИЧ, HTLV-1, HBV и EBV.

Однако метод с использованием растворителя/детергента является недостаточно эффективным для получения безопасных продуктов плазмы из-за присутствия в них вирусов без оболочки, таких как парвовирус и полиовирус, которые являются невосприимчивыми к растворителю/детергенту. Недавно для уничтожения вирусов без оболочки, на которые не действует растворитель/детергент, был разработан другой метод. Этим методом является нанофильтрация. Нанофильтры состоят из микропористых волокон и выпускаются промышленностью под названием Planova BMM (Asahi Chemical Industries, Tokyo, Japan). Размер пор этих фильтров варьируется от около 15 до 35 нм. Эти фильтры могут задерживать некоторые типы вирусов, имеющих размер более чем около 25 нм. Такие фильтры являются эффективными для удержания вирусов, таких как ВИЧ-1 (80-100 нм), НВВ (42 нм), HCV (<80 нм), вирус гепатита Дельта (35 нм), вирус бычьей вирусной диареи (60-70 нм), вирус Sindbis (60-70 нм), реовирус типа 3 (60-80 нм), полиовирус Сабина типа I (25-30 нм), парвовирус человека (20-25 нм); Sekiguchi et al.: Possibility of hepatite В virus (HBV) removal from human plasma using regenerated cellulose hollow fiber (BMM) (Membrane, 1989; 14: 253-261), Hamamoto et al.: A novel method for removal of human immunodeficiency virus: filtration with porous polymeric membranes (Vox sang., 1989; 56: 230-236), Tsurumi et al.: Structure of cuprammonium regenerated cellulose hollow fiber (BMM hollow fiber) for virus removal (Polym. J. 1990, 22: 751-758), Ishikawa et al.: Novel determination method of size of virus in solution using cuprammonium regenerated cellulose membrane (BMM) (Membrane, 1991; 16: 101-111), Тоmokiyo et al.: Studies on virus elimination and inactivation effect of highly purified F-VIII concentrate (The clinical report, 1991; 25: 271-275), Manabe: Virus removal and inactivation in process validation (Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects (Murakami H., Shirahata S., Tachibana H. eds, 1992, 15-30), Burnouf-Radosewich et al.: Nanofiltration, a new specific virus elimination method applied to high-purity factor IX and factor VI concentrates (Vox Sanguinis 1994; 67(2): 132-138)).

Rubinstein и др. (Combined solvent-detergent and 100°C (boiling) sterilizing dry-heat treatment of Factor VIII concentrates to assure sterility (Vox Sanguinis 1991; 60: 60)) использовали двойную инактивацию вирусов в концентрате фактора VIII путем обработки этого концентрата растворителем/детергентом и нагревания конечного продукта при 100°C в течение 30 минут. В соответствии с описанием этих авторов термообработка конечного продукта позволяет инактивировать вирусы не-А,не-В гепатита без липидной оболочки. Термообработка конечного продукта является также мерой предосторожности в случае случайного заражения вирусом во время манипуляции или вследствие использования зараженного оборудования (Vox Sang, 1991; 60: 60).

Недавно Proba и др. (патент США 5506127) использовали тройную инактивацию вирусов в процессе получения тромбина: (1) путем обработки растворителем/детергентом, (2) нанофильтрации и (3) термообработки лиофилизованного продукта при 100°C в течение 1 часа (патент США 5506127, выданный Haemasure Biotech Inc.).

Обработка с тройной инактивацией вируса обеспечивает повышенную безопасность при использовании продуктов, полученных из крови, а в частности, факторов свертывания крови или биологических адгезивов.

Ни в одной из работ не сообщалось о способе трехстадийной инактивации вирусов для получения концентрата других факторов свертывания крови, таких как фибриноген. Кроме того, осуществление этих стадий инактивации вирусов может также навести на мысль, что добавление множества стадий в способ получения продуктов из крови будет приводить к снижению выхода нужных продуктов. Однако существуют возможности увеличения выхода получаемых из крови продуктов без снижения безопасности и качества этих продуктов или возможности увеличения безопасности продуктов без негативного влияния на выход и природу этого продукта.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения компонентов биологического клея, которые все вместе составляют продукт, имеющий хороший выход и высокое качество и являющийся безопасным в отношении передачи вируса.

Объектом настоящего изобретения является способ получения концентрата белков, коагулируемого тромбином и в основном не содержащего вирусной активности, где указанный концентрат белков содержит белки, представляющие собой, в основном, фибриноген, эндогенный фактор XIII и фибронектин, и где указанный способ включает в себя следующие стадии:

а) преципитации, осуществляемой на интактных белках плазмы путем добавления соли в количестве, достаточном для достижения эффекта высаливания и для доведения значения рН от 7,5 до около 8,5 при температуре от около 0°С до 4°С или для достижения кислотной преципитации при рН от около 4,5 до около 5,5 при температуре, составляющей от около 4°С до около 20°С, в результате чего фибриноген, фактор XIII и фибронектин становятся селективно осажденными белками, причем указанную селективную преципитацию проводят в присутствии 6-аминогексановой кислоты в концентрации, составляющей, по крайней мере, 50 мМ;

b) солюбилизации осажденных белков в присутствии от около 0,2 до 0,3 г L-гистидина на один грамм белков с получением раствора, содержащего эти белки;

c) стадию дезактивации вируса, присутствующего в растворе, полученном в стадии (b), с использованием вирицидного раствора растворителя/детергента;

d) доведения концентрации детергента до значения, позволяющего проводить фильтрацию раствора на фильтре с размером пор примерно 35 нм без какой-либо значительной потери указанных белков;

e) фильтрации раствора, полученного в стадии (d) на фильтре с размером пор примерно 35 нм, причем эта стадия предусматривает проведение второй стадии удаления вируса;

f) преципитации отфильтрованного раствора, полученного в стадии (е), с использованием той же соли, что и в стадии (а), примерно при той же температуре и в присутствии приблизительно той же концентрации 6-аминогексановой кислоты с образованием преципитата;

g) промывки преципитата стадии (f) с получением промытого преципитата с нейтральным рН;

h) солюбилизации промытого преципитата стадии (g) в присутствии от около 0,2 до 0, 3 г L-гистидина на один грамм белков;

i) добавления стабилизатора белков, определенное количество которого добавляют в зависимости от количества белков, полученных в стадии (h), с получением раствора;

j) стерильной фильтрации раствора, полученного в стадии (i), с получением стерильно отфильтрованного раствора;

k) распределения аликвот стерильно отфильтрованного раствора стадии (j) по стерильным колбам и

1) лиофилизации аликвот раствора, взятых в стадии (i), с получением лиофилизованного концентрата.

Для получения продукта с тройной инактивацией вирусов указанный способ, кроме того, предусматривает сухую термообработку лиофилизованного продукта примерно при 100°С в течение от около 1 до около 2 часов.

Стадию дезактивации вирусов (с) осуществляют примерно при 24±1°С приблизительно в течение шести часов при непрерывном перемешивании в растворе, состоящем примерно из 10 мг/мл солюбилизированных белков, 1% моноолеата полиоксиэтиленсорбитана и 0,3% три-н-бутилфосфата (конечные концентрации).

Перед проведением нанофильтрации концентрацию моноолеата полиоксиэтиленсорбитана доводят примерно до 2%-4%.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения осаждающей солью является ацетат натрия или калия либо одноосновная или двухосновная фосфатная соль натрия или калия. Стадии (а) и (f) проводят примерно в течение, по крайней мере, 30 минут. Стадию (g) осуществляют при температуре от около 2°С до около 20°С.

В более предпочтительном варианте осуществления изобретения стадия (g), кроме того, включает в себя стадию (g.i) солюбилизации промытого преципитата в чистой воде с нейтральным рН или в воде, подщелоченной до рН около 7,3, и стадию (g.ii) диализа или диафильтрации солюбилизированного преципитата стадии (g.i); а стадия (h), кроме того, включает в себя добавление L-гистидина к диализованному или диафильтрованному преципитату до конечной концентрации от около 0,2 до 0,3 г L-гистидина на один грамм белков.

Вышеуказанная подщелаченная чистая вода, используемая для солюбилизации преципитата перед диализом или диафильтрацией, может представлять собой раствор 0,1-0,5% Триса, приготовленный в чистой воде.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения преципитат стадии (g) промывают раствором 0,1% Трис-HCl с рН 4,5-5,0 или рН 9,50-10,50, приготовленным в чистой воде.

Стадию солюбилизации (b) предпочтительно проводят в 1% Трис и 1,6% цитрате натрия при рН 6-7,3 или рН 9,5-10,5 для доведения концентрации белка до около 20-22 мг/мл перед добавлением L-гистидина.

Стадию солюбилизации (h) предпочтительно проводят в 0,5% Трисе, рН 6,8-7,3, для доведения концентрации белка до 30-40 мг/мл перед добавлением L-гистидина.

Стабилизатор белков может содержать сахарозу, альбумин и моноолеат полиоксиэтиленсорбитана, которые добавляют для достижения концентрации примерно 0,5 г/г белка, 0,05 г/г белка и 17-20 мкг/мг белка соответственно.

Лиофилизованный концентрат, полученный способом настоящего изобретения, солюбилизируют в воде за менее чем пять минут при комнатной температуре, при перемешивании вручную, с образованием солюбилизированного концентрата и стабилизируют при температуре примерно 4-20°С, по крайней мере, за 24 часа.

Белки цельной плазмы, используемые в стадии (а), происходят от человека или животных.

Другим объектом настоящего изобретения является способ крупномасштабного изготовления стойкой при хранении и терапевтически приемлемой тромбиновой композиции, по существу, не содержащей активных вирусов, где указанный способ включает в себя следующие стадии:

a) выделения супернатанта, полученного в стадии (а), способом по п.1;

b) диафильтрации указанного супернатанта против ионообменного раствора, не содержащего соли или с низким содержанием соли;

c) разбавления указанного диафильтрованного супернатанта до получения раствора протромбина около 100 мОсмоль/кг по массе или менее;

d) преципитации протромбина путем добавления кислотного раствора до получения рН около 5,2;

e) солюбилизации преципитата стадии (d) в растворе, имеющем почти нейтральный рН;

f) превращения протромбина стадии (е) в тромбин в присутствии разбавляющего раствора хлорида кальция с получением концентрации хлорида кальция от около 20 до около 30 мМ;

g) инкубирования указанного тромбина с вирицидным раствором растворителя/детергента в количестве, достаточном для инактивации липидсодержащих вирусов;

h) очистки инкубированного материала с помощью последующей ионообменной хроматографии, проводимой с использованием катионообменной моносреды с сульфалкил-активированным полисахаридом, выбранным из группы, состоящей из активированной сульфалкилом полиагарозы, активированного сульфалкилом полидекстрана и несжимаемой композиционной среды, состоящей из активированного сульфалкилом декстрана и частиц двуокиси кремния и обладающей высокой степенью селективности по отношению к тромбину, и с использованием элюирующего агента, содержащего водный буферный раствор, по крайней мере, в трех возрастающих концентрациях; и

i) выделения элюата тромбинового пика в результате проведения хроматографии в стадии (h) и замены буфера элюата физиологически приемлемым буфером для стабилизации композиции в целях стабилизации выделенного тромбина, и получения буферного раствора для приготовления препарата тромбина.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения стадия (b) предусматривает замену водного раствора в объеме, эквивалентном четырем объемам супернатанта.

В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения разбавляющим раствором в стадии (f) является 40 мМ хлорид кальция, добавленный в объеме, эквивалентном примерно четырем объемам солюбилизированного преципитата стадии (е).

Катионообменной средой является указанная несжимаемая композиционная среда, содержащая активированный сульфалкилом декстран и частицы двуокиси кремния.

Предпочтительным сульфалкил-активированным декстраном является декстран, активированный сульфопропилом, и частицы двуокиси кремния. Возрастающие концентрации буфера составляют, в основном, около 0,08 М, 0,15 М и 0,4 М NaCl-буфера для человеческого тромбина.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ, кроме того, предусматривает фильтрацию буферного раствора препарата тромбина через мембрану, состоящую из полых волокон медноаммиачной целлюлозы, в целях отфильтровывания вирионов, присутствующих в буферном растворе препарата, и получение, по существу, не содержащего вирионов буферного раствора препарата тромбина.

Мембрана из полых волокон медноаммиачной целлюлозы предпочтительно имеет размер пор примерно 15 нм.

В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ после проведения фильтрации, кроме того, предусматривает лиофилизацию и сухую термообработку буферного раствора тромбинового препарата для инактивации оставшихся вирионов без денатурации тромбина.

Эту сухую термообработку проводят предпочтительно путем нагревания лиофилизованного продукта примерно при 100°С в течение от около 1 до около 2 часов.

Буферный раствор препарата может включать в себя водный раствор цитрата, хлорида натрия, Трис-НСl и сывороточного альбумина при рН около 7,3. в количествах, достаточных для стабилизации тромбина в целях предотващения значительной потери его активности в процессе термообработки.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения буферный раствор препарата включает в себя водный раствор, содержащий примерно 0,25% цитрата натрия, 0,45% хлорида натрия, 0,25% Трис-HCl (все величины даны в мас./об.%) и сывороточный альбумин в количестве, примерно в 20 раз превышающем количество общего белка в элюате тромбинового пика и доведенном перед лиофилизацией до 2% мас./об.; и имеющий рН примерно 7,3.

Преимущества настоящего изобретения соответствуют всем требованиям, предъявляемым к промышленному производству в отношении экономического показателя "затраты-эффективность" и в отношении вирусобезопасности.

Описание изобретения

Далее приводится описание настоящего изобретения со ссылками на нижеследующие конкретные примеры и чертежи, которые носят лишь иллюстративный характер и не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 проиллюстрированы стадии получения концентрата фибриногена, фактора XIII и фибронектина, выделенных из пула человеческой плазмы в соответствии с настоящим изобретением.

На Фиг.2 проиллюстрирован способ получения тромбина из супернатанта плазмы, продуцированного в процессе выделения концентрата фибриногена, фактора XIII и фибронектина, полученных из пула человеческой плазмы в соответствии с настоящим изобретением.

ПРИМЕР

Получение концентрата, богатого фибриногеном, фактором XIII и фибронектином:

Первое фракционирование

Пул плазмы хранят при температуре, составляющей от около 16°С до около 37°С. Затем при перемешивании добавляют 6-аминогексановую кислоту до достижения минимальной концентрации 50 мМ. Полученную смесь инкубируют в течение, по крайней мере, 15 минут при 35-37°С. Затем эту смесь охлаждают до 0°С±2°С. После этого добавляли одноосновный фосфат натрия или калия (патент США 5290918, выданный Haemacure Biotech. Inc.) или ацетат натрия или калия (патент США 5395923, выданный Haemacure Biotech Inc.) до достижения конечной концентрации 1 М. Эту смесь перемешивают в течение примерно 0,5-1 часа при температуре от около 0°С до 4°С±2°С. Кислотная преципитация фосфатом может быть также осуществлена при комнатной температуре (около 20°С).

Центрифугирование

Смесь фильтруют или центрифугируют при 4200 об/мин (Beckman J6-MC, ротор типа 4,2) в течение 20 минут при 4°С. Супернатант выделяют для получения тромбина и преципитат переносят в другой лабораторный сосуд. Этот супернатант может быть использован непосредственно для последующей обработки, либо он может быть помещен на хранение при температуре ниже -30°С, предпочтительно -80°С на много месяцев либо при температуре 2-4°С примерно на 24 часа.

Солюбилизация

Полученный преципитат, обогащенный фибриногеном, фактором XIII и фибронектином, солюбилизируют буфером, содержащим 1% Трис и 1,6% цитрата натрия, рН 6,0±0,1 (также приемлемым является рН 7,3). Этот преципитат солюбилизируют при комнатной температуре с перемешиванием. При необходимости описанный выше буфер добавляют для получения концентрации белка примерно 20-22 мг/мл. На этой стадии добавляют L-гистидин в количестве 0,2-0,3 г на один грамм белка. Затем этот раствор белка центрифугируют при 10000 об/мин в течение 20 минут приблизительно при 4°С (Beckman J2-MI, ротор типа JA-10). Липидный слой, плавающий на поверхности раствора белка, удаляют. Этот раствор белка осторожно переносят в лабораторный сосуд и фильтруют через капсульный фильтр 0,2 микрон (Gelman SuporCap, продукт №12991 или 12992).

Обработка растворителем/детергентом

Отфильтрованный таким образом раствор белка подвергают обработке для инактивации вирусов путем смешивания равного объема раствора, содержащего 1% Трис, 1,6% цитрата натрия, 2% Tween 80® (моноолеат полиоксиэтиленсорбитана) и 0,6% Трис-н-бутил-фосфат (ТnВР), рН: 6,8±0,1. Эта процедура дает конечные концентрации до около 10 мг/мл белка, 1% Tween 80® и 0,3% ТnBР и конечный рН около 7,0±0,2. Полученный раствор инкубируют при температуре 24°С±1°С при непрерывном перемешивании в течение, по крайней мере, 6 часов.

Удаление вируса посредством нанофильтрации

После обработки в целях инактивации вирусов конечную концентрацию Tween 80® по отношению к белку доводят до 2%-4% с использованием буфера, содержащего 1% Трис, 1,6% цитрата натрия, 6% Tween 80®, рН 7,0±0,1. После этого смесь фильтруют через каскад капсульных фильтров с размером пор 0,2 и 0,1 микрон (Gelman CritiCap 0,2 мк, продукт №12995 или 12996; CritiCap 0,1 мк, продукт №12997 или 12999), и отфильтрованный раствор пропускают через 35-нм фильтр Planova BMM. Добавление Tween 80® необходимо для облегчения фильтрации молекулы с высокой молекулярной массой, подобной молекуле фибриногена, и для оптимизации ее выделения. В отсутствии Tween 80® фильтр быстро блокируется из-за белковой нагрузки.

Второе фракционирование

К фильтрату при перемешивании добавляют амино-6-гексановую кислоту в количестве 50 мМ, и полученную смесь инкубируют при 35±2°С в течение, по крайней мере, 1 часа, а затем охлаждают до 0°С±2°С. После этого добавляют определенное количество одноосновного фосфата натрия или калия (патент США 5290918, выданный Haemacure Biotech Inc.) или ацетата натрия или калия (патент США 5395923, выданный Haemacure Biotech Inc.), эквивалентное одному молю на литр смеси, в результате чего быстро появляется осадок. Перемешивание продолжают в течение 1 часа при 0°С±2°С.

Центрифугирование

Смесь фильтруют или центрифугируют при 4200 об/мин (Beckman J6-MC, ротор типа 4,2) в течение 20 минут при 4°С. Растворитель, детергент и примесные белки удаляют путем центрифугирования. Полученный преципитат выделяют и переносят в лабораторный сосуд.

Промывка

Преципитат промывают несколько раз (по крайней мере, 2 раза) 0,1% Трисом, рН буфера 7,0±0,1. Для нейтрализации раствора рН и концентрацию раствора Триса можно варьировать в пределах от 4,5-5,0 до 9,5-10,5 (концентрация 0,1-0,5%) в зависимости от соли, используемой в предыдущей стадии преципитации. Преципитат выделяют путем центрифугирования после каждой стадии промывки. Этот Трис-буфер предварительно охлаждают при 0°С±2°С, и стадии промывки проводят при 0°С±2°С. Хороших результатов можно добиться, работая и при комнатной температуре. Число стадий промывок может быть уменьшено путем проведения простого диализа или диафильтрации после возвращения преципитата обратно в конечный буфер с использованием водного раствора, подщелоченного до рН 7,3.

Солюбилизация

Промытый преципитат растворяют в конечном буфере, содержащем 0,5% Трис, 0,1% NaCl и 0,5% цитрата натрия, рН 6,8±0,1 (подходящим является также рН 7,3). Объем буфера составляет примерно 2-3 мл/г по массе преципитата. Солюбилизация преципитата может быть ускорена путем нагревания при 37°С. После завершения солюбилизации добавляют определенное количество L-гистидина, соответствующее 0,2-0,3 г на литр исходной плазмы. Затем раствор белка фильтруют или центрифугируют при 10000 об/мин в течение 20 минут примерно при 4°С (Beckman J2-MI, ротор типа JA-10).

На Фиг.1 показаны конечные стадии получения концентрата, обогащенного фибриногеном, фактором XIII и фибронектином.

Корректировка концентрации белка

Конечную концентрацию белка доводят приблизительно до 30-40 мг/мл с использованием того же самого буфера. Концентрацию белка измеряют по О.П. 280 нм.

Приготовление композиции

Конечную концентрацию L-гистидина доводят до 0,2-0,4, а предпочтительно до 0,4 г на один грамм белка, измеряя по О.П. в соответствии со следующей формулой:

[0,4 г (L-гистидина)×концентрация белка мг/мл (О.П.)×объем] - добавленные 0,2-0,3 г L-гистидина/литр плазмы].

К смеси добавляют определенное количество сахарозы, соответствующее 0,5 г/г белка, измеренного по О.П.

К полученной смеси добавляют определенное количество человеческого альбумина (25% в растворе Plasbumin 25® от Milles Inc. Pharmaceutical Division, IN 46515 USA, разрешенном для введения человеку), соответствующее 0,2 мл/г белка, измеренного по О.П.

Количество Tween 80® доводят до 17-20 мкг/мг белка, измеренного по О. П. с использованием буфера, содержащего 0,5% Трис, 0,1% NaCl, 0,5% цитрата натрия и 10% Tween 80®, рН 6,8±0,1. Перед корректировкой в соответствии с методикой, разработанной New York Blood Center, количество Tween 80® должно быть подтверждено по О.П. 620 нм.

Стерильная фильтрация

Конечный раствор белка фильтруют через капсульный фильтр с размером пор 0,2 микрон (Gelman CritiCap 0,2 мк, продукт №12995 или 12996).

Заполнение в условиях асептики

10-мл сосуды заполняют раствором белка в количестве 60±5 мг коагулируемого фибриногена на сосуд.

Лиофилизация

Колбы, содержащие 60±5 мг коагулируемого фибриногена, подвергают лиофилизации в течение 66-72 часов. Температуру постепенно повышают в пределах от -40°С до 22°С±2°С (скорость увеличения температуры составляла 0,02°С в минуту). В результате этой стадии лиофилизации получают продукт с остаточной влажностью ниже 1%, что позволяет избежать денатурации продукта в процессе последующей термообработки.

Сухое нагревание

После цикла лиофилизации сосуды закрывают под вакуумом притертыми пробками и герметично закрывают алюминиевыми крышками. Затем эти сосуды подвергают третьей стадии инактивации вирусов путем сухой термообработки примерно при 100°С± 1°С в течение 1-2 часов в соответствии с методикой, описанной в патенте США 5506127, выданном в апреле 1996 года.

Вирусобезопасность

Была оценена безопасность в отношении передачи вируса. Небольшие вирусы без оболочек, подобные парвовирусу, полиовирусу и вирусу гепатита А, инактивируют в процессе термообработки.

Главной из поставленных задач при выделении является получение по возможности наибольшего количества фибриногена после нанофильтрации. Эту задачу можно решить путем правильной корректировки концентрации Tween 80® для лучшего прохождения фибриногена через нанофильтр. Реовирус 3 без оболочки и вирус SV40 были удалены путем нанофильтрации. Поэтому каждая стадия инактивации вируса достигает своей цели: удаления или инактивации вирусов в каждой адекватной стадии, обеспечивающей тем самым получение продукта, не содержащего вирусной активности. Это означает, что осуществление этих трех стадий обеспечивает инактивацию или захват вирусов, по крайней мере, в одной из них; в противном случае вирусы, резистентные к одной или двум стадиям обработки, могут оставаться в конечном продукте.

Выделение

Полный выход фибриногена, фибронектина и фактора XIII эквивалентен выходу, описанному в патентах США 5290918 и 5395923, что свидетельствует о том, что указанная вирусобезопасность обеспечивается при сохранении активности белков.

Тромбин

Снижение содержания соли путем диафильтрации

Супернатант плазмы, полученный после первого центрифугирования преципитата плазмы, образованного путем кислотной преципитации или преципитации высаливанием (как описано в Примере), содержит значительное количество солей. Плазматическая осмомолярность после обработки солями составляет от около 2200 до 2500 мОсмоль/кг. Для выделения протромбина, присутствующего в супернатанте, такое большое количество соли должно быть удалено. Выделение протромбина может быть осуществлено только в случае, когда плазматическая среда имеет низкую ионную силу, а в частности, когда используется кислотная преципитация. Удаление соли осуществляют классическим методом диафильтрации. Супернатант переносят в систему резервуаров для диафильтрации (Amicon system, model DC10L, со спиральным патроном). Диальфильтрацию проводят против чистой воды. Один объем супернатанта плазмы заменяют в среднем четырьмя объемами чистой воды или диализуют до тех пор, пока осмомолярность плазмы не составляет примерно ниже 50-100 мОсмоль/кг.

Выделение протромбина

Подвергнутую диафильтрации плазму пятикратно разводят чистой водой. рН разведенной плазмы составляет примерно 7,4-7,8. Этот рН снижают до 5,2±0,1 путем добавления по каплям раствора уксусной кислоты (2-5%; Allary et al.: Isolement par chromatographie d'affinite, sur support de silice, de la thrombine humaine en vue de son utilisation dans les preparations de colle biologique (Ann. pharmaceu-tiques francaises 1990; 48(3): 129-135)). Протормбин осаждается в процессе снижения рН (около 5,5-6,0) и полностью осаждается при рН, составляющем 5, 1-5,3. Протромбин быстро ресолюбилизируют при рН выше 6,0 и при увеличении концентрации соли. Плазму инкубируют без перемешивания в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 4200 об/мин в течение 20 минут при 20°С (Beckman J6-MC, ротор JS 4.2). Этот преципитат выделяют и солюбилизируют в растворе, забуференном 2% Трис-HCl при рН 7,5±0,1 (объем: 120-150 мл на литр супернатанта плазмы). Количество протромбина определяют путем хронометрического дозирования (Fibrometre Stago ST4 - France). Выход протромбина составляет примерно 90% по отношению к супернатанту плазмы и исходной плазме, что соответствует примерно 750-850 единицам протромбина на литр плазмы.

Превращение протромбина в тромбин

Четыре объема 40 мМ CaCl₂ быстро добавляют к одному объему раствора протромбина, перемешивая при этом в течение нескольких минут. Эту смесь инкубируют при комнатной температуре в течение примерно одного часа или более и центрифугируют при 4200 об/мин в течение 30 минут при 20°С (Beckman centrifuge J6-MC, ротор JS 4.2). Супернатант, содержащий тромбин, выделяют и фильтруют через фильтр 0,2 микрон (Gelman SuporCap, продукт №12991 или 12992). Активность неочищенного тромбина, полученного после превращения протромбина, составляет приблизительно 110-120 единиц NIH/мл. Удельная активность составляет примерно 25-30 единиц NIH/мг белка или 80-100 единиц NIH тромбина на единицу протромбина. Общий выход тромбина составлет приблизительно 60000-80000 единиц NIH на литр супернатанта плазмы, что, например, в два раза превышает выход, измеренный способом, описанным в патенте США 5506127.

Тромбиновую активность оценивали путем измерения времени коагуляции на фиброметре (Fibrometre Stago ST4 - France) и выражали в единицах NIH. Стандартная кривая была построена с использованием тромбозима (Stago reagentes, Thrombozyme ref. 00332), где активность тромбозима была определена из стандарта NIH, лот J (титр 310 NIH). Пул плазмы использовали в качестве источника фибриногена для определения тромбиновой активности.

Инактивация вируса растворителем/детергентом

На Фиг.2 показаны стадии инактивации вирусов, осуществляемые на растворе тромбина путем последовательной обработки этого раствора растворителем/детергентом, очистки тромбина с помощью хроматографии, фильтрации вируса, приготовления препарата, лиофилизации и термоинактивации вируса при 100°С. Раствор тромбина переносят в чан с двойными стенками, снабженный системой циркуляции жидкости для поддерживания постоянной температуры 24°С±0,5°С. К этому раствору тромбина добавляют, слегка перемешивая, раствор, содержащий 11% Tween 80® и 3,3% три-н-бутилфосфат (TnBP), приготовленный в Трис 0,5%, рН 7,0±0,1. Объем растворителя/детергента представлет собой одну десятую от объема раствора тромбина. После перемешивания в течение одного часа смесь переносят во второй чан, аналогичный первому, и перемешивание продолжают еще приблизительно 5 часов. Тромбиновая активность, измеренная после инактивации вируса, показала, что какой-либо значительной потери активности в процессе обработки растворителем/детергентом не наблюдалось (0-5%). Следует отметить, что если для превращения протромбина в тромбин добавляли определенное количество твердого CaCl₂, примерно эквивалентное количеству жидкого CaCl₂, то в случае использования порошка выход снижался на 20%, а потеря активности в процессе обработки растворителем/детергентом составляла приблизительно 10-15%. В целом при добавлении порошка кальция по сравнению с добавлением раствора CaCl₂ наблюдается потеря тромбиновой активности примерно на 30%.

Очистка тромбина с помощью хроматографии

Очистку тромбина, кроме того, проводят с помощью лишь одной стадии катионообменной хроматографии. Очистка белков с помощью хроматографии хорошо известна специалистам и подробно описана во многих публикациях. Использование различных матриц или носителей зависит от целей очистки и от природы белков. В данном случае носителем является твердый агарозный гель, содержащий привитую сульфопропильную (-СН₂-CH₂-CH₂-SO₃) группу. Гель, именуемый сефарозой (SP Sepharose Fast Flow™) (Pharmacia, код №17-0729-01), представляет собой сильный катионообменник с превосходной текучестью и высокой емкостью для белков при всех значениях pH. Ионообменной группой является сульфопропил, который остается заряженным и, соответственно, сохраняет высокие емкости в течение всего рабочего цикла при рН 4-13. Белковый раствор, включающий в себя неочищенный тромбин, пропускают через колонку, содержащую сефарозу SP. Тромбин и примесные белки адсорбируются на носителе. Перед элюированием белков, оставшихся на геле, необходима интенсивная промывка геля раствором 0,08 М NaCl. Элюирование тромбина осуществляют в ступенчатом градиенте NaCl. Для удаления примесных белков через колонку сначала пропускают 0,15 М раствор NaCl. Тромбин полностью деадсорбируется и выделяется в 0,4 М NaCl. Затем гель очищают от всех адсорбированных примесей путем промывки раствором 2 М NaCl. Очистка тромбина с помощью хроматографии также позволяет удалить растворитель/детергент, использованный в предыдущей стадии инактивации вирусов. Очищенный раствор тромбина стабилизируют путем добавления человеческого альбумина (25% раствор человеческого альбумина USP Plasbumin-25, Miles Inc. Pharmaceutical Division, IN 46515 USA). Добавленное количество альбумина вычисляют по следующей формуле:

20×[c]тромбин(измеренный/О.П.)×объем тромбина (после хроматографии)×100 мл 25×1000

Тромбин в растворе после проведения хроматографической очистки является очень нестабильным. Потеря активности может быть значительной, если этот тромбин быстро не поместить в условия низких температур или если другие стадии, такие как диафильтрация и концентрирование, осуществлять без стабилизации. Использование стабилизатора, такого как альбумин, в значительной степени защищает тромбиновую активность в процессе замены буфера для получения конечной композиции (система Amicon CH2PRS или TCF10 в зависимости от объема). Конечную композицию получают в буфере, содержащем 0,25% Трис - 0,25% цитрата натрия - 0,45% NaCl, pH 7,30±0,1. Примерно шесть объемов буфера для получения композиции обменивают на один объем раствора тромбина. Перед диафильтрацией, для уменьшения обмениваемого объема и снижения времени диафильтрации, раствор тромбина может быть концентрирован с уменьшением объема в несколько раз.

Фильтрация вирусов

Затем в соответствии с описанием в патенте США 5506127, выданном 9 апреля 1996, диафильтрованный раствор тромбина фильтруют через мембрану из полых волокон, такую как микропористая мембрана Planova BMM (Bemberg microporous membrane BMM Development, Asahi Chemical Industries, Tokyo, Japan), содержащую волокна из медноаммиачной регенерированной целлюлозы с размером пор около 15 нм. Эта техника позволяет, в основном, удалять вирусы, которые не имеют липидной оболочки и которые не могут быть инактивированы с помощью SD-обработки.

Заполнение в условиях асептики

После нанофильтрации раствор тромбина разводят примерно до 250 единиц NIH/мл и его аликвоты распределяют по стеклянным 5-мл колбам.

Лиофилизация

Колбы, содержащие 1 мл тромбинового раствора, подвергают лиофилизации в течение 66-72 часов. Температуру постепенно увеличивают от -40 до 22±2°С со скоростью примерно 0,02°С в минуту. В этой стадии достигается остаточная влажность ниже 1%.

Сухое нагревание

После цикла лиофилизации сосуды закрывают под вакуумом притертыми пробками и герметично закрывают алюминиевыми крышками. Затем эти сосуды подвергают третьей стадии инактивации вирусов путем сухой термообработки примерно при 100°С± 1°С в течение около 1-2 часов.

Заключение

Исходя из методов, описанных в патентах США 5290918, 5395923 и 5506127, выданных Haemacure Biotech Inc., настоящее изобретение продемонстрировало, что эти методы могут быть усовершенствованы в целях увеличения выхода тромбина, имеющего высокую степень безопасности, и в целях обеспечения вирусобезопасности концентрата фибриногена без ущерба для выхода продукта.

Хотя настоящее изобретение описано выше на предпочтительных примерах его осуществления, для каждого специалиста очевидно, что в это изобретение могут быть внесены модификации, не выходящие за рамки существа изобретения. Эти модификации входят в объем настоящего изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу получения компонентов биологического клея из пула плазмы, которые все вместе дают высококачественный вирусобезопасный продукт с высоким выходом. Продукт с тройной инактивацией вирусов, не содержащий фибриноген, фибронектин и фактор XIII, получают сначала путем обработки его концентрата вирицидным раствором растворителя/детергента, затем путем нанофильтрации вирусов и, наконец, путем термообработки. Способ настоящего изобретения не влияет на выход этого высококачественного продукта. Технический результат: усовершенствован известный запатентованный способ с увеличением выхода активного тромбина примерно в два раза. 15 з.п. ф-лы, 2 ил.

Формула