Фармацевтический препарат, содержащий рекомбинантный hcg (хорионический гонадотропный гормон человека) - RU2724528C2

Чертежи

Описание

Настоящее изобретение относится к гонадотропинам для применения при лечении бесплодия. В частности, оно относится к хорионическому гонадотропному гормону человека (hCG).

Гонадотропины представляют собой группу гетеродимерных гликопротеиновых гормонов, которые регулируют функцию гонад у мужчин и женщин. Они включают фолликулостимулирующий гормон (FSH), лютеинизирующий гормон (LH) и хорионический гонадотропный гормон (CG).

Хорионический гонадотропный гормон человека (hCG) естественным образом секретируется передней долей гипофиза и функционирует для поддержки развития фолликулов и овуляции. hCG содержит альфа субъединицу из 92 аминокислот, которая также является общей для других гликопротеиновых гормонов LH и FSH, и бета субъединицу из 145 аминокислот, уникальную для hCG, которая обуславливает специфичность гормона. Каждая субъединица посттрансляционно модифицируется путем добавления сложных углеводных остатков. Альфа субъединица содержит сайты 2-N-связанного гликозилирования на аминокислотах 52 и 78, и бета субъединица содержит сайты 2-N-связанного гликозилирования на аминокислотах 13 и 30 и четыре сайта О-связанного гликозилирования на аминокислотах 121, 127, 132 и 138.

hCG, экстрагированный из мочи беременных женщин [Choragon (Ferring)], в течение многих лет используют при лечении бесплодия. Получение hCG, экстрагированного из мочи, включает сбор и переработку больших количеств мочи. Доступна рекомбинантная версия hCG, Ovitrelle (Serono). Она экспрессируется в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Известный рекомбинантый продукт hCG имеет фармакокинетический профиль, отличный от hCG, получаемого из человеческой мочи. Желательно иметь hCG продукт, который ближе воспроизводит или имитирует фармакокинетический профиль продукта, полученного из человеческой мочи.

Существует значительная гетерогенность, связанная с препаратами hCG, которая относится к различиям в количествах разных представленных изоформ. Индивидуальные изоформы hCG демонстрируют идентичные аминокислотные последовательности, но отличаются по степени, в которой они подвергаются посттрансляционной модификации; конкретные изоформы характеризуются гетерогенностью структур разветвленных углеводов и разными количествами включенной сиаловой кислоты (концевой сахар), которые оба, по-видимому, влияют на биоактивность конкретной изоформы.

Гликозилирование природного hCG является весьма сложным. Гликаны в полученном естественным путем hCG гипофиза могут содержать широкий спектр структур, которые могут включать комбинации двух-, трех- и четырехантенных гликанов. Гликаны могут нести дополнительные модификации: фукозилирование ядра, делящий надвое глюкозамин, цепи, удлиненные ацетиллактозамином, частичное или полное сиалирование, сиалирование α2,3 и α2,6 связями и сульфатированный галактозамин, замещенный галактозой. Кроме того, имеются различия между распределениями структур гликанов в индивидуальных сайтах гликозилирования.

Гликозилирование рекомбинантых продуктов hCG ("rhCG") отражает наличие ряда гликозилтрансфераз, присутствующих в линии клетки-хозяина. Существующий продукт rhCG, Ovitrelle, происходит из сконструированных клеток яичника китайского хомячка (клетки СНО). Диапазон модификаций гликана в rhCG, происходящем из СНО, более ограничен, чем диапазон модификаций, обнаруженных в природных продуктах, полученных из мочи. Примеры пониженной гетерогенности гликана, обнаруженного в rhCG, происходящем из СНО, включают отсутствие делящего надвое глюкозамина и пониженное содержание фукозилирования ядра и ацетиллактозаминовых удлинений. Кроме того, клетки СНО способны добавлять сиаловую кислоту лишь с использованием α2,3 связи (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al, 1990). Это отличает его от образующегося в природе hCG, который содержит гликаны со смесью α2,3- и α2,6-связанной сиаловой кислоты.

Было продемонстрировано, что рекомбинантный препарат FSH (Organon) отличается количеством FSH с изоэлектрической точкой (pI) ниже 4 (считаются кислыми изоформами) при сравнении с гипофизарным FSH в сыворотке или моче после менопаузы (Ulloa-Aguirre et al. 1995). Количество кислых изоформ в препаратах FSH мочи было значительно большим по сравнению с рекомбинантными продуктами, Gonal-f (Serono) и Puregon (Organon) (Andersen et al. 2004). Должно быть, это отражает более низкое молярное содержание сиаловой кислоты в rFSH, так как содержание отрицательно заряженного гликана, модифицированного сульфатом, в FSH является низким. Более низкое содержание сиаловой кислоты, по сравнению с природным FSH, является характеристикой обоих имеющихся в продаже продуктов FSH и, следовательно, вероятно отражает ограничение способа производства (Bassett and Driebergen, 2005). Время полувыведения FSH в крови было документально подтверждено для веществ из целого ряда источников. Некоторые из этих веществ фракционировали на основе общего заряда молекулы, характеризуемого их pI, у которых более кислый (pI) соответствует большему отрицательному заряду. Основной вклад в общий заряд молекулы вносит общее содержание сиаловой кислоты каждой молекулы FSH. Например, rFSH (Organon) имеет содержание сиаловой кислоты около 8 моль/моль, тогда как FSH, полученный из мочи, имеет более высокое содержание сиаловой кислоты (de Leeuw et al. 1996). Соответствующие показатели клиренса плазмы у крыс составляют 0,34 и 0,14 мл/мин (Ulloa-Aguirre et al. 2003). В другом примере, когда образец рекомбинантного FSH делили на фракции с высокой и низкой pI, эффективность фракции с высокой pI (более низкое содержание сиаловой кислоты) in vivo была пониженной, и она имела более короткий период полувыведения в плазме (D'Antonio et al. 1999). Заявители обнаружили, что, аналогично FSH, известный, полученный из СНО, рекомбинантный hCG продукт (например, Ovitrelle) также имеет меньшее количество hCG с изоэлектрической точкой (pI) меньше 4 (считаются кислыми изоформами), чем hCG мочи, также отражая меньшее содержание сиаловой кислоты известного продукта rhCG по сравнению с hCG мочи.

Общее содержание сиаловой кислоты в hCG и rhCG нельзя сравнивать непосредственно, так как сиаловые кислоты обычно связаны двумя способами. hCG из гипофиза/сыворотки/мочи содержит как α2,3, так и α2,6-связанную сиаловую кислоту, с преобладанием первой. Однако рекомбинанты, происходящие из клеток СНО, содержат только α2,3 (Kagava et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al, 1990). Другими словами, рекомбинантные белки, экспрессируемые с использованием системы СНО, будут отличаться от их природных аналогов по их типу связей концевых сиаловых кислот. Это является другим отличием между природными и современными рекомбинантными продуктами, помимо меньшего общего содержания сиаловой кислоты последних, и является важным фактором при производстве биологических агентов для фармацевтического применения, так как углеводные группировки могут содействовать фармакологическим свойствам молекулы.

Следовательно, желательно иметь продукт rhCG, который ближе воспроизводит или имитирует физико-химический и фармакокинетический профиль продукта, полученного из человеческой мочи. Желательно иметь продукт rhCG, который имеет улучшенные фармакокинетическое свойство или свойства по сравнению с известным рекомбинантным продуктом.

Согласно настоящему изобретению, предложен рекомбинантный hCG ("rhCG" или "rechCG"), включающий α2,3-сиалирование и α2,6-сиалирование и, возможно, α2,8-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) согласно изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты [выраженное в единицах отношения молей сиаловой кислоты к молям белка] 15 моль/моль или более, например, от 15 моль/моль до 25 моль/моль, например, от 17 моль/моль до 24 моль/моль, например, от 17,7 моль/моль до 23 моль/моль, например, от 18 моль/моль до 22 моль/моль, например, от 19 моль/моль до 21 моль/моль, например, от 19 моль/моль до 20 моль/моль. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,3-сиалирование может составлять 10% или более общего сиалирования. Например, от 45% до 80% общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование, например, от 50% до 70% общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование, например, от 55% до 65% общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование. Например, 65-85% общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,6-сиалирование может составлять 50% или менее общего сиалирования. Например, 20-55% общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование, например, 30-50% общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование, например, 35-45% общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование. Например, 15-35% общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,8-сиалирование может составлять 5% или менее общего сиалирования, например, от 0 до 4%, например, 0,1-4% общего сиалирования может составлять α2,8-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) по изобретению может не иметь α2,8-сиалирования.

Авторы изобретения разработали рекомбинантный hCG человеческого происхождения, который имеет более кислый профиль, чем Ovitrelle, продукт, происходящий из СНО, и который имеет более высокое содержание сиаловой кислоты. Исследование авторов изобретения указывает на то, что тип связи сиаловой кислоты, α2,3- или α2,6-, может иметь существенное влияние на биологический клиренс hCG. Линии человеческих клеток, в отличие от линий клеток СНО, могут экспрессировать рекомбинантный hCG с сиаловыми кислотами, присоединенными как α2,3-, так и α2,6-связями.

Рекомбинантный hCG со смесью и α2,3-, и α2,6-связанной сиаловой кислоты получали конструированием линии человеческих клеток для экспрессии как rhCG, так и α2,3-сиалилтрансферазы (Примеры 4, 5а и 5б). Экспрессируемый продукт является сильно кислым и несет смесь и α2,3-, и α2,6-связанных сиаловых кислот; причем последние обеспечены эндогенной сиалилтрансферазной активностью. Это имеет два преимущества над rhCG, экспрессируемым в традиционных клетках СНО: во-первых, вещество является более сиалированным из-за объединенных активностей двух сиалилтрансфераз; и, во-вторых, вещество имеет более близкое сходство с природным hCG. Это, вероятно, является биологически более подходящим по сравнению с рекомбинантными продуктами, происходящими из клеток СНО, которые продуцировали только α2,3-связанную сиаловую кислоту и имеют пониженное содержание сиаловой кислоты.

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что rhCG по изобретению может ближе воспроизводить или имитировать физико-химический и фармакокинетический профиль природного человеческого продукта из мочи, чем другие рекомбинантные продукты. Другими словами, rhCG по изобретению может быть ближе к «натуральному» hCG. Это может иметь значительные преимущества в отношении дозировки и т.д. Кроме того, более «натуральный» или более «человеческий» продукт может быть более желательным для пациента, который может нуждаться в терапии, и, несмотря на искусственность, является настолько «натуральным», насколько это возможно. У рекомбинантного продукта hCG, имеющего углевод (например, гликан), структура которого ближе к природному hCG (например, человеческому из мочи), могут быть другие преимущества (например, фармакокинетические преимущества) по сравнению с другими рекомбинантными продуктами.

Изобретение, таким образом, представляет собой рекомбинантную версию hCG, который несет смесь α2,3 и α2,6 сиаловой кислоты и, следовательно, имеет более близкое сходство с природным hCG. Ожидается, что применение данного соединения для контролируемой стимуляции яичника в методиках IVF (экстракорпоральное оплодотворение) и индукции овуляции будет приводить к более естественной стимуляции яичника по сравнению с существующими рекомбинантными продуктами.

Согласно настоящему изобретению, предложен рекомбинантный hCG ("rhCG" или "rechCG") (и/или препарат рекомбинантного hCG), включающий α2,3-сиалирование и α2,6-сиалирование. rhCG или препарат rhCG возможно может дополнительно включать α2,8-сиалирование.

Здесь термин «препарат рекомбинантного hCG» включает, например, препарат для фармацевтического применения, который включает рекомбинантный hCG. В воплощениях изобретения rhCG может присутствовать в виде одной изоформы или в виде смеси изоформ.

rhCG (или препарат rhCG) согласно изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты [выраженное в единицах отношения молей сиаловой кислоты к молям белка] 15 моль/моль или более (Пример 8), например, от 15 моль/моль до 25 моль/моль, например, от 17 моль/моль до 24 моль/моль, например, от 17,7 моль/моль до 23 моль/моль, например, от 18 моль/моль до 22 моль/моль, например, от 19 моль/моль до 21 моль/моль, например, от 19 моль/моль до 20 моль/моль. rhCG по изобретению может продуцироваться или экспрессироваться в линии клеток человека.

В rhCG (или препарате rhCG) согласно изобретению α2,3-сиалирование может составлять 10% или более от общего сиалирования. Например, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80 или 90%, или более от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) может включать α2,3-сиалирование в количестве, которое составляет от 45% до 80% от общего сиалирования, например, от 50% до 70% от общего сиалирования, например, от 55 до 65% от общего сиалирования. rhCG (или препарат rhCG) может включать α2,3-сиалирование в количестве, которое составляет от 65% до 85% от общего сиалирования, например, от 70% до 80% от общего сиалирования, например, от 71% до 79% от общего сиалирования. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,6-сиалирование может составлять 50% или менее от общего сиалирования. Например, 45, 40, 30, 20, 10, 5% или менее от общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) может включать α2,6-сиалирование в количестве, которое составляет 20-55% от общего сиалирования, например, 30-50% от общего сиалирования, например, 35-45% от общего сиалирования. rhCG (или препарат rhCG) может включать α2,6-сиалирование в количестве, которое составляет от 15 до 35% от общего сиалирования, например, от 20 до 30% от общего сиалирования, например, от 21 до 29% от общего сиалирования. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,8-сиалирование может составлять 5% или менее от общего сиалирования. Например, 2,5% или менее от общего сиалирования может составлять α2,8-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) может включать α2,8-сиалирование в количестве, которое составляет от 0 до 4% от общего сиалирования, например, от 0,1 до 4% от общего сиалирования, например, от 0,5 до 3% от общего сиалирования, например, от 0,5 до 2,5% от общего сиалирования. rhCG (или препарат rhCG) по изобретению может не иметь α2,8-сиалирования. Под сиалированием подразумевают количество сиаловых остатков, присутствующих на углеводных структурах hCG. α2,3-сиалирование означает сиалирование в 2,3 положении (как хорошо известно в данной области), и α2,6-сиалирование - в 2,6 положении (также хорошо известное в данной области). Таким образом, фраза «% от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование» относится к % от общего числа остатков сиаловой кислоты, присутствующих в hCG, которые сиалированы в 2,3 положении. Термин «% от общего сиалирования, составляющий α2,6-сиалирование» относится к % от общего числа остатков сиаловой кислоты, присутствующих в hCG, которые сиалированы в 2,6 положении.

rhCG (или препарат rhCG) согласно изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты (количество сиалирования на молекулу hCG) (на основе массы белка, а не массы белка плюс углевода) 6% или более (например от 6% до 15%, например, от 7% до 13%, например, от 8% до 12%, например, от 11% до 15%, например, от 12% до 14%) по массе.

Рекомбинантный hCG, экспрессируемый в клетках яичников китайского хомячка (СНО), включает исключительно α2,3-сиалирование.

rhCG по изобретению можно продуцировать или экспрессировать в линии клеток человека. Это может упрощать (и делать более эффективным) способ получения, так как манипулирование и контроль, например, за ростовой средой клеток для сохранения сиалирования могут быть менее критичными, чем в случае с известными способами. Данный способ также может быть более эффективным, так как образуется меньше основного rhCG, чем при получении известных rhCG продуктов; образуется больше кислотного rhCG, и разделение/удаление основного hCG является менее трудоемким. rhCG можно продуцировать или экспрессировать в линии клеток Per.С6, линии клеток, происходящей от Per.С6, или в модифицированной линии клеток Per.С6. Линия клеток может быть модифицирована с использованием α2,3-сиалилтрансферазы. rhCG может включать α2,6-связанные сиаловые кислоты (α2,6-сиалирование), обеспеченные эндогенной сиалилтрансферазной активностью [линии клеток]. Альтернативно или дополнительно, линия клеток может быть модифицирована с использованием α2,6-сиалилтрансферазы.

rhCG можно продуцировать с использованием α2,3-сиалилтрансферазы. rhCG может включать α2,6-связанные сиаловые кислоты (α2,6-сиалирование), обеспеченные эндогенной сиалилтрансферазной активностью. rhCG можно продуцировать с использованием α2,3- и/или α2,6-сиалилтрансферазы.

Согласно настоящему изобретению, в другом аспекте предложен способ получения rhCG и/или препарата rhCG, как здесь описано (согласно аспектам изобретения), включающий стадию продуцирования или экспрессии rhCG в линии клеток человека, например, в линии клеток Per.С6, линии клеток, происходящей от Per.С6, или в модифицированной линии клеток Per.С6, например, линии клеток, которая была модифицирована с использованием α2,3-сиалилтрансферазы.

Структура rhCG содержит гликановые группировки. Разветвление может приводить к тому, что гликан может иметь 1, 2, 3, 4 или более концевых остатков Сахаров или «антенн», как хорошо известно в данной области. rhCG по изобретению может иметь гликаны с присутствием сиалирования на одноантенных и/или двухантенных, и/или трехантенных, и/или четырехантенных структурах. rhCG может включать моносиалированные, дисиалированные, трисиалированные и тетрасиалированные гликановые структуры, например, со следующими относительными количествами: 0,1-4%-моносиалированные; 35-45%-дисиалированные; 0,5-8%-трисиалированные и 0-1% тетрасиалированные (например, как показано анализом WAX заряженных гликанов, как изложено в Примере 8Г). Предпочтительно рекомбинантный hCG по изобретению включает моно(1S), три(2S), три(3S) и тетра(4S) сиалированные структуры. Предпочтительно относительные количества сиалированных структур находятся в следующих соотношениях (1S:2S:3S:4S): 0,2-1%: 35-40%: 2,5-7%: 0,5-1% (например, как показано анализом WAX заряженных гликанов, как изложено в Примере 8Г).

Согласно настоящему изобретению, в другом аспекте предложен rhCG, полученный (например, экспрессированный) в линии клеток человека. rhCG может включать α2,3- и α2,6-сиалирование. rhCG может продуцироваться или экспрессироваться в линии клеток Per.С6, линии клеток, происходящей от Per.С6, или в модифицированной линии клеток Per.С6. Линия клеток может быть модифицирована с использованием α2,3-сиалилтрансферазы. rhCG может включать α2,6-связанные сиаловые кислоты (α2,6-сиалирование), обеспеченные эндогенной сиалилтрансферазной активностью [линии клеток]. Альтернативно или дополнительно, линия клеток может быть модифицирована с использованием α2,6-сиалилтрансферазы. rhCG (или препарат rhCG) согласно изобретению может иметь содержание сиаловой кислоты [выраженное в единицах отношения молей сиаловой кислоты к молям белка] 15 моль/моль или больше, например, от 15 моль/моль до 25 моль/моль, например, от 17 моль/моль до 24 моль/моль, например, от 17,7 моль/моль до 23 моль/моль, например, от 18 моль/моль до 22 моль/моль, например, от 19 моль/моль до 21 моль/моль, например, от 19 моль/моль до 20 моль/моль. В rhCG (или препарате rhCG) α2,3-сиалирование может составлять 10% или более от общего сиалирования, например, от 45% до 80% от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование, например, от 50% до 70% от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование, например, от 55 до 65% от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование. Например, 65-85% от общего сиалирования может составлять α2,3-сиалирование. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,6-сиалирование может составлять 50% или менее от общего сиалирования. Например, 20-55% от общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование, например, 30-50% от общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование, например, 35-45% от общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование. Например, 15-35% от общего сиалирования может составлять α2,6-сиалирование. В rhCG (или препарате rhCG) по изобретению α2,8-сиалирование может составлять 5% или менее от общего сиалирования, например, от 0 до 4%, например, от 0,5 до 4% от общего сиалирования может составлять α2,8-сиалирование. rhCG (или препарат rhCG) по изобретению может не иметь α2,8-сиалирования.

Согласно настоящему изобретению в дополнительном аспекте предложена фармацевтическая композиция, содержащая rhCG, включающий α2,3-сиалирование и α2,6-сиалирование (например, как изложено выше). Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать FSH и/или LH.

FSH может быть получен любыми способами, известными в данной области. FSH в том виде, в котором он здесь используется, включает FSH человеческого происхождения или рекомбинантный FSH. FSH человеческого происхождения может быть очищен из любого подходящего источника (например, мочи) любым способом, известным в данной области. FSH может быть рекомбинантным FSH, например, экспрессируемым в линии клеток человека. Способы проведения экспрессии и очистки рекомбинатного FSH хорошо известны в данной области.

LH может быть получен любыми способами, известными в данной области. LH в том виде, в котором он здесь используется, включает LH человеческого происхождения и рекомбинантный LH. LH человеческого происхождения может быть очищен из любого подходящего источника (например, мочи) любым способом, известным в данной области. Способы проведения экспрессии и очистки рекомбинатного LH хорошо известны в данной области.

Фармацевтическая композиция может служить для лечения бесплодия, например, для применения, например, во вспомогательных репродуктивных технологиях (ART), индукции овуляции или внутриматочной инсеминации (IUI). Фармацевтическую композицию можно использовать, например, при медицинских показаниях, когда используют известные препараты hCG. Согласно настоящему изобретению также предложено применение rhCG и/или описанного здесь препарата rhCG (согласно аспектам изобретения) для изготовления или в изготовлении лекарственного средства для лечения бесплодия. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно готовить в виде препарата хорошо известных композиций для любого пути введения лекарственного средства, например, перорального, ректального, парентерального, чрескожного (например, технология пластыря), внутривенного, внутримышечного, подкожного, внутрицистернального (intrasusternal), внутривагинального, внутрибрюшинного, местного (порошки, мази или капли) или в виде буккального или назального спрея. Типичная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель, такой как водный раствор, нетоксичные эксципиенты, включая соли и консерванты, буферы и тому подобное, как описано, среди прочих, в Remington's Pharmaceutical Sciences, пятнадцатое издание (Matt Publishing Company, 1975) на страницах 1405-1423 и 1461-87 и в Национальном формуляре XIV, четырнадцатое издание (Американская фармацевтическая ассоциация, 1975).

Примеры подходящих водных и неводных фармацевтических носителей, разбавителей, растворителей или наполнителей включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и тому подобное), карбоксиметилцеллюлозу и их подходящие смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат.

Композиции по настоящему изобретению также могут содержать добавки, такие как, но не ограничивающиеся, консерванты, увлажнители, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Для предупреждения роста микробов можно включать антибактериальные и противогрибковые агенты, и они включают, например, парабен, хлорбутанол, фенол, сорбиновую кислоту и тому подобное. Кроме того, может быть желательным включение изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и тому подобное.

В некоторых случаях желательно осуществлять пролонгированное действие для замедления поглощения hCG (и других активных ингредиентов, в случае их присутствия) из подкожной или внутримышечной инъекции. Это можно осуществить путем использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного вещества с плохой растворимостью в воде. Скорость поглощения hCG тогда зависит от его скорости растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристаллов и кристаллической формы. В качестве альтернативы, отложенное поглощение комбинированной формы hCG, введенной парентерально, осуществляется растворением или суспендированием комбинации hCG в масляном носителе.

Формы в виде инъецируемого депо могут быть получены путем образования микроинкапсулирующих матриц hCG (и других агентов, если они присутствуют) в биодеградируемых полимерах, таких как полилактид-полигликолид. Скорость высвобождения hCG можно контролировать, в зависимости от отношения hCG к полимеру и природы конкретного используемого полимера. Примеры других биодеградируемых полимеров включают поливинилпирролидон, поли(ортоэфиры), поли(ангидриды) и т.д. Инъецируемые композиции в виде депо также получают путем заключения hCG в липосомы или микроэмульсии, которые являются совместимыми с тканями организма.

Инъецируемые композиции можно стерилизовать, например, путем фильтрования через фильтр, задерживающий бактерии, или путем включения стерилизующих агентов в форме стерильных твердых композиций, которые можно растворять или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной инъецируемой среде непосредственно перед применением. Инъецируемые композиции можно поставлять в любом подходящем контейнере, например, сосуде, предварительно заполненном шприце, картриджах для инъекции и тому подобном.

Инъецируемые композиции можно поставлять в виде продукта, имеющего фармацевтические композиции, содержащие hCG (возможно с FSH, LH и т.д.). Если имеется более чем один активный ингредиент (т.е. hCG или, например, FSH или LH), они могут быть подходящими для введения раздельно или совместно. При введении раздельно, введение может быть последовательным. Продукт можно поставлять в любой подходящей упаковке. Например, продукт может содержать много предварительно заполненных шприцев, содержащих любой из hCG, FSH или комбинацию и FSH, и hCG, шприцы, упакованные в блистерную упаковку, или другие средства для поддержания стерильности. Продукт возможно может содержать инструкции для применения композиций hCG и FSH.

рН и точную концентрацию разных компонентов фармацевтической композиции регулируют согласно традиционной практике в данной области. Смотри GOODMAN and GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7^th ed. В предпочтительном воплощении композиции по изобретению поставляют в виде композиций для парентерального введения. Общие способы получения парентеральных композиций известны в данной области и описаны в REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, приведенной выше, на страницах 780-820. Парентеральные композиции можно поставлять в жидких композициях или в виде твердого вещества, которое будет смешиваться со стерильной инъецируемой средой непосредственно перед введением. В особенно предпочтительном воплощении парентеральные композиции поставляются в стандартной лекарственной форме для легкости введения и однородности дозировки.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение теперь будет описано более подробно со ссылкой на следующие Примеры и приложенные графические материалы.

Краткое описании графических материалов

На Фиг. 1 показана карта плазмиды экспрессионного вектора рhСGальфа/бета;

На Фиг. 2 показан экспрессионный вектор для α2,3-сиалилтрансферазы (ST3GAL4);

На Фиг. 3 показан экспрессионный вектор для α2,6-сиалилтрансферазы (ST6GAL1);

На Фиг. 4 показана детекция изоформ rhCG в линии клеток человека, полученных из препаратов рекомбинантного hCG согласно изобретению (дорожка 3, 4), посредством IEF (изоэлектрофокусировка), окрашенных кумасси синим, по сравнению с препаратами предшествующего уровня техники (дорожка 1, 2);

На Фиг. 5 показаны скорости метаболического клиренса (MCR) образцов hCG в Per.С6, сконструированных с α2,3-сиалилтрансферазой; и

На Фиг. 6 показаны долговременные MCR образцов rhCG в Per.С6, сконструированных с α2,3-сиалилтрансферазой.

Выбор последовательности

Человеческий hCG

Использовали кодирующую область гена альфа полипептида hCG согласно Fiddes and Goodman (1979). Последовательность внесена в банк данных как АН007338, и во время конструирования отсутствовали другие варианты данной последовательности белка. Данная последовательность называется здесь SEQ ID NO: 1.

Использовали кодирующую область гена бета полипептида hCG согласно Fiddes and Goodman (1980). Последовательность внесена в банк данных как NP_000728 и согласуется с последовательностями белка CGbeta3, CGbeta5 и CGbeta7. Данная последовательность именуется здесь SEQ ID NO: 2.

Сиалилтрансфераза

α2,3-Сиалилтрансфераза - кодирующую область гена бета-галактозид альфа-2,3-сиалилтрансферазы 4 (α2,3-сиалилтрансфераза, ST3GAL4) использовали согласно Kitagawa and Paulson (1994). Последовательность внесена в банк данных как L23767 и называется здесь как SEQ ID NO: 3.

α2,6-Сиалилтрансфераза - кодирующую область гена бета-галактозамид альфа-2,6-сиалилтрансферазы 1 (α2,6-сиалилтрансфераза, ST6GAL1) использовали согласно Grundmann et al. (1990). Последовательность внесена в банк данных как NM_003032 и называется здесь как SEQ ID NO: 4.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Конструирование вектора, экспрессирующего hCG

Кодирующую последовательность альфа полипептида hCG (АН007338, SEQ ID NO: 1) и бета полипептида hCG (NP_000728, SEQ ID NO: 2) амплифицировали ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием комбинаций праймеров CGa-fw и CGa-rev и CGb-fw и CGb-rev, соответственно.

Образующуюся амплифицированную ДНК hCG бета расщепляли рестрикционными ферментами AscI и HpaI и вставляли в сайты AscI и HpaI на экспрессионном векторе млекопитающих под управлением CMV (цитомегаловирус), несущем неомициновый селективный маркер. Аналогично ДНК hCG альфа расщепляли BamHI и NheI и вставляли в сайты BamHI и NheI на экспрессионном векторе, уже содержащем ДНК полипептида hCG бета.

ДНК вектора использовали для трансформации штамма DH5α E.coli. Колонии отбирали для амплификации, и из числа колоний, которые включали вектор, содержащий и hCG альфа, и бета, отбирали двадцать для секвенирования. Все колонии, отобранные для секвенирования, содержали правильные последовательности согласно SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Плазмиду phCG A+B отбирали для трансфекции (Фиг. 1).

Пример 2. Конструирование экспрессионного вектора ST3

Кодирующую последовательность бета-галактозид альфа-2,3-сиалилтрансферазы 4 (ST3, L23767, SEQ ID NO: 3) амплифицировали посредством ПЦР с использованием комбинации праймеров 2,3STfw и 2,3STrev.

Образующуюся амплифицированную ДНК ST3 расщепляли рестрикционными ферментами BamHI и AflII и вставляли в сайты BamHI и AflII на экспрессионном векторе млекопитающих под управлением CMV, несущем маркер устойчивости к гигромицину. Вектор амплифицировали, как описано ранее, и секвенировали. Клон pST3#1 (Фиг. 2) содержал правильную последовательность согласно SEQ ID NO: 3, и был выбран для трансфекции.

Пример 3. Конструирование экспрессионного вектора ST6

Кодирующую последовательность бета-галактозамид альфа-2,6-сиалилтрансферазы 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID NO: 4) амплифицировали посредством ПЦР с использованием комбинации праймеров 2,6STfw и 2,6STrev.

Образующуюся амплифицированную ДНК ST6 расщепляли рестрикционными ферментами BamHI и AflII и вставляли в сайты BamHI и AflII на экспрессионном векторе млекопитающих под управлением CMV, несущем маркер устойчивости к гигромицину. Вектор амплифицировали, как описано ранее, и секвенировали. Клон pST6#11 (Фиг. 3) содержал правильную последовательность согласно SEQ ID NO: 4 и был выбран для трансфекции.

Пример 4. Стабильная экспрессия phCG А+В в клетках PER.С6. Трансфекция, выделение и скрининг клонов

Клоны Per.С6, продуцирующие hCG, генерировали экспрессией обеих полипептидных цепей hCG из одной плазмиды (смотри Пример 1).

Для получения стабильных клонов использовали трансфекционный агент на основе липосом с конструкцией phCG А+В. Стабильные клоны отбирали в селективной среде Per.С6, дополненной 10% FCS (фетальная телячья сыворотка) и содержащей G418. Через три недели после трансфекции вырастали клоны, устойчивые к G418. Всего для выделения отбирали 389 клонов. Выделенные клоны культивировали в селективной среде до 70-80%-ной конфлюентности. Супернатанты анализировали на содержание белка hCG с использованием ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), селективного в отношении hCG, и фармакологической активности на рецепторе hCG в клонированной линии клеток, используя анализ накопления сАМР (циклический аденозинмонофосфат). С клонами (118), экспрессирующими функциональный белок, работали далее для увеличения объема культуры до 24 лунок, 6 лунок и колб Т80.

Исследования для определения продуктивности и качества материала из 47 клонов инициировали в колбах Т80 с генерацией достаточного количества материала. Клетки культивировали в дополненной среде, как описано ранее, в течение 7 суток и отбирали супернатант. Продуктивность определяли с использованием ELISA, селективного в отношении hCG. Определяли изоэлектрический профиль материала (с использованием способа, описанного в Примере 6). Информацию из IEF использовали для отбора клонов для анализа скорости метаболического клиренса. Клоны с достаточной продуктивностью и качеством отбирали для конструирования сиалилтрансферазы.

Пример 5а. Уровень сиалирования увеличивается в клетках, которые сверхэкспрессируют α2,3-сиалилтрансферазу. Стабильная экспрессия pST3 в клетках PER.C6, экспрессирующих hCG; Трансфекция, выделение и скрининг клонов

Клоны Per.С6, продуцирующие сильно сиалированный hCG, генерировали путем экспрессии α2,3-сиалилтрансферазы из отдельных плазмид (смотри Пример 2) в клетках Per.С6, уже экспрессирующих обе полипептидные цепи hCG (смотри Пример 4). Клоны, продуцированные из клеток PER.C6®, как изложено в Примере 4, отбирали на их характеристики, включающие продуктивность, хороший профиль роста, продукцию функционального белка и продуцированный hCG, который включал некоторый уровень сиалирования.

Стабильные клоны генерировали, как описано ранее в Примере 4. Клоны, кодирующие α2,3-сиалилтрансферазу, выделяли, наращивали и анализировали. Конечное число клонов для исследования α2,3- составляло пять. Клоны с α2,3-сиалилтрансферазой адаптировали к бессывороточной среде и условиям суспензии.

Как и ранее, клоны анализировали с использованием ELISA, селективного в отношении hCG, функционального ответа в линии клеток с рецептором hCG, IEF (Пример 6). Их также анализировали на метаболическую скорость клиренса (Пример 9) и в биопробе на hCG USP (Фармакопея Соединенных Штатов Америки) (Пример 10). Результаты сравнивали с имеющимся в продаже рекомбинантным hCG (Ovitrelle, Serono) и с родительскими линиями клеток hCG Per.С6. Репрезентативные образцы показаны в Примерах и на Фигурах.

В заключение необходимо отметить, что экспрессия hCG совместно с α2,3-сиалилтрансферазой в клетках Per.С6 приводит к повышенным уровням сиалированного hCG по сравнению с клетками, экспрессирующими только hCG.

Пример 5б. Стабильная экспрессия pST3 в клетках PER.C6, экспрессирующих hCG - другой способ

Полученный выше альфа бета гетеродимер (Пример 4) имел низкий уровень сиалирования, приводящий к очень основному профилю IEF. Как показано выше (Пример 5а), экспрессия hCG совместно с α2,3-сиалилтрансферазой в клетках Per.С6 приводит к повышенным уровням сиалированного hCG по сравнению с клетками, экспрессирующими только hCG.

Проводили двойную трансфекцию генов альфа и бета субъединицы hCG совместно с геном фермента α2,3-сиалилтрансферазы в клетки Per.С6 в формате суспензионной культуры клеток. Линии клеток генерировали сотрансфекцией вектора hCG (двойной альфа/бета, Пример 1) и вектора, кодирующего α2,3-сиалилтрансферазу (Пример 2) при бессывороточных условиях. Клоны, полученные из клеток PER.C6®, отбирали на их характеристики, включающие продуктивность, хороший профиль роста, продукцию функционального белка и продуцированный hCG, который включал некоторый уровень сиалирования. Клоны выделяли, наращивали и анализировали.

Как и ранее клоны анализировали с использованием ELISA, селективного в отношении hCG, функционального ответа в линии клеток с рецептором hCG, IEF (Пример 6). Их также анализировали на скорость метаболического клиренса (Пример 9) и в биопробе на hCG USP (Пример 10). Результаты сравнивали с имеющимся в продаже рекомбинантным hCG (Ovitrelle, Serono) и родительскими линиями клеток hCG Per.С6. Репрезентативные образцы показаны в Примерах и на Фигурах (смотри Примеры 6, 9, 10, Фиг. 4 и 5). Рекомбинантный hCG, продуцированный клонами (то есть, рекомбинантный hCG согласно изобретению), имеет значительно улучшенное сиалирование (т.е. в среднем больше изоформ hCG с большим числом сиаловых кислот) по сравнению с hCG, экспрессируемым без α2,3-сиалилтрансферазы, и Ovitrelle (смотри Примеры 6 и 8, Фиг. 4).

Пример 6. Анализ изоэлектрической точки, pI, изоформ hCG, продуцированных Per.С6, посредством изоэлектрофокусировки

Электрофорез определяют как транспорт заряженных молекул через растворитель посредством электрического поля. Подвижность биологической молекулы в электрическом поле будет зависеть от силы поля, суммарного заряда на молекуле, размера и формы молекулы, ионной силы и свойств среды, через которую мигрируют молекулы.

Изоэлектрофокусировка (IEF) представляет собой электрофоретическую методику для разделения белков на основе их pI. pI представляет собой рН, при котором белок не имеет суммарного заряда и не будет мигрировать в электрическом поле. Содержание сиаловых кислот изоформ hCG слегка изменяет pI каждой изоформы, что можно использовать при применении данной методики для визуализации изоформ hCG Per.С6 из каждого клона.

Изоэлектрические точки изоформ hCG, продуцированных Per.С6, в супернатантах культуры клеток анализировали с использованием изоэлектрофокусировки. Среды культуры клеток из клонов hCG Per.С6 получали, как описано в Примере 4, 5а и 5б.

Образцы hCG Per.С6 разделяли на IEF гелях Novex®, содержащих 5% полиакриламида, при нативных условиях на градиенте рН 3,0-7,0 в растворе амфолитов с рН 3,0-7,0. Белки визуализировали с использованием окрашивания кумасси синим, используя способы, хорошо известные в данной области.

На Фиг. 4 показана детекция изоформ rhCG посредством IEF с окрашиванием кумасси синим в композициях согласно изобретению (Дорожка 3-10 мкг и Дорожка 4-15 мкг) и композиции, происходящей из СНО, предшествующего уровня техники, Ovitrelle (Дорожка 1 - Ovitrelle, 10 мкг, и Дорожка 2 - Ovitrelle, 15 мкг). Полосы представляют собой изоформы hCG, содержащие разное число молекул сиаловой кислоты. С использованием данного способа были идентифицированы клоны, продуцирующие изоформы hCG с большим числом молекул сиаловой кислоты. На Фиг. 4 показано, что рекомбинантные hCG, происходящие из линии клеток человека, сконструированной с α2,3-сиалилтрансферазой (композиции согласно изобретению), имеют более кислый профиль, чем Ovitrelle.

Пример 7. Анализ связей сиаловой кислоты hCG Per.С6

Гликоконъюгаты анализировали с использованием способа различения гликанов на основе лектинов. Данным способом можно охарактеризовать гликопротеины и гликоконъюгаты, связанные с нитроцеллюлозой. Пектины селективно распознают конкретную группировку, например, α2,3-связанную сиаловую кислоту. Используемые лектины конъюгированы со стероидным гаптеном дигоксигенином, который делает возможной иммунологическую детекцию связанных лектинов.

Очищенный hCG Per.С6 из родительского клона (без дополнительной сиалилтрансферазы) и клона, сконструированного с α2,3-сиалилтрансферазой, разделяли с использованием стандартных методик SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Имеющийся в продаже рекомбинантный hCG (Ovitrelle, Serono) использовали в качестве стандарта.

Сиаловую кислоту анализировали с использованием набора для различения гликанов DIG (Кат. №11 210238001, Roche) согласно инструкциям производителей. Позитивные реакции с агглютинином Sambucus nigra (SNA) показали присутствие связанной (2-6) на конце сиаловой кислоты. Позитивные реакции с агглютинином II Maackia amurensis (МАА) показали присутствие связанной (α2-3) на конце сиаловой кислоты.

В заключение, родительский клон содержал низкие уровни как α2,3-, так и α2,6-сиаловой кислоты. Клоны, сконструированные с α2,3-сиалилтрансферазой, содержали высокие уровни α2,3-связей сиаловой кислоты и низкие уровни α2,6-связей сиаловой кислоты. Стандартный контроль, Ovitrelle, содержит только α2,3-связи сиаловой кислоты. Это согласуется с тем, что известно о рекомбинантных белках, продуцируемых клетками яичника китайского хомячка (СНО) (Kagawa et al, 1988, Takeuchi et al, 1988, Svensson et al., 1990).

В заключение, сконструированные клетки Per.С6 hCG с α2,3-сиалилтрансферазой успешно увеличивали в образце число молекул сиаловой кислоты, конъюгированных с рекомбинантным hCG.

Примеры 8А и 8Б. Количественное измерение общего содержания сиаловой кислоты

Сиаловая кислота представляет собой связанный с белком углевод, считающийся моносахаридом, и встречается в комбинации с другими моносахаридами, подобными галактозе, маннозе, глюкозамину, галактозамину и фукозе. Общее содержание сиаловой кислоты на очищенном rhCG согласно изобретению измеряли с использованием способа на основе способа Stanton et al. (J. Biochem. Biophys. Methods. 30 (1995), 37-48).

Пример 8A

Измеряли общее содержание сиаловой кислоты рекомбинантного hCG из Per.С6, модифицированных α2,3-сиалилтрансферазой (например, Пример 5а, Пример 5б), и обнаружили, что оно больше, чем 15 моль/моль [выражено в показателях отношения молей сиаловой кислоты к молям белка], например, больше, чем 18 моль/моль, например, 19,1 моль/моль. Это можно сравнить с Ovitrelle, который имеет общее содержание сиаловой кислоты 17,6 моль/моль.

Пример 8Б

Измеряли общее содержание сиаловой кислоты рекомбинантного hCG из Per.С6, модифицированных α2,3-сиалилтрансферазой, 080019-19 (получены способами из Примера 56, приведенного выше), и обнаружили, что оно составляет 20 моль/моль [выражено в показателях отношения молей сиаловой кислоты к молям белка]. Вновь это может быть благоприятным по сравнению с Ovitrelle, который имеет общее содержание сиаловой кислоты 17,6 моль/моль. Данный Пример (080019-19) протестировали для количественного измерения относительных количеств α2,3- и α2,6-сиаловой кислоты (Пример 8В).

Пример 8В. Количественное измерение относительных количеств α2,3 и α2,6 сиаловой кислоты

Относительные процентные количества α2,3- и α2,6-сиаловой кислоты на очищенном rhCG [Пример (080019-19) и два других Примера, полученных способами из Примера 5] измеряли с использованием известных методик - HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) с нормальной фазой (NP).

Для количественного измерения альфа 2,3- и 2,6-сиаловой кислоты в О-связанных гликанах проводили следующий анализ. О-связанные гликаны отщепляли от образца hCG с использованием набора для высвобождения гликанов Orela и разделяли на NP-HPLC. Образцы экстрагированных, объединенных гликанов (экстрагированных как описано выше) расщепляли разными сиалидазами для определения связей. Эту ферментативную деградацию гликанов проводили с использованием альфа 2-3,6,8-сиалидазы и альфа 2-3-сиалидазы. Ферментативно расщепленные гликаны затем повторно разделяли на колонке NP, и О-гликаны идентифицировали на NP-HPLC с использованием полученных стандартов. Относительные процентные содержания рассчитаны и показаны в следующей таблице (SA=сиаловая кислота).

Обнаружили, что относительные процентные содержания находятся в интервалах 55%-65% (например, 59%) для α2,3-сиалирования; и от 35 до 45% (например, 41%) для α2,6-сиалирования.

Пример 8Г. Количественное измерение относительных количеств одно-, двух-, трех- и четырехантенных сиалированных структур

Относительные процентные количества одно-, двух-, трех- и четырех(антенных) сиалированных структур на гликанах, экстрагированных из очищенного rhCG (три образца, использованных в Примере 8В), измеряли с использованием известных методик.

Каждый образец rhCG иммобилизовали (блокировали в геле), промывали, восстанавливали, алкилировали и расщепляли РNGазой F в течение ночи. Затем экстрагировали и подвергали обработке N-гликаны. N-гликаны для анализа NP-HPLC и WAX-HPLC метили флуорофором 2АВ, как подробно описано в Royle et al.

HPLC со слабым анионным обменом (WAX) для разделения N-гликанов по заряду (Пример 8В) проводили, как изложено у Royle et al, со стандартом N-гликаном фетуина в качестве контроля. Гликаны элюировали согласно числу сиаловых кислот, которое они содержали. Все образцы включали моно(1S), ди(2S), три(3S) и тетра(4S) сиалированные структуры. Обнаружили, что относительные количества сиалированных структур находятся в следующих соотношениях (1S:2S:4S:4S): 0,1-4%: 35-45%: 0,5-8%: 0-1%.

Предпочтительный пример, 080019-19, включал моно(1S), ди(2S), три(3S) и тетра(4S) сиалированные структуры. Относительные количества сиалированных структур находились в следующих соотношениях (1S:2S:4S:4S): 0,1-4%:35-45%:0,5-8%:0-1%.

Пример 9. Определение скоростей метаболического клиренса rhCG

Для определения скорости метаболического клиренса (MCR) образцов hCG из Per.С6, сконструированных с использованием α2,3-сиалилтрансферазы (например, Пример 5а, 5б), самкам крыс в сознательном состоянии (3 животных на клон) инъецировали болюс rhCG (1-10 мкг/крысу, на основе количественного измерения образцов посредством ELISA, DRG EIA 1288) в хвостовую вену в момент времени ноль. Образцы крови (400 мкл) отбирали из кончика хвоста через 1, 2, 4, 8, 12, 24 и 32 часа после инъекции тестируемого образца. Сыворотку собирали центрифугированием и анализировали на содержание hCG посредством ELISA (DRG EIA 1288). MCR образцов hCG из Per.С6, сконструированных с использованием α2,3-сиалилтрансферазы, показала, что период полувыведения был аналогичным стандарту (Фиг. 5). На Фиг. 6 показано, что другие образцы hCG, сконструированные с использованием α2,3-сиалилтрансферазы, могут иметь улучшенный период полувыведения по сравнению со стандартом (Фиг. 6).

Пример 10. Биопроба на hCG согласно USP (Фармакопея США)

Проводили биопробу на hCG для анализа удельной активности hCG. Активность измеряли согласно USP (USP Monographs: Chorionic Gonadotropin, USPC Official 8/1/09-11/30/09), используя Ovitrelle в качестве стандарта. Ovitrelle имеет биологическую активность 26000 IU/мг (Curr Med Res Opin. 2005 Dec; 21(12): 1969-76). Пороговое значение принятия составляло >21000 IU hCG/мг. Биологическая активность для образца рекомбинантного hCG, происходящего из линии клеток человека, сконструированной с α2,3-сиалилтрансферазой (имеющего содержание сиаловой кислоты 19,1 моль/моль, смотри Пример 8) составляла 27477 IU hCG/мг.

Пример 11. Обзор получения и очистки

Была разработана методика для получения рекомбинантного hCG в клетках PER.C6, которые культивировали в суспензии в бессывороточной среде. Методика описана ниже, и ее применяли для нескольких линий клеток PER.C6, продуцирующих hCG.

Рекомбинантный hCG из клона α2,3- получали с использованием модификации способа, описанного Lowry et al. (1976).

Для получения PER.C6-hCG линии клеток адаптировали к бессывороточной среде, т.е. Excell 525 (JRH Biosciences). Клетки сначала культивировали с получением 70%-90% конфлюентного монослоя в культуральной колбе Т80. При пассировании клетки ресуспендировали в бессывороточной среде, Excell 525+4 мМ L-глутамин, до плотности клеток 0,3×10⁶ клеток/мл. 25 мл суспензии клеток помещали в 250 мл колбу шейкера и встряхивали при 100 об./мин при 37°С при 5% СО₂. После достижения плотности клеток более 1×10⁶ клеток/мл, клетки субкультивировали до плотности клеток 0,2 или 0,3×10⁶ клеток/мл и в дальнейшем культивировали в колбах шейкера при 37°С, 5% CO₂ и 100 об./мин.

Для получения hCG, клетки переносили в бессывороточную среду для продукции, т.е. VPRO (JRH Biosciences), которая поддерживает рост клеток PER.C6 до очень высоких плотностей клеток (обычно более 10⁷ клеток/мл в периодической культуре). Клетки сперва культивировали до плотности более 1×10⁶ клеток/мл в Excell 525, затем осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об./мин и затем суспендировали в среде VPRO+6 мМ L-глутамин до плотности 1×10⁶ клеток/мл. Клетки затем культивировали в колбе шейкера в течение 7-10 суток при 37°С, 5% СО₂ и 100 об./мин. На протяжении этого периода клетки вырастали до плотности >10⁷ клеток/мл. Культуральную среду собирали после того, как начинала снижаться жизнеспособность клеток. Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 1000 об./мин, и супернатант использовали для количественного измерения и очистки hCG. Концентрацию hCG определяли с использованием ELISA (DRG EIA 1288).

Затем проводили очистку hCG, используя модификацию способа, описанного Lowry et al. (1976). Этого достигали хроматографией на DEAE (диэтиламиноэтил) целлюлозе, гель-фильтрацией на Sephadex G100, адсорбционной хроматографией на гидроксиапатите и препаративным электрофорезом в полиакриламидном геле.

В течение всех хроматографических процедур присутствие иммунореактивного рекомбинантного hCG подтверждали RIA (радиоиммуноанализ) (DRG EIA 1288) и IEF (Пример 6).

ССЫЛКИ

Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotropin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online. 9(2), 231-236.

Bassett RM, and Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177.

D'Antonio M., Borrelli F., Datola A., Bucci R., Mascia M., Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167

Fiddes, J.C. and Goodman, H.M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356.

Fiddes, J.C. and Goodman, H.M. (1980) The cDNA for the beta-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3'-untranslated region. Nature, 286, 684-387.

Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem. 263(33), 17508-17515.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), 265-75.

Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones. Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol). 7, 16-21.

Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA and Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144.

Steelman SL, and Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 53(6), 604-616.

Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JO (1990) Organization of the beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem. 265(34):20863-20868.

Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem. 263(8), 3657-3663.

Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (1995). Follicle-stimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev. 16(6), 765-787.

Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod. 69(2), 379-389.

SEQ ID NO: 1

Полипептид альфа хорионического гонадотропина человека

Номер доступа АН007338

Нуклеотидная последовательность hCG альфа

Последовательность белка hCG альфа

Полипептид бета хорионического гонадотропина человека

Номер доступа NP_000728

Нуклеотидная последовательность hCG бета

Нуклеотидная последовательность

Последовательность белка hCG бета

Бета-галактозид альфа-2,3-сиалилтрансфераза 4

Номер доступа L23767

Нуклеотидная последовательность ST3GAL4

Последовательность белка ST3GAL4

Бета-галактозамид альфа-2,6-сиалилтрансфераза 1

Номер доступа NM_003032

Нуклеотидная последовательность ST6GAL1

Последовательность белка ST6GAL1

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ферринг Б.В.

<120> Фарамацевтический препарат, содержащий рекомбинантный hCG

<130> P/60201.WO01

<150> EP 09252360.4

<151> 2009-10-05

<160> 16

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 351

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID 1 Нуклеотидная последовательность hCG альфа

<400> 1

atggattact acagaaaata tgcagctatc tttctggtca cattgtcggt gtttctgcat 60

gttctccatt ccgctcctga tgtgcaggat tgcccagaat gcacgctaca ggaaaaccca 120

ttcttctccc agccgggtgc cccaatactt cagtgcatgg gctgctgctt ctctagagca 180

tatcccactc cactaaggtc caagaagacg atgttggtcc aaaagaacgt cacctcagag 240

tccacttgct gtgtagctaa atcatataac agggtcacag taatgggggg tttcaaagtg 300

gagaaccaca cggcgtgcca ctgcagtact tgttattatc acaaatctta a 351

<210> 2

<211> 498

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID 2 Нуклеотидная последовательность hCG бета

<400> 2

atggagatgt tccaggggct gctgctgttg ctgctgctga gcatgggcgg gacatgggca 60

tccaaggagc cgcttcggcc acggtgccgc cccatcaatg ccaccctggc tgtggagaag 120

gagggctgcc ccgtgtgcat caccgtcaac accaccatct gtgccggcta ctgccccacc 180

atgacccgcg tgctgcaggg ggtcctgccg gccctgcctc aggtggtgtg caactaccgc 240

gatgtgcgct tcgagtccat ccggctccct ggctgcccgc gcggcgtgaa ccccgtggtc 300

tcctacgccg tggctctcag ctgtcaatgt gcactctgcc gccgcagcac cactgactgc 360

gggggtccca aggaccaccc cttgacctgt gatgaccccc gcttccagga ctcctcttcc 420

tcaaaggccc ctccccccag ccttccaagt ccatcccgac tcccggggcc ctcggacacc 480

ccgatcctcc cacaataa 498

<210> 3

<211> 999

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID 3 Нуклеотидная последовательность ST3GAL4

<400> 3

atgtgtcctg caggctggaa gctcctggcc atgttggctc tggtcctggt cgtcatggtg 60

tggtattcca tctcccggga agacaggtac atcgagcttt tttattttcc catcccagag 120

aagaaggagc cgtgcctcca gggtgaggca gagagcaagg cctctaagct ctttggcaac 180

tactcccggg atcagcccat cttcctgcgg cttgaggatt atttctgggt caagacgcca 240

tctgcttacg agctgcccta tgggaccaag gggagtgagg atctgctcct ccgggtgcta 300

gccatcacca gctcctccat ccccaagaac atccagagcc tcaggtgccg ccgctgtgtg 360

gtcgtgggga acgggcaccg gctgcggaac agctcactgg gagatgccat caacaagtac 420

gatgtggtca tcagattgaa caatgcccca gtggctggct atgagggtga cgtgggctcc 480

aagaccacca tgcgtctctt ctaccctgaa tctgcccact tcgaccccaa agtagaaaac 540

aacccagaca cactcctcgt cctggtagct ttcaaggcaa tggacttcca ctggattgag 600

accatcctga gtgataagaa gcgggtgcga aagggtttct ggaaacagcc tcccctcatc 660

tgggatgtca atcctaaaca gattcggatt ctcaacccct tcttcatgga gattgcagct 720

gacaaactgc tgagcctgcc aatgcaacag ccacggaaga ttaagcagaa gcccaccacg 780

ggcctgttgg ccatcacgct ggccctccac ctctgtgact tggtgcacat tgccggcttt 840

ggctacccag acgcctacaa caagaagcag accattcact actatgagca gatcacgctc 900

aagtccatgg cggggtcagg ccataatgtc tcccaagagg ccctggccat taagcggatg 960

ctggagatgg gagctatcaa gaacctcacg tccttctga 999

<210> 4

<211> 1221

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> SEQ ID 4 Нуклеотидная последовательность ST6GAL1

<400> 4

atgattcaca ccaacctgaa gaaaaagttc agctgctgcg tcctggtctt tcttctgttt 60

gcagtcatct gtgtgtggaa ggaaaagaag aaagggagtt actatgattc ctttaaattg 120

caaaccaagg aattccaggt gttaaagagt ctggggaaat tggccatggg gtctgattcc 180

cagtctgtat cctcaagcag cacccaggac ccccacaggg gccgccagac cctcggcagt 240

ctcagaggcc tagccaaggc caaaccagag gcctccttcc aggtgtggaa caaggacagc 300

tcttccaaaa accttatccc taggctgcaa aagatctgga agaattacct aagcatgaac 360

aagtacaaag tgtcctacaa ggggccagga ccaggcatca agttcagtgc agaggccctg 420

cgctgccacc tccgggacca tgtgaatgta tccatggtag aggtcacaga ttttcccttc 480

aatacctctg aatgggaggg ttatctgccc aaggagagca ttaggaccaa ggctgggcct 540

tggggcaggt gtgctgttgt gtcgtcagcg ggatctctga agtcctccca actaggcaga 600

gaaatcgatg atcatgacgc agtcctgagg tttaatgggg cacccacagc caacttccaa 660

caagatgtgg gcacaaaaac taccattcgc ctgatgaact ctcagttggt taccacagag 720

aagcgcttcc tcaaagacag tttgtacaat gaaggaatcc taattgtatg ggacccatct 780

gtataccact cagatatccc aaagtggtac cagaatccgg attataattt ctttaacaac 840

tacaagactt atcgtaagct gcaccccaat cagccctttt acatcctcaa gccccagatg 900

ccttgggagc tatgggacat tcttcaagaa atctccccag aagagattca gccaaacccc 960

ccatcctctg ggatgcttgg tatcatcatc atgatgacgc tgtgtgacca ggtggatatt 1020

tatgagttcc tcccatccaa gcgcaagact gacgtgtgct actactacca gaagttcttc 1080

gatagtgcct gcacgatggg tgcctaccac ccgctgctct atgagaagaa tttggtgaag 1140

catctcaacc agggcacaga tgaggacatc tacctgcttg gaaaagccac actgcctggc 1200

ttccggacca ttcactgcta a 1221

<210> 5

<211> 129

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность белка hCG альфа

<400> 5

Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile

1 5 10 15

Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys

20 25 30

Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly

35 40 45

Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys

50 55 60

Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg

65 70 75 80

Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val

85 90 95

Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys

100 105 110

Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys

115 120 125

Glu

<210> 6

<211> 165

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность белка hCG бета

<400> 6

Met Glu Met Phe Gln Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly

1 5 10 15

Gly Thr Trp Ala Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile

20 25 30

Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr

35 40 45

Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val

50 55 60

Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg

65 70 75 80

Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val

85 90 95

Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu

100 105 110

Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu

115 120 125

Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro

130 135 140

Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr

145 150 155 160

Pro Ile Leu Pro Gln

165

<210> 7

<211> 332

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность белка ST3GAL4

<400> 7

Met Cys Pro Ala Gly Trp Lys Leu Leu Ala Met Leu Ala Leu Val Leu

1 5 10 15

Val Val Met Val Trp Tyr Ser Ile Ser Arg Glu Asp Arg Tyr Ile Glu

20 25 30

Leu Phe Tyr Phe Pro Ile Pro Glu Lys Lys Glu Pro Cys Leu Gln Gly

35 40 45

Glu Ala Glu Ser Lys Ala Ser Lys Leu Phe Gly Asn Tyr Ser Arg Asp

50 55 60

Gln Pro Ile Phe Leu Arg Leu Glu Asp Tyr Phe Trp Val Lys Thr Pro

65 70 75 80

Ser Ala Tyr Glu Leu Pro Tyr Gly Thr Lys Gly Ser Glu Asp Leu Leu

85 90 95

Leu Arg Val Leu Ala Ile Thr Ser Ser Ser Ile Pro Lys Asn Ile Gln

100 105 110

Ser Leu Arg Cys Arg Arg Cys Val Val Val Gly Asn Gly His Arg Leu

115 120 125

Arg Asn Ser Ser Leu Gly Asp Ala Ile Asn Lys Tyr Asp Val Val Ile

130 135 140

Arg Leu Asn Asn Ala Pro Val Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Val Gly Ser

145 150 155 160

Lys Thr Thr Met Arg Leu Phe Tyr Pro Glu Ser Ala His Phe Asp Pro

165 170 175

Lys Val Glu Asn Asn Pro Asp Thr Leu Leu Val Leu Val Ala Phe Lys

180 185 190

Ala Met Asp Phe His Trp Ile Glu Thr Ile Leu Ser Asp Lys Lys Arg

195 200 205

Val Arg Lys Gly Phe Trp Lys Gln Pro Pro Leu Ile Trp Asp Val Asn

210 215 220

Pro Lys Gln Ile Arg Ile Leu Asn Pro Phe Phe Met Glu Ile Ala Ala

225 230 235 240

Asp Lys Leu Leu Ser Leu Pro Met Gln Gln Pro Arg Lys Ile Lys Gln

245 250 255

Lys Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ile Thr Leu Ala Leu His Leu Cys

260 265 270

Asp Leu Val His Ile Ala Gly Phe Gly Tyr Pro Asp Ala Tyr Asn Lys

275 280 285

Lys Gln Thr Ile His Tyr Tyr Glu Gln Ile Thr Leu Lys Ser Met Ala

290 295 300

Gly Ser Gly His Asn Val Ser Gln Glu Ala Leu Ala Ile Lys Arg Met

305 310 315 320

Leu Glu Met Gly Ala Ile Lys Asn Leu Thr Ser Phe

325 330

<210> 8

<211> 406

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> последовательность белка ST6GAL1

<400> 8

Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val

1 5 10 15

Phe Leu Leu Phe Ala Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly

20 25 30

Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gln Thr Lys Glu Phe Gln Val Leu

35 40 45

Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser

50 55 60

Ser Ser Ser Thr Gln Asp Pro His Arg Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser

65 70 75 80

Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp

85 90 95

Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile

100 105 110

Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly

115 120 125

Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu Ala Leu Arg Cys His Leu

130 135 140

Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe

145 150 155 160

Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr

165 170 175

Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asp His Asp Ala Val

195 200 205

Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly

210 215 220

Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu

225 230 235 240

Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile Val

245 250 255

Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Asn

260 265 270

Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His

275 280 285

Pro Asn Gln Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu

290 295 300

Trp Asp Ile Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro

305 310 315 320

Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp

325 330 335

Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val

340 345 350

Cys Tyr Tyr Tyr Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala

355 360 365

Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln

370 375 380

Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly

385 390 395 400

Phe Arg Thr Ile His Cys

405

<210> 9

<211> 39

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер CGa-fw

<400> 9

ccaggatccg ccaccatgga ttactacaga aaaatatgc 39

<210> 10

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер CGa-rev

<400> 10

ggatggctag cttaagattt gtgataataa c 31

<210> 11

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер CGb-fw

<400> 11

ccaggcgcgc caccatggag atgttccagg ggctgc 36

<210> 12

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер CGb-rev

<400> 12

ccgggttaac ttattgtggg aggatcgggg 30

<210> 13

<211> 37

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер 2,3STfw

<400> 13

ccaggatccg ccaccatgtg tcctgcaggc tggaagc 37

<210> 14

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер 2,3STrev

<400> 14

tttttttctt aagtcagaag gacgtgaggt tcttg 35

<210> 15

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер 2,6STfw

<400> 15

ccaggatccg ccaccatgat tcacaccaac ctgaag 36

<210> 16

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ПЦР праймер 2,6STrev

<400> 16

tttttttctt aagttagcag tgaatggtcc gg 32

<---

Реферат

Группа изобретений к относится к хорионическому гонадотропному гормону. Предложены фармацевтическая композиция, обладающая активностью хорионического гонадотропного гормона человека (hCG), содержащая рекомбинантный hCG (rhCG), включающий α2,3-связанную сиаловую кислоту и α2,6-связанную сиаловую кислоту, и фармацевтически приемлемый носитель. Причем rhCG продуцирован или экспрессирован в линии клеток человека, обладающей эндогенной активностью α2,6-сиалилтрансферазы и трансфицированной генами альфа- и бета-субъединиц hCG и геном α2,3-сиалилтрансферазы. Также предложены фармацевтическая композиция, обладающая активностями хорионического гонадотропного гормона человека (hCG) и фолликулостимулирующего гормона (FSH), содержащая rhCG, включающий α2,3-связанную сиаловую кислоту и α2,6-связанную сиаловую кислоту, и FSH. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей указанный rhCG, включает стадию продуцирования или экспрессии rhCG в линии клеток человека, обладающей эндогенной активностью α2,6-сиалилтрансферазы и трансфицированной генами альфа- и бета-субъединиц hCG и геном α2,3-сиалилтрансферазы. Изобретения обеспечивают получение hCG, обладающего активностью 27477 МЕ/мг, с относительным количеством одно-, двух-, трех- и четырех(антенных) сиалированных структур в следующих соотношениях (1S:2S:3S:4S): 0,2-1 : 35-40 : 2,5-7 : 0,5-1 и с содержанием сиаловой кислоты от 15 моль/моль до 25 моль/моль, например 19,1 моль/моль. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 11 пр.

Формула