Способы усиления и ограничения экспрессии генов - RU2226108C2
Код документа: RU2226108C2
Чертежи
Показать все 64 чертежа(ей)
Описание
Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть).
Реферат
Изобретение относится к генной терапии и касается усиления и ограничения экспрессии генов. Сущность изобретения включает набор векторов для поддерживаемой и регулируемой экспрессии, которые содержат терапевтические генные продукты, экспрессия которых осуществляется с помощью индуцибельных промоторов, а также способ достижения локализованной временной экспрессии под контролем индуцируемого теплом промотора. Также изобретение включает новые векторы для генотерапевтического лечения локального и метастазирующего рака молочной железы, яичника и предстательной железы. Преимущество изобретения заключается в создании новых векторов, с помощью которых экспрессия гена в клетках-мишенях усиливается и пролонгируется с помощью промоторов, индуцируемых теплом. 7 с. и 11 з.п.ф-лы, 10 ил.
Формула
1. Рекомбинантный вектор pDATH-Х
(плазмида с промотором теплового шока, контролируемым доминантно-негативной, антисмысловой TET-ON), причем указанный вектор включает: (a) 1-ю кассету, включающую TET-ON, экспрессируемую под контролем
промотора теплового шока и tet-оператора, причем указанная TET-ON состоит из химеры последовательностей, кодирующих аминокислоты 1-207 тетрациклинового репрессора и последние С-концевые 130
аминокислот домена активации транскрипции белка VP16 вируса простого герпеса, причем указанный промотор теплового шока состоит из элементов реагирования на тепловой шок (от -260 до 30) промотора гена
белка теплового шока 70-кД человека, соединенный с минимальным цитомегаловирусным промотором (pCMV), причем указанный tet-оператор состоит из 19-нуклеотидных инвертированных повторов оператора 02
TN10,
с которым связаны tet-репрессор и TET-ON; (b) 2-ю кассету, включающую сайт клонирования терапевтического гена, расположенного ниже промотора tetp-CMV, состоящего из tet-оператора, соединенного
с
минимальным цитомегаловирусным промотором (pCMV), причем указанный tet-оператор состоит из 19-нуклеотидных инвертированных повторов оператора 02 TN10, с которым связаны tet-репрессор и TET-ON; (c)
3-ю
кассету, включающую антисмысловую TET-ON под контролем промотора pCMV, причем указанная антисмысловая TET-ON состоит из антисмысловой последовательности, комплементарной первым 80 нуклеотидам
последовательности TET-ON, включая старт-кодон ATG; (d) 4-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON под контролем промотора pCMV, причем указанная доминантно-негативная TET-ON состоит из
tet-репрессора без домена трансактивации VP16.
2. Способ достижения локализованной временной экспрессии гена под контролем индуцируемого теплом
промотора,
включающий стадии - встраивания указанного гена в сайт клонирования вектора pDATH-X по п.1; внесения вектора, включающего указанный ген, в организм-хозяин; приложения тепловой энергии к
местоположению на указанном организме-хозяине, где желательна экспрессия указанного гена.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанным
организмом-хозяином является человек.
4. Рекомбинантный вектор pDATE-X (экспрессирующая плазмида с промотором EGR, контролируемым доминантно-негативной,
антисмысловой TET-ON), причем указанный вектор включает: (a) 1-ю кассету, включающую последовательность TET-ON под контролем EGRp, сайт связывания тетрациклинового оператора и pCMV; (b) 2-ю кассету,
включающую терапевтический ген Х под контролем промотора tetp-pCMV; (c) 3-ю кассету, включающую антисмысловую TET-ON под контролем промотора pCMV; (d) 4-ю кассету, включающую доминантно-негативную
TET-ON под контролем промотора pCMV.
5. Рекомбинантный экспрессирующий вектор pRIBs-X (индуцируемый облучением промотор, специфичный для молочной
железы),
причем указанный вектор включает: (а) 1-ю кассету, включающую “Gal-DBD-mx”, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей N-концевой (аминокислоты 1-147) ДНК-связывающийся
домен
дрожжевого белка GAL4 (Gal-DBD), химеризованной на основной домен “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” Мах (аминокислоты 8-112) с последующим поли-(A) SV40, причем образованный в
результате
химерный ген GAL-DBD-mx находится под контролем индуцируемого облучением промотора Еgr-1; (b) 2-ю кассету, включающую минимальный промотор CMV, “антисмысловую Gal-DBD-mx”, которая является
антисмысловой конструкцией, комплементарной последовательности Gal-DBD-mx, внутренний сайт вхождения рибосомы (IRES) и “Gal-DBD”, которая конкурирует с Gal-DBD-mx за сайт связывания pGAL; (c) 3-ю
кассету, включающую “VP16-TA-mc”, которая является химерной ORF, кодирующей первые N-концевые 11 аминокислот Gal4 (аминокислоты 1-147), с последующими сигналом ядерной локализации большого Т-антигена
SV40, 130-аминокислотным С-концевым трансактивационным доменом белка VP16 вируса простого герпеса, основным доменом “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” с-Мус (аминокислоты 350-439) и затем
поли-(А) SV40, причем образованный в результате химерный ген VP16-TA-mc находится под контролем промотора с-еrbВ2 “реrВ2” до первого ATG; (d) 4-ю кассету, включающую “Galp”, пять копий 17-мерного
ДНК-связывающего сайта для Gal4, причем последовательность TET-ON помещена под контроль промотора GALp-pTET, a терапевтический ген Х соединен с TET-ON через IRES; (e) 5-ю кассету, включающую
антисмысловую TET-ON, которая является последовательностью, состоящей из последовательности, комплементарной первым 80 нуклеотидам последовательности TET-ON, включая ATG, под контролем промотора pCMV;
(f) 6-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON, состоящую из кодирующих последовательностей для аминокислот 1-207.
6. Рекомбинантный вектор
по
п.5, отличающийся тем, что промотор perbB2 в 3-й кассете заменен на промотор сывороточного кислого белка.
7. Рекомбинантный вектор по п.5,
отличающийся
тем, что промотор perbB2 в 3-й кассете заменен на промотор стромелизина-3.
8. Рекомбинантный вектор по п.5, отличающийся тем, что указанный
ген Х
является геном, кодирующим фактор некроза опухоли альфа.
9. Рекомбинантный экспрепрессирующий вектор pRIPs-X (индуцируемый облучением промотор,
специфичный для предстательной железы), причем указанный вектор включает: (a) 1-ю кассету, включающую “Gal-DBD-mx”, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей N-концевой
(аминокислоты 1-147) ДНК-связывающийся домен дрожжевого белка GAL4, химеризованной на основной домен “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” Мах (аминокислоты 8-112) с последующим поли-(A) SV40,
причем образованный в результате химерный ген GAL-DBD-mx находится под контролем индуцируемого облучением промотора Egr-1; (b) 2-ю кассету, включающую минимальный промотор CMV, антисмысловую
Gal-DBD-mx, которая является антисмысловой конструкцией, комплементарной последовательности Gal-DBD-mx, IRES, которая является внутренним сайтом вхождения рибосомы, и Gal-DBD, которая конкурирует с
Gal-DBD-mx за сайт связывания pGAL; (c) 3-ю кассету, включающую “VP16-TA-mc”, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей первые N-концевые 11 аминокислот Gal4, с последующими
сигналом ядерной локализации большого Т-антигена SV40, 130-аминокислотным С-концевым трансактивационным доменом белка VP16 вируса простого герпеса, основным доменом “спираль-петля-спираль-лейциновая
молния” с-Мус (аминокислоты 350-439) и затем поли-(А) SV40, причем образованный в результате химерный ген VP16-TA-mc находится под контролем промотора гена пробазина “pProbasin” до первого ATG; (d)
4-ю кассету, включающую GALp, пять копий 17-мерного ДНК-связывающего сайта для Gal4, причем последовательность TET-ON помещена под контроль промотора GALp-ptet, a терапевтический ген Х соединен с
TET-ON через внутренний сайт вхождения рибосомы; (e) 5-ю кассету, включающую антисмысловую TET-ON, которая является последовательностью, состоящей из последовательности, комплементарной первым 80
нуклеотидам последовательности ТЕТ-ON, включая ATG, под контролем промотора pCMV; (f) 6-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON, состоящую из кодирующей последовательности для аминокислот
1-207.
10. Рекомбинантный вектор по п.9, отличающийся тем, что указанный промотор пробазина в 3-й кассете заменен на промотор антигена, специфичного
для
предстательной железы.
11. Рекомбинантный вектор по п.9, отличающийся тем, что указанный ген Х является геном фактора-α некроза
опухоли.
12. Рекомбинантный экспрессирующий вектор pHIBs-X (индуцируемый теплом промотор, специфичный для молочной железы), причем указанный вектор
включает: (a) 1-ю кассету, включающую Gal-DBD-mx, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей N-концевой (аминокислоты 1-147) ДНК-связывающийся домен дрожжевого белка GAL4,
химеризованной на основной домен “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” Мах (аминокислоты 8-112) с последующим поли-(A) SV40, причем образованный в результате химерный ген GAL-DBD-mx находится под
контролем индуцируемого теплом промотора белка теплового шока; (b) 2-ю кассету, включающую минимальный промотор CMV, антисмысловую Gal-DBD-mx, являющуюся конструкцией, комплементарной
последовательности Gal-DBD-mx, внутренний сайт вхождения рибосомы и Gal-DBD, которая конкурирует с Gal-DBD-mx за сайт связывания pGAL; (c) 3-ю кассету, включающую “VP16-TA-mc”, которая является
химерной открытой рамкой считывания, кодирующей первые N-концевые 11 аминокислот Gal4, с последующими сигналом ядерной локализации большого Т-антигена SV40, 130-аминокислотным С-концевым
трансактивационным доменом белка VP16 вируса простого герпеса, основным доменом “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” с-Мус (аминокислоты 350-439) и затем поли-(А) SV40, причем образованный в
результате химерный ген VP16-TA-mc находится под контролем промотора гена с-еrbВ2 “реrВ2” до первого ATG; (d) 4-ю кассету, включающую GALp, пять копий 17-мерного ДНК-связывающего сайта для Gal4,
причем последовательность TET-ON помещена под контроль промотора GALp-ptet, a терапевтический ген Х соединен с TET-ON через внутренний сайт вхождения рибосомы; (e) 5-ю кассету, включающую
антисмысловую TET-ON, которая является последовательностью, состоящей из последовательности, комплементарной первым 80 нуклеотидам последовательности TET-ON, включая ATG, под контролем промотора pCMV;
(f) 6-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON, состоящую из кодирующих последовательностей для аминокислот 1-207.
13. Рекомбинантный вектор
по п.12, отличающийся тем, что промотор реrbВ2 в 3-й кассете заменен на промотор сывороточного кислого белка.
14. Рекомбинантный вектор по п.12,
отличающийся тем, что промотор реrbВ2 в 3-й кассете заменен на промотор стромелизина-3.
15. Рекомбинантный вектор по п.12, отличающийся тем, что
указанный терапевтический ген Х является геном фактора-α некроза опухоли.
16. Рекомбинантный экспрессирующий вектор pHIPs-X (индуцируемый теплом
промотор, специфичный для предстательной железы), причем указанный вектор включает: (a) 1-ю кассету, включающую Gal-DBD-mx, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей N-концевой
(аминокислоты 1-147) ДНК-связывающийся домен дрожжевого белка GAL4, химеризованной на основной домен “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” Мах (аминокислоты 8-112) с последующим поли-(A) SV40,
причем образованный в результате химерный ген GAL-DBD-mx находится под контролем индуцируемого теплом промотора белка теплового шока; (b) 2-ю кассету, включающую минимальный промотор CMV (mCMVp),
антисмысловую Gal-DBD-mx, являющуюся конструкцией, комплементарной последовательности Gal-DBD-mx, внутренний сайт вхождения рибосомы и Gal-DBD, которая конкурирует с Gal-DBD-mx за сайт связывания
pGAL;
(с) 3-ю кассету, включающую “VP16-TA-mc”, которая является химерной открытой рамкой считывания, кодирующей первые N-концевые 11 аминокислот Gal4, с последующими сигналом ядерной локализации
большого
Т-антигена SV40, 130-аминокислотным С-концевым трансактивационным доменом белка VP16 вируса простого герпеса, основным доменом “спираль-петля-спираль-лейциновая молния” с-Мус (аминокислоты
350-439) и
затем поли-(А) SV40, причем образованный в результате химерный ген VP16-TA-mc находится под контролем промотора гена пробазина “pProbasin” до первого ATG; (d) 4-ю кассету, включающую GALp,
пять копий
17-мерного ДНК-связывающего сайта для Gal4, причем последовательность TET-ON помещена под контроль промотора GALp-ptet, a терапевтический ген Х соединен с TET-ON через внутренний сайт
вхождения
рибосомы; (e) 5-ю кассету, включающую антисмысловую TET-ON, которая является последовательностью, состоящей из последовательности, комплементарной первым 80 нуклеотидам последовательности
TET-ON,
включая ATG, под контролем промотора pCMV; (f) 6-ю кассету, включающую доминантно-негативную TET-ON, состоящую из кодирующих последовательностей для аминокислот 1-207.
17. Рекомбинантный вектор по п.16, отличающийся тем, что промотор пробазина заменен на промотор антигена, специфичного для предстательной железы.
18. Рекомбинантный вектор по п.16, отличающийся тем, что указанный терапевтический ген Х является геном фактора-α некроза опухолей.
