Код документа: RU2070722C1
В соответствии с настоящим изобретением разработан способ стабилизации фактора роста фибробласта (FGF) в термических, кислотных и/или протеолитических условиях в результате соединения или комплексообразования FGF с солью октасульфата сахарозы (SOS) и главным образом с ее алюминиевой (сукральфат) или калиевой солями. Настоящее изобретение также относится к FGF-стабильным композициям, содержащим SOS и FGF. Такая композиция может использоваться для лечения FGF-зависимых заболеваний, включая лечение ран и язвенных состояний желудочно-кишечного тракта. Настоящее изобретение относится также к использованию SOS в различных диагностических методиках, а также в качестве компонента диагностического комплекта. Наконец, настоящее изобретение относится к использованию SOS для очистки FGF.
Язвенные заболевания желудочно-кишечного тракта, на которые обычно ссылаются, как на пептические язвы, представляют собой заболевания, в которых имеет место дефект эпителия желудочно-кишечного тракта. Дефект такого типа обычно образуется в результате совместного действия соляной кислоты и пепсина. Пептические язвы проникают по крайней мере в подслизистую оболочку; к более поверхностным повреждениям относятся эрозии. Пептические язвы могут находиться в различных местах желудочно-кишечного тракта, включая желудок, двенадцатиперстную кишку или пищевод, в дивертикуле Мекеля, на участках анастомоз, созданных в результате хирургического вмешательства и реже в верхней части тощей кишки.
Двадцать лет назад лечение пептических изъявлений состояло в назначении постельного режима, мягкой диеты, антацидов и/или в хирургическом удалении пораженного участка. Позже для лечения пептических язв стали применять антагонисты H2-рецептора. Два наиболее употребительных антагониста Н2-рецептора представляют собой ранитидин и циметидин, терапевтическое действие которых заключается в ингибировании секреции желудочной кислоты. Эффективность и побочные эффекты двух таких антагонистов были широко исследованы, например, Томасом с сотр. см. clinios in gastroenterolog N 2, стр. 501 529.
Хотя лечение такими антагонистами нашло широкое применение и было относительно успешным, многие пептические язвы оказались устойчивыми к терапии на основе антагонистов Н2-рецептора. Так, например, по не вполне понятным причинам, 20 30% дуоденальных язв не излечивались через 4 6 недель терапии с использованием как циметидина, так и ранитидина. Кроме этого, при использовании антагонистов Н2-рецептора иногда бывает рецидив язвенного состояния.
Сукральфат также использовался в качестве агента для лечения язвы при минимальных побочных эффектах. Предполагается, что сукральфат оказывает влияние на многие механизмы защиты желудочно-кишечного тракта и восстановления (излечивания, включая I) абсорбцию пепсина и желудочных кислот, II) цитозащитную активность гастростимуляции секреции слизи и бикарбонатной секреции желудочной слизью, III) защиту от повреждений профилактивной зоны и IV) защиту сосудистой целостности. Хотя были достигнуты большие успехи в понимании механизма предотвращения сукральфатом эрозий и язв и ускорения извлечения язв, основной задачей остается выяснение хронического терапевтического действия такого лекарства.
Было показано, что фактор роста фибробласта (FGF) является мощным антигенным фактором, который, inter alia ответственен за неоваскуляризацию при излечении ран. Существует два типа FGF, кислотный фактор роста фибробласта (aFGF) и основной фактор роста фибробласта (bFGF). Однако, аFGF и bFGF являются кислотно- и/или либильными. Таким образом, использование FGF в условиях воздействия кислоты и/или тепла, как это имеет место при лечении пептических язв, требует его стабилизации к воздействию таких условий с тем, чтобы максимизировать терапевтический уо/мкл.
Однако недавно в заявке РСТ с серийным номером РСТ/США 8903467, опубликованной 8 марта 1990 г. на которую
ссылаются в
настоящем документе, раскрыты некоторые кислотно-устойчивые FGF композиции, включающие рекомбинантный FGF в комбинации с
I) таким стабилизирующим агентом, как гликозаиминогликан,
глюкан
сульфаты и сульфированные циклодекстрины,
II) такими антисекреторными агентами, как антагонисты Н2-рецептора,
III) цитозащитными агентами и
IV)
антацидами.
Указывается, что такие новые композиции чрезвычайно эффективны в лечении заболеваний, для которых мощным медикаментом мог бы быть FGF, но в условиях кислотного и/или теплового воздействия.
Однако остается потребность в новых путях дальнейшей стабилизации FGF с целью реализации его диагностического и терапевтического потенциалов в лечении заболеваний желудочно-кишечного тракта, ран и т.п.
В соответствии с настоящим изобретением обеспечивается способ стабилизации FGF, который включает соединение или комплексообразование FGF с солью октасульфата сахарозы (SOS) и главным образом с ее алюминиевой (сукральфат) или калиевой солями. Используемый в тексте термин "SOS" включает соли октасульфата сахарозы, которые включают, но не ограничиваются ее алюминиевой и калиевой солями. Стабилизированная FGF композиция настоящего изобретения может использоваться для лечения млекопитающих, страдающих практически любым FGF-зависимым заболеванием и главным образом заболеванием, протекающим при воздействии кислоты или тепла или в условиях присутствия протеолитических факторов. Более конкретно композиция настоящего изобретения может использоваться для лечения язвенных заболеваний желудочно-кишечного тракта в результате применения на пациенте эффективного количества FGF в комбинации с SOS и совместно с фармацевтически применимым носителем, связующим или разбавителем. Такая композиция также применима для лечения ран, когда протеолитические агенты ухудшают терапевтический потенциал FGF.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения было обнаружено, что SOS обладает повышенным сродством к FGF, что позволяет использовать его для очистки FGF, а также в диагностических целях, когда важно наличие и/или определенное количество FGF.
На фиг. 1 проиллюстрировано влияние высокой температуры на bFGF в присутствии и отсутствии SOS.
На фиг. 2 проиллюстрировано влияние кислоты на FGF в присутствии и отсутствии SOS.
На фиг. 3 проиллюстрировано влияние пепсина на мутеин CS23 в присутствии и отсутствии сукральфата.
На фиг. 4 проиллюстрировано сродство SOS к bFGF по его способности извлекать bFGF из гепарина по сравнению с 2М NaCl.
На фиг. 5 проиллюстрирована очистка bFGF из жидкого образца с помощью колонки с сукральфат-сефарозой.
Настоящее изобретение предусматривает новые устойчивые FGF композиции для лечения и/или профилактики заболеваний млекопитающих, реагирующих на FGF-терапию. Настоящее изобретение также предусматривает способы очистки FGF, а также некоторые диагностические применения, в которых должно быть определено наличие и/или количество FGF.
В простейшем виде способ лечения FGF-зависимых заболеваний включает применение на млекопитающем эффективного количества стабилизированной FGF композиции или ее фармацевтически применимой соли, причем такая стабилизированная композиция включает SOS в композиции с FGF. Так, например, различные язвенные заболевания желудочно-кишечного тракта можно лечить путем применения на млекопитающем эффективного количества стабилизированной FGF композиции. Такие язвенные заболевания включают региональную кишечную непроходимость, язвенные колиты и пептическую язву (как язву двенадцатиперстной кишки, так и желудка).
Стабилизированные FGF композиции настоящего изобретения могут также использоваться для лечения других болезненных состояний у млекопитающих,
которые реагируют на FGF терапию,
но в условиях кислотного, теплового и/или протеолитического воздействия. Так, например, при радиотерапии или хемотерапии рака мочевого пузыря часто наблюдается
изъявление ткани тех органов, которые
могут лечиться с помощью FGF, если FGF стабилизирован к воздействию кислотных условий, существующих в мочевом пузыре. Раны также создают кислотные и/или
протеолитические условия, которые реагируют на
стабилизированную FGF композицию настоящего изобретения. Другие состояния, в которых может реализоваться кислотное, тепловое и/или протеолитическое
воздействие и которые могли бы реагировать на FGF
терапию, должны быть известны специалисту в данной области и они включают
I) тканевые нарушения, ожоги, раны, постоперационные ткани,
тромбозы, атеросклерозы;
II) такие нарушения
скелетно-мышечной структуры, как переломы костей, восстановление связок и сухожилий, тендониты и бурситы, такие кожные нарушения, как небольшие
ожоги, порезы, разрывы, пролежни, медленное заживление и
хронические язвы, которые наблюдаются у диабетиков, а также при восстановлении тканей в ходе ишемии и инфаркта миокарда; а также
III)
ретинопатии глаз, включающие диабетическую ретинопатию, и
неоваскулярную глаукому, такие кожные заболевания, как псориаз и pетролентальную фиброплазию, хроническое воспаление, ревматоидные артриты и
некоторые неоплазмы, являющиеся высоко ангиогенными, такие
как рост некоторых доброкачественных и злокачественных опухолей, таких как гемагиомы и ангиофибромы и твердые опухоли.
Стабилизированная FGF композиция настоящего изобретения может представлять собой композицию SOS и аFGF или bFGF, аFGF и bFGF, используемые при практической реализации настоящего изобретения, могут быть получены из ряда источников, включая таких млекопитающих как люди, коровы, обезьяны, свиньи и лошади.
Предпочтительная стабилизированная FGF-композиция представляет собой такую композицию, которая включает модифицированный FGF, например очищенный рекомбинантный человеческий основной FGF (rhb FGF) протеин, в котором мутация индуцирована ("мутеин") изменением одного или более из четырех цистеинов, присутствующих в аминокислотных остатках 25, 69, 87 и 92 зрелого протеина на серин. В нумерации аминокислот, составляющих человеческий bFGF, N-терминальный Pro включает первую аминокислоту. Наиболее предпочтительный FGF представляет собой rhb FGF мутеин CS23, структура которого наиболее полно описана в статье Сену с сотр. в Bio chemical and Biophysical Res. Comm. т.151, N 2, 701 708 (1988), а также в патенте США с серийным N 161123, поданном 18 февраля 1988, который соответствует ЕР-2 818222 А2, на содержание которого ссылаются в настоящем тексте. Другие мутеины, которые могут использоваться при практической реализации настоящего изобретения и которые также описаны в этих ссылках, включают мутеины, в которые добавлены аминокислоты и в которых аминокислоты вычеркнуты или заменены.
Стабилизированные FGF композиции в соответствии с настоящим изобретением, как было установлено, обладают высокой устойчивостью в кислоте, а также в тепловых и протеолитических условиях. Нативные FGF млекопитающих и FGF, подвергнутые рекомбинантной модификации в кислотно-устойчивую форму, обладают очень низкой токсичностью.
Двумя предпочтительными формами октасульфата сахарозы, которые могут использоваться для стабилизации FGF, являются SOS калия и SOS алюминия (сукральфат). Вид формы октасульфата сахарозы, используемой для получения предпочтительной стабилизированной FGF композиции, будет зависеть от ряда факторов, включающих тип применения, требования, предъявляемые к солюбилизации и т.п. Для лечения кишечно-желудочных заболеваний предпочтительным SOS является SOS алюминия (сукральфат), поскольку он не адсорбируется в токе крови.
Предпочтительный путь применения стабилизированной композиции настоящего изобретения будет также зависеть от ряда факторов, включающих состояние, подлежащее лечению, и удобства пациента. Так, например, при использовании для лечения язвенных ран мочевого пузыря, которые индуцируются, например, в результате радиационной обработки или хемотерапии, стабилизированная FGF композиция может применяться через уретральный катетер. При лечении язвенных ран кишечно-желудочного тракта предпочтительным путем применения является оральный, например, путем приема таблеток, капсул, лепешек и жевательной резинки. Другие пути применения для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта включают ректальный, путем клизм и парентеральный.
Приготовление стабилизированной FGF-композиции осуществляют традиционными методами. Так, например, таблетки и капсулы готовят с использованием таких присадок, как фармацевтически применимые носители (например, лактоза, пшеничный крахмал, светлый кремниевый ангидрид, микрокристаллическая целлюлоза, сахароза), связующих агентов (например, крахмал в альфа-форме, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, поливинилпирролидон), дезинтегрирующие агенты (например, кальций карбоксиметилцеллюлоза, крахмал, мало замещенная гидроксипропилцеллюлоза), поверхностно-активные агенты (например, Твин 80 (Као-Атлас), Плюроник 68 (Асахи Денка, Япония); полиоксиэтилен-полиоксипропиленовый сополимер, антиоксиданты (например, 1-цистеин, сульфит натрия, аскорбат натрия), смазочные агенты (например, стеарат магния, тальк) и т.п.
Ректальные препараты также готовят традиционными методами, например, путем использования олеагинового основания, такого как глицерил высшей жирной кислоты (например, масло какао природного происхождения, Витепсолы), полусинтетическое основание (Динамит Нобель, ФРГ), глицерид средней жирной кислоты (например, Миглиолы (Динамит Нобель)) или растительное масло (например, сезамовое масло, соевое масло, кукурузное масло, хлопковое масло и оливковое масло).
При формировании композиции в водный раствор для инъекции такой раствор готовят традиционными методами с использованием в качестве растворителя водной системы (например, дистиллированной воды, физиологического раствора, раствора Рингера) или масляной системы (например, сезамового масла, оливкового масла). Если желательно, то можно использовать одну или более присадок. Такие присадки включают растворяющее средство (например, салицилат натрия, ацетат натрия), буфер (например, цитрат натрия, глицерин), изотонизирующий агент (например, глюкозу, инвертный сахар), стабилизаторы (например, альбумин человеческой сыворотки, полиэтиленгликоль), предохраняющие агенты (например, бензиловый спирт, фенол) или анальгетики (например, бензальконий хлорид, прокаин гидрохлорид). SOS в виде калиевой соли является предпочтительным при внутривенном применении из-за своей растворимости.
При формировании композиции в виде твердого препарата такой препарат можно получать традиционными методами с использованием, например, разбавителя (например, дистиллированная вода, физиологический раствор, глюкоза), эксипиента (например, карбоксиметилцеллюлоза (СМС), аргинат натрия), предохраняющего агента (например, бензилового спирта, бензальконий хлорида, фенола), или анальгетиков (например, глюкозы, глюконата кальция, гидрохлорида прокаина). Предпочтительной формой является сукральфат.
Количество FGF компонента в композиции заметно ниже количества таких других фармацевтических агентов, как Н2-блокираторы, и зависит от ряда факторов, включающих состояние, подлежащее лечению, наличие или отсутствие совместно используемых антисекреторных агентов, цитозащитных агентов и антацидов, и пищевого рациона пациента.
Так, например, при использовании для лечения язвенных болезней кишечно-желудочного тракта у взрослых пациентов, количество FGF протеинового компонента в композициях для орального применения обычно составляет от 0,1 мкг до 30 мг в день, предпочтительно 0,1 мкг 10 мг, более предпочтительно 0,1 мкг 3 мг в день и наиболее предпочтительно 10 мкг 300 мкг в день. При оральном применении 10 мкг 150 мкг rhbFGF мутеина CS23 или его соли может формироваться с сукральфатом (обычно 10 мг 100 мг сукральфата) в виде таблетки или капсулы совместно с фармацевтически применимым носителем, разбавителем или другим подходящим связующим. Такие рецептуры с успехом применяются 1 4 раза в день, в результате чего обеспечивается дозировка в предпочтительном интервале концентраций.
Для некоторых заболеваний нижнего кишечно-желудочного тракта, таких как пептические язвы и язвенные колиты предпочтительно, чтобы стабилизированная FGF композиция была покрыта таким энтерическим сополимером, как фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, фталат ацетатцеллюлозы или сополимер метакриловой кислоты с целью дополнительной защиты стабилизированной FGF от действия кислоты и таких энзимов, как пепсин. Такая покрытая композиция, таким образом, поступает в пищеварительный тракт и в алюментарный канал, где происходит оптимизация терапевтического индекса.
Количество SOS, используемой для стабилизации FGF компонента FGF стабилизированной композиции, зависит от ряда факторов, включающих стабильность. Количество сукральфата, предписанное людям, является характерным для предписаний согласно настоящему изобретению. Так, например, для орального применения могут применяться количества 0,1 6 г/день (предпочтительно раздельными дозировками) в комбинации с компонентом стабилизированной композиции.
SOS компонент настоящего изобретения может также присутствовать в виде других солей. Другие используемые соли могут включать фармацевтически применимые катионы, например натрий, аммоний, триметиламмоний и т.п.
При контролировании FGF протеинового компонента с сульфатированным дисахаридом в водной среде соотношение SOS к FGF компоненту лежит в интервале 1/1 по весу, вплоть до 10000/1 вес.
Концентрация SOS в водной среде составляет предпочтительно 0,4 4000 мг/мл, более предпочтительно 0,4 400 мг/мл, еще более предпочтительно 4 40 мг/мл. Концентрация FGF в водной среде составляет предпочтительно 1 нг/мл - 5000 нг/мл, более предпочтительно 10 500 нг/мл.
Для контактирования FGF протеинового компонента с SOS в водной среде может использоваться простое перемешивание этих материалов в водной среде. В качестве водной среды предпочтительно использовать дистиллированную воду, физиологический раствор, раствор глюкозы, такие буферы, как фосфатный буфер и три-гидроксиметил-аминометан-HCl-буфер. Стабилизированная FGF композиция может использоваться как таковая, без выделения и регенерации.
В соответствии с описанными выше способами получают высокостабилизированную композицию FGF, которая может безопасно использоваться для лечения таких млекопитающих, как люди, крысы, морские свинки, собаки, мыши и т.п.
Не ограничиваясь теорией, предполагают, что терапевтический эффект сукральфата (алюминиевая соль SOS) на язвы желудка и двенадцатиперстной кишки может зависеть от его стабильности функционирования в качестве пролонгированного носителя и стабилизатора эндогенного bFGF. В соответствии с настоящим изобретением предполагается, что сукральфат экстрагирует bFGF из обычной слизи и внеклеточной матрицы и переносит его в биологически активной форме в язвенный слой или другие поврежденные участки желудочно-кишечного тракта. Ранее было показано, что большие количества bFGF хранятся во внеклеточной матрице (см. Влодаскис с сотр. P.N.A.S. (США) 64: 2292 2296 (1987) и Фолькман с сотр. Amer. S. Pubhol 130 393 400 (1988)). Этот факт согласуется с более ранним сообщением о том, что применение экзогенного кислотоустойчивого bFGF способствует быстрому заживлению индуцированных хронических язв двенадцатиперстной кишки (см. Сабо с сотр. Jig. Dis. Sci: 34 1323 (1989) и указанную выше заявку РСТ с серийным номером РСТ (США) 03467). Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предполагается, что стабилизированный SOS FGF обладает эффективностью в пролонгировании биологической активности FGF при излечении ран, ожогов, язв и т.п.
В соответствии с другим воплощением настоящего изобретения предлагаются способы разделения, очистки и идентификации таких соединений, как FGF, которые обладают сродством к сукральфату из образца.
Как правило, такой способ заключается в контактировании образца, содержащего FGF (или других соединений, которые связаны или как-либо иначе закомплексованы с сукральфатом) с SOS, находящимся в колонке в качестве ее компонента. Любой FGF, присутствующий в образце, будет соединяться с сукральфатным компонентом колонки. FGF может элюироваться с колонки при соответствующей высокой концентрации соли или кислоты.
Согласно одному из вариантов такого воплощения FGF может контактировать с колонкой двойного сродства, относящейся к типу, описанному в заявке РСТ/США 88/01660, международная публикация N W 089/08144, на содержание которой ссылаются в настоящем документе, в том случае, когда сукральфат заменяют на гепариновый компонент колонки двойного сродства.
Согласно одному из предпочтительных воплощений сукральфатсефарозную колонку готовят смешиванием сукральфата с шариками сефарозы (Фармация Файн Кэмиклс, Швеция) в соотношении 1:10 вес.
Элюаты, используемые в практической реализации настоящего изобретения, будут зависеть от того, используют ли колонку со стандартным сродством или колонку с двойным сродством. Как правило, для элюирования FGF из колонки со стандартным сродством используют высококонцентрированный раствор такой соли, как хлористый натрий. Другим элюатом может служить уксусная кислота. Предпочтительными элюатами обычно могут служить водные растворы, содержащие физиологическую соль и подходящие буферные материалы с целью установления pH на значении, близком к 7. Предпочтительной буферной композицией является Tris с концентрацией 10 мл. В случае колонки двойного сродства, относящейся к типу, раскрытому в цитированной выше заявке РСТ, могут использоваться элюаты, перечисленные в этой заявке.
Согласно еще одному воплощению настоящего изобретения предусматривается использование сукральфата и FGF в различных диагностических целях. Так, например, степень активности роста эндотелия, связанного с гепарином в моче, увеличивается при раке мочевого пузыря (Ходак Дж.В. с сотр. Caneer Res. 45: 690 694, 1985; и 46: 5507 5510, 1986). Таким образом, использование SOS в батометре будет стабилизировать такую активность в образце, что позволяет повысить чувствительность и применимость FGF в качестве индикатора рака.
Аналогичным образом, FGF в спинно-мозговой жидкости коррелирует со случаями рака мозга. Как и в предыдущем случае, SOS может использоваться для увеличения чувствительности и надежности такого анализа на рак в результате стабилизации FGF, присутствующего в спинно-мозговой жидкости.
В упрощенном виде такой анализ включает контактирование образца жидкости, в которой предполагается наличие FGF с SOS и анализ такой жидкости на наличие комплексов между FGF и SOS. Такой анализ может быть проведен путем измерения внедрения (Н3) тимидина в ДНК клеток мышей разновидности BALB с ЗТЗ (см. Клагсбрун с сотр. PNAS 82; 805 809, 1985), причем на содержание этой статьи ссылаются в настоящем документе.
SOS также используется при стабилизации FGF, обнаруженного в различных тканевых культурах, и было установлено, что он не обладает токсичностью в отношении клеток in vitro вплоть до концентраций 400 мкл/мл. SOS можно добавлять в качестве компонента тканевой культуры с целью стабилизации любого FGF, эндогенного в отношении клеток тканевой культуры.
Рекомбинантный человеческий основной FGF /rhb FGF/, используемый в следующих ниже примерах I и II, получали согласно способу, описанному в примерах 1, 3, 6 или 8 ЕР 237966, с использованием трансформанта Escherichia coli K 12 MM294/pTB669/ IFP 14532. FERM BP-1281/ rhb FGF мутеин СS23, используемый в следующем примере 1, получали по способу, описанному в цитированной выше статье в Bioohemical and Biophysical Res, т. 151, стр. 701 - 708 /1988/, и в ссылочных примерах 1 и 2, а также в примерах 1, 6, 7 и 24 заявки на патент США N 161123, который соответствует ЕР-281822 А2 с использованием трансформанта Е.сoli MM294/pTB762/IFO 14613, Form BP-1645/.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, которые даны для его понимания, но не для ограничения объема притязаний.
Пример I.
Стабилизация FGF сукральфатом.
A. Стабилизация против тепла.
Раствор, содержащий FGF, был получен смешиванием 0,25 мкг человеческого FGF в 50 мкл трис-буфера, содержащего 20 мкг BSA. Этот раствор инкубировали при 60oC в течение 10 минут в присутствии и отсутствии 2 мг калия SOS. К концу периода инкубации в FGF образцы были разведены в 20 раз трис-буфером, содержащим BSA /1 мг/мл/, и анализированы на активность фактора роста путем измерения включения [H3]-тимидина в ДНК BALB/c мышиных ЗТЗ клеток по существу, как описано Klagsburnetal. PNAS USA 82:805-809 /1985/, которая приводится в качестве ссылки и раскрывает указанный метод.
Как можно видеть из фиг. 1, калий SOS стабилизирует FGF против высокой температуры. Активности, обнаруженные при контрольной температуре 4oC, показаны в виде открытых полос.
B. Стабилизация против кислоты.
Кислотный раствор, содержащий FGF, был получен смешиванием 0,5 мкг FGF в 60 мкл 1,5 н. раствора уксусной кислоты, содержащей 20 мкг BSA. Этот раствор, который имел pH 2,2, инкубировали при 37oC в течение 30 минут в присутствии и в отсутствие 2 мг SOS калия. После окончания периода инкубации образцы в FGF разбавляли и нейтрализовали трис-буфером, содержащим BSA /мг/мл/, и анализировали на активность фактора роста в соответствии с описанным выше. Однако при подкислении образцов bFGF они становились нерастворимыми, и поэтому их осветляли центрифугированием. Затем верхний слой и осадок от центрифугирования, который далее растворяли в трис-буфере, содержащем BSA (1 мг/мл), анализировали на активность фактора роста.
Как можно видеть из фиг. 2, SOS калия стабилизирует FGF в отношении воздействия кислых условий, существующих в желудочно-кишечном тракте. Активности при контрольном значении pH (pH 7) показаны незаштрихованными прямоугольниками.
C. Стабилизация от протеолитических факторов.
Раствор rhbFGF мутеина CS23 (200 мкг/мл) инкубировали при pH 2,3 и 37oC в присутствии пепсина (4 мкг/мл) в течение 20 часов в присутствии сукральфата. Сукральфат добавляли в полярном соотношении 1:10. Остаточную митогенную активность определяли с помощью эндотелиальных клеток сердца плода коровы АТСС CRI1395.
Как можно видеть из фиг. 3, сукральфат защищает rhbFGF мутеин CS23 от протеолитического действия пепсина.
Пример II.
Сродство FGF сукральфата.
A. Хроматография по сродству на гепарин.
Жидкостную хроматографическую систему быстрого действия фирмы Фармация (FPIC) использовали для демонстрации сродства FGF к сукральфату следующим образом: 2,5 мкг bFGF в 0,1 мл физиологического раствора, содержащего 0,1 мг BSA, загружали в колонку с TSK гель гепарином 5 PW (внутренний диаметр 8 мм, длина 3,5 см, получена от Сохохаас, Филадельфия, РА). Колонку предварительно уравновешивали 0,6 М NaCl, 10 мМ трис-HCl, pH 7 (трис-буфер). После загрузки колонку промывали 10 мМ трис-буфера с 0,6 М NaCl. Связанные активности элюировали 4 мл трис-буфера, содержащего 2 М NaCl или 78 мМ SOS калия с объемной скоростью 0,5 мл/мин. Собирали фракции объемом 1 мл и анализировали на активность фактора роста в соответствии с описанным в примере 1.
Как показано на фиг. 4, SOS калия отсоединяет bFGF от гепарин-сефарозной колонки при 78 мМ. Кроме этого также показано, что митогенная активность, регенерированная с помощью SOS, по крайней мере сравнима с активностью регенерированной 2М NaCl (рис. 4, верхняя часть). Поскольку предварительное исследование показало, что bFGF крепко прилипает к иммобилизованному гепарину (см. Шинг с сотр. Seitnce 223: 1296 1298 (1984) и Клаксбурн с сотр. см. выше) и может быть элюирован с высокими концентрациями NaCl (т.е. 1,5 М), сделан вывод о том, что bFGF имеет ровное или более высокое сродство к сукральфату по сравнению с гепарином.
B. Сукральфат-сефарозная хроматография.
Сукральфат/сефарозную колонку готовили смешиванием 0,1 г сукpальфата с8 мл (объемом слоя) сефарозы С1 6В (Фармация) в трис-буфере в присутствии 0,6 н. NaCl 2 мкг bFGF в 0,2 мл рассола, содержащего 0,
1
мг BSA, загружали в сукральфатную колонку. Колонку промывали 10 мл трис-буфера в присутствии 0,6 М NaCl и последовательно элюировали с объемной скоростью 15 мл/час
I) градиентом NaCl (80
мл)
0,6 3 М;
II) 20 мл 3 М NaCl и
III) 30 мл 1,5 М уксусной кислоты (pH 2,2).
Отбирали фракции объемом 2 мл. Аликвоты каждой фракции разбавляли, нейтрализовали трис-буфером и анализировали на активность фактора роста согласно методике примера 1.
Как можно видеть из фиг. 5, при смешивании сукральфата в колонке с шариками сефарозы, с помощью градиента NaCl до 3 М не удалось элюировать FGF, который предварительно загружали в колонку. Биологически активный FGF регенерировали с колонки с помощью 1,5 М уксусной кислоты (pH 2,2) и его активность анализировали анализом на активность фактора роста, описанным в примере 1. Полученный результат дополнительно демонстрирует сильное сродство FGF к сукральфату, а также применимость сукральфата для очистки FGF от жидкого образца.
Использование: медицина, для лечения связанных с FGF заболеваний, включая лечение ран и язвенных состояний желудочно-кишечного тракта. Сущность изобретения: описываются способы стабилизации фактора роста фибробласта /FGF/ в тепловых кислотных и/или протеолитических условиях. Такие способы включают объединение или какое-либо иное комплексообразование FGF с солью октасульфата сахарозы /SOS/ и главным образом с его алюминиевой /сукральфат/ или калиевой солями. Изобретение также предусматривает FGF-устойчивую композицию, включающую SOS и FGF. Изобретение также предусматривает различные диагностические методики, в которых используются SOS, а также диагностические наборы, компонентом которых является SOS. Наконец, настоящее изобретение предусматривает способы очистки FGF с помощью SOS. 2 c. и 14 з. п. ф-лы, 5 ил.