Лекарственное средство для лечения вирусных инфекций, спида и/или спид-ассоциированного комплекса (варианты), пептид или его фармацевтически применимая соль (варианты) и нона- и декапептиды - лекарственные средства для лечения вирусных инфекций, спида и - RU2154492C2

Чертежи

Описание

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится преимущественно к области фармакологической промышленности.

Уровень техники
С 1981 г. у мужчин-гомосексуалистов большей частью в Нью-Йорке и Сан Франциско наблюдались до настоящего времени редкие неизлечимые инфекционные заболевания. У всех пациентов находили тяжелые дефекты иммунозащиты. Вскоре после этого Люком Монтанье в Институте Пастера был обнаружен новый вирус, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).

В настоящее время для лечения СПИДа используется только аналог дидезоксинуклеозида 3'-ацидо-3'дезокситимидин (азидотимидин) или цидовудин. Он смягчает симптомы болезни и увеличивает среднюю продолжительность жизни пациентов, болеющих СПИДом (Европейская заявка на патент N 206497). При лечении с помощью аналога дидезоксинуклеозида 3'-ацидо-3'дезокситимидин получают образование устойчивых штаммов вируса и отягчающие побочные действия на костный мозг. Другие медикаменты находятся в клиническом испытании. В выложенной заявке ФРГ N 3935580 описывается применение 1-октадецил-2-метил-глицеро-3-фосфохолина для получения лекарственных средств для борьбы с ВИЧ-инфекциями. В Европейской заявке на патент N 493 378 описывается применение 2'-3'-дидеоксигуанозина или моно- или трифосфатов 2'-3'-дидеоксигуанозина для той же цели.

Все эти вещества находятся еще на этапе клинической разработки и еще не достигли рыночной готовности. Лекарственные средства, используемые в области антивирусной химиотерапии, не обладают в настоящее время желательной избирательностью. Таким образом существует большая потребность в хорошо переносимых, сильнодействующих медикаментах, которые не только замедляют течение болезни, но и препятствуют размножению вирусов, и, кроме того, могут стабилизировать ослабленную иммунную систему пациентов.

Сущность изобретения
Неожиданно было обнаружено, что в опыте по скринингу СПИДа на клетках CEM-IW декапептиды, аналогичные LHRH, согласно формулам II - VIII имеют анти-ВИЧ действие, а также стимулируют рост клеточных культур. Предметом изобретения является получение лекарственного средства на основе пептидных LHRH-антагонистов. Сами соединения имеют незначительную токсичность при самой высокой дозировке при применении.

Аминокислотная последовательность LHRH имеет следующую форму:
LHRH = p-Glu¹-His²-Trp³-Ser⁴-Tyr⁵- Gly⁶-Leu⁷-Arg⁸-Pro⁹-Gly¹⁰-NH₂ . Общая формула I описывает предложенные в изобретении пептиды:
Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-xxx-A-B5-yyy-zzz-Arg-Pro-D-Ala-NH₂, (I)
причем xxx = D-Pal (3), D-Phe (4CI)
yyy = D-Cit, D-Lys (R), D-Hcl
R может иметь значения (C₁-C₄)-ацил или (C₁-C₁₀)-алкил.

zzz = L-Leu, Nle, Nva, t-Leu
A = Ser, Ser (сахар)
Сахар может принимать значения глюкозы, галактозы, аллозы, альтрозы, маннозы, гулозы, идозы или талозы.

В = Туг, Lys (Nic), Mop,
а также фармацевтически приемлемые соли пептидов, как например, гидрохлорид, трифторацетат, ацетат, сульфат, фосфат, месилат или тосилат.

Применяемые сокращения для аминокислот, пептидов и их производных рекомендованы комиссией по биохимической номенклатуре Международного союза по чистой и прикладной химии и Международного союза по биохиии (European J. Biochem, 1984, 138, 9-37).

Сокращения для менее употребительных аминокислот:
Dpa обозначает 2,2-диаминопропионовую кислоту
Nal обозначает 3-(2-нафтил)-аланин,
Thi обозначает β 2'-тиенилаланин,
Tpi обозначает 2,3,4,9-тетрагидро-1H-пиридо-[3,4-b]-индол-3- карбоновую
Nic обозначает никотиноил
Mop обозначает 4-(морполинометил)-фенилаланин
Особенно предпочтительные соединения согласно общей формуле I имеют следующие аминокислотные последовательности:
Формула II = [Ac-D-Nal(2)¹, D-Phe(pCl)², D-Pal(3)³, D-Cit⁶, Nle⁷, D-Ala¹⁰]-LHRH
Формула III = [Ac-D-Nal(2)¹, D-Phe(pCl)², D- Pal(3)³, D-Cit⁶, Nva⁷ , D-Ala¹⁰]-LHRH
Формула IV = [Ac-D-Nal(2)¹, D-Phe(pCl)², D-Trp³, D-Cit⁶, D-Ala¹⁰]-LHRH
Формула V = [Ac-D-Nal(2)¹, D-Phe(pCl)², D-Pal(3)³, D-Cit⁶, D-Ala¹⁰]-LHRH
Формула VI = [Ac-D-Nal(2)¹, D-Phe(pCl)², D-Pal(3)³, D-Cit⁶, D-Ala¹⁰]-LHRH
Формула VII = [Ac-D-Nal(2),¹ D-Phe(pCl)², D-Pal³, D-Cit⁶, t-Leu⁷, D-Ala¹⁰ ]-LHRH
Формула VIII = [Ac-D-Nal(2)¹, D-Phe(pCl)², D-Pal(3)³, D-Cit⁶, Ala⁹, D-Ala¹⁰]-LHRH
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Предложенные в изобретении олигопептиды синтезируются в соответствии с общепринятыми известными в литературе способами. Обобщенное описание рассматриваемого способа имеется, например, в M.Bodannszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 1984.

Принципы твердофазного синтеза полипептидов рассматриваются, например, в учебнике J.M. Stewart J.D.Young, Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chem. Co. , Rockford, II, 1984 (2. Auflage) и в обзорной статье L. Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res. 30, 705-749 (1987).

Синтез пептидов согласно формулам II - VIII осуществлялся согласно блок-схеме на метил-бензидриламин-смоле (товарная форма- гидрохлорид) фирмы Advanced Chem. Tech/Louisville (Kentucky), USA, которая соответственно до присоединения C-концевого Boc-D- аланина была превращена с помощью 10%-ного триэтиламина в дихлорметане (V/V) в свободное основание.

Все последующие N- α -Boc-защищенные аминокислоты были связаны в тройном молярном избытке в присутствии диизопропилкарбодиимида и 1-гидроксибензотриазола в CH₂Cl₂/DMF в течение 90 мин, в дихлорметан/диметилформамид-смеси состава 80/20 (V/V) и Boc-защищенная группа была отщеплена путем получасового воздействия 50%-ной трифторуксусной кислоты в дихлорметане. Остатки свободных аминофункций были блокированы путем ацетилирования в пятикратном избытке ацетилимидазола в дихлорметане. Последовательность стадий реакции синтеза пептидов на смоле следует из блок-схемы. Для отщепления пептидов, связанных со смолой, соответствующий конечный продукт твердофазного синтеза высушивали в вакууме и обрабатывали в 500-кратном избытке HF/анизола 10:1 (V/V) в течение 45-60 мин при температуре 0^oC.

После отгонки HF и анизола в вакууме неочищенные пептидамиды при перемешивании с безводным простым этиловым эфиром выпадали в виде белых твердых веществ. Отделение от имеющихся полимерных носителей осуществлялось путем промывания 50%-ной (V/V) водной уксусной кислотой. Путем щадящего концентрирования уксуснокислых растворов в вакууме могли быть получены соответствующие пептиды в виде высоковязких масел, которые после подачи абсолютного простого эфира постепенно превращались на холоде в белые твердые вещества. Неочищенные пептиды выделяли, промывали на фритте абсолютным простым эфиром и высушивали в вакууме.

Препаративная очистка осуществлялась с помощью жидкостной хроматографии высокого давления в указанных условиях:
Параметры для препаративной жидкостной хроматографии высокого давления:
Приборы: Насос фирмы Шимадзу LC-8A Детектор фирмы Шимадзу SPD-6A Интегратор фирмы Шимадзу C-Р4А Контроллер фирмы Шимадзу SCL-6A
Реактивы: Ацетонитрил Lichrosolv Merck ТИП. 30 Трифторуксусная кислота Fluka N 91700 Чистая вода (Seralpur-приложение)
подвижная фаза A: 970 мл воды (VE-вода чистая) +30 мл ацетонитрила +1 мл трифторуксусной кислоты
подвижная фаза B: 700 мл воды (VE-вода, чистая) +700 мл ацетонитрила +1 мл трифторуксусной кислоты
Скорость протока: 40 мл/мин
Давление: 14 бар
Среднее время пробега препаративного прохождения: примерно от 30 до 40 мин.

Идентичность всех синтезированных пептидов была доказана после очистки с помощью жидкостной хроматографии высокого давления путем аминокислотного анализа, масс-спектрометрии и¹ H-ЯМР-спектроскопии.

Блок-схема для твердофазного синтеза LHRH-пептидов: повторяющиеся циклы твердофазного синтеза объединены в таблице 1; этапы 1-17 описывают необходимую последовательность операций для связи соответственно одной аминокислоты.

Продукт синтеза согласно вышеуказанной блок-схеме:
Ac-D-Nal(2)-D-Phe (4Cl)-Xxx-A-B-Yyy-Zzz-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (согласно формуле I)
Полнота синтеза была проверена с помощью теста на хлоранил по Th. Christensen; Acta Chem. Scand, В 33, 763 (1979) и с помощью Keiser-теста на нингидрин по Stewart, Young.

Изобретение касается способа получения лекарственного средства для терапии вирусных инфекций, предпочтительно для лечения СПИДа. Далее описываются новые пептиды и их синтез, которые можно применять для антивирусной терапии.

Сами пептиды имеют незначительную токсичность при очень высокой дозировке. По сравнению с проверенным контрольным соединением азидотимидина величины EC50 в опыте на NCl в исследуемых пептидах находятся между 5,9•10^-7 моль/л и 2,0•10^-5 моль/л.

Указанное контрольное соединение аналог дидезоксинуклеозида 3'-ацидо-3'дезокситимидин (азидотимидин) имело, например, величину EC50 3,10•10^-9 моль/л.

Все соединения дозировались в диапазоне от 10^-4 до 10^-8 моль/л. Поэтому указанная величина IC50 (ингибирующая концентрация, при которой в неинфицированной культуре погибает 50% клеток) больше, чем самая высокая дозировка.

Обработанная инфицированная культура показывает величину EC50 4,5•10^-5 моль/л. Так как величины для обработанной, неинфицированной культуры не снижаются до величины IC50, то для величины IC50 может указываться только величина для самой высокой дозировки, т.е. IC50 = >3,3•10^-5 моль/л. Терапевтический индекс (Tl 50 = IC50/EC50) больше, чем 7,30.

Описание скрининг-метода на анти-ВИЧ активность
Способ пригоден для поиска биологически активных веществ, эффективных на всех фазах вирусного размножения. Принцип теста заключается в умерщвлении лимфоцитов T4 посредством вируса ВИЧ.

Небольшое количество вируса ВИЧ вводится в клеточные культуры. Необходимо, по меньшей мере, два полных вирусных воспроизводимых цикла, для того чтобы умерщвлить лимфоциты T4 и проанализировать результаты.

Биологически активные вещества, реагирующие с вирусоподобными частицами, клетками или продуктами вирусных генов для взаимодействия с вирусной активностью и таким образом блокирующие размножение вирусов, предохраняют клетки от погибания и лизиса.

Для того чтобы можно было исследовать большое количество клеток, инфицированных вирусами, тестовая система автоматизирована. Однако дегенерирующие, денатурирующие или быстро метаболизирующиеся соединения не обнаруживаются тестовой установкой с достаточной точностью.

В качестве положительного контроля служит для теста аналог дидезоксинуклеозида 3'-ацидо-3'дезокситимидин (азидотимидин) и DDC.

Способы проведения опыта
1. Лимфоциты T4 (CEM -линия клетки) смешиваются в соотношении вирус: клетка, примерно, 1:0,05 с вирусом на микротитрационной планшете.

2. Испытуемое вещество, если не указано иначе, растворяется в диметилсульфоксиде (DMSO) и разбавляется в соотношении 1: 200 (массовые части). Дальнейшее разбавление проводится полулогарифмическими шагами с помощью диметилсульфоксида (DMSO) и затем вводится как в инфицированные, так и в неинфицированные клеточные культуры.

3. Культуры инкубируются в течение 6-7 дней при температуре 37^oC в атмосфере 5% CO₂.

4. Соль тетразолия XTT добавляется в клеточные культуры и клеточные культуры инкубируются дальше, чтобы с помощью выживающих клеток могла осуществляться цветная реакция формазана при соединении с феназинметосульфонатом.

5. Отдельные клеточные культуры анализируются спектрофотометрическим способом и для подтверждения защитного эффекта выжившие клетки исследуются под микроскопом.

6. Обработанные инфицированные вирусом клетки сравниваются с обработанными неинфицированными клетками. Дальнейшие сравнения (необработанные, инфицированные клетки и необработанные неинфицированные клетки, углубления, содержащие биологически активное вещество, не содержащие клеток) проводятся на такой же планшете.

7. Проверяется активность испытанного соединения.

Пептиды согласно примерам 1-7 исследовались на их анти-ВИЧ активность (NCl) по скрининг-методу. Все пептиды были или активными или умеренно активными. Значения EC50, соответствующие найденным активностям, находятся в интервале 4-15 мкМ. Результаты исследований сведены в таблице 2.

Другие экспериментальные подробности можно получить в литературе: Weislow, J. Nat. Cane. Inst. 81 (8), стр. 577 (1989).

Таким образом предложенные в изобретении пептиды пригодны для получения лекарственных средств для лечения СПИДа и для борьбы с болезнями, связанными с вирусом иммунодефицита (СПИД-ассоциированный комплекс).

Указания по дозировке:
Дозировка предложенного в изобретении лекарственного средства составляет от 0,01 мг до 10 мг при ежедневном приеме.

Пример 1
Пептид согласно формуле II:
Масс-спектр: [М+H⁺] = 1431
¹H-ЯМР-спектр (DMSO-d₆, 250 МГц), δ в частях на миллион: 8,65-7,1; много мультиплетов, ароматические и NH-сигналы: 7,0 и 6,6, 2,1 4H, ароматически H Tyr; 5,95 m, NHCONH₂ Cit: 4,8 - 4,1, несколько мультиплетов, C_dH: 3,75 и 3,5, 2 мультиплетов; алифатические H; 3,2-2,65, несколько мультиплетов, CβH алифатические и ароматические аминокислоты; 2,1-1,3, несколько мультиплетов, остаточные алифатические H; 1,780, d, 3H, CβH Ala; 0, 80, m, Nle
Пример 2
Пептид согласно формуле III:
¹H-ЯМР-спектр (DMSO-d₆, 250 МГц) δ в частях на миллион: - (8,65-7,1; много мультиплетов, ароматические и NH-сигналы; 7,0 и 6,6, 2d 4H, ароматически H Tyr; 5,9 m, NHCONH₂ Cit; 4,8 - 4,1, несколько мультиплетов, C₂H: 3,75 и 3,5, 2 мультиплетов; алифатические H; 3,2-2, 65, несколько мультиплетов, CβH алифатические и ароматические аминокислоты; 2,1-1,25, несколько мультиплетов, остаточные алифатические H; 1,70, 5, 3H, CH₃CO^-; 1,20, d, 3H, CβH, Ala; 0,85, m, 3H, Nva
Масс-спектр: [М+H⁺] = 1417
Пример 3
Пептид согласно формуле IV:
Масс-спектр: [М+H⁺] = 1469
¹H-ЯМР-спектр (DMSO-d₆, 250 МГц) δ в частях на миллион: 8,2- 6,5; много мультиплетов, ароматические и NH-сигналы; 5,8 и 5,4, 2 m 3H, NH-CO-NH₂ Citrollia, 4,5, 4,3, 4,2 и 4,0, мультиплеты C_dH, 3,8-2,6, несколько мультиплетов, алифатические и ароматические CβH; 2,0-1,9, несколько мультиплетов, остаточные алифатические протоны: 1,6,5,3 H, CH₃CO^-; 1,1, d, 2H, CβH Ala; 0,7, d, 6H CδH leu
Пример 4
Пептид согласно формуле V, цидовудин: Cetrorelix
Масс-спектр: [М+H⁺] = 1431
¹H-ЯМР-спектр (DMSO-d₆, 250 МГц) δ в частях на миллион: 8,7-7,2, много мультиплетов, ароматические и NH-сигналы; 7,05 и 6,65, 2d, 4H, ароматические H Tyr; 5, 85, m NHCONH₂, Cit; 4,8-4,1, несколько мультиплетов, CαH; 3,8 и 3,55, 2m, алифатические H; 3,3-2,7 CβH алифатические и ароматические аминокислоты; 2,1-1,3, несколько мультиплетов, остаточные алифатические сигналы; 1,7,5,3 H CH₃CO^-; 1,2, d, 3H, CβH Ala; 0,85 2d, 6H, Cδ H leu
Пример 5
Пептид согласно формуле VI:
Масс-спектр: [М+H⁺] = 1444
¹H-ЯМР-спектр (DMSO-d₆, 250 МГц) δ в частях на миллион: 8,6-7,1, много мультиплетов, ароматические и NH-сигналы; 7,0 и 6,6, 2 d, 4 H, ароматические H Tyr; 4,8-4,0, несколько мультиплетов, CαH; 3,7 и 3,5, 2m, 4H; 3,2-2,7, несколько мультиплетов, CβH ароматические и алифатические аминокислоты; 2, 0-1,0, несколько мультиплетов, остаточные алифатические сигналы; 1,7, 5, 3H, CH₃CO; 1,2, d, 3H, CβH Ala; 0,8, dd, 6H, CδH leu
Пример 6
Пептид согласно формуле VII:
Масс-спектр: [М+H⁺] = 1431
¹H-ЯМР-спектр (DMSO-d₆, 250 MГц) δ в частях на миллион: 8,6-7,1, много мультиплетов, ароматические и NH-сигналы; 7,0 и 6,6, 2d, 4H, ароматические H Tyr: 5,9m NHCONH₂, Cit; 4,8-4,0, несколько мультиплетов, CαH; 3,85 и 3,5, 2 мультиплетов, алифатический H; 3,1-2,7, несколько мультиплетов, CβH ароматические и алифатические аминокислоты; 2,1-1,3, несколько мультиплетов, остаточные алифатические H; 1, 7, 5, 3H, CH₃CO; 1,20, d, 3H, CβH Ala; 0,85, 5, 9H, третбутил, Tle
Пример 7
Пептид согласно формуле VIII
Масс-спектр: [М+H⁺] = 1405
¹ H-ЯМР-спектр (DMSO-d₆, 500 МГц) δ в частях на миллион: 9,1-7,3, много мультиплетов, ароматические и NH-сигналы; 7, 21, dd, 4H, ароматические H p-cl-Phe; 7,0 и 6,6 2d, 4H, ароматические H Tyr; 5,9 и 5,4, 2m, 3H, NHCONH₂ Cit: 4,7-4,1, несколько мультиплетов, CαH; 3,55-2,8, несколько мультиплетов, CβH алифатические и ароматические аминокислоты; 1, 70, 5, 3H, CH₃CO^-; 1,55 и 1,45, 2m алифатические сигналы Arg и Leu; 0,80, dd, 6H, CδH leu ароматические аминокислоты: 1, 70, 5, 3H, CH₃CO^-; 1,55 и 1, 45, 2m алифатические сигналы Arg и Leu; 0,80, dd, 6H. CδH Leu
Пример 8
Состав таблеток для защечного (например, подъязычного) введения:
1. Антагонист LHRH - 10 мг
Связующий сахар, USP¹ - 86,0 мг
(¹сухой порошок, фармакопея США)
Кальция стеарат - 4,0 мг
2. Антагонист LHRH - 10 мг
Связующий сахар, USP - 88,5 мг
Магния стеарат - 1,5 мг
3. Антагонист LHRH - 5,0 мг
Маннит, USP - 83,5 мг
Магния стеарат, USP - 1,5 мг
4. Антагонист LHRH - 10,0 мг
Предварительно желатинизированный крахмал, USP - 10,0 мг
Лактоза, USP - 74,5 мг
Предварительно желатинизированный крахмал, USP - 15,0 мг
Магния стеарат, USP - 1,5 мг
Способ А. Антагонист LHRH растворяют в достаточном количестве воды с образованием влажной грануляции при смешивании с порцией сахара наполнителя. После завершения смешивания грануляцию высушивают в поддоне устройства для высушивания (например, эксикаторе). Высушенную грануляцию проверяют для удаления всяческих крупных комков и затем смешивают с оставшимися компонентами. Полученную гранулированную смесь подвергают сжатию в стандартном устройстве для таблетирования с получением таблеток специальной массы.

Способ Б. При этом методе производства все составы содержат 0,01% желатина, USP. Желатин первым растворяют в водном растворителе грануляции с последующим добавлением аналога LHRH. Последующие стадии такие же, как описано выше в способе А.

Пример 9
Состав для внутримышечных инъекций пролонгированного действия
Внутримышечный препарат продолжительного действия - Гель кунжутного масла
Антагонист LHRH -10,0 мг
Алюминия моностеарат, USP - 20,0 мг
Кунжутное масло - до 1,0 мл
Алюминия моностеарат соединяют с кунжутным маслом и нагревают при перемешивании до 125^oC до образования прозрачного желтого раствора. Полученную смесь затем стерилизуют автоклавированием и оставляют для охлаждения. Антагонист LHRH добавляют в асептических условиях при растирании. Особенно предпочтительными антагонистами LHRH являются плохо растворимые соли, например цинковые соли дубильной кислоты (таннаты), памоаты и т.п. Они демонстрируют исключительно продолжительное действие.

Пример 10
Внутримышечный препарат продолжительного действия
Биодеградируемые полимерные микрокапсулы
Антагонист LHRH - 1%
Сополимер гликолид/лактид 25/75
(характеристическая вязкость 0,5) - 99%
Микрокапсулы (0^o - 150^o) указанного выше состава суспендируют в следующей смеси:
декстроза 5,0%, Na-КМЦ 0, 5%, бензиловый спирт 0,9%, Твин 80 0,1%, вода очищенная до 100%; 25 мг микрокапсул суспендируют в 1,0 мл носителя.

Пример 11
Водный раствор для внутримышечных инъекций
Антагонист LHRH - 500 мг
Желатин неантигенный - 5 мг
Вода для инъекций - до 100 мл
Желатин и антагонист LHRH растворяют в воде для инъекций, затем раствор подвергают фильтрованию в стерильных условиях.

Пример 12
Состав для ректального введения
Носитель суппозитория для ректального введения
Антагонист LHRH - 5,0 мг
Витепсол H15 - 20,0 мг
Антагонист LHRH соединяют с расплавленным витепсолом H15, перемешивают и разливают в формы по 2 мг.

Реферат

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается лекарственного средства для лечения вирусных инфекций, СПИДа и/или СПИД-ассоциированного комплекса. Предлагаются LHRH-антагонистические нона- и декапептиды, пригодные для использования в изготовлении лекарственных средств для лечения вирусных инфекций, СПИДа и/или СПИД-ассоциированного комплекса, а также для изготовления лекарственных средств для иммуностимуляции. Изобретение обеспечивает не только замедление течения болезни, но и препятствует размножению вирусов и, кроме того, может стабилизировать ослабленную иммунную систему пациентов. 13 с.п.ф-лы, 2 табл.

Формула