Фармацевтическая композиция с использованием комбинированных вариантов гонадотропин-рилизинг-гормона (gnrh) в качестве иммуногена - RU2537138C2
Код документа: RU2537138C2
Чертежи
Описание
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящая группа изобретений относится к области иммунологии, эндокринологии, онкологии, репродукции, а в частности основана на одновременном создании сильного иммунного ответа против всех молекул GnRH; главным образом, против карбоксильных и аминоконцевых групп гормона, получая, за счет этого, преимущество наилучшего воздействия на иммунную систему молекул GnRH либо в своей естественной, либо в миметической форме, включая варианты, основанные на D-аминокислотах, когда они связаны с молекулой-носителем; в одном случае посредством карбоксильной концевой группы, а в другом случае посредством аминотерминальной группы для того, чтобы образовать 2 различные иммунные молекулы. В дальнейшем они будут упоминаться как карбоксильнотерминальный вариант и аминотерминальный вариант соответственно.
СОСТОЯНИЕ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Гонадотропин-рилизинг-гормон (GnRH), также известный как рилизинг-гормон лютеинизирующего гормона (LHRH), представляет собой гипоталамический декапептид, который воздействует на передний гипофиз, вызывая выделение в кровь фолликулостимулирующего гормона (FSH) и лютеинизирующего гормона (LH). В то же время это стимулирует синтез тестикулярных стероидов наряду с развитием мужских половых желез у молодых особей мужского пола, а также особей мужского пола в подросткового возраста. Что касается особей женского пола, то данный гормон стимулирует развитие яичников, фолликулов и синтез яичниковых стероидов, а также овуляцию.
Роль LHRH в регулировании фертильности является хорошо известной. Таким образом, с гонадотропинами и половыми стероидными гормонами, в частности эстрогенами и тестостероном, связано большое количество заболеваний. Такие заболевания включают рак молочной железы, матки и других видов гинекологического рака, либо такие заболевания, как фиброз эндометрия, фиброз матки, рак предстательной железы и доброкачественная гиперплазия предстательной железы.
Кастрация, также известная как гонадэктомия, хирургическая либо химическая, составляет один из наиболее эффективных способов в терапевтических вмешательствах при гормонзависимых новообразованиях (Huggins C, Hodges CV. Studies on prostatic cancer. I. The effect of castration of estrogen and androgen injection on serum phosphatases in metastatic carcinoma of the prostate. Cancer research 1941; 1: 293-7). В отрасли животноводства кастрация применяется для предупреждения неприятного запаха и вкуса мяса у взрослых животных-самцов, что представляет собой экономическую важность (Proc. Soc. Exp. Biol. Med 175:259-281, 1984. Meloen RN et al. Efficient immunocastration of male piglets by immunoneutralization of GnRH using a new GnRH-like peptide. Vaccine 1984; 12: 741-747. Crowley WF, Vale WW, Rivier J, MacArthur JW: LHRH in hypogonadotropic hypogonadism. In ZatuchniGL, Shelton JD, Sciarra JJ (eds): «LHRH Peptides as Female and Male Contraceptives». Philadelphia: Harper and Row Publishers, 1981, pp. 321-333).
Аналоги GnRH находятся среди наиболее часто применяемых лекарственных средств для лечения рака предстательной железы, яичников и молочной железы. Они оказывают свое действие через выключение эстрогенов или андрогенов и/или прямое действие на раковые клетки (Schally, Comaru-schally AM, Redding TW: Anti-tumor effects of analogues of hypothalamic hormones in endocrine-dependent cancers). Прямой механизм, через который оказывают свое действие данные аналоги и антагонисты GnRH, если они вводятся длительно, связаны с десенсибилизацией и дерегуляцией GnRH-рецепторов. О некоторых из данных сильнодействующих аналогов и антагонистов сообщалось различными авторами (Waxman JH, Wass JAH, Hendry WF, Whitfield HN, Besser GM, Malpas JS, Oliver RTD: Treatment with gonadotropin releasing hormone analogue in advanced prostate cancer. Br. Med. J. 286:1309-1312, 1983. Allen JM, O'Shea JP, Mashiter K, Williams G, Bloom SR: Advanced carcinoma of the prostate: Treatment with gonadotropin releasing hormone agonist. Br. Med. J. 286:1607-1609, 1983). (Couillard S. Labrie C.Belanger A.Candas B. Pouliot F. Labrie F. “Effect of dehydroepiandrosterone and the antiandrogen EM-800 on growth of human ZR-75-1 breast cancer xenografts”. J. Nat. Cancer Inst., May 20, 772-778, 1998; Kolle S. et al.: “Expression of growth hormone receptor in human prostatic carcinoma and hyperplasia”. Int. J. Oncol., vol. 14, № 5, p. 911-916, 1999).
Существует альтернативный вариант, когда применение аналогов GnRH/LHRH является активной иммунизацией нативным гормоном либо его миметическими пептидами, которые могут служить в качестве вакцин, если они связаны с более иммуногенными молекулами, такими как столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин или его эпитопы, KLH (гемоцианин лимфы улитки) или BSA (альбумин бычьей сыворотки), среди других (Gual C, Garza-Flores J, Menjivar M, Gutierrez-Najar A, Pal R, Talwar GP. Ability of an anti-Luteinzing hormone-releasing vaccine to inhibit gonadotropins in postmenopausal women. Fertil Steril 1997; 67: 404-7).
О вакцинации с применением GnRH/LHRH в качестве собственных антигенов были опубликованы различные сообщения, напр. US № 5897863; US № 6132720. Однако, с началом данной практики, одной из существующих проблем является недостаточная способность вызывать сильный иммунный ответ для выработки эффективных уровней анти-GnRH-антител. Это происходит главным образом в результате малых размеров и аутологичной природы данного декапептида у всех млекопитающих. Вот почему, начиная с первых же попыток, значительную помощь оказывает опыт, накопленный в отношении подобных молекул и применения носителей, которые повышают различимость данных пептидов для иммунной системы.
Эксперименты с кандидатными вакцинами, основанными на GnRH или его миметических пептидах, связанных с молекулами-носителями столбнячного анатоксина, проводили на самцах свиней, грызунов и приматов. Данные эксперименты продемонстрировали атрофию яичек, предстательной железы, а также яичников у самок (Talwar GP, Raina K, Gupta J.C, Ray R, Wadhwa S, Ali MM. A recombinant Luteinizing-hormone-releasing hormone immunogen bioeffective in causing prostatic atrophy. Vaccine 2004; 22:3713-372. Millar RP, King JA, Davidson JS, Milton RC. Gonadotropin-releasing hormone-diversity of functions and clinical applications. S Afr Med J 1987; 72: 748-755). Значительная изменчивость результатов, наблюдаемых среди индивидов иммунизированной группы, даже при применении больших доз, является еще одним недостатком, часто относящимся к применению иммуногенов, основанных на GnRH/LHRH, в качестве вакцин против фертильности у домашних животных и животных, представляющих экономический интерес. Это усугубляется проблематичным применением высокореактогенных адъювантов, таких как полный адъювант Фрейнда (Hoskinson et al, Austr. J. Biotech; 4, 166-170 (1990); Bonneau et al., J. Anim. Sci. 72, 14-20 (1994); U.S. Pat. № 4608251; Int. patent appl. WO 88205109; Caraty et al., C.R. Acad. Sc. Paris, t. 303, Serie III, № 16, 673-676 (1986); Falvo et al.; J. Anim. Sci. 63, 986-994 (1986)).
Как и в патенте WO 98/27111 «Preparado vacunal para la inmunocastracion reversible de mamiferos» R. Bringas с соавт., описаны положительные результаты, относящиеся к иммунокастрации свиней препубертатного возраста, применяя мутированный GnRH, связанный со столбнячным анатоксином (ТТ) в процессе синтеза и добавленный в полный адъювант Фрейнда (CFA). Однако широкое применение данного вакцинального препарата не показало наблюдаемую однородность у животных пубертатного возраста.
Первые клинические испытания на пациентах с прогрессирующим раком предстательной железы, а также на женщинах в постменопаузе, с целью исследования ингибирования гонадотропинов, впервые проведенные в десятилетии 90-х годов прошлого столетия, были опубликованы Talwar GP с соавт ((Talwar GP. Vaccines for control of fertility and hormone-dependent cancers. Immunology and Cell Biology 1997; 75: 184-189. Gual C, Garza-Flores J, Menjivar M, Gutierrez-Najar A, Pal R, Talwar GP. Ability of an anti-Luteinizingn hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in post-menopausal women. Fertil Steril 1997; 67: 404-7). Кроме приведенных выше вариантов, которые были использованы, LHRH, химически конъюгированный со столбнячным анатоксином (ТТ) и с дифтерийным анатоксином (DT) в качестве носителей, часто вызывает антигаптенную иммуносупрессию (Schutze M-P, Leclerc C, Jolivet M, Audibert F, Chedid L. Carrier-induced epitopic suppression, a major issue for future synthetic vaccines. J immunol 1985; 135: 2319-22. Gaur A, Arunan K, Singh OM, Talwar GP. By pass by an alternate carrier of acquired unresponsiveness to HCG upon repeated immunization with tetanus conjugated vaccine. Int immunology 1990; 2(2):151-5. Sad S, Gupta HM, Talwar GP, Raghupathy R. Carrier induced suppression of the antibody response to self hapten. Immunology 1991; 74:223-7), in addititon to the loses reported in conjugation process (Gual C, Garza-Flores J, Menjivar M, Gutierrez-Najar A, Pal R, Talwar GP. Ability of an anti- Luteinizing-hormone-releasing hormone vaccine to inhibit gonadotropins in postmenopausal women. Fertil Steril 1997; 67: 404-7).
В последнее время сообщалось, что группа североамериканских исследователей применяла молекулы, обеспечивающие совместное действие Т-эпитопов, происходящие от антигенов микроорганизмов, ответственных за частые инфекционные заболевания у детей. Их связывали с GnRH посредством его аминотерминального участка в том самом процессе химического синтеза с целью обнаружения гораздо более сильного и универсального ответа (Finstad C.L, Wang C.Y, Kowalsky J, Zhang M, Li M, Li X, Xia W, Bosland M, Murthy k.k, Walfield A, Koff W.C, Zamb T.J. Synthetic Luteinizing hormone releasing hormone (LHRH) vaccine for effective androgen deprivation and its application to prostate cancer immunotherapy. Vaccine 2004; 22: 1300-1313). Тем не менее несмотря на хороший иммунологический ответ благодаря применению 4 эпитопов Т-хелперов в одном и том же иммуногене, было необходимо применение повторной иммунизации с масляными адъювантами. Приготовление указанного препарата представляет собой трудный процесс для воспроизведения, очень дорогостоящий и нелегкий для осуществления в крупных промышленных процессах. В этом случае особенно разрабатываемой является потенциальная возможность иммунологического ответа, основываясь на разнообразии молекул-носителей, не принимая во внимание возможность, что можно было бы предложить смесь, где могла бы присутствовать не содержащая аминогруппу либо карбоксильную группу форма GnRH либо его миметики.
В заключение, необходимо обратить внимание, что в литературе имеется некое указание на иммуногенную способность различных иммуноконъюгатов GnRH или их миметиков, а также разные результаты, полученные разными авторами, которые применяли иммунные молекулы GnRH, конъюгированные посредством их карбоксильных и аминных концов, включая применение дополнительных аминокислот, которые облегчают конъюгацию. Аналогичным образом, обнаружены сообщения о применении различных молекул-носителей, связанных с одним из их концов, полученных посредством общепризнанного синтеза пептидов или посредством рекомбинации ДНК или посредством сложных молекул в виде «тандема» и MABS. Однако, что касается применения 2-вариантной готовой формы GnRH, соединенной с молекулой-носителем (одна через амино конец, а другая посредством карбоксильного конца, используемых в одном и том же фармацевтическом препарате), еще не было обнаружено сообщений, касающихся синергического эффекта на иммунный ответ, а также уровней половых гормонов и действия на намеченные органы (предстательную железу, яички, молочную железу, яичники).
Процесс конструирования предложенных молекул включает химическое связывание посредством синтеза, конъюгации или клонирования гибридного белка GnRH или его миметиков с молекулами-носителями. Молекулы-носители могут представлять собой либо нативные белки, либо их фрагменты, либо эпитопы, например: столбнячный анатоксин, белок Р64К Neisseria Meningitidis, поверхностный антиген гепатита В, ядерный антиген вируса гепатита и т.д.
Фармацевтический препарат согласно данному документу, вводимый в той же самой готовой форме, вызывает синергический иммунологический ответ, который нацелен против амино- и карбоксильных концов, не содержащих GnRH. В результате, достигается быстрая и значительная элиминация мужских и женских половых гормонов (андрогенов и эстрогенов, соответственно), которая в свою очередь вызывает мощную иммунокастрацию. Данная готовая форма будет иметь непосредственное применение при иммунокастрации домашних животных и животных, представляющих экономический интерес, а также в регулировании человеческой фертильности и в лечении гормоночувствительных опухолей, таких как рак предстательной железы, молочной железы, яичников, яичка и эндометрия, а также гипофиза и слюнных желез, и других опухолей. Уменьшение объема намеченных органов, понижение массы опухоли и увеличение выживаемости индивидов находятся среди явных эффектов данной готовой формы.
НОВИЗНА И ПРЕИМУЩЕСТВА ПРЕДЛОЖЕННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение основано на комбинации, в одной и той же схеме иммунизации, 2 вариантов гормона GnRH/LHRH, либо естественного, либо его миметиков, включая обратно перевернутые варианты, синтезированные из D-аминокислот. В данном случае варианты GnRH получают посредством химического синтеза, конъюгации или использования химерных ДНК GnRH, неясным образом связанной амино- и карбоксильным терминальными концами с молекулой-носителем типа ТТ или ее эпитопами. Очевидная цель состоит в том, чтобы найти более быстрый и более сильный иммунологический ответ против эндогенной GnRH. В таком случае, карбоксильный и аминотерминальные варианты (касающиеся участка связывания GnRH с молекулой-носителем) могут быть введены одновременно в один и тот же препарат или разделены, в последовательной или поочередной форме в одной и той же схеме иммунизации.
Новизна данного изобретения состоит в синергическом эффекте, которое оно оказывает на иммунную систему, при активной иммунизации 2 вариантами GnRH, приведенными ранее, называемыми карбоксильный конец (вариант, в которой носитель связан с карбоксильным концом GnRH или его миметиков) и аминоконец (вариант, в которой носитель связан с аминоконцом GnRH или его миметиков). После того, как данные варианты вводят в виде частей одной и той же готовой формы, они вызывают быструю и эффективную элиминацию мужских и женских половых гормонов (андрогенов и эстрогенов, соответственно), обеспечивая значительное иммунокастрационное действие. Следовательно, они являются эффективными в качестве иммунной кастрации домашних животных и животных, представляющих экономический интерес. С другой стороны, оно также может быть использовано при регулировании человеческой фертильности, а также при лечении человеческих гормоночувствительных опухолей: предстательной железы, молочной железы, яичников, эндометрия, яичек, гипофиза, слюнных желез и других опухолей. Эффект лечения выражается в виде уменьшения объема намеченных органов, понижения массы опухолей и повышения выживаемости индивидов.
Описанная комбинация не только отображает сумму действий двух вариантов (карбоксильного и аминоконцов), но также синергический эффект на иммунную систему выражен аналогичным образом на намеченных органах, после того как их вводят в виде описанных ранее комбинаций.
В качестве преимущества по поводу описанных ранее видов лечения, настоящее изобретение демонстрирует более быстрое и более сильное действие на намеченные органы (яички, предстательную железу, яичники и т.д.); и/или на опухоли, зависимые от половых гормонов (предстательной железы, молочной железы, яичников, эндометрия, слюнных желез, яичек и т.д.), вследствие достигнутого синергизма, полученного за счет смеси карбоксильной и аминотерминальных вариантов.
Комбинация предложенных вариантов показывает тесную связь между полученными титрами анти-GnRH-антител и уменьшением половых гормонов (андрогенов и эстрогенов) до уровней кастрации. Это, в свою очередь, относится к эффекту, оказываемому на намеченные органы. Данные результаты, кроме эффектов, достигаемых при использовании масляных адъювантов (Монтанид) предоставляют возможность использования других менее реактогенных (безвредных) адъювантов; таких как соли алюминия. Упомянутые выше аспекты предлагают значительное преимущество смеси амино- и карбоксильнотерминальных вариантов GnRH над любым другим основанным на гормоне GnRH иммуногене, о котором сообщалось до настоящего времени.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Иммунный ответ, вызываемый у здоровых взрослых крыс посредством иммунизации с использованием карбоксильных и аминотерминальных пептидных вариантов GnRH в одной и той же готовой форме или кандидатной вакцине, предоставляет возможность получения лучших результатов по сравнению с другими схемами иммунизации, в которых используется только независимый вариант (карбоксильный или аминоконец). Описанные результаты демонстрируют синергизм как при вызывании иммунокастрации, так и при лечении доброкачественных пролиферативных заболеваний (напр., эндометриоз) или злокачественных (рак предстательной железы, молочной железы, эндометрия, яичников, яичек, поднижечелюстных желез) и других чувствительных к элиминации гормонов.
В отличие от применявшихся ранее методик, нативные молекулы GnRH или их миметики, особенно GnRHm1, могут быть непосредственно связаны с белком-носителем в процессе пептидного синтеза или химически конъюгированы или клонированы в виде гибридных белков с высокоиммуногенными молекулами с образованием двух различных вариантов: амино- и карбоксильных концов. Данные варианты могут быть связаны с некоторыми из наиболее часто сообщаемых белков-носителей или их эпитопами, то есть столбнячным анатоксином, дифтерийным анатоксином, белком Р64К Neisseria Meningitidis, поверхностным антигеном гепатита В, ядерным антигеном гепатита В и т.д., для достижения быстрого и сильного иммунологического ответа с синергическим эффектом, приводящего к элиминации GnRH, а также элиминации гормонов, вовлеченных в каскад GnRH/LH-FSH/тестостерон/эстрогены.
Карбоксильный и аминотерминальный варианты могут быть использованы в одной и той же готовой форме в виде различных пропорций, при этом отношение между карбоксильным терминальным вариантом и аминотерминальным вариантом может варьировать от 10:90 до 80:20 (масса/масса). Таким образом, молекула GnRH, которая связана своим карбоксильным терминальным концом, представляет менее, чем 10% от качества общей смеси, и в то же самое время, аминотерминальный вариант представляет, по меньшей мере, 20% общей смеси.
Наилучшие результаты с карбоксильной и аминотерминальной комбинацией получают, при их смешивании в 50% (масса/масса) пропорции каждого варианта.
Аналогичным образом, молекулы GnRH, карбоксильный и аминоконцы могут быть неясным образом связаны в том же самом носителе, в одном случае посредством аминоконца, а в другом посредством карбоксильного конца. В ином случае, один вариант (карбоксильный конец) может быть связан с белком-носителем, тогда как другой вариант (аминоконец) связан с другим белком-носителем. Таким образом, иммуногенная смесь может быть составлена, например, GnRH или его миметиками, связанными в одном случае с носителем в виде ТТ или одним из его эпитопов, а в другом случае с белком Р64К Neisseria Meningitidis или ядерным антигеном вируса гепатита В или его эпитопами, или другой высокоиммуногенной молекулой-носителем.
Данный тип комбинации предоставляет возможность более быстрого и более сильного анти-GnRH иммунологического ответа, с использованием смешанных карбоксильного и аминотерминального вариантов GnRH, добавленных в качестве адъюванта в масляную эмульсию типа Монтанида, или водорастворимых адъювантов типа альбумина и QS 21 в сравнении с другими иммуногенами.
Потенциальная способность описанной готовой формы может быть как будто бы усилена с добавлением иммуностимуляторов, таких как протеолипосомы очень маленького размера (VSSP), полученных из смеси липопротеинов стенки Neisseria Meningitidis с N-Ацетил- или N-гликолил-GM3-ганглиозидами или аналогичным образом при ее смешивании с водорастворимыми адъювантами, наподобие коклеатов или аргинатов.
Как упоминалось ранее, данное изобретение может быть использовано для иммунизации широкого диапазона позвоночных, при этом особенно важно его использование при регулировании фертильности млекопитающих у домашних животных (собак, кошек и т.д.), у диких видов (грызунов, белок и других). Предложенная комбинация обеспечивает повышенные проценты иммуногенности при иммунокастрации свиней, козлов и т.д. с целью избежания нежелательного запаха, появляющегося у мяса и сала данных животных. Другое применение данной комбинации состоит в регулировании фертильности и агрессивности животных, представляющих экономическое значение, таких как быки, буйволы, лошади и другие. В отношении медицины человека, использование данного изобретения имеет непосредственное применение при лечении рака предстательной железы и молочной железы, а также рака матки, яичников, яичек, поднижечелюстных желез, при патологии гипофиза и другой гормоночувствительной неоплазии.
Иммунногенный препарат карбоксильноконцевого типа в качестве одного из компонентов комбинации
Один из компонентов вакцины, карбоксильнотерминальный вариант, может быть в одном из случаев составлен естественной молекулой GnRH или одним из ее миметиков, например GnRHm1 с последовательностью QHWSYPLRPG, присоединенной к Т-хелперному эпитопу столбнячного анатоксина (830-844) (QYIKANSKFIGITEL) или к другим носителям, таким как дифтерийный анатоксин, белок Р64К Neisseria Meningitidis, ядерный антиген вируса гепатита В и т.д., полученным в виде гибридных белков с использованием экспрессирующей системы для генетических конструкций.
Было показано, что химический синтез и привнесение адъювантных свойств масляным адъювантом (типа Монтанида) полного пептида QHWSYPLRPG QYIKANSKFIGITEL обладают сильным эффектом элиминации тестостерона только при 2 иммунизациях животных препубертатного возраста и при 3 или 4 иммунизациях взрослых животных. Полученные титры антител с использованием данного варианта составляли 1/1000-1/2000 для большинства индивидов после четвертой иммунизации с достижением 90% сероконверсии.
Аминоконец: второй компонент комбинации
Аналогичным образом, конструкция естественной молекулы GnRH или одного из ее миметиков, как в случае описанного выше GnRHm1, связанного своим аминотерминальным концом с эпитопом столбнячного анатоксина 830-844 с образованием молекулы (QYIKANSKFIGITELGGQHWSYPLRPG), или ее связи своим аминокислотным концом с пептидом Р48 белка Р64К Neisseria Meningitidis (IPGVAYTSPEVAWVGGGGQHWSYPLRP) или с другими молекулами-носителями вышеупомянутых типов, представляет собой активный компонент с повышенным иммуногенным потенциалом против эндогенного GnRH по сравнению с компонентом, получаемым с помощью уже упомянутого карбоксильнотерминального варианта. Важно, что авторы изобретения обнаружили, что индивиды, иммунизированные ТТ-GnRHm1, демонстрируют естественную сероконверсию GnRH сразу вслед за первой иммунизацией, достигая титров антител от 1:6000 до 1:12000 после третьей или четвертой иммунизации. В свою очередь, аминотерминальный вариант (Р48-Р64К-GnRHm1) вызывает 90% иммунный ответ сразу после одной иммунизации и титры, равные 1:5000 и 1:12000 после четвертой иммунизации. Принимая в расчет, что GnRH представляет собой очень малую аутологичную молекулу, сохраненную у всех млекопитающих, указанные титры можно считать очень значимыми. Однако аминотерминальный вариант не оказывает значительного превосходящего действия на намеченные органы (предстательную железу, яички у самцов или яичники у самок) по сравнению с карбоксильнотерминальным вариантом.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг.1: Схематичное представление аминокислотной последовательности естественной GnRH, вариантов GnRHm1-ТТ, ТТ-GnRHm1, GnRHm1-Р48-Р64К и Р48-Р64К-GnRHm1.
Фиг.2: Средняя (естественная) сероконверсия анти-GnRH иммунизированных животных с различными вариантами GnRH, связанного с молекулой-носителем ТТ.
Фиг.3: Титры анти-GnRH-антител у здоровых Копенгагенских крыс, иммунизированных различными вариантами GnRH, связанного с молекулой-носителем.
Фиг.4: Оценка массы яичек во время убоя (100 дней). Статистическая оценка наименьшего существенного различия Stat-Graphic. 1 - Плацебо, 2 - GnRHm1-ТТ, 3 - ТТ-GnRHm1, 4 - Комбинация 2+3 (50/50), 5 - Комбинация 2+3 (70/30), 6 - Поочередная схема.
Фиг.5: Оценка массы предстательной железы во время убоя (100 дней). Статистическая оценка наименьшего существенного различия Stat-Graphic. 1 - Плацебо, 2 - GnRHm1-ТТ, 3 - ТТ-GnRHm1, 4 - Комбинация 2+3 (50/50), 5 - Комбинация 2+3 (70/30), 6 - Поочередная схема.
Фиг.6: Макроскопический вид яичек и предстательной железы всех оцениваемых животных (n=10 для каждой группы). Группы слева направо: первая - Плацебо, вторая - GnRHm1-ТТ (С-Т), третья - ТТ-GnRHm1 (А-Т), четвертая - Комбинация [С-Т]+[А-Т] (50/50), пятая - Комбинация [С-Т]+[А-Т] (70/30) и шестая - поочередная схема (Alt).
Фиг.7: Средние значения объема опухолей при различных вариантах GnRH, связанных с молекулой-носителем столбнячного анатоксина.
Фиг.8: Титры анти-GnRH-антител Копенгагенских крыс, иммунизированных различными вариантами GnRH, связанными с молекулой-носителем ТР48-Р64К.
Фиг.9: Оценка массы яичек во время убоя (100 дней). Статистическая оценка наименьшего существенного различия Stat-Graphic. 1 - Плацебо, 2 - GnRHm1-Р48-Р64К, 3 - Р48-Р64К-GnTHm1, 4 - Комбинация 2+3 (50/50), 5 - Комбинация 2+3 (70/30), 6 - Поочередная схема.
Фиг.10: Оценка массы предстательной железы во время убоя (100 дней). Статистическая оценка наименьшего существенного различия Stat-Graphic. 1 - Плацебо, 2 - GnRHm1-Р48-Р64К, 3 - Р48-Р64К-GnTHm1, 4 - Комбинация 2+3 (50/50), 5 - Комбинация 2+3 (70/30), 6 - Поочередная схема.
Фиг.11. Оценка скорости опухолевого роста опухолевой клеточной линии Dunning R3327-H, имплантированной Копенгагенским крысам перед иммунизацией животных.
ПРИМЕРЫ
Эксперимент на иммуногенность и действие на намеченные органы карбоксильного и аминотерминального вариантов GnRH, связанных с различными молекулами-носителями.
Пример 1: Иммуногенность карбоксильного и аминотерминального вариантов GnRHm1-ТТ, использующих ТТ в качестве молекул-носителей.
На Фиг.1а и 1b описаны амино- и карбоксильнотерминальные варианты GnRH и ТТ синтезированные пептидные последовательности, используемые в биологических исследованиях.
1.1. Экспериментальные Группы
1 - Плацебо.
2 - Карбоксильный конец (GnRHm1-ТТ) 750 мкг суммарного пептида.
3 - Аминоконец (ТТ-GnRHm1) 750 мкг суммарного пептида.
4 - Комбинация 50/50 (м/м) в одной и той же эмульсии карбоксильноконцевого (GnRHm1-ТТ) + аминоконцевого (ТТ-GnRHm1) вариантов; 750 мкг суммарного пептида (по 375 мкг каждого).
5 - 70/30 (м/м) в одной и той же эмульсии вариантов карбоксильного конца (GnRHm1-ТТ) + аминоконца (ТТ-GnRHm1); 750 мкг суммарного пептида (525 мкг GnRHm1-ТТ и 225 мкг ТТ-GnRHm1).
6 - Поочередная иммунизация карбоксильным концом (GnRHm1-ТТ) 750 мкг суммарного пептида на 0, 30 и 60 дни; и аминоконцом (ТТ-GnRHm1) 750 мкг суммарного пептида на 15 и 45 дни.
Во всех случаях по 5 подкожных иммунизаций для каждого варианта было проделано с использованием адъюванта Монтанид.
1.2. Разработка эксперимента
1.2.1. Иммуногенные препараты, иммунизация животных и анализ результатов.
1.2.2. Привнесение адъювантных свойств: карбоксильнотерминальный пептидный вариант GnRHm1-ТТ и/или аминотерминальный пептидный вариант ТТ-GnRHm1 в соответствующих дозах ресуспендировали по отдельности в воде для инъекции. Позже получали смесь, составляющую 50% (о/о) ресуспендированных пептидов и масляного адъюванта. В заключение, смесь встряхивали в механическом устройстве в течение 20 минут с образованием молочно белой эмульсии, готовой к применению.
1.2.3. Иммунизация: 1 мл эмульсии помещали в одноразовые шприцы и инъецировали подкожно в дорсальную область 9-12-недельных Копенгагенских крыс с использованием двухнедельной схемы.
1.2.4. Измерение титров анти-GnRH-антител: Циркуляцию анти-GnRH-антител, полученных в результате вакцинации, измеряли с использованием системы ELISA (Иммуноферментного твердофазного анализа). 96-луночные полистериновые плашки покрывали 100 мкл нативного GnRH пептида (5мкг/мл) в 100 мМ Na2CO3 (рН 9,6) и инкубировали на протяжении ночи при 4°С. После нескольких промываний PBS 1х (рН 7,4) плашки блокировали 2% BSA в PBS и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Образцы сыворотки животных разбавляли (в соотношениях 1/60-1/2000) в PBS, содержащем 1% BSA, Tween 20 (0,01% м/о) инкубировали в течение 3 часов при 37°С. Плашки промывали PBS несколько раз и вводили в реакцию с анти-IgG-антителами крыс, конъюгированными пероксидазой хрена (SIGVA Biochemical USA). После дополнительных промываний плашки инкубировали со смесью, содержащей субстрат Ортофенилен-диамина (OPD) и H2O2 в цитратном буфере. Титры выражали в виде максимального разбавления образцов, которое достигает значений в 2 раза выше, чем предельное значение анализа.
1.2.5. Определение уровней тестостерона: Уровни тестостерона определяли, используя Набор TESTO CT2 (CisBio, International, France). 25 мкл каждого образца сыворотки добавляли непосредственно в предварительно покрытые пробирки. Образцы инкубировали в двух экземплярах. В заключение, пробирки промывали дистиллированной водой и считывали результат, используя гамма. Результаты выражали в нмоль/л.
1.2.6. Умерщвление животных и статистический анализ: Животных анестезировали и умерщвляли через один месяц после 5-й иммунизации (100 дней) в соответствии с апробированными лабораторными методами. Значимые статистические различия, относящиеся к размерам яичек и предстательной железы оценивали, используя критерий Дункана (программное обеспечение Stat-Graphic). Аналогичным образом, тестостерон анализировали, используя ту же самую статистическую методику (SAS Institute Inc., User,s Guide, SAS/STATTM, Release 6/03 Edition. Cary, NC: SAS Institute Inc., 1988. 1028 pp).
1.3 Результаты эксперимента
1.3.1 Анализ сероконверсии:
Молекула GnRH, как изложено выше, обладает 100% гомологией у всех млекопитающих и у большого количества высших позвоночных. Она имеет также очень малый размер (всего лишь десять аминокислот), что придает ей очень низкую иммуногенную силу, в противоположность ее высокой толерогенной способности вследствие ее эндогенной природы.
В данном примере, авторы изобретения описывают группу, иммунизированную аминотерминальным вариантом (ТТ-GnRHm1), получивших 100% сероконверсии после первой иммунизации, в то время как группа, иммунизированная карбоксильнотерминальным вариантом (GnRHm1-ТТ), показывала 90% сероконверсии только после третьей иммунизации. Комбинация (50/50) со смешанными амино- и карбоксильнотерминальными вариантами имела 100% сероконверсии после второй иммунизации, и в заключение, комбинация (70/30) смеси амино- и карбоксильнотерминальных вариантов, достигала 100% сероконверсии после третьей иммунизации (Фиг.2).
1.3.2. Оценка титров анти-GnRH-антител:
Титры анти-GnRH-антител в образцах сыворотки каждой экспериментальной группы показаны на Фиг.3. Как можно видеть на графике, группа ТТ-GnRHm1 показала высокую скорость иммунного ответа, коррелирующую с возникновением титров анти-GnRH, которые колеблются в диапазоне между 1/6000 и 1/12000 спустя 75 и 100 дней после начала эксперимента, соответственно. Объединенные варианты 50/50 и 70/30 показывали аналогичные титры анти-GnRH-антител, но первый показывал большую скорость ответа титров. Схема поочередной иммунизации с вариантами GnRHm1-ТТ и ТТ-GnRHm1 не могла сохранять высоту титров как у комбинации 50/50; однако, она достигает аналогичной скорости в выявленных титрах. В группе, иммунизированной вариантом GnRHm1-ТТ, титры появлялись позже, чем в остальных экспериментальных группах (после третьей иммунизации) и не могли достигнуть уровней титров выше, чем 1/1000.
1.3.3. Корреляция между титрами анти-GnRH-антител, выявленными в отношении различных областей GnRH, и воздействием на намеченные органы
Провели корреляционный анализ между титрами анти-GnRH-антител и воздействием на намеченные органы (предстательная железа и яички). Как показано на Фиг.3, несмотря на то что иммунизация аминотерминальной областью ТТ-GnRHm1 показывает высоту иммуногенного профиля, карбоксильнотерминальный вариант (GnRHm1-ТТ) показывал более низкую сероконверсию и значительно более низкие титры антител в отношении GnRH. При умерщвлении были обнаружены аналогичные результаты воздействия на намеченные органы. Титров с высотой 1:12000 достигали посредством групп, иммунизированных аминотерминальным вариантом (ТТ-GnRHm1), проявляющим аналогичное действие на намеченных органах (предстательной железе и яичках) по сравнению с группой, иммунизированной карбоксильнотерминальным вариантом (GnRHm1-ТТ) (Фиг.4 и 5).
Смесь в различных пропорциях амино- и карбоксильнотерминальных вариантов в одной и той же схеме иммунизации вызывает значительно более высокий иммунизационный ответ, чем ответ, полученный с отдельным карбоксильнотерминальным пептидом, который производит значительно более высокий биологический эффект, чем два варианта, вводимые по отдельности. Хотя он не достигает абсолютных значений титров, как значения, полученные при использовании аминотерминального варианта. Аналогичные результаты были получены, когда оба пептида инокулировали в поочередном виде в одной и той же схеме иммунизации (фиг.4, 5, 6).
Пример 2: Иммуногенность GnRHm1-ТТ карбоксильно- и аминотерминальных вариантов при использовании Р48-Р64К в качестве молекулы-носителя.
2.1. Экспериментальные группы
1 - Плацебо.
2 - Карбоксильный конец (GnRHm1-Р48-Р64К); 750 мкг общего пептида.
3 - Аминоконец (Р48-Р64К-GnRHm1); 750мкг общего пептида.
4 - Комбинация 50/50 (м/м) в одной и той же эмульсии карбоксильноконцевого (GnRHm1-Р48-Р64К) + аминоконцевого вариантов (Р48-Р64К-GnRHm1; 750 мкг общего пептида (по 375 мкг на каждый).
5 - 70/30 (м/м) в одной и той же эмульсии вариантов карбоксильного конца (GnRHm1-Р48-Р64К) + аминоконца (Р48-Р64К-GnRHm1; 750 мкг общего пептида (525 мкг GnRHm1-Р48-Р64К и 225 мкг Р48-Р64К-GnRHm1).
6 - Поочередная иммунизация (2 и 3) карбоксильным концом (GnRHm1-Р48-Р64К); 750 мкг общего пептида в 0, 30 и 60 дни; и аминоконцом (Р48-Р64К-GnRHm1); 750 мкг общего пептида в 15 и 45 дни.
Во всех случаях по 5 подкожных иммунизаций для каждого варианта было проделано с использованием адъюванта Монтанид.
2.2. Разработка эксперимента
Иммуногенные препараты, иммунизация животных и анализ результатов и статистические данные обрабатывали, как описано в пунктах с 1.2.1 по 1.3.3.
2.3 Результаты эксперимента
2.3.1. Анализ сероконверсии:
В данном эксперименте, группа, иммунизированная аминотерминальным пептидным вариантом (Р48-Р64К-GnRHm1) достигала 100% конверсии после первой иммунизации, тогда как группа, иммунизированная карбоксильнотерминальным пептидным вариантом (GnRHm1-Р48-Р64К) показывала 70-80% сероконверсии только после третьей иммунизации. Однако смешанные амино- и карбоксильнотерминальные варианты, комбинация (50/50) демонстрировали 100% сероконверсии после второй иммунизации. С другой стороны, амино- и карбоксильнотерминальный вариант, комбинация (70/30) и поочередная иммунизационная схема показали 100% сероконверсии после третьей иммунизации (Фиг.7).
2.3.2. Оценка титров анти-GnRH-антител:
Фиг.8 показывает титры анти-GnRH-антител сыворотки каждой экспериментальной группы. На данном графике наблюдается, что группа Р48-Р64К-GnRHm1 показала более быстрое появление титров анти-GnRH, которые находились в пределах 1/5000 и 1/8000 в конце эксперимента. В пределах объединенных вариантов, варианты 50/50 и 70/30 вызывали аналогичные титры анти-GnRH-антител. Однако в варианте 50/50 титры показывали более быстрый ответ. С другой стороны, схема поочередной иммунизации вариантами GnRHm1-Р48-Р64К и Р48-Р64К-GnRHm1 развивала аналогичные иммуногенные уровни, как и уровни, вызываемые в варианте 70/30. Хотя титры не сохранялись такими же высокими, как в первом варианте. Что касается группы, иммунизированной вариантом GnRHm1-Р48-Р64К, титры появлялись позже, чем в остальных экспериментальных группах и не достигали уровней более, чем 1/1000 в лучших случаях.
2.3.3. Корреляция между титрами анти-GnRH-антител, выявленным в отношении различных областей GnRH, и воздействием на намеченные органы.
Как показано на фиг.7 и 8, в то время как иммунизация аминотерминальным вариантом Р48-Р64К-GnRHm1 выявляла высокую иммуногенность, карбоксильнотерминальный вариант (GnRHm1-Р48-Р64К) показывал более низкую сероконверсию, а также значительно более низкие титры анти-GnRH-антител. Наблюдаемые различия в сероконверсии не были очевидны в отношении воздействия на намеченные органы при умерщвлении. Таким образом, титры на уровне 1:8000 в группе, иммунизированной аминотерминальным вариантом (Р48-Р64К-GnRHm1), проявляли аналогичные воздействия на намеченные органы (яички, предстательная железа), как и группа, иммунизированная карбоксильнотерминальным вариантом (GnRHm1-Р48-Р64К) (Фиг.9 и 10).
Амино- и карбоксильнотерминальные варианты, смешанные в различных пропорциях в одной и той же схеме иммунизации, достигают значительно более высокого иммунологического ответа, чем полученный отдельно с карбоксильнотерминальным пептидом, хотя и более низкого, чем титры, полученные при использовании аминотерминального варианта, биологический эффект значительно выше для 2 вариантов введения по отдельности. Аналогичные результаты наблюдали, когда оба пептида инокулировали в одной и той же схеме иммунизации в поочередной форме (Фиг.8, 9 и 10).
Пример 3: Корреляция между гуморальным ответом, выявленным в отношении различных областей GnRH, и воздействием на намеченные органы.
После анализа титров антител проводили корреляционный анализ между данными титрами и воздействием на намеченные органы (предстательную железу и яички). Как показано на Фиг.3 и 8, наблюдалось абсолютно различное поведение, касающееся иммуногенной способности в экспериментальных группах 2 и 3, соответствующих карбоксильно- и аминотерминальным вариантам. Таким образом, тогда как аминоконец, представленный пептидами ТТ-GnRHm1 и Р48-Р64К-GnRHm1TT, показывал более быстрое продуцирование анти-GnRH-антител в используемых моделях, а также высокие титры в отношении данного гормона, значительно более низкая сероконверсия и значительно более низкие титры антител в отношении GnRH были достигнуты в карбоксильнотерминальных вариантах (GnRHm1-ТТ и GnRHm1-Р48-Р64К). Несмотря на то что данные сероконверсия и определение титров сыворотки, являются различными, выявляли аналогичные результаты в своем воздействии на намеченные органы при оценке во время умерщвления животных. Таким образом, можно было наблюдать, что титры антител на уровне 1:12000 в группах, иммунизированных аминотерминальным вариантом, оказывали аналогичные воздействия на намеченные органы (предстательную железу и яички), нежели группы, иммунизированные карбоксильнотерминальным вариантом (фиг.4, 5 и 9, 10). Однако, если амино- и карбоксильнотерминальные варианты смешивали в различных пропорциях в одной и той же схеме иммунизации, получали значительно более высокий иммунологический ответ, чем ответ отдельного карбоксильнотерминального пептида. Данный ответ не достигает значений титров таких же высоких, как значения аминотерминального варианта, но вызывает биологический эффект значительно более высокий, чем при 2 вариантах, вводимых по отдельности. Аналогичные результаты были получены, когда оба пептида инокулировали в одной и той же схеме иммунизации в чередующемся виде (фиг.4, 5, 9 и 10).
Данные результаты приводят к заключению, что свободная карбоксильная группа в GnRH стимулирует в значительной степени иммунологический ответ против данного гормона, когда она связана с молекулой-носителем аминотерминальным концом или другой аминокислотой, далекой от карбоксильной. В отличие от этого, похоже, что GnRHm1-TT, который, когда он связан с молекулой-носителем своим карбоксильным терминальным концом, нарушает воздействие иммунологической системы на данную область и подвергает воздействию только аминоконец. Данная аминотерминальная область не обладает такой же высокой иммуностимулирующей способностью, как первая область, но способна вызывать ответ, который, хотя он и в 10 раз слабее, аналогичным образом нейтрализует гормон, когда его вводят в дозах, равных варианту TT-GnRHm1.
На основании данного открытия, авторы изобретения могут подтвердить, что в случае GnRH, наиболее иммуногенные области не обязательно являются иммунонейтральными зонами. То же самое происходит с другими белками и пептидами.
Приведенные выше результаты позволяют авторам изобретения прийти к выводу, что одновременное использование в смеси 2 вариантов GnRH или его миметиков, связанных с молекулой-носителем, в одном случае своим аминоконцом, а в другом случае своим карбоксильным концом в одной и той же схеме иммунизации, создает синергизм анти-GnRH иммунологического ответа. В данном случае воздействие на иммунологический ответ выше, чем просто суммирование ожидаемых воздействий в некомбинированных вариантах.
Явно синергическое воздействие на уменьшение размера предстательной железы и яичек наблюдалось в комбинациях вариантов 50/50 и 70/30, когда смесь пептидов использовали в иммунизационном процессе. Поочередная и последовательная схемы вызывают также комбинированное воздействие, но оно слабее, чем одновременное воздействие. Данное воздействие реализовывалось главным образом в атрофии яичек и предстательной железы. В качестве эффекта воздействия (Eвоздействия) рассчитывали: единица минус отношение средней массы намеченных органов (предстательной железы и яичек) у животных, подвергшихся воздействию (Рвоздействия), и средней массы намеченных органов у животных плацебо (Рплацебо):
Eвоздействия=1-(Рвоздействия/Рплацебо) (1)
Как показано в Таблицах 1а и 1b, экспериментальное воздействие, достигнутое для комбинации 50/50 карбоксильного и аминоконцов, на предстательную железу и яички было выше, чем ожидаемое теоретическое воздействие, обеспечивая, таким образом, синергический эффект данной комбинации в уменьшении размера намеченных органов с использованием любой из описанных на Фигуре 1 молекул. В случае комбинации двух пептидов 70/30, результаты очень сильно похожи на результаты комбинации 50/50 карбоксильного и аминоконцов. При поочередной схеме иммунизации, связанной с биологическим воздействием на указанные органы (предстательную железу и яички), наблюдался только суммарный эффект, хотя полученные титры превосходили варианты отдельной иммунизации.
Общий синергический эффект, получаемый за счет комбинированной иммунизации по сравнению с отдельными вариантами для каждого из пептидов, когда их использовали как отдельный прием, при иммунизации здоровых взрослых животных, показан в Таблицах 1а и 1b.
Пример 4: Лечебные эксперименты с использованием отдельных GnRHm1-ТТ и ТТ-GnRHm1 вариантов и их комбинаций (GnRHm1-ТТ + ТТ-GnRHm1) для взрослых Копенгагенских крыс с имплантированной клеточной линией Dunning R3327-H.
4.1. Животные, опухолевая модель
Опухолевые фрагменты (2×2×2 мм) мышиной опухолевой модели Dunning R3327-H подкожно (ПК) трансплантировали в дистальную зону правой задней конечности взрослых Копенгагенских крыс с массой от 150 до 200 г. (CENPALAB, Cuba). Это гормонозависимая высокодифференцированная опухолевая клеточная линия с периодом удваивания объема, составляющим 17 дней. Для определения скорости опухолевого роста, опухоли регулярно измеряли один раз в день. Объем опухоли рассчитывали, используя формулу 4/3 π r3, где r представляет собой значение радиуса. Животных содержали на имеющемся на рынке корме и свежей воде по потребности.
4.2. План эксперимента
Экспериментальные группы:
1. Животные плацебо (иммунизированные PBS в Монтаниде ISA 51).
2. Хирургически кастрированные животные.
3. Животные, иммунизированные пептидом GnRHm1-ТТ.
4. Животные, иммунизированные смесью (50/50) пептидов GnRHm1-ТТ + ТТ-GnRHm1.
5. Группа, иммунизированная пептидом GnRHm1-Р48-Р64К.
6. Животные, иммунизированные смесью (50/50) пептидов GnRHm1-Р48-Р64К + Р48-Р64К-GnRHm1.
4.3. Обработки животных
Обработку животных проводили с использованием терапевтической модели, с инокуляцией фрагментов опухолевой клеточной линии Dunning R3327-H, как описано в разделе 3.1.1. Терапевтические вмешательства (иммунизации) начинали, когда опухоли достигали приблизительно диаметра 10 мм. Иммунизации проводили две недели. Дозы, использованные в эксперименте для групп с 3 по 7, были такими же, как дозы, описанные в разделе 1.1.
4.4. Результаты эксперимента
Оценка скорости опухолевого роста у Копенгагенских крыс, имплантированных опухолевой клеточной линией Dunning R3327-H.
Как показано на Фиг.11, в то время как в группе плацебо наблюдался скачкообразный рост опухоли, у кастрированных и иммунизированных групп было достигнуто значительное замедление опухолевого роста. Из всех вариантов, кастрированные животные и объединенные варианты GnRHm1-ТТ + ТТ-GnRHm1 (50/50) и GnRHm1-Р48-Р64К + Р48-Р64К-GnRHm1 (50/50) показали наибольшую способность замедления. Замедление было очень похожим для данных трех экспериментальных вариантов и имело значительное отличие по сравнению с плацебо и другими группами.
Реферат
Группа изобретений относится к области медицины, в частности к иммунологии, эндокринологии, онкологии, и предназначена для регулирования и лечения доброкачественных и злокачественных заболеваний. Фармацевтическая композиция содержит смесь из 2 пептидов GnRH в естественной и/или модифицированной форме. При этом один из пептидов GnRH содержит молекулу-носитель, связанную посредством своего карбоксильного конца, а другой пептид GnRH содержит ту же самую молекулу-носитель, связанную посредством аминотерминального конца. Указанные пептиды состоят в SEQ ID №4-7. Смесь пептидов GnRH применяют в качестве терапевтического инструмента для регулирования, в частности, некоторых гормонозависимых видов рака, таких как: рак предстательной железы, молочной железы, яичников, эндометрия и яичек, рак поднижнечелюстных желез, а также рак печени. Использование группы изобретений обеспечивает более быстрый и более сильный иммунологический ответ против эндогенного гормона GnRH, что приводит к элиминации GnRH. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл., 11 ил., 4 пр.
